Explantátová kultura Trifolium pratense L

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Explantátová kultura Trifolium pratense L.

Jana Šnajdrová

Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jaroslav Dušek, CSc. Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Marie Kašparová, Ph.D. Oponent:

1

Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s pouţitím uvedené literatury.

Hradec Králové 15. května 2006

2

Děkuji PharmDr. Marii Kašparové, Ph.D. za odborné vedení v celém průběhu zpracovávání diplomové práce. Zároveň děkuji za poskytnutí literárních podkladů a také mnohých cenných rad a připomínek.

3

1. ÚVOD Kultivaci rostlinných tkání a buněk v podmínkách in vitro je věnována v posledních letech stále větší pozornost. Explantátové kultury byly zprvu pouze vědeckým

experimentem,

dnes

jsou

perspektivním

zdrojem

pro produkci

sekundárních metabolitů a pouţívají se v rozmnoţování a šlechtění rostlin. Získávání obsahových látek prostřednictvím kalusové kultury má mnohé výhody a některé z těchto látek jsou vyuţívány ve farmacii, kosmetice či parfumerii, diagnostice a dalších odvětvích. I přes mnohá pozitiva této produkce zůstává stále náročné zaloţit a udrţovat tyto kultury, neboť jejich růst stejně jako produkce obsahových látek je ovlivněna řadou faktorů. Přesto je moţné díky pravidelnému pasáţování za splnění určitých nároků udrţovat kultury v podmínkách in vitro neomezeně dlouho. Zřejmý je stoupající zájem o produkci flavonoidů a isoflavonoidů rostlinnými explantáty, coţ souvisí s širokým spektrem biologických účinků těchto látek [1-7]. Velmi nadějným zdrojem těchto sekundárních metabolitů je jetel luční (Trifolium pratense L., Fabaceae), k jehoţ dalším obsahovým látkám patří např. třísloviny, kumariny, saponiny, kyanogenní glykosidy, fenolické glykosidy. Je pouţíván v lidovém léčitelství, například zevně jako koţní dezinficiens na ekzémy nebo ve formě nálevu k úpravě stolice při průjmech a jako expektorans. Dále je také významnou hospodářskou plodinou. Jetel je v poslední době předmětem mnohých studií

snaţících

se

objasnit

přínos

podávání

extraktů

z drogy

u

ţen

v postmenopauzálním období. Pozitivní působení zatím nebylo jednoznačně potvrzeno. Na straně jedné některé studie dokazují ústup symptomů jako návaly, noční pocení a také příznivé účinky na redukci kostní hmoty a hladinu lipidů, jiné studie tyto účinky u postmenopauzálních ţen neprokázaly [8-11].

4

2. CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo seznámit se s metodikou kultivace rostlinných explantátových kultur, odvodit kalusovou kulturu z klíční rostliny čtyř odrůd Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint), optimalizovat ţivné médium a na základě růstové a produkční charakteristiky stanovit vhodný subkultivační interval pro kultivaci této kultury.

5

3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Jetel luční (Trifolium pratense L., Fabaceae)

3.1.1. Popis rostliny, výskyt Trifolium pratense je ve své anatomické stavbě velmi proměnlivý druh. Odlišnosti nacházíme ve vzrůstu rostlin, odění lodyh a dále u palistů podpůrných listů. V ČR se na celém území vyskytuje velmi hojně, od níţin po horské oblasti. Rozšířen je téměř po celé Evropě. Zavlečený, zdomácnělý a pěstovaný je ve východní Asii, severní a jiţní Americe, v Austrálii, na Novém Zélandu a v jiţní Africe. V některých oblastech vytváří morfologicky diferencované rasy, označované obvykle jako subspecies nebo variety [12-14]. Je to vytrvalá (u některých kulturních forem jen 2 aţ 3letá) bylina s mohutným kořenovým systémem, jehoţ základem je silný kůlovitý kořen sahající i přes 60 cm do půdy. Z trsnatého oddenku bez výběţků vyrůstá přízemní růţice listů. Lodyhy mající 3-5 článků jsou přímé, vystoupavé aţ poléhavé, jednoduché nebo spoře rozvětvené, 20 aţ 50 cm vysoké, většinou trochu hranaté. Jsou bělavě chlupaté nebo téměř lysé, často načervenalé. Listy jsou trojčetné střídavé, spodní dlouze řapíkaté, hořejší s řapíky kratšími aţ přisedlé, s palisty. Listy jsou sloţené z lístků v průměru 7-15×15-30 mm velikých, téměř celokrajných, obvejčitých aţ široce okrouhlých, na líci lysých a s příčnou bělavou nebo červenohnědou skvrnou ve tvaru půlměsíce. Na spodní straně jsou přisedle chlupaté a na okraji brvité. Palisty má vejčitě kopinaté, ostře špičaté, s řapíkem listu vysoko srostlé a vně chlupaté. Na stonku vyrůstají hlávkovitá květenství měřící v průměru 2 aţ 3 cm, přičemţ na jedné lodyze bývají 1-3 květenství rozmístěná tak, ţe postranní vyrůstají v paţdí listů a hořejší je zdánlivě vrcholové. Jsou kulatá nebo vejčitá, polozakrytá velikými palisty podpůrných listů. Tato květenství se skládají z drobných, červených, karmínově růţových nebo řidčeji vybledlých aţ bílých kvítků v počtu 30 aţ 60. Pětičetné 13 aţ 18 mm dlouhé oboupohlavné kvítky jsou přisedlé, bez listenců, přímé, sloţené z

6

desetiţilného kalichu a ze spodu srostlé motýlovité koruny. Kalich je tvaru trubkovitě zvonovitého, zbarvený bělozeleně nebo načervenale, vně je krátce chlupatý a má dolní zub delší. Koruna má horní plátek (pavéza) delší neţ oba postranní plátky (křídla) a ty jsou delší neţ dva spodní srostlé v tupý člunek. Plodem je nepukavý, vejčitý, tence blanitý, jednosemenný lusk otevírající se víčkem. Semena jsou nesouměrně srdcovitá, hladká, lesklá, zploštělá, ţlutá aţ pískově hnědá o rozměrech 1,5-2,0 mm x 1,2-1,5 mm. Mají zřetelně vyznačenou rýhu [8,12,13,15,16].

7

Jetel luční roste na loukách, v příkopech, na okrajích lesů či ve světlých lesích a je rovněţ pěstován na polích jako hospodářská plodina v různých vyšlechtěných odrůdách. Poskytuje píci bohatou bílkovinami a minerálními látkami. Roste v mírně vlhkém prostředí, nesnáší sucho, ale ani příliš velké vlhko. Je to významná medonosná rostlina. Opylení obstarávají hlavně čmeláci a někteří motýli, neboť ostatní hmyz má většinou kratší sosák, neţ je zapotřebí [8,12-16].

3.1.2. Odrůdy V České republice nacházíme tři poddruhy, které bývají někdy hodnoceny jako odrůdy. Řadíme tam

Trifolium pratense subsp. pratense, vytrvalá bylina

s významem léčivé rostliny; subsp. sativum, většinou 2-3letá bylina, která je významnou hospodářskou plodinu a subsp. americanum. Tento posledně jmenovaný vytrvalý poddruh k nám byl dovezen v 80. letech 19. století, ale od jeho pěstování bylo později upuštěno[12].

3.1.3. Sběr, úprava, použití Trifolium pratense kvete od května do října. Jako droga se pouţívají nerozpadlé hlávky – Trifolii pratensis flos. (Droga není oficinální v ČL 2002 ani v jeho Doplňcích.) Sbírají se v počátku květu. Odkvétající droga je méně hodnotná, jelikoţ hlávky při sušení hnědnou a rozpadají se. Droga se suší rychle v tenkých vrstvách. Je moţno ji na jeden den vystavit přímému slunci a poté ji dosušit na stinném a vzdušném místě. Pokud sušíme umělým teplem, pak by neměla být teplota sušení větší neţ 35°C. Poměr seschnutí se udává asi 6:1. Během skladování je třeba drogu chránit před vlhkostí a světlem, neboť je značně náchylná ke změně kvality. Kvalitní droga si zachovává původní barvu, případně nepatrně ztmavne, barva se ale nesmí změnit do rezavé [8,16-19].

8

Uţívá se v lidovém léčitelství proti průjmům, jako expektorans při bronchitidě, při revmatismu, na oteklé lymfatické ţlázy a při cukrovce; zevně pak např. ve formě koupelí jako koţní dezinfekce na exémy a hnisavé rány, rovněţ i k léčbě lupénky. Nejčastěji se uţívá ve formě nálevu [8,10,11]. Dnes se uţívá i jako korigens chuti a vůně do čajových směsí. Je součástí mnohých potravních doplňků na zmírnění projevů menopauzálních potíţí. Mladý jetel je moţno podobně jako špenát pouţívat i jako zeleninu bohatou na vlákninu [13,16].

3.1.4. Obsahové látky Spektrum obsahových látek je poměrně široké. Zahrnuje flavonoidy, isoflavonoidy, třísloviny, saponiny, kumariny, kyanogenní glykosidy, fenolické glykosidy, organické kyseliny, minerální kyseliny, barviva, silice, salicyláty, βsitosterol, cholin, lecitin, vitaminy (vitamin A, C, B-komplex), vápník, hořčík, ţelezo. Z hlediska vyuţití Trifolium pratense v terapii se jeví jako nejzajímavější skupina isoflavonoidů zahrnující biochanin A a formononetin, které jsou v jeteli zastoupeny nejvíce, a dále daidzein, genistein, genistin, koumestrol, ononin, trifoliol [11,20].

3.1.4.1. Flavonoidy V dnešní době známe více neţ 4000 flavonoidních látek a stále se nacházejí další sloučeniny tohoto typu. Flavonoidy jsou deriváty fenylchromanu. Základem je chroman arylovaný v poloze 2 (flavany), 3 (isoflavany) nebo 4 (neoflavany). Nejčastěji se vyskytují flavany, méně často isoflavany; neoflavany se vyskytují vzácně a jsou bez terapeutického významu. Všechny tři kruhy bývají hydroxylovány a methoxylovány, jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Právě podle stupně oxidace pyranového kruhu se flavonoidy dělí do několika skupin (flaveny, flavany,

9

flavanoly, flavandioly, flavony, flavonoly flavanony, flavanonoly). Flavonoly jsou nejhojnější skupinou flavonoidů zastoupených v ovoci a zelenině, nejběţnějšími zástupci jsou potom kvercetin a kemferol. V rostlinách se flavonoidy vyskytují většinou glykosidně vázané, rozpuštěné v buněčné šťávě vakuoly. Lipofilnější methoxylované deriváty se nacházejí v silicích. V rostlinách se pravděpodobně účastní oxidačně-redukčních pochodů a chrání je tak před volnými radikály. Další funkcí flavonoidů v rostlinách je vábení opylovačů a ochrana před UV zářením. Aglykony flavonoidních glykosidů vznikají dvěma hlavními cestami. Šestiuhlíkový fragment je odvozen z acetátového metabolismu a zbývající devíti-uhlíkatá část z kyseliny šikimové. Meziproduktem biosyntézy je patnácti-uhlíkatý chalkon (vzniklý z kyseliny skořicové a tří molekul acetátu), který je přetvářen na flavanon a tak dává základ i dalším strukturám flavonoidů. Účinné jsou glykosidy i aglykony. Mohou se pouţívat v čistém stavu, častěji ale jako drogy nebo extrakty. Terapeutické vyuţití je zaloţeno na schopnosti flavonoidů normalizovat permeabilitu kapilár a odstraňovat jejich lomivost. Působí tak antihemorhagicky a antiedematózně (P vitaminový účinek). Jsou inhibitory řady enzymů včetně hyaluronidázy, brání šíření mikrobiálních toxinů tkáněmi a mohou být tedy podpůrnými prostředky při léčení infekčních nemocí. Některé působí diureticky, rozšiřují cévy a sniţují krevní tlak. Potencují účinek vitaminu C. Mají i aktivitu hepatoprotektivní, spasmolytickou, hypocholesterolemickou, antibakteriální a antivirovou. S Ca2+ ionty tvoří komplexní soli a brání tímto mechanismem sráţení krve a zadrţují vápník v těle. Flavonoidy

představují

významný

prvek

antioxidačního

systému.

Antioxidační aktivita flavonoidů je závislá na strukturních aspektech molekuly, zejména počtu a poloze hydroxylových skupin v molekule, vliv má i jejich glykosylace. Optimální radikálově likvidační vlastnosti byly nalezeny pro odihydroxy strukturu v kruhu B, 2,3 dvojnou vazbu a 4-oxo funkční skupinu v kruhu C a 3 a 5-hydroxyskupiny na kruzích A a C. Tuto strukturu mají právě flavonoly. Zabraňují peroxidaci lipidů, likvidují volné kyslíkové radikály, mohou vázat a inaktivovat některé prooxidační ionty (ţelezo, měď). Flavonoidy vzhledem k této aktivitě mohou významným způsobem působit při prevenci chorob, na nichţ se významným

způsobem

podílí

oxidační

poškození

biologických

struktur

(atheroskleróza, kardiovaskulární onemocnění). Vhodný způsob stravování a příjem

10

potravin s vyšším obsahem flavonoidů by mohl pomoci při léčbě těchto chorob a jejich předcházení [21,22,23].

3.1.4.2. Isoflavonoidy Isoflavonoidy jsou odvozené od 3-fenylchromanu, jeví tedy podobnost s flavonoidy (deriváty 2-fenylchromanu), ke kterým jsou také jako zvláštní skupina řazeny. U rostlin jsou ale na rozdíl od flavonoidů mnohem méně zastoupeny. To je dáno

přítomností

specifického

enzymu

zodpovědného

fenylchromanového cyklu na 3-fenylchroman. Isoflavonoidy

za

přeměnu

2-

jsou tak téměř

specifickými obsahovými látkami čeledi Fabaceae. Vzácně je lze nalézt i v některých dalších čeledích, jako například Iridaceae, Myristicaceae, Rosaceae [24,25]. Nejčastěji se vyskytující skupinou těchto sekundárních metabolitů rostlin jsou isoflavony, které se v rostlině nacházejí častěji ve volné formě a méně často glykosidicky vázané. Nejvýznamnějšími zástupci z více neţ 360 zatím popsaných isoflavonů jsou genistein, daidzein, formononetin a biochanin A [25]. O významu isoflavonoidů v rostlině se zatím příliš neví. Pravděpodobně jsou produkovány jako odpověď na infekci patologickým agens (fytoalexiny) a mohou tak představovat jeden z obranných mechanismů rostliny [24]. Isoflavonoidy lze izolovat z většiny rostlinných tkání; v klíčcích, mladých výhoncích a pupenech se vyskytují více. Z toho se usuzuje, ţe by mohly zasahovat do regulace fyziologických procesů důleţitých pro rostlinný růst [26,27]. Nejvýznamnějším zdrojem isoflavonoidů je sója a sojové produkty. Ostatní luštěniny (fazole, hrách) tyto látky obsahují také, v kvantitativním vyjádření je jich zde ale mnohem méně [25]. Dále byly nalezeny v olejnatých semenech, obilninách, ovoci, zelenině, kávě nebo čaji [28]. Isoflavony patří k nejvýznamnějším představitelům tzv. fytoestrogenů. Jsou to rostlinné látky, které přestoţe nemají steroidní strukturu, vyznačují se slabými estrogenními účinky [29]. Někdy se také označují jako selektivní modulátory estrogenových receptorů (SERM). Působí tedy jako slabé estrogeny, ovšem zároveň

11

mohou narušovat funkci endogenních receptorů v lidském organismu, vykazují tedy i estrogen antagonistický účinek. Dnes rozlišujeme dva typy estrogenních receptorů (ER); ER-α – nachází se převáţně v děloze, mléčných ţlázách a hypofýze a ER-β – exprimován v řadě tkání jako například v mozku, kostech, močovém měchýři a thymu [29-32]. Při působení na tkáně se u isoflavonů uplatňuje poněkud slabší vazba na estrogenní receptory ER-β v důsledku strukturní podobnosti s endogenním 17βestradiolem, který ale sám působí převáţně na ER-α receptorech [33-37]. Isoflavonoidy mohou zasahovat do dalších procesů pomocí mechanismů jako inhibice tyroxinkinas, ovlivnění hladiny lipidů, syntézy proteinů, angioneogeneze a buněčné apoptózy. Významné jsou i vzhledem k fenolickému charakteru molekuly účinky antioxidační, antialergické, antibakteriální [25,28,29].

12

3.2. Rostlinné explantáty První pokusy zabývající problematikou rostlinných explantátů, provedl Haberlandt (1902), který bohuţel pracoval s diferencovanými buňkami. Negativní výsledky jeho pokusů vedly k různým modifikacím média a podmínek kultivace. Teprve volba meristematických buněk místo vysoce diferencovaných dala pozitivní výsledky. První Hannig (1904) a aţ dlouho po něm další - Dietrich (1924), Thukey (1933) úspěšně kultivovali rostlinná embrya. První neomezeně rostoucí kalusové kultury odvodili z kambia Nobecourt (1937) a Gautheret (1938). Těchto výsledků dosáhli nezávisle na sobě. V 50. letech došlo k vývoji aparatur. Byly pouţívány různé druhy třepaček (Muir - 1954), White (1953) vyvinul roler, Nickell a Tulecke (1960) pracovali se suspenzemi rostlinných buněk ve fermentačních aparaturách [38]. Na počátku byly rostlinné kultury in vitro pouze vědeckým experimentem, v současné době je tato metoda vyuţívána k produkci sekundárních metabolitů a ve šlechtitelství.

3.2.1. Obecná charakteristika Rostlinný explantát - kaţdý fragment ţivého pletiva, orgán nebo komplex orgánů, odebraný buď z intaktní rostliny nebo z jiţ existující kultury s cílem pěstovat jej v podmínkách in vitro Intaktní rostlina - původní rostlina pěstovaná v přirozených podmínkách Kultivace in vitro - pěstování rostlinného materiálu v podmínkách co nejúplněji

definovatelných po stránce chemické i fyzikální a zabraňujících

neţádoucí kontaminaci cizorodými ţivými organizmy a buňkami Kultura rostlinných explantátů - rostlinné explantáty pěstované po určitou dobu v podmínkách in vitro. Kultury rostlinných explantátů lze podle morfologické charakteristiky zařadit do některé z následujících pěti kategorií:

13

1. Kultura orgánová - orgánové systémy, orgány resp. jejich základy nebo části pěstované v podmínkách in vitro způsobem, který umoţňuje diferenciaci a částečně zachovává i jejich stavbu a funkci 2. Kultura tkáňová - do různého stupně soudrţné, morfologicky dezorganizované mnohobuněčné komplexy tkáně, pomnoţované buď na polotuhých či pevných nosičích, nasycených ţivným médiem nebo výjimečně v tekuté ţivné půdě 3. Kultura suspenzní - volné buňky a buněčné shluky společně pomnoţované, suspendovány v tekuté ţivné půdě, promíchávané a provzdušňované 4. Kultura buněčná - volné jednotlivé buňky, resp. jejich nejbliţší potomstvo, pomnoţované v tekuté či polotekuté půdě nebo na nosiči nasyceném ţivnou půdou 5. Kultura protoplastů - kultura buněk zbavených buněčných stěn, kde buněčný obsah je obalen jen pruţnou elastickou plasmalemou Primární explantát - rostlinný explantát odebraný přímo z intaktní rostliny Primární kultura - kultura primárních explantátů Subkultivace, pasážování - přenos celé kultury nebo její části (inokula) do čerstvé ţivné půdy s cílem obnovit, zachovat nebo zesílit růst kultury Rozpadavost kultur - schopnost tkáňových či suspenzních kultur spontánně se rozpadat na buněčné shluky a volné buňky, schopné dalšího růstu, resp. pomnoţování Kalus, zával - v původním významu neorganizované pletivo, vzniklé činností sekundárních meristémů po poranění rostliny, v přeneseném významu pletivo, které vzniká na povrchu nenádorových primárních explantátů a je schopné subkultivace Kalusová kultura - kultura kalusu in vitro [38,39] .

14

3.2.2. Vlastnosti rostlinných kultur Rostlinné kultury lze odvodit z buňky či komplexu buněk pletiva kteréhokoliv orgánu rostlinného těla (s výjimkou některých velmi specializovaných buněk, např. sítkovice, sklereidy).

Kulturu lze za vhodných kultivačních podmínek pěstovat in vitro neomezeně dlouho.

Tkáňová a suspenzní kultura se v průběhu růstu in vitro dediferencuje, ztrácí svůj původní morfologický a fyziologický charakter, není však homogenní, obsahuje buňky různého stupně diferenciace.

Suspenzní kultury, které lze z tkáně pěstované na pevné půdě získat buď enzymovým rozvolněním (např. pomocí pektináz) nebo mechanickou cestou, jsou tvořeny jednotlivými buněčnými shluky různé velikosti, jejichţ tvorbu se dosud nepodařilo vyloučit; rozpadavost kultury je zřejmě geneticky podmíněna a lze ji ovlivnit sloţením média a kultivačními podmínkami.

Buňky tkáňových ani buněčných kultur nejsou schopny tvořit jednovrstevnou kulturu (monolayer), neuchycují se na tuhé ani polotuhé podklady.

Řada rostlinných kultur je schopna trvale růst na plně syntetických půdách. Vhodnou kombinací růstově aktivních látek a ostatních sloţek kultivačního média lze v kulturách indukovat histogenezi nebo organogenezi, takto je moţné odvodit z jediné somatické buňky ţivotaschopnou rostlinu [39].

3.2.3. Kultivace rostlinných kultur in vitro 3.2.3.1. Odvození kalusové kultury Odvození kalusové kultury je obtíţným úsekem experimentu. Cílem práce je získat sterilní rostlinný materiál, u něhoţ by nedošlo k poškození meristematických pletiv. V případě, ţe se nepodaří dosáhnout poţadované sterility výchozího materiálu, dochází k plesnivění kultury a tím k jejímu znehodnocení. Prvním krokem je výběr vhodné matečné rostliny a odvození primárního explantátu. Nejlepších výsledků je dosahováno, je-li explantát odebrán z rostliny 15

v aktivní fázi růstu nebo ze zásobních orgánů. Před vlastní explantací je nutné rostlinu pěstovat v aseptických podmínkách nebo povrchově sterilizovat. Redukci počtu mikroorganismů napomáhá oplachování rostlin pod tekoucí vodou. Je vhodné přidat detergent, protoţe zlepšuje smáčivost povrchu a zvyšuje účinek dezinfekčních činidel. Při sterilizaci by měl dezinfekční roztok usmrtit všechny mikroorganismy přítomné na povrchu explantované části rostliny a přitom nepoškodit vlastní explantát. Nejpouţívanějšími desinfekčními činidly jsou roztok chloraminu B (1-10 %), ethanol (70-95 %), peroxid vodíku (3-12 %), dusičnan stříbrný (1 %) atd. Po sterilizaci je třeba zbytky činidel dokonale opláchnout sterilní destilovanou vodou. Z takto připraveného rostlinného materiálu se odebere část poţadovaného orgánu a umístí se do kultivační nádoby s vhodným sterilním ţivným médiem a inkubuje se při teplotě 23 – 28 °C. Pokud je zajištěna sterilita a vhodné kultivační prostředí, probíhá u inokula organogeneze nebo produkce parenchymatických nediferencovaných buněk, které se nazývají kalusy. Typ vývoje explantátu podmínkami,

především

koncentrace auxinu

a intenzita proliferace je ovlivněna kultivačními

hormonálním

sloţením

média.

Relativně

vysoké

(1-10 mg/l) v kombinaci s nízkou koncentrací cytokininu

vyvolávají dediferenciaci buněk primárního explantátu do meristematického stavu a vytvoření neorganizovaného kalusu. Opačný poměr růstových regulátorů indukuje regeneraci pupenů a prýtů. U prvních pasáţí se mohou objevit morfologické a morfogenetické odchylky. Patrné jsou zejména změny pigmentace a regenerační schopnosti. Porušení pletiv při izolaci nebo sterilizaci vede k uvolnění a zvýšené syntéze oxidáz (polyfenoloxidáza, katecholoxidáza, tyrozináza aj.). Činností těchto enzymů dochází ke kumulaci fenolických látek, coţ se projeví hnědnutím aţ černáním – hrozí zastavení růstu a nekróza buněk. Nadměrnému zvýšení koncentrace fenolických sloučenin lze zabránit častým pasáţováním na čerstvé médium, přidání adsorbencií (aktivní uhlí) či antioxidačních látek (kyselina askorbová, kyselina citronová, L-cystein, glutathion) nebo substrátů potlačujících aktivitu oxidáz [40,41]. Během růstu pletiva dochází ke změnám ve sloţení ţivného média a to jak kvalitativním, tak kvantitativním. Nastává vysychání agarového gelu, vyčerpání ţivin z půdy, změna pH prostředí a do ţivné půdy jsou vylučovány exkrety kultivované tkáně. Také z těchto důvodů je důleţité pravidelné pasáţování. První pasáţování se provádí v intervalu aţ 3 týdnů, přičemţ se přenáší čerstvě narostlá tkáň bez 16

původního inokula. Další pasáţe se provádějí v intervalech 3 týdnů aţ 2 měsíců. Stabilní a homogenní rostlinný materiál lze získat teprve po provedení většího počtu pasáţí. Důleţité je však také dodrţení konstantních podmínek kultivace (teplota, osvit, sloţení ţivné půdy , frekvence pasáţování atd.). Z kalusové kultury lze enzymatickým nebo mechanickým způsobem odvodit kulturu suspenzní. V prvním případě se pouţívají vhodné pektinázy, ve druhém pomaloběţné rolery a třepačky [38,42]. Pro úspěšnou kultivaci rostlinných kultur je velmi důleţité připravit vhodné fyzikální podmínky a najít optimální sloţení ţivného média.

3.2.3.2. Fyzikální podmínky kultivace Jedním z předpokladů úspěšného pěstování rostlin in vitro je jejich adaptabilita na podmínky kultivace dané kultury. Z fyzikálních faktorů sem lze zařadit osvětlení, teplotu, pH ţivného média, vlhkost vzduchu atd.

Osvětlení Světlo ovlivňuje intenzitu biosyntézy a akumulaci sekundárních metabolitů v intaktní rostlině i explantátové kultuře. Světlo můţe být také induktorem některých biosyntéz, např. syntézy flavonoidů a anthokyanů. Pozitivní vliv světla byl dále prokázán u kultur produkujících digitoxin či diosgenin. Byl popsán i vliv světla o různých vlnových délkách na produkci sekundárních metabolitů. Vliv světla na růst tkáňové kultury není jednoznačný. Jsou známy i případy inhibičního účinku světla na růst kultury. Obecně lze konstatovat, ţe růst rostlinné kultury je svým způsobem částečně inhibován přímým slunečním světlem. Pro většinu kultur je dostačující pro intenzivní růst osvětlení v rozmezí 500 aţ 1000 luxů. Je zajímavé, ţe kultury, které byly pěstovány při nepřetrţitém osvětlení, vykazovaly niţší růst neţ kultury, u nichţ se periodicky po 12 hodinách střídalo světlo a tma [38,39]. Sledováním účinku světla na růst a produkci kumarinů v kalusové kultuře Angelica archangelica bylo zjištěno, ţe permanentní světlo obojí inhibuje. Kultury pěstované ve tmě a při normálním světelném reţimu měly srovnatelné výsledky, růst

17

i produkce kumarinů byly za těchto podmínek stimulovány. Po přidání prekurzorů do média se ukázalo, ţe nejlepší účinek na růst i produkci kumarinů kalusové kultury má denní perioda [43].

Teplota Kultivační teplota je jedním z faktorů, který ovlivňuje průběh kultivace tkáňových kultur. Pokud je teplota příliš nízká, rychlost metabolismu se zpomalí aţ zastaví, pokud je teplota vysoká, dojde k poškození buněk. Teplota kultivace je většinou zvolena empiricky v těsném rozmezí kolem 25 °C. Její hodnota má vliv na rychlost růstu kultury a její zvýšení můţe indukovat i organogenezi kultur [38,44]. Hilton a Rhodes ve své studii zjistili, ţe pro růst tkáňové kultury Datura stramonium je optimální rozmezí teplot 25 aţ 30 °C. Nejvyšší produkce hyoscyaminu však byla zjištěna při 20 °C [45].

Acidita živného média Rostlinné kultury nejsou na rozdíl od kultur ţivočišných nebo kultur mikroorganizmů citlivé na přesnou hodnotu pH ţivného média. Ţivné půdy, na kterých jsou kultivovány, jsou obvykle slabě kyselé. Optimální hodnota pH ţivného média je závislá na typu kultury. Pro většinu kultur in vitro se doporučuje hodnota pH od 5,5 do 5,8; v některých případech i v rozmezí pH 6,0 aţ 7,0. K úpravě pH půdy se většinou pouţívá hydroxid sodný nebo kyselina chlorovodíková, přičemţ je třeba počítat i se změnou hodnot pH během autoklávování média [38,44]. Při studiu např. kalusové kultury Crocus sativus bylo zjištěno optimální pH 5,8 [46].

Atmosférická vlhkost Mezi faktory umoţňující optimální růst patří také vhodná atmosférická vlhkost. Je-li nízká, hrozí nebezpečí, ţe tkáně na povrchu zkorkovatí nebo zahynou. Je-li vlhkost naopak vysoká, páry na povrchu ţivného média kondenzují a dochází k inhibici růstu. Atmosférická vlhkost bývá v kultivačních místnostech nastavena na určitou hodnotu v rozmezí 20-98 % - podle poţadavků dané kultury [38].

18

3.2.3.3. Živné médium Ţivné médium je prostředí, které umoţňuje růst organizmů. Musí obsahovat látky ţivotně důleţité pro růst kultury. Organizmy z něho čerpají ţiviny pro syntézu potřebných buněčných sloţek a energii pro uskutečňování biochemických procesů. Médium můţe být tekuté nebo tuhé (s přísadou agaru). Sloţení ţivného média závisí na typu kultivace. Kvalitativní i kvantitativní zastoupení jednotlivých komponent má rozhodující význam nejen pro růst a morfogenezi explantátu, ovlivňuje například i rozpadavost kalusu při převádění do suspenzní kultury [39]. Kaţdá kultura má specifické nároky, je třeba pro kaţdou zvlášť experimentálně vybrat optimální základní půdu i druh, mnoţství a poměr rostlinných regulátorů. Několika autory bylo publikováno sloţení půd téměř univerzálních, vhodných pro kultivaci většiny rostlinných druhů. Tato média lze rozdělit na [1]: 1) média bohatá na minerální a organické složky, která popsali MS - Murashige, T., Skoog, F. [47] SH - Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. [48] 2) média chudá na minerální a organické složky, která popsali B-5 - Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. [49] NN - Nitsch, C., Nitsch, J. P. [50] Mill - Miller, C. O. [51] MC - McCown, B., Lloyd, G. [52]

Složky živných půd se podle mnoţství v půdě, svého charakteru nebo fyziologických účinků rozdělují do následujících skupin [39]: ● destilovaná voda Voda pouţívaná k přípravě ţivných půd můţe obsahovat jen minimální mnoţství anorganických látek, musí být prostá pyrogenů, plynů a organických nečistot. ● směs anorganických makroprvků K makroelementům, které jsou nezbytné pro kultivaci intaktních rostlin, patří dusík, síra, fosfor, hořčík, vápník, draslík. Přidávají se do ţivné půdy ve formě solí, jejich koncentrace v médiu je vyšší neţ 30 mg.l-1.

19

● směs anorganických mikroprvků K esenciálním mikroelementům patří ţelezo, bor, mangan, jod a molybden; v mnoha případech jsou také nepostradatelné měď a zinek. Význam niklu, kobaltu a hliníku pro růst kultivovaných rostlinných tkání je zatím sporný. ● zdroje organického uhlíku Základní stavební jednotkou pro nově vznikající pletiva je uhlík. Nejlepším zdrojem uhlíku jsou cukry (sacharóza, glukóza, laktóza, fruktóza, galaktóza, maltóza). Pro většinu rostlinných kultur je nejvhodnější sacharóza v koncentraci 2 5%. Alkoholy nemají pro tkáňové kultury takový význam jako cukry, uspokojivým zdrojem uhlíku je glycerin. Ani organické kyseliny nejsou ideální, v koncentraci niţší neţ 2 % působí stimulačně, ve vyšších koncentracích působí inhibičně. Velmi příznivý vliv na růst kultur byl však zjištěn u kyseliny jablečné. ● zdroje dusíku Kultivační médium by mělo obsahovat minimálně 25-60 mM anorganického dusíku. Rostlinné buňky mohou růst na médiu obsahujícím dusík pouze v nitrátové formě, mnohem lepšího růstu je však docíleno při dodání směsi nitrátů a amonných solí. Dostatečné mnoţství redukovaného dusíku je moţné zajistit také přidáním organických sloučenin (aminokyselin). Aminokyseliny jsou vyuţívány hlavně při kultivaci buněčných suspenzí a protoplastů. Mohou buňkám slouţit nejen jako bezprostřední zdroj dusíku, ale také přímo k syntéze proteinů. Jejich přirozené směsi (např. hydrolyzát kaseinu) působí příznivě na růst a vývoj explantátu, podporují také organogenezi. ● vitamíny Intaktní rostliny jsou schopny syntetizovat vitamíny potřebné k růstu a vývoji, mnoţství produkované explantátovými kulturami je však většinou nedostatečné. Ţivné médium je proto obohacováno nejčastěji o pyridoxin, thiamin, kyselinu nikotinovou, biotin a myoinositol. Někdy se pouţívá i kyselina listová, vitamín C a kyselina panthotenová. Thiamin je pro růst kultur nepostradatelný, také myoinositol se přidává do většiny půd, má totiţ výrazně stimulační vliv [53]. ● nedefinované směsi přírodních látek Růst explantátové kultury je moţné stimulovat přidáním celé řady organických extraktů, které obsahují např. aminokyseliny, organické kyseliny, cukry, 20

DNA, RNA. Jako příklad lze uvést hydrolyzát kaseinu, pepton, kokosové mléko, extrakty z koňského kaštanu, vlašského ořechu, kukuřice, pšenice nebo kvasnic a pomerančovou či rajčatovou šťávu. V současné době se dává přednost definovaným kombinacím látek a tím se přechází ke skutečně syntetickým médiím. ● prostředky pro odpěňování živných půd Řadíme tam rostlinné oleje - sójový, řepkový, kokosový, slunečnicový, hořčičný, dále ţivočišné tuky - lůj, dezodorizovaný rybí tuk, tekutá frakce vepřového sádla a silikonové oleje - jako vodná emulze s obsahem 10% silikonu. Tyto prostředky jsou důleţité především ve výrobě. ● látky používané pro zpevnění média Pro přípravu tuhých médií se nejčastěji pouţívá agar, který má oproti jiným látkám řadu výhod. Agarové půdy jsou při kultivačních teplotách stabilní, nedochází k interakcím s ostatními sloţkami média, agar není rozkládán rostlinnými enzymy. Tuhost média je moţné regulovat – závisí na pouţité koncentraci agaru, druhu agaru a pH média. V případě, ţe není pouţito pevné médium, je moţné explantát „fixovat“ na můstcích z filtračního papíru, v polyuretanové pěně, perforovaném celofánu apod. Výhodou oproti klasickým agarovým půdám je snadnější příjem ţivin (z tekutého média přes membránu), díky fúzi nedochází v okolí explantátu k akumulaci zplodin, u řady rostlinných druhů je zvýšen koeficient mnoţení. Sloţení média se dá průběţně měnit, není tedy nutné provádět pasáţování, celý kultivační proces je moţno zautomatizovat [54]. ● růstové regulátory (auxiny, cytokininy, gibereliny) Rostlinné buňky jsou při pěstování in vitro většinou závislé na přítomnosti růstových

regulátorů,

protoţe

syntéza

endogenních

růstových

regulátorů

(fytohormonů) není pro zajištění růstu dostatečná.

3.2.3.4. Růstové regulátory Tyto specifické látky, které jsou rostliny schopny do určité míry syntetizovat, řídí biosyntetické pochody v buňkách a tak zajišťují optimální růst buněk i celé rostliny.

21

Jako

stimulátory

růstu

se

označují

takové

regulátory,

které

ve

fyziologických koncentracích stimulují růst rostliny. Růstovými inhibitory se označují regulátory, které naopak ve fyziologických koncentracích růst inhibují. Tato fyziologická koncentrace je důleţitá, protoţe stimulátory ve vyšších koncentracích mohou růst potlačovat a naopak růstové inhibitory při velmi nízkých koncentracích mohou růstové procesy stimulovat. Růstové regulátory, které produkují rostliny a vyuţívají je k regulaci růstu, se označují jako nativní (endogenní). K nativním růstovým stimulátorům patří auxiny, gibereliny a cytokininy. Mezi nativní růstové inhibitory se řadí také kyselina abscisová a fenolické látky. Zvláštním typem růstového regulátoru je ethylen, který nelze povaţovat za stimulátor ani za inhibitor. Nativní růstové regulátory (fytohormony)

jsou

syntetizovány

především

v meristematických

pletivech

(vrcholové meristémy stébla a kořene). Kromě nativních regulátorů jsou známy i regulátory syntetické, které nahrazují nativní regulátory při exogenní aplikaci [38,39]. Předpokládá se, ţe fytohormony působí jednak na úrovni genů a v určitých případech stimulací syntézy i-RNA také umoţňují syntézu bílkovin enzymů, které se pak podílejí na metabolických a fyziologických procesech v rostlinách. Fytohormony mohou na základě svého širokého působení [38]: • měnit propustnost buněčných stěn pro různé substráty a vodu • uvolňovat vázaný substrát pro předem vytvořený enzym • kontrolovat koncentraci ATP a ADP • působit na vyuţití iontů kovů, které mají centrální úlohu v působení mnoha enzymů • ovlivnit vyuţití různých koenzymů nebo být samy koenzymy • měnit intenzitu dýchání v mitochondriích • působit na uvolňování jiných hormonů z jejich prekurzorů • regulovat aktivitu enzymů • působit na proteosyntetický aparát, tj. na replikaci DNA, transkripci RNA nebo translaci, a to zejména hormonální kontrolou DNA- a RNApolymeráz nebo molekulárních derepresorů.

22

V tomto působení fytohormony různě interferují, jejich účinky jsou buď synergické nebo antagonistické v návaznosti na vnitřní či vnější podněty. Exogenní regulátory růstu působí v souhře s těmito procesy. Mohou účinky fytohormonů stimulovat nebo působit na syntézu, translokaci či inaktivaci hormonů. Pouţití těchto růstově aktivních látek závisí nejen na jejich typu, koncentraci a druhu pěstované rostliny nebo kultury, ale často je důleţitý pro růst explantátové kultury také jejich vzájemný poměr. Rozlišují se dvě základní skupiny přírodních regulátorů [38]: 1. regulátory vznikající při metabolismu aminokyselin, mezi něţ patří auxiny, některé fenolové látky, ethylen a kyselina glutamová (má svou úlohu především u hub) 2. regulátory odvozené od kyseliny mevalonové, které jsou tvořeny isoprenovými jednotkami - cytokininy, abscisiny, gibereliny

Auxiny Mezi auxiny patří látky indolového typu, jejichţ přítomnost je důleţitá pro dělení, růst a diferenciaci buněk. Hlavním účinkem in vitro je stimulace kořenotvorby, indukce tvorby kalusu. Nízké hladiny stimulují růst kořenů, zatímco vysoké hladiny v kombinaci s cytokininy indukují tvorbu kalusu a dediferencovaný růst. Název této skupiny je odvozen od auxinu, kyseliny -indolyloctové (IAA), která byla prvním objeveným rostlinným hormonem. Dalšími látkami s auxinovou aktivitou jsou jiţ syntetické kyseliny, např. kyselina -indolyl-4-máselná (IBA), kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) a kyselina -naftyloctová (-NAA). Podařilo se objasnit vztah mezi růstem indukovaným auxinem a draselnými kanály. Předpokládá se, ţe auxin stimuluje protonovou pumpu, která způsobuje kyselost v okolí buněčných stěn, coţ vede ke ztrátě stěn a k následné expanzi buněčného obsahu. Podmínkou pro růst jsou však draselné ionty, které se pohybují ve směru elektrochemického gradientu, vznikajícího aktivací protonové pumpy [38,55].

23

Gibereliny Hlavními zástupci jsou kyselina giberelová (GBA) a giberelin. Jsou to terpeny tetracyklické struktury sloţené ze čtyř isoprenových jednotek. Tvoří se v mladých listech, meristematických částech lodyh, apikálních částech kořenů, mladých plodech a klíčících semenech. Gibereliny stimulují prodluţovací růst, ale jiným mechanizmem neţ auxiny. Stimulují syntézu bílkovin a procesy kvetení. Mohou porušovat období vegetačního klidu semen mnohých rostlin. Na syntéze giberelinů se významně podílejí kořeny, je však nutná přítomnost dalších růstových látek typu auxinů a cytokininů [38,55].

Cytokininy Název této skupiny je odvozen od jejich hlavního účinku - stimulace buněčného dělení - cytogeneze. Jsou to purinové deriváty odvozené od adeninu. Tvoří se především v kořenových špičkách, ale i v malých plodech a semenech. Z kořenů jsou pak transportovány cévami transpiračním proudem do nadzemní části. Zpomalují stárnutí rostlin, tj. rozklad chlorofylu, nukleových kyselin a bílkovin. Působí stimulačně na klíčení, zvláště u semen v období dormance, v kombinaci s IAA podporují zakořeňování a růst stonkových řízků. Stimulují diferenciaci chloroplastů a tvorbu některých pigmentů. Pravděpodobně se účastní i regulace vodního reţimu zvýšením transpirace. Mají úlohu v regulaci nasazování plodů a procesu dozrávání. Nejdůleţitějšími přírodními cytokininy jsou zeatin a 6-izopentenylaminopurin a syntetickými 6-furfurylaminopurin (kinetin) a 6-benzylaminopurin (BA) [38].

Kyselina abscisová Je to terpenoid velmi blízký vitamínu A, odvozený od kyseliny mevalonové. Všeobecně se kyselina abscisová (ABA) označuje za silného antagonistu giberelinů. Inhibuje růstové procesy, sniţuje permeabilitu membrán, zabraňuje pronikání vody a dalších látek do buněk, urychluje procesy opadávání květů a plodů. ABA téţ reguluje vodní reţim rostlin tím, ţe sniţuje transpiraci. Redukuje negativní vliv nejen nedostatku vláhy (kdy její tvorba stoupá) ale i nízkých teplot a vyšších koncentrací solí. Proto je povaţována za důleţitý faktor adaptace rostlin ke stresovým podmínkám [38].

24

Ethylen Jedná se o růstový regulátor plynného skupenství, který se uplatňuje v řadě vývojových a se stresem spojených procesů rostlin. Účinky ethylenu se projevují při dozrávání plodů, opadávání listů, při vývoji kořene. Silně inhibuje transport auxinů. Ethylen se pouţívá k rychlení nebo k inhibici kvetení. Podobné účinky jako ethylen mají některé syntetické přípravky, např. fenolické kyseliny (kyselina salicylová, deriváty kyseliny benzoové), herbicidy (maleinhydrazid) [55].

Maleinhydrazid Zadrţuje růst rostliny jako celku. Nebrzdí pouze dělení buněk, ale i intenzitu dýchání rostlin. Inhibiční vliv maleinhydrazidu (MH) se někdy vysvětluje tak, ţe struktura MH je velmi podobná struktuře uracilu. Záměnou uracilu za MH dochází k blokádě proteosyntézy v ribozómech. Jiná hypotéza předpokládá aktivaci enzymu, který oxiduje auxin [55].

Další regulátory Dalšími regulátory jsou spermidin, jeho prekurzor putrescin, fusicoccin, argostemin, brassiny. K nejnovějším regulátorům patří také meristimul, 3-alyl-6nitro-2-benzothiazolinon, který vykazuje v závislosti na koncentraci inhibici či stimulaci růstu a syntézy chlorofylu zelených řas, jedno- a dvouděloţných rostlin a kalusových tkáňových kultur. V rozmezí koncentrací 10-5 - 10-15 mol.l-1 stimuluje růst a syntézu chlorofylu rostlin a kalusových kultur a podporuje tvorbu rostlinných orgánů v kalusové kultuře analogicky jako kinetin [55]. Vznik a růst kalusových kultur ovlivňují hlavně auxiny a cytokininy. Tyto dvě skupiny mají v procesech morfogeneze různé účinky. Při zvýšené koncentraci auxinů v kalusové kultuře dochází k indukci kořenů (Skoog a Miller 1957), zatímco převaha cytokininů indukuje tvorbu výhonků. Při vyváţeném poměru auxinů a cytokininů dochází ke vzniku kalusu. Intenzita růstu kalusové kultury závisí nejen na koncentraci a druhu růstových stimulátorů, ale i na velikosti explantátů, citlivosti buněk nebo pletiv, na fyzikálních podmínkách a dalších faktorech [38].

25

3.2.3.5. Růstové fáze kultury Rostlinná kultura během prochází růstu několika fázemi. Po celou dobu je ovlivňována řadou faktorů, které určují její další vývoj. Vedle sloţení ţivného média a fyzikálních faktorů sem patří také typ a genetické vybavení explantátu, sterilita prostředí apod. Vynese-li se do grafu experimentálně zjištěné mnoţství biomasy proti času, získá se charakteristická růstová křivka, na které lze rozlišit následující fáze [39]: 1. lag fáze - období přizpůsobování naočkovaných buněk novému prostředí, jejich koncentrace zůstává konstantní, někdy můţe i poklesnout 2. fáze zrychlení (akcelerační) - všechny důleţité enzymové reakce dosahují konstantní (maximální) rychlosti, buňky se začínají mnoţit se stále vzrůstající rychlostí, po dosaţení maximální rychlosti růstu přechází ve fázi exponenciální 3. exponenciální fáze - buňky rostou stále stejnou maximální rychlostí, buňka se z hlediska chemického sloţení nemění; růst trvá tak dlouho, pokud mají buňky dostatečné mnoţství ţivin a pokud není inhibován vlastními odpadními produkty metabolismu 4. fáze zpomalení (deklinační fáze) - v důsledku postupného vyčerpání ţivin a hromadění metabolických produktů dochází k poklesu růstové rychlosti, tvar růstové křivky se v této fázi můţe velmi lišit, coţ záleţí také na typu rostlinné kultury 5. stacionární fáze - populace buněk dosahuje maximální a po určitou dobu konstantní velikosti, doba této fáze závisí stejně jako u předchozí fáze na způsobu měření koncentrace buněk; maximální dosaţenou koncentraci buněk určuje řada faktorů, např. počáteční koncentrace energetického zdroje, zdroje dusíku a stopových prvků, koncentrace kyslíku, způsob úpravy pH během kultivace

26

6. fáze odumírání - pro průběh této fáze neexistuje ţádné obecné pravidlo, odumírání můţe být pomalé nebo rychlé, spojené nebo nespojené s autolýzou buněk

log x

4

5

6

3

1

2

Xo

t

Fáze růstové křivky: 1) lag-fáze, 2) akcelerační fáze, 3) exponenciální fáze, 4) deklinační fáze, 5) stacionární fáze, 6) fáze odumírání

Důleţité jsou také vzájemné vztahy mezi intenzitou růstu kalusové kultury a velikostí explantátu. Bylo zjištěno, ţe čím je explantát větší, tím různorodější je sloţení buněk. Rostlinná pletiva mají různou fyziologickou polaritu. Vlivem této polarity probíhá tvorba kalusu zvlášť intenzivně na té straně explantátu, která je obrácená směrem ke kořeni. Malé inokulum zabezpečuje rychlé dělení buněk, ale prodluţuje lag-fázi. Délka subkultivačního intervalu (tj. doby od přenesení explantátu na ţivné médium do počátku stacionární fáze) závisí tedy na několika faktorech: na počáteční velikosti inokula (hustotě suspenze), době trvání lag fáze a délce buněčného cyklu. Je-li iniciální hustota buněk nízká, dochází k prodlouţení lag fáze i exponenciální fáze. Růst je moţné podpořit přidáním výtaţku odebraného od kultury o vysoké hustotě buněk. Intenzivně se dělící buňky totiţ vylučují dosud nedefinované substance, které stimulují růst okolních buněk. Díky pravidelnému

27

pasáţování je moţné udrţovat kultury v podmínkách in vitro neomezeně dlouho [38,39].

3.2.4. Biotechnologické využití rostlinných explantátových kultur V posledních letech bylo v Evropě zaloţeno více neţ 500 středisek biotechnologického výzkumu, které se věnují jednak komerčnímu vyuţívání rostlinných kultur in vitro a jednak základnímu výzkumu v této oblasti. Jedná se zejména o instituce v Německu, dále pak v Holandsku, Anglii, Itálii a Francii. Také v USA, Kanadě a Japonsku byla zaloţena řada těchto pracovišť [2]. Vyuţití kultur in vitro lze rozdělit na dvě oblasti, ve kterých je nejintenzivněji prováděn výzkum, který má i své praktické uplatnění. Jde o produkci sekundárních metabolitů těmito kulturami a o problematiku biotechnologických metod v rozmnoţování a šlechtění rostlin.

3.2.4.1. Produkce sekundárních metabolitů Vyšší rostliny jsou bohatými zdroji léčivých látek. Jednou z moţností, jak se vyhnout obtíţím se zajištěním těchto látek, by mohlo být zavedení systému buněčných kultur pro jejich produkci. Hlavní výhody buněčné kultivace oproti kultivaci celé rostliny jsou následující [39]:  Sekundární metabolity mohou být produkovány za kontrolovaných podmínek a v prostředí nezávislém na klimatických změnách nebo půdních podmínkách.  Rostlinné explantáty jsou pěstovány sterilně, bez pouţití ochranných prostředků a hnojiv.  Buňky jakékoliv rostliny, bez ohledu na její geografický původ, mohou být snadno pěstovány k získání jejich specifických metabolitů.  Automatická kontrola buněčného růstu a racionální regulace metabolických procesů můţe přispět ke sníţení pracovních nákladů a zvýšení produktivity.

28

 Kultivace rostlinných explantátů in vitro můţe probíhat během celého roku, pomocí pasáţování jsou kultury udrţovány za optimálních podmínek i několik let. Rostliny i tkáňové kultury syntetizují sekundární metabolity většinou jen v určité ontogenetické fázi, v určitém období růstového cyklu. Často se stává, ţe převedením do kultury in vitro a ztrátou diferenciace pletiva dochází ke změně či přerušení metabolických drah, jejichţ důsledkem je kvalitativní změna spektra produkovaných látek. Můţe jít o vedlejší produkty metabolických drah, modifikované látky výchozích rostlin nebo látky dosud neznámé, které se v intaktní rostlině nevyskytují. Např. při porovnání produkce sekundárních metabolitů kalusové kultury a intaktní rostliny Tenctona grandis bylo zjištěno, ţe kalusová kultura produkuje jiné metabolity (antimikrobiální látky) neţ nativní rostlina [56]. Některé kultury zpočátku produkují látky shodné s výchozí rostlinou či orgánem, po čase však syntéza ustává. To lze pozorovat např. u Digitalis purpurea L., kde dochází ke zúţení spektra a nejpozději po 18. pasáţi k úplnému zastavení produkce kardenolidů. Regenerované rostliny produkují ovšem celé spektrum látek [2]. Byla porovnávána také produkce sekundárních metabolitů v semeni nativní rostliny Cassia pumila a v kalusové kultuře odvozené ze semene Cassia. Obsah sekundárních metabolitů byl v kalusové kultuře výrazně niţší [57]. Následující příklady dokumentují úspěšné pokusy o vyprodukování sekundárních látek buněčnými kulturami v mnoţství větším neţ v intaktní rostlině [2]. sekundární metabolit ajmalicin anthrachinony

rostlina Catharanthus roseus Cassia tora Galium molugo Morinda citrifolia Stephania cepharantha Dioscorea deltoidea Nicotiana tabacum Glycyrrhiza glabra Peganum harmala Nicotiana tabacum Coleus blumei

biscoclaurin diosgenin glutathion glycyrrhizin harmin kofein kyselina rosmarinová

29

L-Dopa nikotin paniculid B protopin rotenon saponiny serpentin šikonin trigonelin tripdiolid ubichinon-10

Mucuna pruries Nicotiana tabacum Andrographis paniculata Macleaya microcarpa Teprosis Panax ginseng Catharanthus Lithospermum erythrorhizon Trigonella foenum-graecum Tripterygium wilfordii Nicotiana tabacum

Je moţné uvést také přehled látek, které jsou nebo byly průmyslově získávány z kultur in vitro [2]. Produkt šikonin

Druh Lithospermum erythrorhizon

berberin

Coptis japonica

využití farmacie kosmetika barvířství farmacie

biomasa peroxidáza geraniol kyselina rosmarinová digoxin

Panax ginseng Raphanus Geranium Coleus blumei

dietetika diagnostika parfumerie farmacie

Digitalis

farmacie

společnost Mitsui Petrochemicals

země JPN

Mitsui Petrochemicals Nitto Denki Kogyo Toyobo Kanebo Natterman

JPN

Boehringer Mannheim

SRN

JPN JPN JPN SRN

Přes dosaţené úspěchy zůstává stále nevyřešena celá řada problémů, které stojí v cestě vyuţití tkáňových kultur pro produkci sekundárních metabolitů. Zřejmě nejváţnějším je nízký obsah ţádaných látek, kombinovaný s často se vyskytující nestabilitou produkce. V poslední době nastal významný pokrok ve vývoji nových technik, jako je např. biotransformace, imobilizace, elicitace a jejich vzájemné kombinace, kterými je moţné dosáhnout zvýšení produkce a akumulace sekundárních přírodních látek v buněčných kulturách in vitro.

30

Budoucnost průmyslového vyuţití buněčných kultur pro produkci přírodních látek v bioreaktorech závisí především na vývoji postupů a technologií zkracujících periodu fermentace a zvyšujících výtěţek. Perspektivní je i přenos rostlinných genů, které kódují enzymy katalyzující reakce biosyntézy sekundární látky do bakteriální buňky nebo do buňky mikroskopických hub [2].

3.2.4.2. Rozmnožování a šlechtění rostlin Kromě významné role v základním výzkumu mají kultury rostlinných buněk důleţité vyuţití v zemědělství. Slouţí k mnoţení, šlechtění a ozdravování rostlin. Z různých aplikací jsou nejdůleţitější [39,42]: 1) Vegetativní množení umoţňující rychlé získání tisíců shodných rostlinných jedinců (orchideje, karafiáty, gerbery). 2) Meristémové kultury, které umoţňují získání ozdravených bezvirových rostlin (brambory, karafiáty). Z explantátů se dají získat rostliny prosté bakteriálních, virových i houbových nákaz. Infekce je eliminována jiţ při vlastním zakládání sterilní kultury, následné kontaminaci lze zabránit přidáním antibiotik a antivirotik do média. K ozdravování kultury přispívají i běţné sloţky ţivných půd – výrazný efekt mají zvláště fytohormony (např. kyselina 2,4dichlorfenoxyoctová. Virózy je moţné potlačit také působením vyšších teplot, které rostlinná buňka ještě snáší, ale pro viry jsou jiţ letální. K eliminaci infekce přispívá i to, ţe explantátem neprochází cévní svazky, které představují hlavní dráhu šíření řady rostlinných patogenů. 3) Pylové kultury umoţňující získání haploidních rostlin a od nich odvozených čistých linií pro šlechtitelské účely (rýţe, tabák, obilí). 4) Fúze protoplastů téhoţ nebo různého druhu umoţňující tvorbu somatických hybridů (buněk nebo celých rostlin) s vlastnostmi epigenetické povahy z jiného druhu (přenos samčí cytoplazmatické sterility, rezistence apod.). 5) Tvorba různých regenerovaných rostlin, coţ umoţňuje vyuţití polymorfismu ve šlechtitelském programu a selekce produkčních klonů na úrovni izolované buňky.

31

6) Genové inženýrství u izolovaných buněk nebo protoplastů pro zavedení nových vlastností do rostliny (pouţití plazmidu z Agrobacterium tumefaciens jako vektoru k přenosu cizorodé DNA).

Mikropropagace Mikropropagace představuje způsob vegetativního mnoţení rostlin pomocí tkáňových kultur. Rychlost mikropropagace je mnohem vyšší neţ u metod tradičních. Průměrná teoretická výtěţnost meristémových kultur při mikropropagaci je 106 rostlin za rok z jednoho původního explantátu. Tato metodika umoţňuje i produkci bezvirových rostlin a mnoţení lze provádět po celý rok bez závislosti na ročním období. Nevýhodami mikroporopagace je poměrně vysoká pracnost těchto metod, které neumoţňují mechanizaci, a relativně ekonomicky nákladné laboratorní vybavení. Metody mikropropagace nalézají v současné době uplatnění především tam, kde nejsou pouţitelné jiné metody vegetativního mnoţení, kdy rychlost vegetativního mnoţení je pomalá nebo kdy makropropagace je velmi nákladná [2].

32

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Použitý materiál, přístroje a pomůcky 4.1.1. Rostlinný materiál K odvození kalusové kultury byla pouţita semena jetele lučního Trifolium pratense L., Fabaceae (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint) získaná ze Šlechtitelské stanice Domoradice.

4.1.2. Chemikálie 6-benzylaminopurin č., Lachema, Brno Dihydrogenfosforečnan draselný č., Lachema, Brno Dusičnan draselný p.a., Lachema, Brno Dusičnan amonný p.a., Lachema, Brno Ethanol 96%, Lachema, Brno Glycin č., Lachema, Brno Chloramin B, Lachema, Brno Chlorid kobaltnatý p.a., Lachema, Brno Chlorid pyridoxinia č., Koch-Light Laboratories, Colnbrook Chlorid thiaminia č., Koch-Light Laboratories, Colnbrook Chlorid vápenatý p.a., Lachema, Brno Jodid draselný p.a., Lachema, Brno Kinetin p.a., Serva, Heidelberg Kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová č., Lachema, Brno Kyselina -naftyloctová č., Lachema, Brno Kyselina boritá p.a., Lachema, Brno Kyselina chlorovodíková p.a., Lachema, Brno Kyselina mravenčí bezvodá p.a., Lachema, Brno Kyselina nikotinová č., Lachema, Brno Kyselina octová bezvodá p.a., Lachema, Brno Kyselina octová ledová p.a., Lachema, Brno Kyselina šťavelová č., Lachema, Brno Methanol p.a., Lachema, Brno Molybdenan sodný p.a., Lachema, Brno Myoinositol č., Sigma, St. Louis Sacharóza p.a., Lachema, Brno Síran amonný p.a., Lachema, Brno Síran hořečnatý p.a., Lachema, Brno Síran manganatý p.a., Lachema, Brno

33

Síran měďnatý p.a., Lachema, Brno Síran zinečnatý p.a., Lachema, Brno Síran ţeleznatý p.a., Lachema, Brno

4.1.3. Přístroje a pomůcky Analytické váhy A 200S, Sartorius, Göttingen Autokláv PS 20A, Chirana, Brno Horkovzdušný sterilizátor HS 31A, Chirana, Brno Box s laminárním prouděním Fatran LF, Ţilina Roler, Vývojové dílny AV ČR, Praha Třepačka Unimax 2010, Heidolph UV-lampa CAMAG, Muttenz Spektrofotometr CE 1010, Cecil Instruments, Cambridge Kapalinový chromatograf Unicam Crystal, Cambridge Kolona LiChrosper RP-18 s předkolonkou, Merck, Darmstadt

4.2. Kultivace explantátové kultury

4.2.1. Kultivační nádoby a nástroje, podmínky pasážování Pro odvození a kultivaci explantátových kultur bylo pouţíváno varné sklo značky SIAL, které vyhovuje poţadavkům kladeným na nádobí pro práci s tkáňovými kulturami a je dostatečně odolné vůči vodě, chemikáliím i rozdílům teplot. Pouţívané kovové nástroje (pinzety, skalpely) byly opláchnuty 96 % ethanolem a zabaleny do hliníkové fólie. Potom byly sterilizovány 2 hodiny při 200 °C v horkovzdušném sterilizátoru. Kalusové kultury byly odvozeny a kultivovány na můstcích z filtračního papíru vloţených do 100 ml Erlenmeyerových baněk s obsahem 30 ml tekutého ţivného media. Odvozování a pasáţování bylo prováděno v aseptickém boxu s laminárním prouděním, jehoţ prostor byl vymyt roztokem Ajatinu (1:10) a vyzářen nejméně 1 hodinu germicidní zářivkou. Při práci byly vţdy zachovávány přísně aseptické podmínky, bylo pouţíváno sterilní sklo a nástroje.

34

4.2.2. Příprava živného média Explantátové kultury Trifolium pratense L. byly odvozeny a kultivovány: 1) na živném médiu podle Murashigeho a Skooga (MS) následujícího sloţení [47]: 440,00 mg.l-1

CaCl2 . 2 H2O

1900,00 mg.l-1

KNO3

370,00 mg.l-1

MgSO4 . 7 H2O

1650,00 mg.l-1

NH4NO3 KH2PO4 . H2O

170,00 mg.l-1

FeSO4 . 7 H2O

27,84 mg.l-1

Na2EDTA

37,34 mg.l-1

MnSO4 . 4 H2O

22,30 mg.l-1

ZnSO4 . 7 H2O

11,50 mg.l-1

H3BO3

6,20 mg.l-1

KI

0,83 mg.l-1

CuSO4 . 5 H2O

0,025 mg.l-1

Na2MoO4 . 2 H2O

0,25 mg.l-1

CoCl2 . 6 H2O

0,025 mg.l-1 100,00 mg.l-1

inositol

1000,00 mg.l-1

hydrolyzát kaseinu glycin

2,00 mg.l-1

kyselina nikotinová

0,50 mg.l-1

pyridoxin hydrochlorid

0,50 mg.l-1

thiamin hydrochlorid

0,10 mg.l-1 30000,00 mg.l-1

sacharosa

2) na živném médiu podle Gamborga (B5) následujícího sloţení [49]:

2 500,00

mg.l-1

CaCl2 . 2 H2O

150,00

mg.l-1

MgSO4 . 7 H2O

250,00

mg.l-1

(NH4)2SO4

134,00

mg.l-1

KNO3

35

NaH2PO4 . H2O

150,00

mg.l-1

FeSO4 . 7 H2O

27,84

mg.l-1

Na2EDTA

37,34

mg.l-1

KI

0,75

mg.l-1

H3BO3

3,00

mg.l-1

MnSO4 . H2O

10,00

mg.l-1

ZnSO4 . 7 H2O

2,00

mg.l-1

Na2MoO4 . 2 H2O

0,25

mg.l-1

CuSO4 . 5 H2O

0,025 mg.l-1

CoCl2 . 6 H2O

0,025 mg.l-1 100,00

mg.l-1

kyselina nikotinová

1,00

mg.-1

pyridoxin

1,00

mg.l-1

10,00

mg.l-1

myoinositol

thiamin

30 000,00 mg.l-1

sacharosa

Jednotlivé substance byly odváţeny na analytických vahách (nízké koncentrace byly

pipetovány z připravených zásobních roztoků). Vše bylo

rozpuštěno v destilované vodě v odměrné baňce na 1000 ml a doplněno destilovanou vodou po značku. K připraveným médiím byly potom přidány různé koncentrace růstových stimulátorů, případně jejich vzájemné kombinace. Ţivná média byla rozlita po 30 ml do Erlenmeyerových baněk s předem vloţenými papírovými můstky. Baňky byly uzavřeny hliníkovou fólií a sterilizovány v autoklávu 15 min při teplotě 121 °C a tlaku páry 0,1 MPa.

4.2.3. Odvození kalusové kultury Semena byla nejprve chemicky sterilizována ponořením na 3 minuty do 70 % lihu, dále ponořením na 2 minuty do 10 % chloraminu a nakonec vloţením na 10 minut do 2 % chloraminu. Mezi kaţdou lázní byla semena důkladně opláchnuta sterilní vodou. Vysterilizovaná semena byla vysévána na můstky z filtračního papíru

36

do Erlenmeyerových baněk s 30,0 ml ţivného média podle Murashigeho a Skooga nebo podle Gamborga. Po týdnu kultivace při teplotě 25 °C a světelné periodě 16 hodin světlo/8 hodin tma byly získány sterilní klíční rostliny. Kalusová kultura Trifolium pratense L. byla odvozena při teplotě 25 °C a světelné periodě 16 hodin světlo/8 hodin tma ze sterilní klíční rostliny pasáţováním na MS a B5 médiu (subkultivační interval 21 dní). K těmto médiím byly přidávány růstové

stimulátory kyselina

2,4-dichlorfenoxyoctová

(2,4-D),

kyselina

-

naftyloctová (NAA), 6-benzylaminopurin (BA) a kinetin v koncentracích 0,05 - 10 mg.l-1 (stimulátory byly zkoušeny samostatně i vzájemně zkombinované) [58-64]. Byla vybrána nejvhodnější kombinace pro kultivaci kalusové kultury Trifolium pratense L.

4.3. Stanovení růstové a produkční charakteristiky U kalusové kultury Trifolium pratense L. (varieta DO-8) kultivované při teplotě 25 °C a světelné periodě 16 hodin světlo/8 hodin tma na médiu podle Gamborga s přídavkem 2,4-D (2 mg.l-1) a BA (2 mg.l-1) byla ve 30. pasáţi v průběhu padesátidenní subkultivace sledována v sedmidenních intervalech dynamika růstu vyjádřením čerstvé hmotnosti a růstového faktoru [65] a produkce flavonoidů stanovená metodou dle ČL 2002 [66]. U ostatních odvozených kalusových kultur Trifolium pratense L. (varieta DO9, Tempus, Sprint) byl zjišťován ve 29. dni subkultivace obsah flavonoidů dle ČL 2002 [66].

4.3.1. Stanovení růstového faktoru Hmotnost inokula (mi) byla stanovena jako rozdíl hmotnosti kultivačních baněk před a po inokulaci. Po ukončení kultivace byly baňky znovu zváţeny a stejně tak i po vyjmutí kalusů. Z rozdílu těchto hmotností byla zjištěna hmotnost kalusu

37

(mk). Pro kaţdou sledovanou baňku byl vypočten přírůstek čerstvé hmotnosti kultury, daný rozdílem hmotnosti kalusu a hmotnosti inokula, a také přírůstek čerstvé hmotnosti vyjádřený v procentech podle vzorce:

přírůstek % =

mk  mi . 100 mi

Růstový faktor (Rf) byl zjištěn ze vztahu: přírůstek % 100

Rf =

Pro kaţdý soubor, který byl tvořen pěti baňkami odebranými ve stejném čase, byla stanovena průměrná hmotnost inokula a kalusu, průměrný přírůstek čerstvé hmotnosti a průměrný růstový faktor [65].

4.3.2. Stanovení obsahu flavonoidů Obsah flavonoidů byl stanoven spektrofotometricky po reakci s roztokem kyseliny borité a kyseliny šťavelové v kyselině mravenčí bezvodé [66]. Základní roztok: 0,400 g práškované drogy (250) se ve 250ml baňce smíchá se 40 ml lihu R 60% (V/V) a zahřívá se 10 min ve vodní lázni při 60 °C, za častého protřepávání. Po ochlazení se zfiltruje přes chomáček vaty do 100ml odměrné baňky. Chomáček vaty se vloţí ke zbytku drogy ve 250ml baňce, přidá se 40 ml lihu R 60% (V/V) a zahřívá se 10 min ve vodní lázni při 60 °C, za častého protřepávání. Po ochlazení se zfiltruje do téţe odměrné baňky. 250ml baňka i filtr se promyjí lihem R 60% (V/V) a promývací tekutina se přidá do odměrné baňky. Spojené roztoky se zředí lihem R 60% (V/V) na 100,0 ml a roztok se zfiltruje. Zkoušený roztok: 5,0 ml základního roztoku se odpaří v baňce s kulatým dnem za sníţeného tlaku do sucha. Zbytek se rozpustí v 8 ml směsi objemových dílů methanolu R a kyseliny octové ledové R (10 + 100) a převede se do 25ml odměrné

38

baňky. Baňka s kulatým dnem se promyje 3 ml směsi objemových dílů methanolu R a kyseliny octové ledové R (10 + 100) a promývací tekutina se převede do téţe odměrné baňky. K tomuto roztoku se přidá 10,0 ml roztoku, který obsahuje kyselinu boritou R (25,0 g/l) a kyselinu šťavelovou R (20,0 g/l) v kyselině mravenčí bezvodé R a zředí se kyselinou octovou bezvodou R na 25,0 ml. Kontrolní roztok: 5,0 ml základního roztoku se odpaří v baňce s kulatým dnem za sníţeného tlaku do sucha. Zbytek se rozpustí v 8 ml směsi objemových dílů methanolu R a kyseliny octové ledové R (10 + 100) a převede se do 25ml odměrné baňky. Baňka s kulatým dnem se promyje 3 ml směsi objemových dílů methanolu R a kyseliny octové ledové R (10 + 100) a promývací tekutina se převede do téţe odměrné baňky. K tomuto roztoku se přidá 10,0 ml kyseliny mravenčí bezvodé R a zředí se kyselinou octovou bezvodou R na 25,0 ml. Po 30 min se měří absorbance (2.2.25) zkoušeného roztoku při 410 nm proti kontrolnímu roztoku. Obsah flavonoidů v procentech, vyjádřeno jako hyperosid (C21H20O12), se vypočítá podle vzorce: A . 1,235 M v němţ značí: A – absorbanci roztoku v maximu při 410 nm; M – hmotnost zkoušené drogy v gramech. Specifická absorbance má hodnotu 405.

4.4. Stanovení obsahu isoflavonoidů Methanolové extrakty odvozených kalusových kultur Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint) byly pomocí HPLC zkoušeny na přítomnost isoflavonoidů [9].

39

Příprava extraktu 0,800 g práškované kultury se extrahuje 15 ml 80 % methanolu 30 minut ve vodní lázni při 80 °C pod zpětným chladičem. Extrakt se zfiltruje do odměrné baňky na 25,0 ml. Zbytek z filtru se extrahuje ještě jednou 30 minut ve vodní lázni 15 ml 80 % methanolu. Zfiltruje se do téţe odměrné baňky a doplní se 80 % methanolem po značku.

40

5. VÝSLEDKY 5.1. Tabulková část Tab. č.1 Vyhodnocení růstu kalusové kultury Trifolium pratense L. (varieta DO- 8) v průběhu 50-ti denní subkultivace

8. den kultivace číslo baňky

hmotnost inokula [g]

hmotnost kalusu [g]

přírůstek čerstvé hmotnosti [g]

přírůstek čerstvé hmotnosti [%]

růstový faktor Rf

1 2 3 4 5 průměr

1,4606 1,8476 2,3217 1,8707 2,3583 1,9718

1,6749 2,0009 2,6144 2,1029 2,7141 2,2214

0,2143 0,1533 0,2927 0,2322 0,3558 0,2497

14,6721 8,2973 12,6071 12,4125 15,0871 12,6152

0,1467 0,0830 0,1261 0,1241 0,1509 0,1262

15.den kultivace číslo baňky


hmotnost kalusu [g]



růstový faktor Rf

1 2 3 4 5 průměr

1,3297 1,7131 2,2619 2,4322 1,9339 1,9342

1,8975 1,9212 2,4614 2,6469 2,3540 2,2562

0,5678 0,2081 0,1995 0,2147 0,4201 0,3222

42,7014 12,1476 8,8200 8,8274 21,7229 18,8439

0,4270 0,1215 0,0882 0,0883 0,2172 0,1884

41



hmotnost kalusu [g]



růstový faktor Rf

1 2 3 4 5 průměr

1,9133 1,9054 1,4167 1,5466 2,0772 1,7718

2,4818 2,4618 1,7071 2,1170 2,4516 2,2439

0,5685 0,5564 0,2904 0,5704 0,3744 0,4720

29,7131 29,2012 20,4983 36,8809 18,0243 26,8636

0,2971 0,2920 0,2050 0,3688 0,1802 0,2686


růstový faktor Rf



hmotnost kalusu [g]


1 2 3 4 5

2,7627 1,3676 1,6372 1,4334 2,0689

3,3191 1,8325 2,2087 2,0058 2,7574

0,5564 0,4649 0,5715 0,5724 0,6885

20,1397 33,9939 34,9072 39,9330 33,2786

0,2014 0,3399 0,3491 0,3993 0,3328

průměr

1,8540

2,4247

0,5707

32,4505

0,3245


růstový faktor Rf



hmotnost kalusu [g]


1 2 3 4 5

1,7175 1,3534 1,4388 1,1887 2,1901

2,3290 2,0533 2,2242 1,7863 3,0668

0,6115 0,6999 0,7854 0,5976 0,8767

35,6041 51,7142 54,5872 50,2734 40,0301

0,3560 0,5171 0,5459 0,5027 0,4003

průměr

1,5777

2,2919

0,7142

46,4418

0,4644

42



hmotnost kalusu [g]



růstový faktor Rf

1 2 3 4 5

1,1673 1,7590 1,0282 2,3294 1,2229

2,5359 3,7363 1,9915 4,2650 2,3632

1,3686 1,9773 0,9633 1,9356 1,1403

117,2449 112,4105 93,6880 83,0944 93,2456

1,1724 1,1241 0,9369 0,8309 0,9325

průměr

1,5014

2,9784

1,4770

99,9367

0,9994



hmotnost kalusu [g]



růstový faktor Rf

1 2 3 4 5

1,1387 1,0901 1,1037 1,1444 1,6732

2,1607 1,7840 2,0851 2,1385 3,0342

1,0220 0,6939 0,9814 0,9941 1,3610

89,7515 63,6547 88,9191 86,8665 81,3411

0,8975 0,6365 0,8892 0,8687 0,8134

průměr

1,2300

2,2405

1,0105

82,1066

0,8211

43

Tab. č. 2 Produkce flavonoidů v kalusové kultuře Trifolium pratense L. (varieta DO-8) v průběhu 50-ti denní subkultivace

den kultivace

navážka [g]

absorbance

obsah flavonoidů [%]

8.

0,2108

0,020

0,117

0,2311

0,018

0,096

0,1982

0,010

0,062

0,1924

0,013

0,083

0,1738

0,009

0,064

0,1743

0,008

0,057

0,2199

0,017

0,095

0,2211

0,013

0,073

0,2298

0,011

0,059

0,2234

0,013

0,072

0,2213

0,012

0,067

0,2160

0,012

0,069

0,2072

0,010

0,060

0,1868

0,008

0,053

15. 22. 29. 36. 43. 50.

průměrný obsah flavonoidů [%]

0,107 0,073 0,061 0,084 0,066 0,068 0,056

Tab. č. 3 Růst a produkce kalusové kultury Trifolium pratense L. (varieta DO-8) v průběhu 50-ti denní subkultivace

produkce kultury

růst kultury den kultivace

8. 15. 22. 29. 36. 43. 50.


hmotnost kalusu [g]

1,97 ± 0,36 1,93 ± 0,39 1,77 ± 0,25 1,85 ± 0,52 1,58 ± 0,35 1,50 ± 0,48 1,23 ± 0,22

2,22 ± 0,39 2,26 ± 0,30 2,24 ± 0,30 2,42 ± 0,54 2,29 ± 0,43 2,98 ± 0,87 2,24 ± 0,42

přírůstek čerstvé hmotnosti [%] 12,62 ± 2,41 18,84 ± 12,83 26,86 ± 6,82 32,45 ± 6,58 46,44 ± 7,31 99,94 ± 12,83 82,11 ± 9,68

44

růstový faktor

Rf


0,13 ± 0,02 0,19 ± 0,13 0,27 ± 0,07 0,32 ± 0,07 0,46 ± 0,07 1,00 ± 0,13 0,82 ± 0,10

0,107 ± 0,011 0,073 ±0,011 0,061 ±0,004 0,084 ±0,014 0,066 ±0,006 0,068 ±0,001 0,056 ± 0,004

Tab. č. 4 Produkce flavonoidů v kalusové kultuře Trifolium pratense L. (varieta Tempus, Sprint, DO-9 ) ve 29. dni subkultivace

varieta

navážka [g]

absorbance


Tempus

0,2637 0,2658 0,2724 0,2553 0,1325

0,018 0,016 0,028 0,024 0,008

0,084 0,074 0,127 0,116 0,075

Sprint DO-9

průměr obsahu flavonoidů [%]

Tab. č. 5 Produkce isoflavonoidů v kalusové kultuře Trifolium pratense L. (varieta Tempus, Sprint, DO-8, DO-9 ) v 29. den subkultivace

varieta

navážka [g]

obsah formononetinu [%]

Tempus Sprint DO-8 DO-9

0,8197 0,8287 0,8173 0,8227

0,02 0,01 0,01 0,02

45

0,079 0,122 0,075

5.2. Obrazová část Na základě výsledků (tab. č. 3) byla získána růstová křivka (graf č. 1) a produkční křivka (graf č. 2) kultury Trifolium pratense L. - varieta DO-8. Graf č.1

1,40

růstový faktor

1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 8.

15.

22.

29.

36.

43.

50.

čas subkultivace [dny]

růstový faktor Rf

Graf č.2


0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 8.

15.

22.

29.

36. 43. 50. čas subkultivace [dny]


46

6. DISKUSE Vyuţití explantátových kultur jako zdroje důleţitých rostlinných metabolitů se jeví jako velmi perspektivní. Růst rostlinných kultur in vitro a produkce sekundárních metabolitů těmito kulturami jsou však ovlivňovány celou řadou faktorů. Proto je nutné nejprve experimentálně určit u kaţdé konkrétní kultury optimální podmínky kultivace, zejména stanovit růstovou a produkční charakteristiku s ohledem na vhodnou délku kultivace. Nezbytné je také najít vhodné ţivné médium, které by současně zaručovalo dobrou produkci ţádaných sekundárních metabolitů a rychlý kontinuální růst kalusu. V současné době je zřejmý stoupající zájem o produkci flavonoidů a isoflavonoidů rostlinnými explantáty, coţ souvisí s širokým spektrem biologických účinků těchto sekundárních metabolitů [1,3-7]. Velmi nadějným zdrojem těchto přírodních látek je jetel luční (Trifolium pratense L., Fabaceae). Je pouţíván v lidovém léčitelství a jako hospodářská plodina. V poslední době se objevuje mnoţství přípravků s obsahem výtaţků z jetele lučního, které jsou doporučovány ţenám na odstranění

či zmírnění příznaků menopauzy. Mnohé studie se snaţí

potvrdit toto příznivé působení na postmenopauzální potíţe, jejich výsledky ale nejsou jednotné [9,11]. Cílem této práce bylo odvodit kalusovou kulturu z klíční rostliny čtyř odrůd Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint), určit vhodné sloţení ţivného média a na základě růstové a produkční charakteristiky stanovit vhodný subkultivační interval pro kultivaci této kultury. Jednu z významných sloţek ţivného média u rostlinných explantátových kultur představují růstové regulátory. Proto byla nejprve vyzkoušena řada stimulátorů v rozmezí koncentrací obvykle pouţívaných při kultivaci explantátových kultur a v koncentracích, které vycházely z publikovaných údajů [58-64], s cílem najít optimální růstový stimulátor. Tvorbu kalusu iniciovaly především následující mnoţství auxinů a cytokininů přidávané na 1 litr základního média: 10 mg NAA; 10 mg NAA+1mg BA; 2 mg NAA+2 mg 2,4-D+2 mg kinetin; 0,5mg NAA+1,25 mg

47

2,4-D+0,5 mg kinetin; 0,05 mg NAA+0,5 mg kinetin; 5 mg 2,4-D+1 mg NAA; 3 mg 2,4-D; 2 mg 2,4-D+2 mg BA; 5 mg 2,4-D+2 mg BA. Na základě všech pozorování je moţné uvést, ţe pro kultivaci explantátové kultury Trifolium pratense L. je optimální ţivné médium podle Gamborga [49] s přídavkem

2

mg.l-1

2,4-dichlorfenoxyoctové

kyseliny

a

2

mg.l-1

6-

benzylaminopurinu. K tvorbě kalusu došlo po pěti aţ sedmi dnech kultivace klíční rostliny. Kalusy byly většinou světle ţluté, křehké, vykazovaly uspokojivý růst bez tendence k morfogenezi. Stabilní a homogenní rostlinný materiál byl získán aţ po jednom roce pravidelného pasáţování při dodrţování konstantních podmínek kultivace (teplota, osvětlení, sloţení ţivné půdy, frekvence pasáţování). Mezi jednotlivými kalusovými kulturami odvozenými od různých odrůd Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint) nebyly zjištěny patrné rozdíly v charakteru kalusů. U jednoleté kalusové kultury Trifolium pratense L. odrůdy DO-8 (20. pasáţ), která vykazovala nejlepší ţivotaschopnost

a tak poskytla nejvíce homogenního

materiálu, byla stanovena růstová a produkční charakteristika. Od 8. dne kultivace byly v sedmidenních intervalech po dobu padesáti dnů odebírány kalusy (vţdy z pěti baněk), u kterých byl zjištěn přírůstek čerstvé hmotnosti a vypočítán růstový faktor. V těchto vzorcích byl po usušení za laboratorní teploty dále spektrofotometricky stanoven obsah flavonoidů podle ČL 2002 [66]. Z charakteru růstové křivky (graf č. 1) vyplývá, ţe po lag fázi (tj. asi od 15. dne kultivace) následuje dlouhá exponenciální fáze, přičemţ maxima růstu je dosaţeno aţ ve 43. dni kultivace, po kterém dochází pravděpodobně v důsledku postupného vyčerpávání ţivin a hromadění metabolických produktů k poklesu rychlosti růstu. Z produkční křivky (graf č. 2) je zřejmé, ţe obsah flavonoidů aţ do 22. dne kultivace nejprve klesal, coţ lze vysvětlit tím, ţe v počáteční růstové fázi kultury se v buňkách neuskutečňuje syntéza nových metabolitů a růstem biomasy kultury dochází zřejmě k ředění obsahových látek vnesených do baňky inokulem (1. maximum produkce v 8. dni subkultivace - 0,107 %). Ve 29. dni subkultivace bylo pak zjištěno druhé maximum produkce (0,084 %). V následujících dnech kultivace došlo k poklesu obsahu flavonoidů, pravděpodobně v důsledku intenzivnějšího růstu kultury mezi 29. a 43. dnem kultivace. Na základě těchto poznatků je moţné

48

doporučit pro kalusovou kulturu Trifolium pratense L. subkultivační interval 29 aţ 43 dní. Obsah flavonoidů ve 29. dni kultivace, tedy ve dni, kdy bylo u kalusové kultury odvozené z variety DO-8 zjištěno druhé maximum produkce, byl sledován také v kalusových kulturách odvozených z dalších odrůd Trifolium pratense L. Obsahy v jednotlivých kulturách byly následující: varieta DO-9 0,075 %, Tempus 0,079 % a odrůda Sprint 0,122 %. Z uvedeného vyplývá, ţe kalusová kultura odvozená z odrůdy Sprint vykazovala, podobně jako u intaktní rostliny odrůdy Sprint [9], nejvyšší produkci flavonoidů, a proto z ní bude odvozena suspenzní kultura. Vztah mezi růstem explantátových kultur a sekundárním metabolismem není přesně vymezen, většinou však existuje nepřímá závislost mezi rychlostí růstu a akumulací sekundárních metabolitů, podobně jako u námi sledované explantátové kultury Trifolium pratense L. Tento poznatek naznačuje určitý

antagonismus

primárního a sekundárního metabolismu, coţ na molekulární úrovni představuje rozdílné vyuţívání společných prekurzorů [38]. Vedle sledování růstu a produkce flavonoidů bylo dále orientačně zkoušeno, zda nově odvozené explantátové kultury Trifolium pratense L. jsou schopny produkovat isoflavonoidy (genistein, daidzein, formononetin a biochanin A). Pomocí HPLC [9] byla zjištěna u všech kultur pouze malá přítomnost isoflavonoidu formononetinu (0,01-0,02 %). Nově odvozená explantátová kultura je tedy schopna produkovat v malém mnoţství také isoflavonoidy, a proto bude dále pouţita pro další studie metabolismu těchto významných látek.

49

7. ZÁVĚR Dosaţené výsledky práce lze shrnout do následujících bodů: 1) Byla odvozena kalusová kultura z klíční rostliny čtyř odrůd Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint). 2) Pro kultivaci kalusové kultury Trifolium pratense L. je optimální ţivné médium podle Gamborga s přídavkem 2 mg.l-1 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny a 2 mg.l-1 6-benzylaminopurinu. 3) Z růstové a produkční charakteristiky vyplývá, ţe pro kalusovou kulturu Trifolium pratense L. je vhodný subkultivační interval 29 aţ 43 dní, neboť v tomto období subkultivace byl zaznamenán intenzivní růst kultury a vrchol produkce flavonoidů. 4) Nejvyšší produkce flavonoidů byla zjištěna u kalusové kultury odvozené z variety Sprint, a proto z ní bude odvozena suspenzní kultura. 5) U kalusové kultury Trifolium pratense L. (varieta DO-8, DO-9, Tempus, Sprint) byl stanoven isoflavonoid formononetin.

50

8. SEZNAM LITERATURY [1] Luczkiewicz, M., Glód, D.: Plant Sci. 165, 1101 (2003) [2] Dušek, J. et al.: Čes. a Slov. Farm 45, 204 (1996) [3] Thiem, B.: Plant Sci. 165, 1123 (2003) [4] Lozovaya, V. V. et al.: Plant Physiol. Biochem. 42, 671 (2004) [5] Federici, E. et al.: Phytochemistry 64, 717 (2003) [6] Li, W. et al.: Phytochemistry 58, 595 (2001) [7] Fedoreyev, K. et al.: Fitoterapia 71, 365 (2000) [8] Korbelář, J., Endris, Z.: Naše rostliny v lékařství, Avicenum, Praha 1981, s. 178 [9] Pízová, R.: Fytochemický výzkum nadzemní části Trifolium pratense L. (diplomová práce), Farmaceutická fakulta UK, 2004 [10] Rijke, E. D. et al.: J. Chromatogr. A 932, 55 (2001) [11] Wu, Q. et al.: J. Chromatogr. A 1016, 195 (2003) [12] Slavík, B. et al.: Květena České republiky, Academia, Praha 1995, s. 474 [13] Pilát, A., Ušák, O.: Atlas rostlin, SPN, Praha 1964, s. 108 [14] http://rostliny.prirodou.cz, 1.10.2005 [15] Hron, F., Zejbrlík, O.: Rostliny polí a zahrad, SPN, Praha 1974, s. 192-193 [16] Gran, J., Jung, R., Münker, B.: Bobulovité uţitkové a léčivé rostliny, Ikar, Praha 1996, s. 102 [17] Tsunoda, N., Pomeroy, S., Nestel, P.: J. Nutr. 132, 2199 (2002) [18] Berman, A., Kronenberg, F.: J. North Americ. Menopause Soc. 8, 335 (2001) [19] Zand, R. S. R., Jenkins, D. J. A., Diamandis, E. P.: Clinica Chimica Acta 312, 213 (2001) [20] http://faf.vfu.cz/index.php, 5.10.2005 [21] Hubík, J. et al.: Obecná farmakognosie II., Sekundární látky, SPN, Praha 1989, s. 31-36 [22] http://home.zf.jcu.cz/ ~dadakova/texty/flavon.htm, 7.10.2005 [23] http://mail.faf.cuni.cz/public, 7.10.2005 [24] Bruneton, J.: Pharmacognosy, Lavoisier Publ., Paris 1999, s. 172 [25] Mazur, W., Adlelercreutz, H.: Pure Appl. Chem. 70, 1759 (1998) 51

[26] Kaufman, P. B. et al.: J. Altern. Complem. Med. 3, 7 (1997) [27] Adlelercreutz, H., Mazur, W.: Ann. Med. 29, 95 (1997) [28] Kroyer, G. T.: Innovat. Food Sci. Emerging Technol. 5, 101 (2004) [29] Ren, M. Q. et al.: Eur. J. Nutr. 40, 135 (2001) [30] Routledge, E. J. et al.: J. Biol. Chem. 275, 35986 (2000) [31] Harris, H. A. et al.: Steroids 67, 379 (2002) [32] Setchell, K. D., Cassidy, A.: J. Nutr. 129, 758 (1999) [33] Kass-Annase, B.: Clin. Obstet. Gynecol. 43, 162 (2000) [34] Miksicek, R. J.: Soc. Exp. Biol. Med. 208, 44 (1995) [35] Hong, T. et al.: Biochem. Biophysic. Res. Comm. 317, 259 (2004) [36] Kuiper, G. G. et al.: Endocrinology 139, 4252 (1998) [37] Kuiper, G. G. et al.: Endocrinology 138, 863 (1997) [38] Kováč, J.: Explantátové kultury rostlin, Vydavatelství Univerzity Palackého, Olomouc 1995, s. 13-21, 26-27, 50-95 [39] Sikyta, B., Dušek, J.: Biotechnologie pro farmaceuty, 1. vydání, Karolinum, Praha 1992, s. 84-97 [40] Mayer, A. M.: Phytochemistry 22, 1329 (1983) [41] Ziv, M., Halevy, A. M.: Hort. Sci. 18, 434 (1983) [42] Novák, F. J.: Explantátové kultury a jejich vyuţití ve šlechtění rostlin, Academia, Praha 1990, s. 5-57 [43] Siatka, T.: Čes. a Slov. Farm. 44, 252 (1995) [44] Kamenická, A., Rypák, M.: Explantáty v rozmnoţování drevín, Veda, Bratislava 1989, s. 42-45 [45] Hilton, M. G., Rhodes, M. J. C.: Planta Med. 59, 340 (1993) [46] Dufresne, Ch., Cormier, F., Dorion, S.: Planta Med. 63, 150 (1997) [47] Murashige, T., Skoog, F.: Physiol. Plant. 15, 475 (1962) [48] Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C.: Can. J. Bot. 50, 199 (1972) [49] Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K.: Exp. Cell Res. 50, 151 (1968) [50] Nitsch, C., Nitsch, J. P.: Planta 72, 355 (1967) [51] Miller, C., O.: In: Moderne Methoden der Pflanzenanalyse 6, 194 (1963) [52] McCown, B., Lloyd, G.: Hort. Sci. 16, 453 (1981) [53] Sepehr, M. F., Ghornbanli, M.: Plant Cell Tis. Org. 68, 171 (2002) [54] Landa, Z. et al.: Uplatnění explantátových kultur v genetice a šlechtění, SPN, Praha 1980, s. 7-45 52

[55] Kincl, M., Causy, L.: Základy fyziologie rostlin, SPN, Praha 1977, s. 103-106 [56] Marvani, E.: Nat. Prod. Sci. 3, 75 (1997) [57] Jain, S. C., Purohit, M.: Herba Pol. 31, 115 (1985) [58] Poerba, Y. S.: Plant Physiol. 57, 5399 (1997) [59] Pederson, G. A.: Plant Sci. 45, 101 (1986) [60] Wang, H., Holl, F. B.: Plant Sci. 55, 159 (1988) [61] Bond, J. E., Webb, K. J.: Plant Sci. 61, 119 (1989) [62] Mizuhiro, M. et al.: Plant Sci. 160, 1221 (2001) [63] Beach, K. H., Smith, R. R.: Plant Sci. Lett. 16, 231 (1979) [64] Matkowski, A.: J. Plant Physiol. 161, 343 (2004) [65] Dušek, J., Zahradníček, M., Hubík, J.: Českoslov. Farm. 35, 313 (1986) [66] Kolektiv autorů: Český lékopis 2002, Grada, Praha 2002, s. 2155

53

OBSAH

1. ÚVOD........................................................................................................ 4 2. CÍL PRÁCE ................................................................................................. 5 3. TEORETICKÁ ČÁST .....................................................................................6 3.1. Jetel luční (Trifolium pratense L., Fabaceae) ....................................................6 3.1.1. Popis rostliny, výskyt .................................................................................... 6 3.1.2. Odrůdy ..................................................................................................... 8 3.1.3. Sběr, úprava, použití ................................................................................... 8 3.1.4. Obsahové látky .......................................................................................... 9 3.1.4.1. Flavonoidy ......................................................................................... 9 3.1.4.2. Isoflavonoidy ................................................................................... 11 3.2. Rostlinné explantáty .................................................................................. 13 3.2.1. Obecná charakteristika ............................................................................... 13 3.2.2. Vlastnosti rostlinných kultur ........................................................................ 15 3.2.3. Kultivace rostlinných kultur in vitro ............................................................... 15 3.2.3.1. Odvození kalusové kultury ............................................................. 15 3.2.3.2. Fyzikální podmínky kultivace ......................................................... 17 3.2.3.3. Ţivné médium ................................................................................. 19 3.2.3.4. Růstové regulátory .......................................................................... 21 3.2.3.5. Růstové fáze kultury ....................................................................... 26 3.2.4. Biotechnologické využití rostlinných explantátových kultur ................................ 28 3.2.4.1. Produkce sekundárních metabolitů .................................................. 28 3.2.4.2. Rozmnoţování a šlechtění rostlin .................................................... 31

54

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................ 33 4.1. Použitý materiál, př ístroje a pomůcky............................................................ 33 4.1.1. Rostlinný materiál .......................................................................................33 4.1.2. Chemikálie ...............................................................................................33 4.1.3. Př ístroje a pomůcky ................................................................................. 34 4.2. Kultivace explantátové kultury...................................................................... 34 4.2.1. Kultivační nádoby a nástroje, podmínky pasážování........................................ 34 4.2.2. Př íprava živného média .............................................................................35 4.2.3. Odvození kalusové kultury.......................................................................... 36 4.3. Stanovení růstové a produkční charakteristiky ................................................ 37 4.3.1. Stanovení růstového faktoru ......................................................................... 37 4.3.2. Stanovení obsahu flavonoidů..................................................................... 38 4.4. Stanovení obsahu isoflavonoidů................................................................... 39 5. VÝSLEDKY ............................................................................................... 41 5.1. Tabulková část ......................................................................................... 41 5.2. Obrazová část ......................................................................................... 46 6. DISKUSE .................................................................................................. 47 7. ZÁVĚR ..................................................................................................... 50 8. SEZNAM LITERATURY ................................................................................ 51

55

56

Explantátová kultura Trifolium pratense L

Recommend Documents