Invloed van concurrentie op genetische diversiteit en invloed van kroonbuislengte op zaadopbrengst in rode klaver (Trifolium pratense)

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013 – 2014

Invloed van concurrentie op genetische diversiteit en invloed van kroonbuislengte op zaadopbrengst in rode klaver (Trifolium pratense)

Winnie Poncelet Promotor: dr. Katrien Strubbe Tutors: dr. ir. Tim Vleugels, prof. Isabel Roldán-Ruiz

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

6 juni 2014 Winnie Poncelet,

Dr. Katrien Strubbe,

Abstract Nederlands Kernwoorden: rode klaver (Trifolium pratense), SSR merker, genetische diversiteit, bloemmorfologie, cultivar. Binnen deze thesis werden veranderingen in genetische diversiteit onderzocht van rode klaver (Trifolium pratense) in velden met concurrentie van Engels raaigras (Lolium perenne) in het kader van het Multisward EU-project voor de optimalisering van graslandgebruik. Dit gebeurde met behulp van simple sequence repeat (SSR) merkers. Gedurende twee jaar, van 2011 tot 2013, werden stalen genomen uit testvelden van monoculturen en mengsels van rode klaver en Engels raaigras. Over deze tijdspanne kon men geen systematische veranderingen in genetische diversiteit aantonen bij rode klaver. De gebruikte sets van SSR loci werden bruikbaar bevonden voor het karakteriseren van genetische diversiteit in dergelijke populaties en deze werden verder geoptimaliseerd. Voor de landbouw betekent dit dat rode klaver, ook gemengd met Engels raaigras, na ten minste twee jaar nog voldoende functionele diversiteit bezit, zonder risico op erosie van genetische diversiteit. Bijkomend werd de invloed van diverse bloemmorfologische kenmerken op de zaadopbrengst van rode klaver onderzocht. Planten van vijf diploïde en vijf tetraploïde cultivars werden bestudeerd voor kroonbuislengte, zaadopbrengst, aantal bloemhoofden per plant, aantal bloemen per bloemhoofd en fractie rijpe bloemhoofden bij zaadoogst. Kroonbuislengte, duizendkorrelgewicht en fractie rijpe bloemhoofden waren significant hoger bij tetraploïde cultivars dan bij diploïde cultivars. Zaadopbrengst en aantal bloemhoofden per plant waren significant hoger bij diploïde cultivars. Het aantal bloemen per bloemhoofd was niet significant verschillend tussen de ploïdiegraden. Er was geen significante correlatie tussen kroonbuislengte en zaadopbrengst. Zaadopbrengst was positief gecorreleerd met aantal bloemhoofden per plant. Zaadopbrengst was niet significant gecorreleerd met de resterende kenmerken. Het verhogen van zaadopbrengst van rode klaver kan gebeuren door veredeling naar meer bloemhoofden per plant.

Abstract English Key words: red clover (Trifolium pratense), SSR marker, genetic diversity, flower morphology, cultivars. In this thesis, a study was conducted about changes in genetic diversity of red clover (Trifolium pratense) when combined with perennial ryegrass (Lolium perenne), as part of the Multisward EUproject for optimizing grassland use. Simple sequence repeat (SSR) markers were used to characterize these changes over time. At two points, spring 2011 and spring 2013, samples were taken at testing fields of monocultures and mixtures of red clover and perennial ryegrass. During this period, no systematic changes in genetic diversity were observed for red clover. The sets of utilized SSR markers were found useful to characterize genetic diversity in these populations and were optimized for future research. For agriculture this means that red clover, even mixed with perennial ryegrass, maintains enough functional diversity for at least two year periods without risk of erosion of genetic diversity. Additionally, we studied the influence of various morphological flower traits on seed yield of red clover. For plants of five diploid and five tetraploid cultivars measurements were made for corolla tube length, seed yield, number of flower heads per plant, number of flowers per flower head and fraction of ripe flower heads at seed harvest. Corolla tube length, thousand seed weight and fraction of ripe flower heads were significantly higher for tetraploid cultivars than for diploid cultivars. Seed yield and number of flower heads per plant were significantly lower for tetraploid cultivars. The number of flowers per flower head did not differ significantly by ploidy. No significant correlation was found between seed yield and corolla tube length. Seed yield was positively correlated with amount of flower heads per plant. There was no correlation between seed yield and the other traits. For increasing seed yield of red clover through breeding, one can select for more flower heads per plant.

Voorwoord In dit voorwoord wil ik iedereen oprecht bedanken die betrokken was in het tot stand komen van deze thesis. Zonder de uitstekende begeleiding die ik gekregen heb aan het ILVO zou deze thesis er niet geweest zijn in de huidige vorm. In het bijzonder wil ik mijn mentor dr. ir. Tim Vleugels bedanken voor zijn uitstekende begeleiding bij elke aspect van de thesis, voor zijn kritische advies, om steeds te antwoorden op mijn vele vragen en voor de interessante en aangename gesprekken die zich niet enkel beperkten tot het onderwerp. Ook wil ik prof. Isabel Roldán-Ruiz bedanken voor de begeleiding van het deel over Multisward en het nalezen van mijn teksten. Haar kritische blik en kennis i.v.m. populatiegenetica waren onmisbaar. Ik bedank Nancy Mergan voor de goede begeleiding bij het praktische werk, voor het bijbrengen van vele praktische vaardigheden en voor de hulp bij het uitvoeren van praktisch werk waar dit nodig was. Verder bedank ik ook mijn promotor aan de Universiteit Gent, dr. Katrien Strubbe om me te motiveren om dit onderwerp te kiezen, voor het sturen van de thesis in de goede richting en voor het nalezen van mijn teksten. Ik bedank dr. Gerda Cnops voor het begeleiden van de voorbereidende bachelorproef en haar inbreng in het Multisward-experiment. Ik dank alle andere mensen aan het ILVO die in zekere mate betrokken waren bij de thesis, zoals Sabine Van Glabeke met het programma GeneMapper, voor hun hulp en om de periode tot een aangename ervaring te maken. Ten slotte wil ik ook mijn familie en vrienden bedanken voor de ondersteuning en het begrip voor de periodes van eenzame opsluiting die gepaard gaan met het schrijven van een thesis.

Inhoudsopgave Lijst met afkortingen .............................................................................................................................................1 Lijst met figuren .....................................................................................................................................................2 Lijst met tabellen ....................................................................................................................................................3 Inleiding ..................................................................................................................................................................4 1 Literatuurstudie ..................................................................................................................................................5

2

1.1 ILVO ..................................................................................................................................................5 1.2 Rode klaver ........................................................................................................................................6 1.2.1 Algemene kenmerken ....................................................................................................6 1.2.1.1 Oorsprong ........................................................................................................6 1.2.1.2 Morfologie .......................................................................................................6 1.2.1.3 Voortplanting ...................................................................................................7 1.2.1.4 Tetraploïde planten .......................................................................................... 7 1.2.2 Veredeling van rode klaver ............................................................................................ 8 1.2.2.1 Massaselectie ...................................................................................................8 1.2.2.2 Familieselectie .................................................................................................8 1.2.2.3 Polycross selectie ............................................................................................. 8 1.2.3 Landbouwkundige waarde van rode klaver ...................................................................9 1.2.3.1 Opbrengst .........................................................................................................9 1.2.3.2 Stikstoffixatie ...................................................................................................9 1.2.3.3 Voederwaarde ................................................................................................ 10 1.2.3.4 Persistentie ..................................................................................................... 11 1.2.4 Bloembiologie en bloemmorfologie ............................................................................ 11 1.3 Grasland .......................................................................................................................................... 13 1.3.1 Algemene kenmerken van graslanden ......................................................................... 13 1.3.2 Multi-species swards (MSS) ....................................................................................... 15 1.3.3 Voordelen van een voedergras – rode klavermengsel .................................................. 15 1.3.4 Interacties tussen rode klaver en voedergrassen .......................................................... 16 1.4 Analyse van genetische diversiteit ................................................................................................. 17 1.4.1 Genetische diversiteit ................................................................................................... 17 1.4.2 Genetische shift ............................................................................................................ 18 1.4.3 Het Hardy-Weinberg equilibrium ................................................................................ 19 1.4.4 Genetische merkers ...................................................................................................... 20 1.4.4.1 AFLP merkers ................................................................................................ 21 1.4.4.2 SSR merkers .................................................................................................. 21 1.4.4.3 SNP merkers .................................................................................................. 22 1.5 Lopend ILVO-onderzoek waarbinnen deze thesis kadert ........................................................... 22 1.5.1 Het Multisward-project ................................................................................................ 22 1.5.2 Het Multisward-experiment aan het ILVO .................................................................. 23 1.5.3 Onderzoek bloemmorfologie ....................................................................................... 24 1.5.3.1 Thesis Joke Dumortier ................................................................................... 25 1.5.3.2 Stage Frederik De Jonghe .............................................................................. 25 Materiaal en methoden ................................................................................................................................. 26 2.1 Multisward ...................................................................................................................................... 26 2.1.1 Zaaien en onderhoud van de planten ........................................................................... 26 2.1.2 Staalname ..................................................................................................................... 27 2.1.3 DNA extractie .............................................................................................................. 28

3

4

5

2.1.4 Voorbereiding van de DNA stalen ............................................................................... 29 2.1.5 SSR reacties ................................................................................................................. 30 2.1.6 Capillaire elektroforese ................................................................................................ 32 2.1.7 Verwerking van de SSR data ....................................................................................... 32 2.1.8 Statistische verwerking van de data ............................................................................. 33 2.2 Onderzoek bloemmorfologie .......................................................................................................... 34 2.2.1 Onderhoud van de planten ........................................................................................... 34 2.2.2 Verzamelen van de stalen ............................................................................................ 35 2.2.3 Verwerking van de stalen ............................................................................................ 36 Resultaten en bespreking.............................................................................................................................. 38 3.1 Multisward ...................................................................................................................................... 38 3.1.1 Herhalingen.................................................................................................................. 38 3.1.2 Vegetatieve vermenigvuldiging ................................................................................... 39 3.1.3 Controle van de representativiteit van de staalneming ................................................ 39 3.1.4 FIS-waarden .................................................................................................................. 41 3.1.5 Differentiatie tussen populaties.................................................................................... 43 3.1.5.1 Hypothese (i): er is een verschil in genetische diversiteit van tijdstip T1 naar tijdstip T5 ....................................................................................................... 43 3.1.6 Allelic richness en heterozygositeit ............................................................................. 44 3.1.6.1 Hypothese (ii): er is een vermindering in genetische diversiteit van tijdstip T 1 naar tijdstip T5................................................................................................ 44 3.1.6.2 Hypothese (iii): veranderingen in diversiteit zijn het gevolg van bepaalde omgevingsfactoren ......................................................................................... 46 3.2 Onderzoek bloemmorfologie .......................................................................................................... 47 3.2.1 Hypothese (i): de kroonbuislengte van tetraploïde cultivars is groter dan deze van diploïde cultivars ......................................................................................................... 47 3.2.2 Hypothese (ii): de zaadopbrengst van tetraploïde cultivars is lager dan deze van diploïde cultivars ......................................................................................................... 49 3.2.3 Hypothese (iii): er bestaat een negatieve correlatie tussen de kroonbuislengte en de zaadopbrengst .............................................................................................................. 51 3.2.4 Hypothese (iv): er bestaat een positieve correlatie tussen het totaal aantal bloemhoofden per plant en de zaadopbrengst .............................................................. 52 3.2.5 Hypothese (v): er bestaat een positieve correlatie tussen het aantal bloemen per bloemhoofd en de zaadopbrengst per plant .................................................................. 55 3.2.6 Hypothese (vi): er bestaat een positieve correlatie tussen de fractie rijpe bloemhoofden en de zaadopbrengst ..................................................................................................... 55 Conclusies ...................................................................................................................................................... 56 4.1 Multisward ...................................................................................................................................... 56 4.2 Bloemmorfologie ............................................................................................................................. 57 Referenties ..................................................................................................................................................... 58

Bijlage 1................................................................................................................................................................. 62 Bijlage 2................................................................................................................................................................. 63

Lijst met afkortingen AFLP bp cM cpDNA CTAB DKG EDTA FIS FST H Hj Ho HPLC HT HWE ILVO LG MSS mtDNA PCA PCR PPO SSR SNP TE buffer

amplified fragment length polymorphism basenparen centimorgan chloroplast DNA cetrimoniumbromide duizendkorrelgewicht ethyleendiaminetetra-azijnzuur fixatie-index inteeltcoëfficiënt heterozygositeit verwachte heterozygositeit geobserveerde heterozygositeit high performance liquid chromatography verwachte heterozygositeit Hardy-Weinberg equilibrium Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek linkage groep multi-species swards (multi-species graslanden) mitochondrial DNA principal component analysis polymerase chain reaction polyfenol oxidase simple sequence repeat single nucleotide polymorphism Tris-EDTA buffer

1

Lijst met figuren Figuur 1: De vier eenheden van het ILVO met hun onderzoeksdomeinen ......................................... 5 Figuur 2: Rode klaverplanten in bloei, gefotografeerd te Melle, België ............................................. 6 Figuur 3: Diversiteit van het V-teken tussen genotypen van de ILVO cultivar ‘Global’ .................... 7 Figuur 4: De stikstofcyclus, met stikstoffixatie door Rhizobium sp. rood omkaderd........................ 10 Figuur 5: Samenstelling bloem rode klaver....................................................................................... 12 Figuur 6: Meeldraden en stempel met pollen .................................................................................... 12 Figuur 7: Verdeling van grasland in Europa gebaseerd op data uit 2003, 2006 en 2009 .................. 14 Figuur 8: Piekpatroon van een diploïde rode klaverstaal met de merkers van set 2 ......................... 33 Figuur 9: Configuratie van het programma FSTAT .......................................................................... 34 Figuur 10: Meting in ImageJ van (a) kroonbuislengte en (b) bloemhoofdbreedte ............................ 37 Figuur 11: Aantal waargenomen verschillende allelen in functie van het aantal genomen stalen op T1 .......................................................................................................................................... 42 Figuur 12: PCA-plot van de rode klaverpopulaties ........................................................................... 48 Figuur 13: Gemiddelde kroonbuislengte per genotype, ingedeeld per cultivar voor alle tien cultivars ................................................................................................................................ 49 Figuur 14: Gemiddelde kroonbuislengte per cultivar en groepering van de cultivars volgens kroonbuislengte .................................................................................................................... 50 Figuur 15: Gemiddelde zaadopbrengst per cultivar en groepering van de cultivars volgens zaadopbrengst ....................................................................................................................... 52 Figuur 16: Scatterplot van de zaadopbrengst per plant vs. het aantal bloemhoofden per plant ........ 54 Figuur 17: Gemiddeld aantal bloemhoofden per plant per oogstdatum in functie van de oogstdatum ........................................................................................................................... 55 Figuur 18: Standaardafwijking van de oogstdatum in functie van het gemiddeld aantal bloemhoofden per cultivar.................................................................................................... 55

2

Lijst met tabellen Tabel 1: Samenstelling en zaaidichtheid van de testveldjes in zaden/m² .......................................... 26 Tabel 2: Bemestingsdata voor de testveldjes..................................................................................... 27 Tabel 3: Data van maaien en wieden van de testveldjes ................................................................... 27 Tabel 4: Samenstelling van de gebruikte buffers voor de DNA extractie ......................................... 28 Tabel 5: Details van de SSR primers ................................................................................................. 31 Tabel 6: Samenstelling van het PCR-mengsel per staal .................................................................... 31 Tabel 7: Het programma van de PCR................................................................................................ 31 Tabel 8: Gebruikte cultivars voor het onderzoek van de bloemmorfologie ...................................... 35 Tabel 9: Instellingen van Nikon D200 fototoestel ............................................................................ 36 Tabel 10: Aantal bruikbare stalen per populatie van de eerste resultaten en na herhaling ................ 39 Tabel 11: Waargenomen aantal verschillende allelen per locus voor iedere gebruikte SSR merker .......................................................................................................................... 40 Tabel 12: Maximaal aantal verschillende allelen per populatie ........................................................ 41 Tabel 13: Gemiddelde FIS-waarden over alle populaties per merker ................................................ 43 Tabel 14: Voorstel voor nieuwe SSR merkers .................................................................................. 44 Tabel 15: Verwachte heterozygositeit en verwachte allelische rijkdom per populatie ..................... 45 Tabel 16: Bovenkant: paarsgewijze FST-waarden per populatie; onderkant: significantie van de verschillen (p-waarden) ........................................................................................................ 46 Tabel 17: Gemiddelden en standaardfouten van de onderzochte bloemkenmerken per cultivar en per ploïdiegraad .................................................................................................................... 51

3

Inleiding Om de groeiende wereldbevolking te blijven onderhouden, is het ontwikkelen van nieuwe, duurzame landbouwtechnieken een noodzaak. Het Multisward EU-project is een internationale samenwerking van onderzoeksinstellingen met als doel het optimaliseren van het gebruik van graslanden in de landbouw. Aan het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) is in dit kader in 2011 een experiment gestart dat de genetische dynamiek bestudeert van rode klaver (Trifolium pratense) en Engels raaigras (Lolium perenne) in Multi-species swards (MSS). In deze thesis wordt het deel van dit experiment dat betrekking heeft op rode klaver behandeld. Naast het Multisward-experiment doet ILVO ook onderzoek naar de relatie tussen bloemkenmerken en zaadopbrengst bij rode klaver, met als doel de zaadopbrengst te verhogen via veredeling. In deze thesis werd onderzoek verricht binnen beide projecten. De doelstellingen van het Multisward-experiment zijn het nagaan en karakteriseren van veranderingen in genetische diversiteit bij rode klaver na enkele jaren van concurrentie met Engels raaigras. Op die manier wordt inzicht verkregen in de achterliggende mechanismen van genetische veranderingen met als ultiem doel het behouden van genetische diversiteit binnen rode klavercultivars na meerdere jaren van cultivatie. Binnen de context van genetische diversiteit zal een reeks simple sequence repeat (SSR) merkers geëvalueerd worden op zijn toepasbaarheid. Bij rode klaver is zaadopbrengst van cultivars een zeer belangrijke economische factor voor het gebruik in de landbouw. Bij een geringe zaadproductie zien zaadbedrijven hun winstmarges dalen, waardoor ze vaak vroegtijdig stoppen met het commercialiseren van cultivars die soms zeer waardevol zijn voor bijvoorbeeld opbrengst of ziekteresistentie. Een voorbeeld hiervan zijn tetraploïde cultivars: deze zijn productiever, persistenter en hebben doorgaans een hogere ziekteresistentie dan diploïde cultivars. De zaadopbrengst van tetraploïden is echter meestal gevoelig lager, waardoor veel zaadbedrijven stoppen met de commercialisering ervan. Het is moeilijk om te veredelen naar zowel hoge opbrengst en persistentie als hoge zaadopbrengst. Daarenboven is het moeilijk objectieve cijfers te bekomen voor zaadopbrengsten, omdat zaadproductie sterk afhangt van de locatie, het management van het gewas en de weersomstandigheden tijdens het oogstjaar. Ten slotte is rode klaver een insectenbestuiver en is de invloed van bestuiving op zaadopbrengst nog onvoldoende gekarakteriseerd. Het onderzoek naar bloemmorfologie bij ILVO heeft als doel het beter begrijpen van de invloed van bloemmorfologische kenmerken op zaadopbrengst bij zowel diploïde als tetraploïde cultivars, met als doel de zaadopbrengst te verhogen via veredeling. Dit is een aanzet naar een onderzoek over de rol van bestuivers in de zaadopbrengst van rode klaver.

4

1 Literatuurstudie 1.1 Instituut voor Landbouw en Visserijonderzoek

Het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) is een onafhankelijk onderzoeksinstituut, behorend tot de Vlaamse Overheid. De missie van het ILVO is het uitvoeren en coördineren van beleidsonderbouwend wetenschappelijk onderzoek en de daaraan verbonden dienstverlening vanuit een economisch, ecologisch en maatschappelijk perspectief. De hoofdactiviteit van het ILVO is het leveren van kwalitatief onderzoek, in samenwerking met binnen- en buitenlandse universiteiten, hogescholen, onderzoeksinstellingen, het beleid, de administratie en praktijkcentra. Hierbij wordt aan jonge en ambitieuze onderzoekers de mogelijkheid geboden om een wetenschappelijke carrière uit te bouwen (www.ilvo.vlaanderen.be). De specifieke onderzoeksactiviteiten worden onderverdeeld in vier eenheden: Plant, Dier, Technologie & Voeding en Landbouw & Maatschappij, elk met hun eigen onderzoeksdomeinen. Het organigram van de indeling is weergegeven in Figuur 1. Deze thesis gebeurt binnen twee onderzoeksdomeinen van de Eenheid Plant, namelijk Groei & Ontwikkeling en Toegepaste Genetica & Veredeling. In de Eenheid Plant van het ILVO wordt er veredeld in voedergewassen, nateelten, groenten en sierteeltgewassen. Dit valt onder het onderzoeksdomein Toegepaste Genetica & Veredeling. Binnen het onderzoeksdomein Groei & Ontwikkeling gebeurt meer strategisch basisonderzoek in functie van veredeling en teelttechniek optimalisatie.

Figuur 1: De vier eenheden van het ILVO met hun onderzoeksdomeinen (www.ilvo.vlaanderen.be).

5

1.2 Rode klaver

1.2.1 Algemene kenmerken 1.2.1.1 Oorsprong Rode klaver (Trifolium pratense L.) is een semi-persistent gewas dat behoort tot het geslacht Trifolium in de familie van de Fabaceae (vroeger Leguminosae) of vlinderbloemigen. Rode klaver heeft een levensduur van drie tot vier jaar (Taylor & Quesenberry, 1996). Enkele rode klaverplanten in bloei zijn weergegeven in Figuur 2. Rode klaver vindt zijn oorsprong in Zuidoost Eurazië. Doorheen de 16e en 17e eeuw werd rode klaver vanuit Turkije eerst verspreid naar Spanje en daarna via Vlaanderen naar de rest van Europa. Finaal werd rode klaver uitgevoerd naar Amerika en Oceanië. Hierdoor zijn er aangepaste rassen aanwezig in gebieden met erg variërende klimaten. Dit is gereflecteerd in het genoom van rode klaver, dat erg heterozygoot en divers is. Men vindt rode klaver terug in zowel vochtige als droge omstandigheden en zowel in kust- als berggebieden. Vandaag treft men rode klaver aan in bijna alle gematigde gebieden ter wereld (Kjærgaard, 1995; Taylor & Quesenberry, 1996).

1.2.1.2 Morfologie Doordat rode klaver in veel verschillende klimaten voorkomt, bestaan er duidelijke verschillen in morfologie tussen de lokale rassen. De planten worden doorgaans 20-60 cm groot en hebben bladeren die een spiraliserend patroon volgen. Op de bladeren is een bleek V-teken aanwezig dat varieert in vorm en grootte naargelang het genotype (Figuur 3) (Taylor & Quesenberry, 1996).

Figuur 2: Rode klaverplanten in bloei, gefotografeerd te Melle, België.

6

A

B

C

D

Figuur 3: Diversiteit van het V-teken tussen genotypen van de ILVO cultivar ‘Global’ (Vleugels, 2013).

De wortelstructuur van rode klaver is een hoofdwortel (penwortel) waaruit meerdere kleinere wortels groeien. Het wortelsysteem varieert echter sterk volgens bodemvochtigheid, bodemdichtheid, plantafstand en genetische factoren. Planten met een erecte groeihabitus hebben een diepe penwortel terwijl kruipende planten doorgaans een fibreuze wortelstructuur hebben (Taylor & Quesenberry, 1996).

1.2.1.3 Voortplanting Rode klaver is zelfincompatibel en kan bijgevolg in principe geen zelfbestuiving doen. Echter in uitzonderlijke omstandigheden, zoals temperaturen hoger dan 35 °C tijdens de bloei, kan toch een klein percentage zelfbestuiving optreden. In dat geval worden nakomelingen getroffen door een ernstige inteeltdepressie. Deze eigenschappen maken rode klaver tot een typische kruisbestuiver. Naast voortplanting via zaad (generatieve voortplanting) kan rode klaver ook vegetatief vermeerderd worden via stekken. In vitro vermeerdering is slechts mogelijk bij een beperkt aantal genotypen. De bestuiving van rode klaver gebeurt hoofdzakelijk door bijen en hommels (Taylor & Quesenberry, 1996; Boller et al., 2010).

1.2.1.4 Tetraploïde planten Rode klaver is van nature diploïd, met een haploïde chromosoomset van 7 (2n = 2x = 14). Sinds de ontdekking van colchicine in 1937 zijn er talloze onderzoeken gebeurd naar het verdubbelen van chromosomen bij planten, waaronder rode klaver. Door behandelen van kiemlingen van rode klaver met colchicine kan tetraploïdie geïnduceerd worden met 2n = 4x = 28. Andere technieken om tetraploïdie te induceren zijn distikstofmonoxidebehandeling en gametische non-reductie (Taylor & Quesenberry, 1996). In het algemeen zijn tetraploïde rassen persistenter en ziekteresistenter, zoals bijvoorbeeld tegen klaverrot (Vleugels et al., 2013). Bovendien hebben ze een hogere voedingswaarde, zijn ze meer bestand tegen ongedierte en hebben ze een hogere drogestof opbrengst. Het nadeel van tetraploïde rassen is echter de lagere zaadopbrengst (tot ruim 50% minder) en bijgevolg hogere zaadproductiekosten. Ook de zaairatio is hoger door het lager aantal zaden per eenheid van gewicht. Bij diploïde rassen wegen 1000 zaden ongeveer 2 g, terwijl dit bij tetraploïde rassen ongeveer 3 g is (Taylor & Quesenberry, 1996).

7

1.2.2 Veredeling van rode klaver Het doel van veredeling is om zo veel mogelijk positieve eigenschappen van een plant te verenigen in één ras of cultivar. Dit wordt echter gecompliceerd door negatieve correlaties tussen gewenste en ongewenste kenmerken. Zo zijn bijvoorbeeld bij rode klaver een kleine plantengrootte en een kruipende groeihabitus, ongewenste kenmerken, gecorreleerd met verhoogde persistentie, hetgeen wel gewenst is (Dias et al., 2008). Een andere correlatie heeft betrekking op planten die zeer sterk groeien in het eerste jaar: deze zijn meestal minder persistent. Ze spenderen al hun energie aan groei in het eerste jaar, ten koste van reservestoffen in de wortels die zorgen voor de persistentie. Dit betekent dat er bij veredeling vaak compromissen gesloten moeten worden in functie van het gewenste resultaat. De voornaamste voorwaarde om te kunnen veredelen naar een kenmerk is dat dit kenmerk erfelijk is. Veredeling naar gewenste kenmerken gebeurt in ruwweg drie stappen: eerst wordt een grote, brede populatie uitgezet. Daarna worden al deze planten geëvalueerd in termen van vooropgestelde parameters. Uiteindelijk worden de planten die het best scoren op deze parameters met elkaar gekruist om de volgende generatie te kweken. Drie mogelijke veredelingsmethoden in kruisbestuivende gewassen zoals rode klaver zijn massaselectie, familieselectie en polycross selectie (Taylor, 2008).

1.2.2.1 Massaselectie Bij massaselectie worden uit een grote, diverse groep planten zaden van de planten met de gewenste kenmerken geoogst in bulk. Deze zaden worden gebruikt om een nieuwe populatie uit te zetten en het proces wordt herhaald. Zo zal de frequentie van de genen betrokken bij de gewenste kenmerken verhoogd worden in de bekomen populatie, terwijl een groot deel van de genetische variatie behouden blijft (Taylor, 2008).

1.2.2.2 Familieselectie Familieselectie is het kruisen van planten die uit dezelfde populatie stammen, maar uit verschillende families. De term familie wordt hier gebruikt als een verzameling planten die afstammen van eenzelfde zaad producerende plant. De zaadoogst gebeurt per plant zodat de afkomst (moederlijke bijdrage) van de zaden gekend is. Enkel de beste planten uit de beste families worden met elkaar gekruist in een volgende generatie. Uiteindelijk worden een vijftal families (soms meer) gecombineerd om een kandidaat ras te maken. Families die ook planten met slechte eigenschappen bevatten, worden niet gebruikt omdat ook de goede planten uit deze families vaak drager zijn van negatieve allelen voor de gewenste eigenschappen. Men zal bij familieselectie sneller de gewenste resultaten bekomen dan bij massaselectie, maar de genetische variatie zal sneller verlaagd worden in latere generaties (Taylor, 2008).

1.2.2.3 Polycross selectie Om polycross selectie toe te passen worden meerdere planten met de gewenste kenmerken gestekt. Ze worden in verschillende combinaties bij elkaar uitgezet om te kruisen en de zaden worden in bulk geoogst per veldje. Meerdere combinaties met stekken van verschillende genotypen kunnen getest worden op verschillende veldjes. De zaden geoogst op elk veldje noemt men synthetische populaties. 8

Deze zaden worden uitgezaaid en de nakomelingen worden geëvalueerd op de selectiekenmerken. De synthetische populaties die het best scoren, kunnen worden aangemeld als kandidaat-cultivars (candivars) (Taylor, 2008).

1.2.3 Landbouwkundige waarde van rode klaver 1.2.3.1 Opbrengst Door zijn groeihabitus is rode klaver zeer geschikt als maaigewas, zowel in monocultuur als in mengteelt met voedergrassen. Witte klaver daarentegen is meer geschikt voor begrazing. Rode klaver heeft een hoge opbrengst: 13 ton droge stof per hectare per jaar in goede omstandigheden (d.i. aangepaste bemesting, aangepast maairegime en goede weersomstandigheden). Het is waardevol als voedergewas door zijn hoge verteerbaarheid en hoog gehalte aan ruw eiwit (tot 18%) en onverzadigde vetzuren (omega-3 vetzuren). Door de stikstoffixatie van bacteriën geassocieerd aan rode klaver zijn zowel opbrengst als eiwitgehalte, in tegenstelling tot deze van voedergrassen, niet afhankelijk van de toegediende stikstofbemesting. Hierdoor behoudt rode klaver een hoog eiwitgehalte gedurende het hele groeiseizoen, terwijl het eiwitgehalte van voedergrassen hoog is in het voorjaar, maar daarna gevoelig daalt door gebrek aan stikstof. Door rode klaver en voedergrassen in mengteelt te telen, kan de landbouwer voorzien in een redelijk constante aanvoer van voedereiwitten. Een bijkomend voordeel van rode klaver over bijvoorbeeld alfalfa, dat vaak gebruikt wordt als voedergewas onder maaivoorwaarden in warmere en drogere klimaten, is de aanwezigheid van het enzym polyfenoloxidase (PPO). PPO zorgt voor een efficiëntere opname van stikstof bij herkauwers (Sullivan & Hatfield, 2006) en inhibeert de proteolyse tijdens inkuilen (Pahlow et al., 2003). PPO remt ook de hydrogenatie van onverzadigde verzuren in de pensmaag, zodat koeien die rode klaver in hun dieet hebben meer omega-3 vetzuren afscheiden in hun melk en vlees (Taylor & Quesenberry, 1996). Nadelen van rode klaver zijn het gebrek aan persistentie en de aanwezigheid van hoge gehaltes aan isoflavonen in sommige rassen. In schapen kunnen deze isoflavonen, vooral formononetin, leiden tot abortie en tijdelijke onvruchtbaarheid (Adams, 1995). Intussen zijn er cultivars beschikbaar met een verlaagd formononetin gehalte, waaronder ‘Formica’, ‘Crossway’ en ‘Broadway’, die meer geschikt zijn voor begrazing door schapen.

1.2.3.2 Stikstoffixatie Door de symbiose met stikstoffixerende bacteriën, Rhizobium trifolii, produceert rode klaver tot 400 kg stikstof per hectare per jaar (Taylor & Quesenberry, 1996). Deze N-fixatie door vlinderbloemigen is een essentiële stap in de N-cyclus (zie Figuur 4). Een deel van de gefixeerde stikstof loogt uit via de wortels, accumuleert in de bodem en wordt beschikbaar voor het volggewas of voor het gewas in mengteelt. Wanneer gras en klaver in mengteelt geteeld worden, kan het gras bijgevolg een deel van de uitgeloogde gefixeerde stikstof gebruiken. De accumulatie van stikstof maakt rode klaver een geschikt gewas voor groenbemesting en het wordt dan ook vaak in rotatie geteeld met andere gewassen zoals granen. Door de diepe penwortel heeft rode klaver bovendien verbeterende effecten op de bodemstructuur. De groei en drogestof opbrengst van rode klaver hangen uiteraard af van de fosforen vooral de kaliumconcentratie in de bodem. Er moet dan ook voldoende bemest worden met deze twee mineralen (bv. P2O5 en K2O) om goede groeiomstandigheden te creëren. 9

Figuur 4: De stikstofcyclus, met stikstoffixatie door Rhizobium sp. rood omkaderd (Benjamin Cummings, 2005).

Een goed ontwikkeld rode klaver gewas heeft behoefte aan 0 kg N, 120 kg P2O5 en 400 kg K2O per hectare per jaar. Momenteel limiteert het mestactieplan 4 (MAP4) de fosfaatbemesting op rode klaver echter tot 65 kg P2O5 per hectare per jaar, om reden dat de Belgische bodems een voldoende grote voorraad fosfaat zouden bevatten.

1.2.3.3 Voederwaarde De verteerbaarheid van rode klaver is lager dan deze van bv. raaigrassen (Lolium spp.), maar rode klaver wordt wel sneller verteerd. Dit is een duidelijk voordeel, want zo kunnen herkauwers sneller een volgende maaltijd eten en bijgevolg meer nutriënten opnemen per dag. Hoewel witte klaver en tetraploïde rode klaver een hogere concentratie aan ruw eiwit en aminozuren bevatten dan diploïde rode klaver, hebben diploïde rode klaverplanten een hogere biologische waarde doordat ze een hogere concentratie aan essentiële aminozuren bevatten. Hun biomassa bevat hogere concentraties aan lysine, methionine en leucine (Penkov et al., 2003).

10

1.2.3.4 Persistentie De levensduur van individuele rode klaverplanten is doorgaans 3 tot 4 jaar. Dit wordt echter sterk beïnvloed door stressfactoren zoals ziekten, begrazing, insectenvraat, vorstschade, vochtigheid en competitie met andere gewassen. Bij begrazing zijn de meeste rode klavercultivars weinig persistent, dus dit mag niet te intens gebeuren. Ook bodemuitputting (meestal door kaliumgebrek) zal de levensduur verkorten. Dit kan voorkomen worden door voldoende te bemesten. Verder kunnen ook ziekten de levensduur verkorten. De belangrijkste ziekten worden veroorzaakt door schimmels: klaverrot (Sclerotinia trifoliorum), wortelrot (voornamelijk Fusarium spp.), echte meeldauw (Erysiphe trifolii) en roest (Uromyces trifolii). Verder kunnen ook meerdere virale ziekten en nematoden, vooral de stengelnematode Ditylenchus dipsaci, ernstige schade veroorzaken in rode klaver (Taylor & Quesenberry, 1996). In Europa heeft rode klaver relatief weinig last van insectenvraat. Insecten waar rode klaver mee te kampen kan hebben, zijn onder andere bladluizen, dwergcicaden en verscheidene soorten kevers. Haartjes op de stengel en bladeren kunnen bescherming bieden tegen insectenaanvallen. Ook kan er veredeld worden naar tolerantie tegen specifieke insectensoorten (Taylor & Quesenberry, 1996).

1.2.4 Bloembiologie en bloemmorfologie Rode klaverplanten in bloei produceren meerdere bloemhoofden: clusters met 50 tot 300 bloempjes. Het bloemhoofd wordt geflankeerd door schutbladen zonder omwindsel. De kleine bloempjes zijn bilateraal symmetrisch (zie Figuur 5). Ze bestaan uit een kelk met vijf lobben, een kroonbuis met vijf blaadjes, een standaard, twee vleugels en twee samengegroeide kielblaadjes (Taylor & Quesenberry, 1996). De bloempjes bevatten zowel de mannelijke voortplantingsorganen (meeldraden) als het vrouwelijk voortplantingsorgaan (stamper). De kroonbuis van rode klaver is zygomorf en heeft een witte tot violette kleur. Zij is langwerpig en komt samen in de bloemkelk. Binnenin de kroonbuis zitten tien meeldraden die in een cirkel staan rond de iets langere stamper (zie Figuur 6). Deze komt tot net aan de mond van de kroonbuis en is omgeven door de kielblaadjes. De nectarklieren bevinden zich onderaan de bloem in een ring rondom de basis van de stamper (Taylor & Quesenberry, 1996). Tetraploïde planten vertonen morfologische verschillen met diploïde planten. De grotere bloemen, en bijgevolg de langere kroonbuizen, van tetraploïde cultivars is het belangrijkste verschil (Bond & Fyfe, 1968; Muntean, 2008). De lagere zaadopbrengst van tetraploïde planten wordt vaak toegeschreven aan dit feit. Honingbijen en sommige hommelsoorten met korte tongen (bv. Bombus terrestris) kunnen namelijk moeilijkheden ondervinden om de nectarklieren te bereiken wanneer de kroonbuis te lang is. Verder zijn tetraploïde planten groter dan diploïde planten, hebben ze ruwere stengels, dikkere en rondere bladeren, grotere bloemhoofden en grotere zaden. Diploïde planten scoren algemeen beter op de morfologische kenmerken geassocieerd met zaadopbrengst (Muntean, 2008).

11

Figuur 5: Samenstelling bloem rode klaver (naar Johnston, 2006).

Figuur 6: Meeldraden en stempel met pollen (naar Johnston, 2006).

12

1.3 Grasland 1.3.1 Algemene kenmerken van graslanden Graslanden zijn oppervlakten met gras (in de brede zin van het woord) die gecultiveerd worden voor diervoeding. Een kaart van de verdeling van het grasland in Europa is weergegeven in Figuur 7. Het is duidelijk dat grasland een belangrijke rol speelt in Europa. Indien grasland niet gebruikt wordt zal dit in een Europees klimaat evolueren naar heide of bos. Grasland bestaat bijgevolg enkel door haar gebruik door landbouwers en veehouders. Zo vormt grasland de essentiële eerste stap in het voederen van vee en uiteindelijk de bevoorrading van melk en vlees voor de mens. Andere toepassingen zijn biomassaproductie voor biogas en bioraffinage (Encyclopedia Pratensis). Door de steeds toenemende vraag en concurrentie ten gevolge van de globalisering, is deze eerste stap van de voedselketen zeer belangrijk. De vraag naar producten moet kunnen beantwoord worden op een manier die economisch haalbaar is voor de landbouwers en zo weinig mogelijk belastend is voor het milieu (Encyclopedia Pratensis). De laatste 30 jaar is het aantal graslanden in Europa sterk gedaald ten voordele van maïsproductie en andere éénjarige gewassen. Hierdoor is er de noodzaak om de aanwezige graslanden zo efficiënt mogelijk te benutten (Multisward doelstelling 1.1). Naast hun directe landbouwkundige waarde spelen graslanden een belangrijke biogeochemische rol: ze belemmeren de transfer van stikstof en chemicaliën naar omliggende waterstromen en grondwater, ze slaan koolstof uit de atmosfeer op en ze zorgen voor de ophoping van biomassa in de bodem. De captatie van koolstof zorgt voor een verlaging van het broeikaseffect, maar dit wordt deels tegengegaan door het uitstoten van andere broeikasgassen zoals N2O bij denitrificatie in de bodem en zoals methaan van grazende herkauwers. Ook bodemerosie wordt tegengegaan door graslanden, doordat ze de bodem permanent bedekken en een dicht wortelsysteem bezitten. Grasland heeft ook een positieve invloed op de perceptie van ‘natuurlijkheid’ van een landschap. Dit betekent een voordeel voor recreatie en toerisme. Een belangrijke ecologische functie van graslanden is hun rol als habitat. Graslanden bewaren de biodiversiteit van diverse planten en dieren. Deze biodiversiteit hangt af van de complexiteit van de aanwezige planten en de manieren waarop het grasland onderhouden wordt. Het aantal soorten bestuivers is bijvoorbeeld positief gecorreleerd met het aantal soorten planten in een grasland. De populatiegrootte van vogels, vlinders, slakken en kevers hangt ook in grote mate af van de diversiteit van graslanden (Encyclopedia Pratensis). De productiviteit van grasland hangt af van verschillende factoren zoals de gebruikte species en cultivars, de bodemkarakteristieken, het klimaat en het management (graas- of maaiweiden, de bemesting en het onkruidbeheer). De voornaamste klimaatcondities die een rol spelen zijn temperatuur en regenval, zowel het totaal als de seizoensgebonden verdeling ervan. Extreme hitte, regenval en droogte kunnen de productiviteit van grasland verminderen (Craine, 2012). Naast weersomstandigheden zijn het maai- en bemestingsregime zeer bepalend voor de opbrengst.

13

Figuur 7: Verdeling van grasland in Europa gebaseerd op data uit 2003, 2006 en 2009 (Agricultural intensity data, www.ivm.vu.nl).

Het geslacht van de raaigrassen (Lolium) omvat Engels raaigras (Lolium perenne) en Italiaans raaigras (Lolium multiflorum), twee frequent gebruikte grassoorten in koude tot gematigde klimaten (waaronder België). Waar Italiaans raaigras omwille van zijn snelle jeugdgroei en vroege start in het voorjaar voornamelijk gebruikt wordt voor éénjarig grasland, wordt Engels raaigras meestal gebruikt voor meerjarig grasland omwille van zijn betere winterhardheid. In West-Europa is Engels raaigras een van de meest gebruikte voedergrassoorten. Van Engels raaigras bestaan cultivars aangepast aan maaicondities en begrazingscondities. Moderne cultivars hebben een hoge opbrengst onder intensieve omstandigheden, een goede verteerbaarheid en een hoge smakelijkheid voor het vee (Vandewalle, 2007). Als voedergewas wordt Engels raaigras vaak geteeld in combinatie met rode (voor maaibeheer) en witte klaver (voor begrazing) (Cool, et al., 2004).

14

1.3.2 Multi-species swards (MSS) Onder multi-species swards (MSS) verstaat men graslanden met meerdere plantensoorten. Het belang van MSS ligt in het diversiteiteffect. Dit effect kan gedefinieerd worden als de betere prestaties van soortenmengsels ten opzichte van monoculturen van de samenstellende componenten (Multisward doelstelling 2.4). De voordelen zijn onder andere te danken aan complementariteit en positieve interacties tussen de plantensoorten in het mengsel. De diversiteit is tweeledig: ten eerste is er het aantal species in een bepaald gebied en ten tweede is er de gelijkmatigheid van het mengsel, namelijk hoe gelijkmatig de biomassa verdeeld is over de verschillende species in dat gebied. Hoewel de relatie tussen biodiversiteit en het functioneren van ecosystemen nog onvoldoende begrepen is, kan een verlies aan biodiversiteit een grote impact hebben hierop en op het gebruik in de landbouw. Het is moeilijk te achterhalen hoeveel species er nodig zijn om een maximaal diversiteiteffect te bekomen, maar het is wel duidelijk dat een soortenrijk mengsel niet noodzakelijk zal voldoen aan de hoofdeis van landbouwers: een hoge opbrengst in een productief en stabiel milieu (Multisward doelstelling 2.4). Terwijl een soortenrijk mengsel met zijn multifunctionaliteit in heterogene milieus een voordeel kan betekenen, zou het in minder veeleisende milieus praktischer zijn om hetzelfde resultaat te bekomen met een mengsel van weinig, maar goed aangepaste species. Men benadert het probleem beter in termen van functionele diversiteit van de samenstellende plantensoorten dan van species diversiteit. Een functionele eigenschap is elke morfologische, fysiologische of fenologische eigenschap van een individu die een invloed heeft op zijn geschiktheid op vlak van groei, voortplanting en overleving. Bijkomend kunnen MSS ook een invloed hebben op eigenschappen van het ecosysteem zoals de tijdsdistributie van de opbrengst, stabiliteit van de opbrengst, voederkwaliteit, de opname door dieren, weerstand tegen stress, onkruidinvasie, koolstofopslag, wateropname en reductie van stikstofverliezen naar de omgeving. Zo is een meer volledig gebruik van middelen uit de omgeving een van de mogelijke verklaringen voor de verhoogde resistentie tegen invasie van niet-gezaaide planten, een bijkomend voordeel van MSS (Frankow-Lindberg et al., 2009). Het succes van het combineren van twee species hangt ook af van hun initiële relatieve hoeveelheden. Het optimaliseren van de verhoudingen is nodig voor een blijvend verhoogde productiviteit (Multisward doelstelling 2.4). De voorbije decennia werden hoofdzakelijk monoculturen van voedergrassoorten gebruikt in landbouwkundige context. De belangrijkste reden hiervoor in België is het mestoverschot. In België mag men meer stikstofbemesting toepassen op monoculturen van voedergras onder maaivoorwaarden dan op mengsels met klaver. Als gevolg hiervan mogen mengteelten met rode klaver minder stikstofbemesting krijgen, waardoor boeren blijven zitten met hun stalmest. Een tweede belangrijke reden is dat dicotyle onkruiden makkelijker te bestrijden zijn in grasland zonder klaver. Veel (maar niet alle) herbiciden tegen dicotylen in grasland doden ook de klaver af. Bijkomstige redenen voor het gebruik van monoculturen zijn het eenvoudigere onderhoud en de relatief lage kost van minerale meststoffen (vooral in het verleden) (Multisward doelstelling 2.4).

1.3.3 Voordelen van een voedergras - rode klavermengsel Een mengsel van voedergras en rode klaver heeft enkele duidelijke voordelen over hun monoculturen. Het belangrijkste voordeel bestaat erin dat het stikstofmetabolisme van de voedergrassen positief beïnvloed wordt, wat leidt tot een hogere opbrengst. Grassen beginnen vroeger met groeien in het voorjaar dan rode klaver. Dit is een vorm van concurrentie: bij een hoog gehalte aan stikstof zullen 15

grassen meer stikstof uit de bodem opnemen en de klaverplanten overgroeien, waardoor de grassen zonlicht blokkeren voor de klaverplanten. In de zomer is het echter andersom: de stikstof in de bodem is nu grotendeels opgebruikt en de voedergrassen groeien trager. Doordat rode klaver door symbiose zijn eigen stikstof fixeert, groeit deze nu veel beter dan de grassen. Bovendien wortelt rode klaver dieper dan voedergras, waardoor het beter bestand is tegen eventuele droogteperiodes. De dominantie van klaver in de zode op het einde van de zomer zorgt ervoor dat stikstof zich ophoopt in de bodem, wat dan weer de groei van de grassen stimuleert (de zogenaamde ‘paradox of enrichment’). Het totaalbeeld is een dynamisch systeem van negatieve feedback waarbij op lange termijn een competitief evenwicht ontstaat tussen het voedergras en rode klaver. Doordat beide soorten elkaar aanvullen, blijft de voederkwaliteit van het gras - klavermengsel doorheen het jaar nagenoeg constant (Black et al., 2009). Een bijkomend voordeel situeert zich op vlak van voedingswaarde. Rode klaver en grassen zijn hierin erg complementair. Voedergras is in het voorjaar even eiwitrijk als rode klaver, maar wordt sneller taai en vezelig waardoor de kwaliteit vermindert. Voedergrassen hebben een hoog suikergehalte doorheen het ganse groeiseizoen, terwijl rode klaver een constant eiwitgehalte heeft. Het resultaat is een evenwichtig en voedzaam mengsel doorheen het ganse groeiseizoen. Ten slotte bestaat er ook op vlak van morfologie complementariteit tussen rode klaver en voedergrassen. Rode klaver bezit een diepe penwortel, terwijl grassen in het algemeen een ondiepe fibreuze wortelstructuur hebben. Zo treden deze soorten minder in competitie met elkaar voor nutriënten.

1.3.4 Interacties tussen rode klaver en voedergrassen De voornaamste factoren onderhevig aan concurrentie tussen grassen en klaver zijn licht, nutriënten en water. Andere omgevingsfactoren, zoals weersomstandigheden, spelen echter een grote rol bij de relatieve belangrijkheid van deze factoren. Bladgrootte is een belangrijke factor voor het competitief vermogen van planten, want het bepaalt de hoeveelheid licht dat de plant opvangt. Betere prestaties werden ook gelinkt aan langere bladstelen, een hogere kruin en een hogere plasticiteit van de bladsteel (het vermogen om de bladsteel te verlengen als respons op schaduwvorming). De bladgrootte bleek een invloed te hebben op hoe zwaar deze bladkenmerken doorwegen op de prestaties (Annicchiarico, 2003). Een voordeel van klaver over gras is dat de bladeren van klaver doorgaans horizontaal georiënteerd staan, waardoor ze efficiënter licht opvangen dan de verticaal georiënteerde bladeren van grassen (Black et al., 2009). Klaver heeft deze hogere lichtintensiteiten nodig voor een maximale groeisnelheid (Haynes, 1980). Zoals hoger vermeld beginnen grassen vroeger in het voorjaar te groeien, waardoor ze de klaverplanten al gauw gaan overschaduwen. Na verloop van tijd wordt er echter een dynamisch evenwicht bereikt (Black et al., 2009). De intensiteit van begrazing of maaien is een belangrijke factor die de competitie tussen de aanwezige plantensoorten beïnvloedt. Het vermogen van een plant om snel terug bladeren te vormen is bepalend in de competitie voor licht. Rode klaver is minder goed in staat om snel bladeren te produceren na het grazen of maaien dan voedergras. Sommige rode klavercultivars hebben echter een hogere hergroeicapaciteit en/of zijn meer vertakt, waardoor ze beter geschikt zijn voor gebruik in mengsels met voedergras.

16

Door de verschillen in wortelstructuur haalt rode klaver nutriënten uit een diepere zone in de bodem en is er relatief weinig competitie met voedergrassen (Mengel & Steffens, 1985). Voedergras neemt wel meer nutriënten op dan rode klaver, omdat zijn wortels fijn zijn en een groter bodemvolume innemen (Haynes, 1980). Een ander gevolg van de diepe penwortel van rode klaver is een hogere weerstand tegen langdurige droogteperiodes. Bij een voldoende vochtigheidsgraad verbruikt gras echter meer water dan rode klaver. Ook het gehalte aan stikstof dat in de bodem uitloogt, speelt een rol bij competitie. Men zou verwachten dat de opbrengst van voedergras in een mengsel met klaver achteruit gaat door de competitieve effecten. De opbrengst van het voedergewas blijft echter constant, aangezien de competitieve effecten worden tegengegaan door de extra stikstof die beschikbaar wordt door de stikstoffixatie van klaver (Annicchiarico, 2003). Bemesting, ten slotte, heeft ook een invloed op een gras - klaver mengsel. De extra stikstof is voornamelijk een voordeel voor de voedergrassen, terwijl de rode klaver dan weer meer bevoordeeld wordt door een ruime fosfaat- en kaliumbemesting. Bij een ruime stikstofbemesting zal het voedergras de klaver meer overgroeien, waardoor deze minder licht krijgt en het aandeel van rode klaver in het mengsel daalt (Black, 2009).

1.4 Analyse van genetische diversiteit 1.4.1 Genetische diversiteit Het concept van genetische diversiteit zoals het hier behandeld wordt, is gelinkt aan populaties van een bepaald species. Genetische diversiteit binnen een dergelijke populatie heeft betrekking op de allelfrequenties binnen die populatie. Er zijn twee aspecten aan deze genetische diversiteit: enerzijds is er het aantal verschillende allelen, anderzijds zijn er de verhoudingen van de allelfrequenties ten opzichte van elkaar. Genetische diversiteit is belangrijk voor het aanpassingsvermogen van een species aan veranderende omgevingsfactoren zoals het koloniseren van nieuwe gebieden of niches, of het veranderende klimaat. Verder is genetische diversiteit in het algemeen gecorreleerd met fitheid van nakomelingen en de persistentie als species (Rogers, 2006). Op de productiviteit van witte klaver heeft genetische diversiteit op zich echter geen invloed, noch in monocultuur noch in mengcultuur. Dit spreekt in het voordeel van genetisch minder diverse cultivars die beter aangepast zijn aan een weinig variabele omgeving (Annicchiarico & Piano, 1997). Veranderingen in genetische diversiteit treden steeds op doorheen de tijd in alle populaties. Men kan ze grofweg indelen in vier groepen op basis van hun oorzaak. Als eerste zijn er de evolutionaire veranderingen, dewelke de basis zijn van de evolutietheorie van Darwin. Veranderende omgevingsfactoren oefenen een zekere selectiedruk uit op een populatie, waardoor hierin een genetische shift optreedt. Een tweede vorm van verandering in genetische diversiteit wordt genetische drift genoemd. Dit effect treedt op door toevallige veranderingen in kleine populaties en zorgt voor willekeurige veranderingen in genetische diversiteit doorheen de generaties. Een derde vorm is de introductie van nieuw genetisch materiaal door migratie uit andere populaties. Ten slotte kan de genetische samenstelling van een populatie veranderen door de recombinatie die optreedt bij voortplanting. Recombinatie kan statistisch goed gekarakteriseerd worden, terwijl migratie beperkt kan worden tijdens experimenten en genetische drift niet voorkomt als er geen seksuele voortplanting gebeurt. De invloed van omgevingsfactoren op populaties moet echter empirisch bepaald worden via grootschalige experimenten en is nog niet helemaal begrepen (Roldán-Ruiz, 2013). 17

Voor het brede toepassingsgebied van rode klaver is het behouden van genetische variatie erg belangrijk. Hiervoor is het nodig om de biotische en abiotische factoren te begrijpen die een impact kunnen hebben op de genetische diversiteit (Greene et al., 2004). Om nieuwe cultivars te ontwikkelen vertrekt men best van een populatie die zowel genetisch als morfologisch zo divers mogelijk is (Göransson et al., 2012). Uit een studie van Herrmann et al. (2005) blijkt dat Zwitserse 'Mattenklee' landrassen een hoge graad van genetische diversiteit bezitten. Door de strikte normen in verband met onderscheidbaarheid, uniformiteit en stabiliteit van nieuwe cultivars is het belangrijk dat men de genetische diversiteit in kaart brengt en controleert (Collins et al., 2012).

1.4.2 Genetische shift Gezien de grote diversiteit aanwezig in een rode klavercultivar en de manier waarop deze cultivars veredeld worden (zie 1.2.2), kan men een rode klavercultivar als een genetisch zeer heterogene ‘populatie’ beschouwen (Collins et al., 2012). Eens deze cultivar gezaaid wordt voor landbouwkundig gebruik, zullen bepaalde genotypen zich vestigen en verder groeien, terwijl andere genotypen na verloop van tijd verloren zullen gaan. In afwezigheid van bloei, zaadproductie of migratie, wordt een daling van de diversiteit over tijd verwacht. De specifieke set van ‘overlevende’ genotypen zal sterk afhangen van zowel biotische en abiotische factoren zoals hierboven beschreven. In deze context spreekt men van genetische shifts. Men mag genetische shift niet verwarren met fenotypische plasticiteit. Genetische shift slaat op het verschil tussen dezelfde populatie op verschillende tijdstippen. Genetische plasticiteit is een maat voor hoe dezelfde populatie presteert onder verschillende omgevingsomstandigheden. Cultivars die goed aangepast zijn aan hun omgeving ondergaan weinig genetische shift (Collins et al., 2002). De selectiedruk die omgevingsfactoren uitoefenen op populaties kan ingedeeld worden volgens het effect dat ze hebben op de diversiteit. Bij stabiliserende selectie ondervinden de meest extreme fenotypes de grootste selectiedruk, waardoor het optimale fenotype samenvalt met het gemiddelde. Dit vermindert de variatie binnen de populatie, zodat de diversiteit verlaagd wordt. Directionele selectie bevoordeelt in een fenotypisch spectrum enkel individuen aan één kant. Disruptieve selectie bevoordeelt individuen met extreme fenotypische kenmerken (Taggart, 2001). Wanneer de omgevingsomstandigheden sterk afwijken van de omstandigheden waaraan de populatie aangepast is, spreekt men over stress. Onder stressomstandigheden zal stabiliserende selectie doorgaans kenmerken met een hoge aanpassingsgraad naar uniformiteit dwingen. Als de omgevingsfactoren echter jaar na jaar sterk verschillen, zullen planten geselecteerd worden met een hoge morfologische en genetische diversiteit. De voornaamste stressfactor bij planten is temperatuur, naast competitie, bodemvochtigheid, neerslag en intensieve begrazing of maaien (Collins et al., 2001). Zo hebben Collins et al. (2001) een directionele selectie aangetoond onder invloed van lage temperaturen op vlak van morfologische en voortplantingskenmerken in witte klaver. Door lage temperaturen treedt een verschuiving op naar genotypen met een verhoogd gehalte aan onverzadigde vetzuren en geaccumuleerde koolhydraten. Deze kenmerken spelen een belangrijke rol in de koudetolerantie bij planten en staan onder stabiliserende selectie (Helgadóttir et al., 2001; Göransson et al., 2012).

18

1.4.4 Het Hardy-Weinberg equilibrium Om de genetische diversiteit van populaties te karakteriseren maakt men gebruik van bepaalde principes. Het Hardy-Weinberg equilibrium principe speelt hierin een belangrijke rol. Het Hardy-Weinberg theorema is een centraal concept in de populatiegenetica. Het basisprincipe is dat allel- en genotypenfrequenties van generatie op generatie constant blijven in voldoende grote populaties (Roldán-Ruiz, 2013; Shane's Simple Guide to F-statistics, www.library.auckland.ac.nz). De genotypenfrequenties in de volgende generatie zullen een evenwicht benaderen, het Hardy-Weinberg equilibrium (HWE), dat volledig bepaald wordt door de allelfrequenties. Het theorema is gebaseerd op vijf aannames: 1. De populatie is oneindig groot: geen invloed van genetische drift of gelijkaardige kanseffecten; 2. De voorplanting gebeurt volledig willekeurig: er is m.a.w. geen interne structuur in de populatie; 3. Er vindt geen selectie plaats op de bestudeerde loci; 4. Er vinden geen mutaties plaats: er komen bijgevolg geen nieuwe allelen bij; 5. Er is geen migratie: er worden geen allelen van andere populaties ingevoerd. Reële populaties zijn echter zelden in HWE: 1. Alle populaties zijn eindig: er treedt bijgevolg steeds een zekere graad van genetische drift op; 2. De voortplanting gebeurt niet altijd volledig willekeurig. Bij planten zullen bijvoorbeeld vroege bloeiers en late bloeiers elkaar vaak onderling bevruchten (associative mating). Hierdoor kunnen de genotypenfrequenties afwijken van de verwachte waarden; 3. Sommige allelen of genotypes zijn bevoordeeld of benadeeld door selectie; 4. Mutaties creëren nieuwe allelen; 5. Migratie treedt op bijna altijd op, zij het vaak beperkt, door zaden of pollen. Een voorbeeld van het equilibrium voor een locus met twee allelen in een diploïd organisme is:

Met     

p² = frequentie van genotype AA; 2pq = frequentie van genotype Aa; q² = frequentie van genotype aa; p = frequentie van allel A; q = frequentie van allel a.

Deze formule volgt het binomium van Newton. Voor meer dan twee allelen kan de formule bepaald worden via een binomiale expansie met als graad het aantal verschillende allelen. De verwachte heterozygositeit (Hj) en homozygositeit kunnen berekend worden volgens deze formule. Bij meer dan twee allelen is het eenvoudiger om de heterozygositeit H te berekenen volgens H = 1 - homozygositeit. Om te achterhalen of een bestudeerde populatie in HWE is, worden de verwachte genotypenfrequenties vergeleken met de geobserveerde genotypefrequenties door middel van een χ²test.

19

De inbreeding coëfficiënt of inteeltcoëfficiënt FIS drukt de reductie van het aantal heterozygoten (H) in subpopulaties uit als gevolg van niet willekeurige voortplanting. Het is een maat voor de graad van inteelt tussen subpopulaties. FIS (soms gewoon F genoemd) kan variëren van -1.0 (100% heterozygoten) tot +1.0 (0% heterozygoten). Het wordt berekend via de volgende formule:

Waarbij Ho de geobserveerde heterozygositeit voorstelt en Hj de verwachte heterozygositeit. De fixatie-index FST drukt de reductie van H in subpopulaties uit. Het is een maat voor de graad van differentiatie tussen subpopulaties. FST kan variëren van 0 (geen differentiatie) tot 1.0 (volledige differentiatie). Het wordt berekend via de volgende formule:

Waarbij HT de verwachte heterozygositeit van de totale populatie voorstelt en Hj de verwachte heterozygositeit van de subpopulatie. In deze thesis worden de allel- en genotypenfrequenties gebruikt om de diversiteit van diverse populaties numeriek uit te drukken en te vergelijken met elkaar. Dit gebeurt via de F-statistieken. De geobserveerde heterozygositeit (Ho) wordt afgeleid uit de data en de verwachte heterozygositeit van de subpopulaties (Hj) worden berekend. Ook de verwachte heterozygositeit van de totale populatie (HT) wordt berekend.

1.4.5 Genetische merkers Er bestaan verschillende soorten merkers, elk met hun voor- en nadelen (Rogers, 2006). Men kan ze indelen volgens de stoffen waarmee individuen getypeerd worden: volgens DNA (genetische merkers), eiwitten of bepaalde chemische stoffen (biochemische merkers). Genetische merkers worden vaak toegepast voor het in kaart brengen van genetische diversiteit. Binnen de groep van de DNA merkers zijn er drie methoden die frequent toegepast worden in studies over genetische diversiteit in plantenpopulaties: amplified fragment length polymorphism (AFLP) merkers, simple sequence repeat (SSR of microsatelliet) merkers en single nucleotide polymorphism (SNP) merkers. De keuze van de meest geschikte methode hangt af van de kenmerken van de merkers, de species eigenschappen (generatielengte, aanwezige kennis over de species, beschikbare weefseltypes, ...), de beschikbare protocols en de eigenschappen van het genoom (welk genoom geschikt is om een bepaalde vraag te beantwoorden: mtDNA, cpDNA, nucleair DNA). Verder moet men ook rekening houden met de kostprijs en de benodigde technologie en expertise. In een tijd waar DNA sequenering steeds goedkoper en algemener wordt, is het mogelijk dat het gebruik van merkers in de toekomst overbodig wordt. Merkers geven namelijk slechts informatie over een klein deel van genomen. De kenmerken van de verschillende merkers (analysetijd, resolutie, reproduceerbaarheid, …) hangen in grote mate af van het type experiment dat uitgevoerd wordt.

20

1.4.5.1 AFLP merkers AFLP merkers zijn een handig instrument om aan DNA-fingerprinting en genetische mapping te doen voor species waarvoor weinig genoominformatie gekend is (Roldán-Ruiz et al., 2000). AFLP heeft de capaciteit om meerdere loci te detecteren in een enkele assay en bijgevolg worden er per primercombinatie veel merkers tegelijk gegenereerd. De analyse van stalen kan bovendien in bulk gebeuren, wat een efficiënte screening op grote schaal toelaat (Herrmann et al., 2005). AFLP merkers zijn met succes gebruikt voor het karakteriseren van genetische variatie in populaties van onder andere Trifolium repens (witte klaver) en Persoonia mollis (Collins et al., 2012; Göransson et al., 2012). AFLP merkers zijn ook met succes toegepast voor fingerprinting, genetische mapping en cultivar identificatie in witte klaver (Van Treuren et al., 2005). AFLP merkers geven bovendien ook informatie over de structuur van het genoom (Göransson et al., 2012). De soorten protocols en de statistische verwerking spelen een grote rol in het bekomen van goede resultaten en moeten dan ook geoptimaliseerd worden per species (Roldán-Ruiz et al., 2001). Er zijn echter enkele nadelen aan AFLP merkers. Door het dominante karakter van AFLP merkers kan men geen onderscheid maken tussen een heterozygoot en een dominante homozygoot. Dit bemoeilijkt het schatten van allelfrequenties (Krauss, 2000). Verder zijn de resultaten van AFLP merkers niet altijd consistent met de resultaten van andere soorten merkers (Roldán-Ruiz et al., 2001). De detectiemethode is ook lang en arbeidsintensief, en leent zich niet tot automatisatie (Mammadov et al., 2012).

1.4.5.2 SSR merkers SSR’s of microsatellieten zijn stukjes DNA met als sequentie een herhaling van twee of meer basenparen. Ze komen steeds op dezelfde plaats (= locus) voor in genomen van individuen van dezelfde species, meestal in intergenische gebieden. Door de hoge graad van mutatie bezitten minder verwante individuen vaak een verschillend aantal herhalingen. SSR merkers kenden hun opkomst in het begin van de 21e eeuw en worden tegenwoordig nog vaak gebruikt. Ze zijn namelijk erg reproduceerbaar en lenen zich tot automatisatie (Mammadov et al., 2012). Ze kennen tal van toepassingen zoals onderzoek van genetische diversiteit in populaties (Dias et al., 2008), onderzoek van de genetische structuur in populaties (Dugar & Popov, 2013) en bij ouderschapsanalyses (Dumortier, 2012). Het codominante karakter en de hoge graad van polymorfisme maken SSR merkers erg geschikt voor dergelijke studies. Dit is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van de hoge graad van mutatie in SSR sequenties (Dugar & Popov, 2013). Door de codominante aard van SSR merkers kunnen deze wel het onderscheid maken tussen heterozygoten en homozygoten (Krauss, 2000). In een species zoals rode klaver, dat een hoge heterozygositeit bezit, laten SSR merkers toe om een meer gedetailleerde analyse uit te voeren in vergelijking met AFLP. In het genoom van rode klaver zijn 1414 SSR loci gekarakteriseerd door Isobe et al. (2009), hetgeen ruim voldoende is voor het analyseren van genetische diversiteit. Om bovenstaande redenen werd voor het huidige experiment aan het ILVO gekozen voor SSR merkers. Er was bovendien al een set SSR merkers aanwezig die op punt gezet was in een eerder onderzoek aan ILVO (Dumortier, 2012). De genetische diversiteit wordt opgevolgd door voor elke bemonsterde plant een vingerafdruk van SSR merkers op te stellen.

21

1.4.5.3 SNP merkers SNP’s zijn polymorfismen van één basenpaar lang tussen individuen van dezelfde species. Ze komen vaak voor in niet-coderende delen van het genoom, maar ook in mindere mate in het coderende deel. Ze werden voor het eerst ontdekt in het menselijk genoom en bleken universeel te zijn als de meest aanwezige vorm van genetische variatie tussen individuen van dezelfde species. Ze lenen zich erg goed tot high- tot ultra-high-throughput automatisatie. Hun toepassing is sterk gelinkt aan de opkomst van next-generation sequencing technieken (bv. SOLiD en Ion Torrent), die goedkoop en efficiënt ganse genomen kunnen sequeneren (Mammadov et al., 2012). Een nadeel is hun biallelische aard, waardoor ze minder polymorf zijn dan bv. SSR merkers. Dit verlies aan resolutie moet gecompenseerd worden door een groot aantal SNP’s te gebruiken. Dit is mogelijk door de overvloed waarin ze aanwezig zijn en doordat high- tot ultra-high-throughput detectie mogelijk is. Het werken met polyploïde soorten kan ook een moeilijkheid vormen. Loci kunnen namelijk polymorf zijn binnen een enkel genotype, waardoor verkeerde resultaten bekomen worden (Mammadov et al., 2012). Het gebruik van SNP merkers is het meest recent van de drie besproken technieken en dit kent een grote opkomst. Het laat toe om veel gedetailleerder aan genetische mapping te doen, maar voor rode klaver moeten de SNP merkers nog op punt gesteld worden.

1.5 Lopend ILVO-onderzoek waarbinnen deze thesis kadert 1.5.1 Het Multisward-project Het doel van het Multisward-project is het ondersteunen van innovatie in het gebruik en onderhoud van grasland in verschillende Europese landbouwsystemen (www.multisward.eu). Men wil hiermee de rol van grasland versterken voor het produceren van goederen in de landbouw en erosie van de biodiversiteit tegengaan. Ook wil men de economische, agronomische en nutritionele aspecten optimaliseren voor het ontwikkelen van innovatieve en duurzame productiesystemen voor herkauwers. Er werken 15 Europese partners mee aan het Multisward-project en ILVO is daar één van. Om deze doelen te bereiken is het Multisward-project opgedeeld in zeven werkpakketten. ILVO neemt deel aan verschillende werkpakketten, maar uitsluitend werkpakket 2 is relevant voor deze thesis. Dit werkpakket heeft als hoofddoel ‘De prestatie van multi-species swards (MSS) beoordelen in termen van plantproductiviteit en voedingswaarde in verschillende milieus en de meest geschikte plantmengsels bepalen volgens de bodem- en klimaatcondities’. De specifieke doelen van werkpakket 2 zijn: 1. Het beoordelen van de prestaties van MSS in termen van voedingswaarde, plantenopbrengst en plantenstabiliteit in verschillende milieus om de meest geschikte mengsels te bepalen afhankelijk van het milieu, het gebruik en de bodem- en klimaatcondities. 2. Het identificeren van de genetische en ecofysiologische basis van plant - plant interacties in MSS. 3. Het ontwikkelen van een bodem/bedekking model dat breder toepasbaar is over gans Europa. ILVO is betrokken in werkpakket 2.2, met als specifieke doel behandeld in deze thesis de genetische shifts in bi-specifieke mengsels van rode klaver en Engels raaigras over tijd te onderzoeken. 22

1.5.2 Het Multisward-experiment aan het ILVO Genetische veranderingen zullen na een tijd steeds optreden in populaties en eventueel een invloed hebben op de productiviteit. Het is belangrijk om deze veranderingen in kaart te brengen, zodat men een hoge en constante opbrengst kan garanderen, ook na een langere periode. De hoofdbestanddelen van graslanden in gematigde gebieden zijn doorgaans kruisbestuivende, heterozygote en meerjarige planten, hetgeen impliceert dat ze een hoge genetische diversiteit bezitten. Bij gezaaide graslanden zullen niet alle zaden kiemen en zal in het zaaijaar doorgaans een grote sterfte optreden, waardoor de genetische diversiteit van de populatie kan afnemen. Bij blijvend grasland met een stabiele teeltmethode zal er in de volgende jaren natuurlijke selectie optreden onder druk van de actuele omgevingsfactoren. Hierdoor zal de genetische diversiteit eventueel geleidelijk verder afnemen. Het effect van de vermindering van genetische diversiteit doorheen de tijd kan deels worden tegengegaan door het gebruik van soortenmengsels. De genotypen die overleven zijn tegelijk zowel sterke concurrenten als goede buren. De species componenten van het mengsel zullen uiteindelijk in evenwicht zijn met elkaar. Het experiment aan het ILVO onderzoekt de evolutie van de genenpool van zowel rode klaver als Engels raaigras in veldjes rode klaver, in veldjes Engels raaigras en in veldjes met een mengteelt van rode klaver en Engels raaigras. In de gemengde veldjes zullen de genotypen die het best aangepast zijn aan concurrentie en aan de lokale omstandigheden de grootste overlevingskans hebben. De twee gebruikte rode klavercultivars zijn ‘Crossway’ (met kruipende groeihabitus) en ‘Lemmon’ (met erecte groeihabitus). Enkel de rode klaver wordt in deze thesis behandeld. Er wordt verwacht dat er een verschuiving van de genetische diversiteit zal optreden na twee jaar. De proef wordt in tweevoud opgezet, reeks A en reeks B genoemd. Er zijn metingen gedaan voor T0: net na het zaaien, T1: 4 maanden na zaaien, T3: 1 jaar na zaaien, T5: 2 jaar na zaaien. Een meting bestaat uit 30 tot 40 stalen van enkele blaadjes van verschillende willekeurige planten in het veldje. De meting net na het uitzaaien is de nulsampling of controle. Van 4 maanden naar 1 jaar en van 1 jaar naar 2 jaar zullen telkens de zwakste, minst aangepaste planten sterven waardoor de genetische diversiteit mogelijks vermindert. De genetische diversiteit wordt nagegaan met behulp van SSR merkers. Elk individu heeft een uniek patroon van SSR allelen, dus dit is een maatstaf voor de genetische diversiteit van een populatie. Er wordt gemaaid voordat de planten in bloei komen, dus er is geen geslachtelijke vermenigvuldiging. Er wordt bovendien verondersteld dat er geen migratie optreedt, m.a.w. er komen geen zaden van buitenaf in de proef terecht. Migratie kan de genetische diversiteit dus niet vergroten. Wel kan er vegetatieve vermenigvuldiging optreden wanneer een tak van een rode klaverplant wortel schiet en zo een nieuwe, genetisch identieke plant vormt. Deze vorm van voortplanting komt frequent voor bij grassen, maar gebeurt zeer zelden bij rode klaver. De mate waarin vegetatieve vermenigvuldiging gebeurt kan nagegaan worden via de data van op tijdstip T5. Uiteindelijk worden eerst de data van T1 en T5 vergeleken in termen van genetische diversiteit. Enkel indien hiertussen een significant verschil gevonden wordt, zullen ook de andere tijdstippen geanalyseerd worden. T0 dient enkel als nulsampling, door de grote sterfte in de eerste 4 maanden wordt dit tijdstip niet meegenomen in de analyse. De hypothesen die men vooropstelt voor dit experiment zijn de volgende: (i) (ii) (iii)

De populaties of tijdstippen T1 naar T5 zijn genetisch gedifferentieerd. Er is een vermindering in genetische diversiteit van tijdstip T1 naar T5. Veranderingen in diversiteit zijn het gevolg van bepaalde omgevingsfactoren. 23

1.5.3 Onderzoek bloembiologie Zaadproductie wordt typisch uitgedrukt in kg geschoond zaad per hectare. Het is vooral van economisch belang omdat dit in grote mate de kostprijs van de zaden zal bepalen. Zaadopbrengst is echter moeilijk te meten en fluctueert sterk per locatie en jaar. Het staat dan ook niet weergegeven in rassenlijsten. In dit experiment wordt onderzocht of zaadproductie van rode klaver gecorreleerd is met respectievelijk de lengte van de kroonbuis, het aantal bloemhoofden per plant, het aantal bloemen per bloemhoofd en de fractie rijpe bloemhoofden. Het aantal bloemhoofden en het aantal bloempjes per bloemhoofd en hebben beide een rechtstreekse invloed op de zaadproductie (Montardo et al., 2003). Het zijn erfelijke kenmerken waarop kan geselecteerd worden voor veredeling. Dit is een aanzet naar onderzoek over de rol van bestuiving in de zaadopbrengst. Het experiment wordt uitgevoerd op moderne cultivars, zodat de resultaten representatief zijn voor de landbouw. Omdat de literatuur suggereert dat de lagere zaadopbrengst bij tetraploïden te wijten is aan langere kroonbuizen, wordt hier de correlatie tussen kroonbuislengte en zaadopbrengst onderzocht in een set van diploïde en tetraploïde cultivars. Een waarschijnlijke oorzaak voor deze correlatie ligt op het niveau van de bestuivers. Bij rode klaver zit de nectar onderaan in de bloem. Door de lange kroonbuislengte kunnen honingbijen sowieso niet aan de nectar met hun tong, maar ze bezoeken rode klaver wel voor het pollen. Wanneer de kroonbuis te lang is, kunnen ook hommels de nectar niet bereiken. Sommige hommelsoorten zoals Bombus terrestris maken in dat geval een gaatje onderaan de kroonbuis, zodat ze de nectar kunnen bereiken zonder de bloem te bestuiven. Door deze gaatjes kunnen ook andere soorten bestuivers de nectar bereiken zonder de bloem te bestuiven. Andere hommelsoorten zullen na enkele pogingen de rode klaver links laten liggen en gaan op een ander gewas vliegen. Een langere kroonbuis wordt bijgevolg verondersteld nefast te zijn voor de bestuiving. De mate waarin gaatjes gebeten worden in kroonbuizen en de kroonbuislengte zijn ook positief gecorreleerd (Brødsgaard & Hansen, 2002). Het is mogelijk om te veredelen naar kortere kroonbuislengte (Hawkins, 1971), hoewel er bewijs geleverd is dat een kortere kroonbuislengte geen effect heeft op de bestuiving door honingbijen (Rao, 2009). De lengte van de tong van honingbijen is ook niet gecorreleerd met de zaadopbrengst (Brødsgaard & Hansen, 2002). Omwille van de verschillen in zaadopbrengst van jaar tot jaar, wordt de correlatie tussen kroonbuislengte en zaadopbrengst bepaald voor twee opeenvolgende jaren. Verder zijn studies in verband met correlaties tussen planteigenschappen ook van belang om een beeld te scheppen van de effecten van langdurige selectie. Zo zal de frequentie van een gunstige eigenschap in de populatie stijgen, maar kunnen ook al dan niet gewenste eigenschappen prominenter naar voor komen in de populatie door correlatie met het selectiecriterium. De hypothesen die men vooropstelt voor dit experiment zijn de volgende: (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi)

De kroonbuislengte van tetraploïde cultivars is groter dan deze van diploïde cultivars. De zaadopbrengst van tetraploïde cultivars is lager dan deze van diploïde cultivars. Er bestaat een negatieve correlatie tussen de kroonbuislengte en de zaadopbrengst. Er bestaat een positieve correlatie tussen het aantal bloemhoofden per plant en de zaadopbrengst. Er bestaat een positieve correlatie tussen het aantal bloemen per bloemhoofd en de zaadopbrengst per plant. Er bestaat een positieve correlatie tussen de fractie rijpe bloemhoofden en de zaadopbrengst. 24

Aan het ILVO is er reeds onderzoek verricht naar bloemmorfologie bij rode klaver, de resultaten zijn hieronder beknopt weergegeven.

1.5.3.1 Thesis Joke Dumortier Er werd een gemengde set cultivars van diploïde en tetraploïde planten bestudeerd op kroonbuislengte. Deze data bevestigden dat de bloemen van tetraploïde rassen groter zijn dan die van diploïde rassen. De zaadopbrengst kon binnen de tijdspanne van deze thesis niet gemeten worden (Dumortier, 2012), maar werd achteraf wel bepaald (Vleugels et al., 2013). Voor dezelfde planten zal de data uit dit onderzoek vergeleken worden met de data verkregen in deze thesis.

1.5.3.2 Stage Frederik De Jonghe In dit project werd de zaadopbrengst gemeten van de planten uit bovenstaand onderzoek. Vervolgens werd de correlatie tussen de zaadopbrengst en de kroonbuislengte nagegaan voor alle cultivars en voor beide ploïdieniveau’s. De correlatie tussen zaadopbrengst en kroonbuislengte werd ook nagegaan op 50 genotypen uit een tetraploïde selectieproef. Er werd in beide gevallen geen correlatie gevonden tussen de kroonbuislengte en de zaadopbrengst (De Jonghe, 2012).

25

2 Materiaal en methoden 2.1 Multisward

Bij het Multisward-experiment werden het zaaien van de planten, het onderhoud en de staalname verricht door het personeel van het ILVO.

2.1.1 Zaaien en onderhoud van de planten Benodigdheden: o o o o

Zaden van rode klavercultivars ‘Lemmon’ en ‘Crossway’ Zaden van Engels raaigras cultivars ‘Meloni’ en ‘Merks’ Zaaimachine (Oyoert) Maaimachine met weegoptie (Haldrup)

Uitvoering: De planten werden gezaaid met een zaaimachine (Oyoert) op 15 april 2011. Er werden planten gezaaid van twee cultivars rode klaver: ‘Lemmon’ en ‘Crossway’. Van Engels raaigras werden ook twee cultivars gezaaid: ‘Meloni’ en ‘Merks’. De precieze samenstelling van elke populatie is weergegeven in Tabel 1. Elke samenstelling werd in tweevoud gezaaid zowel in Merelbeke (testveld G8) als in Ravels. In deze thesis werd enkel met de rode klaverstalen van Merelbeke gewerkt. Het schema van de indeling van de testvelden is bijgevoegd in Bijlage 1. De zaaidichtheid is weergegeven in Tabel 1. De bemesting van de veldjes is weergegeven in Tabel 2. Het maaien met de maaimachine (Haldrup) en het wieden (manueel) van de testveldjes gebeurden op de data weergeven in Tabel 3. Er werd geen extra water gegeven aan de planten.

Tabel 1: Samenstelling en zaaidichtheid van de testveldjes in zaden/m².

Veldje 04 06 07

Gras Merks Meloni 490 980

490

Rode klaver Crossway Lemmon 700 210 105 105

Totaal 700 1190 1190

26

Tabel 2: Bemestingsdata voor de testveldjes. De waarden zijn weergegeven in bemestingseenheden.

Datum 24/5/2011 12/7/2011 09/8/2011 Totaal 2011 12/3/2012 10/5/2012 22/6/2012 8/8/2012 Totaal 2012 27/3/2013 21/5/2013 21/6/2013 26/7/2013 Totaal 2013

N

Klaver P₂O₅

0

0 45

0

45 45

0

45

K₂O 80 50 50 180 80 80 60 60 280 80 80 60 60 280

N 54 27 81 54 54

108 54 54

108

Gras - rode klaver P₂O₅ K₂O 80 50 50 0 180 45 80 80 60 60 45 280 45 80 80 60 60 45 280

Tabel 3: Data van maaien en wieden van de testveldjes.

2011 05/07/2011 Eerste snede 05/07/2011 Wieden Tweede snede 04/08/2011 03/10/2011 Derde snede

2012 Eerste snede Tweede snede Derde snede Vierde snede

08/05/2012 21/06/2012 03/08/2012 17/09/2012

2013 Eerste snede Tweede snede Derde snede Vierde snede Vijfde snede

08/05/2013 19/06/2013 24/07/2013 02/09/2013 21/10/2013

2.1.2 Staalname Benodigdheden: o o o

Vloeibare stikstof (N2) Translucide papieren zakjes voor stalen Vriesdroger

Uitvoering: Van 30 planten in de gemengde veldjes en 40 planten in de veldjes met monoculturen werden er willekeurig drie blaadjes genomen. Deze blaadjes werden in kleine zakjes gedaan en in vloeibare stikstof gestoken. Deze stalen werden bewaard bij -80 °C tot ze gevriesdroogd werden. Daarna werden ze in vacuümverpakking bewaard bij kamertemperatuur.

27

Tabel 4: Samenstelling van de gebruikte buffers voor de DNA extractie.

Buffers

Extractiebuffer

Lysis buffer

TE buffer

Reagentia Sorbitol Tris HCl pH 7,6 EDTA β-mercaptoethanol Opgelost in milli-Q water Tris HCl pH 7,6 EDTA NaCl CTAB Opgelost in milli-Q water Tris HCl pH 8,0 EDTA Opgelost in milli-Q water

Concentratie 0,35 M 0,1 M 5 mM 0,1% 0,2 M 50 mM 2M 2% 0,01 M 0,1 mM

2.1.3 DNA extractie De DNA extractie van de stalen gebeurde via een aangepaste versie van het protocol van Riday (Štorchová et al., 2000), zie Bijlage 2. Benodigdheden: o o o o o o o o o o o o o o o

Nonsterile Polypropene Microtubes 1,2 ml (Qiagen) Retsch bolletjes 2.3 mm Tissuelyser II (Qiagen) Centrifuge 5804 (Eppendorf) Extractiebuffer (samenstelling zie Tabel 4) Vortex Lysis buffer (samenstelling zie Tabel 4) Mini Oven MKII (Hybaid) CHCl3 : isoamyl alcohol (24:1) 96 well PCR-plaat (Greiner) Isopropanol (100%) Microseal ‘A’ Film (Biorad) Ethanol (70%) TruTemp DNA Microheating System (Robbins Scientific) TE buffer (samenstelling zie Tabel 4)

Uitvoering: In elke microtube werden 2 Retsch bolletjes gebracht. Per microtube werd ongeveer 1 blaadje van het staal ingebracht. De microtubes werden per doos van 96 fijngemalen, tweemaal (of meer indien nodig) gedurende 30 seconden bij 28 Hz (Tissuelyser II). Tussen de twee cycli moesten de bolletjes losgemaakt worden door de microtubes tegen de werktafel te tikken, zodat de Tissuelizer optimaal kon fijnmalen. Wanneer al het bladmateriaal tot poeder gemalen was, werden de dozen 1 min gecentrifugeerd aan 130 g (Centrifuge 5804) om het poeder naar de bodem van de tubes te brengen.

28

Na het fijnmalen werd aan elke microtube 130 µl extractiebuffer toegevoegd, waarna de tubes goed werden gemixt met een vortex. De stalen werden 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Vervolgens werden ze 15 min gecentrifugeerd aan 1300 g, waarna het supernatans verwijderd werd. Aan elke microtube werd 45 µl extractiebuffer en 60 µl lysis buffer toegevoegd en de tubes werden grondig gemixt met een vortex. De dozen met gesloten microtubes werden voor 15 min in een oven (Mini Oven MKII) gezet bij 80 °C. De dekseltjes van de tubes werden goed vastgemaakt opdat ze niet open zouden springen onder invloed van de warmte. Meteen na het verwarmen werden de stalen 1 min in de ijskast geplaatst bij 4 °C. Daarna werden de dozen gecentrifugeerd voor 2 min aan 800 g. Een volume van 75 µl CHCl3:isoamyl alcohol (24:1) werd toegevoegd aan elke tube en de tubes werden goed gemixt met een vortex. De dozen werden daarna gecentrifugeerd voor 5 min aan 1300 g. 80 µl van de waterfase werd getransfereerd naar een PCR-plaat, waarna 50 µl ijskoude isopropanol (100%) werd toegevoegd aan elke well. De platen werden afgedekt met een plastic film (Microseal ‘A’ film) en gecentrifugeerd voor 60 min aan 1300 g. Hierna werd de isopropanol verwijderd door de platen te inverteren op absorberend papier. Om de DNA pellets te wassen werd er 50 µl ethanol (70%) toegevoegd, waarna de platen terug afgedekt werden met de film en gemixt met een vortex. Daarna werden de platen gecentrifugeerd voor 15 min aan 1300 g en werd de ethanol verwijderd door inverteren op absorberend papier. Het DNA werd vervolgens gedroogd in een open verwarmer (TruTemp DNA Microheating System) bij 50 °C gedurende 10 min of langer, tot alle ethanol verdampt was. Uiteindelijk werd het DNA heropgelost in 20 µl TE buffer en werd de plastic film terug aangebracht. De stalen werden gedurende minstens één dag in de ijskast bij 4°C geïncubeerd, zodat het DNA tijd kreeg om volledig op te lossen. Indien nodig kunnen de stalen voor langere tijd bewaard worden bij 4°C. 2.1.4 Voorbereiding van de DNA stalen voor PCR Benodigdheden: o o o o o

ND-1000 Spectrophotometer (Nanodrop) Milli-Q water TE buffer 96-well PCR-plaat (Greiner) Microseal ‘A’ Film (Biorad)

Uitvoering: Van het geïsoleerde DNA werd de concentratie gemeten met een spectrofotometer (ND-1000 Spectrophotometer). Deze werd voor gebruik gespoeld met MQ-water en als blanco werd TE buffer gebruikt. Om te meten werd 2 µl staal op de spectrofotometer gebracht. Tussen elke meting werd de meeteenheid van het toestel gereinigd met een papieren zakdoek. De benodigde DNA-concentratie voor de PCR is 10 ng/µl. Er werd berekend hoeveel de DNA-stalen moesten verdund worden om een totaalvolume van 20 tot 50 µl te bekomen, afhankelijk van de gemiddelde concentratie van de DNA isolaten. Als deze namelijk te hoog is, dan is het moeilijk om nog accuraat de erg kleine hoeveelheden isolaat te pipetteren. Het DNA hoeft niet in TE buffer verdund te worden aangezien dit niet veel effect heeft. De verdunningen werden gemaakt in een nieuwe 96-well PCR-plaat door eerst het MQ-water toe te voegen en dan het staal, zodat beter gemengd kon worden. De verdunningen werden afgedekt met een film (Microseal ‘A’ Film) en bewaard in een ijskast bij 4 °C.

29

2.1.5 SSR reacties Benodigdheden: o o o o o o

Primerparen voor elke SSR locus (100 µM) (details weergegeven in Tabel 5) Multiplex PCR-kit (Qiagen) 96 well PCR-plaat (Greiner) MicroAmp Optical Adhesive Film (Life Technologies) Centrifuge 5804 (Eppendorf) GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems)

Uitvoering: De merkers werden opgedeeld in twee sets van negen merkers. Een set is een verzameling primers die samen gebruikt worden tijdens de multiplex PCR. Dit is om de reactie optimaal te laten doorgaan, want hoe meer primers tegelijk gebruikt worden, hoe groter de kans is op interactie. Bij het samenstellen van merkersets is het aangewezen om elke linkage groep (LG) te vertegenwoordigen met tenminste één locus om een zo volledig mogelijk totaalbeeld te krijgen. Een linkage groep is een verzameling loci op eenzelfde chromosoom die samen overgeërfd worden. De loci in een linkage groep zijn gelinkt aan elkaar op vlak van hun recombinatiefrequentie (cM). Linkage groepen zijn dus empirisch bepaald, terwijl het aantal chromosomen een fysisch gegeven is. Meerdere LG kunnen tot één chromosoom behoren. Bij rode klaver is dit niet het geval: er zijn 7 LGs en 7 paar chromosomen (n = 7). De gebruikte sets zijn aanpassingen van de twee sets gebruikt in een voorgaand onderzoek aan het ILVO (Dumortier, 2012). Negen nieuwe SSR merkers werden ingevoerd, welke eerst op een klein aantal stalen getest werden, zie Tabel 5. De fragmentgrootte is het experimenteel bepaald gebied waartussen de lengtes zich kunnen bevinden. Uit set 2 werd van de primer RCS1748 een dubbele hoeveelheid toegevoegd, dit werd experimenteel zo bepaald voor een optimale reactie. Vóór gebruik werden alle diepgevroren primers ontdooid en gecentrifugeerd zodat alle vloeistof onderaan de microtube zat. Er werd een PCR-mengsel gemaakt dat gelijk was voor elk staal. De samenstelling van dit mengsel is weergegeven in Tabel 6. Er werd 8 µl van het mengsel toegevoegd aan elke well van een nieuwe 96-well PCR-plaat. Hieraan werd 2 µl verdund DNA-staal (10 ng/µl) toegevoegd. De PCR-platen werden afgedekt met een plastic film geschikt voor PCR (MicroAmp Optical Adhesive Film) en gecentrifugeerd (Centrifuge 5804) voor 1 min aan 3700 g. Deze werden daarna in het PCRtoestel gebracht (GeneAmp PCR system 9700). Voor alle stalen in dit experiment werd hetzelfde PCR-toestel gebruikt. Het programma dat gebruikt werd voor de PCR is weergegeven in Tabel 7. Er werden 25 cycli doorlopen. De bekomen amplificatieproducten werden donker bewaard bij 4 °C om de fluorescentie stabiel te houden.

30

Tabel 5: Details van de SSR primers (Sato et al., 2006). De ongelabelde (reverse) primers zijn van Invitrogen of IDT, de gelabelde (forward) primers zijn van IDT (FAM) en van Applied Biosystems (VIC, PET en NED). De merkers aangeduid in het groen zijn nieuwe SSR merkers gebruikt in dit experiment.

Set

1

2

SSR Nummer RCS0883 RCS1501 RCS1679 RCS1647 RCS2728 RCS5376 RCS3236 RCS1868 RCS1897 RCS4956 RCS1935 RCS1748 RCS1526 RCS3015 RCS1940 RCS1683 RCS0004 RCS0051

Merker

Motief

PET (rood) VIC (groen) VIC VIC NED (geel) PET FAM (blauw) FAM NED FAM VIC PET VIC NED NED PET NED FAM

AAG AAG AAG AAG AAC AAC AAAT ATC AAAG AAAC ATC ATC AAG AAC AAG AAC AAG AAG

Fragmentgrootte (bp) 157 180 107 273 202 300 300 162 280 272 298 266 209 110 265 168 188 133

Linkage group LG1 LG2 LG3 LG4 LG4 LG5 LG5 LG6 LG7 LG1 LG2 LG2 LG3 LG3 LG4 LG6 LG7 LG7

Positie (cM) 89 55 70 21 71 46 63 53 64 121 122 85 98 20 116 88 18 87

Tabel 6: Samenstelling van het PCR-mengsel per staal. Per set wordt elke primer toegevoegd.

Reagentia PCR Mastermix RNase-vrij water Forward primer (100 µM) Reverse primer (100 µM)

Volume (µl) 5,00 2,64 (2,60 voor set 2) 0,02 0,02

Tabel 7: Het programma van de PCR. Er werden 25 cycli doorlopen.

Fase Initiatie Denaturatie Annealing Elongatie Aantal cycli Finale elongatie

Duur 15 min 30 s 90 s 1 min 25 30 min

Temperatuur (°C) 95 94 1 57 cyclus 72 60

31

2.1.6 Capillaire elektroforese Benodigdheden: o o o o o o o o o o

384-well plaat HPLC water (Biosolve) Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) GeneScan-500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems) Genesis 200 (Tecan) Centrifuge 5804 (Eppendorf) TruTemp DNA Microheating System (Robbins Scientific) 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) POP-7 Performance Optimized Polymer (Applied Biosystems) 3730 Running Buffer (10x) met EDTA (Applied Biosystems)

Uitvoering: De amplificatieproducten bekomen uit de PCR werden eerst voorbereid om op het capillaire elektroforese toestel (3130xl Genetic Analyzer) gebracht te worden. Er werd 13,5 µl formamide en 0,5 µl LIZ standaard toegevoegd aan elke well van een 384-well plaat met behulp van een pipetteerrobot (Genesis 200). De LIZ standaard is een standaard op basis van fragmentgrootte, waardoor de grootte van de amplificatieproducten kan bepaald worden. Daarna bracht de robot 1 µl van ieder staal over. De robot mag in geen geval droog komen te staan. De 384-well plaat werd kort gecentrifugeerd (Centrifuge 5804) en 3 min geïncubeerd bij 90 °C (TruTemp DNA Microheating System) om het DNA te laten denatureren. Meteen hierna werd de plaat afgekoeld op ijs, waardoor de DNA strengen gescheiden blijven. Enkelstrengige DNA moleculen migreren namelijk beter doorheen het polymeer van de analyzer. Alvorens de analyzer op te starten wordt de loopbuffer (10x) verdund met HPLC water en in de voorziene bakjes gegoten. Ook worden er twee bakjes gevuld met HPLC water. Het polymeer wordt gecontroleerd en vervangen indien nodig. Hierna wordt gecontroleerd of er zich geen luchtbellen bevinden in het toestel. Via de software wordt de functie voor fragment analyse gekozen. Om de resultaten juist te benoemen wordt een vooraf opgesteld Excel-bestand geladen dat iedere well linkt aan een zijn overeenkomstige staalnaam. De resultaten worden weergegeven in bestanden die te lezen zijn door een gespecialiseerd verwerkingsprogramma.

2.1.7 Verwerking van de SSR data Benodigdheden: o

GeneMapper Software v4.1 (Life Technologies)

Uitvoering: De bestanden verkregen uit de fragment analyse werden ingeladen in het programma GeneMapper (v4.1). Eerst werden de verschillende parameters ingevoerd: de labels van de merkers, de gebruikte standaard en het type van de analyse (microsatellieten). Dan moest GeneMapper ingesteld worden om automatisch pieken te herkennen. Hiervoor moet GeneMapper weten in welk gebied deze pieken zich kunnen bevinden, hetgeen gebeurt door het maken van zogenaamde bin sets. Elke bin set is een

32

Figuur 8: Piekpatroon van een diploïde rode klaverstaal met de merkers van set 2; op de x-as ligt de fragmentgrootte, op de y-as de intensiteit van het signaal; de oranje pieken zijn afkomstig van de LIZ-500 standaard.

verzameling van gebieden van mogelijke fragmentgroottes. Deze volgen voor elke merker een vast patroon, aangezien de fragmenten (op uitzonderingen na) enkel een discrete afstand van elkaar verwijderd kunnen zijn. Deze afstand komt overeen met de lengte van het SSR motief, zie Tabel 3. Met deze informatie kan GeneMapper beginnen aan de analyse. Na de analyse werden alle pieken bekeken, om eventueel handmatig verkeerd gescoorde pieken te verwijderen en niet gescoorde pieken te scoren. Op deze manier werd ook nagegaan welke merkers algemeen beschouwd goede of slechte piekpatronen geven. In Figuur 8 is weergegeven hoe een SSR-piekpatroon van diploïde rode klaver er uitziet met de merkers van set 2. Uiteindelijk werd van elk individu de ligging van de pieken weergegeven in een tabel. De hoogte van iedere piek is niet representatief voor de hoeveelheid fragmenten die initieel aanwezig was. De ligging van alle pieken vormt de numerieke fingerprint van ieder individu. Deze werden gegroepeerd per populatie.

2.1.8 Statistische verwerking van de data Benodigdheden: o o o

CONVERT versie 1.31 (Glaubitz, 2004) FSTAT versie 2.9.3 (Goudet, 1993) STATISTICA 10 Software (StatSoft)

Uitvoering: De tabellen met fingerprints werden omgezet naar een vorm die leesbaar is voor het programma FSTAT (v1.31). Dit gebeurde via een omweg aangezien de ingebouwde omvormer van FSTAT enkel 33

Figuur 9: Configuratie van het programma FSTAT (v1.31).

Genepop bestanden kan lezen. De tabel uit de vorige stap werd naar Genepop formaat omgezet met behulp van het programma CONVERT (v2.9.3). Daarna werd deze omgevormd en ingelezen door FSTAT. De configuratie van FSTAT voor het uitvoeren van de berekeningen is weergegeven in Figuur 9. De resultaten worden weergegeven in verschillende tekstbestanden. De bekomen waarden zijn onder andere paarsgewijze FST-waarden, hun significantie, FIS-waarden, allelische rijkdom en heterozygositeit. Voor verdere verwerking van deze waarden, zoals het vergelijken van gemiddelden (t-test) en het opstellen van een boom werd STATISTICA 10 gebruikt. Om een clusteranalyse uit te voeren en een dendrogram op te stellen in STATISTICA moeten de FST-waarden in de vorm van een matrix ingevoerd worden, met vermelding van het aantal stalen.

2.2 Onderzoek bloemmorfologie

Bij dit experiment werd het gedeelte ‘Onderhoud van de planten’ verricht door het personeel van het ILVO.

2.2.1 Onderhoud van de planten Benodigdheden: o o o

Quickpot QP96T trays (HerkuPlast) 0,9 l potten 5 l potten 34

Tabel 8: Gebruikte cultivars voor het onderzoek van de bloemmorfologie.

Naam cultivar Taifun Avanti Astur Larus Rotra Merviot Crossway Global Arlington Milvus

Ploïdie Tetraploïd Tetraploïd Tetraploïd Tetraploïd Tetraploïd Diploïd Diploïd Diploïd Diploïd Diploïd

Uitvoering: De groep planten die in dit experiment onderzocht werden zijn grotendeels hetzelfde als deze onderzocht door Dumortier (2012). De gebruikte cultivars en hun ploïdie zijn weergegeven in Tabel 8. Voorafgaand aan het onderzoek werden 48 planten van elke cultivar gezaaid in trays (Quickpot QP96T) in januari 2012. Deze werden vier keer gemaaid over een periode van vier maanden om vertakking te stimuleren. In mei 2012 werden 16 tot 33 planten van elke cultivar (244 in totaal) verpot naar 0,9 l potten en in juni 2012 naar 5 l potten. Deze potten werden op het containerveld van ILVO geplaatst waar ze één tot twee keer per dag geïrrigeerd werden, afhankelijk van de dagelijkse hoeveelheid zonnestraling. Er werd vier keer bemest tussen 15 april 2012 en 17 september 2012 om de vier tot zes weken. Per plant werd 200 ml mestvloeistof toegediend, zodat iedere plant het equivalent kreeg van 140 eenheden N, 80 eenheden P2O5 en 190 eenheden K2O per hectare. In de herfst van 2012 werden alle planten overgebracht naar een serre om te overwinteren. Op 4 april 2013 werden 219 overlevende planten teruggebracht naar het containerveld. Deze werden twee keer gemaaid en drie keer bemest tussen maart en juli 2013.

2.2.2 Verzamelen van de stalen Benodigdheden: o o

D200 fototoestel (Nikon) Fotokabinet met standaard illuminatie

Uitvoering: Tijdens de zomermaanden werden in het begin van de bloei drie bloemhoofden per plant verzameld. De bloemhoofden werden zo snel mogelijk verwerkt, wat bestaat uit het fotograferen van de drie bloemhoofden, het fotograferen van 40 bloempjes per plant en het tellen van het aantal bloempjes per bloemhoofd. De dag zelf werden foto’s genomen, vooraleer de bloemen verwelkten, terwijl het tellen van de bloemen eventueel de dag nadien kon gebeuren. Verwelking kan immers een invloed hebben op de grootte van de bloemhoofden. De foto's werden genomen in een fotokabinet met standaard illuminatie. Op elke foto is een meetlat in beeld voor de schaal en een grijskaart als kleurreferentie. De instellingen van het fototoestel zijn weergegeven in Tabel 9.

35

Tabel 9: Instellingen van Nikon D200 fototoestel.

F-stop Belichtingstijd ISO-snelheid Brandpuntsafstand Max. lensopening Flitsmodus

f/8 1/60 sec. ISO-200 70 mm 4,3 Geen flits

Wanneer het zaad van de rode klaverplanten rijp was (tijdens de zomermaanden), werden per plant alle bloemhoofden afgeknipt, het aantal rijpe en onrijpe bloemhoofden werd geteld en alle bloemhoofden werden in een zakje gedaan. Na het oogsten van de bloemhoofden werd elke plant ook volledig kortgeknipt en bemest. Het oogsten moet gebeuren op droge momenten, want natte bloemhoofden drogen moeilijk en kunnen leiden tot beschimmeld zaad. De bloemhoofden werden gedroogd bij 23 °C in een incubator met wind gedurende zeven tot veertien dagen. De volledig droge bloemhoofden werden uitgewreven tussen twee schuurpapieren om het zaad eruit te halen. De uitgewreven zaden werden gescheiden van de bloemhoofden door passage door een zeef met maasgrootte 2,4 mm en een zeef met maasgrootte 1 mm. De bloemhoofden blijven op de bovenste zeef liggen en werden opnieuw uitgewreven. De zaadjes en grote kafjes blijven op de tweede zeef liggen. De fijne kafjes passeren door beide zeven en werden weggegooid. Dit werd herhaald tot alle bloemhoofden volledig uitgewreven waren. Uiteindelijk werden de goede zaden gescheiden van het kaf en de verschrompelde zaden met behulp van windtriage. Het geschoonde zaad van iedere plant werd afgewogen.

2.2.3 Verwerking van de stalen Benodigdheden: o o o o

Zadenteller Contador (Pfeuffer) Weegschaal xs 104 (Mettler Toledo) ImageJ software (versie 1.47) STATISTICA 10 (StatSoft)

Uitvoering: Om het duizendkorrelgewicht (DKG) te bepalen van elke plant, werden van het geschoond zaad van iedere plant vier maal 100 zaden geteld met een automatische zadenteller (Contador) en vervolgens gewogen (weegschaal xs 104). Van deze vier gewichten werd het gemiddelde genomen en dit werd verrekend naar het gewicht per 1000 zaden. De lengtes van de kroonbuizen per plant werd gemeten met de ImageJ software (v1.47). Op elke foto werd de schaal geijkt op de meetlat (x aantal pixels = y cm). Dan werd een gebroken lijn getekend over de lengte van de bloembuis, zoals weergegeven in Figuur 10a, waarna de lengte van deze lijn gemeten werd door ImageJ. Er werd opgelet dat bij elk bloempje vanaf eenzelfde startpunt gemeten werd, zodat de resultaten onderling te vergelijken waren. De lengte en breedte van de bloemhoofden werden gemeten met een rechte lijn vanuit vaste punten. De breedtemeting is weergegeven in Figuur 10b. 36

Figuur 10: Meting in ImageJ van (a) kroonbuislengte en (b) bloemhoofdbreedte.

Per plant werden het gemiddelde aantal bloemen per bloemhoofd, de fractie rijpe bloemhoofden, het totale aantal bloemhoofden en de gemiddelde kroonbuislengte berekend. De fractie rijpe bloemhoofden is gelijk aan het aantal rijpe bloemhoofden gedeeld door het totale aantal bloemhoofden. De data werd ingevoerd in spreadsheets in STATISTICA 10. In workbooks werden dan de verschillende tests in verband met correlaties uitgevoerd. Eerst moest er nagegaan worden of de onderzochte kenmerken normaal verdeeld zijn en of ze significante verschillen vertonen per cultivar en ploïdieniveau. Van de gemiddelde kroonbuislengte werd ook nagegaan of deze verschilt per genotype. Om de normaliteit van de gegevens per kenmerk na te gaan werd Levene’s test gebruikt. Om de significante verschillen aan te tonen werd een one way ANOVA test uitgevoerd. Voor het groeperen van de resultaten werd Tukey’s test uitgevoerd. Daarna werden de correlaties uit de hypothesen berekend. Bijkomend werd de correlatie tussen het aantal bloemhoofden per plant en de oogstdatum berekend. Hiervoor werd het gemiddelde aantal bloemhoofden per plant per oogstdatum berekend. Ook de spreiding van de oogstdatum per cultivar en de correlatie hiervan met het gemiddelde aantal bloemhoofden per cultivar werden berekend.

37

3 Resultaten en bespreking 3.1 Multisward

3.1.1 Herhalingen In een eerste stap werd er van 200 stalen op T1 en 200 stalen op T5 DNA geëxtraheerd en geanalyseerd. Uit deze analyse bleek dat niet alle SSR loci goed te scoren waren: de merkers RCS1940 (LG4) en RCS0051 (LG7) bleken ongeschikt tijdens de GeneMapper analyse. De verwachte pieken ontbraken namelijk bij een groot aantal stalen. Deze merkers werden bijgevolg niet gebruikt voor de verdere analyse. Bij een deel van de stalen was er ook geen bruikbare data voor andere loci, waardoor er voor T1 slechts 121 bruikbare stalen waren en voor T5 187. Dit waren er te weinig om een analyse op uit te voeren: per populatie had men minstens 25 goede stalen nodig (Tabel 10). De mislukte stalen werden opgedeeld in twee groepen. De eerste groep bevatte de stalen waarbij de standaard slecht was of waarbij de pieken (SSR allelen) enigszins zichtbaar waren, maar niet hoog genoeg of duidelijk genoeg om ze met zekerheid aan te kunnen duiden. De tweede groep bevatte de stalen met geen of ontbrekende pieken. Voor de eerste groep werd besloten om een dubbele dosis amplificatieproduct op de sequencer te brengen. Dit bleek echter geen oplossing aangezien de achtergrondruis hierbij ook verhoogde. Voor de tweede groep werd besloten om nieuwe DNA extracties uit te voeren en een dubbele dosis DNA te gebruiken voor de PCR. De fingerprints van deze stalen waren wel geslaagd en hiermee was er van een voldoende aantal stalen per populatie informatie beschikbaar voor verdere analyse. Uiteindelijk werden in totaal 190 stalen van T1 en 195 stalen van T5 geanalyseerd (Tabel 10). Deze stalen hadden elk informatie voor minstens de helft van de zestien loci, maar het merendeel had er dertien tot zestien. Het aantal waargenomen verschillende allelen is weergegeven in Tabel 11. Er wordt opgemerkt dat er bij de stalen van tijdstip T1 algemeen meer loci onbruikbaar waren. Dit kan te wijten zijn aan de langere bewaartijd van deze stalen.

Tabel 10: Aantal bruikbare stalen per populatie van de eerste resultaten en na herhaling. Rood gemarkeerd zijn de populaties met een onvoldoende aantal stalen.

Aantal Bruikbare Aantal Bruikbare bruikbare stalen na Populatie bruikbare stalen na stalen herhaling stalen herhaling 22 36 37 39 T1_04MA T5_04MA 28 36 39 40 T1_04MB T5_04MB 15 30 30 30 T1_06MA T5_06MA 19 30 30 30 T1_06MB T5_06MB 18 29 27 29 T1_07MA T5_07MA 19 29 24 27 T1_07MB T5_07MB 121 190 187 195 Totaal Totaal Populatie

38

Tabel 11: Waargenomen aantal verschillende allelen per locus voor iedere gebruikte SSR merker.

Locus RCS0883 RCS1501 RCS1679 RCS1647 RCS2728 RCS5376 RCS3236 RCS1868 RCS1897

Aantal verschillende allelen 8 31 16 8 11 9 11 5 20

Locus RCS4956 RCS1935 RCS1748 RCS1526 RCS3015 RCS1940 RCS1683 RCS0004 RCS0051

Aantal verschillende allelen 10 9 8 9 8 8 12 -

3.1.2 Vegetatieve vermenigvuldiging In de populaties op tijdstip T5 werd tweemaal een koppel van identieke SSR-profielen waargenomen: één bij populatie 04MB en één bij 07MB. Een mogelijke verklaring is dat er tijdens het twee jaar durende experiment twee gevallen van vegetatieve vermenigvuldiging opgetreden zijn in de subpopulatie van 195 planten. ‘Crossway’ planten vertakken sterker dan ‘Lemmon’ planten en vertonen bovendien een beperkte beworteling op laaghangende takken, terwijl ‘Lemmon’ planten dit veel moeilijker doen. Er werd bijgevolg verwacht dat ‘Crossway’ een hogere graad van vegetatieve vermenigvuldiging zou vertonen. In dit experiment was dit echter niet het geval: ook in de populatie met enkel ‘Lemmon’ (04MB) werd er een identiek koppel waargenomen. Een andere verklaring voor de identieke profielen is het nemen van twee stalen van dezelfde plant op tijdstip T 5. In dichtgegroeide, gezaaide veldjes is het immers moeilijk om planten uit elkaar te houden. Op tijdstip T1 kwamen er geen identieke profielen voor.

3.1.3 Controle van de representativiteit van de staalneming Bij een experiment waarbij de diversiteit van verschillende populaties vergeleken wordt of waarbij tijdelijke veranderingen in diversiteit bestudeerd worden, is het belangrijk dat het aantal stalen per bemonsteringsmoment een goede weergave is van de populatie op het veld. In dit experiment werden er per bemonsteringsmoment 30 stalen van rode klaverplanten genomen bij de mengsels met Engels raaigras en 40 stalen in de monoculturen. Deze aantallen werden op voorhand bepaald aan de hand van de zaaidensiteit. Men kan zich echter afvragen of de subset van planten die op een bepaald moment bemonsterd werd representatief is voor de populatie op het veld. Indien een te klein aantal stalen geanalyseerd wordt, is het mogelijk dat waargenomen verschuivingen in genetische diversiteit gewoon te wijten zijn aan het feit dat er te weinig stalen genomen werden, waardoor niet alle aanwezige diversiteit waargenomen werd. Dit wordt nagegaan voor de stalen van T1. Bij een staalname wordt verwacht dat hoe meer stalen men neemt, hoe meer verschillende allelen men zal waarnemen (en bijgevolg hoe hoger de genetische diversiteit is). De curve die het aantal waargenomen verschillende allelen uitzet in functie van het aantal genomen stalen uit de populatie zal in het begin nagenoeg lineair stijgen. Vanaf een bepaald aantal stalen zal men echter alle verschillende soorten allelen waarnemen en zal de maximale 39

diversiteit bemonsterd worden. In de grafiek wordt dit weerspiegeld doordat de curve afvlakt en constant blijft vanaf het kritische aantal stalen. Een aantal stalen dat groter of gelijk is hieraan, zal representatief zijn voor de allelische rijkdom in gans de populatie. Hierdoor kan men stellen dat een verandering van de diversiteit van T1 naar T5 niet te wijten zal zijn aan allelen die simpelweg niet gesampled werden op tijdstip T1. Aangezien de diversiteit in theorie niet kan verhogen in dit experiment, wordt ook het aantal stalen genomen op T5 representatief geacht voor de populatie. Om dit te testen werden uit de totale hoeveelheid stalen per populatie willekeurig subsets van stalen genomen. De grootte van deze subsets varieerde van 5, 10, 15, ... stalen tot het totale aantal stalen voor de populatie. Elke subsetgrootte werd in vijfvoud genomen. Deze subpopulaties werden verwerkt met FSTAT om de allelic richness (allelische rijkdom) te bepalen en voor elke subsetgrootte werd het gemiddelde en de standaardafwijking hiervan berekend over de vijf subsets. Uit de curven in Figuur 11 en de waarden uit Tabel 12 volgt dat het aantal genomen stalen op tijdstip T1 representatief is, aangezien voor alle populaties de curve rond een subsetgrootte van 30-35 afvlakt en het maximum aantal waargenomen allelen in de buurt komt van het theoretisch maximale aantal verschillende allelen.

Tabel 12: Maximaal aantal verschillende allelen per populatie. De theoretische maxima werden berekend uit de sigmoïdale fits voor elke populatie. De theoretische maxima werden bepaald aan de hand van de fits weergegeven in Figuur 11.

Populatie T1_04MA T1_04MB T1_06MA T1_06MB T1_07MA T1_07MB

Max. aantal verschillende allelen 121 119 118 109 130 130

Theoretische maxima 122,3 123,4 121,4 109,8 135,9 136,4

40

Figuur 11: Aantal waargenomen verschillende allelen in functie van het aantal genomen stalen op T 1. x-as: aantal genomen stalen; y-as: aantal verschillende allelen. De foutenvlaggen geven de standaardafwijking aan. De gefitte curven zijn sigmoïdale curven.

3.1.4 FIS-waarden Zoals hoger vermeld drukt de FIS-waarde uit of een populatie meer homozygoten bevat dan wat verwacht wordt volgens het Hardy-Weinberg equilibrium. Hoe hoger de graad van homozygositeit van een locus, hoe kleiner de kans dat deze veel variatie vertoont tussen individuen van de populatie en hoe minder geschikt de locus is als merker. De gemiddelden over de populaties van de FIS-waarden zijn weergegeven in Tabel 13. Hier zijn de minder geschikte merkers aangeduid in het rood. Deze drie merkers vertonen hogere FIS-waarden dan alle anderen. Hogere FIS-waarden bij bepaalde loci kunnen verschillende oorzaken hebben. Zo is het mogelijk dat een locus evolutief jong is, waardoor het nog niet veel tijd gehad heeft om te muteren. Het zal bijgevolg niet veel verschillende allelen bevatten en meer homozygoot zijn. Bij een van nature erg heterozygote species als rode klaver is het echter meer plausibel dat deze hoge waarden het gevolg zijn van null allelen. Deze allelen worden foutief niet gedetecteerd, waardoor heterozygote loci vals als homozygoot gedetecteerd worden. De oorzaak hiervan is het voorkomen van verschillen in de primer41

Tabel 13: Gemiddelde FIS-waarden over alle populaties per merker. De fragmentgrootte en het aantal verschillende allelen zijn deze die experimenteel waargenomen werden in deze studie. De merkers in het rood zijn minder geschikt als merker op basis van de FIS-waarde. De merkers in het blauw bleken ongeschikt bij de analyse in GeneMapper (zie 3.1.1). De positie van de loci (in cM) is zoals in Sato et al. (2006).

Set

1

2

Locus RCS0883 RCS1501 RCS1679 RCS1647 RCS2728 RCS5376 RCS3236 RCS1868 RCS1897 RCS4956 RCS1935 RCS1748 RCS1526 RCS3015 RCS1940 RCS1683 RCS0004 RCS0051

Fluorescent Linkage label groep PET VIC VIC VIC NED PET FAM FAM NED FAM VIC PET VIC NED NED PET NED FAM

LG1 LG2 LG3 LG4 LG4 LG5 LG5 LG6 LG7 LG1 LG2 LG2 LG3 LG3 LG4 LG6 LG7 LG7

FIS 0,045 0,012 0,018 0,131 0,013 0,183 0,212 -0,044 -0,024 0,115 0,551 -0,004 0,011 0,327 / 0,060 0,043 /

Aantal verschillende allelen 5 11 16 31 8 9 8 11 20 10 9 9 8 8 / 8 12 /

Positie (cM) 89 55 70 21 71 46 63 53 64 121 122 85 98 20 116 88 18 87

Fragmentgrootte (bp) 130-190 130-235 90-120 250-300 190-225 280-320 270-330 140-180 225-290 250-350 226-330 250-290 185-229 80-140 235-295 155-190 160-220 100-160

bindingssites waardoor bepaalde allelen in een heterozygoot individu niet geamplificeerd worden. Wanneer de SSR primers wel kunnen binden aan de flankerende sequenties voor het ene allel, maar niet aan de flankerende sequenties voor het tweede allel, dan wordt er slechts één allel gedetecteerd en lijkt dit individu homozygoot te zijn. Er kan ook een grote insertie zijn opgetreden bij één allel, waardoor het veel grotere amplificatieproduct niet gedetecteerd wordt binnen de grenzen van de bin set. Een analoge situatie kan optreden door een deletie ter hoogte van één allel. Om nog steeds een voldoende differentiërend vermogen te hebben in toekomstige studies moeten merkers met te hoge FIS waarden (hoger dan 0,2) vervangen worden, zie Tabel 13. Nieuwe merkers kunnen geselecteerd worden uit de tabellen opgesteld door Sato et al. (2006) na hun volledige structurele analyse van het genoom van rode klaver. De merkers dienen eerst op kleine schaal uitgetest te worden op enkele klaverplanten, waarna ze in een volgend onderzoek op grotere schaal kunnen geëvalueerd worden. Men gebruikt ze best voor gelijkaardige populaties, aangezien merkers kunnen verschillen in diversiteit per populatie. Belangrijk hierbij is dat de primers ook in multiplex PCR uitgetest worden in combinatie met de andere primers van de set waartoe de merker behoort. Er kan namelijk interferentie optreden tussen de primers bij een multiplex PCR amplificatie. Belangrijk bij de selectie van een nieuwe merker is de fragmentgrootte. Deze mag niet overlappen met een ander fragment die met hetzelfde fluorescente label gemerkt wordt, anders zijn ze niet te onderscheiden van elkaar bij de verwerking. Voor een goed onderscheidend vermogen is het ook aangeraden dat de merkers niet te dicht bij elkaar liggen op de chromosomen. Deze voorwaarde was voldaan voor de te vervangen merkers, dus worden nieuwe merkers op ongeveer dezelfde positie geselecteerd. De vijf voorgestelde merkers zijn weergegeven in Tabel 14.

42

Tabel 14: Voorstel voor nieuwe SSR merkers. De fragmentgrootte en positie is zoals in Sato et al. (2006).

Set

Locus

1

RCS4783 RCS0753 RCS2449 RCS2166 RCS2358

2

Fluorescent label FAM VIC NED NED FAM

Motief AATT GGA ACT AAC ATC

Fragmentgrootte (bp) 276 92 108 279 123

Linkage group LG5 LG2 LG3 LG4 LG7

Positie (cM) 63 126 27 127 84

3.1.5 Differentiatie tussen populaties Alle populaties worden met elkaar vergeleken met behulp van paarsgewijze FST-waarden, zie Tabel 16. Hoe groter deze waarde, hoe meer gedifferentieerd de twee beschouwde populaties zijn. Ook wordt nagegaan of het waargenomen verschil significant is (P < 0,05), zie Tabel 16. Bij het vergelijken van de populaties met elkaar heeft FSTAT automatisch een correctie doorgevoerd op de waarschijnlijkheids-grens P < 0,05 om te compenseren voor het kanselement (zie 1.4.4). De nieuwe, strengere grens is P < 0,000758. Aangezien de A en B reeksen herhalingen zijn van elkaar, wordt verwacht dat er geen differentiatie is tussen deze populaties op tijdstip T1. De kleine FST-waarden in Tabel 16 bevestigen dit, in combinatie met de hoge P-waarden. Er wordt echter ook geen significant verschil gedetecteerd tussen populaties die op tijdstip T1 een andere samenstelling hebben qua cultivars (tussen populaties 04MA, 04MB, 06MA en 06MB en populaties 07MA en 07MB). Omdat rode klaver als species een hoge graad van genetische variatie bezit tussen cultivars, zou men zeker verschillen verwachten tussen deze populaties. Algemeen zijn slechts vier populaties significant verschillend van elkaar. Het is duidelijk dat de gecorrigeerde eis te streng is voor een dergelijk experiment met erg kleine verwachte verschillen in diversiteit. Men hanteert bijgevolg beter de eis P < 0,05 om significante verschillen na te gaan.

3.1.5.1 Hypothese (i): er is een verschil in genetische diversiteit van tijdstip T1 naar tijdstip T5. Populaties T1_07MA en T1_07MB bevatten naast ‘Lemmon’ ook ‘Crossway’. Ze zijn initieel genetisch meer divers dan de andere populaties op tijdstip T1, die enkel ‘Lemmon’ bevatten. Dit wordt bevestigd (P < 0,05) door de resultaten in Tabel 16. De populaties 04MA, 04MB, 06MA en 06MB die enkel ‘Lemmon’ bevatten, worden verwacht genetisch identiek te zijn op tijdstip T1. Het enige verschil is namelijk de aanwezigheid van Lolium perenne. Dit wordt ook bevestigd (P < 0,05) door de resultaten in Tabel 16. Hypothese (i) kan bevestigd worden voor populaties 04MA en 07MB (P < 0,05). Het verschil voor populatie 04MA is zwak significant met FST-waarde 0,0035 en het verschil voor populatie 07MB is zwak significant met FST-waarde 0,0128. Bij populaties 04MB, 06MA, 06MB en 07MA is er geen significante verandering opgetreden in genetische diversiteit over de twee jaren. Blijkbaar zijn er relatief weinig planten afgestorven gedurende de twee jaar durende veldproef. Waarschijnlijk heeft het gewas weinig stress ondervonden doordat de weersomstandigheden niet extreem genoeg waren, of doordat de concurrentie tussen planten niet bijzonder hoog was. Een andere verklaring is de tijdspanne van het experiment. De persistentie van rode klaver is doorgaans beperkt tot 2 à 3 jaar, pas daarna beginnen de planten af te 43

sterven. Het is mogelijk dat het effect van de stressfactoren in dit experiment, aangezien deze relatief zwak zijn, pas zichtbaar worden na meer dan twee jaar. Uit het ontbreken van significante verschillen over tijd bij het merendeel van de populaties en de zwakke significantie bij de andere populaties kan men concluderen dat de verschillen die optreden na twee jaar erg klein zijn. Over deze tijdspanne blijkt de competitie met Lolium perenne geen grote invloed te hebben op de genetische diversiteit in rode klaver. Bij gezaaide graslanden die voor korte perioden gebruikt worden, verwacht men bijgevolg geen problemen met genetische diversiteit in rode klaver ten gevolge van de competitie. In verder onderzoek dienen de effecten van concurrentie over langere perioden onderzocht te worden. Omdat tijdelijk grasland maximaal vijf jaar mag aanliggen, zou het interessant zijn deze studie uit te breiden naar een looptijd van vijf jaar.

3.1.6 Allelische rijkdom en heterozygositeit De verwachte heterozygositeit is een maat voor de genetische diversiteit in een populatie. Het is gebaseerd op de geobserveerde allelfrequenties volgens het theorema van Hardy-Weinberg. De verwachte heterozygositeit is per populatie weergegeven in Tabel 15. De allelische rijkdom is een ander aspect van de genetische diversiteit. Een maat hiervoor is de verwachte allelische rijkdom berekend door FSTAT. Dit is het verwachte aantal verschillende allelen aanwezig in een subpopulatie, gebaseerd op de grootte van de kleinste subpopulatie (hier 23) in de analyse. Hoe minder verschillende allelen voorkomen in een populatie, hoe lager de genetische diversiteit. Deze waarden zijn eveneens weergegeven in Tabel 15.

3.1.6.1 Hypothese (ii): er is een vermindering in genetische diversiteit van tijdstip T1 naar tijdstip T5. Hiervoor gaat men met een t-test na of de gemiddelde heterozygositeit of allelische rijkdom van de populaties verschilt tussen tijdstip T1 en tijdstip T5. Uit deze analyse kon geconcludeerd worden dat de gemiddelde heterozygositeit en de allelische rijkdom niet significant veranderd waren doorheen de tijd (P < 0,05). Hypothese (ii) wordt bijgevolg verworpen. Tabel 15: Verwachte heterozygositeit en verwachte allelische rijkdom per populatie.

Populatie T1_04MA T1_04MB T1_06MA T1_06MB T1_07MA T1_07MB T5_04MA T5_04MB T5_06MA T5_06MB T5_07MA T5_07MB

Verwachte heterozygositeit 0,732 0,720 0,708 0,728 0,731 0,733 0,710 0,727 0,722 0,763 0,726 0,697

Verwachte allelische rijkdom 7,039 6,853 7,044 6,657 7,738 7,829 7,513 7,158 7,134 7,280 7,035 6,336 44

45

0,55000

0,74470

0,00909

0,01970

0,00227

0,04697

0,05076

0,08561

0,01439

0,37727

0,00227

T1_04MB

T1_06MA

T1_06MB

T1_07MA

T1_07MB

T5_04MA

T5_04MB

T5_06MA

T5_06MB

T5_07MA

T5_07MB

T1_04MA

T1_04MA

0,01212

0,95455

0,18333

0,10455

0,50000

0,03712

0,00152

0,01364

0,34318

0,94773

0,0003

T1_04MB

0,04242

0,82424

0,53409

0,28864

0,52045

0,13864

0,00303

0,05985

0,45303

-0,0043

-0,0003

T1_06MA

0,01667

0,27652

0,12727

0,02803

0,07727

0,00379

0,00227

0,00606

-0,0011

0,0013

-0,0012

T1_06MB

0,24091

0,07500

0,00152

0,00152

0,00152

0,01439

0,61212

0,0056

0,0054

0,0041

0,0057

T1_07MA

0,00455

0,00303

0,00076

0,00076

0,00076

0,00076

-0,0004

0,0061

0,0095

0,0100

0,0099

T1_07MB

0,01212

0,56970

0,17500

0,04167

0,11742

0,0101

0,0074

0,0034

0,0039

0,0054

0,0035

T5_04MA

0,00152

0,44318

0,84545

0,14848

0,0058

0,0156

0,0086

0,0018

0,0008

0,0009

0,0033

T5_04MB

0,03788

0,26364

0,17576

0,0011

0,0082

0,0159

0,0093

0,0037

0,0028

-0,0003

0,0009

T5_06MA

0,00379

0,03788

0,0047

-0,0005

0,0057

0,0107

0,0110

-0,0001

0,0030

0,0007

0,0054

T5_06MB

Tabel 16: Bovenkant: paarsgewijze FST-waarden per populatie; onderkant: significantie van de verschillen (p-waarden).

05

0,02197

-0,0010

-0,0009

0,0010

-0,0001

0,0020

0,0030

-0,0009

-0,0057

-0,0074

-0,00

T5_07MA

0,0009

0,0146

0,0025

0,0096

0,0055

0,0128

0,0051

0,0076

-0,0006

0,0056

0,0082

T5_07MB

3.1.6.2 Hypothese (iii): veranderingen in diversiteit zijn het gevolg van bepaalde omgevingsfactoren. Indien er gestuurde veranderingen in diversiteit optreden, wordt er verwacht dat reeksen A en B van eenzelfde samenstelling een gelijkaardige evolutie ondergaan. Dit wilt zeggen dat ze evenveel differentiatie tussen elkaar moeten vertonen op tijdstip T5 als op tijdstip T1. Als men echter de FST- en P-waarden beschouwt in Tabel 16, ziet men dat de differentiatie tussen reeksen A en B toegenomen is over de tijd. Dit is een indicatie dat er een divergerende evolutie gebeurt is, een gevolg van het kanselement. In populatie 07MA ('Crossway' en 'Lemmon') is de diversiteit niet verlaagd, maar ze is wel anders op tijdstip T1 dan op tijdstip T5. Op tijdstip T1 verschilde deze van populaties 04 en 06 (zonder ‘Crossway’), maar op tijdstip T5 is dit niet meer het geval. Op tijdstip T1 vertoonde populatie 07MA geen verschillen met 07MB, terwijl ze op tijdstip T5 als duidelijk verschillend aangetoond worden. Dit is mogelijks te verklaren door het verdwijnen van ‘Crossway’ in 07MB, waardoor deze populatie op tijdstip T5 enkel ‘Lemmon’ bevat en bijgevolg genetisch erg gelijkend is aan populaties 04 en 06 op tijdstip T1. Dit wordt verder bevestigd in Figuur 12: populatie T1_07MA wordt door principal component analysis (PCA) bij T1_07MB gegroepeerd, maar T5_07MA wordt bij de overige populaties op tijdstip T1 gegroepeerd. Een mogelijke verklaring hiervoor ligt in het feit dat ‘Crossway’ een kruipende cultivar uit Nieuw-Zeeland is, aangepast aan een ander klimaat en geoptimaliseerd voor begrazing door schapen. Het Belgische klimaat is echter anders en bovendien werd tijdens deze proef gemaaid en niet begraasd. Het is ook mogelijk dat ‘Crossway’ minder aangepast is aan het voedergras species dat gebruikt werd, of slecht presteert onder competitie. ‘Lemmon’ is meer erect en aangepast aan maaien. Het is ontwikkeld uit Europees materiaal en veel beter aangepast aan het klimaat en de groeiomstandigheden in België.

Figuur 12: PCA-plot van de rode klaverpopulaties.

46

Het nagenoeg volledig verdwijnen van de ‘Crossway’ planten lijkt echter een veel te drastisch effect als men dit vergelijkt met de erg kleine verschillen die optreden over de tijd in de andere populaties. Ook het feit dat een soortgelijke evolutie zich niet heeft voorgedaan bij populatie 07MB, wijst mogelijks naar een andere oorzaak. Men concludeert dat het gedrag van 'Crossway' onvoorspelbaar kan zijn. Men kan hypothese (iii) bijgevolg verwerpen: er is geen bewijs geleverd voor veranderingen onder invloed van omgevingsfactoren en de bovengenoemde indicaties geven aan dat de veranderingen willekeurig waren.

3.2 Onderzoek bloemmorfologie 3.2.1 Hypothese (i): de kroonbuislengte van tetraploïde cultivars is groter dan deze van diploïde cultivars Elke plant kreeg een uniek nummer samengesteld uit een getal van één tot tien voor de cultivar waartoe de plant behoort, in de volgorde zoals weergegeven in Figuur 13, en daarna het nummer van de plant binnen de cultivar. Zo heeft de eerste plant van cultivar ‘Taifun’ het nummer 101. In totaal werden 217 planten onderzocht. In een eerdere studie met deze planten werd onderzocht of de gemiddelde kroonbuislengte verschilde tussen bloemhoofden van dezelfde plant (Dumortier, 2012). De gemiddelde kroonbuislengte bleek sterk (r = 0,91; P < 0,001) gecorreleerd tussen bloemhoofden van dezelfde plant. Aangezien deze correlatie sterk is en men verwachtte dat de lengtes gelijkaardig zouden zijn, werd dit niet opnieuw onderzocht in dit onderzoek. Om dezelfde reden nam men bij het verzamelen van de data 40 bloempjes van drie bloemhoofden. Het verschil in kroonbuislengte tussen de bloemhoofden van eenzelfde plant is namelijk verwaarloosbaar. Per plant werd van 40 bloempjes de gemiddelde kroonbuislengte bepaald: deze was significant verschillend per genotype (P < 0,001). Ook verschilde de gemiddelde kroonbuislengte significant per cultivar (P < 0,001) en per ploïdiegraad (P < 0,001) (Figuur 14). Tussen de twee ploïdiegraden waren enkel ‘Arlington’ en ‘Taifun’ niet significant verschillend van elkaar, terwijl de andere cultivars correct per ploïdie gegroepeerd werden door STATISTICA, zie Figuur 14. De gemiddelde kroonbuislengte van de diploïde cultivars bedroeg 0,977 ± 0,008 cm terwijl deze van de tetraploïde cultivars 1,067 ± 0,007 cm bedroeg. De gemiddelde kroonbuislengte per cultivar is weergegeven in Tabel 1. Men kan hypothese (i) bijgevolg aanvaarden met P < 0,001.

47

Figuur 13: Gemiddelde kroonbuislengte per genotype, ingedeeld per cultivar voor alle tien cultivars.

Figuur 14: Gemiddelde kroonbuislengte per cultivar en groepering van de cultivars volgens kroonbuislengte. Rood de diploïde cultivars, blauw de tetraploïde cultivars. De foutenvlaggen geven de standaardfout aan. Letters boven elke staaf duiden significante verschillen aan.

48

Zoals vermeld in de inleiding zijn rode klavercultivars genetisch erg divers. Dit is gereflecteerd in sterke verschillen in morfologische kenmerken tussen de planten, zelfs binnen cultivars. Het verschil in gemiddelde kroonbuislengte tussen de genotypen van eenzelfde cultivar, weergegeven in Figuur 13, stemt hiermee overeen. Het verschil tussen de ploïdieniveau’s is in overeenstemming met de geraadpleegde literatuur (Hawkins, 1971; Furuya, 2001). Dumortier (2012) onderzocht dezelfde planten die ook in deze studie onderzocht werden. Het meten van de kroonbuislengte gebeurde op een andere manier dan in deze studie, maar de bloemen werden nadien opnieuw gemeten om ze te kunnen vergelijken met de huidige waarden. Zo vond men in 2012 gemiddelde kroonbuislengten van 0,987 ± 0,001 cm bij diploïde cultivars en 1,011 ± 0,001 cm bij tetraploïde cultivars. Deze waarden zijn erg vergelijkbaar met de geobserveerde waarden in deze studie. De kleine fluctuaties zijn mogelijks te verklaren door verschillen in omgevingsfactoren (bv. weersomstandigheden) tussen de twee jaren. Brødsgaard & Hansen (2002) vonden geen significant verschil in kroonbuislengte tussen diploïde en tetraploïde planten. Er werden tien bloemen per plant gemeten van 30 planten per veld afkomstig uit 3 velden. De gebruikte cultivars waren ‘Rajah’ (2n) en ‘Kvarta’ (4n). Het ontbreken van een verschil kan te wijten zijn aan het feit dat er slechts twee cultivars gebruikt werden die mogelijks toevallig geen verschil in kroonbuislengte hadden. Dit is ook het geval in de huidige studie voor de cultivars ‘Arlington’ (2n) en ‘Taifun’ (4n), zie Figuur 14. Een andere mogelijke verklaring is dat Brødsgaard & Hansen (2002) slechts 10 bloemen per plant gemeten hebben, tegenover 40 bloemen per plant in onze studie. Mogelijks is 10 bloemen per plant onvoldoende om kleine verschillen in kroonbuislengte tussen cultivars statistisch te bewijzen. Ten slotte kunnen omgevingsomstandigheden ook een rol gespeeld hebben. Zo heeft een hogere kaliumconcentratie langere kroonbuizen tot gevolg. De aanwezigheid van bepaalde pesticiden of groeihormonen in de bodem die een effect hebben op de kroonbuislengte kan het verschil ook verstoren.

3.2.2 Hypothese (ii): de zaadopbrengst van tetraploïde cultivars is lager dan deze van diploïde cultivars De zaadopbrengst, uitgedrukt in zaden per plant, is significant verschillend per cultivar (P < 0,001) en per ploïdiegraad (P < 0,001). Voor de diploïde planten bedraagt de zaadopbrengst 3179 ± 107, en voor de tetraploïde planten 686 ± 92 zaden per plant. De gemiddelde zaadopbrengst per cultivar is weergegeven in Tabel 17. Men kan hypothese (ii) bijgevolg aanvaarden met P < 0,001. Dit verschil wordt gereflecteerd in de groepering van de cultivars volgens zaadopbrengst in Figuur 15: de diploïde cultivars zijn samen gegroepeerd en zijn allemaal significant verschillend van de tetraploïde cultivars.

49

50

94,7 ± 5,2 97,1 ± 4,9 106,5 ± 4,7 104,7 ± 5,3 103,5 ± 6,9 77,6 ± 6,9 108,7 ± 5,4 108,3 ± 4,8 99,6 ± 5,2

0,8366 ± 0,0185 0,9188 ± 0,0211 0,9230 ± 0,0207 0,7923 ± 0,0221 0,9027 ± 0,0292 0,9172 ± 0,0281 0,9486 ± 0,0238 0,9237 ± 0,0188 0,8798 ± 0,0221

42,47 ± 3,90 39,52 ± 4,45 30,92 ± 4,36 41,38 ± 4,66 39,17 ± 6,17 67,92 ± 5,93 69,61 ± 5,04 57,66 ± 3,97 42,95 ± 4,66 41,36 ± 2,05 55,70 ± 2,37

396 ± 150 588 ± 171 775 ± 167 725 ± 179 2087 ± 237 2583 ± 228 4745 ± 193 3557 ± 152 2306 ± 179 686a ± 92 3179b ± 107

Avanti

Astur

Larus

Rotra

Merviot

Crossway

Global

Arlington

Milvus

Gem. 4n

Gem. 2n

2n

4n

0,8684 ± 0,0096

101,6 ± 2,6

103,1 ± 2,3

112,0 ± 4,9

0,8717 ± 0,0198

51,35 ± 4,18

994 ± 161

Taifun

0,9150 ± 0,0111

Aantal bloemen per bloemhoofd

Fractie rijpe bloemhoofden

Aantal bloemhoofden per plant

Aantal zaden per plant

Ploïdieniveau

Cultivar

0,977 ± 0,008

1,067 ± 0,007

0,943 ± 0,016

1,047 ± 0,015

0,938 ± 0,017

0,990 ± 0,020

0,942 ± 0,022

1,072 ± 0,016

1,068 ± 0,014

1,062 ± 0,015

1,080 ± 0,016

1,057 ± 0,015

Kroonbuislengte (cm)

Tabel 17: Gemiddelden en standaardfouten van de onderzochte bloemkenmerken per cultivar en per ploïdiegraad.

1,628 ± 0,026

2,604 ± 0,023

2,604 ± 0,023

1,842 ± 0,043

1,572 ± 0,055

1,391 ± 0,064

1,533 ± 0,067

2,640 ± 0,051

2,618 ± 0,047

2,616 ± 0,048

2,569 ± 0,042

2,590 ± 0,046

Duizendkorrelgewicht (g)

Figuur 15: Gemiddelde zaadopbrengst per cultivar en groepering van de cultivars volgens zaadopbrengst. Blauw de tetraploïde cultivars, rood de diploïde cultivars. De foutenvlaggen geven de standaardfout aan. Letters boven elke staaf duiden significante verschillen aan.

Het is algemeen aanvaard dat tetraploïde cultivars een lagere zaadopbrengst hebben dan diploïde cultivars (Taylor & Quesenberry, 1996). De resultaten van dit onderzoek zijn hiermee in overeenstemming. Zoals later besproken wordt, kunnen de kroonbuislengte en het aantal bloemhoofden hier een rol in spelen. Het vaker optreden van problemen tijdens de zaadproductie bij tetraploïde planten kan ook een oorzaak zijn van verlaagde zaadopbrengst. Deze problemen situeren zich ter hoogte van zowel de mannelijke als de vrouwelijke voortplantingsorganen en de embryonale ontwikkeling (Algan & Bakar, 1996, 1997; Buyukkartal & Colcegen, 2007; Grebenişan & Savatti, 2011; Grebenişan et al., 2012). Doordat tetraploïde planten meer chromosomen hebben dan diploïde planten, is de kans groter dat er hiermee een probleem optreedt bij de celdeling. Een andere factor die een rol kan spelen in de zaadopbrengst is de nectarproductie. Het nectarniveau in de kroonbuis bepaalt namelijk, naast de kroonbuislengte zelf, ook of een bestuiver aan de nectar kan. Een lage nectarproductie zou bijgevolg de oorzaak kunnen zijn van verminderde zaadopbrengst. Dit is één van de factoren die in een volgend experiment aan het ILVO zal onderzocht worden. Het duizendkorrelgewicht (DKG) verschilt per ploïdie (P < 0,001) en per cultivar (P < 0,001). Het gemiddelde DKG bedraagt 1,628 ± 0,026 g voor diploïde planten en 2,604 ± 0,023 g voor tetraploïde cultivars. Dit bevestigt wat reeds aanvaard is in de literatuur (Taylor & Quesenberry, 1996). Het gemiddelde DKG per cultivar is weergegeven in Tabel 17.

3.2.3 Hypothese (iii): er bestaat een negatieve correlatie tussen de kroonbuislengte en de zaadopbrengst De zaadopbrengst is negatief gecorreleerd met de kroonbuislengte met r = -0,3809 (P < 0,001), een matige correlatie. Wanneer men echter de data opsplitst per ploïdieniveau, dan ontbreekt deze correlatie zowel bij de diploïde (P > 0,05) als bij de tetraploïde planten (P > 0,05). Men toonde onder hypothese (i) en (ii) aan dat tetraploïde planten een langere kroonbuis en een lagere zaadopbrengst 51

hebben dan diploïde planten. Als men de ganse dataset beschouwt, zijn zaadopbrengst en kroonbuislengte gecorreleerd, maar het is mogelijk dat deze kenmerken los staan van elkaar. Indien dit een causaal verband zou zijn, verwacht men dat deze correlatie ook bestaat binnen beide ploïdieniveau’s, hetgeen niet het geval was. Deze resultaten tonen aan dat de kroonbuislengte niet de oorzaak was van de lagere zaadopbrengst in tetraploïde planten. Men stelde bij deze planten in 2012 eveneens geen correlatie vast tussen de kroonbuislengte en de zaadopbrengst (Cnops et al., 2013). Het optreden van correlaties is erg variabel. Hierdoor worden in de literatuur soms schijnbaar tegenstrijdige resultaten bekomen. Zo zullen de correlaties verschillen per jaar bv. door de weersomstandigheden. Het is ook afhankelijk van de leeftijd van de planten: het eerste jaar is de zaadopbrengst meestal hoger dan het tweede jaar, waardoor correlaties gemaskeerd kunnen worden. In toekomstige experimenten kan men andere factoren onderzoeken die mogelijks een rol spelen in de zaadopbrengst van rode klaver en een verklaring geven voor de lagere zaadopbrengst in tetraploïde planten. Bestuivers discrimineren mogelijks planten op bloemkleur, dus men kan de kleur van de bloempjes onderzoeken: in alle foto’s genomen tijdens deze studie is een grijskaart in beeld als referentiekleur. Ook kan er verder onderzoek gedaan worden naar de pollenproductie en nectarsecretie als mogelijke oorzaken voor lagere zaadopbrengst bij tetraploïden (Buyukkartal & Colcegen, 2007).

3.2.4 Hypothese (iv): er bestaat een positieve correlatie tussen het totaal aantal bloemhoofden per plant en de zaadopbrengst Het aantal bloemhoofden per plant verschilde significant per cultivar (P < 0,001) en per ploïdiegraad (P < 0,001). Diploïde cultivars hadden gemiddeld 55,70 ± 2,37 bloemhoofden per plant, tegenover 41,36 ± 2,05 bij tetraploïde cultivars. Het gemiddelde aantal bloemhoofden per cultivar is weergegeven in Tabel 17. Het lagere aantal bloemhoofden bij tetraploïde cultivars komt overeen met de geraadpleegde literatuur (Urda, 2011). De zaadopbrengst is positief gecorreleerd met het aantal bloemhoofden met r = 0,6134 (P < 0,001), dit is een sterke correlatie. In Figuur 16 is het scatterplot van deze relatie weergegeven. Deze correlatie is eveneens aanwezig binnen de ploïdiegraden apart. Men kan hypothese (iv) bijgevolg aanvaarden met P < 0,05. De combinatie van deze correlatie en het lagere aantal bloemhoofden bij tetraploïde cultivars is een verklaring voor de lagere zaadopbrengst, zoals aangetoond onder hypothese (ii). Tijdens dit experiment werden ook de lengte en de breedte van drie bloemhoofden per plant gemeten. Deze data biedt mogelijkheden voor verder onderzoek naar de rol van de bloemhoofdgrootte in de zaadopbrengst.

52

Figuur 16: Scatterplot van de zaadopbrengst per plant vs. het aantal bloemhoofden per plant.

De correlatie is te verklaren door het rechtstreekse effect: hoe meer bloemhoofden een plant heeft, hoe meer bloemen de plant zal hebben en hoe meer zaden er kunnen gevormd worden. Men merkt ook op dat er een positief lineair verband bestaat tussen het aantal bloemhoofden per plant en de oogstdatum met r = 0,9629 (P < 0,001). De oogstdatum is de datum waarop de planten rijp genoeg werden bevonden om te oogsten. Deze werd genummerd van de eerste dag (12 augustus 2013) tot de laatste dag van de zaadoogst (13 september 2013). Het verband is weergegeven in Figuur 17. Een mogelijke verklaring voor dit verband is dat de planten met meer bloemhoofden per plant later als rijp werden beschouwd omdat er minder bloemhoofden simultaan rijp zijn en er bijgevolg meer onrijpe bloemhoofden zichtbaar waren. Deze verklaring kan verder onderzocht worden door de correlatie te beschouwen tussen het aantal bloemhoofden en de fractie rijpe bloemhoofden. Deze zijn zwak negatief gecorreleerd met r = -0,2375 (P < 0,01). Een mogelijke verklaring voor de negatieve correlatie is dat er bij planten met meer bloemhoofden een grotere spreiding bestaat in het moment waarop de bloemhoofden rijp zijn. Zo zullen relatief minder bloemhoofden simultaan rijp zijn op het moment van oogsten. Om dit na te gaan werd per cultivar de standaardwijking van de gemiddelde oogstdatum bepaald. Er werd een sterk negatieve correlatie gevonden tussen de standaardafwijking van de oogstdatum per cultivar en het gemiddelde aantal bloemhoofden per cultivar met r = -0,8624 (P < 0,01), zie Figuur 18. De spreiding van de oogstdatum is bijgevolg geen verklaring voor de negatieve correlatie tussen de fractie rijpe bloemhoofden en het aantal bloemhoofden.

53

Figuur 17: Gemiddeld aantal bloemhoofden per plant per oogstdatum in functie van de oogstdatum. De foutenvlaggen stellen de standaardfout voor.

Figuur 18: Standaardafwijking van de oogstdatum in functie van het gemiddeld aantal bloemhoofden per cultivar. De foutenvlaggen stellen de standaardfout voor.

54

3.2.6 Hypothese (v): er bestaat een positieve correlatie tussen het aantal bloemen per bloemhoofd en de zaadopbrengst per plant Het aantal bloemen per bloemhoofd is significant verschillend per cultivar (P < 0,01), maar niet per ploïdiegraad (P > 0,05). Dit is niet in overeenstemming met de literatuur (Muntean, 2008), die suggereert dat het aantal bloemen per bloemhoofd hoger ligt bij diploïde planten. Bij de diploïde cultivars is het gemiddeld aantal bloemen per bloemhoofd gelijk aan 101,6 ± 2,6, voor tetraploïde cultivars is 103,2 ± 2,3. Het gemiddeld aantal bloemen per bloemhoofd is voor alle cultivars en voor beide ploïdiegraden weergegeven in Tabel 17. Er werden geen correlaties aangetoond met de andere onderzochte kenmerken. Hypothese (v) wordt bijgevolg verworpen met P > 0,05. Dit is niet in overeenstemming met wat verwacht wordt van het rechtstreekse verband tussen het aantal bloemen per hoofd en de zaadopbrengst (Urda, 2011): hoe meer bloemen elk bloemhoofd heeft, hoe meer zaden per bloemhoofd en bijgevolg hoe hoger de zaadopbrengst van de plant. Het ontbreken van een overeenkomst met de literatuur is mogelijks te wijten aan omgevingsfactoren, welke per jaar anders zijn. De bloemmorfologie wordt namelijk beïnvloed door de weersomstandigheden, de bemesting en de bodemcondities.

3.2.5 Hypothese (vi): er bestaat een positieve correlatie tussen de fractie rijpe bloemhoofden en de zaadopbrengst De fractie rijpe bloemhoofden, een maat voor de gedetermineerdheid, verschilt significant per cultivar (P < 0,001) en per ploïdie (P < 0,01). De gemiddelde fractie rijpe bloemhoofden per cultivar is weergegeven in Tabel 17. Voor diploïde cultivars is de gemiddelde fractie rijpe bloemhoofden gelijk aan 0,8684 ± 0,0096 en voor tetraploïde cultivars is dit gelijk aan 0,9150 ± 0,0111. De fractie rijpe bloemhoofden is zwak positief gecorreleerd met de zaadopbrengst met r = 0,2115 (P < 0,01). Deze correlatie bestaat echter niet binnen de ploïdiegraden apart. Ook hier gaat het niet om een causaal verband. Hypothese (vi) wordt bijgevolg verworpen met P > 0,05. Het aantal bloemhoofden per plant speelt een veel grotere rol in de zaadopbrengst dan de fractie rijpe bloemhoofden.

55

4 Conclusies 4.1 Multisward

Men kan besluiten dat het aantal genomen stalen in dit experiment voldoende was om de genetische diversiteit in de beschouwde rode klaverpopulaties te karakteriseren. De toegepaste DNA-extractie- en analyseprocedures werden bovendien goed bevonden: de meeste gebruikte loci waren bruikbaar voor de analyse. De merkersets waren een verbetering van de sets gebruikt in een eerder onderzoek aan het ILVO (Dumortier, 2012). De stalen van tijdstip T1 waren echter duidelijk minder goed bruikbaar dan de stalen van tijdstip T5, wat aan de langere bewaartijd kan te wijten zijn. De minder bruikbare loci uit dit experiment werden vervangen. De sets kunnen bijgevolg verder toegepast en geëvalueerd worden in toekomstig onderzoek. De gecorrigeerde eis die voorgesteld werd door het programma FSTAT bleek te streng voor dit experiment. De veranderingen die optreden in een dergelijk experiment zijn namelijk erg klein. Gebruikmakend van een minder strenge eis (P < 0,05) werden er echter geen systematische veranderingen in genetische diversiteit waargenomen bij de populaties van tijdstip T1 naar T5. Hypothese (i) werd bijgevolg verworpen. Bij de weinige gevallen waar er wel een verandering waargenomen werd, ging het niet om een vermindering van de genetische diversiteit en was dit niet het gevolg van omgevingsfactoren. Hypothesen (ii) en (iii) werden bijgevolg verworpen. Over een tijdspanne van twee jaar had de aanwezigheid van Lolium perenne weinig invloed op de genetische diversiteit in rode klaver. In toekomstig onderzoek kan men nagaan of er wel een effect optreedt na een langere periode. Men kan ook een gelijkaardig experiment opzetten in meer uitdagende omgevingscondities. Na twee jaar bezit rode klaver nog voldoende functionele diversiteit, zowel in mengcultuur met Engels raaigras als in monocultuur. Voor de landbouw betekent dit in de praktijk dat rode klaver verder geteeld kan worden voor periodes van ten minste twee jaar zonder risico op erosie van genetische diversiteit.

56

4.2 Bloemmorfologie

De kroonbuislengte van tetraploïde cultivars was groter dan deze van diploïde cultivars, net als bij dezelfde planten in het vorige jaar (Dumortier, 2012). Hypothese (i) werd bijgevolg aanvaard. Dit is in overeenstemming met de geraadpleegde literatuur (Hawkins, 1971; Furuya, 2001), hoewel er in andere studies geen verschil gevonden werd (Brødsgaard & Hansen, 2002). Het waargenomen significante verschil in kroonbuislengte tussen de cultivars en zelfs tussen de genotypen van eenzelfde cultivar onderstreept de grote genetische diversiteit van rode klaver. De zaadopbrengst van de tetraploïde cultivars was significant lager dan deze van diploïde cultivars en het duizendkorrelgewicht van tetraploïden was significant hoger. Hypothese (ii) werd bijgevolg aanvaard. Dit bevestigt wat reeds algemeen aanvaard is. Het achterhalen van een verklaring hiervoor biedt mogelijkheden tot toekomstig onderzoek. Zo zullen de rol van de nectarproductie en de rol van de bestuivers en van eventuele fertiliteitsproblemen bij tetraploïden in de zaadopbrengst onderzocht worden in een volgende onderzoek aan het ILVO. Er werd geen correlatie gevonden tussen de zaadopbrengst en de kroonbuislengte. Hoewel de diploïde cultivars een lagere kroonbuislengte en een hogere zaadopbrengst hadden dan de tetraploïde cultivars, bestaat er geen causaal verband vanwege het ontbreken van een correlatie binnen de ploïdiegraden. Hypothese (iii) werd bijgevolg verworpen. De verzamelde data is bruikbaar bij een volgende onderzoek naar de correlatie tussen bloemkleur en zaadopbrengst. Het aantal bloemhoofden per plant was significant hoger bij diploïde cultivars dan bij tetraploïde cultivars, wat in overeenstemming is met de literatuur (Urda, 2011). Dit aantal was bovendien positief gecorreleerd met de zaadopbrengst. Hypothese (iv) werd bijgevolg aanvaard. Dit speelt hoogstwaarschijnlijk een rol in de lagere zaadopbrengst van tetraploïde cultivars. Er werd ook een correlatie tussen het aantal bloemhoofden per plant en de oogstdatum opgemerkt: cultivars met meer bloemhoofden per plant hadden een latere bloeidatum. Als mogelijke verklaring werd onderzocht of cultivars met meer bloemhoofden per plant een hogere spreiding in oogstdatum hadden, maar deze verklaring werd verworpen. De verzamelde data laat ook toe om in de toekomst de rol van de bloemhoofdgrootte te onderzoeken. Het aantal bloemen per bloemhoofd was niet significant verschillend per ploïdiegraad. Dit is niet in overeenstemming met de geraadpleegde literatuur (Muntean, 2008) die suggereert dat dit aantal hoger ligt bij diploïde cultivars dan bij tetraploïde cultivars. Er werd geen correlatie gevonden tussen het aantal bloemen per bloemhoofd en de zaadopbrengst. Hypothese (v) werd bijgevolg verworpen. Er werd geen correlatie gevonden tussen de fractie rijpe bloemhoofden en de zaadopbrengst. Hoewel deze correlatie wel aanwezig was wanneer men alle planten beschouwde, ontbrak deze bij de ploïdiegraden apart. De fractie rijpe bloemhoofden verschilde wel significant per ploïdiegraad en was hoger bij tetraploïde cultivars. Er was geen causaal verband tussen de fractie rijpe bloemhoofden en de zaadopbrengst. Hypothese (vi) werd bijgevolg verworpen. Indien men de zaadopbrengst van rode klaver wil verhogen via veredeling, kan men selecteren op een hoger aantal bloemhoofden per plant. Omwille van de slechte zaadopbrengst bij tetraploïde cultivars, is verder onderzoek naar de oorzaken die hier een rol in spelen een erg belangrijke stap. Het beter begrijpen van de oorzaken van lage zaadopbrengst bij tetraploïden kan het gebruik van deze waardevolle cultivars ten goede komen. 57

5 Referenties Adams, N. R. (1995). Detection of the effects of phytoestrogens on sheep and cattle. Journal of Animal Science, 73(5), 1509-1515. Agricultural intensity data, , geraadpleegd op 25 februari 2014. Algan, G. & Bakar, H. N. (1996). Light and electron microscopic examination of the embryo and endosperm development in the natural tetraploid Trifolium pratense L. Israel Journal of Plant Sciences, 44(4), 273-288. Algan, G. & Bakar, H. N. (1997). The ultrastructure of the mature embryo sac in the natural tetraploid of red clover (Trifolium pratense L.) that has a very low rate of seed formation. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 66(1), 13-20. Annicchiarico, P. (2003). Breeding white clover for increased ability to compete with associated grasses. The Journal of Agricultural Science, 140(3), 255-266. Annicchiarico, P. & Piano, E. (1997). Response of white clover genotypes to intergenotypic and interspecific interference. The Journal of Agricultural Science, 128(4), 431-437. Boller, B., Schubiger, F. X. & Kölliker, R. (2010). Red clover. In Fodder crops and amenity grasses (pp. 439-455). Springer New York. Bond, D. A. & Fyfe, J. L. (1968). Corolla tube length and nectar height of Fl red clover plants (Trifolium pratense) and their seed yield following honey-bee pollination. The Journal of Agricultural Science, 70, 5-10. Benjamin Cummings. Nitrogen cycle, , geraadpleegd op 3 februari 2014. Black, A. D., Laidlaw, A. S., Moot, D. J. & O'Kiely, P. (2009). Comparative growth and management of white and red clovers. Irish Journal of Agricultural & Food Research, 48(2), 149-166. Brødsgaard, C. & Hansen, H. (2002). Pollination of red clover in Denmark. Danmarks JordbrugsForskning. Buyukkartal, H. N. & Colgecen, H. T. (2007). The reasons of sterility during pollen grain formation in the natural tetraploid Trifolium pratense L. International Journal of Botany, 3(2), 188-195. Collins, R. P., Helgadóttir, Á., Fothergill, M. & Rhodes, I. (2001). Variation amongst survivor populations of two white clover cultivars collected from sites across Europe: morphological and reproductive traits. Annals of Botany, 88(1), 761-770. Collins, R. P., Helgadóttir, Á., Fothergill, M. & Rhodes, I. (2002). Variation amongst survivor populations of white clover collected from sites across Europe: growth attributes and physiological responses to low temperature. Annals of Botany, 89(3), 283-292. Collins, R. P., Helgadóttir, Á., Frankow-Lindberg, B. E., Skøt, L., Jones, C. & Skøt, K. P. (2012). Temporal changes in population genetic diversity and structure in red and white clover grown in three contrasting environments in northern Europe. Annals of botany, 110(6), 1341-1350. Cool, M., Hannaway, D. B., Larson, C. & Myers, D. (2004), , geraadpleegd op 21 maart 2014. Craine, J. M., Nippert, J. B., Elmore, A. J., Skibbe, A. M., Hutchinson, S. L. & Brunsell, N. A. (2012). Timing of climate variability and grassland productivity. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(9), 3401-3405. 58

De Jonghe, F. (2012). Stageverslag ILVO, onderzoek in klaver, selder, gele mosterd en prei. Stageverslag. Universiteit Gent. 24p. Dias, P. M. B., Julier, B., Sampoux, J. P., Barre, P. & Dall'Agnol, M. (2008). Genetic diversity in red clover (Trifolium pratense L.) revealed by morphological and microsatellite (SSR) markers. Euphytica, 160(2), 189-205. Dias, P. M. B., Pretz, V. F., Dall’Agnol, M., Schifino-Wittmann, M. T. & Zuanazzi, J. A. (2008). Analysis of genetic diversity in the core collection of red clover (Trifolium pratense) with isozyme and RAPD markers. Crop Breeding and Applied Biotechnology, 8, 202-211. Dugar, Y. N. & Popov, V. N. (2013). Genetic structure and diversity of Ukrainian red clover cultivars revealed by microsatellite markers. Open Journal of Genetics, 3, 235-242. Dumortier, J. (2012). Toepassing van vaderschapstesten en onderzoek van bloembiologie voor selectie naar hogere zaadopbrengst in rode klaver. Bachelor Thesis. KAHO Sint-Lieven. 62p. Encyclopedia Pratensis, , geraadpleegd op 4 februari 2014. Frankow-Lindberg, B. E., Brophy, C., Collins, R. P. & Connolly, J. (2009). Biodiversity effects on yield and unsown species invasion in a temperate forage ecosystem. Annals of botany, 103(6), 913-921. Furuya, H. (2001). Comparisons of seed weight and seedling characteristics of diploid and autotetraploid red clover. PhD thesis. University of Florida. 80p. Greene, S. L., Gritsenko, M. & Vandemark, G. (2004). Relating morphologic and RAPD marker variation to collection site environment in wild populations of red clover (Trifolium pratense L.). Genetic resources and crop evolution, 51(6), 643-653. Glaubitz, J. C. (2004). CONVERT: a user‐friendly program to reformat diploid genotypic data for commonly used population genetic software packages. Molecular Ecology Notes, 4(2), 309310. Goudet, J. (1995). FSTAT (version 1.2): a computer program to calculate F-statistics. Journal of heredity, 86(6), 485-486. Göransson, M., Kristjánsdóttir, T. A., Dalmannsdóttir, S. & Helgadóttir, Á. (2012). Genetic shift in white clover (Trifolium repens) after natural selection in a marginal area. Icelandic Agricultural Sciences, 25, 41-50. Grebenişan, M., Pamfil, D. & Domokos, D. A. (2012). Researches on the main characteristics of red clover seedlings and their influence in seed production. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture, 69(1), 94-102. Grebenişan, M. & Savatti, M. (2011). The comparative effects of the micro-and macrosporogenesis of the red clover with different levels of ploidy, in relation with its fertility. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture, 68(1), 138-143. Hawkins, R. P. (1971). Selection for height of nectar in the corolla tube of English singlecut red clover. The Journal of Agricultural Science, 77(3), 347-350. Haynes, R. J. (1980). Competitive aspects of the grass-legume association. Advances in Agronomy, 33, 227-261. Helgadóttir, Á., Dalmannsdóttir, S. & Collins, R. P. (2001). Adaptational changes in white clover populations selected under marginal conditions. Annals of Botany, 88(1), 771-780. Herrmann, D., Boller, B., Widmer, F. & Kölliker, R. (2005). Optimization of bulked AFLP analysis and its application for exploring diversity of natural and cultivated populations of red clover. Genome, 48(3), 474-486. ILVO website, , geraadpleegd op 21 maart 2014. 59

Isobe, S., Kölliker, R., Hisano, H., Sasamoto, S., Wada, T., Klimenko, I., Okumura, K. & Tabata, S. (2009). Construction of a consensus linkage map for red clover (Trifolium pratense L.). BMC plant biology, 9(1), 57. Johnston, B. (2006). A close-up view of the wildflower "red clover", , geraadpleegd op 3 februari 2014. Kjærgaard, T. (1995). Agricultural development and nitrogen supply from an historical point of view. Biological Agriculture & Horticulture, 11(4), 3-14. Krauss, S. L. (2000). Accurate gene diversity estimates from amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers. Molecular Ecology, 9(9), 1241-1245. Mammadov, J., Aggarwal, R., Buyyarapu, R. & Kumpatla, S. (2012). SNP markers and their impact on plant breeding. International journal of plant genomics, 2012, 1-11. Mengel, K. & Steffens, D. (1985). Potassium uptake of rye-grass (Lolium perenne) and red clover (Trifolium pratense) as related to root parameters. Biology and fertility of soils, 1(1), 53-58. Montardo, D. P., Dall'Agnol, M., Crusius, A. F. & Paim, N. R. (2003). Path analysis for seed production in red clover (Trifolium pratense L.). Revista Brasileira De ZootecniaBrazilian Journal of Animal Science, 32(5), 1076-1082. Multisward website, , geraadpleegd op 4 februari 2014. Muntean, L. (2008). A comparative study of the variability of some morphological traits in a collection of diploid and tetraploid cultivars of red clover. Journal of Central European Agriculture, 4 (2), 185-190. Pahlow, G., Muck, R. E., Driehuis, F., Elferink, S. J. & Spoelstra, S. F. (2003). Microbiology of ensiling. Silage science and technology, 42, 31-93. Penkov, D., Pavlov, D. & Mihovsky, T. (2003). Comparative study of the amino acid's true digestibility of different clover (Trifolium) varieties in experiments with ganders. Journal of Central European Agriculture, 4(2), 191-198. Rao, S. & Stephen, W. P. (2009). Bumble bee pollinators in red clover seed production. Crop Science, 49(6), 2207-2214. Rogers, 2006. Why do we care about genetics, , geraadpleegd op 15 maart 2014. Roldán-Ruiz, I., Calsyn, E., Gilliland, T. J., Coll, R., Van Eijk, M. J. T. & De Loose, M. (2000). Estimating genetic conformity between related ryegrass (Lolium) varieties. 2. AFLP characterization. Molecular Breeding, 6(6), 593-602. Roldán-Ruiz, I., Van Euwijk, F. A., Gilliland, T. J., Dubreuil, P., Dillmann, C., Lallemand, J., ... & Baril, C. P. (2001). A comparative study of molecular and morphological methods of describing relationships between perennial ryegrass (Lolium perenne L.) varieties. Theoretical and Applied Genetics, 103(8), 1138-1150. Roldán-Ruiz, 2013. Analysis of genetic diversity. Unpublished data, ontvangen via e-mail. Sato, S., Isobe, S., Asamizu, E., Ohmido, N., Kataoka, R., Nakamura, Y., Kaneko, T., Sakurai, N., Okumura, K., Klimenko, I., Sasamoto, S., Wada, T., Watanabe, A., Kohara, M., Fujishiro, T. & Tabata, S. (2006). Comprehensive structural analysis of the genome of red clover (Trifolium pratense L.). DNA Research, 12(5), 301-364. Shane’s Simple Guide to F-statistics, , geraadpleegd op 27 februari 2014.

60

Štorchová, H., Hrdličková, R., Chrtek Jr, J., Tetera, M., Fitze, D. & Fehrer, J. (2000). An improved method of DNA isolation from plants collected in the field and conserved in saturated NaCl/CTAB solution. Taxon, 49, 79-84. Sullivan, M. L. & Hatfield, R. D. (2006). Polyphenol oxidase and o-diphenols inhibit postharvest proteolysis in red clover and alfalfa. Crop Science, 46(2), 662-670. Taggart R. E. (2001). Modes of Selection, , geraadpleegd op 16 maart 2014. Taylor, N. L. (2008). A century of clover breeding developments in the United States. Crop science, 48(1), 1-13. Taylor, N. L. & Quesenberry, K. H. (1996). Red Clover Science: Springer, 226p. Urda, M. (2011). Research on the structure of di- and tetraploid redclover seed plants and the influence of meiotic anomalies on the fertility of autotetraploid forms. PhD thesis. University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. 211p. Vandewalle, M. (2007). DNA marker assisted selection for yield and quality traits in Italian ryegrass (Lolium multiflorum L.). PhD thesis. Universiteit Gent. 176p. Van Treuren, R., Bas, N., Goossens, P. J., Jansen, J. & Van Soest, L. J. M. (2005). Genetic diversity in perennial ryegrass and white clover among old Dutch grasslands as compared to cultivars and nature reserves. Molecular Ecology, 14(1), 39-52. Vleugels, T. (2013). Breeding for resistance to clover rot (Sclerotinia spp.) in red clover (Trifolium pratense). PhD thesis. Universiteit Gent. 192p. Vleugels, T., Roldán-Ruiz, I., Baert, J. & Cnops, G. (2013). Corolla tube lengths in red clover (Trifolium pratense) cultivars. Meeting abstract. First Legume Society Conference, Novi Sad, 1p. Vleugels, T., Baert, J., & van Bockstaele, E. (2013). Morphological and pathogenic characterization of genetically diverse Sclerotinia isolates from European red clover crops (Trifolium Pratense L.). Journal of Phytopathology, 161(4), 254-262.

61

Bijlage 1: Indeling van het testveld G8 in Merelbeke

62

Bijlage 2: Sorbitol extraction of plant DNA in 96-well PCR plates Adapted by Andrew Krohn ([email protected]) from: Storchova et al. (2000). An improved method of DNA isolation from plants collected in the field and conserved in saturated NaCl/CTAB solution. Taxon, 49,79-84. EXTRACTION BUFFER:

0,35 M sorbitol 0,1 M Tris-Cl, pH 7,6 0,005 M EDTA 10 mM 2-mercaptoethanol (0,1% v/v)

LYSIS BUFFER:

0,2 M Tris-Cl pH 7,6 0,05 M EDTA 2 M NaCl 2% (w/v) CTAB

1X TE BUFFER, pH 8,0:

1X TE containing 10 µl RNase (100 mg/ml) per 100 ml

CHLOROFORM:ISOAMYL ALCOHOL (24:1) ISOPROPANOL 70% ETHANOL * Just prior to beginning, make fresh extraction buffer in a falcon tube by adding 1 μl 2mercaptoethanol for every ml of extraction buffer needed. Be sure to make a slight excess to account for pipetting errors. Typically, you will need 175 μl per sample (x96 = 16,8 ml per plate, x2 = 33,6 ml per pair of plates), so make 35 ml for two plates. 1. Add two 2,3 mm chrome-steel beads and approximately five 1,3 mm chrome-steel beads to each well. Add about 0,02 g fresh leaf tissue. Beads will remain in plate during extraction. Seal wells with Fisher strip caps using strip-cap sealing tool. Noting vertical orientation, mark each strip with corresponding well column number at top and plate number at bottom. Cool samples in liquid N2. 2. Use yellow plate racks that have had the margin removed, 4 compression mats, and aluminum Qiagen adapter plates in order to make a thick enough sandwich to properly clamp plates into Retsch Mixer Mill (currently upstairs in John Ralph’s lab). Weigh sandwiches and ensure they are within 5 g of each other. Grind samples 3 times at 28 Hz. Wells containing sufficiently ground samples will have very green caps. Return to lab. 3. Spin samples down briefly (2-3 min >2500 rpm). Add 130 μl of extraction buffer to each well. 4. Recap samples with the same cap strips and mix well by inversion. Leave suspension on bench for 15 minutes at RT. During this time, polyphenol compounds are extracted in to the buffer. Occasional mixing during this step may be beneficial. 5. Centrifuge samples 15 minutes at 3500 rpm speed.

63

6. Remove and discard the supernatant (pellet will not be solid, nor will it adhere well to the bottom of the tube). Add 45 μl extraction buffer, pipetting up and down to resuspend pellet and mix. Add 60 μl lysis buffer, mixing each set of wells by pipetting up and down. 7. Recap samples with the same cap strips. Place plates onto a thermal cycler and run a program of 15 min at 80 °C followed by 1 minute at 4 °C. Prolonged high temperature incubation may result in higher yield of DNA. 8. Spin plates down briefly (2-3 min >2500 rpm). 9. In the hood, add 75 μl CHCl3:isoamyl 24:1, seal using same cap strips, and mix well by inversion and/or shaking. Centrifuge 5 minutes at 3500 rpm. 10. Carefully remove 80 μl of aqueous (upper) phase to fresh PCR plates. Make certain you do not transfer any organic phase, or any solid from the interphase. Place CHCl3-containing plate in the hood for proper CHCl3 disposal. 11. To the removed aqueous phase, add 55 μl isopropanol. Seal with new cap strips and mix very well by multiple inversion. Place in -20 °C freezer for >15 minutes. 12. Remove samples from freezer and centrifuge 30-60 minutes at >3000 rpm. Carefully remove plates from centrifuge and immediately remove foil seals, invert onto two clean, folded paper towels and place carefully in inverted position into centrifuge. Spin plates inverted for 10-15 seconds at 200 rpm. 13. Add 50 μl 70% EtOH to the pellet, seal with foil and mix by inversion. Centrifuge 15 minutes at 3500 rpm. 14. Repeat inverted spin as before in step 12. 15. Place unsealed plates on an open thermal cycler set to incubate at 50 °C. 16. When samples are dry (after 5-10 min – don’t over-dry), dissolve DNA pellet in 20 μl 1X TER pH 8.0, seal with same cap strips, mix well and spin samples down (use quick spin button on centrifuge). Check samples by running on gel, quantification or PCR dilution series, and store in the appropriate location.

64