METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian Studi Pengaruh Variasi Pemberian Kadar Teh Hijau dalam Mengontrol Level Glukosa Plasma Darah Post-Prandial pada Subjek Dewasa Muda Sehat dilaksanakan dalam dua tahap (tahap pendahuluan dan tahap clinical) pada bulan November 2010 sampai Januari 2011. Penelitian tahap pendahuluan dilaksanakan di Laboratorium Analisis Teh dan Kina, Pusat Penelitian Teh dan Kina Gambung, Indonesia. Penelitian tahap klinis dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Gizi, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor, Indonesia. Penelitian ini merupakan uji klinis tingkat satu (Phase 1 Clinical Trials) yang telah direview oleh tim Komisi Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Kementerian Kesehatan Indonesia dengan dikeluarkannya Ethical Approval atau Ethical Clearance No. LB.03.04/KE/8749/2010 yang diterbitkan di Jakarta pada tanggal 31 Desember 2010 (Lampiran 1).
Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah teh Camellia sinensis var. Assamica klon Gambung 7 yang diperoleh dan diproses di Laboratorium Mini Processing Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Gambung, Indonesia. Sampel merupakan bahan yang sama dengan yang digunakan pada penelitian Studi Pengaruh Teh Hijau, Teh Hitam, Teh Daun Murbei, serta Campurannya terhadap Pengendalian Kadar Glukosa Darah Tikus Diabetes (Kustiyah et al. 2009). Bahan pereaksi kimia yang digunakan untuk analisis EGCG (epigallocatechin gallate) teh hijau terdiri dari kloroform p.a., etil asetat p.a., air bebas ion, standar EGCG, pelarut polifenol (asetonitril 12 ml, etil asetat 2 ml, H2PO4 0,05% 86 ml). Alat yang digunakan untuk analisis EGCG teh hijau adalah Erlenmeyer 500 ml, timbangan elektronik, timbangan mikro Mettler H34, labu ukur 50 ml dan 250 ml, corong biasa, corong pisah 250 ml, gelas ukur 50 ml, pipet gondok 25 ml, labu didih bundar (alas datar) 250 ml, Millex HA 0,45 µm, rotavapor, strirrer, sonicator, kolom MetaChem PolarisTM Amide C18-5 µm-4,6 x 250 mm, HPLC UV-Vis Waters. Bahan dan alat yang digunakan untuk analisis glukosa darah adalah D(+)-glucose anhydrous-Charge/Lot K40684937029-Series 1.08337.5000 - Merck KgaA - Darmstadt - GERMANY, glucometer OneTouch®
Ultra™ Blood Glucose Monitoring System-Series BJJ86C8TT-Lot T10062023X LifeScan Inc.-Milpitas CA-USA-Johnson and Johnson Company, glucose strip OneTouch® Ultra™ Lot 3068957 LifeScan Inc.-Milpitas CA-USA-Johnson and Johnson Company.
Metode Penelitian ini terdiri atas dua tahap, yaitu tahap penelitian pendahuluan dan tahap penelitian klinis. A. Tahap penelitian pendahuluan Tahap penelitian pendahuluan bertujuan untuk mengetahui kandungan EGCG pada minuman teh hijau awal (biang) dan menentukan perhitungan untuk mengencerkan minuman teh hijau awal (biang) sehingga didapatkan cara membuat minuman teh hijau intervensi dengan kadar 100 dan 200 mg/200 ml. 1. Analisis kadar EGCG minuman teh hijau awal (biang) Mula-mula dilakukan penetapan metode cara pembuatan minuman teh hijau awal (biang) yang merupakan modifikasi dari penelitian Komes et al. (2010) dan Venditti et al. (2010), yaitu metode penyeduhan teh hijau dengan hasil perolehan EGCG yang maksimal (Gambar 13). Teh hijau ditimbang sebanyak 5 g ↓ Diseduh dengan 200 ml air panas (~90oC) ↓ Diaduk selama satu menit dan didiamkan selama dua menit ↓ Penyaringan ↓ ampas (dibuang) Minuman teh hijau awal (biang) Gambar 13
Cara pembuatan minuman teh hijau awal (modifikasi Komes et al. 2010 dan Venditti et al. 2010)
Tahap selanjutnya untuk analisis kadar EGCG dari minuman teh hijau awal (biang) yaitu proses ekstraksi (liquid/liquid extraction) untuk mengekstrak EGCG yang terdapat dalam minuman teh hijau awal (biang). Tahapan tersebut ditunjukkan pada Gambar 14. Minuman teh hijau di atas disaring dengan menggunakan kertas saring dan larutannya dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml ↓ Larutan dipipet sebanyak 25 ml dan dimasukkan ke dalam corong pisah 250 ml ↓ Ditambahkan 50 ml kloroform p.a. dan dikocok selama + 2 menit, kemudian dipisahkan larutan bawahnya (kloroform) untuk dibuang (proses tersebut dilakukan sebanyak tiga kali) ↓ Larutan contoh kemudian ditambahkan 50 ml etil asetat p.a. kemudian dikocok selama + 7 menit, kemudian dipisahkan larutan atasnya (etil asetat) dan ditampung ke dalam labu didih bulat 250 ml ↓ Larutan etil asetat pada labu didih bulat 250 ml diuapkan dengan menggunakan rotavapor sampai kering (tidak berbau etil asetat) ↓ Kemudian dilarutkan dengan solven (etil asetat, asetonitril, H2PO4) ke dalam labu ukur 50 ml, diimpitkan dan dikocok ↓ Kemudian disaring dengan Millex HA 0,45 µl ↓ Larutan siap disuntikkan ke HPLC Gambar 14
Prosedur analisis kadar EGCG di dalam minuman teh hijau awal (biang) (PPTK 2006)
Setelah didapatkan luas area puncak dari analisis EGCG dan tg α zat standar EGCG, maka untuk menghitung konsentrasi EGCG dalam satuan ppm (part per million) digunakan persamaan berikut:
x=
y b
Keterangan: x = konsentrasi EGCG-epigallocatechin gallate (ppm) y = luas area puncak b = tg α standar EGCG-epigallocatechin gallate (4,4752)
2. Penetapan cara perhitungan kadar EGCG minuman teh intervensi. Konsentrasi EGCG yang diperoleh memiliki satuan ppm. Satuan ppm (part per million) setara dengan satuan mg/l dengan asumsi berat jenis minuman teh sama dengan berat jenis air (Satterfield 2004). Oleh karena itu, untuk mengkonversi kadar EGCG dalam satuan ppm (part per million) menjadi satuan mg/200ml yaitu dengan membagi angka satuan ppm (part
per million) dengan angka lima. Setelah mendapatkan kadar EGCG minuman teh hijau awal (biang), maka dapat dilakukan perhitungan stokiometri untuk mengetahui volume yang dibutuhkan untuk membuat minuman teh hijau dengan kadar 100 dan 200 mg EGCG di dalam 200 ml. Pertama dilakukan perhitungan molaritas dari minuman teh hijau awal dengan persamaan berikut:
M1 =
g Mr x V
Keterangan: M1 = molaritas minuman teh hijau awal (mol/l) g = kandungan EGCG pada minuman teh hijau awal (g) Mr = masa molekul EGCG (g/mol) V = volume minuman teh hijau awal (l)
Selanjutnya untuk mengetahui volume yang harus diambil dari minuman teh hijau awal (MTHj awal / minuman teh hijau biang) sehingga didapatkan minuman teh hijau dengan kadar EGCG sebesar 100 mg dan 200 mg di dalam 200 ml, maka dilakukan perhitungan dengan persamaan berikut:
VX =
g Mr x M1
Keterangan: M1 = molaritas minuman teh hijau awal (mol/l) g = kandungan EGCG pada minuman teh hijau yang diinginkan (0,1 g atau 0,2 g) Mr = masa molekul EGCG (mol/l) Vx = volume minuman teh hijau untuk kadar yang diinginkan (l)
B. Tahap penelitian klinis Tahap penelitian klinis bertujuan untuk mengetahui pengaruh intervensi EGCG pada respon glukosa darah post-prandial. Tahap penelitian klinis terdiri dari empat sub tahap yaitu: 1. Penentuan jumlah subjek yang akan dilibatkan dalam penelitian Populasi target adalah mahasiswa Institut Pertanian Bogor yang memenuhi kriteria inklusi penelitian. Kriteria inklusi diberlakukan bagi subjek penelitian sehingga hasil dari pengukuran glukosa plasma darah subjek benar-benar valid dan tidak terpengaruh oleh faktor-faktor luar selain dari intervensi yang diberikan yang menyebabkan fluktuasi dari kandungan glukosa plasma darah. Kriteria subjek adalah: a. Individu sehat dengan IMT 18,5-23 kg/m2 (WHO Expert Consultation 2004); b. Berusia antara 20-35 tahun (Shephard 1998); c. Tidak menderita diabetes
mellitus (Lee 2009); d. Tidak sedang hamil atau menyusui (Lee 2009); e. Tidak merokok (Lee 2009); f. Tidak mengkonsumsi alkohol (Lee 2009); g. Tidak sedang mengkonsumsi obat-obatan (Lee 2009); h. Aktivitas fisik sedang (Lee 2009); i. Tidak mengalami tekanan psikis (Radahmadi et al. 2006). Open call untuk individu yang tertarik untuk berpartisipasi dalam penelitian ini dilakukan pada minggu terakhir bulan November 2010. Apabila individu memenuhi kriteria inklusi dan bersedia menandatangani
Informed Consent, maka individu tersebut ditetapkan sebagai subjek penelitian. Penentuan jumlah subjek dilakukan dengan menggunakan nomogram ukuran sampel dan power dalam membandingkan dua atau lebih kelompok perlakuan pada clinical trials (Day & Graham 1989). Perhitungan awal dilakukan untuk menghitung difference parameter (ψ Plan = λ ) dengan menggunakan persamaan berikut:
ψ Plan =
∑ (µ
i
− µ)
2
( g − 1)σ 2 Plan
Keterangan: ψ Plan = nilai difference parameter
µi µ σ Plan
g
= nilai rata-rata kelompok ke-i 151, 133, 113 mg/dl = nilai rata-rata antar kelompok 133 mg/dl = tetapan untuk menentukan standar deviasi 15 = jumlah kelompok penelitian yang akan diberikan perlakuan 100 mg, 200 mg
kontrol,
Dalam perhitungan jumlah sampel dengan menggunakan rumus diatas maka untuk mendapatkan nilai difference parameter (ψ Plan = λ ), indikator seperti µ i dan µ harus merujuk pada penelitian-penelitian sebelumnya. Penelitian yang dijadikan rujukan adalah penelitian yang dilakukan oleh Tsuneki et al. (2004) dalam mengevaluasi kadar glukosa darah subjek sehat yang diberikan intervensi minuman teh hijau ekuivalen dengan 84 mg EGCG yang kemudian setelah jeda 10 menit diberikan 225 ml Trelan-G75 yang mengandung glukosa murni 75 g. Hal tersebut dibandingkan dengan kelompok kontrol yang hanya diberikan intervensi 225 ml Trelan-G75 yang mengandung glukosa murni 75 g. Hasil dari penelitian Tsuneki et al. (2004) menunjukkan bahwa nilai rata-rata kadar glukosa plasma darah puncak untuk kelompok perlakuan kontrol yaitu 151 mg/dl, sedangkan untuk kelompok perlakuan 84 mg EGCG yaitu 133 mg/dl. Selisih dari kedua perlakuan tersebut adalah 18 mg/dl, sehingga dengan menetapkan hipotesis semakin tinggi kadar EGCG yang diberikan maka akan memberikan efek penurunan glukosa darah yang sebanding maka untuk perlakuan 168 mg EGCG diasumsikan dapat menurunkan nilai glukosa plasma darah menjadi 115 mg/dl. Nilai tersebut dimasukkan ke dalam perhitungan
∑ (µ
i
− µ)
2
sehingga didapatkan nilai sebesar
648. Tetapan umum yang sering digunakan dengan lebar rentang interkuartil sebesar 2SD adalah dengan menggunakan nilai σ Plan sebesar 15. Setelah semua indikator tersebut dimasukkan dalam rumus ψPlan di atas, maka diperoleh nilai ψPlan sebesar 1,2. Kemudian nilai ψPlan dimasukkan pada nomogram ukuran sampel dengan ditetapkan power 99% dan nilai α 5%, maka didapatkan jumlah sampel minimal untuk tiap
kelompok perlakuan yaitu 8 (delapan) subjek. Untuk menghindari drop-out pada saat penelitian, maka ditambahkan 2 (dua) subjek untuk masingmasing kelompok perlakuan, sehingga jumlah subjek yang dibutuhkan untuk masing-masing kelompok yaitu sebanyak 10 (sepuluh) subjek. Penelitian ini menggunakan disain paired samples clinical trials sehingga hanya dibutuhkan sepuluh subjek, dengan aturan kesepuluh subjek tersebut akan mendapatkan seluruh taraf perlakuan intervensi (kontrol, minuman teh hijau 100 mg EGCG, minuman teh hijau 200 mg EGCG) dengan periode washout antar perlakuan selama dua hari. Perhitungan dan pengeplotan dari ψ Plan = λ dijabarkan sebagai berikut:
ψ Plan =
∑ (µ
i
− µ)
2
( g − 1)σ 2 Plan
ψ Plan =
(151 − 133) 2 + (133 − 133) 2 + (115 − 133) 2 (3 − 1)152
ψ Plan =
(18) 2 + (0) 2 + (18) 2 450
ψ Plan =
324 + 0 + 324 450
ψ Plan =
648 450
ψ Plan = 1,44 ψ Plan = 1,2
Keterangan: Untuk mendapatkan jumlah sampel yang dibutuhkan per kelompok, hasil perhitungan nilai ψPlan (difference parameter) = 1,2 yang didapatkan ditarik garis lurus secara vertikal. Kemudian nilai power yang telah ditetapkan (99%) ditarik garis lurus horisontal. Setelah itu titik kelompok dan nilai α yang telah ditentukan (g=3 dan α=5%) ditarik garis memotong perpotongan garis vertikal ψPlan dan garis horisontal power menuju garis horisontal kelompok dan nilai α. Kemudian dilanjutkan dengan menarik garis vertikal untuk mendapatkan jumlah sampel minimal yang dibutuhkan per kelompok (8 subjek).
Gambar 15 Nomogram ukuran sampel dan power (Day & Graham 1989)
2. Intervensi minuman teh hijau sesuai taraf perlakuan intervensi Perlakuan dalam penelitian ini adalah konsentrasi EGCG dalam 200 ml minuman teh hijau. Perlakuan tersebut terdiri dari tiga taraf yaitu: kontrol (0 mg EGCG), 100 mg EGCG, dan 200 mg EGCG. Sebelum mendapatkan intervensi, subjek dipuasakan selama 10 jam sebelumnya dengan makan terakhir pukul 23.00 pada hari sebelum pengambilan darah (ADA 2001). Selama waktu puasa, subjek tidak diperkenankan mengkonsumsi jenis makanan apapun kecuali air mineral (CCNIH 1999). Pada pagi hari subjek dikumpulkan di Laboratorium Biokimia Gizi, kemudian intervensi dilakukan pada pukul 09.00 pagi.
Pada kelompok kontrol, subjek diberikan intervensi 75 g glukosa murni (anhydrous D-glucose) yang dilarutkan pada 200 ml air mineral. Pada kelompok 100 mg, subjek diberikan intervensi minuman teh hijau yang mengandung 100 mg EGCG dalam 200 ml, kemudian setelah selang 10 menit subjek diberikan intervensi 75 g glukosa murni (anhydrous D-glucose) yang dilarutkan pada 200 ml air mineral. Begitu juga pada kelompok 200 mg EGCG, subjek diberikan intervensi minuman teh hijau yang mengandung 200 mg EGCG dalam 200 ml, kemudian setelah selang 10 menit subjek diberikan intervensi 75 g glukosa murni (anhydrous D-glucose) yang dilarutkan pada 200 ml air mineral.
3. Pengukuran kadar glukosa plasma darah Tujuan dari pengambilan sampel darah adalah untuk mengetahui kadar glukosa darah subjek ketika diberikan perlakuan. Prosedur yang digunakan dalam pengukuran glukosa plasma darah yaitu berdasarkan prosedur pengukuran OGTT (Oral Glucose Tolerance Test) yang dirujuk dari standar WHO (Reinauer et al. 2002). Pengukuran kadar glukosa plasma darah ini terdiri dari dua bagian, yaitu persiapan sebelum pengambilan darah dan pada saat pengambilan darah. Berikut merupakan poin penting persiapan sebelum pengambilan darah: a. Ruangan dipastikan pada suhu ruangan yang sejuk dengan dilengkapi oleh AC pada suhu maksimal 20oC. Hal ini untuk menjaga kestabilan plasma darah yang akan diuji pada alat uji glukometer (Reinauer et al. 2002). b. Subjek diharuskan dalam kondisi rileks selama 5 menit sebelum pengambilan darah. c. Subjek disarankan untuk menggunakan jari tangan tengah atau jari tangan yang menurut subjek tidak terasa dingin. Hal ini untuk menghindari terjadinya hematoma. d. Subjek
disarankan
menggelantung
ke
untuk
memposisikan lengan tangan rileks
samping
selama
beberapa
saat
untuk
melancarkan aliran darah. e. Lancet yang digunakan hanya sekali pakai untuk pengambilan darah (disposable).
satu kali
Berikut merupakan tahapan pada saat pengambilan darah: a. Sebelum mendapat perlakuan intervensi, subjek diambil darahnya untuk mengetahui glukosa plasma darah menit ke-0. b. Kemudian subjek diberi intervensi sesuai dengan taraf perlakuan konsentrasi EGCG pada minuman teh hijau yang harus diminum dan dihabiskan dalam waktu lima menit (Provan & Krentz 2002). c. Selama 150 menit pasca pemberian perlakuan, sampel darah sebanyak 2 µl diambil dengan menggunakan finger-prick capillary
blood samples method—dengan berturut-turut diambil pada menit ke 30, 60, 90, 120, 150 (Louie et al. 2008; Provan & Krentz 2002; Reinauer et al. 2002; Wolever 2006). d. Tahapan yang dilakukan oleh paramedik saat mengambil darah adalah : 1) Strip glukosa dibuka dari kemasan; 2) Strip glukosa kemudian dipasangkan pada glukometer; 3) Lancet sekali pakai (disposable) dipasangkan pada pen lancet, kemudian ditusukkan secara otomatis ke jari subjek; 4) Tetesan darah ditempatkan pada sensor yang terdapat pada strip glukometer; 5) Dalam hitungan sekitar 30 detik, hasil dari pengukuran dapat terbaca pada layar glukometer (Clayton 2007). Gambar 16 berikut merupakan ilustrasi dari tahapan pengambilan sampel darah.
Tahap 1
Tahap 4 Gambar 16
Tahap 2
Tahap 3
Tahap 5
Ilustrasi tahapan pengambilan sampel darah (Clayton 2007)
4. Pengeplotan, perhitungan luas kurva AUC ( area under curve), dan perhitungan nilai glucose score Data kadar glukosa darah yang didapatkan dari setiap individu kemudian diplotkan ke dalam grafik dengan menit pengukuran pada sumbu-x dan kadar glukosa darah pada sumbu-y. Setelah itu dilakukan perhitungan luas AUC untuk setiap individu pada masing-masing perlakuan. Luas AUC digunakan untuk mengetahui luasan di bawah kurva dari grafik respon glukosa darah. Metode yang digunakan untuk mengitung luas AUC adalah Trapezoid Method / Trapezoid Rules (Shiang 2004; Wolever 2006). Perhitungan luas AUC dengan menggunakan
Trapezoid Method / Trapezoid Rules dilakukan dengan menggunakan persamaan berikut:
(a + b) x t Luas AUC = ∑ 2
Keterangan: a dan b = dua sisi sejajar, yaitu kadar glukosa darah antar dua periode pengukuran (mg/dl) t = tinggi, yaitu jarak periode pengukuran kadar glukosa darah (jam)
Nilai
glucose
score
digunakan
untuk
mengetahui
persen
perbandingan antara nilai glukosa kelompok kontrol dengan kelompok yang diberikan intervensi (Louie et al. 2008). Perhitungan nilai glucose
score dilakukan untuk setiap individu dengan cara membandingkan luas AUC kelompok intervensi dibandingkan dengan luas AUC kelompok kontrol yang kemudian dikalikan dengan angka 100. Penjabaran perhitungan nilai glucose score dapat dilihat pada persamaan berikut:
Nilai glucose score =
A x 100 B
Keterangan: -1 A = luas AUC kelompok intervensi (mg.dl .h) -1 B = luas AUC kelompok kontrol (mg.dl .h)
Nilai kepentingan klinis yang diuji adalah RR (relative risk), RRR (relative risk reduction), dan ARR (absolute risk reduction). Dalam menentukan nilai kepentingan klinis, peneliti menetapkan jika subjek
kelompok intervensi pada penelitian memiliki perbedaan kadar glukosa darah sepuluh poin dibandingkan dengan kadar glukosa darah kelompok kontrol maka dinyatakan bermakna dalam menurunkan kadar glukosa darah. Selisih sepuluh poin tersebut dirujuk berdasarkan penelitian Venables et al. (2008). Nilai kepentingan klinis dihitung dengan menggunakan tabel dan formulasi yang merujuk pada Dahlan (2010).
Tabel 3 Nilai kepentingan klinis perlakuan kontrol dan eksperimen
Perlakuan Perlakuan eksperimen Perlakuan kontrol
Keluaran Tidak Ya a b c d
Total a+b c+d
Keterangan : Keluaran : penurunan kadar glukosa darah a : jumlah subjek yang tidak mengalami penurunan kadar glukosa darah pada kelompok intervensi b : jumlah subjek yang mengalami penurunan kadar glukosa darah pada kelompok intervensi c : jumlah subjek yang tidak mengalami penurunan kadar glukosa pada kelompok kontrol d : jumlah subjek yang mengalami penurunan kadar glukosa darah pada kelompok kontrol
EER =
a a+b
CER =
c c+d
RR =
EER CER
RRR = 1 – RR ARR = | EER – CER | Keterangan : CER : control event rate (proporsi pada kelompok kontrol) EER : experiment event rate (proporsi pada kelompok eksperimen) RR : relative risk RRR : relative risk reduction ARR : absolute risk reduction
Bagan alur tahapan penelitian ini secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 17.
TAHAP PENELITIAN PENDAHULUAN Analisis EGCG minuman teh hijau
Perhitungan stokiometri untuk membuat minuman teh hijau yang digunakan intervensi yang mengandung 100 mg EGCG dan 200 mg EGCG
TAHAP PENELITIAN KLINIS
Populasi subjek Normal dewasa muda sehat
Kriteria inklusi: 2 - Sehat (IMT 18,5 – 23 kg/m ) - Usia 20-35 tahun - Aktifitas fisik sedang
Randomized assigned
Kriteria eksklusi: - Memiliki riwayat DM - Sedang hamil atau menyusui - Memiliki kebiasaan merokok - Mengkonsumsi alkohol - Mengkonsumsi obat-obatan - Mengalami tekanan psikis
Sampel 10 subjek (single dose oral response) Clinical trials paired samples
Kelompok Kontrol n = 10
wash-out (dua hari)
Kelompok 100 mg EGCG n = 10
wash-out (dua hari)
Kelompok 200 mg EGCG n = 10
Subjek diukur kadar gula darah post-prandial pada menit ke-0, 30, 60, 90, 120, 150
Keterangan : 1. K. Kontrol
= Kelompok kontrol pada subjek yang tidak mendapat intervensi minuman teh hijau (75 g glukosa yang dilarutkan dalam 200 ml air mineral) 2. K .100 mg EGCG = Kelompok subjek yang mendapat intervensi teh hijau A (75 g glukosa yang dilarutkan dalam 200 ml air, kemudian setelah jeda 10 menit diberikan 200 ml minuman teh hijau yang mengandung 100 mg EGCG) 3. K. 200 mg EGCG = Kelompok subjek yang mendapat intervensi teh hijau B (75 g glukosa yang dilarutkan dalam 200 ml air, kemudian setelah jeda 10 menit diberikan 200 ml minuman teh hijau yang mengandung 200 mg EGCG)
Gambar 17
Bagan alur tahapan penelitian pendahuluan dan klinis
Pengolahan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan adalah pendekatan Rancangan Acak Lengkap Faktorial yang terdiri atas dua faktor perlakuan. Percobaan faktorial dicirikan oleh perlakuan yang merupakan komposisi dari semua kemungkinan kombinasi dari dua faktor atau lebih. Penetapan rancangan didasarkan pada asumsi bahwa unit percobaan yang digunakan relatif homogen yaitu dengan memberlakukan kriteria inklusi subjek penelitian yang tertulis pada metode tahap penelitian klinis pada halaman 38 dan bagan alur tahapan penelitian pada halaman 46.
Perlakuan yang diberikan adalah : A. Faktor perlakuan intervensi (air mineral / kontrol, 200 ml minuman teh hijau yang mengandung 100 mg EGCG dan 75 gr anhydrous D-glucose yang dilarutkan dalam 200 ml air, minuman teh hijau yang mengandung 200 mg EGCG dan 75 gr anhydrous D-glucose yang dilarutkan dalam 200 ml air). B. Faktor waktu pengambilan darah (menit ke-0, menit ke-30, menit ke-60, menit ke-90, menit ke-120, menit ke-150).
Model matematika dari rancangan tersebut adalah sebagai berikut: Yijk = µ + α i + βj + ε
ijk
Keterangan: Yijk = nilai pengamatan pada pemberian intervensi taraf ke-i, waktu (menit) taraf ke-j dan ulangan ke-k µ = nilai rata-rata α i = pengaruh pemberian intervensi taraf ke-i βj = pengaruh waktu (menit) ke-j ε ijk = galat error dari pemberian intervensi taraf ke-i, waktu (menit) ke-j, dan ulangan ke-k i = taraf intervensi, yaitu = 0, 100, dan 200 mg EGCG j = periode atau waktu pengamatan, yaitu = 0, 30, 60, 90, 120, 150 k = ulangan
Keseluruhan data yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk nilai rerata ±
standard error mean (rata-rata ± SEM). Sebelum dilakukan uji analisis statistik, dilakukan uji normalitas data dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk. Data kemudian dianalisis dengan menggunakan uji statistik repeated ANOVA (Analisis
of Variance) dan uji t-test untuk mengetahui signifikansi antar perlakuan. Bila terdapat perbedaan nyata antara perlakuan, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan uji lanjut Post-Hoc Test (Sidak-Holm).
