Mendelova Universita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství
Vliv činnosti kvasinek v silážích a možnosti jejich eliminace Bakalářská práce
Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc. Brno 2012
Vypracovala: Barbora Vaculíková
Mendelova univerzita v Brně Ústav výživy zvířat a pícninářství
Agronomická fakulta 2011/2012
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE
Autorka práce: Studijní program: Obor:
Barbora Vaculíková Zootechnika Zootechnika
Název tématu:
Vliv činnosti kvasinek v silážích a možnosti jejich eliminace
Rozsah práce:
30-40 stran
Zásady pro vypracování: 1. Sestavte osnovu pro zpracování literárního přehledu na uvedené téma 2. V literárním přehledu věnujte pozornost požadavkům, aktivitě a produktům metabolické aktivity kvasinek v silážích a jejich hodnocení 3. Zhodnoťe význam kvasinek z pohledu výroby siláží, zejména kukuřičných a travních 4. Věnujte zvláštní pozornost technologickým možnostem, včetně aplikace vhodných silážních aditiv, pro omezení činnosti kvasinek v silážovaných krmivech 5. Pozornost věnujte účinkům dieteticky méně vhodných produktů jejich činnosti na bachorový metabolismus skotu 6. Zpracujte jednotlivé kapitoly literárního přehledu a v závěru navrhněte metodické zásady pro provedení cíleného pokusu
Seznam odborné literatury: 1. LOUČKA, R. -- MACHAČOVÁ, E. -- ŽALMANOVÁ, V. Aditiva používaná k silážování. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 1997. 50 s. Metodiky pro zemědělskou praxi. ISBN 80-86153-16-9.2. 2. WILHELM, H. -- WURM, K. Futterkonservierung und -qualität : Silagebereitung, Heuwerbung, Getreide-, Maistrocknung. Graz: Leopold Stocker Verlag, 1999. 143 s. ISBN 3-7020-0845-4.3. 3. WILKINSON, J. M. Silage. 1. vyd. Lincoln: Chalcombe Publications, 2005. 254 s. ISBN 0-948617-50-0.4. 4. DOLEŽAL, P. -- ZEMAN, L. -- SKLÁDANKA, J. -- KALHOTKA, L. -NEDĚLNÍK, J. -- DVOŘÁČEK, J. Hygiena krmiv a zdravotní rizika. Zemědělec. 2009. sv. XVII, č. 9, s. 10--14. ISSN 1211-3816.5. 5. Kvasinky a kvasinkové mikroorganismy.. 6. POŠTULKA, R. -- DOLEŽAL, P. -- VYSKOČIL, I. -- SKLÁDANKA, J. -NEDĚLNÍK, J. -- MORAVCOVÁ, H. The influence of preserve by the preparate against European corn borer (OSTRINIA NUBILALIS)on the content of yeasts and moulds in the maize silage. In 14th International Symposium forage conservation. 1. vyd. Brno: Mendel University Brno, 2010, s. 192--194. ISBN 978-80-7375-386-3.7. 7. BARNETT, J. A. -- PAYNE, R. W. -- YARROW, D. Yeasts : characteristics and identification. 3. vyd. Cambridge, U.K.: Cambridge University Press, 2000. 1139 s. ISBN 978-0-521-57396-2.8. 8. FLEET, G. H. -- QUEROL, A. Yeasts in food and beverages. Berlin: Springer, 2006. 453 s. Yeast handbook . ISBN 3-540-28388-9 Datum zadání bakalářské práce:
listopad 2010
Termín odevzdání bakalářské práce:
duben 2012
Barbora Vaculíková Autorka práce
prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Vedoucí ústavu
prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc. Vedoucí práce
prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Vliv činnosti kvasinek v silážích a možnosti jejich eliminace vypracovala samostatně a použila jen parametrů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………
podpis ……………………………
PODĚKOVÁNÍ
Ráda bych na tomto místě poděkovala vedoucímu bakalářské práce prof. MVDr. Ing. Petru Doležalovi, CSc. za odborné vedení, při zpracovávání této bakalářské práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Ladislavu Jemelkovi, za poskytnuté materiály a také své rodině za podporu po celou dobu studia.
ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá literárním přehledem o vlivu činnosti kvasinek v silážích a možnostech jejich omezení. První část práce je zaměřena namorfologickou stavbu kvasinek a jejich metabolismus. Druhá část je věnována činnosti kvasinek v silážích a možnostem jejich technologického omezení, a to především faktorům v průběhu naskladňování silážované hmoty, včetně pravidel vybírání hotových siláží. Dále je věnována pozornost aplikaci vhodných silážních aditiv, která pozitivně ovlivňují fermentační procesy a zlepšují následnou stabilitu siláží. Jelikož je siláž v současné době základní složkou krmiva ve výživě zvířat, musíme výskytu kvasinek v silážích věnovat velkou pozornost, neboť jsou hlavními původci sekundární fermentace siláží. Takovéto siláže mají negativní vliv na zdravotní stav zvířat. Klíčová slova: kvasinky,metabolismus, siláž, aerobní stabilita, aditiva
ABSTRACT This bachelor thesis deals with literature review on the influence of yeast activity in the silages and possibilities of their limitation. The first part focuses on morphological structure and metabolism of yeast. The second part concerns with the activity of yeasts in silage and alternatives of their technological limitations, especially the factors during the forage stacking including the rules of collecting the finished silage. An attention is paid to the appropriate application of silage additives which has a positive influence on fermentation processes and the subsequent stability of silage. Since the silage is currently a basic ingredient for the animal nutrition purposes, we have to pay a close attention to the yeasts in silage. Yeasts are the main agents of the secondary fermentation of silage. Such silage has got negative effects on animal health.
Keywords: yeast, metabolism, silage, aerobic stability, additives
OBSAH 1
ÚVOD........................................................................................................................ 8
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................... 9 2.1
Silážování ........................................................................................................... 9
2.2
Kvasinky ............................................................................................................ 9
2.2.1
Morfologie kvasinek ................................................................................. 10
2.2.2
Růst a rozmnožování ................................................................................ 11
2.2.2.1 Voda ...................................................................................................... 12 2.2.2.2 Uhlík a dusík ......................................................................................... 13 2.2.2.3 Růstové látky......................................................................................... 13 2.2.2.4 Vliv teploty............................................................................................ 13 2.2.2.5 pH prostředí ........................................................................................... 14 2.2.3
Metabolismus kvasinek............................................................................. 14
2.2.3.1 Biokatalyzátory ..................................................................................... 14 2.2.3.2 Fosforylace ............................................................................................ 15 2.2.3.3 Dýchání ................................................................................................. 16 2.2.3.4 Fermentace ............................................................................................ 16 2.2.3.5 Vztah mezi dýcháním a fermentací ....................................................... 18 2.2.3.6 Metabolismus dusíku ............................................................................ 19 2.2.4 2.3
Nejčastější kvasinky vyskytující se v silážích .......................................... 20
Kvasinky a siláž ............................................................................................... 21
2.3.1
Mikroorganismy ve výchozím materiálu .................................................. 21
2.3.2
Kvasinky během silážování a aerobní stabilita ......................................... 23
2.3.3
Technologické možnosti ovlivnění výskytu kvasinek v silážích .............. 25
2.3.3.1 Plodina................................................................................................... 25 2.3.3.2 Nečistoty ............................................................................................... 26
2.3.3.3 Obsah sušiny ......................................................................................... 27 2.3.3.4 Struktura píce ........................................................................................ 28 2.3.3.5 Hodnota pH ........................................................................................... 28 2.3.3.6 Teplota................................................................................................... 29 2.3.3.7 Obsah sacharidů .................................................................................... 30 2.3.3.8 Rychlost naskladnění ............................................................................ 31 2.3.3.9 Dusání ................................................................................................... 31 2.3.3.10
Zakrytí ............................................................................................... 32
2.3.3.11
Doba skladování ................................................................................ 34
2.3.3.12
Způsob odběru ................................................................................... 34
2.3.4
Aditiva ...................................................................................................... 35
2.3.4.1 Biologická aditiva ................................................................................. 35 2.3.4.2 Chemická............................................................................................... 39
3
2.4
Hodnocení siláží ............................................................................................... 42
2.5
Kvasinky a zdravotní stav zvířat ...................................................................... 44
VLASTNÍ PRÁCE .................................................................................................. 46 3.1
Cíl práce ........................................................................................................... 46
3.2
Materiál a metodika (nástin pro experimentální část) ...................................... 46
4
ZÁVĚR .................................................................................................................... 47
5
POUŽITÁ LITERATURA ...................................................................................... 48
1 ÚVOD Konzervovaná objemná krmiva tvoří hlavní složku krmné dávky skotu po celý rok, proto je jejich kvalita velmi důležitá, a to nejen z ekonomického hlediska, protože jen od zdravého zvířete v dobré kondici, můžeme očekávat vysokou produkci. Silážovaná krmiva hrají velkou roli na výsledné hospodaření. Kvasinky jsou v přírodě velmi rozšířené mikroorganismy. Jsou schopné dobře přežívat nejen v silážích. V oblasti vědy, medicíny a potravinářského průmyslu jsou široce využívány, některé jsou příčinou onemocnění nejen zvířat, ale i lidí. Svou činností v silážích jsou zodpovědné za jejich kažení. Při zkrmování takto poškozené siláže dochází k zdravotním problémům zvířat. Proto je důležité věnovat se možné kontaminaci plodin již na poli, jelikož kvasinky se přirozeně na rostlinách v určitém množství vyskytují. Následná technologie sklizně pícnin určených k silážování je velmi důležitým faktorem, kterým ovlivňujeme výslednou kvalitu zesilážované hmoty. V současné době mají zemědělští pracovníci k dispozici širokou škálu silážních aditiv, avšak použití aditiv s cílem zlepšení výsledné kvality siláží, je ovlivněno mnoha faktory.
8
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Silážování Siláže jsou konzervovaná objemná krmiva, která se vyznačují nízkou hodnotou pH (3,6-5,0) vlivem vzniku organických kyselin, zejména kyseliny mléčné fermentací vodorozpustných sacharidů (ZEMAN, 2006). Silážování je technologický způsob konzervace krmiv založený na rychlém okyselení naskladněné, dobře pořezané a udusané hmoty za nepřístupu vzduchu, tedy za přísně anaerobních podmínek. Silážování umožní uchování krmných plodin při inaktivaci enzymových systémů samotné rostliny a při současném přerušení nežádoucí mikrobiální aktivity (DOLEŽAL a kol., 2010). Výroba siláží významně ovlivňuje ekonomiku chovu skotu na dlouhou dobu dopředu. Pro stabilitu siláží od vlastního procesu silážování jsou důležitá dvě kritická období. Jedná se o fermentaci siláže během skladování a období během odebírání siláží, kdy dochází k rozvoji kvasinek a plísní ( KRÁTKÝ, 2006). Uchování siláže je odvislé od nízké hodnoty pH, která je zapotřebí k potlačení klostridií a další škodlivé anaerobní mikroflóry a zajištění anaerobních podmínek bránící růstu aerobním mikroorganismům, jako jsou kvasinky a plísně (MUCK a SHINNERS, 2001). Pro výrobu krmiv s vysokou kvalitou je bezpodmínečně nutné zajistit snížení rizika vlivu počasí při polních operacích (vhodné sklizňové linky, používání vhodných konzervačních přípravků), zajistit bezpečnou a cíleně řízenou fermentaci, zabezpečit sila proti průniku vzduchu a mikrobiální nezávadnost krmiv, zvýšit aerobní stabilitu krmiv, zajistit vysokou nutriční hodnotu a zdravotní nezávadnost krmiv (DOLEŽAL a kol., 2009).
2.2 Kvasinky Podle JELÍNKA (2005), zařazujeme kvasinky do říše: Houby (Fungi), oddělení: Houby vřeckovýtrusné (Ascomycota). Část patří do třídy Endomycetes, tyto kvasinky se označují jako pravé. A nesporulující neboli anaskogenní kvasinky řadíme do třídy Deuteromycet – nepravé kvasinky (AMBROŽ, 1991). Kvasinky patří mezi mikroskopické houby (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Za kvasinky se ve všeobecnosti pokládají ty mikroorganismy, které tvoří spory ve vřeckách, tedy zástupci hub vřeckovýtrusných (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1957). Dle WILKINSONA, (2005) se jedná o eukaryotní, fakultativně anaerobní mikroorganismy. V siláži se 9
vyskytují především rody Candida, Hansenula, Saccharomyces a Torulopsis. Za anaerobních podmínek jsou původci alkoholového kvašení. Jsou to chemoheterotrofní mikroorganismy, které získávají energii oxidací organických sloučenin (ŠAFRÁNKOVÁ, 2002). Jejich výskyt je v přírodě velmi rozšířený, můžeme je nacházet v půdě, vodě, v trávicím traktu zvířat a lidí i na povrchu jejich těl (AMBROŽ, 1991; HRUBÝ a kol., 1984). 2.2.1 Morfologie kvasinek ŠAŠEK A BECKER (1969) uvádějí jako základní tvar kvasinek rotační elipsoid se dvěma možnými odchylkami, a to buď tvary kulaté, nebo podlouhlé až vláknité. Tvar kvasinek je velmi rozmanitý, charakteristický pro jednotlivé druhy a souvisí s jejich způsobem vegetativního rozmnožování (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Jedná se například o tvary vláknité, kulovité, vejcovité, citronovité, lahvovité a další. Kvasinky mohou měnit svůj tvar v závislosti na prostředí a na stadiu jejich vývoje. Jejich velikost je 1-100 mikrometrů (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky nedisponují orgány umožňující pohyb, tudíž nejsou schopny aktivního pohybu (AMBROŽ, 1991). Kolonie, které vytvářejí, mají povrch hladký, drsný nebo slizovitý s většinou krémovým zbarvením (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999).
Obr. 1. Kolonie kvasinek (PYROCHA a kol., 2006)
10
2.2.2 Růst a rozmnožování Za optimálních podmínek se mikroorganismy rozmnožují obrovskou rychlostí (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Růstem se rozumí zvětšování objemu buňky kvasinek a růstem kultury se rozumí zvětšování počtu kvasinek. Na růst a rozmnožování vyžadují kvasinky výživu, kterou přijímají z živného prostředí. Základními prvky výživy jsou voda, uhlík a dusík, kyslík, fosfor, hořčík, stopové prvky, vitamíny a růstové látky (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Kvasinky se rozmnožují se pomaleji než bakterie (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky se rozmnožují vegetativně a to pučením (JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999; FLEET, QUEROL, 2006), takto vytváří pseudomyselia s tvorbou blastospor. Některé
kvasinky
se
rozmnožují
dělením
s tvorbou
tzv.
pravého
mycelia
(ŠILHÁNKOVÁ, 2002). V případě, kdy se dostanou do nepříznivého prostředí, což je například prostředí chudé na cukry, minerální látky a nízká vlhkost prostředí, tvoří kvasinky spory. Tyto spory jsou uvnitř buněk a dochází k jejich přeměně na vřecka (AMBROŽ, 1991). Průběh růstu lze znázornit růstovou křivkou, která má charakteristický esovitý tvar (DEAK, 2008).
Obr. 2 Růstová křivka (DEAK, 2008) Růstová křivka má několik fází: I.
Lag–fáze, neboli přípravná fáze: Buňky se v této fázi připravují na budoucí množení, syntetizují nukleové kyseliny, ribozomy, enzymy. Dochází k zvětšování buňky. Čím jsou podmínky vhodnější, tím je lag fáze kratší (AMBROŽ, 1999; DEAK, 2008). 11
II.
Fáze zrychlujícího se růstu: Toto období je krátké, a představuje zrychlující se buněčnou syntézu a růst (DEAK, 2008; ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
III.
Exponenciální fáze růstu: V této fázi probíhá nejbujnější růst a rychlé množení buněk (DEAK, 2008; ASADUZZMAMAN, 2007). Charakteristická je nejkratší generační doba buněk, která je konstantní po celou dobu exponenciální fáze (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Hromadí se metabolity a buňky se zmenšují (AMBROŽ, 1999).
IV.
Fáze zpomalujícího se růstu: Postupně klesá přírůstek nových buněk, hromadí se metabolity, dochází k změnám pH a ubývání živin (AMBROŽ, 1999; KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982; VRANNÁ, 1986)
V.
Stacionární fáze růstu: Tato fáze se vyznačuje změnou fyziologických vlastností, například buňky vykazují zvýšenou odolnost k různým stresům (DEAK, 2008) a klesá metabolická aktivita (AMBROŽ, 1999). Po stacionární fázi následuje fáze odumírání buněk, kdy nastává jejich pomalá autolýza za současného hromadění metabolitů v prostředí. Čím víc v prostředí ubývá živin, tím víc se hromadí produkty metabolismu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2.2.2.1 Voda Prostředí pro růst musí být dostatečně vlhké, což je kolem 30%. Vázaná voda je důležitá pro strukturní funkci buňky, například pružnost buněčné stěny. Volná voda slouží jako transportní prostředek při látkové výměně, odvádí přebytečné teplo (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kvasinky jsou většinou mezofyly, v případě kdy je relativní vlhkost nižší než 98-97% dochází k snížení intenzity jejich růstu (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Buňka kvasinek přijímá kyslík, jen pokud jsou molekuly kyslíku rozpuštěné ve vodě. V tom případě tento kyslík buňka přijímá pro své oxidační procesy z tekutiny prostředí. Nedostatek vody může způsobit dysfunkce, kdy se buňka dostane do stavu klidu a po přijetí dostatečného množství vody se buňka dostává zpět do fyziologického stavu (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Minimální aktivita vody kvasinek je nižší než u většiny bakterií, pohybuje se v rozmezí 0,91 až 0,88 (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
12
2.2.2.2 Uhlík a dusík Kvasinky jsou chemoheterotrofní organismy, přijímající uhlík a dusík nejčastěji ve formě organických sloučenin. Zdrojem uhlíku jsou například: polyoly, alkoholy, organické kyseliny a aminokyseliny, které mohou podporovat jejich růst, ale přednostně metabolizují sacharidy (RODRIGUES et al., 2006), které využívají oxidačním i neoxidačním způsobem. K základním sacharidům patří hexózy, D-glukóza, D-fruktóza a D-manóza. Druhy rodu Candida využívají D-xylózu, L-arabinózu a další. Zdrojem uhlíku jsou pro kvasinky organické sloučeniny. Z anorganických solí jsou uvolňovány silné anorganické kyseliny, které mění hladinu pH a působí inhibičně. Využitelnost KNO3 je důležitým taxonomickým znakem. Rod Hansenula se liší od rodu Pichia tím, že využívá KNO3 jako jediný zdroj dusíku (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). 2.2.2.3 Růstové látky K růstovým látkám patří m-inositol, biotin, β-alanin a leucin, tiamin, pyridoxin, aminokyseliny, mastné kyseliny. Z vitamínů jsou to hlavně vitamíny skupiny B, a to minositol, kyselina pantotenová, biotin, tiamin, pyridoxin, niacin. Pro kvasinky nejsou tyto látky zdrojem energie, ale jsou důležité pro jejich biosyntézu (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). 2.2.2.4 Vliv teploty Teplota
významně
ovlivňuje
rychlost
růstu
a
množení
mikroorganismů
(ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Optimální teplota pro rozmnožování většiny kvasinek je 25 až 28 °C. Nejnižší teplota potřebná pro růst je 4 až 5 °C a nejvyšší 40°C. V případě zvýšení nebo snížení teploty mimo optimum, dochází ke zpomalení rozmnožování a po překročení určité hranice nastává smrt (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Za vysokých teplot dochází k denaturaci enzymů potřebných k růstu. Tato denaturace je zpočátku reversibilní. Krátkodobé zvýšení teploty nad maximální hodnotu, vede k teplotnímu šoku a k různým výkyvům metabolismu. Spory kvasinek a plísní se nevyznačují velkou odolností vůči působení vysokých teplot, k jejich usmrcení zpravidla dochází při působení teplot 60-70 °C po dobu 10 minut. Optimální teplota pro rozmnožování nemusí být vždy shodná s optimální teplotou pro ostatní životní procesy buňky (ŠILHÁNKOVÁ, 2002).
13
2.2.2.5 pH prostředí Kvasinky pro růst vyžadují optimálně kyselé prostředí v rozmezí pH 4,2 - 5,5. (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; DEAK, 2008). Jsou však velice tolerantní k hodnotám pH (DEAK, 2008). Čím je odchylka od optimální hodnoty pH větší, tím je jejich odolnost k vysokým teplotám nižší (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2.2.3 Metabolismus kvasinek Látková přeměna, se odehrává v buňkách kvasinek a jejich činností i v prostředí, kde rostou a rozmnožují se (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). K této výměně látek slouží cytoplazmatická membrána, přenos živin je enzymatického charakteru, což znamená, že je substrátově specifický a může být indukován (AMBROŽ, 1991). Metabolismus může směřovat k: biosyntéze látek neboli anabolismu – asimilační proces, na jehož realizaci potřebuje buňka energii. Nebo směřuje k rozkladu látek, degradaci neboli katabolismu – disimilační proces, při tomto procesu naopak buňka energii uvolňuje (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; FELDMANN, 2005). Katabolismus je regulován především hladinou ATP a NADH v buňce, anabolismus je řízen především množstvím produktů jeho drah (VONDRÁŽKA, 1999). Katabolismus a anabolismus probíhají odděleně v různých částech buňky (ZEHNÁLEK, 2009; VONDRÁŽKA, 1999). Energie uvolněná při katabolismu se může využít na uskutečnění anabolického procesu, avšak energie uvolněná z katabolického procesu se nikdy zcela nespotřebuje při asimilačním procesu a uvolní se ve formě tepla do prostředí. Z celkové volné energie se
použije
na
biosyntetické
procesy
v buňce
okolo
29
%
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Vysoká intenzita metabolismu mikroorganismů je významně ovlivněna zejména vnějšími podmínkami. Dostatečný přísun živin, vhodná teplota a hodnota pH prostředí vede k intenzivnímu metabolizmu a rychlé syntéze buněčné hmoty. Ta se za optimálních podmínek u Candida utilis až zdvojnásobí zhruba za 2 hodiny (VODRÁŽKA, 2006). Obsah sacharidů a dostupnost kyslíku jsou hlavními podmínkami prostředí, mající velký vliv na metabolismus kvasinek (RODRIGUES et al., 2006). 2.2.3.1 Biokatalyzátory Většina reakcí obou metabolismů potřebuje na své uskutečnění biokatalyzátory, enzymy zajišťující potřebnou energii, aby mohla být reakce uskutečněna. Aktivita enzymů je ovlivněna řadou faktorů, jako je hodnota pH, teplota, koncentrace a složení 14
substrátu, redoxní potenciál a další. Některé faktory účinek enzymů zvyšují – aktivátory, a naopak látky brzdící aktivitu enzymů nazýváme inhibitory (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Oxidoreduktázy: Katalyzují intermolekulové oxidačně redukční přeměny. Oxidační děje realizují přenosem atomů vodíku, elektronů nebo vestavěním atomu kyslíku do substrátu – oxygenázy. Alkoholdehydrogenáza, laktátdehydrogenáza, glukosaoxidáza: beta glukóza, citochrom c-oxidáza, kataláza, peroxidáza (VONDRÁŽKA, 1999). Kofaktory oxidoreduktáz jsou např.: NAD+, NADH+, flavinadenindinukleotid a další (ZEHNÁLEK, 2009). Transferázy: Přenášející skupiny -CH3, NH2, zbytek glukózy a pod. v aktivované formě
z jejich
donoru
na
akceptor.
Acetyl-CoA-acetyltransferáza,
alaninaminotransferáza, hexokináza, DNA- řízená RNA- polymeráza, DNA-řízená DNA polymeráza. Hydrolázy: Hydrolyticky štěpí vazby, které vznikly kondenzací, např. peptidové, glykosidové, esterové. Glukoza-6-fosfatáza, rybonukleáza, Α-amyláza, lysozym, karboxypeptidaza A, tripsin, adenosintrifosfatáza. Lyázy: Katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik vazeb C-C, C-O, C-N, tak, že odštěpují ze substrátu nebo do něj vnášejí malé molekuly (H2O, CO2, HN3,) bez pomoci dalšího reaktantu. Fruktóza-bisfosfátaldolaza, karbonátdehydratáza, fumaráthydratáza, l- serindehydratáza. Isomerázy: Zprostředkovávají vnitromolekulové přesuny atomů a jejich skupin, tedy vzájemné přeměny isomerů. Triosafosfátisomeráza. Ligázy: Katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu látky
uvolňující
energii.
Alanyl
–
tRNA-syntetáza,
pyruvátkarboxyláza,
polynukleotidsyntetáza, (VONDRÁŽKA, 1999) 2.2.3.2 Fosforylace Vázání kyseliny fosforečné na organické látky probíhá pomocí dvou skupin fosforylačních enzymů. Jsou to kinázy a fosfatázy, druhou skupinou jsou fosforylázy. Průběh fosforylace dělíme na dvě části: 1. Fosforylační pochody od esterifikace po rozložení hexózy na dvě triózy: Fosforylace glukózy s následným vznikem esteru D-glukosa-6-fosfát, který slouží jako výchozí látka pro anabolické a katabolické pochody, což je syntéza sacharidů až tvorba
15
polysacharidů. Nebo dochází ke vzniku kyseliny 6-fosfoglukonové, s následným vznikem pentóz s navázanými organickými sloučeninami. 2.
Fosforylační pochody přeměny trióz po vznik pyrohroznové kyseliny:
Probíhají oxidačně redukční procesy. A to defosforylace kyseliny 1,3-difosfoglycerové až po vznik kyseliny pyrohroznové (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1957). 2.2.3.3 Dýchání Dýchání neboli respirace je proces, kdy dochází k uvolňování energie při reakcích, při přenášení elektronů (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Donory vodíku jsou organické molekuly a kyslík je konečným akceptorem (AMBROŽ, 1991). Vzhledem k celkovému efektu se jedná o velmi výhodný proces, neboť aerobně metabolizující kvasinky oxidují glukózu až na oxid uhličitý a vodu. Při úplné oxidaci se uvolní 2881 kJ. Při anaerobní přeměně glukózy na etanol a oxid uhličitý je to jen 3 až 5% ATP získaného biologickou oxidací (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982; AMBROŽ, 1991). Dýchací řetězec se skládá z několika systémů, které se účastní přenosu elektronů a vodíku. Přenašeči mimo NAD+ jsou také flavoproteiny, chinony a cytochromy (AMBROŽ, 1991). Řetězec získává vodík z NADH2 tak, že NAD+ přijal tento vodík ze substrátu, např. z izocitrátu. Poté následují oxidačně redukční procesy a nakonec se vodík váže na molekulový kyslík, nebo na jiný akceptor vodíku (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Největší část energie se ukládá do ATP jako biologicky zužitkovatelná energie a pouze malá část se uvolňuje ve formě tepla (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2.2.3.4 Fermentace Disimilační procesy mohou probíhat i jinak než formou respirace. Probíhají za nepřístupu vzduchu (anaerobně) a označují se kvašení neboli fermentace (JELÍNEK a kol., 2005). Dochází k přeměně sacharidů na etanol a oxid uhličitý (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Sacharidy jsou za anaerobních podmínek odbourávány v metabolických drahách na něž navazují jednotlivá kvašení (AMBROŽ, 1991). Samotnému kvašení předchází substrátová fosforylace až po vznik kyseliny pyrohroznové.
Poté
nastupuje
enzym
pyruvátdekarboxyláza.
Koenzymem
pyruvátdekarboxylázy je tiaminpyrofosfát (TTP). Fosforylace je využívána na výstavbu tohoto
koenzymu,
kterou
zajišťuje
ATP 16
katalyzující
reakci
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Dekarboxylací kyseliny pyrohroznové, které se účastní TTP, dochází k produkci fermentačních prodůktů, a to je: acetaldehyd, kyselina octová, kyselina mléčná a mravenčí, dikarboxylové kyseliny, kyselina citronová, kyselina acetoctová,
aceton,
CO2,
H2O,
molekulový
vodík
apod.
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1982; JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999). Jednoduchá dekarboxylace kyseliny pyrohroznové tvoří hlavní směr metabolismu sacharidů. Kyselina pyrohroznová je dekarboxylována na acetyldehyd, jenž je akceptorem aktivovaného vodíku a tímto je redukován na etanol. Výsledkem jsou 2 moly etanolu a 2 moly CO2 (AMBROŽ, 1991; ŠILHÁNKOVÁ, 2002; FELDMANN, 2005; DEAK, 2008).
Obr. 3. Alkoholové kvašení. (ANONYM, 2008) Produkce glycerolu Glycerol je jedním z nejdůležitějších vedlejších produktů kvašení (DEAK, 2008). Difosforečný ester fruktózy je rozkládán na dvě triózy: dihydroxyacetonfosfát a glyceraldehyd-3-fosfát,
mezi
nimiž
je
Z dihydroxyacetonfosfátu
vzniká
2-fosfoglycerát
udržován a
asi
rovnovážný 2
až
3%
stav.
glycerolu
z fermentovaného cukru. Vedlejšími produkty kvašení jsou například: akrolein, trimethylenglykol, manitol. (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Kvašení oligosacharidů Nejprve musí dojít k jejich rozkladu na monosacharidy katalytickým působením enzymů, jakož jsou maltázy, α-D-fruktozodázy, α-glukozidázy a invertázy. Některé druhy kvasinek sacharózu nezkvašují, jsou to například Pichia a Candida, a jen 3% ze všech
druhů
kvasí
celobiózu,
kam
KRATOCHVÍLOVÁ, 1982).
17
patří
rod
Candida
(KOCKOVÁ-
U většiny kvasinek je zjištěna neschopnost fermentovat různé disacharidy, i přesto že disacharidy jsou utilizovány a vzniklé monosacharidy fermentovány. Tomuto jevu říkáme Kluyverovův efekt. Jednou z příčin může být, že za semiaerobních podmínek jsou disacharidy do buňky přenášeny usnadněnou difúzí, což je pomalé a jejich koncentrace v buňce je v tom případě nízká. Glykosidázy, které je hydrolyzují, mají k nim nízkou afinitu. Výsledkem je pomalý průběh glykolýzy a výsledkem je nesprávné tvrzení o neschopnosti kvasinek ke kvašení (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). 2.2.3.5 Vztah mezi dýcháním a fermentací Proces dýchání a kvašení se vzájemně prolíná (VONDRÁŽKA, 1999). Z termodynamického hlediska je důležité, zda buňka zpracovává sacharid oxidačně nebo anoxidačně. Čím je vyšší spalné teplo látek vznikajících při těchto procesech, tím méně se uvolní energie pro buňku. Oxidace glukózy dýcháním probíhá dle následující rovnice: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2,82 MJ Štěpení glukózy fermentací na etanol: C6H12O6 → 2CH3CH2OH +2CO2 +0,092MJ Štěpení glukózy na kyselinu mléčnou: C6H12O6 → 2CH3CH2OHCOOH + 0,094MJ V anaerobních podmínkách se vytvoří 2 molekuly ATP na 1 mol zkvašené glukózy, v aerobních podmínkách se vytvoří 28 molekul ATP oxidované glukózy (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Dýchání a kvašení probíhá u některých kvasinek stejnoměrně, ale u jiných může jeden pochod převládat. Pasteur pozoroval, že v přítomnosti kyslíku kvasinky silně omezují kvašení. Oxidace jedné molekuly sacharidu chrání 4 až 6 molekul sacharidu před zkvašením. Prakticky se to projeví tak, že v určitých podmínkách zkvasí kultura kvasinek všechen sacharid za 54 hod., při provzdušňování až za 60 hodin (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Jev, kdy kvasinky při přechodu z anaerobního do aerobního prostředí se vlivem kyslíku omezuje kvašení, nazývá Pasteurův efekt (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Pasteurův efekt může být narušen enzymovými jedy, jimiž je například 2,4 dinitrofenol. Za jeho přítomnosti zkvašují kvasinky hexózy na etanol i za aerobních podmínek (AMBROŽ, 1991). Glukóza působí takto v případě, že je její přítomnost v živném prostředí vyšší než 0,3%. Podobně mohou působit i jiné sacharidy (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). 18
Vnější vlivy na dýchání a kvašení Způsob metabolismu závisí na druhu kultury a také na vnějších podmínkách. Směrem k alkalickému prostředí probíhá dýchání intenzivněji a naopak ke kyselé hodnotě pH je intenzivnější zase proces kvašení. Oxidační děj bývá přímo úměrný koncentraci metabolizující hmoty jen v určitém úseku. Při vyšší koncentraci kvasinek oxidační
procesy
klesají
na
úkor
procesů
fermentačních
(KOCKOVÁ-
KRATOCHVÍLOVÁ, 1982).
Obr. 3. Metabolismus kvasinek za aerobních a anaerobních podmínek (FELDMANN, 2005). 2.2.3.6 Metabolismus dusíku Do buněk kvasinek difundují pouze jednodušší složky. Nejsnadněji kvasinky využívají amonné ionty a aminokyseliny, nejvíce pak kyselinu glutamovou a glutamin (JANDEROVÁ, BENDOVÁ, 1999). V případě nedostatku dusíku v prostředí dochází k narušení celkového metabolismu, ale oxidaci sacharidů to ovlivní méně než fermentace. Glykolýza se zastaví, jakmile nastane přeměna fosforylované triózy katalytickým účinkem dehydrogenázy, kdy respirace pokračuje dále. Respirace pokračuje cestou přeměny glyceraldehydu-6 fosfátu (G-6-P) na kyselinu 6-fosfoglukonovou. Dále se zjistilo, že nedostatek dusíku podporuje tvorbu acetyl-CoA a mastných kyselin, následkem čehož se zvýší tvorba tuků (KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Aminokyseliny jsou do buňky transportovány aktivně, zatímco dusičnany, případně dusitany utilizují například rody Hansenula a Candida (JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999).
19
2.2.4
Nejčastější kvasinky vyskytující se v silážích
Rod Candida Tento rod kvasinek je považován za nejrozsáhlejší. Zástupci jsou jedinci se silnými fermentačními účinky, ale i druhy nekvasící (JANDROVÁ a BENDOVÁ; 1999 ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Kolonie těchto kvasinek se vyznačují porcelánově bílým, krémovým nebo žlutavým zbarvením (BARNETT, 2000). Jsou plochého nebo vyklenutého tvaru směrem do středu se zvyšující, mohou být také nepravidelné, morušovité nebo deformované. Jejich okraj může být rovný, nebo nepravidelně vláknitý, taktéž vykusovaný. Můžeme pozorovat lesklý, matný, hladký, drsný povrch. Při mikroskopickém vyšetření pozorujeme na větveném pseudomyceliu blastospory uspořádané do řetízků (FRÁGNER, 1967). Zkvašují glukosu, celobiosu, laktosu, škrob, hemicelulosum
pektin,
inulin,
xylosu
(BARNETT,
2000),
utilizují
dusitany
(JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999). Rod Torulopsis Kolonie jsou zbarveny do běla, žluta nebo hněda, polomatné, lesklé či hlenovité, ploché nebo vyklenuté, nebo uprostřed vyvýšené. Jsou hladké, nebo s radiální kresbou a okraj je rovný nebo laločnatý (FRÁGNER, 1967). Zkvašuje laktosu (BARNET, 2000). Rod Saccharomyces Tento
rod
je
považován
za
nejznámější
a
nejdůležitější
z kvasinek
(ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Jedná se o saprofyty (FRÁGNER, 1967), rozmnožují se pučením, buňky mají kulovitý, elipsoidní nebo cylindrický tvar (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1982). Zkvašující glukosu, sacharosu a maltosu, dusičnany nejsou asimilovány (BARNETT, 2000). Laktosa není využívána jako zdroj uhlíku (ŠILHÁNKOVÁ, 2000). Rod Hansenula Jedná se o kulaté, protáhlé nebo oválné buňky vytvářející pseudomycelium. Rozmnožují se pučením (FRÁGNER, 1967). Utilizující nitráty (JANDEROVÁ a BENDOVÁ, 1999), fermentuje glukosu a asimiluje sacharosu, maltosu, laktosu, tvoří kyseliny a estery (BARNETT, 2000).
20
2.3 Kvasinky a siláž 2.3.1 Mikroorganismy ve výchozím materiálu Mikroorganismy hrají v konzervačním procesu silážování píce klíčovou roli. Mikroflóra siláže se tradičně dělí na dvě skupiny: žádoucí (prospěšná) a nežádoucí mikroflóra. První skupinu zahrnují bakterie mléčného kvašení (BMK). Do druhé pak patří bakterie účastnící se kažení siláže za anaerobních podmínek (klostridie a enterobakterie), nebo aerobních podmínek jako jsou kvasinky, plísně a
listerie
(DRIEHUIS a ELFERINK, 2000). Aktivita mikroorganismů nejen v silážích výrazně ovlivňuje kvalitu krmiv a je významným faktorem představující zdravotní riziko (DOLEŽAL a kol., 2009). Silážní hmota je ovlivňována nejen samotnou kvalitou silážovaných plodin a kvalitou epifytní mikroflóry (MIČAN, 2010), při sklizni plodin se do siláže dostává velké množství populací mikroorganismů. Zastoupení těchto populací silně kolísá v závislosti na ročním období, povětrnostních podmínkách, stanovišti, druhu pícniny, stupni znečištění, době a způsobu zavadání apod. (CONAGHAN, 2010; DOLEŽAL a kol., 2009; JAKOBE a kol., 1987; KUNG, 2001). Žádoucí bakterie mléčného kvašení jsou v této mikroflóře zastoupeny jen malém množství (DOLEŽAL a kol., 2010; JAKOBE a kol., 1987; KUNG, 2001; BOLSEN, 1993). Na jeden žádoucí zárodek odpovídá 50 000 nežádoucích (JAKOBE, 1987). Tab. 1. Počet mikroorganismů v 1g krmiva (SHMIDT, WETTERAU, 1974), upraveno Mléčné
Druh krmiva
kvasinky
bakterie Pastevní porost čerstvý
10
1100
Pastevní porost zavadlý a pomoklý
300
500
Vojtěška čerstvá
10
4000
Vojtěška zavadlá
1000
48000
Kukuřice
100000
200
Z údajů uvedených v tabulce vyplývá, že většinou podmínky na počátku kvasných procesů v silážované píci jsou nepříznivé, až na silážní kukuřici. U většiny pícnin je zastoupení mléčných bakterií nízké, a proto je nutné využívat veškerá opatření a
21
možnosti podporující rychlý rozvoj těchto bakterií (JAKOBE a kol., 1987 ; SHMIDT, WETTERAU, 1974; WILKINSON, 2005; OUDE ELFERINK et al., 1999). MIČAN (2010) uvádí rozdílné zastoupení mikroorganismů na vertikální ose rostlin i ve vztahu k vegetační zralosti. Výskyt sporulujících mikroorganismů, enterobakterií a kvasinek je nejvyšší v nadzemní, případně střední části plodin. Zatímco výskyt mléčných bakterií je soustředěn převážně na střední a vrcholovou část. V souvislosti s vlhkým klimatem dochází k zvyšování počtu enterobakterií a kvasinek v nadzemní části rostlin a celkový počet laktacidoprodukčních bakterií naopak klesá. V porovnání s bakteriemi mléčného kvašení do silážované hmoty dostává mnohem větší množství kvasinek (JAKOBE a kol., 1987; DOLEŽAL a kol., 2010; SHMIDT, WETTERAU, 1974). Kvasinky konkurují mléčným bakteriím, neboť mají obdobné nároky (JAKOBE a kol., 1987; DOLEŽAL a kol., 2010; SHMIDT, WETTERAU, 1974;. FLEET, QUEROL, 2006). Epifytní mikroflóra je klíčová v silážování, neboť ovlivňuje průběh vlastního fermentačního procesu, a také má vliv na následnou skladovatelnost a kvalitu výsledné siláže (DOLEŽAL a kol., 2010; OUDE ELFERINK et al., 1999). Počáteční epifytní mikroflóra je u kukuřice zastoupena ve větším množství než u trav. U silážní kukuřice při sušině 30% je uváděno průměrné množství epifytní mikroflóry 2,3*105 na jeden gram kukuřice a u CCM až 6,7*105 na jeden gram. Pro usměrnění fermentačního procesu je důležité zajistit, aby bakterie mléčného kvašení co nejrychleji převládaly nad epifytní mikroflórou (DOLEŽAL a kol., 2010). Z výsledku dlouhodobého sledování epifytní mikroflóry vyplývá klesající tendence výskytu mikroflóry na plodinách, což platí i pro zastoupení druhově pozitivních mikroorganismů pro průběh silážování, které jsou nahrazovány nežádoucími mikroorganismy. Toto může být důsledkem těžké mechanizace, používáním hnojiv a chemických látek na ochranu rostlin. (MIČAN, 2010). Kvasinky jsou také zodpovědné za tvorbu alkoholu v silážích. Rody Candida a Hansenula produkují alkohol za přítomnosti vzduchu. Rody Saccharomyces a Torulopsis dokáží produkovat alkohol i za nepřítomnosti vzduchu (PŘIKRYL, 2011). V souvislosti s nárůstem nežádoucí mikroflóry pícnin dochází k zvyšování obsahu alkoholu v silážích (PŘIKRYL, 2011).
22
2.3.2 Kvasinky během silážování a aerobní stabilita Jako stabilní siláže označujeme siláže odolné změnám, které vznikají v průběhu skladování a při vyskladňování působením přístupného vzduchu. Kyselina mléčná se odbourává již v anaerobním prostředí a kvalita siláže se postupně snižuje. Sekundární fermentace má rychlý průběh, a neboť významně ovlivňuje dobu skladovatelnosti, nesmíme ji podceňovat (JAKOBE a kol., 1987). Produkty primárního kvašení jsou vhodnými substráty pro růst mikroorganismů, jako například kyselina mléčná, která je metabolizována kvasinkami (WILKINSON, 2005). Aktivita kvasinek může být problematická, zejména v případě nedodržení technologických požadavků sklizně, konzervace a skladování. Kvasinky nejsou přímo odpovědné za přeměnu nutričně a hygienicky významných látek, ale jejich zvýšená činnost je vždy spojena s aerobní nestabilitou siláží po otevření sil a vysokými ztrátami živin při a zkrmování siláží (ZEMAN, 2006; DOLEŽAL a kol., 2009) V aerobní fázi během navážení hmoty dochází k respiraci u rostlin, avšak počty kvasinek a dalších aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů mohou dosáhnout takového počtu, že se stanou významnými zdroji respirace (BOLSEN, 1993; OUDE ELFERINK et al., 1999). Respiraci rostlinou nebo mikrobiální lze minimalizovat rychlým omezením přístupu vzduchu (MUCK a SHINNERS, 2001). Kvasinky mají v počáteční fázi i pozitivní funkci, kdy se podílejí na urychlení spotřeby kyslíku v silážované hmotě a tím i na vytvoření anaerobního prostředí (JAKOBE a kol., 1987). Během fermentační fáze za anaerobních podmínek jsou schopny růst různé skupiny mikroorganismů (bakterie mléčného kvašení, enterobakterie, klostridie a kvasinky) (DRIHERIUS et al., 1999). Kvasinky fermentují vodorozpustné sacharidy na etanol a oxid uhličitý za současného snížení obsahu energie kolem 0,2 % v závislosti na obsahu sušiny siláže (DOLEŽAL a kol, 2010), některé kvasinky oxidují vzniklou kyselinu mléčnou, což způsobuje zvýšení hodnoty pH siláže. Následkem je růst mnoha jiných organismů přispívajících ke kažení (WOOLFORD, 1990). Současně jsou také redukovány aromatické látky. Při masivním pomnožení kvasinek stoupá riziko vzniku samozáhřevu s následnou destabilizací siláží, přičemž zkrmování nestabilních siláží může zapříčinit výrazné průjmy u skotu (DOLEŽAL a kol., 2010). V případě překročení počtu populace kvasinek 107 -108 CFU/g, nebo plísní 106 – 107 CFU/g dochází k zahřívání siláží (ZEMAN, 2006; BOLSEN 1993). Alkoholové kvašení není pro silážování vhodné, neboť alkohol nezajistí konzervační efekt (KOPŘIVA, 1992) a 23
nevzniká dostatečné množství kvasných kyselin, zároveň dochází k větším ztrátám uhlíku (RADA A VLKOVÁ (2010)
cit. Podle DRIEHUIS a ELFERINK, 2000).
Aktivita kvasinek je postupně potlačována rostoucí koncentrací kyseliny octové a mléčné (PILTZ a KAISER, 2004). Ve fázi stabilní siláže se počet životaschopných mikroorganismů snižuje, kvasinky přežívají toto období v téměř neaktivním stavu, jiné mikroorganismy jako jsou enterobakterie a klostridií tvoří spory Některé mikroorganismy, jako například Lactobacillus buchneri zůstávají aktivní i při nízké hodnotě pH (DRIHERIUS et al., 1999; OUDE ELFERINK et al., 1999). V případě, že dochází k pronikání kyslíku do sila, dochází k růstu kvasinek a plísní, teplota silážované hmoty stoupá a dochází ke ztrátám sušiny. Výsledkem je snížení stravitelnosti živin za současného zvýšení obsahu vlákniny (BOLSEN, 1993) V případě, že celý proces silážování proběhne optimálně, proběhne jen tzv. primární kvašení, pH poklesne na hodnotu 4,0-4,2, vytvoří se kolem 1,7 % kyseliny mléčné, 0,7 % kyseliny octové a 0,3 % kyseliny máselné (WILKINSON, 2005). Stabilní siláž je dlouhodobě skladovatelná, a to nejméně 3-4 měsíce (RADA, 2009). WEISSBACH, (1993) předpokládal, že v budoucnu bude kvalita fermentace a hygienický stav siláže stane ještě důležitější. Aerobní stabilita je v současné době považována jako jeden z největších problémů siláží (GALLO, 2007). Pokud neproběhne důkladné primární kvašení, například při nevhodné skladbě mikroflóry, dochází k sekundárnímu kvašení. Při sekundárním kvašení dochází ke zvýšení pH, neboť nastává fermentace kyseliny mléčné či octové na kyselinu máselnou, která vykazuje nižší kyselost. Jsou také rozkládány aminokyseliny a bílkoviny za vzniku amoniaku, amidů a aminů (RADA, 2009; WOLFORD 1990). Po otevření sila: Pravé kvasinky (rod Saccharomyces, Hansenula) i nepravé kvasinky (Torulopsis, Candida), patří k hlavním původcům následné fermentace siláží po jejich otevření. Má-li v průběhu silážovacího procesu přístup vzduch, dochází k rozvoji jiných populací kvasinek. Jde o kvasinky metabolizující kyseliny (Candida, Hansenula, Pichia a Endomycopsis), zatímco kvasinky rodů Torulopsis fermentují přednostně cukry (WOOLFORD, 1990). Teploty siláží jsou po otevření sila ještě určitou dobu stabilní, avšak poté se zvyšují geometrickou řadou (LOUČKA, 1993) Po otevření silážního žlabu dojde k nastartování aerobní fermentace. V případě, že je v siláži obsažen zbytkový cukr, dojde nejprve k aktivaci mléčných bakterií, protože jsou mikroaerofilní a na počátku nemají 24
konkurenci. Počet kvasinek se ale velmi rychle zvyšuje (KOPŘIVA a kol., 1999). Kvasinky jsou velmi tolerantní vůči nízkým hodnotám pH a jsou schopné přetrvávat v latentním stavu ve skladovací anaerobní fázi v uzavřených silech (DOLEŽAL A DVOŘÁČEK, 2000; ), podmínky pro kvasinky v siláži jsou zpravidla vždy příznivé (KOPŘIVA, 1992). V případě překročení kritické hodnoty zárodků kvasinek, dochází k rychlému vývoji kvasinek, a po otevření sila způsobují intenzivním dýcháním rychlé zvýšení teploty. Rychle a přednostně využívají zásoby reziduálních sacharidů za současného vzniku alkoholu, současně odbourávají vzniklou kyselinu mléčnou na vodu a oxid uhličitý (DOLEŽAL a DVOŘÁČEK, 2000), se vzrůstající hodnotou pH připravují substrát pro kažení siláže dalšími mikroorganismy RADA a VLKOVÁ (2010) cit. podle DRIEHUIS a ELFERINK (2000) a tím siláže destabilizují (DOLEŽAL a DVOŘÁČEK, 2000). Změny v počtu mikroorganismů v siláži se projeví nejprve u kvasinek a až poté následují změny jiných mikroorganismů (KOPŘIVA, 1992). 2.3.3 Technologické možnosti ovlivnění výskytu kvasinek v silážích I přesto, že sklízecí technika a nabízené konzervační přípravky jsou srovnatelné se zahraničím, nedosahuje kvalita objemných krmiv v mnoha podnicích požadovaných kvalit. Tyto problémy se vyskytují nejčastěji na jaře a v létě. Tehdy je siláž často narušena aerobní sekundární fermentací (ILLEK, 2004). Ztráty v důsledku aerobního kažení siláží v důsledku nedostatečného uzavření sil, aerobního narušení během krmení při vysokých teplotách okolí a další, mohou být dosti značné (WILKINSON, 2005). 2.3.3.1 Plodina Silážovatelnost pícnin je rozdílná dle druhu pícniny v závislosti na rozdílném chemickém složení (JAKOBE a kol., 1987; KUNG, 2001). Dělí se na lehce, středně a těžce silážovatelné (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996). Bílkovinné pícniny, obsahující nedostatek zkvasitelných cukrů a vysoký obsah dusíkatých látek, patří k těžko silážovatelným pícninám pro nedostačující pokles pH hodnoty. Zhoršená silážovatelnost je také způsobena pufrovací schopností bílkovin a alkalických produktů (JAKOBE a kol., 1987; KUNG, 2001). Kukuřice se řadí k snadno silážovatelným pícninám. Ovšem podmínkou je sklizeň při vhodné fázi zralosti (JAKOBE a kol., 1987). Platí zásada, raději část kukuřice začít 25
sklízet při obsahu sušiny 28 %, aby na konci sklizně obsah sušiny nepřesahoval 35 %. V případě vyšší sušiny nepřibývá v kukuřici obsah škrobu, jen narůstá obsah vlákniny a obsah cukru se snižuje (PŘIKRYL, 2005). Při silážování celých rostlin je klíčové zlepšení aerobní stability, díky relativně vysokému obsahu živin, je velmi často aerobní stabilita zhoršována v důsledku činnosti kvasinek (ARAGÓN et al., 2010). Všeobecně u sacharidových siláží je větší riziko vzniku aerobní fermentace (ILLEK, 2006; SCHÖNDORFER et al., 2010), a to i z důvodu dlouhého období růstu, a tudíž vysokou přírodní kontaminací plísní a kvasinek (SCHÖNDORFER et al., 2010). Při silážování kukuřice dochází k vysoké tvorbě kyseliny mléčné s nízkým poměrem octové kyseliny. Kyselina octová je důležitým prvkem v boji proti kvasinkám. Proto je tvorba kyseliny octové posuzována novým způsobem. Při koncentraci této kyseliny okolo 0,5 - 1% dochází k zvýšené aerobní stabilitě (MATHIES, HOLGER, 2009). 2.3.3.2 Nečistoty Znečištěním píce se nepříznivě ovlivňuje průběh kvasných procesů, kdy je obsah kyseliny mléčné podstatně nižší než v siláži neznečištěné (WILHELM, WURM, 1999). Znečišťujícími příměsi mohou být prach, zemina, popílek, hnůj, hydraulické a převodové oleje a pod. (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996). Znečištění je ovlivněno počasím, způsobem sklizně a organizací práce (SHMIDT, WETTERAU, 1974; WILHELM, WURM, 1999). Díky pufrujícímu účinku omezují částečky půdy rychlé okyselení siláže. Obsah energie v siláži se s každým procentem podílu písku snižuje o cca 0,1MJ NEL na 1kg sušiny (MAHTIES, 2002). Podíl nečistot by měl činit méně než 3% v sušině. Zvláště pak při sečení, obracení, a shrnování hmoty musí být optimálně seřízen stroj, jen tak se do silážované hmoty nedostanou znečišťující částice (MAHTIES, 2002). Strniště po zesečení se nechává minimálně 6-8 cm vysoké (KRÁTKÝ, 1998). Důkladné vyčištění sila před naskladňováním je nezbytným předpokladem pro správný průběh fermentace siláže, proto je nutné odstranit ze silážního prostoru staré zbytky siláže, a také zabezpečit čistotu okolí žlabu (DOLEŽAL, 2010; WILKINSON, 2005). Není vhodné naskladňovat silážovanou hmotu po celé délce žlabu, protože přejezdy vozů dochází k zanášení velké množství bláta a hlíny. Vždy je lépe naskladňovat píci do klínu. To je výhodné i při nepřízni počasí, kdy při dešti lze naskladňovanou hmotu zakrýt plachtou a voda většinou odteče, což při naskladňování po celé délce silážního žlabu není možné (PŘIKRYL, 2005). 26
V případě kontaminace píce zeminou je nezbytné použití konzervačních silážních prostředků (DOLEŽAL a kol., 2006). 2.3.3.3 Obsah sušiny Obsah sušiny patří mezi nejvýznamnější faktor, kterým můžeme ovlivnit kvalitu konzervované píce a také vlastní průběh fermentace. Z praktického hlediska je ověřeno, že u víceletých pícnin v souvislosti s vyšším obsahem dusíkatých látek, je nutné nechat píci zavadnout dostatečně rychle na optimální obsah sušiny. Tímto předcházíme rozvoji nežádoucí mikroflóry (DOLEŽAL a ZEMAN, 2011). V případě, že zavadání probíhá příliš dlouhou dobu, dochází k výraznému úbytku stravitelných živin a k rapidnímu zhoršení procesu fermentace, mléčného kvašení (KRÁTKÝ, 1998; LOUČKA a MACHAČOVÁ, 1996). V průběhu zavadání dochází k změnám složení epifytní mikroflóry. Množství laktobacilů se zvyšuje, avšak při překročení sušiny 44 % opět klesá. Počty kvasinek a plísní se zvyšují geometrickou řadou (JAMBOR a kol., 1993). Delší vadnutí silážní píce před zesilážování může zvýšit náchylnost siláže k aerobní nestabilitě (WOOLFORD, 1990). Pro urychlení doby zavadání je vhodné použití kondicionérů, načechrávacích a rozmetací prvků (LOUČKA a
MACHAČOVÁ, 1996). Pícniny s nízkým obsahem
sušiny jsou všeobecně velmi těžko silážovatelné (DOLEŽAL a ZEMAN, 2011). Zvýšením obsahu sušiny je ovlivněno množství kyseliny mléčné. Současně se obsah kyseliny octové výrazně nemění a kyselina máselná není snižována (JAKOBE a kol., 1987). Podíl dostupné vody v píci má významný vliv na mikroorganismy a jejich životaschopnost i v závislosti na kritické hodnotě pH, která bývá kritériem stability siláží. Zvýšením obsahu sušiny silážované píce je snižována potřeba kyselin k vytvoření určité kvality siláže, protože takováto píce má vyšší selektivně bakteriostatickou účinnost (DOLEŽAL a kol, 2010). Nadměrně vysoká sušina píce není pro kvalitní fermentační proces vhodná (WILHELM, WURM, 1999), neboť při sušině nad 45% dochází nejen k problémům při dusání (MATHIES, 2003). U nás není výjimkou setkat se silážemi s obsahem sušiny vyšší než 50 až 60%. Při tomto vysokém obsahu sušiny má jen okolo 10% z populace bakterií mléčného kvašení schopnost jen částečně zkvašovat přítomné cukry na fermentační produkty v malém množství. Takové siláže jsou velmi nestabilní, dochází k zahřívání a hodnota pH je vysoká. Obsah kyseliny mléčné je nízký. Toto přeschnutí
27
může být relativně korigováno přídavkem zředěné melasy, fyziologického roztoku, syrovátky nebo okyselené vody (DOLEŽAL a ZEMAN, 2011). Za normálních povětrnostních podmínek doporučují DOLEŽAL a ZEMAN (2011) nechat zavadnout víceleté pícniny s kombinací se silážními aditivy na sušinu: vojtěška: nad 35% (35 až 45%) jeteloviny: nad 30% (30 až 45%) trávy: nad 30% (28 až 40%) silážní kukuřice: 28 až 34% Je vhodné nekosit píci ihned ráno, ale až dojde k odpaření rosy v průběhu dne (KRÁTKÝ, 1998). 2.3.3.4 Struktura píce Délka řezanky je významná zejména z hlediska dusání (MATHIES, 2002; WILHELM, WURM, 1999). Krátkou řezankou je zajištěno dobré udusání a tím také uvolnění enzymů a živin potřebných k rychlé produkci kyseliny mléčné, čímž je zajištěno požadované rychlé snížení hodnoty pH. Optimální pořezání podpoří rozklad rostlinných buněk, tímto je dosaženo rychlejšího a intenzivnějšího fermentačního procesu za současného snížení ztrát a rizik následného kvašení (DOLEŽAL, 2010; KOPŘIVA, 1992; WILHELM, WURM, 1999; PILTZ a KAISER, 2004). V případě řezanky kratší než 8 mm, vzniká siláž s nestrukturální vlákninou (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996). WINKELMANN (2002) uvádí jako optimální délku řezanky cca 35 mm při 35 % sušině. 2.3.3.5 Hodnota pH Čerstvá zelená píce má hodnotu pH obdobně jako sladké mléko, což je přibližně 6,8 až 7,2. Rozvoj mikroorganismů v silu probíhá velmi brzy. V případě vhodných podmínek se vyvíjejí převážně bakterie mléčného kvašení (SHMIDT, WETTERAU, 1974; WILKINSON, 2005). Jejich činností dochází ke vzniku organických kyselin, zejména kyseliny mléčné, jenž způsobují pokles hodnoty pH (JAKOBE, 1987, DOLEŽAL a kol., 2010). Rychlý pokles hodnoty pH silážované píce je zárukou pro uchování bílkovin, dále potlačení aktivity, růstu a množení kvasinek (KRÁTKÝ, 1998; HASSANAT et al., 2007). Optimální hodnota pH siláže se pohybuje v rozmezí 3,6 – 5 (ZEMAN, 2006).
28
Na základě hodnoty pH můžeme za několik dnů odhadnout výsledek silážování z čerstvé či mokré píce. Výrazný rozdíl je zejména mezi stabilními a nestabilními silážemi. Ovšem v případě siláží ze zavadlé píce neznamená relativně vysoká hodnota pH nepříznivý proces kvasných procesů, ale nesmí překročit kritickou hodnotu (SHMIDT, WETTERAU, 1974; LOUČKA a MACHAČOVÁ, 1996). Pro nežádoucí mikroorganismy je minimální hodnota pH vyšší než pro mléčné bakterie, ale pro kvasinky a plísně je tato hodnota nižší! Optimální pH pro růst kvasinek je 5,07,0 (JAKOBE, 1987; DEAK, 2008). 2.3.3.6 Teplota KIM a ADESOGAN (2006) dokazují nepříznivý vliv vysokých teplot při silážování na proces fermentace výslednou kvalitu siláží. LOUČKA a kol. (2011) ve své studii uvádějí, že v hloubce nad 45 cm pod povrchem, mají siláže stabilní teplotu, a to bez ohledu na teplotu vnějšího prostředí. S tímto se shodují i výsledky studie BORREANIHO a TABACCIOHO (2010). Při teplotách kolem 30 °C doporučují LOUČKA a kol. (2011) odstraňovat z blízkostí stěn silážního žlabu zkaženou siláž, fólie odkrývat jen na jedno krmení, měřit teplotu vrchní části siláže a dle potřeby zakrývat část, která vykazuje vysokou teplotu, zbytky krmiva z předchozího dne nepřidávat do krmné dávky. BORREANI a TABACCO (2010) rovněž ve svém pokusu sledovali změny teplot v silážích. Z jejich studie plyne, že na podzim a v zimním období je vnitřní teplota siláže vyšší s rostoucí hloubkou a naopak na jaře a v letním období je teplota nižší. Což je způsobeno postupným ochlazováním siláží v zimě. V dobré siláži nesmí teplota stoupnout nad 6 až 16 °C vůči okolní teplotě při sklizni (URIARTEL, BOLSEN, BOLSEN, 2006). Vyšší teplota ve vrchní části siláže může být způsobena nedostatečným udusáním Zvýšení teploty v silážích je spojeno s aerobním narušením siláží spojeným s příliš vysokou sušinou naskladňované hmoty (LOUČKA a kol., 2011). související se špatným utěsněním sil (BORREANI a TABACCO, 2010; BOLSEN et al., 1993). Při silných mrazech se v silážích udržuje vnitřní teplota nad bodem mrazu v hloubce 30 cm (LOUČKA, 2010). Při náhlém ochlazení siláže může nastat problém se sekundárním kvašením i u kukuřičné siláže, která v podstatě nevyžaduje silážních aditiv (WILKINSON, 2005). Měření teploty siláží, je dobrý způsob kontroly kvality siláží (BORREANI a TABACCO, 2010). 29
2.3.3.7 Obsah sacharidů Obsah zkvasitelných sacharidů je významným faktorem pro rozvoj mléčných bakterií a je určujícím faktorem pro vhodnost jednotlivých pícnin k silážování (JAKBE a kol., 1987; KOPŘIVA 1992). Čím vyšší koncentrace cukru obsahuje plodina při sklizni, tím je větší šance dosažení dobrého kvašení (WILKINSIN, 2005). Podle A. A. Zubrilina nazýváme cukerné minimum, minimálním množství cukru, které je dostačující k hromadění kyselin v silážované hmotě do stupně pH 4,2 (KOTORA, 1958). Jako kritická koncentrace sacharidů je považována 30g/kg čerstvé plodiny, kdy koncentace pod touto hranicí výrazně zvyšuje riziko nekvalitní fermentace (WILKINSON, 2005). Mléčného kvašení se účastní především monosacharidy a oligosacharidy, a také hydrolyzovatelné fruktozany (JAKBE a kol., 1987). Pro silážovatelnost pícnin je obsah vodorozpustných sacharidů velmi důležitý. Nejrychleji je štěpena sacharóza, která je během 24 až 48 hodin téměř odbourána. Zatímco fruktóza a glukóza jsou odbourávány pomaleji. Tato rozdílná rychlost štěpení je velice významná pro průběh fermentace v počáteční fázi fermentace (ŠPIČKA, 1993). Čím je vyšší podíl pohotové energie v silážích, tím jsou vyšší ztráty na kvalitě siláží (LOUČKA, 1993)
Pokud je v siláži
obsaženo
velké množství zbytkových
vodorozpustných sacharidů dochází k zhoršování aerobní stability siláží (PITT ET et al., 1991). Siláže s nízkou nebo žádnou hladinou zbytkového cukru jsou většinou po otevření relativně stabilní, neboť obsahují zvýšenou hladinu kyseliny octové, potlačující růst kvasinek a plísní (WILKINSON, 2005). Nízký obsah zkvasitelných cukrů je spojen se současným vysokým obsahem dusíkatých látek, jejímž následkem je těžká silážovatelnost. Největším problémem je tvorba čpavku, který má schopnost neutralizovat kyselinu mléčnou (JAKBE a kol., 1987). Vzájemný poměr dusíkatých látek a sacharidů lze využít jako vodítko pro snadnost silážování. V případě poměru nižším než 0,6 se jedná ve většině o obtížně silážovatelné píce. U travnatých pícnin lze dusíkatým hnojením ovlivnit vzájemný poměr dusíkatých látek a vodorozpustných sacharidů (JAKBE a kol., 1987). Během noci je velká část cukrů prodýchána, a proto kosení píce až v průběhu dne nebo na večer je výhodnější (WILHELM, WURM, 1999).
30
2.3.3.8 Rychlost naskladnění Rychlost sklizně je nutné přizpůsobit sklizňovým sušinám. Měla by začínat a končit v požadovaných optimálních sušinách. Rychlost ovšem nesmí negativně ovlivnit požadovanou intenzitu dusání v závislosti na sklizňové sušině ( PŘIKRYL, 2005). Pokud se nestihne zaplnit žlab za jeden den a plnění probíhá až tři dny, farmáři mezi plněním, což je hlavně přes noc, zakrývají siláž plachtou, aby omezili přístup vzduchu (KRÁTKÝ, 1998). Pomalým plněním dochází k nadměrnému zachytávání vzduchu v silážované hmotě (KUNG, 2001). 2.3.3.9 Dusání Velké množství mikroorganismů je schopno dobře prospívat v siláži i při nepatrném množství kyslíku, proto je utěsnění tak důležité (WOLFORD, 1990). Intenzita dusání je závislá na vlhkosti píce a délce řezanky (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996). V průběhu dusání silážované hmoty se vzduch vytěsňuje ven ze silážní hmoty. Snižováním množství vzduchu klesá aktivita aerobních mikroorganismů, které rozkládají cukry na oxid uhličitý a vodu. Při tomto procesu dochází k uvolňování tepla, tudíž se silážovaná píce zahřívá a dochází ke ztrátám sušiny (HOLMES, 2006). Pokud ale aerobní mikroorganismy mají možnost působit po delší dobu, dochází k dramatickému rozmnožování bakterií, nižších hub, plísní a kvasinek (HOLMES, 2006; KUNG, 2001). V případě že silážovaná píce je vysoce porézní, dochází k snadnému průniku vzduchu do naskladňované hmoty, ve které probíhají nežádoucí biochemické pochody, které významně sníží výslednou kvalitu siláže. V případě, že je siláž dobře udusána a současně je i správně odebírána (s hladkou a kompaktní čelní plochou), vzduch do siláže tolik neproniká. Tímto jsou snižovány ztráty sušiny a prodlužuje je skladovatelnost siláže (HOLMES, 2006). Výhodnější je zvolit naskladňování píce do klínu, než po celé délce žlabu, kdy je větší nebezpečí nerovnoměrného vrstvení a tím vzniká riziko nedostatečného vytěsnění vzduchu (PŘIKRYL, 2005). Dusání je určující pro rychlost navážené hmoty. Mělo by být zajišťováno jen nejspolehlivějšími řidiči. Vhodné je použití dvou dusacích stojů, kdy jeden zajišťuje
31
rozhrnování a druhý provádí dusání s maximální rychlostí 3km/h. Výška dusané hmoty nesmí být vyšší než 30 cm, aby bylo zajištěno dusání 230kg/m2 (KUHLMANN, 2007). Volba vhodné dusací techniky závisí na tlaku na kontaktní plochy. Ta je udávaná plochou pneumatik a zatížením náprav. Bylo prokázáno, že běžně používané zatížení nápravy 2,5 tuny, což je stroj s 2 bary tlaku, je nedostačující, proto je použití zdvojených pneumatik méně vhodné. Každá nová vrstva silážované píce by měla být hned dusána (MATHIES, 2002), minimálně pěti přejezdy, neboli 4 až 6 min./t hmoty. Požadované dusání je 1 až 2 hodiny každý den i po skončení navážení silážované píce a to i před konečném zakrytí sila (DOLEŽAL a kol.20010). Při přerušení navážení a dusání píce je doporučováno začít s dusáním až po návozu další vrstvy silážované píce, jinak by dusací technika vytlačila vznikající oxid uhličitý a mohlo by dojít ke vzniku prostoru pro přístup kyslíku JEDLIČKA (2006) cit. LIGHTA. Udusaná hmota o nižší sušině je méně permeabilní a pronikání kyslíku odolává lépe než hmota neudusaná a s vysokým obsahem sušiny (HOLMES, 2006). Uplatňujeme zásadu, že čím je sušina vyšší, tím se musí silážovaná píce dusat intenzivněji (KOPŘIVA, 1992). Vytěsnění vzduchu za každou cenu je podmínkou pro potlačení kvasinek, způsobující ztráty během silážování a především při vyskladňování (PŘIKRYL, 2005) . 2.3.3.10 Zakrytí Kompletní těsnění silážního prostoru je základním předpokladem pro úspěšné silážování (WILKINSON, 2005). Dlouhá prodleva před utěsněním je negativní z hlediska kvality siláže (KIM a ADESOGAN, 2006), neboť nadměrné působení vzduchu na počátku kvašení prodlužuje metabolismus nežádoucích mikroorganismů prospívajících za aerobních podmínek a zpomaluje růst prospěšných bakterií, které produkují kyselinu mléčnou (RANJIT a KUNG, 2000). Každý průnik vzduchu vede vždy ke znehodnocení siláže (DOLEŽAL a kol., 2010), proto musí být naskladněná píce co nejrychleji důkladně zakrytá. Musíme zajistit anaerobní prostředí pro rychlý rozvoj bakterií mléčného kvašení. Jako nevhodnější prostředek se používají různé druhy silážních fólií. Jejich funkce spočívá v zamezení přístupu vzduchu a současně zabránění vnikání dešťové vody do siláže (KOPŘIVA, 1992). Avšak materiály používané k utěsnění se zatížením pneumatikami nemají stoprocentní schopnost ochrany proti průniku vzduchu do siláže (HOLMES, 2006;
32
BOLSEN et al., 2006), proto se používá vícevrstevný systém zakrytí silážních prostor (LOUČKA, 2009). Důležité je také zajištění utěsnění stěn a dna silážních staveb proti pronikání spodní i dešťové vody, vlhkosti a vzduchu. Proto se pokládají fólie po stěnách, případně po dně silážního žlabu před jeho naskladňováním. Problémem bývá ale uchycení fólie (LOUČKA, 2009). Předpokladem je naplnění silážního žlabu až po vrchní okraj. Tímto se zamezí vzniku žlábku, do kterého by zatékala srážková voda a v případě protržení folie by se tato voda dostala do siláže (KOPŘIVA, 1992). Průjezdná sila naplněna nad hranu boční stěny nelze dostatečně vzduchotěsně uzavřít a dochází tak po stranách silážního žlabu k druhotnému zahřívání (MATHIES, 2002). Pro redukci průniku nežádoucího vzduchu je vhodné pod běžnou fólii umístit tenkou smršťující fólii (KUHLMANN, 2007), která bývá slabší (0,03 až 0,045 mm). Tato fólie je průhledná, a proto je zakrývána horní krycí fólií (plachtou) o síle 0,1 až 0,2mm. Dříve byla tato krycí plachta pokládána samostatně a byla po obou stranách černá, proto absorbovala teplo. Stále častěji je používána třívrstevná plachta, která je z jedné strany černá a z druhé bílá. Prostřední vrstva je opatřena ochranných filtrem proti UV záření (LOUČKA, 2009). Silážní plachta by měla přesahovat přes okraje silážního žlabu minimálně 1metr, aby mohla dešťová odtékat přes okraj žlabu vně a nezatékala do siláže( DOLEŽAL, 2010). Na závěr zakrytí lze navíc použít ochranou síť jako ochranu proti mechanickému poškození a následnému průniku vzduchu. Proti nadzvedávání fólie jsou kladeny na povrch zátěžové pytle (KUHLMANN, 2007; WILKINSON, 2005), které se plní štěrkem nebo kačírkem. Pytle se pokládají po obvodu plachty tak, že se překrývají. Takto se docílí dokonalému utěsnění obvodu plachty. V zahraničí bývá používána i speciální těžká průmyslová tkanina, která plní funkci zatížení a zároveň chrání plachtu proti mechanickému poškození (LOUČKA, 2009), běžně jsou také používány ojeté pneumatiky, avšak problém je se zadržování vody v prostoru pneumatik, rozřezání pneumatik tento problém vyřeší, ale je výrazně snížena hmotnost zatížení na m2 (WILKINSON, 2005). Pokud dojde brzy po zasilážování k vytvoření plynového čepce, je to známkou dobrého zakrytí žlabu a řádného utěsnění (DOLEŽAL, 2010; PFLAUM, 2002). Utěsnění vyžaduje pravidelnou kontrolu (WILHELM, WURM, 1999), a při poškození je nutné případný otvor ihned opravit (LOUČKA a kol., 1997). 33
Nezakrytí žlabu z hlediska úsporných opatření, způsobuje velké ztráty znehodnocením siláže, které se projevují i do hloubky silážního jádra (BOLSEN a BOLSEN, 2010). 2.3.3.11 Doba skladování Udusání a zvláště doba skladování přímo ovlivňuje obsah kmenů kvasinek v silážích. Doba skladování 6-8 týdnů je zárukou snížení počtu kvasinek a plísní. Jedná se o tzv. samočištění (MATHIES, 2003). 2.3.3.12 Způsob odběru Při odebírání siláže musí být zajištěno omezení působení vzduchu na minimum (MATHIES, 2003). K zahřívání siláže dochází po vystavení působením vzduchu po dobu tří až pěti dnů (WILKINSON, 2005).
Podmínkou je zajištění vybírání vždy
čerstvé siláže, proto musí být profil stěny neporušený. Řez stěny musí být hladký a čistý (WILKINSON, 2005). Z tohoto důvodu je nepřípustné použití nakladačů, které způsobují rozrušení řezu do hloubky. Při vybírání siláže se používají frézové vybírače (KOPŘIVA a kol., 1999), vykusovače nebo štít, který hmotu odkrojí bez provzdušnění odkrojené hmoty v silážním žlabu (PŘIKRYL, 2005). Technologickou chybou je naskladnění hmoty do takové výše, že ji ani fréza, vykusovač, či štít neodebere. Tyto vrstvy jsou poté odebírány nakladačem, přičemž uložená siláž je provzdušňována (PŘIKRYL, 2005). Odebírání siláže v dostatečném množství napomáhá zabránění aerobnímu kažení (KUNG, 2001). Čím menší objem siláže se odebírá, tím je vyšší riziko sekundárních ztrát, neboť na odebraný profil stěny působí po dlouhou dobu vzduch nebo vysoké teploty (PŘIKRYL, 2005). S tímto se shoduje i DOLEŽAL a kol. (2011), jenž uvádějí jako nejčastější příčinu zahřívání siláží v teplých měsících malá množství odběru a také nesprávný způsob odběru. Minimální odběr v zimních měsících by měl být 15 až 25 cm denně a minimální odběr 25 až 40 cm denně v teplých měsících (HOLMES, 2006). Množství odebrané siláže by mělo být takové, aby byla zkrmena týž den (BRANIČ, ŠTENCL, 1992).
34
2.3.4 Aditiva Jako aditiva označujeme konzervační přípravky přidávané k silážované píci, jejichž úkolem je nejen příznivě ovlivnit mléčné kvašení a zvýšit stabilitu výsledné siláže, ale také zvýšit krmnou hodnotu siláže (KUNG, 2004). Aditiva jsou pouze doplňkem při silážování a nelze jimi nahradit technologické chyby či nedostatky při silážování (LOUČKA a kol., 1997; DOLEŽAL a kol., 2006; KUNG, 2004). Úkolem aditiv je z dobrých siláží udělat ještě lepší (DOLEŽAL a kol., 2006). Od aditiv je očekávána stimulace rychlé acidifikace silážované píce zvýšenou produkcí kyseliny mléčné, a také omezování růstu a množení škodlivých mikroorganismů (LÁD a JANČÍK, 2005), ale mimo potlačení nežádoucích bakterií, kvasinek a plísní, je jejich úkolem zajistit aerobní stabilitu siláží (TYROLOVÁ, 2011). K omezení kvasinek se používají přípravky biologické, chemické, nebo jejich kombinace (LOUČKA a kol., 1997). Jako nejjistější použití aditiv pro zlepšení aerobní stability a zároveň i hygienické kvality se jeví aplikace silážních aditiv na bázi soli. Důležité je věnovat pozornost výběru vhodného přípravku (KUNG, 2004), neboť rozdíly mezi jednotlivými druhy preparátů jsou dosti velké (GALLO, 2007). Při aplikaci je velmi důležité dodržení stanoveného dávkování přípravků (GALLO, 2007; DOLEŽAL a kol., 2006). I u zcela nových řezaček není zaručené, že aplikátory dávkují aditivum ve správném množství (GALLO, 2007). Čím je aditivum rovnoměrněji dávkováno, tím rychleji nastupuje enzymatické uvolnění zdrojů energie a homofermentativní laktacidogenní fermentace (LOUČKA a kol., 1992). Zvolení vhodného aditiva je závislé na složení a povaze silážované hmoty, obsahu sušiny a koncentraci živin v sušině (DOLEŽAL a kol., 2006). Čím je sušina silážované hmoty vyšší, tím se účinnost sypkých preparátů snižuje, což platí zejména u biologických (LOUČKA, 2009). 2.3.4.1 Biologická aditiva Účelem přidávání biologických aditiv do silážované hmoty je schopnost rychlé přeměny heterofermentativního kvašení v homofermentativní (LOUČKA, 1997). Mikrobiální aditiva (inokulanty) Mechanismem účinku inokulantů není jen rychlá produkce kyseliny mléčné, ale také zlepšení aerobní stability siláží v souvislosti s produkcí kyseliny octové, detoxikace
35
mykotoxinů, inhibice patogenních mikroorganismů způsobujících kažení siláží, a v neposlední řadě uplatnění probiotických účinků (RADA a VLKOVÁ, 2010). Použití bakteriálních aditiv oproti chemickým prostředkům je výhodnější, neboť nepředstavují zdravotní rizika (KOPŘIVA a kol., 1992). Tyto přípravky se používají k zlepšení fermentačního procesu. Bývají také levnější a nevyžadují tak přísná opatření pro bezpečnost práce. Můžeme je aplikovat v tekuté formě, kdy využíváme jejich jednodušší aplikace, ale musíme počítat s jejich omezenou dobou skladovatelnosti, neboť aktivita bakterií v roztoku postupně klesá (TYROLOVÁ, 2007), proto jsou míchány s vodou těsně před aplikací. Použití chlorované vody může nepříznivě ovlivnit účinek inokulantu (KUNG, 2004). Formu granulovanou volíme pouze při obsahu sušiny maximálně 45 %, jinak hrozí větší ztráty přípravku (TYROLOVÁ, 2007). Biologická aditiva musí být skladována v suchu, chladu a mimo sluneční záření (KUNG, 2004). Namoknutí během zavadání píce, vysoká intenzita dusíkatého hnojení a vyšší podíl plevelů potlačují fermentaci inokulavaných krmiv (ŠKULÉTY, 1993). Ve většině aditiv jsou obsaženy jako účinné látky bakterie fakultativně anaerobní rodu Lactobacillus. Jedná se o gramnegativní (G-) tyčinky, které netvoří spory. Svou činností přetvářejí jednoduché cukry na kyselinu mléčnou, oxid uhličitý, vodu a také na peroxid vodíku, který má baktericidní účinky. Mezi nejčastější zástupce obsažené v silážních aditivech patří Lactobacillus plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. lactis, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L. pentosus (LOUČKA a kol., 1997). V aditivech jsou i grampozitivní (G+) bakterie. Jedná se například o Streptococcus faecium, S. lactis, S. cremonis, Enterococcus faecium, E. faecalis, Pedicoccus acidilactici, P. pentosaceus, Bacillus subtilis, Bacilus pumilus, Lactobacillus fermentum, L. brevis, L. buchneri. Tyto bakterie jsou typické svým krátkým generačním intervalem. Bakteriím mléčného kvašení napomáhají vytvořit příznivé prostředí pro jejich růst.
A díky tomu v počáteční fázi fermentace mohou konkurovat jiným
mikroorganismům, především kvasinkám a plísním (LOUČKA a kol., 1997). Inokulanty homofermentativních bakterií mléčného kvašení v silážích jsou zodpovědné za vysoký obsah kyseliny mléčné, zatímco heterofermentativní bakterie mléčného kvašení zvyšují hladinu kyseliny octové (DANNER et al., 2003) Použití homo a heterofermentativních bakterií v silážním inokulantu má průkazně pozitivní vliv na snížení hodnoty pH, zvýšení kyseliny mléčné, pokles etanolu, amoniaku, omezení ztrát obsahu sušiny a zvýšení aerobní stability siláží (ARAGÓN, 2011; ŠKULÉTY a kol., 1993). Zvolení homofermentativní nebo heterofermentativní očkovací látky závisí 36
na účelu očkování. Homofermentativní inokulanty jsou účinnější ve zlepšení fermentace (KUNG et al., 2003), většina nemá schopnost inhibovat růst kvasinek, protože mají tendenci maximalizovat výrobu kyseliny mléčné a současně snížit hromadění těkavých kyselin, které mají dobrou antimykotickou aktivitu (KUNG, 2005). Heterofermentativní inokulanty jsou účinnější v udržení stability siláže aerobní (KUNG et al., 2003). Bakterie Lactobacillus buchneri je nejdůležitějším (heterofermentativním) kmenem pro docílení dobré aerobní stability siláží (FLEISCHER, 2004; WILKINSON, 2005; LOUČKA, 2009). Také FILYA (2003) ve své studii dokazuje, schopnost L. buchneri samostatně nebo v kombinaci s L. plantarum zlepšit aerobní stabilitu siláží. Výhodou L. buchneri oproti ostatním mléčným bakteriím je růst i při nižší hodnotě pH a schopnost vyšší tvorby kyseliny octové a 1,2 propandiolu s významným antifungálním účinkem. (FLEISCHER, 2004; WILKINSON, 2005; LOUČKA, 2009). Tyto bakterie mohou narušovat růst bakterií octového kvašení, ale v menším rozsahu než kvasinek (DRIEHUIS at al., 1999). Také ELFERINK et al. (2001) potvrzuje schopnost bakterií L. buchneri a dalších příbuzných bakterií jako je L. Parabuchneri rozkládat kyselinu mléčnou na kyselinu octovou za současného vzniku 1,2 propandiolu za anaerobních podmínek bez akceptoru elektronů, dále ve své studii uvádí, že L. buchneri a L. parabuchneri neprodukují při rozkladu kyseliny mléčné vodík, ale velké množství 1,2propandiolu. Při použití těchto bakterií jako inokulantu uvádí ELFERING et al. (2001) až dvacetinásobné zvýšení aerobní stability siláží. Použitím aditiva s L. buchneri je narušována aktivita kvasinek, dochází k snížení přežitelnosti kvasinek a také dochází k téměř úplné inhibici růstu kvasinek po otevření siláže (DRIEHUIS et al., 1999). Bakterie Lactobacillus brevis vykazuje taktéž výborné učinky na aerobní stabilitu siláží (SCHÖNDORFER, 2010). Často se používají heterofermentativní baterie Propionibacterium, které sacharidy přetvářejí na kyselinu propionovou. Tato kyselina podporuje aerobní stabilitu siláží (LOUČKA a kol., 1997) a je považována jako nejúčinnější prostředek k potlačení činnosti kvasinek (LOUČKA, 2009). HIGGINBOTHAM et al. (1998) dokazuje při použití propionových bakterií opožděnější nástup zahřívání siláží. Také KUNG et al. (2000) ve svém pokusu dokazuje, že přídavek kyseliny propionové příznivě ovlivňuje silážní proces a stimuluje bakterie mléčného kvašení. Tyto bakterie lze využít u substrátu s vyšší sušinou. Jako zdroj energie využívají také kyselinu mléčnou a dokáží přežívat i vysoce nízkou hodnotu pH (LOUČKA, 2009). 37
Dodané bakterie s krátkým generačním intervalem (Enterococcus, Streptococcus, Pedicoccus) pomáhají rychlému vytvoření příznivého prostředí homofermentativním bakteriím rodu Lactobacillus (LOUČKA, 2009). Počet bakterií se udává v CFU jednotkách na jeden gram substrátu. Jedná se o ukazatel počtu životaschopných bakterií (LOUČKA a kol., 1997). Aplikace přísad s bakteriemi mléčného kvašení zajistí nízkou hodnotu pH, avšak může dojít k snížení koncentrace kyseliny octové pod hranici potřebnou k potlačení kvasinek, proto se využívá kombinace aplikace očkovacích látek s bakteriemi mléčného kvašení a soli těkavé mastné kyseliny nebo jiného chemického přípravku, takto je eliminován nedostatek očkovacích látek a zabráněno aerobní nestabilitě (WEISSBACH, 1993). Enzymatická aditiva Obsahují enzymy, které jakožto bílkoviny mají katalytické účinky. Vyznačují se svou stabilitou a aktivitou. Enzymatická aditiva štěpí strukturální vlákninu, čímž dochází k uvolňování pohotové energie pro mléčné bakterie (KOPŘIVA, 1992; JAMBOR a kol., 1993). Enzymy pocházejí z mikroorganismů. Mezi producenty enzymů patří například plísně rodu Aspergilus, Trichoderma, nebo bakterie rodu Bacillus. Nevýhodou enzymů je jejich nákladná výroba (LOUČKA a kol., 1997). Mezi nejvýznamnější používané enzymy patří celulázy, hemicelulózy, amylázy nebo pektinázy (DOLEŽAL a kol., 2010). Hydrolytické enzymy, mezi které se řadí celulázy, hemicelulázy, xylanázy, glukosidázy, štěpí celulózu a hemicelulózu až na monosacharidy, které jsou bakteriemi mléčného kvašení snadno využívány. Jejich účinnost výrazně klesá při sklizni pícnin v pozdější vegetační fázi, neboť lignin je velmi stabilní vůči biologickému rozkladu. αamyláza je využívána při silážování kukuřice o sušině 33 % a vyšší (LOUČKA a kol., 1997). Hlavním štěpným produktem pektináz je kyselina galakturonová, jenž je dále heterofermentativně zkvašována za vzniku kyseliny octové, máselné, mravenčí, jantarové, vodíku a oxidu uhličitého (LOUČKA a kol., 1997). Mezi oxidoredukční enzymy patří například glukózaoxidáza (GO), která napomáhá přeměně glukózy na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku. Vzniklá kyselina glukonová se podílí na okyselování silážované hmoty a dále je zkvašována na kyselinu mléčnou, etanol, acetát a oxid uhličitý. Spotřeba velkého množství kyslíku při této
38
reakci na počátku fermentace příznivě omezuje respiraci nežádoucích mikroorganismů. Účinek GO by měl být také vázání volné vody (LOUČKA a kol., 1997). Aplikace enzymů samostatně nezaručuje vždy dobrou kvalitu siláže. Je tedy výhodnější zvolit kombinaci enzymů a mikrobiálních aditiv společně, neboť je dosahováno lepších výsledků (JAMBOR a kol., 1993). Kombinovaná aditiva Biologická aditiva jsou převážně kombinovaného charakteru (mikrobiálně enzymatická). Obsahují jak bakteriální a enzymatickou složkou, tak nosič, který je zdrojem sacharidů a výživných látek. I přes vyšší cenu těchto přípravků jsou velmi oblíbená zejména při silážování těžce silážovatelných pícnin. Důvodem je rychlé navození
správné
fermentace
(převaha
homofermentativního
nad
heterofermentativním), která vede ke snížení fermentačních ztrát. Mikrobiální složka se používá v práškové podobě a složka enzymatická v podobě hustého roztoku. U některých aditiv lze každou složku použít zvlášť. Například při příznivých klimatických podmínkách nemusíme použít enzymatickou složku a tím snižujeme náklady na silážování (LOUČKA a kol., 1997). 2.3.4.2 Chemická Principem účinku chemických aditiv je zvýšení kyselosti na povrchu bakteriální buňky, zvýšení kyselosti uvnitř bakteriální buňky, selektivní působení na aerobní mikroorganismy, selektivní působení na nežádoucí epifytní mikroflóru (LOUČKA, 2009). Úkolem chemických aditiv je zvýšit uchování zbytkových pohotových sacharidů, redukovat snížení krmné hodnoty, zlepšení hygieny krmiva inhibicí nežádoucích mikroorganismů, zamezit rozkladu bílkovin v důsledku snížení hodnoty pH (DOLEŽAL a kol., 2006) . PYROCHA, KALHOTKA, DOLEŽAL (2006) ve své práci prokazují, že chemická aditiva příznivě ovlivňují pokles pH za současné zvýšené tvorby kyseliny mléčné. Zároveň dochází k potlačení tvorby kyseliny octové. Přídavkem těchto aditiv také dochází k redukci počtu kvasinek v prvních dnech silážování a následné vyšší aerobní stabilitě s nižším zahříváním. Podle DOLEŽALA (2010) jako chemické inhibitory lze použít organické kyseliny (jejich směsi s různým obsahem a poměrem organických kyselin, nebo solí), směsné
39
konzervační prostředky, které obsahují i soli aromatických kyselin, biochemické preparáty, amoniak a močovinu. Mezi chemická aditiva zvyšující kyselost silážované hmoty patří například kyselina sírová, chlorovodíková a jejich soli, a také fosforečná. Tyto kyseliny silážovanou hmotu silně okyselují, ale po jejich aplikaci dojde k i potlačení bakterií mléčného kvašení (LOUČKA a kol., 1997). Z organických kyselin je využívána kyselina mravenčí, propionová a octová a jejich soli. Mohou být použity i další kyseliny jako například mléčná, sorbová nebo benzoová, ale pro jejich vysokou cenu se v aditivech téměř nepoužívají. Negativní vlastností organických kyselin je jejich korozivní účinek, toto je ale v současné době omezováno přídavkem antikorozivních látek v aditivech (LOUČKA a kol., 1997). Kyselina octová, propionová, máselná a vyšší mastné kyseliny, jako například valerová a etanová, mají dobré výsledky při omezení činnosti kvasinek, a proto jsou dobrými prostředky k zvýšení aerobní stability siláží (DEMETHER et al., 1999). Přípravky nebývají tvořeny jen jednou kyselinou, ale jsou v nich kombinovány jak kyseliny, tak soli a to v různém poměru (TYROLOVÁ, 2009; KAISER, 2004). Kyselina propionová I přestože, že je kyselina propionová oproti kyselině mléčné slabší, její předností je schopnost potlačovat růst kvasinek a plísní (LOUČKA, 2009). Použitím kyseliny propionové jako chemického konzervatu je zajištěna lepší odolnost siláží vůči i aerobnímu znehodnocení (PYŚ et al., 2010). Účinnost této kyseliny je zesílena při nízké hodnotě pH, a proto je vhodná pro použití v kukuřičných silážích (KUNG, 2001), omezuje rozvoj plísní a kvasinek také při vybírání otevřené siláže (TYROLOVÁ, 2009), avšak její použití je
Účinnost kyseliny propionové a jejich solí souvisí s jejich
rozpustností ve vodě. Propionát amonný je nelépe rozpustný ve vodě (95 %), rozpustnost propionátu sodného je 25 % a propionátu vápenatého 5 % (KUNG, 2004). Kyselina octová Kyselina octová příznivě omezuje zárodky kvasinek. Má za následek pokles počtu kvasinek a také zpomaluje jejich růst na ploše řezu (MATHIES, 2003). Efekt kyseliny octové podpoří přídavek kyseliny mléčné, neboť při nižším pH se kyselina octová nachází ve větším zastoupení v biologicky aktivní formě působící na kvasinky
40
(MATHIES, HOLGER, 2009). Cílovou hodnotou kyseliny octové v čerstvé hmotě je kolem 1 % (MATHIES, 2003). Kyselina octová je považována za jednu z nejúčinnějších látek zodpovědnou za aerobní stabilitu siláží, neboť působí jako inhibitor organismů způsobujících kažení siláží, pouze kyselina máselná se vyznačuje obdobným účinkem. Velmi nízké hladiny této kyseliny mohou zvýšit stabilitu siláží za aerobních podmínek, avšak kyselina máselná není v silážích žádoucí, a proto není vhodná k zvyšování aerobní stability (DANNER et al., 2003). Kyselina mravenčí Ačkoli je tato kyselina nejpoužívanější organickou kyselinou (DOLEŽAL a kol., 2010), pro svou schopnost rychlé redukce hodnoty pH, ale k omezení kvasinek a plísní zodpovědných za aerobní nestabilitu siláží je neúčinná, neboť jsou tyto organismy vůči ní velmi tolerantní (DOLEŽAL, DVOŘÁČEK, 2000; TYROLOVÁ, 2009). Kyselina benzoová Jedná se o slabou organickou kyselinu, která je účinnější v méně kyselém prostředí. Účinná je pouze její nedisociovaná forma. K potlačení kvasinek je potřebná koncentrace 0,10 % až 0,15 % (DOLEŽAL a kol., 2010) Benzoan sodný Tento chemický konzervant je vhodný zejména k potlačení kvasinek rodu Saccharomyces a Torulopsis produkující alkohol i za nepřítomnosti vzduchu (PŘIKRYL, 2011). Benzoan sodný příznivě ovlivňuje aerobní stabilitu siláží (KLEINSCHMIT et al., 2005) a běžně je součástí silážních aditiv (KUNG, 2005). Amoniak Použití amoniaku je podmíněno přísným dodržením maximálních dávek, neboť dochází k zvyšování hodnoty pH a tím je snižována stabilita siláže (ČERNÍK, 2005; KUNG, 2005). Dle výzkumů vyplývá, že při dávce 0,9 – 1,8 kg bezvodného čpavku na 1 t hmoty může docházet k redukci fermentačních ztrát siláží. Překročení dávky 1,8 kg/1t dochází k inhibici vlastní fermentace (ČERNÍK, 2005). Čpavkované kukuřičné siláže a senáže se vyznačují nižšími fermentačními ztrátami, obsahují více by-pass proteinů v sušině a mají vyšší aerobní stabilitu (ČERNÍK, 2005).
41
Močovina Podle PŘIKRYLA (2005) je použití močoviny nevhodné, neboť při aplikaci na povrch siláže dochází k alkalické reakci. Pod alkalizovanou vrstvou probíhá mléčné kvašení a vznikající kyselina mléčná potlačuje ostatní mikrobiální ztrátové procesy. Methylová skupina z kyseliny mléčné je vytěsňována vznikajícím amoniakem a je produkován mléčnan amonný, který způsobuje pufraci okyselování, čímž k poklesu hodnoty pH nedochází. Oxid uhličitý Jeho účinkem je omezení dýchání rostlinných buněk i mikroorganismů. Do silážované hmoty se jako aditivum nepřidává, ale při silážním procesu se vytváří (LOUČKA, 1997).
2.4 Hodnocení siláží Mimo chemických a mikrobiologických analýz, se využívá i senzorických metod, jako je barva, textura a aroma (PÖTSCH et al., 2010). Produkce mléka a dobré přírůstky hmotnosti zvířat jsou tím nejlepším znakem kvalitní siláže (WILKINSON, 2005), ale užitkovost zvířat je také ovlivněna moha dalšími faktory, a proto se hodnotí kvalita siláže organolepticky nebo laboratorně (RADA a VLKOVÁ, 2010). Při vizuálním posouzením siláže nemusí být vždy patrný problém výskytu kvasinek (GALLO, 2007). Dobře fermentovaná, po dlouhou dobu skladovatelná siláž s vysokou nutriční hodnotou se vyznačuje dominantní produkcí kyseliny mléčné, což představuje asi 60 až 80% z celkového obsahu fermentovaných kyselin, dále s relativně nízkou degradací aminokyselin a nízkým obsahem kyseliny máselné a ethanolu (WILKINSON, 2005). Tepelně poškozená siláž se vyznačuje tmavě hnědým zbarvením. Zápach je silně karamelovo – tabákový (URIARTEL, BOLSEN, BOLSEN, 2006). V případě siláže teplé na dotek, byla vystavena na vzduchu několik dní a ztratila asi 5 % ze své původní sušiny. Pokud probíhá v siláži aerobní kažení, nejvyšší teploty dosahuje v hloubce 0,5 až 1 metr (WILKINSON, 2005). Teplá siláž nemusí být absolutním ukazatelem kažení siláže, protože velká sila často udržují relativně vysoké základní teploty i v zimě. A také pára vystupující ze silážní hmoty při vybírání sila nemusí být známkou aerobního kažení (KUNG, 2005). Hodnocení fermentačního procesu je z pohledu technologie sklizně a konzervačních preparátů velmi důležitá. Hodnotí se hodnota pH, KVV, kyselina mléčná, octová a 42
alkohol, také podíl TMK a kyseliny mléčné a celkový objem kyselin (JAMBOR, VOSYNKOVÁ, 2005). Přítomnost kyseliny máselné je důkazem nepříznivého průběhu fermentačního procesu, nebo průniku vzduchu s následnou druhotnou fermentací (LOUČKA, MACHAČOVÁ, 1996). WILKINSON (2005) doporučuje zařadit do laboratorní analýzy:
Stanovení sušiny: Při nižším obsahu sušiny hrozí vyšší riziko sekundární
fermentace a naopak příliš vysoký obsah je spojen s náchylností k plesnivění.
Hodnota pH: Čím vyšší hodnota pH, tím vyšší sušina. U dobře fermentované siláže
by měla být hodnota pH kolem 4. U glycidových siláží je hodnota pH důležitým ukazatelem průběhu fermentace, ale také dietetickým faktorem, naopak u bílkovinných a polobílkovinných není spolehlivým ukazatelem průběhu fermentace, protože je závislá na obsahu sušiny (LOUČKA a MACHAČOVÁ, 1996).
Stanovení kyselin a alkoholu: Vysoký obsah etanolu způsobuje horší aerobní
stabilitu.
Stanovení stravitelnosti a energetické hodnoty: Je vyhodnocován obsah ligninu a
vlákniny.
Stanovení proteinů: Hrubý protein a formy stravitelného dusíku.
Organoleptické hodnocení: Subjektivní stanovení barvy, textury, vůně a chuti.
Tab. 2.: Laboratorní analýza ideální siláže (WILKINSON, 2005). Parametr Sušina (g/kg) pH 4,0–4,2 Popeloviny (g/kg sušiny) Hrubý protein (g/kg sušiny) Kyselina mléčná (g/kg sušiny) Kyselina octová (g/kg sušiny) Kyselina máselná (g/kg sušiny) Etanol (g/kg sušiny) ME (MJ/kg sušiny) Amonný dusík (g/kg celkového dusíku) Aminokyselinový dusík (g/kg celkového rozpustného dusíku)
43
Ideální hodnota 300–350 4,0–4,2 < 80 150–170 100–150 20–30 0 < 10 > 11 < 50 > 700
2.5 Kvasinky a zdravotní stav zvířat Kvasinky jako organismy nepředstavují pro zdraví zvířat riziko. Jejich výskyt v životním prostředí zvířat je zcela běžný. Problém nastává až při jejich přemnožení v konzervovaných krmivech (GALLO, 2007). Silážovaná píce představuje nevětší podíl v krmné dávce dojnic. Kvalitní siláže představují významný zdroj energie, bílkovin, minerálních látek a vitamínů. Mají příznivý dietetický účinek, zvyšují žravost zvířat a podporují trávení v předžaludku (ILLEK, KADLEC, 1995), avšak zkrmování nestabilní siláže způsobuje problémy při optimalizaci krmné dávky a především zdravotní problémy zvířat, jako je snížený příjem krmiva, pokles užitkovosti, snížení kvality mléka a poruchy reprodukce (KRÁTKÝ, 1998). Siláž je nejvariabilnější složkou celé směsné krmné dávky (WILKINSON, 2005). Tepelně narušené siláže mají nízkou degradovatelnost dusíkatých látek v bachoru a rovněž je narušena stravitelnost dusíkatých látek v tenkém střevě (DVOŘÁČEK, 2000). Podle ILLKA (2006) je typickým příznakem při zkrmování aerobně nestabilní siláže snížená žravost, doprovázená poklesem užitkovosti, změnou jakosti mléka, zvýšeným výskytem mastitid. Objevují se také choroby paznehtů, a zvýšený výskyt hnisavých endometritid. Zdravotní problémy se vyskytují i u telat. Ta mají sníženou životaschopnost, nechtějí přijímat mlezivo, které má nedostatek imunoglobulinů. Následkem je nevytvoření dostatečné imunity telat a následný vyšší výskyt průjmů a úhynů. Narušená konzervovaná píce negativně ovlivňuje fermentační procesy v bachoru, vyvolává indigesce, záněty sliznic trávicího ústrojí, dystrofie a záněty jater (ILLEK, KADLEC, 1995). V Hannoveru při výzkumu bylo zjištěno, že zkrmováním zkažené siláže dochází v bachoru zvířat k devitalizaci velkého množství mikroorganismů. V důsledku toho dochází k redukci tvorby těkavých mastných kyselin asi o jednu třetinu a kvasné plyny se tvoří jen na úrovni 65% z původní hladiny (MATHIES, 2002). Dochází k posunu pH bachorové tekutiny směrem k alkalické straně, významně klesá koncentrace kyseliny propionové a obsah kyseliny máselné je většinou zvýšený. Nedostatečně jsou využívány NL a mikrobiální protein je tvořen v malém množství. Příčinou tohoto je přítomnost čpavku v bachorové tekutině. Byl také zaznamenán pokles nálevníků. Jejich počet může často klesnout pod hranici nižší než 100 000 v ml bachorové tekutiny. V případě závažnější poruch může dojít k jejich úplné absenci. 44
Bachorová tekutina se vyznačuje změnou barvy, konzistencí a také vůně (ILLEK, 2004). Zkrmování zahřáté siláže je spojeno se snížením stravitelnosti organické hmoty. V případě zkrmování zahřáté siláže zastoupené z 25 % v celkové krmné dávce dochází k snížení stravitelnosti celé krmné dávky o 7 %. Proto mají tepelně poškozené siláže velký vliv na užitkovost zvířat (MATHIES, 2002). Metabolity vytvořené během aerobní fermentace jsou zodpovědné za snížení chutnosti siláže a jsou důvodem snížení příjmu sušiny až o 30% (ILLEK, 2007). Kvasinky jsou zodpovědné za zvýšenou tvorbu etanolu, čímž je negativně ovlivněna chutnost krmiva (MLEJNKOVA a kol., 2012). Zkrmování aerobně fermentované siláže je nebezpečné v tom, že se obtížně hledá příčina poklesu užitkovosti a zdravotních poruch. Dochází tak k přímým i nepřímým ztrátám (ILLEK, 2006). Mikrobiálně narušená siláž znehodnocuje celou TMR a obtížně se dekontaminuje (DOLEŽAL a kol., 2011). Důležitá je proto prevence, jako je přísné dodržování technologických postupů při silážování a také používat vhodná aditiva (ILLEK, 2006). Znehodnocené krmivo se nepřidává ke krmivu nezávadnému. Jedná se o tzv. „ředění“, kdy zkrmování takového krmiva nemusí zdraví zvířat viditelně ovlivňovat. Při nahromadění nežádoucích látek v organismu může poté dojít k selhání některých orgánů (LOUČKA, 2008). Aerobně narušená siláž představuje riziko pro zkrmování zvířaty, také vzhledem k vývoji nežádoucích mikroorganismů v siláží. Jedná se především o plísně a listerie (WILKINSON, 2005). Pro minimalizaci aerobního kažení v krmném žlabu doporučuje KUNG (2005) přídavek konzervantu na bázi kyseliny propionové přímo do TMR. Tab 3. Parametry bachorové tekutiny zdravých dojnic (A) a dojnic po zkrmování aerobně narušené kukuřičné siláže (B). (Upraveno, IILEK, 2004) A
B
pH
6,56
6,99
NH3(mmol/l)
8,55
11,70
TMK(mmol/l)
121
93,03
A (%)
55,13
62,42
P (%)
23,72
20,97
B (%)
14,48
16,62
45
3 VLASTNÍ PRÁCE 3.1 Cíl práce Cílem této práce bylo literárně shrnout vliv činnosti kvasinek na siláž a možnosti jejich eliminace. Práce byla zaměřena na morfologii, růst a metabolismus kvasinek, dále byla v práci věnována značná pozornost technologickým možnostem jejich omezení výskytu v silážích, včetně použití možných aditiv. Poté byl uveden vliv zkrmování znehodnocené siláže na zdravotní stav zvířat.
3.2 Materiál a metodika (nástin pro experimentální část) Za účelem posouzení účinnosti silážních aditiv omezit výskyt kvasinek a posílit aerobní stabilitu, budou v modelových pokusech v následujícím období sledovány modelové silážní hmoty, ošetřené vybranými silážními aditivy. Jednotlivé modelové siláže budou uzavřeny v různém časovém rozpětí. Studie bude zaměřena na vývoj teplot během a po otevření siláží v určitém časovém rozmezí. Dále bude věnována pozornost zejména množství alkoholu, hodnotě pH a bude proveden mikrobiologický rozbor. Modelové silážní hmoty budou porovnány s kontrolní siláží.
46
4 ZÁVĚR Kvasinky v souvislosti se silážemi nelze rozhodně opomíjet. Neboť jsou fakultativně aerobní chemotrofní mikroorganismy, jejichž výskyt v přírodě je velmi rozšířený a podmínky pro ně jsou téměř vždy optimální. V procesu silážování hrají významnou roli, protože fermentují cukry na CO2, H2O a etanol a jsou významnými konkurenty bakterií mléčného kvašení. Jsou hlavní příčinou sekundární fermentace siláží, čímž siláž znehodnocují. Takováto siláž je nevhodná pro zkrmování zvířatům, neboť způsobuje zdravotní problémy s následným poklesem užitkovosti zvířat. Siláže tvoří hlavní ekonomiku v chovu skotu a v souvislosti se současnou ekonomickou situací v zemědělství se musí velice zodpovědně přistupovat ke kvalitě krmné dávky, neboť krmivo tvoří největší náklady na provoz podniku. Nejdůležitější pro omezení činnosti kvasinek je bezchybný postup při zakládání siláží. Základem je již sklizeň neznečištěné píce v optimální době zralosti a volba vhodné délky řezanky v závislosti na obsahu sušiny. V současné době je k dispozici široká škála silážních přípravků, kterými lze příznivě ovlivnit kvalitu siláží. Na trhu mají zemědělští pracovníci k dispozici neustále novější a dokonalejší produkty, ale správný technologický proces silážování je považován za nejdůležitější prevenci k omezení kvasinek v silážích a ani ten nejlepší silážní přípravek neeliminuje nedostatky během zakládání siláží.
47
5 POUŽITÁ LITERATURA AMBROŽ, Z. (1991): Mikrobiologie: (obecná část). 3.vyd. Brno: VŠZ, 100 s. ANONYM,
(2008):
Databáze
online
[cit.
03.
09.
2012].
Dostupné
na:
http://www.orko.cz/?link=Biologie%202010 ARAGÓN, A.Y., JATKAUSKAS, J., VROTNIAKIEN, V. (2011): The effect of a silage inoculant on silage quality, aerobic stability and meat production. Databáze online [cit. 2012-02-23]. Dostupné na: www.isrn.com/journals/vs/aip/345927.pdf ARAGÓN, A. Y., HERNÁNDEZ, R., GONZÁLEZ, S. (2010): An inoculant to improve the corn silage quality under field conditions. In: 14th International Symposium forage conservation. Brno: Mendel University Brno, s. 178-180. ISBN 978-80-7375-386-3. ASADUZZMAMAN, M. D. (2007): Standardization of Yeast Growth Curves from Several Curves with Different Initial Sizes. Databáze online [cit. 2012-03-26] Dostupné na:https://www.google.cz/url?url=https://student.portal.chalmers.se/en/Studies/MasterPr ogrammes/BioinformaticsandSystemsBiology/Documents/2007/20071.pdf&rct=j&sa=X&ei=Xe173FDJGYhQenn6C1Bw&ved=0CD4Q2wQ&q=r%C5%AFstov%C3%A1+k%C5%99iv ka+kvasinek&usg=AFQjCNH6i5y30I8s_x7EUTrmx-P3WJAjug BARNETT J. A., PAYNE R. W., YARRPW D. (2000): Yeasts charakteristics and identification, 3.vyd. Cambridge: Cambridge University Press, 1139 s. ISBN 0-52157396-3. BRANIČ, F., ŠTENCL, J. (1992): Aerobní stabilita a vybírání siláží, s. 27. In: KOPŘIVA, A. (ed.), Konzervace, skladování a úpravy krmiv. Brno:VŠZ, 105 s. ISBN 80-7157-029-X BOLSEN, K. K. (1993): Základní principy silážování se zvláštním zřetelem na fermentaci a konzervační přípravky, s. 59-66. In: 6 Mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, s. 252 s.
48
BOLSEN, K. K., DICKERSON, J. T., BRENT, B. E., SONON, R. N. Jr., DALKE, B. S., LIN, C., BOYER, J. E. Jr. (1993): NUTRITION, FEEDING, AND CALVES. Rate and Extent of Top Spoilage Losses In Horizontal Silos. J. Dairy. Sci., 76, s. 2940-2962. BOLSEN, K. K., HUCK, G. L., SIEFERS, M. K., SCHMIDT, T. E., POPE, R. V., URIARTE, M. E. (2006): Silage Management: Five Key Factors. Databáze on line [cit. 2012-03-03]. Dostupné na: http://www.ksre.ksu.edu/pr_silage/bunker_silo_mgmt.htm BOLSEN, K. K., BOLSEN, R. E. (2010): Safety Issues in Managing Large-scale Bunker Silos and Drive-over Piles, s. 148-151.. In: The14th International symposium forage conservation. 1.vyd. Brno: Mendel University Brno, 224 s. BORREANI, G., TABACCO, E. (2010): The relationship of silage temperature with the microbiological status of the face of corn silage bunkers. J. Dairy. Sci., 93, 6, s. 26202629. CONAGHAN, P., KIELY, P. O.,O’MARA, F. P. (2010): Conservation characteristics of wilted perennial ryegrass silage made using biological or chemical additives. J. Dairy. Sci., 93, s. 628-643. ČERNÍK, V. (2005): Silážní aditiva v USA. Krmivářství, 2, s. 31. DANNER, H., HOLZER, M., MAYRHUBER, E., BRAUN, R. (2003): Acetic Acid Increases Stability of Silage under Aerobic Conditions. Appl. Environ. Microbiol., 69 (1), s. 562–567 DEAK, T. (2008): Handbook of food spoilage yeasts. 2 vyd. Boca Raton, FL: CRC Press, 325 s. ISBN 978-1-4200-4493-5. DEMETHER, A., FRANK, B., LINDSTROM, E.A. (1999): Maize silage in Sweden. In : The 12th International Silage Konference, Uppsala, s. 317-318. DOLEŽAL, P., DVOŘÁČEK, J. (2000): Aerobní stabilita siláží z krmivářského pohledu. Krmivářství, 1, s. 26 – 28. DOLEŽAL, P., VYSKOČIL, I., DOLEŽAL, J., KALHOTKA, L., ZEMAN, L., PYROCHA, V. (2006): Stabilizace krmiv a siláží organickými kyselinami. Krmivářství, 1, s. 35 – 38.
49
DOLEŽAL, P., ZEMAN, L., SKLÁDANKA, J., KALHOTKA, L., NEDĚLNÍK, J., DVOŘÁČEK, J. (2009): Hygiena krmiv a zdravotní rizika. Zemědělec –týdeník moderního ospodáře, 9, s. 10-14. ISSN 1211-3816. DOLEŽAL, P. a kol. (2010): Konzervace, skladování a úpravy objemných krmiv (Přednášky). Brno: Mendelova universita v Brně, 348 s. ISBN 978-80-7375-441-9. DOLEŽAL. P., ZEMAN, L. (2011): Objemná krmiva a hlavní zásady pro zlepšení jejich kvality. Krmivářství, 2, s. 25-27. DOLEŽAL, P., NEDĚLNÍK, J., SKLÁDANKA, J., MORAVCOVÁ, H., POŠTULKA, R., VYSKOČIL, I., DVOŘÁČKOVÁ, J., ZEMAN, L. (2011): Kukuřice ve výživě zvířat. Krmivářství, 4, s. 16-18. DRIEHUIS, F., OUDE ELFERINK, S. J. W. H., SPOELSTRA, S. F. (1999): Anaerobic lactic acid degradation during ensilage of whole crop maize inoculated with Lactobacillus buchneri inhibits yeast growth and improves aerobic stability. Journal of Applied Microbiology, 87, (4) , s. 583-594. DVOŘÁČEK, J. (2000): Vliv kvality objemných krmiv na zdravotní stav dojnic, s. 6367. In: Šlechtitelské, výživářské a technologické aspekty produkce a kvality mléka. Sborník příspěvků. Svaz výrobců mléka, Rapotín: Českomoravská společnost chovatelů, Výzkumný ústav pro chov skotu, 144 s. DIHEHUIS, F., ELFERING, S.J.W.H. (2000): The impact of the duality of silane on animal health and food stafety. Wet. Quart, 22, s. 212-217. FELDMANN, H. (2005): Yeast molecular biology. A short compendium on basic features and novel aspects. Databáze online [cit. 2012-04-03]. Dostupné na: http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/ FILYA, I. 2003: The effect of Lactobacillus buchneri and Lactobacillus plantarum on the fermentation, aerobic stability, and ruminal degradability of low dry matter corn and sorghum silages. J. Dairy Sci, 86, s. 3575 – 3581. FLEET, G. H., QUEROL, A. (2006): Yeasts in food and beverages. Berlin: Spinger, s. 453. ISBN 3-540-28388-9.
50
FRÁGNER, P. (1967): Mykologie pro lékaře. 1. vyd. Praha: Státní zdravotnické nakladatelství, 348 s. GALLO, M. (2007): Hygienická kvalita krmív – od kvasinek ku plesňam. Krmivářství, 2, s. 38 - 40. HASSANAT, F., MUSTAFA, A.F., SEGUIN, P. (2007): Effects of inoculation on ensiling characteristics, chemical composition and aerobic stability of regular and brown midrib millet silages. Animal Feed Science and Technology, 139 s. 125–140. HIGGINBOTHAM, G. E., MUELLER, S. C., BOLSEN, K. K., DEPETERS, E. J. (1998): Effects of Inoculants Containing Propionic Acid Bacteria on Fermentation and Aerobic Stability of Corn Silage. J. Dairy. Sci., 8, s. 2185–2192. HOLMES, B. J. (2006): New Technologies for Bunker Silo Management in North America s 50-64. In: 12th International symposium Forage konservation. Databáze online [cit. 2012-02-23] Dostupné na: http://www.isfc.eu/isfc12/pdf/celysbornikEN.pdf HRUBÝ, S., BARTL, V., EMBERGER, O., KORBELÁŘOVÁ, T., POLSTER, M., ŽEŽULKOVÁ, M. (1984): Mikrobiologie v hygieně výživy. 1.vyd. Aviceum, Praha, 208 s. ILLEK, J., KADLEC, I. (1995): Výživa dojnic a její vliv na jakost a složení mléka, s. 69-105.. In: KADLEC, I. a kol.: Problematika prvovýroby mléka. ÚVO Pardubice, 202. s. ILLEK, J. (2004): Aerobní stabilita siláží – předpoklad vysoké produkce a dobrého zdravotního stavu. Krmivářství, 3, s. 1-3. ILLEK, J. (2006): Health Risks Posed by Feeding Low Quality Silage, s. 129-130. In: 12th International symposium Forage konservation Databáze online [cit. 2012-02-23] Dostupné na: http://www.isfc.eu/isfc12/pdf/celysbornikEN.pdf ILLEK, J. (2007): Zdraví a hygienická kvalita siláží. Krmivářství, 2, s. 29-31. JAKOBE, P., a kol. (1987): Konzervace krmiv. Praha: Státní nakladatelství v Praze, 1. vyd. 264 s.
51
JANDEROVÁ, BENDOVÁ, B. (1999): Úvod do biologie kvasinek. 1.vyd. Universita Karlova v Praze, 108 s. JAMBOR, V., HARTMAN, M., KLEJDUS, B., DUFKOVÁ, L. (1993):
Vliv
biologických konzervačních prostředků na fermentační proces vojtěškových siláží v různém stupni zavadání, s. 85-87. In: 6. mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, 252 s. JAMBOR, V., VOSYNKOVÁ, B. (2005): Jak objektivně hodnotit kukuřičnou siláž. Chov skotu. 2 (2), s. 22-23. JEDLIČKA, M. (2006): Silážování podle Petera Lighta. Krmivářství, 2, s. 6-7. JELÍNEK, J., ZICHÁČEK,V. (2005): Biologie pro gymnázia (teoretická a praktická část). 7. vyd. Nakladatelství Olomouc, 575 s. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ,
A.
(1982):
Kvasinky
a
kvasinkovité
mikroorganizmy. 1. vyd. Bratislava: Alfa, 483 s. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A. (1957): Kvasinky. 1.vyd. Bratislava: Slovenské nakladateľstvo technickej literatúry. 344s KOPŘIVA, A. a kol. (1992): Konzervace, skladování a úpravy krmiv. Vysoká škola zemědělská v Brně. 105 s. ISBN 80-7157-029-X KOTORA, M. (1958): Silážování. Státní zemědělské nakladatelství v Praze. 225 s. KRÁTKÝ, J. (1998): Silážování ve Velké Británii. Krmiva a výživa, 1, s. 6-7 KRÁTKÝ, J. (2006): Jak se vyvarovat problémům s aerobní stabilitou siláží. Krmivářství, 2, s. 20-22. KAISER, A. G. (2004): Silage additives, s. 171-196. In: KAISER, A. G., PILTZ, J. W., BURNS, H. M., GRIFFITHS, N. W.: Successful Silage. Dairy Australia and New Wales Department of primary Industries, 420 s. Databáze online [cit. 02.04. 2012] Dostupné na: http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture. KLEI, I.J., YURIMOTO, H., SAKAI, Y., VEENHUIS, M. (2006): The Significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast. Biochemica et Biophysica Acta, 1763, s. 1453–1462 52
KLEINSCHMIT, D.H., SCHMIDT, R.J., KUNG. L. (2005): The effects of various antifungal additives on the fermentation and aerobic stability of corn silage. J. Dairy Sci.,88, s. 2130–2139 KUHLMANN, T. (2007): Kvalitní siláže – co je k tomu zapotřebí? Krmivářství, 2, s. 41. KUNG, Jr. L., ROBINSON, J. M., RANJIT, N. K., CHEN, J. H., GOLT, C. M., PESEK, J. D. (2000): Microbial populations, fermentation end products, and aerobic stability of corn silage treated with ammonia or a propionic acid-based preservative. J. Dairy Sci., 83, p. 1479 – 1486. KUNG, Jr. L. (2001): Silage fermentation and additives. Databáze online [cit. 2012-0307]. Dostupné na: http://www1.foragebeef.ca/$Foragebeef/frgebeef.nsf/all/frg69/$FILE/silagefermentation additives.pdf KUNG Jr. L., MARTIN, R. S., LIN, C. J. (2003): Silage additives. In: BUXTON, D. R., MUCK, R. E., HARRISON, J. H., Silage Science and Technology. ASA Inc., Madison, WI, USA, s. 305–360. KUNG, Jr. L. (2004): A review on silage additives and enzymes. Databáze online [cit. 2012-03-02]. Dostupné na: http://ag.udel.edu/anfs/faculty/kung/articles/a_review_on_silage_additives_and.htm KUNG, Jr., L. (2005): Aerobic Stability of Silages. Databáze online [cit. 2012-03 02]. Dostupné na: http://alfalfa.ucdavis.edu/+symposium/2010/files/talks/CAS10_KungAnaerobicStability .pdf LÁD, F., JANČÍK, F. (2005): Ukazatelé kvality silážovaných krmiv. Krmivářství, 1, s. 31-32. LOUČKA, R. (1993): Hodnocení aerobní stability siláží, s. 167-168. In: 6. Mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, 252 s.
53
LOUČKA, R., MACHAČOVÁ, E. (1996): Silážování. Metodiky pro zemědělskou praxi. . Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 26. s. ISSN 02319470. LOUČKA, R., MACHAČOVÁ. E., ŽALMANOVÁ, V. (1997): Aditiva používaná k silážování. Metodiky pro zemědělskou praxi. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací. 50. s. ISBN 80-86153-16-9. LOUČKA, R. (2008): Hygienická nezávadnost krmiv. Náš chov, 6, s. 72-74. LOUČKA, R. (2009): Dokonalé utěsnění je podmínkou. Krmivářství, 1, s. 30-31. LOUČKA, R. (2009): Systém výběru silážních přípravků. Krmivářství, 2, s. 24-27. LOUČKA, R., KNÍŽKOVÁ, I., KUNC, P. (2011): Vliv vysokých teplot na kvalitu kukuřičných siláží a užitkovost dojnic. Krmivářství, 4, s. 19-21. LOUČKA, R. (2010): Krmení vysokoprodukčních dojnic v mrazivém období. Krmivářství, 2, s. 24-25. MATHIES, E. (2002): Bonsilage mais pro vyšší efektivnost. Úspěch ve stáji. 2, s.3-4. MATHIES, E. (2002): Management silážování určuje úspěch. Úspěch ve stáji. 3, s. 2. MATHIES, E. (2004): Přesvědčivé použití Bonsilage Plus v Nizozemí. Úspěch ve stáji, 2, s. 5. MUCK, R. E., SHINNERS, K. J. (2001): Conserved forage (silage and hay); Progress and Priorities. In: Proceeding of 19 International Grassland Congress, Brazil, s. 753762. MATHIES, E. HOLGER, K., (2009): Stabilní siláže s jistotou. Úspěch ve stáji, 1, s. 1213. MLEJNKOVÁ, V., FRÖDEROV, M., KALHOTKA, L., DOLEŽAL, P. (2012): Vliv zavadáni vojtěšky na složeni epifytni mikroflóry. Krmivářstvi, 2, s. 16–18. OUDE ELFERINK, S.J.W.H., DRIEHUIS, F., GOTTSCHAL, J.C., SPOELSTRA,S.F. (1999): Silage fermentation processes and their manipulation. In: FAO Electronic
54
Conference on Tropical Silage. Databáze online [cit. 2012-03-02]. Dostupné na: http://www.cd3wd.com/cd3wd_40/lstock/003/Silage/PDF/Paper2.pdf OUDE ELFERINK, S. J. W. H., KROONEMAN, J., GOTTSCHAL, J., DRIEHUIS, F. (2001): Anaerobic Conversion of Lactic Acid to Acetic Acid and 1,2-Propanediol by Lactobacillus buchneri. Appl. Environ. Microbiol., 67(1), s. 125–132. PILTZ, J. W., KAISER., A. G. (2004): Silage as pasture management tool, 24-25. In: KAISER, A. G., PILTZ, J. W., BURNS, H. M., GRIFFITHS, N. W.: Successful Silage. Dairy Australia and New Wales Department of primary Industries, 420 s. Databáze online [cit. 02.04. 2012] Dostupné na: http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture. PITT, R. E., MUCK, R. E., PICKERING, N. B. (1991): A model of aerobic fungl growth in silag. 2. Aerobic stability. Grass and Forag science, 46, s. 301-312. PFLAUM, J. (2002): Vysoké utěsnění a perfektní zakrytí. Úspěch ve stáji, 1, s. 2-3. PÖTSCH, E. M., RESCH, R., BUCHGRABER, K. (2010): Forage conservation in mountainous regions – results of the Austrian silage monitoring project, , s. 4-11. In: The14th International symposium forage conservation. 1.vyd. Brno: Mendel University Brno, 224 s. PŘIKRYL, J. (2005): Způsoby konzervace kukuřice. Krmivářství, 5, s. 39-42. PŘIKRYL, J. (2011): Silážování kukuřice pro možné zlepšení dietetické kvality. Kukuřičné listy, 3, s. 2. PYROCHA, V., KALHOTKA, L., DOLEŽAL, P. (2006): Vliv přídavku chemických aditiv na fermentační proces a aerobní stabilitu kukuřičných siláží. Databáze online [cit. 2012-02-28]. Dostupné na: http://web2.mendelu.cz/af_291_mendelnet/mendelnet2006/articles/zoo/pyrochta.pdf PYŚ,J. B., KARPOWICZ, A., SZAŁATA, A. (2010): Effect of Bacterial or Chemical Additives on Chemical Composition and Aerobic Stability of High-Moisture Maize Grain Silages, s. 184-185. In: 14th International Symposium forage conservation. 1.vyd. Brno: Mendel University Brno, 224 s. RADA, V. (2009): Siláž a zdraví zvířat. Databáze online [cit. 2012-02-29]. Dostupné na: http://www.vuzv.cz/sites/SilazRada.pdf 55
RADA, V., VLKOVÁ, E. (2010): Silážní inokulanty. Výzkumný ústav živočišné výroby, v.v.i., Praha Uhříněves, 58 s. ISBN 978-80-7403-069-7. RANJIT, N. K., KUNG, L. Jr. (2000): The effect of Lactobacillus buchneri, L. plantarum, or a chemical preservative on the fermentation and aerobic stability of corn silage. J. Anim. Sci., 83, s. 526-535. RODRIGUES, F., LUDOVICO, P., LEAO, C. (2006): Sugar metabolism in yeasts: an overview of aerobic and anaerobic glucose catabolism. Berlin: Springer-Verlag. SCHÖNDORFER, K., ARAGÓN, A. Y., KLIMITSCH, A.,SCHATZMAYR, G. (2010): Effect of BioStabil Mays on Aerobic Stability of Corn Silages, , s. 153-154. In: 14th International Symposium forage conservation. 1.vyd. Brno: Mendel University Brno, 224 s. SCHMIDT, W., WETTERAU, H. (1974): Výroba siláže. Státní zemědělské nakladatelství Praha. 516 s. ŠAŠEK, V., BECKER G.E. (1969): Effect of different nitrogen Sources on the cellular form of Trigonopsis variabilis. J. Bacteriol. 99: 891-892. ŠILHÁNKOVÁ, L. (2002): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. 2. vyd. Praha: Academia, 363 s. ŠKULÉTY, M., BENCOVÁ, E., VÁCLAVOVÁ, M., ŠKULÉTYOVÁ, N., KEČMÉTHY, A., CHOVANEC. (1993): Vplyv inokulantov na fermentáciu trávnych a lucernových siláží, s. 67-68. In: Sborník 6. Mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, 252 s. ŠPIČKA, J. (1993): Sledování dynamiky fermentace zkvasitelných sacharidů na počátku silážování, s. 93-94. In: 6. Mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, 252 s.! URIARTEL, M. E., BOLSEN, K. K., BOLSEN, R. R. (2006): A Trouble-shooter for Common Silage Problems in Mexico and the USA, s. 65-72. In: 12th International symposium Forage konservation Databáze online [cit. 2012-02-23] Dostupné na: http://www.isfc.eu/isfc12/pdf/celysbornikEN.pdf VODRÁŽKA, Z. (2006): Biochemie. Praha: Akademie věd ČR, 474 s. 56
TYROLOVÁ, Y. (2007): Přípravky používané při silážování. Zemědělec – týdeník moderního hospodáře, 15, s. 16-19. TYROLOVÁ, Y. (2011): Přehled konzervantů do siláží na českém trhu v roce 2011. Krmivářství, 2, s. 1-10. VRANNÁ, D. (1986): Kvasinky ve výzkumu a praxi. Praha: Academia, 375 s. WEISSBACH, F. (1993): Současné úkloly a možnosti při zlepšování kvality siláže, s. 127-131. In: 6. Mezinárodní sympozium konzervace objemných krmiv. Pohořelice: ČZS,VÚVZ, 252s. WILHELM, H., WURM, K. (1999): Futterkonservierung und-qualität: Silagebereitung, heuwerbung, Getreide-, Maistrocknung. Graz: Leopold Stocker Verlag, 141s. WILKINSON, J. M. (2005): Silage. Lincoln: Chalcombe Publication, 254 s. WINKELMANN, J. (2002): Qualitätssilagen als listungsbasis. Erfolg im stall, 1, s. 7-8. WOOLFORD, M. K. (1990): The detrimental effects of air on silage. Journal of Applied Bacteriology, 68, s. 101-116. ZEHNÁLEK, J. (2009): Biochemie 2. 2 vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 200 s. ISBN 978-80-7375-327-6. ZEMAN, L. a kol. (2006): Výživa a krmení hospodářských zvířat. 1. vyd. Praha: Profi Press, 360 s. ISBN 80-86726-17-7.
57
