IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN HORMON PERTUMBUHAN (GH-MspI) PADA KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis)
SKRIPSI LIDIA PUSPA AGUSTIANI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
RINGKASAN LIDIA PUSPA AGUSTIANI. 2009. Identifikasi Keragaman Gen Hormon Pertumbuhan (GH-MspI) pada Kerbau Lokal (Bubalus bubalis). Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc. Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. Kerbau lokal (Bubalus bubalis) merupakan sumber plasma nutfah yang dapat dimanfaatkan dalam rangka meningkatkan ketersediaan pangan karena memiliki potensi besar sebagai penghasil daging. Perbaikan secara genetik merupakan usaha yang dapat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas kerbau yaitu dengan mencari keragaman gen yang memiliki kaitan erat dengan pertumbuhan. Salah satunya adalah gen hormon pertumbuhan (GH-MspI). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen hormon pertumbuhan (GH-MspI) intron 3 pada kerbau lokal dengan metode PCR-RFLP yang dapat dijadikan sebagai dasar informasi untuk melakukan seleksi. Penelitian ini dilaksanakan selama empat bulan di Laboratorium Zoologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sampel darah kerbau yang digunakan berjumlah 320 sampel yang diambil dari empat daerah, yaitu 75 sampel dari Semarang, 103 sampel dari Mataram, 65 sampel dari Medan dan 77 sampel dari Banten. Pengidentifikasian keragaman gen hormon pertumbuhan (GH-MspI) dilakukan menggunakan metode PCR-RFLP. Metode ini mendeteksi keragaman gen dengan memanfaatkan perbedaan runutan DNA yang bisa dikenali oleh enzim restriksi MspI. Total sampel yang berhasil diamplifikasi sebanyak 261 sampel dengan persentase keberhasilan sebesar 81,56%. Panjang fragmen hasil amplifikasi gen GH-MspI intron 3 adalah 327 pb dengan situs pemotongan pada posisi 104. Lokus GH-MspI pada kerbau lokal bersifat polimorfik dengan 3 genotipe, yaitu genotipe +/+ (223 pb dan 104 pb), genotipe +/- (327 pb, 223 pb dan 104 pb) dan genotipe -/- (327 pb). Frekuensi genotipe total yaitu +/+ (0,805), +/- (0,146) dan -/- (0,05) serta frekuensi alel total yaitu + (0,878) dan – (0,122). Genotipe +/+ dan tipe alel + memiliki frekuensi kemunculan yang paling besar pada tiap populasi. Nilai heterozigositas tertinggi terdapat pada populasi kerbau asal Semarang (0,562) dan terendah pada populasi asal Banten (0,093). Rata-rata heterozigositas dari semua populasi adalah 0,370. Nilai indeks fiksasi gen GH menunjukkan bahwa tidak terjadi fiksasi gen GH karena nilainya menyebar dan tidak sama dengan nol. Kata-kata kunci: Kerbau, Gen GH-MspI, PCR-RFLP
ABSTRACT Identification of Growth Hormone Gene (GH-MspI) in Local Buffalo (Bubalus bubalis) Agustiani, L. P., C. Sumantri and A. Farajallah The aim of this study was to identify polymorphism of buffalo’s growth hormone (GH-MspI) gene that localized in intron 3 using Polymerase Chain Reaction (PCR) – Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method. Total of the blood samples were 320 which is from Semarang, Medan, Mataram and Banten. Polymorphism in 261 samples were identified and revealed three genotypies that are 223 bp and 104 bp for the +/+ genotype; 327 bp, 222 bp and 104 bp for the +/genotype and 327 bp (no digestion) for the -/- genotype. Frequencies of the +/+ genotype and + allele were the highest in whole populations. Frequencies were 0.805 for +/+ genotype, 0.146 for +/- genotype, and 0.05 for -/- genotype. The frequency of + allele was 0.878. The frecuencies of + allele and +/+ genotype were the highest. The highest heterozygocities was 0.562 for Semarang population and the lowest was 0.093 for Banten population and the average heterozygocities for all populations detected was 0.370. Index fixation value of GH gene showed there was no gene fixation in all populations. Keywords: Buffalo, GH-MspI gene, PCR-RFLP
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN HORMON PERTUMBUHAN (GH-MspI) PADA KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis)
LIDIA PUSPA AGUSTIANI D14052429
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN HORMON PERTUMBUHAN (GH-MspI) PADA KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis)
Oleh LIDIA PUSPA AGUSTIANI D14052429
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 14 April 2009
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Dr. Ir. Cece Sumantri, M. Agr. Sc
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M. Si
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Ketua Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Luki Abdullah, MSc. Agr
Dr. Ir. Cece Sumantri, M. Agr. Sc
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 15 Agustus 1987 di Bogor. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan (Alm.) Bapak N. Walidi dan Ibu Lilis Djubaedah. Penulis menyelesaikan sekolah dasar pada tahun 1999 dari SD Negeri Ciriung 02, Cibinong. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2002 di SLTP Negeri 1 Cibinong dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun 2005 di SMA Negeri 3 Bogor. Penulis diterima sebagai mahasiswa pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2005. Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di organisasi dan kegiatan kemahasiswaan yaitu HIMAPROTER 2006/2007 dan 2007/2008, Uni Konservasi Fauna (UKF) 2005/2006 dan 2006/2007, dan Paduan Suara Fakultas Peternakan Graziono Symponia. Selain itu, penulis juga berperan aktif dalam berbagai kepanitiaan di Institut Pertanian Bogor.
KATA PENGANTAR Puji syukur Penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, taufik dan hidayah-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan studi, penelitian, seminar dan skripsi ini. Shalawat dan salam semoga senantiasa dicurahkan kepada Nabi Muhammad SAW. Skripsi dengan judul “Identifikasi Keragaman Gen GH-MspI pada Kerbau Lokal (Bubalus bubalis)” ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen hormon pertumbuhan (GHMspI) intron 3 pada kerbau lokal dengan metode PCR-RFLP yang dapat dijadikan sebagai dasar informasi untuk melakukan seleksi. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh sebab itu Penulis memohon maaf apabila terdapat kekurangan. Tak lupa ucapan terima kasih Penulis sampaikan kepada semua pihak yang turut membantu penyusunan skripsi ini, hanya Allah Yang Maha Pemurah dan Penyayang yang akan membalasnya. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi dunia pendidikan dan peternakan serta menjadi catatan amal saleh. Amin.
Bogor, April 2009
Penulis
DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN .........................................................................................
i
ABSTRACT ............................................................................................
ii
LEMBAR PERNYATAAN ....................................................................
iii
LEMBAR PENGESAHAN ....................................................................
iv
RIWAYAT HIDUP ................................................................................
v
KATA PENGANTAR ............................................................................
vi
DAFTAR ISI ...........................................................................................
vii
DAFTAR TABEL ...................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
xi
PENDAHULUAN ..................................................................................
1
Latar Belakang ............................................................................ Tujuan .........................................................................................
1 1
TINJAUAN PUSTAKA .........................................................................
2
Kerbau ......................................................................................... Populasi Kerbau di Indonesia ..................................................... Karakteristik Pertumbuhan Kerbau ............................................ Peternakan Kerbau di Indonesia ................................................. Gen Hormon Pertumbuhan (GH) ................................................. Analisis Keragaman DNA ...........................................................
2 3 4 4 5 6
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) .... Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) ...... Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) ....... Analisis Sekuen (Sequencing) ..........................................
6 6 7 7
..........................................................................................
8
Lokasi dan Waktu ....................................................................... Materi .......................................................................................... Sampel Darah dan Ekstraksi DNA ................................. Primer .............................................................................. PCR-RFLP ....................................................................... Elektroforesis .................................................................. Pewarnaan Perak ............................................................. Rancangan .................................................................................... Prosedur ...................................................................................... Pengambilan dan Penanganan Sampel ........................... Ekstraksi DNA dari Sampel Darah .................................. Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR-RFLP ............... Elektroforesis ....................................................................
8
METODE
8 8 8 8 9 9 10 10 10 11 11
Halaman Pewarnaan Perak............................................................... Pendeteksian Keragaman DNA ......................................
11 11
HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................
13
Amplifikasi Gen Hormon Pertumbuhan (GH-MspI) .................. Pendeteksian Keragaman Gen GH-MspI dengan PCR ............... Keragaman Gen GH-MspI Kerbau Lokal ..................................... Nilai Heterozigositas ................................................................... Indeks Fiksasi .............................................................................
13 14 16 17 18
KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................
19
Kesimpulan ................................................................................. Saran ...........................................................................................
19 19
UCAPAN TERIMAKASIH ...................................................................
20
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................
21
LAMPIRAN
25
..........................................................................................
DAFTAR TABEL Nomor
Halaman
1. Populasi Kerbau Terbanyak di 10 Propinsi Indonesia ....................
4
2. Hasil Perhitungan Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen GH-MspI ..................................................................................
16
3. Nilai heterozigositas (ĥ) dan Rataan Heterozigositas (Ĥ) Gen GH- MspI Kerbau Lokal...................................................................
17
4. Nilai Indeks Fiksasi Gen GH-MspI Kerbau Lokal ...........................
18
DAFTAR GAMBAR Nomor
Halaman
1. Pita DNA hasil elektroforesis setelah pewarnaan perak. Fragmen hasil amplifikasi PCR ditambah dengan enzim pemotong MspI. ...
12
2. Posisi Penempelan Primer (cetak tebal) pada sekuen Gen GH-MspI. Terjadi Mutasi pada Situs Pemotongan C|CGG pada Posisi 104 (C menjadi T)(Gordon et al., 1983).................................................
14
3. Hasil Pemotongan Fragmen Gen GH-MspI pada Gel Poliakrilamida 6% ..........................................................................
15
.
DAFTAR LAMPIRAN Nomor
Halaman
1. Modifikasi Metode Ekstraksi DNA Menggunakan Genomic DNA Mini Kit Geneaid ...........................................................................
26
2. Sekuen Gen GH-MspI yang diakses di GenBank (no. M57764) ....
27
PENDAHULUAN Latar Belakang Kerbau lokal (Bubalus bubalis) merupakan sumber plasma nutfah yang dapat dimanfaatkan dalam rangka meningkatkan ketersediaan pangan. Kerbau memiliki potensi besar sebagai penghasil daging. Tercatat bahwa pertambahan bobot badan kerbau yang digemukkan bisa mencapai 0,8 sampai 1 kg per hari yang berarti tidak kalah dengan pengemukkan sapi (Bahri dan Talib, 2007). Akan tetapi di Indonesia pemeliharaan ternak kerbau masih dilakukan secara tradisional serta hanya ditujukan untuk ternak kerja dan tabungan hidup. Hal ini mengakibatkan rendahnya pertumbuhan kerbau dan menurunnya populasi kerbau di Indonesia. Pertumbuhan populasi kerbau dari data statistik peternakan adalah sekitar 3,41% dengan jumlah total populasi 2,201 juta ekor. Perkembangan ternak kerbau di Indonesia selama 5 tahun terakhir menunjukkan terjadinya penurunan populasi pada tahun 2004 dan 2005 masing-masing sebesar 2,28% dan 11,43% dibandingkan dengan tahun sebelumnya (Direktorat Jenderal Peternakan, 2006). Upaya perbaikan pertumbuhan dapat dilakukan dengan seleksi untuk meningkatkan
kualitas
ternak
kerbau.
Kemajuan
teknologi
sekarang
ini
memungkinkan seleksi langsung pada DNA yang mengontrol sifat-sifat ekonomis. Keterkaitan antara keragaman DNA dengan sifat-sifat ekonomis ini dapat dijadikan dasar untuk melakukan metode MAS (Marker Assisted Selection). Metode MAS merupakan cara yang lebih unggul untuk melakukan seleksi
karena
dapat
mempercepat pengambilan keputusan dalam manajemen ternak. Gen hormon pertumbuhan (GH) merupakan salah satu gen yang berkaitan erat dengan pertumbuhan. Berdasarkan penelitian, gen hormon pertumbuhan (GH) berpengaruh terhadap produksi ternak. Oleh karena itu, hormon pertumbuhan merupakan kandidat gen yang dapat digunakan untuk penanda genetik dalam program seleksi kerbau. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen hormon pertumbuhan (GH-MspI) intron 3 pada kerbau lokal (Bubalus bubalis) pada populasi di Semarang, Mataram, Medan dan Banten dengan metode PCR-RFLP.
1
TINJAUAN PUSTAKA Kerbau Klasifikasi kerbau menurut Bhattacharya (1993) adalah kelas Mamalia, ordo Ungulata, famili Bovidae, sub familia Bovinae, genus Bubalus, dan spesies bubalis. Kerbau
termasuk dalam spesies Bubalus bubalis diduga hasil domestikasi dari
Bubalis arnee, kerbau liar dari India yang dijumpai pada daerah Assam. Ternak kerbau adalah ternak semi akuatik. Indonesia adalah habitat yang baik untuk ternak kerbau dimana 40% dari wilayah Indonesia beriklim tropis basah (Praharani dan Triwulanningsih, 2007). Kerbau diketahui memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan sapi. Diwyanto dan Handiwirawan (2006) menyatakan bahwa kerbau dapat hidup dalam kondisi pakan yang berkualitas rendah. Kemampuan ini menjadikan peternakan kerbau sangat baik untuk dikembangkan karena dengan input yang sedikit, kerbau masih dapat menghasilkan output yang tinggi. Selain itu, pemeliharaan kerbau yang masih ditujukan untuk ternak kerja sedikit demi sedikit harus diubah karena sudah dapat digantikan dengan mesin atau traktor. Dengan demikian potensi kerbau sebagai penghasil daging dapat lebih dioptimalkan dengan melakukan pemeliharaan yang sesuai. Berdasarkan karakteristiknya, kerbau dibagi menjadi dua, yaitu kerbau sungai dan kerbau lumpur (rawa). Kedua bangsa kerbau ini merupakan kerbau Asia yang telah didomestikasi dan memiliki jumlah pasangan kromosom yang berbeda, yaitu kerbau lumpur memiliki 48 kromoson dan kerbau sungai memiliki 50 kromosom. Perkawinan keduanya akan menghasilkan keturunan yang juga fertil baik pada ternak jantan maupun betina, hanya diduga bahwa daya reproduksi crossbred tersebut lebih rendah dibandingkan masing-masing tetuanya (Bahri dan Talib, 2007). Kerbau sungai menunjukkan kesenangan terhadap air mengalir yang bersih, sedangkan kerbau lumpur suka berkubang dalam lumpur, rawa-rawa dan air menggenang. Kerbau tipe lumpur biasa digunakan sebagai ternak kerja dan penghasil daging sedangkan kerbau sungai merupakan tipe penghasil susu (Hasinah dan Handiwirawan, 2006). Kerbau lumpur memiliki dua bentuk tanduk, yaitu bertanduk normal yang memanjang ke belakang lalu melengkung ke atas dan tanduk tergantung yaitu tanduk memanjang ke belakang dan mengarah ke bawah, sedangkan kerbau
2
sungai (Murrah) memiliki dua tipe tanduk yaitu tanduk normal melingkar ke atas membentuk spiral dan tanduk tergantung yaitu tanduk jatuh ke bawah lalu melengkung ke dalam (Asoen, 2008). Kerbau rawa memiliki beberapa ciri-ciri yang spesifik, diantaranya 1) warna kulit kerbau rawa pada umumnya abu-abu, 2) memiliki garis kalung (chevron), 3) memiliki unyeng-unyeng (whorls) yang terdapat di pinggang, dan 4) memiliki warna kaki putih dan hitam (Erdiansyah, 2008). Populasi Kerbau di Indonesia Ternak kerbau di Indonesia sebagian besar merupakan kerbau rawa (swamp buffalo) yang mencapai 95% dengan keragaman warna, ukuran dan tingkah laku yang besar pula. Sisanya sebanyak 5% termasuk kerbau sungai (river buffalo) yang banyak dipelihara di Sumatera Utara. Puslitbang Peternakan (2006) menyatakan bahwa ada kecenderungan populasi dan mutu genetik kerbau nasional menurun dari tahun ke tahun, karena sistem perkawinannya tidak menentu. Tabel 1. Populasi Kerbau Terbanyak di 10 Propinsi Indonesia Lokasi
Jumlah (ekor)
Nangroe Aceh Darussalam
340.031
Sumatera Utara
261.308
Sumatera Barat
211.008
Jawa Barat
156.570
Nusa Tenggara Barat
156.568
Banten
145.439
Nusa Tenggara Timur
141.236
Sulawesi Selatan
128.502
Jawa Tengah
123.826
Sumatera Selatan
103.577
Sumber : Direktorat Jenderal Peternakan (2006)
Data populasi kerbau di Indonesia yang diperoleh dari Direktorat Jenderal Peternakan (2006) menunjukkan bahwa rataan pertumbuhan populasi kerbau di Indonesia adalah sekitar 3,41% per tahun. Jumlah populasi kerbau di Indonesia adalah sebanyak 2,201 juta ekor yang menyebar hampir di seluruh propinsi tetapi tidak merata jumlahnya. Perkembangan ternak kerbau di Indonesia selama 5 tahun
3
terakhir menunjukkan terjadinya penurunan populasi pada tahun 2004 dan 2005 masing-masing sebesar 2,28% dan 11,43% dibandingkan dengan tahun sebelumnya. Sementara pada tahun 2003 dan 2006 terjadi peningkatan masing-masing sebesar 2,35% dan 3,41%. Karakteristik Pertumbuhan Kerbau Kerbau merupakan ternak yang lambat dewasa secara seksual, umur dewasa kelamin antara 2 sampai 3 tahun bergantung dari tipe, kondisi manajemen, perkawinan dan pakan. Kerbau dapat hidup sampai 15-20 tahun. Kerbau sungai memiliki bobot jantan dewasa antara 300–700 kg dan 250-650 kg pada betina, sedangkan kerbau lumpur jantan memiliki bobot dewasa 500 kg dan kerbau betina 400 kg dengan tinggi pundak jantan dan betina adalah 135 dan 130 cm (Fahimuddin, 1975). BPTP (2002) menyebutkan bahwa kerbau lumpur pada umur 1 tahun dapat mencapai bobot 195-200 kg, panjang badan 95,4-97,6 cm dan lingkar dada 135,7138,4 cm. Kerbau lumpur dewasa berumur 3 tahun mencapai berat badan 400-500 kg dengan panjang badan 128-138 cm dan lingkar dada 174,6-177,0 cm.
Kerbau
lumpur memiliki bentuk tubuh yang gempal, padat dan berisi yang membuktikan bahwa kerbau ini mampu mengubah pakan yang berkualitas rendah menjadi daging. Laju pertumbuhan kerbau terbilang lebih rendah dibandingkan dengan sapi, hal ini terkait dengan manajemen pemeliharaannya (Fahimuddin, 1975). Peternakan Kerbau di Indonesia Di Indonesia, pemeliharaan kerbau masih dilakukan secara tradisional, baik dalam pemberian pakan, perkandangan, pemeliharaan kesehatan, penggunaan tenaga ternak dan pemerahan serta pengolahan susu. Keterbatasan peternakan kerbau diantaranya adalah kualitas pakan yang rendah, terbatasnya pengetahuan peternak tentang reproduksi dan belum diterapkannya teknologi tepat guna. Beternak kerbau secara umum merupakan usaha turun temurun sebagai tabungan. Pertimbangan ekonomi masih jauh dari pertimbangan peternak kerbau, yang ada hanya kerbau dipelihara dan setelah besar akan dijual. Sistem pemeliharaan kerbau secara umum hanya dengan melepaskan kerbau di padang pengembalaan untuk memperoleh rumput dan hijauan lain. Kerbau tidak diberi makanan tambahan (konsentrat).
4
Pemeliharaan dan pemberian pakan anak kerbau, kerbau dara, kerbau laktasi, kerbau kering dan pejantan tidak dibedakan (Ibrahim, 2008). Gen Hormon Pertumbuhan (GH) Hormon pertumbuhan merupakan salah satu faktor yang paling penting dalam pertumbuhan dan perkembangan sel hewan (Pierzchała et al., 2004). Pada hewan yang sedang tumbuh, hormon pertumbuhan dapat meningkatkan efisiensi produksi, pengurangan deposisi lemak, merangsang pertumbuhan otot, meningkatkan efisiensi pertumbuhan pakan, meningkatkan pertumbuhan organ, dan meningkatkan pertumbuhan tulang (Etherton dan Bauman, 1998). Hormon pertumbuhan dibutuhkan untuk pertumbuhan jaringan dan metabolisme lemak yang berperan penting untuk reproduksi, laktasi, dan pertumbuhan tubuh (Burton et al., 1994; Ohlsson et al., 1998). Hubungan tersebut menjadikan hormon pertumbuhan sebagai salah satu kandidat gen yang dapat digunakan sebagai penanda genetik dalam program seleksi ternak. Walis et al. (1973) menyatakan bahwa bovine growth hormone (bGH) merupakan sebuah peptida tunggal dengan berat molekul 22 KDa. Lingappa et al. (1977) dan Wallis et al. (1973) menyatakan bahwa bGH disusun oleh 190 atau 191 asam amino dengan panjang sekuen nukleotida 2856 pb (Gordon et al., 1983) dan menurut Hediger et al., (1990) gen bGH terletak pada kromosom nomor 19. Gen bGH terdiri atas 5 ekson ( Gordon et al., 1983 dan Woychick et al., 1982). Cowan et al. (1989) dan Hilbert et al. (1989) mendeteksi situs keragaman untuk enzim restriksi MspI, situs keragaman GH-MspI terletak pada intron 3 dari gen hormon pertumbuhan pada posisi 1547 (Zhang et al., 1993). Dilaporkan bahwa keragaman gen GH-MspI pada babi berpengaruh positif terhadap laju pertumbuhan dan kualitas karkas (Pierzchała et al., 2004). Thomas et al. (2006) menyatakan bahwa pada sapi Brangus bergenotipe +/- (heterozigot) fragmen GH-MspI memiliki pengaruh positif terhadap pertambahan bobot badan harian dan karkas. Selain itu, genotip +/+ dan +/- framen GH-MspI berpengaruh positif pada sifat bobot badan dan kualitas daging (Unanian et al., 2000)Keragaman gen GH-MspI juga dilaporkan pada berbagai ternak meliputi sapi Holstein Beijing (Zhou et al., 2005); sapi Brahman muda (Beauchemin et al., 2006); sapi Pesisir, sapi Bali, sapi Limousin dan sapi Simmental (Jakaria, 2008).
5
Analisis Keragaman DNA Polimerase chain reaction (PCR) adalah suatu reaksi in vitro untuk menggandakan molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesa molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA tersebut dengan enzim polymerase dan oligonukleotida pendek sebagai primer dalam mesin thermocycler Metode ini berjalan secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Proses yang terjadi dalam mesin PCR melipti tiga tahap utama yaitu denaturasi (pemisahan untai ganda DNA), annealing (penempelan primer) dan ekstensi (pemanjangan primer). Proses dari mulai denaturasi, penempelan dan ektensi disebut sebagai satu siklus. Produk PCR dapat langsung divisualisasikan melalui proses elektroforesis dan dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Muladno, 2002). Keragaman DNA amplikon atau produk PCR bisa dilakukan dengan berbagai cara, antara lain RFLP, SSCP, DGGE dan sequensing. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) PCR-RFLP merupakan metode analisis lanjutan dari produk PCR. Metode PCR memanfaatkan perbedaan pola pemotongan enzim restriksi atau enzim pemotong yang berbeda pada tiap-tiap mikroorganisme. Analisis RFLP sering digunakan untuk mendeteksi lokasi genetik dalam kromosom yang menyandikan penyakit yang diturunkan (Orita et al., 1989) ataupun untuk mendeteksi adanya keragaman pada gen yang berhubungan dengan sifat ekonomis, seperti produksi dan kualitas susu (Sumantri et al., 2004; Sumantri et al., 2005). Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) PCR-SSCP merupakan salah satu metode analisis lebih lanjut yang memanfaatkan produk PCR. Metode PCR-SSCP merupakan metode yang handal dalam mendeteksi adanya mutasi secara cepat. Dalam analisis ini, sekuen mutasi dapat dideteksi dengan perubahan pola migrasi dari bentuk ikatan utas tunggal DNA pada gel poliakrilamida (Hayasi, 1991), yang disebut sebagai perubahan konformasi atau bentuk molekul. Pendeteksian dalam SSCP dipengaruhi oleh matriks gel, kondisi elektroforesis, panjang fragmen dan kandungan G+C (Nataraj et al., 1999).
6
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Elektroforesis yang dilakukan menggunakan gel poliakrilamida dengan gradien urea yang ditambah dengan formamida. Pemisahan dilakukan tanpa enzim restriksi dan sekuen bukan berdasarkan berat molekul. Teknik ini menggunakan dasar perbedaan stabilitas produk PCR. Dengan demikian sangat tergantung dari jumlah ikatan hidrogen yang ada dalam DNA tersebut (Suryanto, 2008). Analisis Sekuen (Sequencing) Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik ini berkembang setelah orang menciptakan mesin DNA sequencer. Pada prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme (Suryanto, 2008). Sequencing merupakan proses penentuan urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA atau RNA. Sequencing menghasilkan penggambaran linear simbolik yang disebut sekuens yang meringkas sebagian besar struktur tingkat atom atas molekul yang disekuensing. Sequencing DNA akan menghasilkan sekuens DNA yang digambarkan sebagai untaian abjad lambang nukleotida-nukleotida penyusun DNA (Muladno, 2002).
7
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan selama empat bulan, dimulai dari bulan September 2008 – Desember 2008. Lokasi penelitian ini adalah Laboratorium Zoologi Departemen Biologi, dan Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Sampel Darah dan Ekstraksi DNA Sampel darah kerbau yang digunakan berjumlah 320 sampel yang diambil dari empat daerah, yaitu 75 sampel dari Semarang, 103 sampel dari Mataram, 65 sampel dari Medan dan 77 sampel dari Banten. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit (Geneaid). Primer Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah mengikuti Mitra et al., (1995), yaitu forward 5’-CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3’ reverse 5’-TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3’ PCR – RFLP Bahan – bahan yang digunakan adalah air bebas ion steril, sampel DNA, MgCl2 2,5 mM (NEB), pasangan primer 25 ng/ml, enzim Taq polymerase (NEB) 5 unit/µl dan buffernya, , dNTP 10 nmol/µl, air destilata dan enzim restriksi (RE) MspI masing – masing dengan buffernya. Alat – alat yang digunakan antara lain tabung PCR, mesin thermocycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4), alat sentrifugasi, pipet mikro dengan tipsnya, vortex, dan power supply 500vA. Elektroforesis Bahan – bahan yang digunakan adalah air destilata steril, akrilamida 30%, 5 x TBE, TEMED (tetramethylendiamine) dan APS (ammonium persulfat) 10%, loading dye, dan marker.
8
Alat – alat yang digunakan antara lain dua lempeng kaca (20 x 16 cm) untuk cetakan gel, gelas ukur, tabung reaksi, sisir pencetak sumur, pipet mikro 2 µl dengan tipsnya dan power supply 500vA. Pewarnaan Perak Bahan – bahan yang digunakan adalah air destilata, CTAB (cetyltrimetil ammonium bromide), NH4OH, AgNO3, NaOH, Na2CO3, formaldehida dan asam asetat. Alat – alat yang digunakan antara lain nampan, gelas ukur, tabung Erlenmeyer, dan water-bath shaker. Rancangan Keragaman genotip pada masing – masing individu ternak dapat ditentukan melalui pita – pita DNA yang ditemukan. Frekuensi alel dihitung dengan rumus Nei (1987), sebagai berikut : 2nii + ∑nij 2n
xi = Dimana : xi
= Frekuensi alel i
nii
= Jumlah individu bergenotip ii
nij
= Jumlah individu bergenotip ij
n
= Jumlah individu sampel
Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA menggunakan rumus Nei (1987) : ĥ=
2n (1 - ∑xi2) (2n – 1)
Keterangan : ĥ
= Nilai heterozigositas lokus
xi
= Frekuensi alel i
n
= Jumlah individu sampel
Ragam
heterozigositas (Vsl( ĥ )) diantara individu dalam satu kesatuan
frekuensi alel populasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
9
Vsl( ĥ ) = {}
2 { 2(2n – 2)( ∑xi3 – (∑xi2)2 ) + ∑xi2 – (∑xi2)2 } 2n(2n-1)
dan SE diperoleh dari akar ragam heterozigositas (Nei, 1987). Rataan heterozigositas (Ĥ) dihitung dengan rumus sebagai berikut : r
ˆ = ∑ hˆ /r H j j=1
Keterangan : ĥj= derajat heterozigositas untuk lokus ke-j r = jumlah lokus yang diuji Ĥ = rataan heterozigositas Indeks fiksasi pada masing – masing populasi diperoleh dari persamaan :
FISki
X kii − X 2 ki = X ki (1 − X ki )
Keterangan : Xkii = Frekuensi genotipe homozigot alel i pada populasi ke-k Xki = Frekuensi alel i Prosedur Pengambilan dan Penanganan Sampel Sampel darah diambil melalui vena jugularis menggunakan jarum dan tabung vaccutainer berheparin. Ekstraksi DNA dari Sampel Darah Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit Geneaid (Lampiran 1).
10
Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR-RFLP Proses amplifikasi DNA secara umum menggunakan metode sebagai berikut: 2 µl sampel DNA dimasukkan kedalam tabung PCR, kemudian ditambah 0,2 µl primer. Larutan dalam tabung kemudian ditambah dengan premix yang terdiri dari 18,45 µl air destilata, 2,5 µl 10 x bufer, 2 µl 2,5 mM MgCl2, 0,2 µl dNTP 2mM, dan 0,15 µl enzim taq polymerase. Tabung kemudian diInkubasi pada mesin thermocycler dengan suhu annealing 620C. Produk PCR sebanyak 2 µl dipindahkan ke dalam tabung baru 0,2 ml dan ditambahkan dengan enzim restriksi MspI dan buffernya. Campuran tersebut diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37°C overnight. Elektroforesis Potongan DNA produk PCR dipisahkan dengan teknik elektroforesis gel polyakrilamida 6%. Gel dibuat dengan cara mencampurkan 12 ml air destilata, 4 ml 5 x TBE, 4 ml akrilamida 30%, 15 µl TEMED, dan 160 µl APS 10%. Sebanyak 2 µl produk PCR dilarutkan dalam loading dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tagangan konstan 220 v atau sampai pewarna bromtimol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak. Pewarnaan perak Pewarnaan perak (silver staining) dilakukan dengan langkah sebagai berikut: gel dimasukan kedalam larutan CTAB 0,2 g/200 ml air destilata selama 8 menit sambil digoyang, kemudian dicuci dengan air destilata selama 2 x 2 menit. Air tersebut dibuang dan ditambahkan larutan NH4OH selama 6 menit sambil digoyang. Kemudian dilanjutkan dengan larutan AgNO3 selama 10 menit sambil digoyang. Kemudian gel dicuci kembali dengan air destilata 2 x 2 menit. untuk memunculkan pita, gel direndam dalam larutan Na2CO3. Setelah pita muncul, ditambahkan larutan asam asetat. Pendeteksian keragaman DNA Setelah pewarnaan, akan muncul pita – pita DNA. Setiap pita DNA dibandingkan dengan marker untuk mengetahui panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel dibandingkan untuk menentukan genotipe pita DNA. Gambar di bawah
11
merupakan gambar pita-pita DNA yang menunjukkan genotipe kerbau. Kerbau memiliki genotipe +/+ apabila terdapat fragmen terpotong di panjang 223 pb dan 104 pb. Genotipe +/- apabila terdapat fragmen gabungan yaitu terdapat 3 pita di panjang 327, 223, dan 104 pb. Genotipe -/- apabila fragmen tidak terpotong, hanya terdapat 1 pita di panjang 327 pb. M
+/+
+/-
-/-
327 pb 223 pb 104 pb
Gambar 1. Pita DNA hasil elektroforesis setelah pewarnaan perak. Fragmen hasil amplifikasi PCR ditambah dengan enzim pemotong MspI.
12
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen Hormon Pertumbuhan (GH-MspI) Gen hormon pertumbuhan pada kerbau lokal berhasil diamplifikasi dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Primer yang digunakan yaitu pasangan primer berdasarkan penelitian Mitra et al. (1995) yang digunakan pada ternak sapi. Primer ini berhasil mengamplifikasi gen target sepanjang 327 pb di intron 3 dan ekson 4. Hasil amplifikasi disajikan pada Gambar 1.
400 pb 300 pb
327 pb
200 pb
100 pb Gambar 1. Hasil Amplifikasi Gen Hormon Pertumbuhan dengan PCR dalam Gel 6% Poliakrilamida Fragmen gen GH-MspI intron 3 dan ekson 4 sepanjang 327 pb dapat diketahui dengan mencocokkan pasangan primer pada sekuen gen GH pada GenBank (nomor akses M57764). Panjang fragmen ini berbeda 2 pb dengan hasil yang didapatkan oleh Zhou et al. (2005) yaitu 329 pb. Posisi penempelan primer dan titik mutasi pada intron 3 pada sekuen gen GH-MspI disajikan pada Gambar 2. Suhu annealing merupakan suhu yang memungkinkan terjadinya penempelan primer pada sampel. Suhu annealing sangat penting dalam proses amplifikasi karena proses pemanjangan DNA baru dimulai dari primer. Suhu annealing yang digunakan dalam penelitian ini adalah 620C, suhu ini merupakan suhu optimal untuk penempelan primer dan berbeda dengan suhu yang digunakan oleh Zhou et al. (2005) dalam penelitiannya yang menggunakan suhu annealing 600C. Hal ini mungkin saja
13
terjadi namun selama perbedaan suhu menghasilkan produk amplifikasi yang sama, maka kisaran suhu tersebut dapat digunakan. 1441 CCCCCACGGG CAAGAATGAG GCCCAGCAGA AATCAGTGAG TGGCAACCTC
GGACCGAGGA
forward 1501 1561 1621 1681 1741
GCAGGGGACC CTTCTCCCCG GGCAGGAGGT CCGACCACCC GTCGTGGCTT
TCCTTCATCC AGGTGGCGGA CCTCGGGCAG ACCTGCCAGC GGGCCCCTGC
TAAGTAGGCT GGTTGTTGGA AGGCCGACCT AGGACTTGGA AGTTCCTCAG
GCCCCAGCTC TGGCAGTGGA TGCAGGGCTG GCTGCTTCGC CAGAGTCTTC
CCGCA C|CGGC GGATGATGGT CCCCAGACCC ATCTCACTGC ACCAACAGCT
CTGGGGCGGC GGGCGGTGGT GCGGCACCCA TCCTCATCCA TGGTGTTTGG
reverse Gambar 2. Posisi Penempelan Primer (cetak tebal) pada sekuen Gen GHMspI. Terjadi Mutasi pada Situs Pemotongan C|CGG pada Posisi 104 (C menjadi T)(Gordon et al., 1983) Menurut Viljoen et al. (2005), keberhasilan dalam mengamplifikasi DNA bergantung pada interaksi komponen PCR dalam kosentrasi yang tepat. Beberapa hal yang umum dilakukan untuk optimasi PCR diantaranya adalah suhu penempelan primer, kosentrasi Mg2+, kosentrasi primer, dan kosentrasi DNA target. Selain itu, terdapatnya inhibitor yang dapat menghambat proses PCR harus dieliminasi semaksimal mungkin. Inhibitor yang biasa ditemukan mencemari PCR diantaranya adalah material organik, logam berat, lipid, hemoglobin dan urea. Pendeteksian Keragaman Gen GH-MspI dengan PCR-RFLP Metode restriction fragment length polymorphisms (RFLP) digunakan untuk mengidentifikasi keragaman gen GH-MspI pada kerbau lokal. Analisis RFLP mendeteksi keragaman dengan memanfaatkan perbedaan panjang fragmen DNA yang dipotong oleh enzim restriksi MspI. Enzim restriksi MspI mengenali situs pemotongan empat basa C│CGG. Cowan et al. (1989) and Hilbert et al. (1989) mendeteksi situs keragaman untuk enzim restriksi MspI, keragaman berlokasi di intron 3 dari gen GH pada posisi 1547 (Zhang et al., 1993). Terjadinya mutasi transisi yang merubah basa C – T menyebabkan situs pemotongan untuk enzim restriksi MspI berubah. Mutasi transisi yang terjadi karena adanya subtitusi antara basa Adenin dengan Guanin (Purin) atau antara basa Sitosin dengan Timin (Pirimidin) (Paolella, 1998). Diketahui bahwa titik mutasi gen GH-MspI berada pada daerah intron 3, daerah intron merupakan daerah non-coding karena pada saat transkripsi bagian ini
14
akan hilang (splicing). Mutasi yang terjadi pada sekuen yang tidak ditranskripsikan (intron) akan mengakibatkan silent mutation yaitu mutasi yang tidak mengakibatkan perubahan fenotipik. Selain itu, silent mutation juga dapat terjadi karena 1) mutasi yang terjadi tidak menyebabkan perubahan asam amino karena beberapa asam amino yang sama dikodekan oleh kodon yang berbeda, 2) mutasi tidak terjadi pada situs aktif protein (Paolella, 1998). Namun Funk (2001) menyatakan bahwa tingkat polimorfisme dan mutasi yang tinggi pada daerah non-coding diduga dapat mempengaruhi ekspresi gen secara tidak langsung. Mutasi pada intron dapat mengganggu proses spilicing, seperti tidak terpotongnya intron atau timbulnya splice site baru, hal ini yang akan menyebabkan terganggunya pengaturan ekspresi gen. Sebagai contoh, menurut Gunadi (2006) hampir 50% penyakit genetik pada manusia diakibatkan oleh mutasi yang mengganggu splicing dan salah satu contoh penyakitnya adalah ß-thalasemia. Terdeteksinya keragaman gen GH-MspI karena ditemukan 2 alel + dan dengan genotipe yaitu +/+, +/-, dan
-/-. Genotipe homozigot (+/+ dan -/-) berarti
bahwa kedua tetua masing-masing menyumbangkan gen (alel) yang sama dan genotipe heterozigot (+/-) merupakan kombinasi gen yang berbeda dari kedua tetua atau kromosom yang berpasangan. Ketiga jenis genotipe dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil Pemotongan Fragmen Gen GH-MspI pada Gel Poliakrilamida 6%
15
Keragaman Gen GH-MspI Kerbau Lokal Nei (1987) menyatakan bahwa suatu alel dikatakan polimorfik jika memiliki frekuensi alel sama dengan atau kurang dari 0,99(99%) atau dengan kata lain suatu alel dikatakan monomorfik jika frekuensi alel sama dengan atau kurang dari 0,01(1%). Frekuensi alel yaitu frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi atau jumlah suatu alel terhadap jumlah total alel dalam suatu populasi (Nei dan Kumar, 2000). Selain dengan mengetahui frekuensi alel, keragaman genetik juga dapat diukur secara akurat dengan nilai heterozigositas (Nei, 1987). Pendugaan nilai heterozigositas memiliki arti penting untuk diketahui karena dapat memberikan informasi mengenai tingkat polimorfisme suatu alel, serta prospek populasi dimasa yang akan datang (Falconer dan Macay, 1996). Berdasarkan hasil gen GH-MspI pada kerbau lokal bersifat polimorfik. Sejumlah 261 sampel dari 320 sampel berhasil diidentifikasi keragaman gen GHMspI dengan metode PCR-RFLP yang berarti persentase keberhasilannya sebesar 81,56%. Dari total sampel, kemunculan alel + sebesar 0,878 dan alel – sebesar 0,122. Frekuensi genotipe +/+ sebesar 0,805, genotipe +/- sebesar 0,146 dan genotipe -/sebesar 0,05. Frekuensi genotipe dan frekuensi alel gen GH-MspI secara lengkap disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil Perhitungan Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen GHMspI Lokasi
N
Frekuensi Genotipe
Frekuensi Alel
+/+
+/-
-/-
+
-
Semarang
52
0,750
0,077
0,173
0,788
0,212
Mataram
94
0,787
0,181
0,043
0,867
0,133
Medan
52
0,731
0,269
0
0,865
0,135
Banten
63
0,952
0,048
0
0,976
0,024
Total
261
0,805
0,146
0,05
0,878
0,122
Tabel diatas menunjukkan bahwa frekuensi genotipe +/+ tinggi di seluruh populasi dengan nilai tertinggi terdapat di populasi Banten (0,952) dan terendah di
16
populasi Medan (0,731). Frekuensi genotipe +/- tertinggi terdapat di populasi Medan (0,269) dan terendah di populasi Banten (0,048), sedangkan frekuensi genotipe -/tertinggi terdapat di populasi Semarang (0,173) dan terendah terdapat di populasi Medan dan Banten (tidak ditemukan genotipe -/-). Alel + juga memiliki frekuensi yang paling tinggi di setiap populasi, dengan frekuensi tertinggi terdapat pada populasi Banten (0,976) dan terendah pada populasi Semarang (0,788). Sebaliknya untuk alel -, frekuensi yang tertinggi terdapat pada populasi Semarang (0,212) dan terendah pada populasi Banten (0,024). Berdasarkan hasil perhitungan ini dapat diartikan bahwa kerbau lokal Indonesia berpotensi untuk dijadikan ternak pedaging karena berdasarkan beberapa penelitian menyebutkan bahwa genotip +/+ dan +/- framen GH-MspI berpengaruh positif pada sifat bobot badan dan kualitas daging (Unanian et al., 2000). Nilai Heterozigositas Nilai heterozigositas dari masing-masing populasi berkisar 0,093 – 0,562. Populasi Semarang memiliki nilai heterozigositas tertinggi dan populasi Banten terendah. Nilai heterozigositas total adalah 21,5 % dan nilai rataan heterozigositas dari seluruh populasi adalah 37%. Dapat dikatakan bahwa nilai heterozigositas di keseluruhan populasi rendah, karena menurut Javanmard et al., (2005) nilai heterozigositas di bawah 0,5 (50%) mengindikasikan rendahnya variasi suatu gen dalam populasi. Tabel 3. Nilai heterozigositas (ĥ) dan Rataan Heterozigositas (Ĥ) Gen GHMspI Kerbau Lokal ĥ ± SE
Ĥ
Semarang
0,562 ± 0,047
0,370 ± 0,039
Mataram
0,409 ± 0,036
Medan
0,417 ± 0,049
Banten
0,093 ± 0,026
Daerah
Total
0,215 ± 0,087
Berdasarkan penelitian Primasari (2009), nilai heterozigositas dari gen GHRH pada populasi kerbau lokal yang sama didapatkan hasil nilai heterozigositas total sebesar 46,1%. Hasil tersebut lebih besar dibandingkan dengan nilai yang
17
diperoleh pada penelitian ini yang berarti pelaksanaan usaha peternakan tradisional ternyata sejalan dengan upaya seleksi gen GH. Indeks Fiksasi Indeks fiksasi dapat digunakan untuk mengetahui pola perkawinan dan seleksi yang dilakukan dalam populasi. Indeks fiksasi bisa bernilai positif maupun negatif, hal tersebut dipengaruhi oleh adanya inbreeding, seleksi dan kawin tidak acak. Nilai indeks fiksasi gen GH-MspI kerbau lokal dari empat populasi di Indonesia disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Nilai Indeks Fiksasi Gen GH-MspI Kerbau Lokal Daerah
Alel
FISki
Semarang
+
0,7725
-
0,7665
+
0,3062
-
0,2195
+
-0,1475
-
-0,1561
+
-0,0245
-
-0,0246
Mataram Medan Banten
Nilai indeks fiksasi tertinggi adalah 0,7725 (alel +) yaitu pada populasi kerbau lokal Semarang. Sedangkan nilai indeks fiksasi terendah terdapat pada populasi Medan yaitu -0,1561 (alel -). Nilai indeks fiksasi menyebar dan tidak bernilai nol, hal ini menandakan bahwa tidak terjadinya fiksasi gen GH atau tidak mengarah ke salah satu tipe alel (perkawinan acak masih terjadi).
18
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Gen GH-MspI pada kerbau lokal bersifat polimorfik. Penelitian menemukan 2 tipe alel yaitu alel + (0,878) dan alel – (0,122) serta genotipe yaitu +/+ (0,805), genotipe +/- (0,146) dan genotipe -/- (0,05). Tipe alel + dan genotipe +/+ memiliki frekeunsi kemunculan yang paling besar pada tiap populasi. Tingginya frekuensi genotip +/+ menunjukan bahwa kerbau lokal diduga berpotensi untuk menjadi ternak pedaging karena genotip ini berpengaruh positif terhadap pertumbuhan bobot badan dan kualitas daging. Nilai heterozigositas total sebesar 21,5% dengan nilai terendah pada populasi Banten (9,3%) dan tertinggi pada populasi Semarang (56,2%). Nilai indeks fiksasi menyebar dan tidak bernilai nol yang berarti gen GH tidak terfiksasi tau masih terjadinya kawin acak. Saran Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui hubungan antara keragaman gen GH-MspI dengan sifat-sifat kuantitatif sehingga selanjutnya dapat dijadikan acuan untuk melakukan program seleksi dalam upaya memperoleh bibit unggul.
19
UCAPAN TERIMAKASIH Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Pada kesempatan ini pula penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.
Mama dan Alm. Bapak tercinta yang telah memberikan kasih sayang, nasehat, bimbingan dan pengorbanan yang begitu besar, kedua adik tersayang, Aditya Prabowo dan Fahmi Ramadhan serta beserta seluruh keluarga lainnya yang telah membantu hingga penulis dapat menyelesaikan studi di Fakultas Peternakan.
2.
Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si sebagai dosen pembimbing atas segala bimbingan, perhatian, motivasi dan arahan bagi penulis dalam penelitian dan skripsi ini.
3.
Dr. Ir. Heni Nuraeni, MSi dan Ir. Lilis Khotijah, MS sebagai dosen penguji sidang yang telah banyak memberikan saran dalam penyelesaian tugas akhir ini.
4.
Terima kasih Penulis ucapkan kepada teman-teman satu tim (Mira, Ires dan Wiwin), Grup Zoo (Pak Khoirul, Bu Bibah, Bu Ria, Kak Wildan, Kak Ogi, Mba Muli) dan Kak Eryk Andreas atas bimbingannya.
5.
Sahabat-sahabat tercinta “3G” (Asty, Tristy, Thata, Mpit dan Nenk) atas semua kebersamaan dan keceriaan selama berada Fakultas Peternakan, persahabatan yang telah terjalin semoga tak akan pernah terlupakan
6.
Personil maupun alumni Alcatraz (Aan, Othel, Windy, Trimi, Mbo, Asty, Mamah, Baqi, Mpus, Vina, Yuni dan Putri) yang telah menjadi kelurga selama di IPB.
7.
Seluruh teman-teman di IPTP 42 yang tidak bisa disebutkan satu per satu.
8.
Kak Vamy yang telah memberikan semangat serta kasih sayangnya selama ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi dunia peternakan Indonesia. Amin.
Bogor, April 2009
Penulis
20
DAFTAR PUSTAKA Asoen, N. J. F. 2008. Studi craniometrics dan pendugaan jarak genetik kerbau sungai, rawa dan silangannya di Sumatera Utara. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Bahri, S dan C. Thalib. 2007. Strategi pengembangan pembibitan ternak kerbau. Prosiding. Seminar dan Lokakarya Nasional Usaha Ternak Kerbau 2008. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan, Bogor. Balai Pengkajian Teknologi Peternakan. 2002. Dalam : Lendhanie, U. U. 2005. Karakteristik reproduksi kerbau rawa dalam kondisi lingkungan peternakan rakyat. J. of Bioscientiae vol. 2 (1):43-48. Beauchemin, V. R., M. G. Thomas, D. E. Franked dan G. A. Silver. 2006. Evaluation of DNA polymorphisms involving growth hormone relative to growth and carcass characteristics in Brahman steers. Genet. Mol. Res. 5:438-447. Bhattacharya. 1993. Dalam : W.G.A. Williamson dan W. J. A. Payne (Editor). Pengantar Peternakan di Daerah Tropis. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Burton, J. L., B. W. Mc Bride, E. Block dan D. R. Glimm. 1994. A review bovine growth hormone. Can. J. Anim. Sci. 74 : 167-201 Cowan, C. M., M. R. Dentine, R. L. Ax dan L. A. Schuler. 1989. Restriction fragment length polymorphism associated with growth hormone and prolactin genes in Holstein bulls: evidence for a novel growth hormone allele. Anim. Genet. 20 157–165 Direktorat Jenderal Peternakan. 2006. Statistik Peternakan 2006. CV Arena Seni, Jakarta. Diwyanto, K. dan H. Handiwirawan. 2006. Strategi pengembangan ternak kerbau: aspek penjaringan dan distribusi. Prosiding. Lokakarya Nasional Usaha Ternak Kerbau Mendukung Program Kecukupan Daging Sapi. 2006. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan, Bogor. Erdiansyah, E. 2008. Studi keragaman fenotipe dan pendugaan jarak genetik antara kerbau lokal di Kabupaten Dompu NTB. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Etherton, T.D. dan D.E. Bauman. 1998. Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals. Physical Rev., 78: 745-61. Fahimudin, M. 1975. Domestic Water Buffalo. Oxford dan IBH Publishing Co., New Delhi.
21
Falconer, D. S. Dan T. F. C. Mackay. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. Fourth Ed. Longman Inc., New York. Funk, D. 2001. Genetics technologies in the 1992. http//www.inform.umd.edu. [0203-2009]. Gunadi. 2006. Antisense oligonukleotide : potensial terapi penyakit genetik akibat gangguan splicing. http//www.inovasionline.com. [20-04-2009]. Gordon, D. F., D. P. Quick, C. R. Ewin, J. E. Donelson dan R. A. Maurer. 1983. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal gene. Mol. Cell. Endocrinol. 33:81–95 Hasinah, H. dan E. Handiwirawan. 2006. Keragaman genetik ternak kerbau di Indonesia. Prosiding. Lokakarya Nasional Usaha Ternak Kerbau Mendukung Program Kecukupan Daging Sapi 2006. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan, Bogor. Hayashi, K. 1991. PCR-SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA. PCR Methods Appl. 1:34-38. Hediger, R, S. E. Johnson, W. Barendse, R. D. Drinkwater, S. S. Moore dan J. Hetzel. 1990. Assignment of the growth hormone gene locus to 19q26-qter in cattle and to 11q25-qter in sheep by in situ hybridization. Genomics 8:171– 174. Hilbert, P., A. Marcotte, A. Schwers, R. Hanset, G. Vassart dan M. Georgens. 1989. Analysis of genetic variation in the Belgian Blue cattle breed using DNA sequence polymorphism at the growth hormone, low density lipoprotein receptor, a- subunit of glycoprotein hormones and thyroglobin loci. Anim. Genet. 20 383–394. Ibrahim, L. 2008. Produksi susu, reproduksi dan manajemen kerbau perah di Sumatera Barat. J. Peternakan vol. 5 (1) : 1-9. Jakaria. 2008. Keragaman genetik gen hormon pertumbuhan pada sapi Pesisir Sumatera Barat. Disertasi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Javanmard, A., N. Asadzadeh, M. H. Banabazi dan J. Tavakolian. 2005. The allele and genotype frequencies of bovine pituitary specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo populations using PCR-RFLP. Iranian journal of biotechnology vol. 39(2). Lingappa, V. R., T. A. Devillers dan G. Blobel. 1977. Nascent prehormones are intermediates in the biosynthesis of authentic bovine pituitary growth hormone and prolactin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:2432–2436.
22
Mitra, A., P. Schlee, C. R. Balakrishnan dan F. Pirchner. 1995. Polymorphisms at growth hormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo. J. Anim. Breed. Genet. 112: 71–74. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetik. Pustaka Wira Usaha Muda. Bogor. Nataraj, A. J., I. O. Glander, N. Kusukawa dan W. E. Highsmith Jr. 1999. SingleStrand Conformation Polymorphism and Heteroduplex Analysis for GelBased Mutation Detection. Electrophoresis 20:1177-1185. Nei, M. 1987. Molecular Evalutionery Genetics. Columbia University Press. New York. Nei, M and S. Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, Inc., New York. Ohlsson, C., B. A. Bengtsson, O. G. P. Isaksson, T. T. Andreassen dan M. C. Slootweg. 1998. Growth hormone and bone. Endocr. Rev. 19 : 55-79. Orita, M., H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi, dan T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2766-2770. Paolella, P. 1998. Introduction to Molecular Biology. Mc Graw Hill Companies, Inc., Boston, Massachusetts. Pierzchala, M., B. Tadeusz dan K. Jolanta. 2004. Growth rate and carcass quality in relation to GH/MspI and GH/HaeII PCR-RFLP polymorhism in pigs. Animal Science Papers and Reports vol. 22(1):57-64. Praharani, L dan E. Triwulanningsih. 2007. Karakterisasi bibit kerbau pada agroekosistem dataran tinggi. Prosiding. Seminar dan lokakarya nasional usaha ternak kerbau. 2008. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan, Bogor. Primasari, A. 2009. Identifikasi keragaman gen growth hormone-releasing hormone (GHRH) pada kerbau lokal (Bubalus bubalis) dengan metode PCR-RFLP. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. 2006. Studi karakterisasi kerbau sungai, kerbau lumpur dan persilangannya di Sumatera Utara, Jawa Tengah dan Jawa Timur. Badan penelitian dan pengembangan peternakan Departemen Pertanian, Bogor. http://www.deptan.com. [02-03-2009] Sumantri, C., A. Anggraeni, R. R. A. Maheswari, K. Dwiyanto, A. Farajallah, dan B. Brahmantiyo. 2004. Frekuensi gen kappa-kasein (κ-kasein) pada sapi perah FH berdasarkan produksi susu di BPTU Baturaden. Prosiding. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2004.
23
Sumantri, C., A. Anggraeni, R. R. A. Maheswari, K. Dwiyanto, dan A. Farajallah. 2005. Pengaruh genotipe kappa-kasein terhadap kualitas susu pada sapi perah FH di BPTU Baturaden. Prosiding. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2005. Suryanto, D. 2008. Melihat keanekaragaman organism melalui beberapa teknik genetika molekuler. Program Studi Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara. http://library.usu.ac.id. [0403-2009] Thomas, M. G., G. A. Silver dan R. M. Enns. 2006. Relationships of DNA polymorphisms in growth hormone (GH) to growth and carcass traits observed in a population of Brangus bulls with a larger number of sires. Int. Plant and Animal Genome XIV: P526 (Abstract). Unanian, M. M., C. C. Borreto, A. R. de Freitas dan C. M. T. Cordeiro. Association between GH gene polymorphism and weight traits in Nellore Novines. Rev. Bras zootec. 29 : 1380-1386. Viljoen, G. J., L., H. Nel, dan J. R. Crowther. 2005. Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer, Dordrecht, Netherland. Wallis, M. 1973. The primary structure of bovine growth hormone; FEBS Lett. 35: 11–14 Woychick, R. P., S. A. Camper, R. H. Lyons, S. Horowtts, E. C. Goodwin dan F. M. Rottman. 1982. Cloning and nucleotide sequencing of the bovine growth hormone gene. Nucleic Acids Res. 10:7197–7210. Zhang, H. M., K. C. Maddock, D. R. Brown, S. K. Denise dan R. L. Ax. 1993. A novel allele of the bovine somatotropin gene detected by PCR-RFLP analysis. J. Anim. Sci.71 2276. Zhou, G. L., H. G. Jin, S. L. Guo, Q. Zhu dan Y. H. Whu. 2005. Association of Genetic Polymorphism in GH Gene with Milk Production Traits in Beijing Holstein Cows; J. Biosci. 30 : 595-598.
24
LAMPIRAN
25
Lampiran 1. Modifikasi Metode Isolasi DNA Menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Geneaid) Sampel darah ↓ Sentrifugasi 3500 rpm, 10 menit Sel darah putih dipindahkan ke tabung 1,5 ml ↓ + Etoh absolut sampai 1 ml Masukkan ke freezer, 2 jam ↓ Sentrifugasi 7000 rpm, 10 menit Supernatan dibuang + TE sampai 500 μl ↓ Sentrifugasi 7000 rpm, 10 menit Supernatan dibuang + 1 x STE sampai 350 μl + 5 mg/ml proteinase K 10 μl ↓ Inkubasi 56°C, 1 jam + 10 % SDS 40 μl + Bufer GB 250 μl ↓ Inkubasi 70°C, 10 menit + Ethanol 250 μl ↓ Pindahkan ke GD Column ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 3 menit Cairan ditabung penampung dibuang + Bufer W1 400 μl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Cairan ditabung penampung dibuang + Bufer pencuci 600 μl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Cairan ditabung penampung dibuang Pindahkan GD Column ke tabung 1,5 ml ↓ + Bufer pengelusi 100 μl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Didapatkan cairan berisi DNA dalam tabung 1,5 ml
26
Lampiran 2. Sekuen Gen GH-MspI yang diakses di GenBank (no. M57764) LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM
REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL PUBMED COMMENT FEATURES source
gene mRNA
exon
CDS
intron
exon
intron
exon
intron
exon
intron
BOVGHGH 2856 bp DNA linear MAM 27-APR-1993 Bovine growth hormone gene, complete cds. M57764 M28453 M57764.1 GI:163091 growth hormone. Bos taurus (cattle) Bos taurus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos. 1 (bases 1 to 2856) Gordon,D.F., Quick,D.P., Erwin,C.R., Donelson,J.E. and Maurer,R.A. Nucleotide sequence of the bovine growth hormone chromosomal gene Mol. Cell. Endocrinol. 33 (1), 81-95 (1983) 6357899 Original source text: Bovine liver DNA. Location/Qualifiers 1..2856 /organism="Bos taurus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9913" /tissue_type="liver" join(649..723,971..1131,1359..1475,1703..1864,2138..2439) /gene="GH1" join(649..723,971..1131,1359..1475,1703..1864,2138..2439) /gene="GH1" /product="growth hormone" 649..723 /gene="GH1" /number=1 join(711..723,971..1131,1359..1475,1703..1864,2138..2338) /gene="GH1" /codon_start=1 /product="growth hormone" /protein_id="AAA30544.1" /db_xref="GI:163092" /translation="MMAAGPRTSLLLAFALLCLPWTQVVGAFPAMSLSGLFANAVLRA QHLHQLAADTFKEFERTYIPEGQRYSIQNTQVAFCFSETIPAPTGKNEAQQKSDLELL RISLLLIQSWLGPLQFLSRVFTNSLVFGTSDRVYEKLKDLEEGILALMRELEDGTPRA GQILKQTYDKFDTNMRSDDALLKNYGLLSCFRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF" 724..970 /gene="GH1" /number=1 971..1131 /gene="GH1" /number=2 1132..1358 /gene="GH1" /number=2 1359..1475 /gene="GH1" /number=3 1476..1702 /gene="GH1" /number=3 1703..1864 /gene="GH1" /number=4 1865..2137 /gene="GH1"
27
/number=4 2138..2439 /gene="GH1" /number=5
exon
ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821
gtactggggt tgagtctcct cttctgctgc agacagcagc ttgccatttc tccgaccctc ctcgcttctg ccctgtgtgc gacatgaccc ttagcacagg ggagagagag aggacccagt caggtaagct ctgccgatgg ctacacccag ggggctggca ctctccctag actcaggtgg ctccgggctc cgagggatgc agtgggagga gcagaaacgg caccagctta gacagagata cccccacggg gcaggggacc cttctccccg ggcaggaggt ccgaccaccc gtcgtggctt cacctcggac gcgggtgggg cttagccagg agcagtccag ttctccaagc ggcccttcgg ggctgggcag cgcgctgctc gacgtacctg gccagccatc ccactgtcct ctattctggg ggcatgctgg cctcctgggc cctggttctt caatcccacc aaacctagcc agagaaaatg
gggttgcctt gcatttgcag tgctgctgct ccaccaggtc ctcctccaat agcgacccca ctacctcccc acagccctct cagagaagga ctgccagtgg aagaagccag tcaccagacg cgctaaaatc atgtgttcag acatttggcc ggagatcagg gcccccggac tgggcgcctt agcacctgca gtcctagggg aactgaggag gggtgtgtgg gacctgggtg ctccatccag caagaatgag tccttcatcc aggtggcgga cctcgggcag acctgccagc gggcccctgc cgtgtctatg atggcgttgt agaatgcacg ccttgaccca ctgtagggga cctctctgtc atcctcaagc aagaactacg agggtcatga tgttgtttgc ttcctaataa gggtggggtg ggatgcggtg cagaaagaag agttccagcc cgctaaagta tccaagagtg cctccaacat
tctcttctcc ctagattctt gctaagttgc cccgtccctg gcatgaaagt tggactgcag tttaaaaaga ggctggtggc acgggaacag tccttgcata ggtataaaaa actcagggtc ccctccattc agctttgggc aagtttgaaa cgtctagctc ctccctgctc cccagccatg tcagctggct tggggaggca ttcagccgta ggtggggagg ggtgtgttct aacacccagg gcccagcaga taagtaggct ggttgttgga aggccgacct aggacttgga agttcctcag agaagctgaa gggtcccttc tgggcttggg ggggaaacct gggtggaaaa tctccctccc agacctatga gtctgctctc agtgccgccg ccctcccccg aatgaggaaa gggcaggaca ggctctatgg caggcacatc ccactcatag cttggagcgg ggaagaaatt gtgaggaagt
aggggattta tacggctgag ttcagtcgtg ggattctcca gaaaagtgaa ccttccagaa aaacctatgg agtggagacg gatgagtgag aatgtataga tggcccagca ctgtggacag gcgtgtccta tttagggctt tgttctcagt cctggggccc ctggctttcg tccttgtccg gctgacacct ggaaggggtg ttttatccaa gttccgaata tcccccagga ttgccttctg aatcagtgag gccccagctc tggcagtgga tgcagggctg gctgcttcgc cagagtcttc ggacctggag catgtggggg gagacagatc tttccccttt tggagcgggc ttggcaggag caaatttgac ctgcttccgg cttcggggag tgccttcctt ttgcatcgca gcaaggggga gtacccaggt cccttctctg gacactcata tctctccctc aaagcaagat aatgag
tctgacccag ccacctggga tccgacctgt ggcaagaaca agtgaagtca tggggtgcca ggtgggctct ggatgatgac aggaggttct gcacacaggt gggaccaatt ctcaccagct aaggggtaat ccgaatgtga ccctggaggg tccgtcgcgg ccctgctctg gcctgtttgc tcaaagagtt aatccacacc gtagggatgt aggcggggag gcgcacctac cttctctgaa tggcaacctc ccgcaccggc ggatgatggt ccccagaccc atctcactgc accaacagct gaaggcatcc ccatgcccgc cctgctctct tgaaacctcc aggagggagc ctggaagatg acaaacatgc aaggacctgc gccagctgtg gaccctggaa ttgtctgagt ggattgggaa gctgaagaat tgacacaccc gctcaggagg cctcatcagc aggctattaa
ggattgaacc agcccattcg gcgacgccat ttggagtggg ctcagttgtg ttgccttctc caagctgaga aagcctgggg aaattatcca ggggggaaag ccaggatccc atgatggctg gcggggggcc acataggtat aagggtaggt ccctcctggt cctgccctgg caacgctgtg tgtaagctcc ccctccacac ggttagggga gggaaccgcg atcccggagg accatcccgg ggaccgagga ctggggcggc gggcggtggt gcggcaccca tcctcatcca tggtgtttgg tggccctgat cctctcctgg ccctctttct ttcctcgccc tgctcctgag gcaccccccg gcagtgacga ataagacgga ccttctagtt ggtgccactc aggtgtcatt gacaatagca tgacccggtt tgtccacgcc gctccgcctt ccaccaaacc gtgcagaggg
//
28
