IMUNOCYTOCHEMICKÁ METODA – JEJÍ PRINCIP A VYUŽITÍ V LABORATOŘI Radka Závodská, PedF JU v Českých Budějovicích
Imunocytochemická metoda - použítí protilátky k detekci antigenu v buňkách (Imunohistochemie- použítí protilátky k detekci antigenu v tkáních) Princip imunocytochemie • fixace proteinu (antigenu) ve tkáních • navázání specifické protilátky • vizualizace protilátky • Co jsou to protilátky Protilátky –imunoglobuliny produkované bílými krvinkami B-lymfocyty - pět tříd imunoglobulinů : IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM - mají schopnost rozpoznat a navázat se na určitý antigen - součástí imunitního systému Vazba proteinů k jiným molekulám • proteiny se mohou vázat selektivně a s velkou afinitou k povrchu jiného proteinu (=ligandu) → tvorba mnoha slabých nekovalentních vazeb povrchová kontura ligandu se velmi blízce shoduje s proteinem
Nekovalentní vazby - vodíkové můstky: - O -H |||||||| O = >N – H |||||||| O = atom H mezi dvěma elektronegativními atomy
1
- iontové vazby: + |||||||| mezi plně nabitými skupinami nebo skupinami s částečným nábojem - van de Waalsovy síly: na velmi blízké vzdálenosti jsou 2 atomy přitahovány slabou silou, která je dána jejich pohyblivými el. náboji + hydrofobní interakce - hydrofobní skupiny se spojí, aby minimalizovaly svůj kontakt s vodou
Vazebné místo - oblast proteinu, která asociuje s ligandem - dutina na povrchu proteinu, která je tvořena specifickým uspořádáním aminokyselin aminokyseliny patří ke vzdáleným oblastem bílkovin, ale dostávají se blízko k sobě, když molekula bílkoviny zaujme svou trojrozměrnou konformaci
2
Molekula protilátky - 2 stejná vazebná místa - smyčky polypeptidového řetězce malá změna délky nebo pořadí aminokyselin → velká rozmanitost vazebných míst → rozsáhlá řada různých protilátek Molekula protilátky- schéma:
Vazba protilátky a antigenu pořadí aminokyselin variabilní domény lehkého nebo těžkého řetězce změněno mutací → velká rozmanitost vazebných míst → rozsáhlá řada různých protilátek
Vznik protilátek • •
vytvářeny v organismu bílými krvinkami - B-lymfocyty klidový B-lymfocyt má v membráně navázané molekuly určitého typu protilátky - tento membránový protein slouží jako receptor pro rozeznání specifického antigenu
• •
po navázání antigenu je buňka stimulována k dělení a tvorbě stejného typu protilátky při opakované infekci stejným antigenem je reakce rychlejší
3
Produkce protilátek v laboratorních zvířatech • • •
imunizace pokusného zvířete injikací antigenu
opakovaná injikace → stimulace specifických B-lymfocytů k tvorbě krevního oběhu
protilátek → do
•
dochází ke stimulaci mnoha různých B lymfocytů → jsou namířeny proti různým epitopům určitého antigenu
•
po úspěšné imunizaci se zvířeti odebere sérum obsahující spektrum protilátek proti různým epitopům příslušného antigenu → polyklonální protilátky
•
polyklonální protilátky - produkt mnoha různých klonů B-lymfocytů
monoklonální protilátky - jediný typ protilátky → fúze jediného B-lymfocytu s nádorovou buňkou (B-lymfocyt) → hybridní buňka se množí a vylučuje protilátky jediného typu
4
Vizualizace protilátky • •
označení protilátek vhodným markerem lze označit: - primární protilátku – reaguje přímo s antigenem
(přímá metoda)
- sekundární protilátku – váže se na primární protilátku
Přímá metoda vizualizace
5
( nepřímá metoda)
Nepřímá metoda vizualizace
Vysvětlivky:
antigeny - A, B primární protilátka – Rabbit anti-A - protilátka proti králičímu antigenu A sekundární protilátka - Goat anti-rabbit - protilátka (imunoglobulin Ig G) proti králičí protilátce fluorescenční barvivo - Fluorescent-staining tag (např.cyanin) buňka - Cell
Možnosti značení a detekce • • •
enzym (enzym křenové peroxidázy, alkalické fosfatázy) → optický mikroskop fluorescenční barvivo → fluorescenční a konfokální mikroskop koloidní zlato → elektronový mikroskop
Protilátky s konjugovaným enzymem •
enzymy po dodání příslušného substrátu tvoří nerospustný barevný produkt např. křenová peroxidáza (HRP) + 3´,3´-diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) vznikne hnědé barvivo nerozpustné ve vodě i alkoholu
•
detekce světelným mikroskopem
neurony circadiánních hodin v mozku hmyzu (foto Závodská)
6
Protilátky značené fluorescenčním barvivem • fluorofory po ozáření (excitaci) světlem jsou schopny absorbovat světlo určité vlnové délky a následně vyzařovat (emitovat) světlo o delší vlnové délce napr. Cyanin, DAPI, GFP
Pigment Dispersní Hormon (PDH) v mozku Drosophila melanogaster (foto Sehadová)
Nespecifické imunohistochemické reakce •
způsobeny vazbou protilátky ke kolagenu či jiným bílkovinám
•
nutno vysytit nespecifická vazebná místa tzv. normálním sérem (ze stejného druhu zvířete jako sekundární protilátka)
Kontrola specifity reakce • stejný postup pro tkáň, která zaručeně obsahuje a která zaručeně neobsahuje hledaný antigen •
náhrada primární protilátky kontrolním sérem ze stejného zvířecího druhu (popř. zvířete = preimunní sérum)
•
vysycení primární protilátky antigenem
7
Immunocytochemická metoda a její použití v laboratoři Imunocytochemické šetření lze provádět: •
v celé části tkáně - tzv. totální preparáty
•
na paraplastových řezech
rozdíly: - způsob fixace - délka inkubace s primární i sekundární protilátkou - zalévací média - mikroskopická analýza
Imunocytochemie na paraplastových řezech A) Fixace tkání a příprava paraplastových řezů Pitva a fixace tkání - pitva hmyzích tkání ve fyziologickém roztoku (= Ringerův roztok) - fixace v Bouin-Hollande roztoku přes noc ve 4 oC - antigen nesmí být vyplaven a musí být zachovány jeho antigenní vlastnosti Vymytí fixáže z tkání - 70 % etanol Dehydratace tkáně vzestupnou alkoholovou řadou a převedení do rozpouštědla a paraplastu 96% EtOH 100% EtOH chloroform Zalití tkáně do paraplastu Příprava paraplastových bločků na krájení • Orientace tkáně na dně bločku (vzhledem k rovině řezu) • Polymerizace paraplastu při pokojové teplotě (nejméně 2 hod)
Krájení tenkých řezů na mikrotomu
8
Odstranění paraplastu z řezů • Xylen- rozpouštědlo paraplastu • Sestupná alkoholová řada -převedení do vodního prostředí: 96% EtOH 70% EtOH destil. voda • Fosfátový pufr- pH 7.4
B) Imunocytochemie • • • • •
Blokování nespecifických vazebných míst - 10% kozí sérum Aplikace primární protilátky - např. králičí protilátka proti určitému antigenu Inkubace s primární protilátkou - přes noc při 4o C
Vymytí primární protilátky -fosfátový pufr - 3 x 10 Aplikace sekundární protilátky - např. kozí protilátka proti králičím IgG Vymytí sekundární protilátky- fosfátový pufr - 3 x 10 min
C) Tvorba trvalých preparátů •
Převedení preparátů z vodního prostředí do organického rozpouštědla přes alkoholovou řadu: 70% EtOH 96% EtOH 100% EtOH xylen
•
Montování preparátů do zalévacího média - např. DPX, kanadský balzám
Literární zdroje: • Alberts B. a kol.: Základy buněčné biologie, Espero publishing, Ústí nad Labem,2001 • Campbell N.A., Reece,J.B: Biology. The Benjamin/Cummings Publishing Copany, Inc., 1996 • Závodská R. : Biologie buněk, Scientia, 2006
9
Obrázky v textu o principu imunocytochemie převzaty z Alberts a kol. (2006)
10
