Dr.Iván Mária Uzsoki Kórház Központi laboratórium Immunkémiai részleg
2013
Az orvostudomány régi törekvése, hogy a rosszindulatú daganatos megbetegedéseket korán felismerje, majd a gyógykezelés során a beteg állapotát folyamatosan kövesse..
Bevezetés markerek jellemzői kombinációk,algoritmusok kimutatásuk módjai meghatározást befolyásoló tényezők minőségbiztosítás eredmények értékelése
Egy kis történelem 1845 ben felismert Bence-Jones fehérjéről Kahler 1889-ben már bebizonyította,hogy myeloma multiplexben kórjelző értékű Klasszikus tumormarker-korszak az 1960-as évekkel kezdődött Módszerek fejlesztésének fő időszaka az 1970-1980 közöttiévekre tehető Napjainkig markerek egész sorának felismerése
Mit nevezünk tumormarkernek? Tumormarkernek tekintünk minden olyan testazonos anyagot, amelynek megjelenése vagy koncentrációjának változása jelzi a tumort. Lehetnek celluláris /szöveti/ és extracelluláris /keringő/ tumormarkerek A tumor növekedésének, a terápia eredményességének indikátorai, prognózis megítélésének fontos eszközei Laboratóriumunkban az extracelluláris v. keringő markerek kimutatását végezzük,amelyeket testnedvekből mutatunk ki.
Tumormarkerek Dr. Bekő Gabriella Szakasszisztens képzés 2013 szeptember
• Mintaszöveg szerkesztése • Második szint
• Harmadik szint
• Negyedik szint • Ötödik szint
• Mintaszöveg szerkesztése • Második szint
• Harmadik szint
• Negyedik szint • Ötödik szint
• Mintaszöveg szerkesztése • Második szint
• Harmadik szint
• Negyedik szint • Ötödik szint
Tumormarkerek csoportosítása kimutatásuk szerint Celluláris – daganatszövetből P53, a sejtciklus szabályozója és tumorszupresszor is egyben. uPA,urokinase típusú plasminogén activator hormonreceptorok
Extracelluláris – keringő tumormarkerek Klinikai alkalmazásuk nagyban növelte a rosszindulatú daganatok felismerésének és gyógykezelésének hatékonyságát.
A klinikai gyakorlatban használt legfontosabb markerek Marker
Biokémiai tulajdonság
Elsődleges klinikai alkalmazás
Alfa-foetoprotein - AFP
Glikoprotein, 4% szénhidrát
Primer hepatocelluláris és csírasejtes tumorok
Cancer antigén 125- Ca125
Mucin
Ováriumrák monitorizálása
Cancer antigén 15.3- Ca153 Mucin
Emlőrák monitorizálása
Cancer antigén 72.4- Ca72
Glikoprotein
Gyomorrák monitorizálása
Carcinoembryonalis antigén - CEA
Glikoprotein, 44-60% szénhidrát
Emésztőszervi és egyéb adenocarcinomák
CYFRA 21 - 1
Cytokeratin 19 fragmentjei
Hólyag – és tüdőrák monitorizálása
Human chorion gonadotropin - HCG
Glikoprotein, α és β alegységek
Nem-seminomás csírasejtes tumorok, choriocarcinomák, seminomák,hydatidiform mola
A klinikai gyakorlatban használt legfontosabb markerek Marker
Biokémiai tulajdonság
Elsődleges klinikai alkalmazás
Neuronspecifikus enoláz NSE
Enoláz enzim dimerje
Kissejtes tüdőrák, neuroblastoma, apudoma
Placenta alkalikus foszfatáz
Alkalikus foszfatáz hőstabil izomerje
Csírasejtes tumorok (seminoma) monitorizálása
Prosztataspecifikus antigén - PSA
Glikoprotein, szerinproteáz
A prosztatarák szűrése, monitorizálása
Szöveti polipeptid antigén TPA
A cytokeratin 8, 18, és 19 fragmentjei
Hólyag – és tüdőrák monitorizálása
Szöveti polipeptid – specifikus antigén -TPS
A gytokeratin 18 fragmentje
Áttétes emlőrák monitorizálása
S – 100 protein
Ca-kötő asztrogliális fehérje
Központi idegrendszer primer és áttétes tumor és melanoma monitorizálása
Squamous cell carcinoma antigén- SCC
Laphámsejtes rákok
Hormonok, mint jelzőanyagok Malignus sejtfolyamatokra utalhatnak, ha a hormonok túlprodukciója tapasztalható, a fiziológiás termelődés helyétől eltérő szövetekben található. Eutopicus hormonképződés tumor
hormon
hatás
mellékvese-velő
adrenalin
Katekolaminok és metabolitok fokozott jelenléte a vizeletben
mellékvese-kéreg
aldoszteron
Conn - szindróma
Hypophysis
prolaktin
Cushing - szindróma
Ectopicus hormonképződés tumor
hormon
emlőrák
HCG, kalcitonin, parathormon
tüdő adenocarcinomái
prolaktin, inzulin, glukagon
Tumormarker kombinációk Tumor
Tumor marker
Tumor
Tumor marker
Máj (primer)
AFP, CEA
Prostata
PSA; fPSA
Here
AFP, HCG
Hólyag
TPA; CEA; CA 19-9
Fej/Nyak
SCC; CEA
Emlő
CA 15-3; CEA; TPA
Tüdő
NSE; SCC; CEA; TPA
Cervix
SCC; CA 125; TPA
Epe, Epevezeték
CA 19-9; CEA; TPA
Ovarium
CA 125; CA 19-9; CA 72-4; TPA; HE-4
Pankreasz
CA 19-9; CEA
Neuroblastoma
NSE; VMA; HVA
Colorectal
CEA; CA 19-9; TPA
Limfómák, leukémia
TK1;β-2 mikroglobulin Bence Jones fehérje
Pajzsmirigy
Tg(papill); Calcitonin (Medull.)
Melanoma
S-100
Tumormarker vizsgálatok laboratóriumunkban 2500 2000 2002 2003 2004 2005 2006 2012
1500 1000 500 0 CEA
AFP
CA125
CA15-3 CA19-9
Tumormarkerekről általában • • • • • • • •
tumormarker vizsgálat nem elsődleges tumorkereső döntő többsége nem specifikus nem daganatos betegséghez is társulhat markerszint-emelkedés nem minden daganat markerpozitív ugyanaz a marker-többféle tumor kiindulási érték nagyon fontos a további követésben mintavételek megfelelő időzítése (terápiás beavatkozás után a markerszintek megemelkednek ) az adatok korrekt értelmezése
CEA Legrégebben alkalmazott TM Glikoprotein Az embrionális fejlődés során a pancreasban és a gastrointestinális traktusban képződik Felnőttkorban minimális szintézis zajlik dohányosoknál (annak mértékétől függően) és néhány jóindulatú megbetegedésben (gyulladás) is emelkedhet a CEA szérumkoncentrációja. Nem specifikus
Elsősorban a terápia hatékonyságának és a betegség prognózisának a megítélésére használható más tumormarkerekkel kombinálva. 3-6 hónappal előbb jelzi a visszatérő vagy áttétképző daganatot, mint a klinikai tünetek, vagy a képalkotó eszközök.
CA 15.3 és CEA kombinációja esetén 9 hónapra nő az előrejelzés ideje (LEAD TIME), illetve többszörösére - 7-szeresére - nő a szenzitivitás.
NSE Neuron Specifikus Enolase A neuron specifikus enoláz (NSE) egy tumormarker, mely a 2-foszfoglicerát-foszfoenolpiruvát átalakulást katalizálja. Emelkedett szint neuroendokrin irányban differenciált tumrokban fordul elő leginkább Bronchiális karcinóma: A kissejtes bronchiális karcinóma monitorozásnál az NSE tekinthető az elsődlegesen választandó tumor-markernek, javasolt kombináció SCLC: NSE, TPA; Újabb vizsgálatok Pro-Grp
TPA A TPA (tissue polypeptide antigen) a cytokeratin 8, 18 és 19 keringésbe került polipeptid fragmentumait méri. A cytokeratinok az epithel sejtek közbülső filamentum hálózatában találhatók, a sejtek strukturális integritásában játszanak szerepet. A cytokeratin 8, 18 és 19 az epithel sejtekben kimutatható, mind az egészséges, mind a daganatos sejtek termelik. Szintje jól korrelál az epithel sejtekből kiinduló daganatok proliferációjával. A cytokeratinok jellegzetessége, hogy élettani pH esetén vizes oldatokban nagyon rosszul oldódnak, így a szérumban mérhető cytokeratinok feltehetően a szövetekben található cytokeratinok proteolitikus fragmentumjai.
TPA Nem daganat specifikus tumor marker, különböző daganatok nyomon követéséreaélaémas. Legérzékenyebb a következő daganatok progressziójára: • emlőrák • tüdőrákok • hólyagrák
• colorectalis tumorok • fej, nyak rákok Szérum koncentrációja jelentősen emelkedik hepatitisek, súlyosabb májfunkció zavar esetén is, de szintén magasabb koncentráció észlelhető diabéteszesekben valamint a légzőszervi infekcióban szenvedő betegekben. Ezen állapotokban azonban a betegség javulásával koncentrációja gyorsan csökken (malignus betegségekben a koncentráció hosszú időn keresztül változatlan marad vagy emelkedik).
Glikoprotein Fiziológiáselőfordulása: szekrécióra képes epithélium Emlőtumor monitorozására alkalmazható Hónapokkal előre jelezheti a relapsust CA 15-3 CEA,TPA többszörösére növeli az érzékenységet
Glikoprotein Fiziológiásan előfordul foetális májban szérumban Anyai szérumban 36-38.héten éri el a maximumát Májsejt rosszindulatú vagy gyulladásos elváltozásaiban mutat emelkedést
Lipid és mucin részekből áll Fiziológiásan májban,pancreasban,gyomor-bél rendszerben fordul elő
Pancreas és emésztőszervi tumorok élvonalbeli markere
Pro-GRP
Pro-Gastrin Releasing Peptide vékonybélben termelődő hormon hatású peptid előfordulása: gastrointestinális rendszer,légzőtraktus központi idegrendszer,neuroendokrin sejtek humán GRP gén a 18-as kromoszómán lokalizálódik újabb kutatások szerint az NSE mellett SCLC small cell lung cancer egyik markere lehet
β HCG Glikoprotein Fiziológiásan terhes szérumban fordul elő Referens tartomány:5 mU/ml alatt Diagnosztikus jelentőség: mola terhességben choriocarcinómában heretumoroknál +AFP egyidejú mérésével monitorozásra alkalmazható
Glikoprotein Fiziológiásan belső szervek epithéliumából mutatható ki(ovárium,hasnyálmirigy, epehólyag,gyomor,hörgő,vastagbél Emelkedett érték fiziológiásan:terhes szérumban,anyatejben,magzatvízben fordul elő Utánkövetésre,recidívák felismerésére a pos.esetekben jól használható
PSA Glikoprotein,prostata epithelsejtjei termelik Referens tartomány korfüggő Szűrés alkalmas Prosztatarák diagnózisa • PSA szint meghatározás+fPSA+PSAratio • RDV vizsgálat • Transzrectalis ultrahang prostata biopsia? További vizsgálatok Pro PSA ,Phi index,PCA3
Korspecifikus PSA- normál érték Korspecifikus PSA- normál érték Életkor
PSA érték ( ng/ml)
50-59
2,5
60-69
3,5
70-79
4,5
>80
> 6,5
A PSA emelkedés (velocity) akkor kóros, ha az évi növekedés több mint 0.17 ng/ml /év/
Pro PSA Segítség a döntésben: szükség van biopsziára vagy nincs? A pro PSA vizsgálatakor három értékből (total PSA, free PSA és pro PSA) úgynevezett phi
(prosate healty index) indexet számolnak
phi range
Prosztatarák kockázata
Rák valószínűsége
0-20,9
alacsony
8,4%
21-39,9
mérsékelt
21,0%
40-
magas
44%
PCA3 A teszt a vizeletben lévő prosztatarák-sejteket mutatja ki a PCA3 gén (Prostate Cancer Gene 3, korábban DD3) mRNSexpressziójának mérése révén. A PCA3 expressziója nem csak a prosztatára, hanem a prosztatarákra is specifikus, mert a gén jelentősen nagyobb mértékben (66x) fejeződik ki a prosztatarákos szövetben az egészséges vagy jóindulatú elváltozást mutató prosztataszövetekhez képest. A mérés digitális rektális vizsgálat után nyert elsősugár-vizeletből történik .
A HE4 új tumormarker, melynek alkalmazása a petefészek epiteliális karcinómájának korai felismerésében jelent nagy segítséget. 13kD protein Spermium érésben szerepet játszó proteáz inhibítor Nagy szenzitivitás és specificitás petefészekrákban Korai stádiumokban is emelkedett Benignus állapotokban nem
Miért fontos ? Petefészekrák-évente több mint 1000 megbetegedés Korai tünetek hiánya Magas mortalitás Gyors progresszió
Elsőként Kirchoff éás munkatársai azonosították Hellström és mnktsai antitesteket fejlesztettek ki Újabb vizsgálatok alapján a HE4 - CA 125 marker együttes alkalmazása az epiteliális ovárium karcinóma korai kimutatására alkalmazható.
Bizonyítást nyert az is hogy endometriosis esetében nem emelkedik,ellentétben a ca125 értékekkel,mely gyakran okoz differenciáldiagnosztikai nehézségeket Álpozitivitást okozhat:vesebetegség májchirrosis bizonyos tüdőbetegségek
Adnextumor diagnosztikája Multidiszciplináris: Nőgyógyászati: •Fizikális vizsgálat •Hüvelyi UH Labor: tumormarker (CA125, HE4) kockázatbecslő algoritmusok: RMI,ROMA
• Képalkotás: CT, MR, Rtg., hasi UH… • Társszakmák konzílium: endoszkópia…
Bizonyítást nyert hogy a HE4 és ca125 szintjének meghatározásán alapuló kockázat elemzés hatékony módszer a petefészekelváltozások műtét előtti kivizsgálása során CA 125: sens:43,3% HE4: sens:72,9% Ca125+HE4 sens:76,4%
A CA-125 és HE4 vizsgálat együttes alkalmazása vezetett a legmagasabb (76,4 %-os) szenzitivitásra 95 %-os specifitás mellett Kockázatbecslő algoritmusok nagyban segítik a dg.felállítását
Gynecol Oncol2008
RMI Az RMI kalkulátor elnevezése mozaikszóból ered:
Risk of Malignancy Index, RMI score = ultrahang pont x menopauza pontszám x CA125 szint U /ml. RMI 1 pontszám
RMI 2 pontszám
Ultrahang jelek • multilocular ciszta • kétoldali léziók • ascites • hasüregi áttétek
0 = nincs 1 = egy rendellenesség 3 = két vagy több rendellenesség
0 = nincs 1 = egy rendellenesség 4 = két vagy több rendellenesség
Premenopauzális
1
1
Posztmenopauzális
3
4
CA125
U / ml
U / ml
A hámeredetű petefészekrák valószínűségének becslésére szolgál a ROMA index (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm): az algoritmus figyelembe veszi a HE4 és a CA-125 értéket, valamint a beteg menopauzális státuszát. PI(Prediktív index) Premenopausában -12,0+2,38xLN(HE4)+0,0626xLN(CA125) Postmenopausában -8,09+1,04xLN(HE4)+0,732xLN(CA 125)
ROMA index%:
exp(PI) 1+Exp(PI) x100
Premenopausa: Alacsony rizikó<7,4%<magas rizikó Postmenopausa: alacsony rizikó:<25,3%<magas rizikó
Timidin kináz
•Kulcsfontosságú a DNS szintézisben, a sejtosztódásban Deoxitimidin 5’-foszfát
Deoxitimidin
Timidin kináz
+ ATP
+ ADP
A timidin-kináz a citoplazmában megtalálható enzim, mely a DNS-szintézis ún. mentési útvonalában vesz részt;a timidint dezoxi-timidin-monofoszfáttá (dTMP) alakítja.
Timidin kináz Megkülönböztetjük a timidin-kináz két formáját citoplazmatikus (TK1) mitokondriális (TK2) A TK1 aktivitása a sejtciklust követi: G1/S fázis határán jelentősen fokozódik, az M fázishoz érve gyorsan csökken. Normál sejtműködés esetén, a gyors degradáció miatt nem jelenik meg számottevő koncentrációban a szérumban
Timidin kináz Széteső tumor sejtekből jelentős mennyiségű enzim szabadulhat fel ,és a szérumkoncentráció emelkedés jól mutatja a daganat progresszióját. Referencia-tartomány korfüggő, kialakítása a laboratórium feladata A TK1 szérumkoncentráció arányos a sejt proliferációs aktivitásával,így alkalmas a malignus folyamat progressziójának felismerésére és a kemoterápiás kezelés hatékonyságának megítélésére.
Timidin kináz Az alábbi malignus betegségeknél igazolt a TK1 önálló vagy más tumor markerrel kombinált alkalmazhatósága: Hodgkin lymphoma (HL) Myelodysplasticus syndroma (MDS) Non-Hodgkin lymphoma (NHL) Kronikus lymphoid leukemia (CLL) Acut myeloid leukemia (AML) Acut lymphoid leukemia (ALL) Myeloma multiplex (MM)
Kissejtes tüdô carcinoma (SCCL) Prostata carcinoma Emlô carcinoma Colorectalis carcinoma Laphámsejtes fej-nyaki rákok Álpozitivitást okozhatnak a vészes vérszegénység, illetve a herpes simplex vírus okozta betegség akut stádiuma.
Enzim immunoassay (EIA, ELISA, EMIT) Fluoreszcens polarizációs immunoassay (FPIA) Lumineszcens immunoassay (LIA) Immunoradiometrikus assay( IRMA) Radioimmunoassay (RIA) Microbead-enzim immunoassay (MEIA) Enzimhez kapcsolódó fluoreszcens assay (ELFA) Lectin-enzim immunoassay (LEIA) Immunofluoreszcens assay (IFA) Electrochemilumineszcens assay (ECLIA) Immunomagnetikus electrochemilumineszcens assay (IMECL) Más módszerek
Luminescens Immunoassay
MEIA • antitesttel fedett mikropartikulum+minta • üvegszálmatrixhoz rögzítés majd mosás • alkalikus foszfatázzal jelölt antigénspecifikus antitest hozzáadás • 4-metilum biliferon foszfát MUP hozzáadás • fluoreszcens termék mérése Abbott
AXSYM
Immulite 2000 Antigén-antitest reakción alapuló mérés kemiluminescens anyaggal való jelölés foton kibocsátását detektáljuk
ECLIA Electro-chemiluminescens immunoassay
Chemiluminescens paramagnetikus enzimimmunoassay
Abbott Architect
UniCel DxI 600
Megbízható preanalítika szükséges!! éhgyomri mintavétel beavatkozás előtti-kiindulási érték mérése terápia után körültekintő időpontválasztás -bizonyos markerek többszöröse mérhető közvetlen műtét vagy kemoterápiás kezelés után
natív vérvételi cső szükséges, - géles mintavételi cső bizonyos assay-nél zavarhat egyértelmű jelölés, kérőcédula pontos kitöltése centrifugálás, szérum elválasztás tárolás : általában 4-5 napig 2-8 ºC-on, ennél tovább-20ºC-on 2 hónapig
A therápia hatékonyságának , a betegség prognózisának a megítélésére.a markerértékek nagymértékben hozzájárulnak Ahhoz hogy a kapott számszerű értékeket megfelelő információ értékkel ruházzuk fel, számos követelménynek kell eleget tennünk. -korrekt mintavétel, mintakezelés ,mintatárolás, időpont választás -a vizsgálatot megelőző körülmények ismerete -páciens megfelelő előkészítése -biológiai variábilitások ismerete kiindulási érték fontossága -eredményeket befolyásoló tényezők ismerete - esetleges gyógyszeres kezelés - orvosi beavatkozás, műtét
Jóindulatú ,ill.gyulladásos betegégek (pl.bronchitis,hepatitis,gastritis,pancreatitis) Metabolizmus és kiválasztás zavara májbetegségekben (AFP,CA 153,CEA,CA 199,CA 125) Rectális digitális vizsgálat(PSA) Terhesség!!(AFP,CA 125) Menstruáció,endometriosis (CA 125) Veseműködés zavara(CA 153,CA 199,CEA,PSA,CA 125) Therápiás beavatkozások -műtét -kemotherápia járulékos hatása Vészes vérszegénység, illetve a herpes simplex vírus okozta betegség akut stádiuma(TK1)
Immunkomplex képződés keringő antitestekkel Tumorszövet vascularizációja gyenge TM nem képződik, vagy benn marad a sejtben,ill.a felszínén Kevés a markert szintetizáló tumorsejt száma Blokkolt TM szintézis Gyorsult TM lebomlás és kiürülés Helytelen marker választás
Eredmények közlése
analízis
eredmény értékelése
• technikai ellenőrzés • diplomás validálás • leletezés
• 3 szintű saját kontroll • 2 szintű független kontroll • külső QualiCont, EQA vagy RIQAS rendszer
Összegzés A monitorozás hatékonyságának érdekében minimálisra kell csökkenteni a preanalitikai hibákat. Nagy hangsúlyt kell fektetni a beteg megfelelő előkészítésére, a mintakezelésre Minden betegnek rendelkeznie kell a terápa előtti kiindulási értékkel, amit lehetőleg ugyanabban a laboratóriumban (ugyanazon módszerrel) kell kontrollálni . A terápia utáni mérések megtervezésénél figyelembe kell venni a felezési időt, az esetleges kiválasztási zavart, finanszírozási protokollt Törekedni kell a multiparametrikus vizsgálatra, mely nagymértékben javítja diagnosztikai érzékenységet sokszor specificitást is, de szerepet játszik a prognózis felállításában és terápia monitorozásában is. Az eredményeket csak más klinikai és műszeres diagnosztikai információkkal együtt szabad értékelni A molekulárbiológia , genetika várható fejlődése tovább fogja segíteni a tumorok felismerését és differenciálását, ezzel a speciálisabb terápia kifejlesztését
Köszönöm a megtisztelő figyelmet
