Imunochemické stanovení Elecsys Syphilis a zpìtná vazba napøíè odbornostmi

RNDr. Pavlína Šorfová, Ing. Igor Klimíèek, MBA (organizátoøi) Roche s.r.o., Diagnostics Division

Imunochemické stanovení Elecsys® Syphilis a zpìtná vazba napøíè odbornostmi V prvním kvartálu tohoto roku byl uveden test pro stanovení celkových protilátek proti Treponema pallidum v lidském séru a plazmì na všech platformách založených na mìøicím principu elektrochemiluminiscence, tedy na systémech Elecsys® 2010, Modular® ANALYTICS <E170>, cobas e 411 a cobas e 601/e 602. Pøed uvedením tohoto testu na trh byly provedeny na èetných skupinách probandù multicentrické studie, jejichž výsledky jsou souèástí pøíbalového letáku a o nichž jsme vás již informovali v pøedchozích vydáních èasopisu Labor Aktuell a také pomocí jiných informaèních kanálù. Vzhledem k tomu, že bývá dobrým zvykem si dané parametry ovìøit i na lokální úrovni a rovnìž se podrobnìji seznámit se specifiky dané imunochemické metody, požádali jsme tøi významná pracovištì v Èeské republice reprezentující jiný zákaznický segment z hlediska odbornosti i typu organizace. Touto cestou bychom si jim také dovolili podìkovat za vstøícnost, skvìlou spolupráci a invenci. V následujících èástech budou postupnì probrány jejich zkušenosti.

4

Labor Aktuell 04/14

1) Zhodnocení testu Elecsys® Syphilis na analyzátoru cobas® 6000 – OHKT ÚVN Praha Pplk. MUDr. Miloš Bohonìk, Ph.D., Ing. Ludmila Landová, Ph.D., MUDr. Hana Zákoucká, Bc. Eliška Sládková, Dana Horèièková Oddìlení hematologie a krevní transfuze, Ústøední vojenská nemocnice - Vojenská fakultní nemocnice Praha Bìhem studie bylo na Oddìlení hematologie a krevní transfuze ÚVN Praha vyšetøeno 200 negativních sér dárcù krve z OHKT ÚVN Praha a 61 pozitivních sér zapùjèených z Národní referenèní laboratoøe pro syfilis (SZÚ). Celkem 200 negativních sér bylo vyšetøeno v den 0 (následující den po odbìru) na analyzátoru Galileo pomocí hemaglutinaèní metody Immucor TPHA ScreenTM a souèasnì na analyzátoru cobas® 6000 (na modulu e 601) metodou Elecsys® Syphilis (ECLIA). Následnì byly vzorky odeslány do Národní referenèní laboratoøe pro syfilis a vyšetøeny na analyzátoru Architect i2000 metodou Syphilis TP (CMIA). Další den (den 1) tamtéž byly vzorky opakovanì vyšetøeny na analyzátoru Architect i2000 a odeslány zpìt do ÚVN Praha pro opakované stanovení na analyzátorech Galileo a cobas® 6000 (tab. 1). Dále pak 61 pozitivních sér zapùjèených z Národní referenèní laboratoøe bylo vyšetøeno všemi konfirmaèními metodami v NRL používanými, tj. VDRL, TPPA, TPHA, FTA-ABS IgG, FTA-ABS IgM, 19S IgM SPHA a také na Architect i2000. V den 0 (den doruèení do ÚVN Praha) a den 1 (následující den) byly vzorky vyšetøeny na analyzátoru cobas® 6000 metodou Elecsys® Syphilis (tab. 2). Nakonec jsme testovali také samostatnou skupinu 20 falešnì pozitivních vzorkù z NRL. Vzorky byly vyšetøeny na analyzátoru cobas® 6000 s negativním závìrem (tab. 3). Na základì provedené studie mùžeme konstatovat, že výsledky získané testem Elecsys® Syphilis jsou plnì srovnatelné se souèasnými specifickými IgG testy pro stanovení syfilis a pøináší tak nové možnosti pro automatizaci screeningu protilátek proti syfilis u dárcù krve. Metoda pro screening syfilis Elecsys® Syphilis na analyzátoru cobas® 6000 je vhodná pro rutinní vyšetøení dárcù krve a krevních složek i pro vyšetøení pacientù.

Tab. 1: Pøehled vyšetøených negativních vzorkù

Tab. 2: Pøehled pozitivních výsledkù mìøených analyzátorem cobas® 6000

Tab. 3: Falešná pozitivita syfilis u jednotlivých vzorkù

Labor Aktuell 04/14

5

2) Zkušenosti z testování metody Elecsys® Syphilis v mikrobiologické laboratoøi fakultní nemocnice MUDr. Jana Bednáøová, Ph.D., Mgr. Krystyna Kantorová Oddìlení klinické mikrobiologie, Fakultní nemocnice Brno Na Oddìlení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno bylo v rutinním provozu v mìsících kvìtnu a èervnu roku 2014 vyšetøeno na analyzátoru cobas e 411 celkem 327 vzorkù, z toho 240 negativních a 87 pozitivních. Iniciálnì pozitivní séra byla vyšetøena duplicitnì. U všech vzorkù byla sledována pøíslušná shoda/neshoda namìøených výsledkù s dalšími technologiemi a typy metod, a sice netreponemovou metodou RPR firmy Omega a treponemovým hemaglutinaèním testem provenience BioRad. V pøípadì nesouhlasných interpretací dosažených tìmito metodami, zejména pak BioRad TPHA, nebo ve speciálních pøípadech indikovaných kliniky se pøistoupilo k dalšímu provìøovacímu a konfirmaènímu testování, což je vidìt v pøiložených tabulkách. K tomuto byly použity tyto soupravy ELISA: EIA Treponema pallidum IgG, EIA Treponema pallidum IgM (firmy TestLine) a Western blot: T. pallidum IgG Marblot Strip Test System, T. pallidum IgM Marblot Strip Test System (spoleènosti MarDx Diagnostics Inc., Trinity Biotech). Jak je vidìt níže, tabulka 4 ukazuje zjištìné neshody u negativních sér metodou Elecsys® Syphilis a tabulka 5 pak shrnuje nalezené rozpory ve výsledcích u opakovanì reaktivních vzorkù testem Elecsys® Syphilis. Pod každou z tabulek jsou tyto rozpory v hodnocení podrobnìji rozebrány a je také definován závìreèný komentáø pro každý z pøípadù. Vzorky è. 1544, 1891 Jde o dva pacienty se slabì pozitivními IgM v testu ELISA, všechny ostatní testy

(RPR, TPHA, ELISA IgG, u pacienta 1891 rovnìž Western blot IgG, Western blot IgM) negativní. Bez anamnestických èi klinických údajù svìdèících pro syfilis. Závìr: Pravdìpodobnì falešná reaktivita IgM v testu ELISA. Vzorek è. 1721 Jde o pacienta se sporným výsledkem TPHA, všechny ostatní testy (RPR, ELISA IgG, ELISA IgM, Western blot IgG, Western blot IgM) negativní. Bez anamnestických èi klinických údajù svìdèících pro syfilis. Závìr: Pravdìpodobnì falešná reaktivita TPHA. Vzorky è. 1296, 1614, 1617, 1830 Jde o pacienty ve vìku 3 týdny až 3 mìsíce, u nichž došlo k pasivnímu pøenosu protilátek tøídy IgG bìhem gravidity z matky na plod. Tyto protilátky jsou po porodu po urèitou dobu detekovatelné v krvi dítìte, odkud jsou postupnì eliminovány. U všech ètyø pacientù byly v dobì vyšetøení na analyzátoru cobas e 411 detekovány protilátky v nižších hodnotách (v rozmezí 2,76–8,00), ze stejného odbìru bylo u tìchto pacientù TPHA již negativní, z dalších treponemových testù bylo u dvou pacientù pozitivní stanovení IgG metodou Western blot a u dalších dvou pacientù byl výsledek vyšetøení IgG metodou Western blot hranièní. Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacientù s pasivnì pøenesenými antitreponemovými protilátkami.

Tab. 4: Pøehled negativních výsledkù namìøených metodou Elecsys® Syphilis

6

Labor Aktuell 04/14

Vzorky è. 1439, 1690, 1712 Jde o pacienty, kteøí prodìlali laboratornì i klinicky potvrzenou syfilis v roce 2009, resp. 2011 a 2013. U všech tøí pacientù dochází k postupnému „slábnutí“ reakce TPHA – v dobì vyšetøení byla reakce TPHA u všech tøí pacientù pouze sporná, výsledek na analyzátoru cobas e 411 byl pozitivní (hodnoty 9,83; 6,59 a 55,93). Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacientù s døíve prodìlanou infekcí. Vzorek è. 1489 Jde o pacienta se sporným výsledkem reakce TPHA, ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní. Stejný laboratorní výsledek TPHA, ELISA a Western blot byl detekován již v roce 2013, bez dalších známých anamnestických údajù. Sérologický nález odpovídá døíve prodìlanému onemocnìní syfilis, postupné „slábnutí“ reakce TPHA. Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s døíve prodìlanou infekcí. Vzorky è. 1526, 1553 Dva vzorky od téhož pacienta odebrané s odstupem 2 dnù. Jde o pacienta s èerstvým onemocnìním syfilis, z obou vzorkù RPR 1 : 4 a TPHA negativní, z druhého vzorku doplnìny testy ELISA a Western blot – ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní, IgM hranièní. Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s èerstvou syfilis.

Tab. 5: Pøehled pozitivních výsledkù metodou Elecsys® Syphilis

Vzorek è. 1496 Jde o HIV+ pacienta s negativním RPR a TPHA, výsledek na analyzátoru cobas e 411 byl nízce pozitivní (hodnoty 2,01, resp. 2,11). Z dalších testù pouze Western blot IgG hranièní. Dle anamnézy se v minulosti v Praze léèil pro syfilis. Protilátková odpovìï mùže být ovlivnìna základním onemocnìním (HIV+). Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s døíve prodìlanou infekcí. Vzorek è. 1587 Jde o pacienta s negativním výsledkem RPR a TPHA v základním screeningu, na základì výsledkù z analyzátoru cobas e 411 doplnìny konfirmaèní testy, zde ELISA IgG pozitivní, Western blot IgG pozitivní. Sérologický nález odpovídá døíve prodìlanému onemocnìní syfilis. Závìr: Vyšší senzitivita stanovení Ig pomocí analyzátoru cobas e 411 vs. TPHA u pacienta s døíve prodìlanou infekcí.

Závìr: Vzhledem k negativitì všech sérologických testù (RPR, TPHA, ELISA, Western blot) pravdìpodobnì nejde o onemocnìní syfilis. Nelze vylouèit falešnou pozitivitu testu cobas e 411, blíže se však ke srovnání obou testù nelze vyjádøit. Vzorek è. 1791 Pøestože jde o kontakt od pacienta è. 1526, 1553 s èerstvou syfilis, byly výsledky všech testù negativní (RPR, TPHA, ELISA, Western blot). Klinický stav pacienta t. è. nesvìdèí pro onemocnìní. Závìr: Vzhledem k udávanému kontaktu s pozitivním pacientem a souèasnì nega-

tivnímu výsledku všech sérologických testù se ke srovnání obou testù nelze blíže vyjádøit. Z uvedených výsledkù a závìrù vyplývá, že test Elecsys® Syphilis pøedstavuje rychlý a spolehlivý zpùsob detekce specifických antitreponemových protilátek v èasných i pozdních fázích infekce. Ve srovnání s tradièními precipitaèními a aglutinaèními metodami minimalizuje riziko falešnì negativních výsledkù v èasné fázi infekce a umožòuje jednoznaènou interpretaci výsledkù ve všech fázích onemocnìní.

Vzorek è. 1770 Jde o pacienta s negativním výsledkem RPR a TPHA v základním screeningu, na základì výsledkù z analyzátoru cobas e 411 doplnìny konfirmaèní testy, ELISA negativní, Western blot negativní. Bez dalších známých anamnestických údajù stran syfilis. Labor Aktuell 04/14

7

3) Ovìøování vlastností a využití automatizované metody Elecsys® Syphilis v moderní soukromé laboratoøi Mgr. Andrea Dolinová, Ph.D., RNDr. Jaroslav Loucký IMALAB s.r.o. Zlín Laboratoø IMALAB zajišuje široké spektrum vyšetøení pro klinické specialisty Zlínského kraje, pøièemž oblast sérologie je pomìrnì èetnì zastoupenou indikací. Tato laboratoø velmi úzce spolupracuje s centrem prenatální diagnostiky a genetiky PREDIKO, s.r.o., a s IVF centrem reprodukèní medicíny, pro které provádí mj. screeningová vyšetøení tìhotných, kde vyšetøení treponemových a netreponemových protilátek hraje svou nezastupitelnou roli. Výhoda automatizovaného a èasovì neomezeného stanovení napomáhá ke zlepšení organizace práce a umožòuje tak dodávat komplexní informace klinikùm v mnohem kratším èase. Na tomto pracovišti byla testována zejména vhodnost soupravy pro rutinní provoz z hlediska stability. Reagenèní kit byl založen po dobu 6 týdnù na palubì analyzátoru cobas e 411, pøièemž byl uskladòován v lednici pouze o víkendech. Každý den byla provádìna kontrola kvality prostøednictvím kontrolního materiálu Elecsys® PreciControl Syphilis na jedné hladinì, výjimeènì na obou hladinách.

Pro jednotlivá stanovení kontroly kvality byly použity pøíslušné jednorázové alikvóty, které byly pøipraveny z pøíslušných lyofilizátù. Namìøené hodnoty kontrol jsou znázornìny na níže uvedeném obrázku 1 a demonstrují stabilní chování soupravy v èase, které pøekraèuje minimální deklarovanou stabilitu na palubì, uvedenou v pøíbalovém letáku (28 dní). Po celou dobu používání soupravy nebylo nutné soupravu rekalibrovat. V pøípadì negativní kontroly se hodnotí QC dle tzv. target range (rozmezí cílových hodnot), které je stanoveno v tomto pøípadì v rozmezí COI = 0-0,3, což odpovídá povaze této kvalitativní (semikvantitativní) metody. Prùmìr našich 29 mìøení této hladiny è. 1 docílil hodnoty 0,132. Pozitivní kontrola je již nastavena na klasickou cílovou hodnotu COI = 5,29 s deklarovanou 1SD = 0,53, pøièemž nᚠprùmìr z 27 mìøení pøedstavoval COI = 4,76 se zjištìnou 1SD = 0,31. Dovolujeme si pøipomenout, že správnost mìøení pacientù je garantována firmou, pokud se QC v tentýž den nalézá v rozmezí 5,29 ± 3SD.

Obr. 1: Ukázka výsledkù QC pomocí obou hladin Elecsys® PreciControl Syphilis na obrazovce QC/Run Status analyzátoru cobas e 411

8

Labor Aktuell 04/14

V rámci získávání zkušeností s tímto kitem byly zmìøeny rovnìž vzorky externí kontroly kvality ze Státního zdravotního ústavu a výsledky byly porovnány s ELISA soupravou PATHOZYME®SYPHILIS Competition výrobce Omega Diagnostics, která se v dobì testování soupravy Elecsys v místní laboratoøi používala. Vyhodnocení treponemového testu (Omega Diagnostics) bylo provedeno na základì zmìøené cut-off kontrolního vzorku, který byl souèástí IVD soupravy. Vzorky s OD450 menší než cut-off kontrolního vzorku byly považovány za pozitivní, hodnoty vyšší než cut-off kontrolního vzorku byly negativní. Výsledky byly rovnìž potvrzeny kvantitativnì netreponemovým RPR testem a byly ve shodì s hodnocením SZÚ. Mìøení kontrolních vzorkù metodou Elecsys® Syphilis bylo provedeno v duplikátech. Za pozitivní byly považovány výsledky COI ≥ 1. Dosažené výsledky shrnuje tabulka 6. Díky laskavosti pøedstavitelù Transfuzního a tkáòového oddìlení FN BrnoBohunice, jmenovitì primáøky MUDr. Evy Tesaøové a RNDr. Evy Køížové, Ph.D., bylo možné pøemìøit vzorky dárcù s opakovanì reaktivními výsledky, stanovené pùvodnì systémem Abbott Architect i2000. Z dùvodu tìchto výsledkù byly vzorky dárcù v roce 2009 vyøazeny a uchovány v zamraženém stavu. V tabulce 7 jsou rovnìž závìry výsledkù konfirmace ze SZÚ, se kterými jsou výsledky metody Elecsys® Syphilis ve shodì. Bylo provedeno opakování v duplikátu jednak pro ovìøení preciznosti stanovení a jednak pro potvrzení poèáteènì reaktivních vzorkù (COI ≥ 1). V záøí letošního roku jsme zavedli metodu Elecsys® Syphilis do rutinního provozu, èímž jsme udìlali další krok ke zvýšení úrovnì našich služeb poskytovaných klinikùm a k nárùstu efektivity práce naší laboratoøe.

Tab. 6: Ovìøení shody výsledkù EHK metodou Elecsys® Syphilis s hodnocením SZÚ a TPHA Omega Diagnostics

Tab. 7: Ovìøení shody metody Elecsys® Syphilis s hodnocením SZÚ u vzorkù vyøazených dárcù z TTO Brno

UNESCO otevøelo novou UnescoWorld knihovnu vìdy pro on-line vzdìlávání zdarma V listopadu 2014 byla díky spoleènému úsilí Unesco, Nature Education a Roche uvedena do provozu nová on-line vìdecká knihovna UnescoWorld (WLoS). Tato knihovna poskytuje návštìvníkùm zdarma nejnovìjší vìdecké informace a zároveò nabízí i virtuální prostor pro výmìnu zkušeností ve spoleènì sdíleném on-line prostøedí. Oèekává se, že tuto pøíležitost budou využívat zejména studenti ze znevýhodnìných regionù, pro které jsou jiné možnosti vzdìlávání témìø nedostupné. Knihovna WLoS obsahuje více než 300 kvalitních èlánkù, 25 elektronických knih a 70 videí od Nature, nejcitovanìjšího vìdeckého èasopisu na svìtì. Zároveò zahrnuje state-of-art, digitální platformu HUBù pro spoleènou výuku. Uživatelé mohou navštìvovat rùzné tøídy, vytváøet skupiny a propojovat se s ostatními studenty na www.unesco.org/wls. WLoS podporuje návštìvníky z øad uèitelù a studentù i tím, že pedagogùm poskytuje konkrétní návody, jak prezentovat složitá vìdecká témata, a žákùm naopak nabízí prameny pro doplnìní uèiva i z dalších zdrojù prostøednictvím databáze s možností vyhledávání obsahu. (zdroj: Staff Reporter)

Labor Aktuell 04/14

9