MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE NOVÉ NANOBIOTECHNOLOGICKÉ METODY PRO VÝZKUM POŠKOZENÍ DNA NA ÚROVNI JEDNOTLIVÝCH MOLEKUL

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

____________________________________________________

NOVÉ NANOBIOTECHNOLOGICKÉ METODY PRO VÝZKUM POŠKOZENÍ DNA NA ÚROVNI JEDNOTLIVÝCH MOLEKUL Diplomová práce

Veronika Horňáková

_______________________________________________ Vedoucí práce: Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.

Brno 2012

Bibliografický záznam

Autor:

Bc. Veronika Horňáková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie

Název práce:

Nové nanobiotechnologické metody pro výzkum poškození DNA na úrovni jednotlivých molekul

Studijní program:

Biochemie

Studijní obor:

Analytická biochemie

Vedoucí práce:

Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.

Akademický rok:

2012

Počet stran:

103

Klíčová slova:

SPM; STM; AFM; Mikroskopie atomárních sil; DNA; protein; komplex DNA-protein; imobilizace; slída

Bibliographic Entry

Author:

Bc. Veronika Horňáková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry

Title of thesis:

DNA damage analysis on a single molecular level

Degree programme: Biochemistry Field of study:

Analytical biochemistry

Supervisor:

Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.

Academic Year:

2012

Number of Page:

103

Keywords:

SPM; STM; AFM; Atomic Force Microscopy; DNA; protein; complex DNA-protein; immobilization; mica

Abstrakt Diplomová práce je zaměřena na výzkum poškození DNA na úrovni jednotlivých molekul prostřednictvím mikroskopie atomárních sil (AFM). AFM je nejrozšířenější odnoţí mikroskopie se skenující sondou (SPM), která pracuje na principu těsného přiblíţení měřící sondy ke vzorku. Teoretická část zahrnuje popis skenovacích mikroskopických technik, zejména samotný mikroskop AFM, jeho instrumentaci, jednotlivé měřící módy a měřící techniky. V neposlední řadě práce zahrnuje informace o podkladních materiálech, jejich přípravě před samotným měřením a způsoby imobilizace vzorků na tyto nosiče. Experimentální část se zabývá jak optimalizací metod pro přípravu vzorků samotné DNA a její imobilizací na vhodné nosiče pro měření pomocí mikroskopu AFM, tak i moţností nespecifického a specifického značení DNA vazbou protilátky za účelem vizualizace jejich poškozených částí.

Abstract The thesis is focused on the research of DNA damage at the level of individual molecules by atomic force microscopy (AFM). AFM is the most common type of scanning probe microscopy (SPM), which works by a close approach of measuring probe to the sample surface. The theoretical part includes a description of scanning microscopy techniques, namely AFM microscope itself, its instrumentation setup, measuring modes and different measuring techniques. Finally, the work mentions substrates, their preparation before the actual measurement and methods of immobilization of samples on the carrier. The experimental part deals with the optimization of methods for sample preparation of DNA itself and its immobilization on a suitable surfaces for AFM measurements using a AFM microscope, and the possibility of nonspecific and specific labeling of DNA by bound antibodies for visualization of the damaged parts.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala zejména vedoucímu mé diplomové práce Mgr. Janu Přibylovi, Ph.D. za cenné rady, podněty a veškerou pomoc a čas, který mi věnoval v průběhu práce. Poděkování patří také celému kolektivu NanoBio skupiny a všem kolegům z laboratoře za vytvoření příjemné pracovní atmosféry a také za ochotu pomoci při řešení problémů. V neposlední řadě patří velký dík rodině a všem přátelům za psychickou podporu, pochopení a toleranci při zpracování diplomové práce.

Prohlášení Prohlašuji,

ţe

jsem

svoji

diplomovou

práci

na

téma

„Nové

nanobiotechnologické metody pro výzkum poškození DNA na úrovni jednotlivých molekul“ vypracovala samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

V Brně dne …………………

……………………………….

Obsah

Obsah ÚVOD ........................................................................................................................ 11 I.

TEORETICKÁ ČÁST ..................................................................................... 12

1.

Mikroskopie skenující sondou (SPM).............................................................. 12 1.1

Základní charakteristika a vlastnosti metody................................................ 13

1.2

Skenovací tunelová mikroskopie (STM) ...................................................... 15

1.3

Mikroskopie atomárních sil (AFM) ............................................................. 17 1.3.1 Základní princip ............................................................................... 17 1.3.2 Charakteristické síly ......................................................................... 18 1.3.3 Stavba a instrumentace mikroskopu ................................................. 20 1.3.4 Měřící prostředí................................................................................ 24 1.3.5 Pracovní a zobrazovací reţimy ......................................................... 25 1.3.6 Silová spektroskopie ........................................................................ 28 1.3.7 Nosiče vzorků .................................................................................. 29

2.

AFM a významné biomolekuly ....................................................................... 31 2.1

DNA ........................................................................................................... 31

2.2

Proteiny ....................................................................................................... 33 2.2.1 Rozpoznávací funkce proteinů ......................................................... 35 2.2.2 Vazebné interakce proteinů s DNA .................................................. 35

3.

Vybrané modifikace nosičů ............................................................................. 36 3.1

Imobilizace DNA ........................................................................................ 36 3.1.1 Dvojmocné ionty.............................................................................. 37 3.1.2 Silanizace ......................................................................................... 38 3.1.3 Poly-L-lysin .................................................................................... 41 3.1.4 Ostatní modifikace .......................................................................... 42

3.2 4.

Imobilizace proteinů .................................................................................... 42

Cíl diplomové práce......................................................................................... 44

8

Obsah

II.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................ 45

5.

Materiál a metody ............................................................................................ 45 5.1

Chemikálie, biologický a jiný materiál ........................................................ 45

5.2

Přístrojové vybavení a software ................................................................... 46

5.3

Příprava pufrů a zásobních roztoků .............................................................. 48

5.4

Příprava a čištění slídového povrchu ............................................................ 49

5.5

Modifikační a imobilizační postupy pro DNA ............................................. 50 5.5.1 Slída / dvojmocné ionty / DNA ........................................................ 50 5.5.2 Slída / různé typy silanizace / DNA ................................................. 51 5.5.3 Slída / ethanolamin-HCl / DNA ....................................................... 54

5.6

Pasivní imobilizace IgG1 a DNA vazebného proteinu Srs2 .......................... 55

5.7

Imobilizační postupy pro nespecifickou interakci mezi DNA a IgG1 ........... 56 5.7.1 Slída / silanizace / DNA a IgG1........................................................ 56 5.7.2 Slída / ethanolamin-HCl / DNA a IgG1 ............................................ 57

5.8

Imobilizační postupy pro specifickou interakci mezi DNA a Srs2 ................ 57 5.8.1 Slída / DNA a Srs2 ........................................................................... 58 5.8.2 Slída / dvojmocné ionty / DNA a Srs2 .............................................. 58

5.9

Imobilizační postup pro komplex DNA-Srs2 ............................................... 59

5.10 Nastavení AFM mikroskopu NTEGRA Vita................................................ 60 6.

Výsledky a diskuze ........................................................................................... 63 6.1

AFM snímky DNA ...................................................................................... 64 6.1.1 DNA imobilizovaná přes dvojmocné ionty ....................................... 64 6.1.2 DNA imobilizovaná silanizačními technikami .................................. 69 6.1.3 DNA imobilizovaná přes ethanolamin .............................................. 80

6.2

AFM snímky protilátky IgG1 ...................................................................... 81

9

Obsah

6.3

AFM snímky proteinu Srs2.......................................................................... 84

6.4

AFM snímky nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 ............................... 86 6.4.1 DNA a IgG1 - imobilizace pomocí silanizace ................................... 86 6.4.2 DNA a IgG1 - imobilizace pomocí ethanolaminu ............................. 88

6.5

AFM snímky specifické interakce mezi DNA a Srs2 ................................... 90 6.5.1 DNA a Srs2 - pasivní imobilizace .................................................... 90 6.5.2 DNA a Srs2 - imobilizace přes dvojmocné ionty .............................. 91

6.6

AFM snímky komplexu DNA-Srs2 ............................................................. 92

SOUHRN ................................................................................................................... 97 SUMMARY ............................................................................................................... 99 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY .................................................................... 101

10

Úvod

Úvod Nanobiotechnologie, rozhraní

mezi

respektive

biologickými

nanobiotechnologické

vědami

a

nanotechnologií.

metody,

vytváří

V podstatě

je

nanobiotechnologie definována jako vědní obor zabývající se vyuţitím nanomateriálů, zobrazovacích nanotechnologických metod a nanozařízení pro zkoumání a porozumění biologickým systémům a jejich moţných přeměn (např. biomolekul, proteinů, nukleových kyselin, vícemolekulárních komplexů, virů, buněčných komponent). Další moţná vyuţití se nachází v molekulární medicíně – nanomedicíně (diagnostika chorob a následná léčba, nahrazování částí lidského těla, regenerativní medicína a nanometrická chirurgie), v biofarmacii při vývoji nových léků a v potravinářství při konzervaci potravin. Do budoucna nanobiotechnologie slibují nová řešení při zlepšování kvality lidského výkonu (zvyšování smyslové kapacity, integrování nervových systémů s nanoelektronikou a nanostrukturovanými materiály). Mezi významné zobrazovací metody, které nanobiotechnologie nabízejí, patří bezpochyby mikroskopie skenující sondou (Scanning Probe Microscopy, SPM). SPM slouţí ke studiu povrchů s atomárním rozlišením s moţností vytváření trojrozměrných obrazů. Po uvedení základní metody SPM vznikla celá řada variací vhodných pro studium různých typů povrchu s různými vlastnostmi. V biologii však dosáhla největšího rozmachu mikroskopie atomárních sil (Atomic Force Microscopy, AFM), která je zaloţena na mapování atomárních sil na povrchu zkoumaného vzorku [1]. Velkým přínosem SPM metod, zejména potom AFM, je moţnost zobrazovat i ţivé organismy. Velmi často se pomocí AFM zobrazuje DNA, a to nejen za účelem porozumění jejím povrchovým vlastnostem, ale i z důvodu studia jejího moţného poškození. Jedním ze způsobů, kterým můţe být poškozena dědičná informace obsaţená ve struktuře DNA, je například navázání metabolitu polyaromatického uhlovodíku na některou z bází. Takto modifikovaná DNA se nesprávně replikuje a v samotném důsledku můţe toto poškození vést aţ ke zhoubnému bujení. Lokalizace přesného místa poškození v molekule DNA a zároveň kvantifikace četnosti tohoto poškození prostřednictvím protilátky můţe pomoci vysvětlit, co se s poškozenými buňkami děje a tím i případně přispět k lepšímu porozumění vzniku rakovinného bujení, coţ by do budoucna znamenalo

velký

přínos

v boji

proti

tomuto

onemocnění.

11

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM)

I. TEORETICKÁ ČÁST 1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) V posledních třiceti letech prošla oblast mikroskopie rozsáhlou revolucí zavedením nové skupiny mikroskopických technik souhrnně označovaných jako mikroskopie skenující sondou. Hlavním přínosem SPM je schopnost měření fyzikálních a chemických vlastností vzorku s vysokým rozlišením povrchu v řádu několika nanometrů, coţ nebylo v takto malém měřítku aţ do roku 1981 moţné. V tomto roce byla vědci G. Binningem a H. Rohrerem představena skenovací tunelová mikroskopie (Scanning Tunneling Microscopy, STM) - metoda, která poloţila základní kámen široké rodiny SPM [2]. O velkém přínosu nové mikroskopické techniky svědčí rok 1986, kdy oba tvůrci STM obdrţeli Nobelovu cenu za fyziku. Avšak neţ oblast mikroskopie došla do tohoto bodu, prošla několika různými vývojovými fázemi. První teoretický návrh pro realizaci mikroskopie s moţností téměř atomárního rozlišení byl představen jiţ v roce 1928 vědcem E. H. Syngem. Jeho koncept spočíval v optickém zobrazení povrchu vzorku ostrým skleněným hrotem za vyuţití apertury malých rozměrů na konci hrotu. Hlavní princip spočívá v práci v oblasti blízkého pole (tzn. pro optické metody je velikost oblasti menší neţ příslušná vlnová délka a takto malá vzdálenost umoţňuje dosáhnout rozlišení pod difrakčním limitem). Hrot je umístěn v těsném kontaktu s povrchem vzorku tak, aby se světlo nestačilo před průchodem vzorkem laterálně rozšířit, čímţ je odstraněna závislost na vlnové délce světla a umoţněno skenování ke konstrukci obrazu. Tento návrh však ve svých letech zůstal bez povšimnutí zejména kvůli technickým nárokům na provedení. K myšlenkám teoretického principu skenování se znovu vrátil v roce 1956 fyzik J. A. O’Keefe a konečně v roce 1972 dvojice vědců Ash a Nicholls, kteří uskutečnili první experimentální ověření rozlišení pod vlnovou mezí s mikrovlnami (λ kolem 3 cm) a výsledným rozlišením 150 µm. Významným mezníkem roku 1972 bylo také sestrojení Topografineru – přístroje, který pracuje v emisním reţimu a je schopný mapovat topografii vodivého vzorku s rozlišením 3 nm vertikálně a 400 nm horizontálně. Zároveň došlo k nastínění moţnosti vyuţití tunelového jevu pro lepší kvalitu rozlišení, ale i přesto vznikly problémy se stabilitou, které se nepodařilo vyřešit. Obrovský zlom v oblasti mikroskopie nastal později v 80. letech, kdy byla poprvé úspěšně provedena jiţ zmiňovaná realizace tunelovaní Binningem a Rohrerem v laboratořích IBM. Přístroj

12

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) pracoval ve vakuu a vibrace byly tlumeny magnetickou levitací, poprvé byla vyuţita také zpětná vazba a piezokeramické pohybové členy [3]. Další vývoj po vynálezu STM směřoval k zjednodušení konstrukce mikroskopu, k vývoji matematického aparátu potřebného pro zpracování získaných obrazů a v neposlední řadě ke hledání nejlepších materiálů a technologií pro vytváření vhodných nosníků a samotných hrotů [1].

1.1 Základní charakteristika a vlastnosti metody SPM (někdy označovaná také jako SXM, kde X popisuje fyzikální, popřípadě chemické vlastnosti měření) [4] je soubor experimentálních mikroskopických technik určených ke studiu povrchové struktury vzorků s atomárním rozlišením. Umoţňuje vytvoření trojrozměrných obrazů povrchu a stanovení jejich parametrů ve všech třech souřadnicích (x, y, z) [1]. Hlavní princip spočívá v těsném přiblíţení měřící sondy ke vzorku, tzn. práce v oblasti „blízkého pole“. Takto malá vzdálenost dovoluje dosáhnout rozlišení pod tzv. difrakční mezí, která je analogická s vlnovou délkou, ale pouze za cenu získání lokální informace o vzorku. Pro zobrazení celého povrchu vzorku a pro jeho charakterizaci je nutné provádět postupná měření ve více bodech - konstrukce obrazu skenováním (rastrováním) sondou nad vzorkem. Hlavní popularita SPM metod je zaloţena na jejich extrémně vysokém rozlišení v reálném prostoru s relativně nízkými náklady, a to zejména v porovnání s difrakčními technikami nebo elektronovou mikroskopií. Obě výhody jsou umoţněny těsnou blízkostí sondy a vzorku, která vede ke sníţení energie potřebné k měření a tím i k sníţení energetického zatíţení vzorku. Na druhou stranu, malá vzdálenost klade vysoké nároky na řízení pohybu a mechanickou stabilitu z důvodu mechanického poškození vzorku. Velkým přínosem SPM metod je schopnost zobrazovat i výřezy vzorků ve velikosti od stovek mikrometrů do jednotek nanometrů, pro ty nejmenší oblasti aţ v subatomárním měřítku. V nejlepších případech se jedná o rozlišení hodnot setin aţ tisícin nanometrů. Pro určení orientace polohy na vzorku se vyuţívá optický systém a naopak SPM se mnohdy zabudovává díky svým malým rozměrům do elektronového mikroskopu, případně do jiných aparatur pro tvorbu a přípravu vrstev (např. napařováním). Mezi další aplikace, které SPM nabízí, patří modifikace povrchů aţ na atomární škále, litografické zpracování vzorků, mechanické odstraňování a manipulace s jednotlivými molekulami i atomy. I přesto tyto obrovské

13

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) zásluhy, SPM nemůţe nahradit tradiční elektronovou mikroskopii a je spíše povaţována za metodu doplňkovou. SPM metody našly uplatnění nejen ve fyzice ke studiu povrchů [3], ale i pro vyšetřování struktury individuálních biomolekul, povrchů buněčných membrán, polymerů a ţivých buněk v oblasti biologie. Obrovským potenciálem je schopnost poskytovat informace o mezimolekulárních interakcích a moţnost studia dynamických procesů. SPM se postupně stává slibným nástrojem i v oblasti nových aplikací v biochemii, mikrobiologii a biomateriálovém inţenýrství [5]. Do dnešního dne existuje více neţ 20 různých variací SPM technik, z nichţ nejvýznamnější je metoda STM (kapitola 1.2) a AFM (kapitola 1.3). Jelikoţ všechny mikroskopické techniky SPM staví na stejném základu, je pro ně typické, ţe kaţdý mikroskop z rodiny SPM má obdobnou sestavu a vţdy obsahuje následující části: -

sondu, která je tvořena z ostrého hrotu a nosné části a liší se vţdy typem mikroskopie

-

skener, respektive piezokeramický pohybový člen, jehoţ hlavním úkolem je vytvářet měřící rastr a přibliţovat a oddalovat sondu

-

detektor snímající měrnou veličinu, většinou potřebuje aktivní část – laser

-

obvody zpětné vazby, řídící elektroniky a záznamu a vizualizace dat

-

stolek pro tzv. realizaci hrubého posuvu, tedy pro manipulaci a upevnění vzorku

-

optický systém pro snadnou orientaci na povrchu vzorku

Z těchto společných částí vyplývá i společný základní princip SPM metod zaloţených na interakci sondy (hrotu) se vzorkem. Sonda při interakci mění svůj stav, který je snímán senzorem a následně je přes obvod zpětné vazby ovlivňováno prodlouţení piezokeramiky. Změna prodlouţení je přenášena do počítače, který sestavuje výsledný obraz zkoumaného vzorku [3]. Společný základní princip SPM vede k celé řadě vlastností shodných pro všechny mikroskopické techniky patřící do této rozsáhlé rodiny. Vlastnosti jsou následující: -

přímé zobrazení v reálném prostoru a trojrozměrný obraz v reálném čase

-

téměř atomární rozlišení vzorku

-

schopnost pouţití v různých prostředích (např. pro biologické vzorky zobrazování in vivo a in vitro) 14

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) -

malá

velikost

hlavy

SPM

umoţňuje

kombinaci

s jiným

typy

mikroskopických technik -

zobrazování lokální interakce (neobsahuje obraz informací o zbytku povrchu)

-

není zapotřebí speciální úprava vzorků (pouze fixace nebo případně vodivé pokrytí)

-

vysoká citlivost k vibracím a vysokým teplotám

-

není třeba externí zdroj částic, jako je to u elektronů v elektronové mikroskopii nebo světelného zdroje ve světelné mikroskopii

-

citlivost pouze na několik povrchových vrstev (mnohdy pouze na jednu)

-

velké mnoţství falešných obrazů - artefaktů, např. zrcadlení hrotu, kdy si v podstatě hrot se vzorkem vymění roli

-

sloţité opětovné zobrazení stejného místa na vzorku [1]

1.2 Skenovací tunelová mikroskopie (STM) Hlavní princip STM je zaloţen na monitorování protékajícího proudu mezi vodivým hrotem a vodivým vzorkem, aniţ by byly v přímém mechanickém kontaktu. V prostoru mezi kovy (hrotem a vzorkem) se vytváří energetická bariéra, kterou mohou elektrony pronikat, ale to jen pouze v případě, kdy se jedná o velmi úzkou bariéru. Průchod bariérou udává i pravděpodobnost přenosu náboje, ten souvisí s proudem procházejícím soustavou. Tento princip je známý pod pojmem tunelový efekt, který umoţňuje z hlediska kvantové mechaniky procházení částic energetickou potenciálovou bariérou. Základním prvkem tunelování je přesná vzdálenost mezi hrotem a vzorkem, která je pro vlastní reţim STM v rozmezí 0,3 - 1 nm. Při této vzdálenosti vede výměna procházejících elektronů ke vzniku přitaţlivosti a pod napětím k tunelovému efektu. Základní schéma STM je znázorněno na obr. 1. Důleţitým parametrem STM je velikost vertikálního rozlišení, které dosahuje aţ 1 pm a je dáno mechanickou stabilitou šířky tunelovací mezery. Laterální rozlišení je potom závislé na hrotu a jeho poloměru zakřivení, který by měl být co nejmenší, tzn. nejlépe jen jeden atom na špičce hrotu. Výroba takového hrotu je ale náročná, a proto často postačuje hrot s makroskopickým zaoblením, je-li jeden atom vyčnívající. Přes tento atom potom teče téměř veškerý proud. Rozlišení ovlivňuje i celá řada jiných

15

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) parametrů, jako je velikost skenovacího kroku, konstrukční parametry přístroje a prostředí a v neposlední řadě také chemická podstata vzorku.

Obr. 1: Základní schéma STM [6]. Samotné měření probíhá tak, ţe se hrot nejprve v hrubém přiblíţení přivede ve směru osy z ke vzorku (např. krokovým motorkem či mikrometrickým šroubem). Poté se přivede napětí mezi hrot a vzorek, který umoţní průchod proudu a pomocí piezokeramiky se teď jiţ vzorek přiblíţí ke hrotu tak, aby nabyl měřitelných hodnot (řádově nA). Konečné skenování obrazu se uskutečňuje posuvem v rozměrech x, y. Metoda STM pracuje ve dvou základních reţimech:

-

při konstantní výšce - po dosaţení tunelového efektu je poloha hrotu fixována a během skenování se mění velikost proudu. Přesnost je dána stabilitou fixované polohy hrotu, i při relativně malých změnách se totiţ proud mění v rozmezí několika řádů. Zobrazovaný povrch by proto měl být velmi hladký (Δz < 1 nm), velikost zobrazované plochy je typicky v řádu jednotek nanometrů. Účinnost zpětnovazebné smyčky je v tomto módu prakticky potlačena a i proto je tento druh měření velice citlivý na jakékoliv rušivé vlivy (termální drift, zvýšený reliéf vzorku, externí rušivé vlivy, atp.).

-

při konstantním proudu - hrot se přibliţuje ke vzorku do té doby, neţ proud dosáhne poţadované hodnoty. Během skenování se vyrovnávají jeho změny zpětnou vazbou a piezokeramikou. Přesnost zobrazení tedy závisí na nastavení zpětné vazby [3].

16


1.3 Mikroskopie atomárních sil (AFM) AFM, někdy také označovaná jako mikroskopie skenujících sil (Scanning Force Microscopy, SFM) [7], je moderní experimentální metoda, která byla poprvé představena v roce 1986 vědci G. Binnigem, C. F. Quatem a Ch. Gerberem [2]. Hlavní myšlenka pro vytvoření AFM vycházela z pozorování systematických odchylek v průběhu měření mikroskopem STM. Tyto odchylky byly následně vysvětleny působením elektromagnetických sil atomárního původu mezi atomy hrotu a vzorku. A proto, z důvodu potřeby měřit i nevodivé vzorky, coţ nebylo prozatím moţné, vznikl nápad vyuţít tyto síly přímo k měření. Záhy poté byl zkonstruován mikroskop na bázi atomárních sil - AFM [3]. AFM tedy způsobila obrovský průlom v rozsáhlé rodině SPM technik, jelikoţ umoţnila získávání obrazu jak vodivých, tak nevodivých vzorků. Kromě vodičů však mohou být zobrazovány i organické materiály, izolátory, keramické látky, polymery, skla, biologické makromolekuly a ţijící i neţijící buňky. Další velkou výhodou AFM je moţnost zobrazování některých materiálů v různých prostředích, tzn. vzduch, kapaliny, roztoky či vakuum. Z těchto moţností vyplývá i schopnost pozorovat dynamické jevy v buňkách a navíc i buněčné procesy v reálném čase, které odpovídají jejich přirozenému ţivotnímu prostředí a ţivotním podmínkám. Nejčastěji se pouţívá zobrazování topografie vzorku, potom fázové zobrazení nebo zkoumání mechanických vlastností. Spojením s různými jinými zobrazovacími metodami (fluorescenční mikroskopie, optické metody) je moţné získat i další informace o vzorku [8]. I přesto, jako kaţdá metoda, má i AFM své nedostatky. Např. při zobrazování tkání, které jsou velmi měkké a členité, se můţe hrot snadno zachytit. Další nevýhodou je relativně vysoká cena zařízení a nezbytná vysoká znalost personálu při interpretaci získaných snímků. Z tohoto důvodu je rozšíření AFM v bioanalytických aplikacích značně omezeno [1].

1.3.1 Základní princip Na obr. 2 je znázorněn základní schematický diagram AFM. Hlavní částí je sonda, která skenuje povrch vzorku a poskytuje signál o své interakci s povrchem. Interakce bývají zaloţeny na nejrůznějších vlastnostech vzorku (magnetických, elektrostatických, teplotních, topografických, elastických). Princip AFM je z velké části

17

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) podobný STM, ale důleţitým specifikem AFM je na rozdíl od STM potřeba upevnění hrotu na konec tzv. kantileveru – nosníku (nebo raménka) [8]. Hrot se tedy pohybuje v těsné blízkosti nad vzorkem, případně v dotyku s ním a je přitahován nebo odpuzován vzorkem [3]. Snímá atomární sílu a kantilever poskytuje informace o síle do okolí. Toto silové působení způsobuje ohyb kantileveru z jeho původní polohy, a právě tento ohyb je následně detekován. Jádrem skenovacího systému je piezokeramický člen, který mění svou velikost v závislosti na přiváděném napětí. Piezokeramika tak zajišťuje pohyb kantileveru na poţadované místo na povrchu vzorku. Přivedeným napětím se pak ve všech měřených bodech stanoví soubor dat, které jsou následně vyhodnoceny. Nejběţnější metodou AFM je experimentální uspořádání, ve kterém je laserový paprsek fokusován na konec kantileveru odkud se odráţí na detektor. Změna stavu hrotu způsobená interakcí se vzorkem je snímána senzorem a přes obvod zpětné vazby je ovlivněno prodlouţení piezokeramiky. Konečná rekonstrukce obrazu pomocí vhodného programu na počítači je umoţněna prostřednictvím přenesené změny délky piezokeramiky na změnu napětí [8].

Obr. 2: Základní schéma AFM [9].

1.3.2 Charakteristické síly V průběhu AFM měření při interakci mezi hrotem a vzorkem působí celá řada sil různé fyzikální podstaty, které ovlivňují svými vlastnostmi výsledný obraz vzorku [3]. Hlavní princip funkce kantileveru však vyplývá z Hookova zákona: 18

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) F = -k . z kde F je síla působící na kantilever,

je konstanta tuhosti kantileveru a z popisuje

vertikální výchylku kantileveru. Díky tomu je moţné měřit síly působící na sondu právě jiţ zmíněným sledováním vertikálního vychýlení kantileveru (tzn. ve směru z) [5]. Tyto síly mohou mít různý původ a rozdělují se většinou podle vzdálenosti interakce hrot vzorek na síly krátkého a dlouhého dosahu. V následujícím přehledu jsou představeny základní charakteristiky těchto sil.

Van der Waalsovy síly Hlavní podstata sil je elektromagnetická. Působí ve větší vzdálenosti od vzorku, takţe patří do skupiny sil dlouhého dosahu. Dále se řadí mezi slabě orientované síly a vyskytuje se u nich i poměrně slabá anizotropie. Nejvíce se při interakci hrot vzorek projevují ve vzdálenostech 0,1 -100 nm a poskytují rozlišení v řádu nanometrů.

Repulsivní síly Jedná se o síly krátkého dosahu, které vychází z Pauliho principu a z coulombovského odpuzování mezi jádry atomů, jelikoţ při velkém přiblíţení nejsou jejich náboje úplně odstíněny.

Kapilární síly Projevují se pouze při přechodu přes rozhraní kapalina - vzduch . Vznikají buď z jiţ přítomných kapek, nebo v případě kdy hrot působí jako zárodek kondenzace kapaliny. Mezi parabolickým hrotem a vzorkem, který je rovinný působí celková síla o velikosti:

kde γ je povrchové napětí, r1,2 jsou hlavní poloměry křivosti menisku a x je poloměr vodního sloupce. Mezi další síly, které se při interakcích uplatňují, patří fyzisorpce a chemisorpce. Tyto síly vedou k tvorbě vazebných interakcí mezi hrotem a vzorkem. Při

19

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) těsném přiblíţení dvou kovů dochází k překrytí vlnových funkcí a vzniká přitaţlivá síla. Interakce vede také k plastické deformaci, tření či elastické deformaci. Kromě van der Waalsových sil, které se řadí mezi dalekosahové, se k silám, které působí ve větších vzdálenostech řadí i síly magnetické a elektrostatické [3].

1.3.3 Stavba a instrumentace mikroskopu Hrot a kantilever Hrot, který je upevněn kolmo ke konci kantileveru tvoří v podstatě „srdce“ mikroskopu, protoţe je v nejbliţším kontaktu se vzorkem a poskytuje obraz prostřednictvím jeho silové interakce. V prvním prototypu mikroskopu AFM byl pouţit hrot ve formě malého úlomku diamantu, který byl připevněn na konec malého kousku zlaté vrstvy [10]. Dnes jsou materiály, ze kterých jsou tvořeny hroty a kantilevery často totoţné, většinou se jedná o křemík, případně jeho nitrid. Tvar hrotu je závislý na materiálu a výrobním procesu. Speciálním případem hrotu jsou nanotrubičky, které se nasazují na klasický AFM hrot. Jejich velkou předností je štíhlost a malá adheze ke vzorku, dále také vysoká přesnost hrotu. Výrobním materiálem pro nanotrubičky je uhlík, sulfid wolframičitý a kobalt. Velkou nevýhodou je časté opotřebení hrotů a potřeba je vyměnit za nové. Pokud je hrot jiţ vícekrát pouţitý nebo poškozený neposkytuje tak kvalitní obraz. Kvalita hrotu se většinou zjišťuje skenováním standardního vzorku (např. kovové mříţky) dodávaného přímo s mikroskopem. Z tohoto testování hrotu se zjistí důleţitý parametr kaţdého hrotu - poloměr zakřivení r [8], který udává celkovou ostrost hrotu. Dalším parametrem je poměr stran celého hrotu [10]. Tyto dva základní parametry, které vypovídají o kvalitě hrotu, jsou znázorněny na obr. 3.

Obr. 3: Parametry hrotu - poloměr zakřivení (r) a poměr stran (w - šířka, h - výška hrotu) [10].

20

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) Na kvalitu rozlišení výsledného obrazu, který by se měl v ideálním případě shodovat se studovaným objektem, má velký vliv právě také geometrie, ostrost a tvar hrotu. V případě pouţití ostrého hrotu získáme pomocí AFM mikroskopie reálný obraz vzorku (obr. 4a), při pouţití hrotu standardního (obr. 4b) je jiţ výsledný obraz „oříznut“ o detaily, poloměr zakřivení je zde větší. V posledním případě, kdy je při měření vyuţit hrot neostrý (tupý), jiţ nelze sledovat detailní strukturu vzorku (obr. 4c) [11].

a)

b)

c)

Obr. 4: Efekt ostrosti hrotu na rozlišení mikroskopu při měření; a) ostrým hrotem; b) standardním hrotem; c) neostrým hrotem [11].

Kantilevery nesoucí hrot jsou připojeny k malému skleněnému „čipu“, který umoţňuje jeho snadnou manipulaci a umístění v mikroskopu. V zásadě existují dvě základní provedení kantileveru znázorněné na obr. 5. Jedná se buď o tvar písmene „V“ (trojúhelníkový) nebo o jednoramenný tvar (obdélníkový). Oba tyto kantilevery mají různé torzní vlastnosti. Mezi základní parametry kantileveru patří jeho konstanta tuhosti a rezonanční frekvence. Jednotlivé typy kantileverů se pouţívají různě podle typu vzorku a dále podle měřícího reţimu a měřícího prostředí [10]. Hroty pro zobrazování biomolekul mají poloměr zakřivení typicky pod 10 nm, pro reálné zobrazení objektů o

21

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) velikosti jednotek aţ desítek nanometrů je potřeba pouţít hroty s poloměrem zakřivení pod 2 nm. Kantilevery se připravují litografickými technikami většinou současně s hrotem. Velikost takto vyrobeného kantileveru je v rozmezí 100-200 μm na délku, 1040 μm na šířku a tloušťka do 20 μm. K vytvoření hrotu na kantileveru se také vyuţívá kombinace izotropního a anizotropního naleptávání. Takto vytvořené hroty mají poloměr lepší neţ 50 nm [3].

Obr. 5: Základní typy kantileverů [10].

Piezokeramický člen Keramická

směs

PZT

(Pb(Zr,Ti)O3)

je

základním

piezokeramickým

materiálem, který musí být pro dosaţení poţadovaných vlastností dotován různými příměsemi. Piezokeramika se nejčastěji vyrábí spékáním prášku do poţadovaného tvaru. Hlavní podmínkou pro uskutečnění piezokeramického jevu je přítomnost vlastních dipolů krystalků, které jsou ale u prášku uspořádány nahodile. Po spečení se musí např. trubička opět zahřát a vystavit stejnosměrnému elektrickému poli, které způsobí orientaci dipólů do svého směru. Základní vlastností piezokeramiky je piezoelektrická konstanta, díky které se zjistí velikost změny rozměrů po přiloţení napětí. V zásadě piezokeramika umoţňuje roztaţení v intervalu od 0,1 nm aţ do řádově stovek mikrometrů při napětí od 1mV do 1000 V. Existuje několik základních tvarových variací piezokeramiky, z nichţ se sestavuje skener. Např. hranolek, sestava disků nebo dutá trubička.

Skener Skener představuje pohybový prvek k realizaci jemného pohybu při měření a dále umoţňuje přiblíţení hrotu ke vzorku po hrubém posuvu. Jeho hlavní funkcí je skenování, při kterém v pravidelném rastru přemisťuje hrot po zvolené rovině. Další funkcí je pohyb kolmo ke vzorku při měření současně za vyuţití zpětné vazby s cílem udrţení konstantního signálu. 22


Detektor Historicky první AFM měření vycházelo z tzv. „dvojitého“ mikroskopu, ve kterém byl kantilever pokovený z odvrácené strany. Tento princip sledování povrchu vzorku vyuţíval navíc snímání STM hrotem, takţe v obvodu pracovaly současně dvě zpětné vazby. Dnes se jiţ méně pouţívá také metoda pro detekci ohybu kantileveru prostřednictvím kapacitního snímače. Mikroskop v tomto případě obsahuje jednu pevnou elektrodu, druhá je tvořena pokoveným kantileverem. Dohromady tvoří kondenzátor, jehoţ kapacita se mění ohnutím kantileveru. Nejvíce se však v současnosti vyuţívá kvadratický detektor rozdělený na čtyři stejné segmenty, který umoţňuje detekci pohybu skvrny vytvořené laserovou diodou. Před samotným měřením se mechanicky nastavuje místo dopadu laseru na špičku kantileveru, odkud se paprsek odráţí.

Zpětná vazba Základem obvodu zpětné vazby je PID regulátor, který se skládá z derivační, proporcionální a integrační sloţky. Nejdůleţitější částí regulátoru je integrační sloţka, ta totiţ zásadním způsobem ovlivňuje výsledný obraz. Hlavním poţadavkem je velmi krátká odezva a takový zisk, který je malý při vlastních frekvencích systému a naopak vysoký pro nulovou frekvenci. Z praktického hlediska jsou dány parametry zesilovačů a manipuluje se pouze s těmi parametry, které minimalizují chybný signál. Integrační člen umoţňuje dosaţení relativně malé chyby tím, ţe zvyšuje stabilitu systému při velkém zesílení.

Elektronika Z elektronického hlediska je mikroskop vybaven napěťovými zdroji, generátory pro řízení piezokeramiky, vysokonapěťovými zesilovači pro piezokeramiku, obvody pro komunikaci se samotným počítačem, který uchovává, zpracovává a zobrazuje průběh měření. Tyto elektronické prvky jsou umístěny v zařízení, které se často nazývá kontroler a je mozkem celého AFM systému.

23


Antivibrační systémy Důleţitou součástí mikroskopu jsou systémy umoţňující tlumení vibrací kvůli velké náchylnosti AFM na změny vzdálenosti mezi hrotem a vzorkem. Nejčastější příčinou vibrací jsou kmity budov a jejich chvění, buzení pracujícími stroji a chůzí po podlaţí. Proto se zpravidla pouţívá tlumení vertikální ve formě antivibračních stolků, tzn. masivních bloků, na které se mikroskop upevňuje. Jedná se o kombinaci desek z oceli a vitonu [3]. Kromě tohoto tradičního pasivního přístupu k tlumení vibrací se v poslední době rozšiřuje tzv. aktivní antivibrace, coţ jsou podloţní plochy zaloţené na aktivní

eliminaci

vibrací

pomocí

piezoelektrických

členů.

K odstínění

elektroakustického šumu (zvukové vlnění, rušivý vliv elektromotorů a dalších elektronických zařízení) je mikroskop většinou umístěn do dobře izolované komory nebo je jeho citlivá měřící část zakryta těţkým kovovým poklopem.

1.3.4 Měřící prostředí Skenování povrchu vzorku je moţné provádět jak v suchém, tak v kapalném prostředí. Suché prostředí je relativně snadnější na přípravu, na druhou stranu kapalné můţe poskytnout více informací o vzorku. S oběma měřícími reţimy souvisí řada výhod i nevýhod, které jsou shrnuty níţe.

Měření v suchém prostředí Vzorky zobrazované v atmosférickém prostředí jsou často jednoduše nalepovány na nosič vzorku, zpravidla se jedná o kovový disk. Tento disk se poté vkládá do AFM, kde ho pevně drţí malý magnet. Z důvodu zamezení špatného zobrazení je důleţité zajistit pevné spojení vzorku s nosičem. Proto je pro měření zásadní i správný výběr lepidla nebo lepicí pásky, a navíc je třeba se vyhnout lepidlu s pomalým schnutím nebo příliš tlusté lepicí pásce. Velkou nevýhodou je obtíţné odstranění vzorku ze svého nosiče po jeho pouţití, aniţ by nebyl poškozen. Některé měřící systémy jsou schopny vzorky měřit přímo bez předchozího lepení. V tomto případě jsou zajištěny pouze kovovou svorkou nebo pruţinkou. Výhoda je, ţe se vzorek nepoškodí a můţe být pouţit pro jiné experimenty, ale naopak stabilita vzorku je

24

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) mnohem niţší. Při manipulaci se vzorkem je třeba se vyvarovat jakékoliv kontaminaci způsobené otisky prstů nebo prachem ze špinavého prostředí.

Měření v kapalině Oproti měření v suchém stavu je tento způsob měření komplikovanější. I přesto je ale příčinou velkého úspěchu AFM v oblasti biomedicíny. Umoţňuje totiţ zobrazovat vzorky ve fyziologickém stavu, tzn. ponořené v kapalině, kde je ovšem náročné vzorky dostatečně uchytit k povrchu nosiče [10]. Například při zobrazování celých buněk se uchycení k nosiči provádí přidáním kolagenu, entaktinu apod., čímţ se zvyšuje adheze vzorku [8]. Nejčastěji se pro měření vyuţívají standardní Petriho misky, do kterých se přímo aplikuje zkoumaný vzorek ve formě roztoku. Při zobrazování v kapalině je důleţitým parametrem teplota roztoku. Jelikoţ je kantilever extrémně citlivý na jakékoliv teplotní změny, je vhodné před měřením nechat systém ustálit. Po dokončení experimentu je nezbytné všechny součásti mikroskopu, které byly v kontaktu s roztokem očistit, aby nedošlo ke kontaminaci budoucích experimentů [10]. Velmi atraktivní je tento způsob měření například při výzkumu nových léků, kdy metoda umoţňuje snadnou reakci buněk na různé stimuly [1].

1.3.5 Pracovní a zobrazovací reţimy Jelikoţ je nutné přistupovat ke kaţdému měřenému vzorku z důvodu různé drsnosti a velikosti povrchu jedinečným způsobem, existují pro různé typy vzorků navíc i různé způsoby měřících módů pouţívané při interakci mezi hrotem a vzorkem. Mezi základní módy patří kontaktní, poklepový (téţ nazývaný semikontaktní) a nekontaktní mód.

Kontaktní mód Koncepčně je tento mód, který je znázorněn na obr. 6, jako jediný v přímém kontaktu se vzorkem. Vzdálenost mezi hrotem a vzorkem je natolik malá, ţe zde působí odpudivé síly [12]. Tyto síly se snaţí kantilever ohnout ve směru od povrchu a podaří se jim to pouze v případě, kdy je tuhost kantileveru menší neţ tuhost drţící atomy vzorku pohromadě. V tomto případě je velikost ohnutí kantileveru mírou síly. V opačném

25

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) případě dochází k poškození vzorku [3]. Tento měřící mód není vhodný pro měkké vzorky nebo měkké materiály o různé tuhosti [12]. V podstatě se jedná o původní měřící mód AFM, který můţe být realizován na vzduchu i v kapalině. Sonda, tzn. hrot na konci pruţného kantileveru, je přenesena do kontaktu s povrchem vzorku a rastrově skenuje přes tento povrch pomocí piezokeramického skeneru. Změny v ohybu a vychýlení kantileveru jsou během skenování sledovány a kontrolovány pomocí obvodu zpětné vazby [13]. Stejně jako u mikroskopie STM se u kontaktního módu AFM vyuţívají obdobné základní měřící reţimy. V podstatě se jedná o reţim:

-

s konstantní výškou - v průběhu měření je neustále udrţována určená hodnota výšky z0 a měří se ohnutí kantileveru. Přesnost je dána kalibrací kantileveru a stabilitou polohy.

-

s konstantní silou - v tomto případě se naopak udrţuje konstantní ohnutí kantileveru a při skenování se přidává posun vzorkem či hrotem ve směru osy z. Tento způsob modifikace je častější z důvodu menší závislosti prohnutí kantileveru na kapilárních silách a pruţnosti kantileveru. Na druhou stranu je ovšem měření s konstantní silou pomalejší, jelikoţ se během měření provádí posun vzorku závislý na odezvě zpětné vazby. Přesnost je dána kalibrací piezokeramiky a vlastnostmi zpětné vazby [3].

Obr. 6: Kontaktní mód [14].

Nekontaktní mód Nekontaktní mód znázorněný na obr. 7 je zaloţen na oscilaci kantileveru v těsné blízkosti od povrchu vzorku. Vzdálenost mezi hrotem a vzorkem je taková, aby zde mohly dominantně působit přitaţlivé van der Waalsovy síly. Kantilever zpravidla osciluje ve vzdálenosti 1-10 nm od povrchu [12]. V této oblasti jsou ale síly poměrně slabé, proto se vyuţívá dostatečně pruţný kantilever, který musí být zároveň tuhý. Kantilever se zde rozkmitá v okolí své rezonanční frekvence s vyuţitím takové amplitudy, s kterou nedojde ke kontaktu se vzorkem [3]. Obvod zpětné vazby potom

26

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) v závislosti na velikosti amplitudy realizuje posuv vzorku. Tímto způsobem jsou nejčastěji zobrazovány měkké a jemné povrchy, jelikoţ nedochází k ţádnému poškození nebo znečištění způsobenému kontaktem se vzorkem. Nicméně technika se pouţívá pouze pro měření v suchém stavu, protoţe v kapalinách se často vyskytují i další odpudivé síly, které maskují van der Waalsovy interakce potřebné pro nekontaktní mód [12].

Obr. 7: Nekontaktní mód [14].

Poklepový mód V podstatě se jedná o kombinaci obou předchozích metod. Je zaloţen na oscilaci kantileveru, který se udrţuje v těsné vzdálenosti od kontaktu se vzorkem [12] (několik desetin nanometrů) [3]. Po dosaţení rezonanční frekvence kantileveru uţ dochází ke kontaktu se vzorkem. Výsledný obraz je realizován sledováním změn v amplitudě oscilujícího kantileveru, která je pouze tak velká, aby umoţnila krátký kontakt hrotu se vzorkem [12]. Pokud je systém nastaven tak, aby k laterálnímu posunu hrotu docházelo pouze v době, kdy je od vzorku dál, získají se výhody plynoucí z obou metod. Tzn. nepoškození vzorku a vyšší rozlišení. Vyššího rozlišení je dosaţeno tím, ţe se hrot dotkne povrchu hned několikrát, neţ se posune o svůj průměr [3]. Výhodou je moţnost měření jak v suchém, tak v kapalném prostředí [13]. Schematicky je poklepový mód znázorněn na obr. 8.

Obr. 8: Poklepový mód [14]. Nespornou výhodou poklepového módu je moţnost poskytnout v rámci jednoho skenování vzorku nejen informace o jeho topografii získané z prohnutí kantileveru směrem nahoru a dolů [3,13], ale i moţnost fázového zpracování obrazu. Jedná se o poměrně nový způsob zpracování obrazu vyuţívající toho, ţe interakce mezi hrotem a vzorkem nezávisí jen na topografii, ale i na jiných vlastnostech (tvrdost,

27

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) pruţnost, adheze nebo tření), které ovlivňují pohyb kantileveru [13]. Změny způsobené různými vlastnostmi materiálu vedou ke zpoţdění oscilace kantileveru [14], coţ se tedy projeví na výsledném obrazu, který se vytváří z těchto fázových posunů. Fázové skenování můţe například objevit různé sloţky v polymerech dané rozdílnou tuhostí, nebo oblasti s různou hydrofobicitou v hydrogelech [13]. Schematické zobrazení rozdílů v topografickém a fázovém zobrazení je znázorněno na obr. 9. Vzorek je zde tvořen ze dvou oblastí (A a B) s rozdílnou tuhostí materiálu. Topografie poskytuje informace o trojrozměrném profilu vzorku, kdeţto díky fázovému zobrazení se můţe pozorovat rozhraní těchto dvou oblastí, které se liší tuhostí materiálu [14].

Obr. 9: Topografické a fázové zobrazení vzorku [14].

1.3.6 Silová spektroskopie Kromě zobrazování povrchové topografie vzorku a zkoumání chemických vlastností, můţe být AFM pouţita také k měření tzv. silových křivek. Tyto křivky závislosti ohybu kantileveru na prodlouţení piezokeramiky (F-d křivky) poskytují kvantitativní informace o silách působících mezi hrotem a vzorkem. Na obr. 10 je znázorněn příklad silové křivky. Ve fázi 1 probíhá přibliţování hrotu k povrchu vzorku, ale zatím nedochází k ţádnému kontaktu hrot - vzorek. Ke kontaktu dojde ve fázi 2, kdy hrot vlivem van der Waalsových a elektrostatických sil „přiskočí“ do přímého styku se vzorkem. Kantilever se v tuto chvíli vychyluje zvýšením síly, která na něj působí aţ nad lineární část silové křivky (fáze 3“↓“). Následně působením piezokeramiky, která posune vzorek ve směru osy z od hrotu, síla kantileveru klesá (fáze 3“↑“). Adheze mezi hrotem a vzorkem udrţuje hrot stále v kontaktu aţ po předchozí první kontaktní síly. V této fázi (4) dojde k vychýlení kantileveru na opačnou stranu aţ do té míry, ţe se

28

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) kantilever „odtrhne“ od povrchu (fáze 5) a vrátí se zpět do počáteční výchylky (fáze 1) [14]. Hlavním přínosem silových křivek je například moţnost měřit elasticitu ţivých buněk, popřípadě pochopit konkrétní přitaţlivost mezi ligandem a receptorem, která je provedena imobilizací hrotu různými molekulami (bílkoviny, lipidy) s následným měřením silové interakce mezi nimi. V neposlední řadě se uplatňuje i k měření hustoty náboje na povrchu vzorku [13].

Obr. 10: Příklad silové křivky [14].

1.3.7 Nosiče vzorků Substráty nebo nosiče, na které jsou uchyceny vzorky pozorované pomocí AFM, musí mít dostatečně rovný povrch (vzhledem k velikosti zkoumaných molekul aţ atomárně rovný). Mezi další poţadavky, které jsou na ně kladeny, patří vysoká čistota, dostupná cena a snadná příprava pro měření. Běţně se pro AFM pouţívají následující substráty [8].

Grafit (HOPG, Highly Ordered Pyrolytic Graphite) Tento atomárně rovný povrch, někdy téţ nazývaný jako Kishův grafit, byl dříve produkován jako vedlejší produkt při výrobě oceli [15]. Aplikace vysoce orientovaného pyrolytického grafitu v AFM je relativně niţší a uplatňuje se především tehdy, pokud se vedle AFM současně provádí i STM měření [8]. Z chemického hlediska se jedná o syntetickou formu grafitu s vysokou čistotou. Tvoří hexagonální, planární

29

1. Mikroskopie skenující sondou (SPM) strukturu, která se čistí loupáním. Vzdálenost mezi rovinami vrstev je 325 pm. Dále je vysoce hydrofobní a vodivý, čehoţ se vyuţívá v elektronové mikroskopii, kde se pouţívá jako tradiční podkladní materiál. Imobilizace vzorků je velmi jednoduchá a provádí se spontánní adsorpcí na povrch [15].

Slída Tento substrát je v AFM vysoce oblíbený hlavně díky jeho dokonalé štěpnosti, pruţnosti a chemické stálosti. Velké uplatnění zde nachází především Muskovit, který se řadí stejně jako HOPG mezi atomárně rovné povrchy [8]. Toto pojmenování je spjato s Moskvou, kde probíhala těţba nejkvalitnější suroviny. Z hlediska chemické struktury se jedná o sloučeninu K2O·Al2O3·SiO2 a samotný povrch lze popsat jako hydratovaný SiO2. Je tedy dobře chemicky modifikovatelný. Povrch je vysoce hydrofilní na rozdíl od HOPG a při fyziologickém pH je záporně nabitý (pKa ~ 3). Imobilizace se provádí buď iontovou interakcí, nebo kovalentní vazbou biomolekul [15].

Sklo Obvykle se jedná o leštěná krycí sklíčka, která se pouţívají pro zobrazování celobuněčných a větších útvarů (bakterie, sperma, buňka). Z hlediska chemické modifikace nese skleněný povrch ve vodných roztocích také negativní náboj stejně jako slída. Nevýhodou je nízká adheze buněk ke sklu [8]. Chemická struktura povrchu se také podobá slídě - hydratovaný SiO2. Drsnost povrchu je mnohem vyšší neţ u slídy a jak jiţ bylo řečeno, nelze ho pouţívat pro zobrazování malých buněk.

Zlato Inertní kov pouţívaný zejména v elektrochemii jako pracovní elektroda. Díky vysoké vodivosti se vyuţívá i jako nosič v STM a AFM. Povrch je hydrofobní, proto se imobilizace biomolekul provádí spontánní adsorpcí na povrch. Chemická vazba je umoţněna pomocí koordinačně-kovalentní vazby thiolů (-SH). Ve vodě je poměrně nestabilní, proto je potřeba aplikovat adhezivní vrstvu (Al/Cr/Ti). Samotná příprava probíhá napařováním zlatých vrstev [15].

30

2. AFM a významné biomolekuly

Plasty V neposlední řadě se pouţívají plastová sklíčka typu Thermanox. Jejich velkou výhodou jsou výborné adherentní vlastnosti pro různé typy buněk [8].

2. AFM a významné biomolekuly Jak jiţ bylo řečeno dříve, AFM otevřela nové obzory a moţnosti v oblasti medicíny a výzkumu nových léků. Z tohoto hlediska patří mezi biomolekuly, které jsou nejčastěji pomocí AFM zkoumány zejména DNA a proteiny, popřípadě jejich vzájemná interakce. DNA se z tohoto důvodu stala dokonce jedním z prvních vzorků, které byly prostřednictvím AFM zkoumány. Pro DNA je důleţité zejména pořadí nukleotidů kódující genetickou informaci organismů. Kaţdá chyba v tomto pořadí můţe vést k závaţným poruchám a onemocněním organismu, jako je například i rakovina. Proto je hlavní prioritou pochopit věškeré fyzikální funkce a chemické vlastnosti DNA a identifikovat všechny chybné sekvence, které mohou způsobovat aberantní mutace. Stejný význam platí i v případě proteinů - malých buněčných organel, které jsou v buňce syntetizovány prostřednictvím ribozomů. Ţivé organismy jich obsahují na tisíce. Liší se od sebe podle své hlavní funkce na transportní, obranné, regulační, stavební a katalytické. Doposud nebylo zcela pochopeno, jak tyto biologicky velmi významné biomolekuly plní všechny své funkce. Proto je do oblasti SPM, speciálně AFM, vkládána veliká naděje z hlediska úspěšného zkoumání jednotlivých proteinů s moţností

aţ atomárního rozlišení. AFM tedy můţe do budoucna přispět

k prohloubení vědomostí o vztahu mezi strukturou a funkcí proteinu a odhalit podstatu různých onemocnění. V neposlední řadě spolu s tím i přispět při navrhování strategie pro efektivní terapii [5].

2.1 DNA DNA (deoxyribonukleová kyselina) se skládá z jednoho nebo dvou komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců, které ve své struktuře uchovávají základ genetické paměti organismů. Tyto řetězce jsou tvořeny nukleotidy, základními stavebními jednotkami nukleových kyselin, spojenými nvzájem 3 ',5'fosfodiesterovou vazbou [16]. Nukleotidy jsou fosforečné estery heteroglykosidů,

31

2. AFM a významné biomolekuly zvaných nukleosidy, jejichţ cukernou část tvoří 2'-deoxyribosa a necukernou sloţku dusíkatá báze (A-adenin, G-guanin, C-cytozin, T-tymin). Sekvence nukleotidů se nazývá primární struktura, a právě tato struktura kóduje genetickou informaci organismu [17]. Na obr. 11 je znázorněno základní schéma nejčastější podoby prostorové - tzn. sekundární struktury DNA - dvoušroubovice. Charakteristické rysy a vlastnosti této struktury jsou následující:

-

Dva polydeoxyribonukleotidové řetězce obtáčejí osu dvoušroubovice.

-

Oba řetězce jsou navzájem komplementární (párování bází: A = T, C ≡ G).

-

Jeden závit dvoušroubovice je tvořen z 10,5 párů bází (10,5 bp), tj. úsek o délce 3,4 nm. Vzdálenost mezi dvěma páry bází je 0,34 nm. Páry se vytváří uvnitř dvoušroubovice a jsou tedy orientovány dovnitř, kdeţto vnější část tvoří opornou strukturu DNA neboli páteř DNA [16].

-

Fosfátové zbytky páteře nesou záporné náboje, které umoţňují poutat elektrostatickými silami kladně nabité ionty kovů (obvykle Mg 2+) nebo protonované skupiny polyaminů a silně bazických bílkovin za vzniku nukleoproteinových komplexů [17].

-

Největší vzdálenost osy dvoušroubovice od páteře DNA je 1 nm.

-

Oba komplementární řetězce jsou antiparalelní - liší se směrem fosfodiesterové vazby.

-

Vzhled dvoušroubovice není hladký, ale vyznačuje se dvěma ţlábky různé šířky a hloubky, z důvodu posunutí párů bází od osy dvoušroubovice o určitou

vzdálenost.

Spojnice

mezi

komplementárními

nukleotidy

neprochází touto osou. -

Větší ţlábek je široký 1,2 nm, menší ţlábek 0,6 nm. Oba se vyznačují přítomností atomů schopných tvořit vodíkové vazby s proteiny, větší ţlábek ve větší míře.

-

Dvoušroubovicové vinutí můţe být pravotočivé nebo levotočivé.

32

2. AFM a významné biomolekuly

Obr. 11: Schéma dvoušroubovicové DNA [16].

Dvoušroubovice se často stáčejí do šroubovic vyšších řádů tvořících terciální strukturu, která se označuje jako nadšroubovice (superhelix) [16]. O kvarterní struktuře se hovoří pouze u nukleoproteinových komplexů (chromatin, ribozomy, částice virů) [17].

2.2 Proteiny Protein je makromolekula sloţená z jednoho nebo více polypeptidových řetězců.

Polypeptidy

jsou

v podstatě

heteropolymery,

jejichţ

monomery

-

aminokyseliny jsou spojené do lineárního sledu peptidovými vazbami. Pořadí jednotlivých aminokyselin v polypeptidu se označuje jako aminokyselinová sekvence, která určuje tzv. primární strukturu proteinu. Veškeré informace, které jsou potřebné pro tvorbu vyšších struktur (sekundární, terciální a kvarterní), jsou obsaţené právě v primární struktuře. Sekundární strukturou se rozumí uspořádání polypeptidových řetězců do α-helixu nebo β-skládaného listu. Tyto sekundární struktury vznikají sbalováním proteinu.

-

α-helix (α-šroubovice) - peptidová páteř se stáčí do šroubovice (obr. 12), z níţ vyčnívají postranní řetězce aminokyselin, které zcela určují hydrofilní a hydrofobní vlastnosti helixu. Na tvorbě se podílí všechny aminokyseliny vyjma prolinu (místo -NH2 skupiny má iminoskupinu NH).

33

2. AFM a významné biomolekuly polypeptidová páteř

vodíková vazba kovalentní vazba atomů

Obr. 12: α-helix [16]. -

β-struktura (β-skládaný list) - uspořádání proteinu spočívá v tom, ţe jednotlivé úseky aminokyselin (5-10) téhoţ polypeptidového řetězce jsou poloţeny vedle sebe a spojeny vodíkovými vazbami mezi CO- a NHskupinami a zbytky aminokyselin vyčnívají kolmo k rovině listu (obr. 13) [16].

Obr. 13: β-skládaný list [16]. Celková konformace polypeptidového řetězce a jeho tvar jsou dány terciální strukturou, která je výsledkem interakcí mezi jednotlivými úseky v sekundární struktuře. Ve fixaci struktury se uplatňují hydrofobní a elektrostatické interakce a v neposlední řadě i disulfidické vazby [17]. Hlavním důvodem tvorby terciální struktury je různorodost aminokyselinových postranních skupin, které jsou schopny tvořit nekovalentní vazby s jinými skupinami v energeticky výhodném tvaru. Podle terciální struktury se proteiny dělí na:

34

2. AFM a významné biomolekuly -

globulární - střídají se zde α-helixy a β-struktury s jinými segmenty proteinu tak, ţe výsledkem je kompaktní klubko kulovitého tvaru.

-

fibrilární - převaţují segmenty typu α-helix nebo β-struktury [16].

Většina globulárních bílkovin jsou oligomery tvořené z podjednotek, které mohou být identické nebo různé a vytváří tzv. kvartérní strukturu proteinu. V oligomeru se na vytvoření všech úrovní konformace podílí hydrofobní interakce, vodíkové vazby, elektrostatické interakce, van der Waalsovy síly a kovalentní a disulfidické vazby. Vytvoření kvartérní struktury umoţňuje vznik nových potřebných vlastností proteinu. Příkladem proteinu s mimořádnou strukturou jsou například bílkoviny krevního séra imunoglobuliny [17].

2.2.1 Rozpoznávací funkce proteinů Pod pojmem rozpoznávání se v souvislosti s proteiny rozumí proces specifického

spojení

dvou

biologických

makromolekul,

případně

biologické

makromolekuly s malou molekulou, které vychází z nekovalentní interakce. Zvláště důleţité jsou vodíkové vazby. V podstatě je rozpoznávání základem funkce proteinů jako enzymů vázajících substráty, receptorů hormony, imunoglobulinů antigeny. Dále se také rozpoznávání uplatňuje při výstavbě buněčných struktur, kde se proteiny musí navzájem pospojovat v souladu s architekturou stavěné struktury. Z biologického hlediska je zvláště významné rozpoznávání nukleových kyselin s proteiny.

2.2.2 Vazebné interakce proteinů s DNA V podstatě se dají interakce proteinů s DNA rozdělit na sekvenčně specifické a sekvenčně nespecifické. Při specifických interakcích se uplatňují zejména vodíkové vazby a solné můstky se zbytky bází v malém a velkém ţlábku dvoušroubovice. U nespecifických interakcí se obecně jedná o interakce s cukrfosfátovým řetězcem. V přenosu genetické informace však sehrává významnou úlohu především vazba na specifické úseky DNA, coţ jsou hlavně tzv. regulační oblasti. Ve chvíli, kdy se určitý specifický protein naváţe na tuto regulační oblast (většinou se jedná o promotor nebo operátor), aktivuje nebo naopak zastaví molekulární děj, který je touto oblastí řízen (např. transkripci genů). Většina proteinů specificky se vázajících na DNA, vyuţívá

35

3. Vybrané modifikace nosičů k vazbě interakci α-helixů s větším ţlábkem. Hlavním důvodem je tvar a rozměr αhelixů umoţňující snadné zapadnutí do většího ţlábku. Významnou roli zde ale hrají nukleotidové sekvence ve vazebném místě pro protein a jim odpovídající sekvence aminokyselin v místě, ve kterém se protein váţe k DNA. Přestoţe dochází k některým interakcím i v menším ţlábku, větší ţlábek je nejlépe rozpoznávaným místem v DNA. Je to dáno jeho velikostí, která je přístupnější a poskytuje více moţností pro tvorbu interakcí proteinů s bázemi DNA ve formě vodíkových vazeb a hydrofobních interakcí. Asi polovina vodíkových vazeb zahrnutých do kontaktu proteinů s DNA se týká interakcí s cukrfosfátovou páteří DNA. K tvorbě těchto interakcí se ve většině případů pouţívá kyslík z fosfodiesterových vazeb. Hlavní význam vazby s páteří DNA spočívá v tom, ţe se jimi upravuje pozice rozpoznávajících proteinů vhledem k bázím [16].

3.

Vybrané modifikace nosičů Pro zobrazování biomolekul prostřednictvím AFM byly postupně vyvinuty

různé metody jejich imobilizace na rovný povrch. Obecně se nejčastěji vychází z fyzikálního připoutání molekul - adsorpce, nebo z chemického navázání nebo zesítění molekul k povrchu nosiče. V některých případech je nutné pro imobilizaci molekul na substrát provést jeho modifikaci a zvýšit tak fixaci zkoumaného vzorku [8]. V následujících kapitolách jsou vysvětleny základní techniky umoţňující imobilizaci DNA a proteinů na nosiče.

3.1 I mobilizace DNA Imobilizace vzorku je klíčovým krokem v zobrazování molekul DNA prostřednictvím AFM. Mezi nosiče, které se nejčastěji pouţívají pro imobilizaci DNA, patří slída (speciálně Muskovit). Čerstvě očištěná (naštípaná) slída s pouţitím lepicí pásky nebo ţiletky je okamţitě připravená k modifikaci a pouţití. Po procesu čištění se totiţ získá atomárně rovný povrch o tloušťce několika mikronů [18]. Povrch slídy (na obr. 14), jak jiţ bylo řečeno v kapitole 1.3.7, je ovšem vysoce hydrofilní a při fyziologickém pH záporně nabitý [15]. Tato skutečnost je způsobená přítomností hydroxylových skupin, které se nacházejí ve vzdálenosti 0,5 nm pod povrchem slídy. Spojnici mezi hydroxylovými skupinami tvoří draselné kationty, které v podstatě spojují jednotlivé vrstvy slídy [19]. Situaci komplikuje základní vlastnost DNA, ta nese díky

36

3. Vybrané modifikace nosičů fosfátovým zbytkům v cukrfosfátové páteři také záporný náboj. Většina imobilizačních technik je proto zaloţena na tvorbě kladného náboje na povrchu nosiče, coţ následně umoţní poutat DNA elektrostatickými silami. Nejčastěji se pro zavedení kladného náboje pouţívají dvojmocné ionty a různé metody modifikace povrchu slídy silanizací [18].

Obr. 14: Povrch slídy [18].

3.1.1 Dvojmocné ionty Při vystavení slídy působení vodného roztoku s dvojmocnými ionty, nejčastěji Mg2+, slída podstoupí proces iontové výměny, při které jsou ionty draselné obsaţené na povrchu slídy nahrazeny ionty hořečnatými. Tzn., ţe dvojmocné ionty, které mají valenci +2 mohou nahradit ionty draselné s valencí +1 a vytvářet tak vazbu mezi záporně nabitou slídou a zápornými fosfátovými skupinami DNA. Tímto způsobem je DNA připoutána elektrostatickými silami na povrch slídy. Později bylo zjištěno, ţe slída nemusí být pro dostačující elektrostatickou interakci s DNA nejprve upravována působením dvojmocných iontů. Pro silnou vazbu postačuje přidání dvojmocných iontů přímo do pufru, ve kterém je obsaţena i DNA určená k imobilizaci na slídu [19]. Mezi další dvojmocné ionty, které se pro vazbu DNA pouţívají, patří ionty Ni2+, Co2+ a Zn2+. Obecně jsou právě tyto ionty nejvhodnější pro fixaci DNA na povrch slídy, neboť je jejich vazba dostatečně silná i pro měření v kapalině. Vazba pomocí Mg2+ je slabší a proto se pouţívá pouze pro měření v suchém stavu [20]. Důvodem slabší vazby Mg2+ je jeho veliký iontový poloměr. Efektivita vazby DNA na slídu totiţ nezávisí jen na její dostatečné koncentraci, ale i na velikosti iontového poloměru. Z toho vyplývá, ţe se zvyšující se hodnotou iontového poloměru slábne vazba iontů k DNA [19]. Praktickou komplikací při pouţití dvojmocných kationtů je fakt, ţe dvojmocné ionty způsobují nejen zachycení řetězců DNA k podloţní vrstvě slídy, ale také spojování řetězců do větších celků. Částečným řešením je předběţná úprava povrchu slídy roztokem dvojmocného iontu, takto upravený povrch pak váţe DNA. Pouţití dvojmocných iontů se ale v odborných studiích z poslední doby téměř nevyskytuje.

37

3. Vybrané modifikace nosičů

3.1.2 Silanizace Z chemického hlediska se jedná o proces, který umoţňuje kovalentní imobilizaci biomolekul na povrch nosiče. V podstatě umoţňuje aktivaci povrchu slídy kontaktní vrstvou silanu s vhodnou reaktivní skupinou X. Vyuţívají se méně reaktivní alkoxyderiváty silanů, které ponechávají volné skupiny k vazbě biomolekul [21]. Nejběţněji se pouţívají sloučeniny znázorněné na obr. 15.

3-aminopropyltriethoxysilan (APTES)

3-aminopropyldimethylethoxysilan (APDMES)

3-glycidoxypropyltriethoxysilan (GOPS)

1-(3-aminopropyl)silatran (APS)

Obr. 15: Významné alkoxyderiváty silanů [22]. Účinkem těchto sloučenin vznikají na povrchu nosiče tenké molekulární vrstvičky tvořené z aminoskupin nebo reaktivních oxiranových zbytků. Nanášení na povrch se provádí silanizací z organické fáze, kdy se daný povrch refluxuje několik hodin v roztoku silanu v organickém rozpouštědle. Druhou variantou je nanášení vrstev z vodné fáze, které se provádí krátkou hydratací povrchu povařením ve vodě. V tomto případě je vazebná kapacita menší, ale vrstva je stabilnější při pouţití ve vodném prostředí. Nejjednodušší a zároveň nejčastěji pouţívanou metodou nanášení reaktivních zbytků na povrch nosiče je třetí moţnost - tzv. odpařovací nanesení, při kterém se povrch inkubuje 1 aţ 2 hodiny nejčastěji v exsikátoru obsahujícím páry daného silanu [21]. 38


Slída-APTES Metoda modifikace slídy pomocí APTES, někdy nazývaná jako AP-slída (APaminopropyl), byla prvotně vyvinuta k zobrazování komplexů DNA-protein, dnes se ale hojně vyuţívá i pro samotnou DNA. Reakce s APTES je schematicky znázorněna na obr. 16 a vede ke kovalentnímu uchycení aminopropylových skupin, které jsou kladně nabité díky protonaci aminoskupin, na povrch slídy [18].

slída

APTES

AP-slída

ethanol

Obr. 16: Modifikace slídy pomocí APTES [18]. Tyto aminoskupiny mají pKa cca 10,6 a přestoţe se nahromadění aminoskupin na povrchu AP-slídy s klesajícím pH sniţuje, je povrch v roztoku při neutrálním pH stále kladně nabitý. Tento princip je klíčový pro uchycení DNA [22], která se váţe na povrch

AP-slídy

v důsledku

elektrostatických

interakcí

mezi

protonovanými

aminoskupinami APTES a záporným nábojem své cukrfosfátové páteře [18] Pokud je ţádoucí dosáhnout monovrstvy pouţívá se speciální sloučenina 3aminopropyldimethylethoxysilanu (APDMES), který nemůţe vytvářet boční kříţové vazby a sloţitější struktury označované pojmem self-polymerizace (4 aţ 5 vrstev silanu) v přítomnosti vody, jejichţ příklady jsou znázorněny na obr. 17. Silanizace je tedy velmi citlivá na

reakční podmínky a je lépe ji provádět v parách nad sušidlem, aby nedocházelo k porušení topografie vzorku vlivem vodních par [15, 23].

Obr. 17: Neţádoucí reakce APTES s povrchem slídy [23].

39


Slída-APDMES Modifikace slídy prostřednictvím APDMES je v principu shodná s metodou předcházející, schematicky je znázorněna na obr. 18.

slída

APDMES

AP-slída

ethanol

Obr. 18: Modifikace slídy pomocí APDMES [18]. Jelikoţ má APDMES pouze jednu alkoxyskupinu je jeho pouţití oproti APTES výhodnější z důvodu jiţ zmíněné neschopnosti tvořit kříţové vazby. Jeho vyuţití je ale vhodné navíc s organickým katalyzátorem. APDMES se totiţ váţe vodíkovými vazbami s hydroxylovými skupinami na povrchu slídy oběma konci své molekuly - jak ethoxyskupinou, tak aminopropylovou skupinou. V průběhu silanizace se mnoţství silanu spojeného s povrchem slídy přes Si-O-Si vazbu zvyšuje primárně vodíkovou vazbou ethoxyskupiny s hydroxylovou skupinou povrchu. Aminopropylové skupiny silanu jsou sice méně reaktivní, ale v podstatě blokují povrch a tím i znemoţňují ţádoucí vazbu. Pro rychlejší a kvantitativnější průběh silanizce se proto pouţívá bazická katalýza. Tato katalýza vede ke zvýšení počtu vazebných aminopropylových skupin vyčnívajících z povrchu (obr. 19). Pro praktické provádění se pouţívají silně bazické terciární aminy, nejčastěji triethylamin (pKa ~ 10,8), jeho vazba slouţí ke dvěma základním účelům. Za prvé se jedná o silnější bázi neţ je propylamin, a proto můţe potenciálně blokovat vazbu aminopropylové skupiny silanu tím, ţe se váţe silněji. Za druhé triethylamin katalyzuje reakci ethoxyskupiny silanu na povrch slídy [23].

Obr. 19: Modifikace slídy APDMES a triethylaminem v parách [23].

40


Slída-GOPS Další

variantou

silanizace

je

modifikace

slídy

3-

glycidoxypropyltriethoxysilanem (GOPS), princip je shodný s předcházejícími typy silanizace. Výjimkou je pouze tvorba oxiranových zbytků na povrchu slídy vázající záporně nabitou DNA, namísto aminoskupin. Schematicky je reakce znázorněna na obr. 20.

slída

slída-GOPS

GOPS

ethanol

Obr. 20: Modifikace slídy pomocí GOPS [18, 22].

Slída-APS Kovalentní vazbu vytváří s povrchem slídy také alternativa alkoxysilanů, tzv. 1-(3-aminopropyl)silatran (APS). Reakce se slídou je znázorněna na obr. 21. Výhodou je jeho malá reaktivita a extrémní odolnost vůči polymeraci povrchu při neutrálním pH, na rozdíl od APTES. Nevýhodou je, ţe APS není komerčně dostupný [18]. Je však moţné ji připravit reakcí APTES s triethanolaminem (zahřívání za přítomnosti katalytického mnoţství kovového sodíku), nadbytek reaktantů je posléze odstraněn vakuovou evaporací [24].

H2 O

slída

APS

slída-APS

Obr. 21: Modifikace slídy pomocí APS [18].

3.1.3 Poly-L-lysin Poly-L-lysin je pozitivně nabitý polymer (obr. 22), který se velmi dobře adsorbuje na povrch záporně nabitého skla nebo slídy a tím umoţňuje tvorbu kladně nabité vrstvy. Tento princip umoţňuje velmi silnou vazbu poly-L-lisinu se záporně nabitou molekulou DNA [25]. Nevýhodou je ovšem tvorba kondenzátů molekul DNA na povrchu nosiče, proto se tato metoda pouţívá méně [20]. 41

3. Vybrané modifikace nosičů NH 2 H

NH CH2 CH2 CH2 CH2 CH CO

OH n

Obr. 22: Struktura Poly-L-lysinu.

3.1.4 Ostatní modifikace Pro imobilizaci DNA a jejich komplexů se kromě slídy pouţívá nejčastěji HOPG nebo zlaté vrstvy. Oba tyto nosiče jsou spíše inertní a potřebují další chemickou aktivaci. Zlaté nosiče bývají nejčastěji modifikovány organickými thioly nebo bifunkčními disulfidy, které zvyšují jeho afinitu. Nukleové kyseliny jsou pak kovalentně vázány na modifikovaný povrch. Atraktivní vlastností HOPG i zlatých vrstev je vodivost, coţ umoţňuje pouţití i mino AFM, tj. pro STM či SEM (skenovací elektronová mikroskopie). HOPG má stejně jako slída několik rovin, nicméně strukturální nedostatky a jeho jemná struktura i po jeho očištění připomíná strukturu očekávané DNA, a tak mohou být výsledné obrazy občas zavádějící. Jelikoţ je HOPG hydrofobní nosič, je zobrazování hydrofilních vzorků včetně DNA poněkud komplikované a spočívá v modifikaci povrchu thioly, které zvyšují stejně jako u zlatých vrstev afinitu nosiče k DNA. Nedávno byla navrţena metoda modifikace HOPG zaloţená na vyuţití tzv. grafitového modifikačního činidla sloţeného z dvojic uhlovodík-peptid, kde se na jednom konci nachází aminoskupina: (CH2)n(NCRH2CO)m-NH2. Aplikace tohoto činidla na hydrofobní povrch HOPG způsobí vznik tenké vrstvy kladně nabitého polymeru, který umoţňuje silnou vazbu s DNA [18].

3.2

Imobilizace proteinů Imobilizace proteinů na povrch nosiče je komplikovaný proces, který zahrnuje

různě sloţité interakce mezi všemi sloţkami, tzn. včetně povrchu nosiče, proteinu, pufru a jiných přítomných rozpuštěných látek. Tyto interakce jsou jak intramolekulární vodíkové vazby, hydrofobní interakce, tak intermolekulární - elektrostatické interakce a iontové vazby. Všechny přítomné síly přispívají k poklesu Gibbsovy energie potřebné k adsorpci proteinů na nosič [26]. Z hlediska imobilizace proteinů je důleţitá zejména základní charakteristická vlastnost jejich stavebních jednotek - aminokyselin. Molekuly aminokyselin mají dipolární charakter, takţe se v závislosti na pH prostředí mohou chovat jako kyseliny 42

3. Vybrané modifikace nosičů nebo zásady (obr. 23). Látky, které mohou reagovat jako anionty v silně zásaditém prostředí a jako kationty v silně kyselém prostředí se označují jako amfolyty. Hodnota pH roztoku, ve kterém se daný amfolyt pohybuje nulovou rychlostí v elektrickém poli, tzn. hodnota pH, při které má amfolyt nulový náboj, se označuje jako izoelektrický bod (pI) [16]. Elektrické náboje proteinů hrají tedy významnou roli nejen při formování a stabilizaci konformace (elektrostatické interakce), ale jsou také zdrojem reaktivity bílkovin vůči okolí (elektrostatické interakce s okolními ionty a polárními látkami) [17]. Nosiče, které se pro imobilizaci pouţívají, musí být stejně jako u DNA atomárně rovné. Nejčastěji se pouţívá slída, popřípadě HOPG. Pro imobilizaci proteinu na vysoce hydrofilní slídu je důleţité zvolit vhodné pH pufru, ve kterém je daný protein připravován [15]. Obecně se při adsorpci proteinu na hydrofilní povrch uplatňují nejvíce hydrofobní interakce, ale při nízké iontové síle média se na vazbě proteinu s povrchem podílí elektrostatická interakce [27]. Jak jiţ bylo zmíněno, pH silně ovlivňuje konformaci proteinu a vazebnou sílu k nosiči. Pro dobrou imobilizaci proteinu k povrchu slídy platí, ţe se pH pufru s proteinem musí pohybovat v rozmezí pK slídy a pI proteinu: pK (slída) < pH < pI [15].

Obr. 23: Chování proteinů při rostoucím pH na slídě. V případě imobilizace proteinu na hydrofobní povrch HOPG nosiče se vychází ze dvou základních metod. Interakce můţe probíhat spontánní interakcí na povrch HOPG. Jedná se o nespecifický typ reakce, při kterém je důleţité, aby pH pufru bylo rovno pI proteinu [15]. Při tomto pH je totiţ konformace proteinu nejstabilnější a jeho vnitřní/vnější náboj je minimální [27]. Druhou variantou je jiţ specifická iontová interakce, která je umoţněna vytvořením náboje na povrchu HOPG nosiče. Nejčastěji se elektrochemicky na povrchu nosiče vytváří karboxylové skupiny, které jsou následně schopny svým záporným nábojem poutat proteiny [15].

43

4. Cíl diplomové práce

4. Cíl diplomové práce Hlavní cíl diplomové práce byl následující: Optimalizovat metody vhodné pro imobilizaci DNA, proteinů a komplexů DNA-protein na slídový povrch pomocí AFM mikroskopie. Vedle samotné imobilizace se také zaměřit na nastavení tohoto mikroskopu a měřících podmínek tak, aby byla umoţněna jejich reprodukovatelnost v dalším výzkumu, který se týká vizualizace poškozených částí DNA prostřednictvím specifické vazby DNA vazebného proteinu právě na tyto poškozené úseky v DNA molekule. Pro práci není důleţité zaměřit se na jeden určitý typ DNA a pracovat právě s jednou specifickou molekulou o určité délce a molekulové hmotnosti, ale obecně pomocí dostupných publikací a vědeckých prací vybrat a optimalizovat nejvhodnější postupy imobilizace, které budou v budoucnu nápomocné při jiţ zmiňovaném výzkumu.

44

5. Materiál a metody

II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5. Materiál a metody 5.1

Chemikálie, biologický a jiný materiál

Sigma-Aldrich, USA: -

chlorid kobaltnatý (CoCl2)

-

sodná sůl kyseliny deoxyribonukleové z tkáně telecího brzlíku - DNACT (10-15 mil. Da), vysoce polymerní DNA ve formě vláken obsahující jak ssDNA, tak dsDNA (převládá dsDNA)

-

3-(ethoxydimethylsilyl)propylamin (APDMES)

-

ethanolamin-hydrochlorid

-

triethoxy-(3-glycidyloxypropyl)-triethoxysilan (GOPS)

-

triethanolamin

-

sodík ve formě hroudy uchovávaný pod parafínovým olejem

Penta, ČR:

-

chlorid sodný (NaCl)

-

chlorid nikelnatý - hexahydrát (NiCl2·6H2O)

-

chlorid hořečnatý - hexahydrát (MgCl2·6H2O)

-

dihydrogenfosforečnan sodný - dihydrát (NaH2PO4·2H2O)

-

hydrogenfosforečnan disodný - dodekahydrát (Na2HPO4·12H2O)

-

hydroxid sodný (NaOH)

Fluka, Švýcarsko:

-

3-(2-aminoethylamino)propyltriethoxysilan (APTES)

-

triethylamin

45

5. Materiál a metody Carl Roth, Německo:

-

N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonová kyselina) (HEPES)

-

TRIS-hydrochlorid (TRIS-HCl)

-

dimethylsulfoxid (DMSO)

-

molekulové síto (aluminosilikát, Ø 1,6-2,5 mm)

-

ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA)

-

ethanol

EXBIO, ČR:

-

myší monoklonální protilátka IgG1 AL-01 se specifitou k lidskému sérovému albuminu (proteinu o molekulové hmotnosti 65-67 kDa), pI (8,0 - 9,4)

Protein a komplex poskytla Mgr. María Victoria Marini Palomeque, Ph.D. (LORD):

-

DNA vazebný protein: Srs2 helikasa (Saccharomyces cerevisiae, 103,2 kDa, pI 9,44)

-

komplexy DNA-protein: dsDNA na koncích s jednovláknovým přesahem - 49mer + 22mer DNA vazebný protein - helikasa Srs2

2SPI Supplies, USA: Slída Grade V-1 Muscovite (K2O·Al2O3·SiO2)

5.2

Přístrojové vybavení a software

-

analytické váhy

-

pH metr InoLab pH 730 se skleněnou kombinovanou elektrodou

-

jednostupňová vakuová rotační olejová pumpa (vakuum 10 Pa)

46


-

AFM mikroskop NTEGRA Vita - NT-MDT, Zelenograd, Rusko (obr. 24):

Ochranný kryt proti elektroakustickém u šumu

Obr. 24: AFM mikroskop NTEGRA Vita [28]. -

AFM sondy: ETALON (HA-NC), NT-MDT, Zelenograd, Rusko (obr. 25)

Obr. 25: AFM sonda - ETALON (HA-NC) [29]. charakteristika: materiál - dopovaný křemík rezonanční frekvence - 160-250 kHz délka kantileveru - 115 μm délka (výška) hrotu - 5 - 10 μm

-

AFM sondy: Super Sharp Silicon (SSS-NCHR-10), Nanosensors, Švýcarsko charakteristika: materiál - dopovaný křemík rezonanční frekvence - 204-497 kHz délka kantileveru - 125 μm délka (výška) hrotu - 10 μm

47

5. Materiál a metody softwarové ovládání AFM mikroskopu NTEGRA Vita a vyhodnocování AFM

-

snímků (3D, rastrové linky a detaily) programem: NOVA RC1 (1.0.26.1297) vyhodnocování topografických AFM snímků programem Gwyddion 2.27

-

Příprava pufrů a zásobních roztoků

5.3

Pufry

0,1 M fosfátový pufr (PB)

10 mM TRIS-HCl pufr

NaH2PO4·2H2O

7,80 g

Na2HPO4·12H2O

17,90 g

TRIS-HCl

0,79 g

- rozpuštěno

- rozpuštěno

- doplněno na objem 1000 ml dH2O


- pH upraveno na 6,8


10 mM TRIS-HCl, 15 mM NaCl

40 mM HEPES, 10 mM MgCl2 pufr

5 mM EDTA pufr TRIS-HCl

0,79 g

NaCl

0,44 g

EDTA

0,93 g

HEPES

0,48 g

MgCl2

0,10 g

- rozpuštěno

- rozpuštěno





Zásobní roztoky

1 mg·ml-1 DNACT

1 mg DNACT byl rozpuštěn v 1 ml dH2O, před pouţitím bylo nutno nechat roztok hydratovat na 24 hod v ledničce.

1 mM NiCl2·6H2O

11,85 mg NiCl2·6H2O bylo rozpuštěno v 50 ml dH2O

1 mM CoCl2

6,49 mg CoCl2 bylo rozpuštěno v 50 ml dH2O

1 mM MgCl2·6H2O

4,76 mg MgCl2·6H2O bylo rozpuštěno v 50 ml dH2O

48


Příprava a čištění slídového povrchu

5.4

Postup čištění slídového povrchu byl proveden u všech experimentů vţdy stejným způsobem (obr. 26):

1.

Slída ve tvaru disku o průměru 1,2 cm byla přenesena prostřednictvím pinzety na oboustrannou lepicí pásku přilepenou na pevném podkladu (laboratorním stole).

2.

Pomocí další lepicí pásky (uţ jednostranné) byly postupně odloupnuty 2 aţ 3 povrchové vrstvy slídy za účelem odstranění povrchových nečistot. Výsledkem byl atomárně rovný a hladký povrch.

3.

Následně byly ze slídy odstraněny poslední zbytky nečistot a makroskopických šupinek pistolí se stlačeným vzduchem (centrální rozvod stlačeného vzduchu, vzduch čištěný filtrací a sušený vymraţováním).

4.

V posledním kroku byla slída pomocí pinzety odlepena z oboustranné lepicí pásky a přenesena na Petriho misku, kde uţ byly prováděny příslušné imobilizace různých typů vzorků popsané v následujících kapitolách.

Obr. 26: Čištění slídového povrchu. 49


Modifikační a imobilizační postupy pro DNA

5.5

Všechny modifikační a následně imobilizační postupy byly provedeny okamţitě na čerstvě očištěný a atomárně rovný slídový povrch (postup přípravy slídy kapitola 5.4).

5.5.1 Slída / dvojmocné ionty / DNA Mg2+:

1.

Na střed čerstvě očištěné slídy bylo napipetováno 5 μl zásobního roztoku MgCl2 o 1 mM koncentraci.

2.

Slída byla následně v Petriho misce vloţena na 10 minut do chladničky k inkubaci

3.

Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto cca 1000 μl destilované vody a osušeno stlačeným vzduchem.

4.

Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v 1 mM roztoku MgCl2 na výslednou koncentraci 1 μg·ml-1.

5.

Takto připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 2 μl napipetován na střed slídy upravené Mg2+ kationty a umístěné v Petriho misce.

6.

Poté byla slída i s roztokem DNACT ponechána volně na vzduchu, dokud nedošlo k zaschnutí roztoku na jejím povrchu.

7.

Po zaschnutí roztoku DNACT byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto opět cca 1000 μl destilované vody.

8.

V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem.

9.

Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro měření AFM mikroskopem.

Ni2+/Co2+: V případě imobilizace DNACT na slídu pomocí dvojmocných iontů Ni2+ a Co2+ byl postup shodný a od modifikace povrchu pomocí Mg 2+ se lišil pouze v několika krocích.

50

5. Materiál a metody 1.

Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v 1 mM roztoku NiCl2 (v dalším experimentu v 1mM roztoku CoCl2) na výslednou koncentraci 1 μg·ml-1.

2.

Takto připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 2 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce.

3.

Poté byla slída i s roztokem DNACT v uzavřené Petriho misce vloţena na 10 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout).

4.

Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody.

5.

V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem.

6.

Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro měření AFM mikroskopem [20].

5.5.2 Slída / různé typy silanizace / DNA 3-(2-aminoethylamino)propyltriethoxysilan (APTES): Modifikace povrchu slídy pomocí APTES byla provedena vystavením slídy jeho parám, tzv. „vapour APTES“ metodou podle následujícího postupu:

1.

Čerstvě očištěná slída byla vloţena v otevřené Petriho misce do exsikátoru nad sušidlo.

2.

Následně bylo do exsikátoru vloţeno 25 μl APTES v otevřené mikrozkumavce (důleţité je aby byl APTES vţdy čerstvý).

3.

V dalším kroku byl exsikátor uzavřen a ponechán na 10 minut připojený ke zdroji vakua (vakuová rotační pumpa).

4.

Po uplynutí této doby byl přívod vakua uzavřen a slída byla ponechána na 2 hodiny v exsikátoru, kde byla vystavena působením par APTES.

5.

Posléze byly páry APTES z exsikátoru v digestoři pomalu vypuštěny a slída byla připravena po opláchnutí cca 1000 μl destilované vody k imobilizaci DNACT [18]. Imobilizace DNACT byla provedena po modifikaci slídy pomocí APTES

v parách vţdy stejným způsobem. Experiment byl uskutečněn následovně s ředěním 51

5. Materiál a metody zásobního roztoku DNACT buď v destilované vodě [30], v dalším pokusu v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru [31] a poslední variantou bylo ředění v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru [18]: 1. Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v destilované vodě (v dalším experimentu v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru a v poslední variantě v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1. 2. Takto připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 20 μl napipetován na střed čerstvě nasilanizované slídy pomocí APTES a umístěné v Petriho misce (roztok nesmí přesahovat přes okraj slídy). 3. Poté byla slída i s roztokem DNACT v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout). 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody. 5. V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro měření AFM mikroskopem.

3-(ethoxydimethylsilyl)propylamin (APDMES): Modifikace povrchu slídy pomocí APDMES byla realizována stejným způsobem jako v případě APTES, s rozdílem v postupu v bodě č. 2, kdy byla vloţena do exsikátoru mikrozkumavka s 25 μl APDMES namísto APTES. Samotná imobilizace DNACT byla provedena také stejným způsobem ředěním zásobního roztoku DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1.

3-(2-aminoethylamino)propyltriethoxysilan (APTES) a triethylamin: Modifikace povrchu slídy pomocí APTES za současné katalýzy triethylaminem byla opět prováděna tzv. „vapour APTES“ metodou v exsikátoru. Tento způsob se lišil od klasické „vapour APTES“ metody bez vyuţití triethylaminu také v bodě č. 2. V této fázi byla totiţ do exsikátoru, kde se jiţ nacházela v Petriho misce čerstvě očištěná slída, vedle

52

5. Materiál a metody otevřené mikrozkumavky s 25 μl APTES vloţena navíc i druhá mikrozkumavka s 25 μl triethylaminu. Další postup byl jiţ shodný [23].

Následná imobilizace DNACT byla provedena také stejným způsobem ředěním zásobního rozotku DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1. 3-(ethoxydimethylsilyl)propylamin (APDMES) a triethylamin: Modifikace povrchu slídy pomocí APDMES za současné katalýzy pomocí triethylaminu byla realizována stejným způsobem jako v případě APTES a triethylaminu v parách v exsikátoru. Rozdílnou částí byl opět bod č. 2, kdy b yla do exsikátoru vedle mikrozkumavky s 25 μl triethylaminu vloţena k čerstvě očištěné slídě mikrozkumavka s 25 μl APDMES namísto APTES. Další část postupu jiţ byla provedena shodně [23].

Na takto modifikovanou slídu byla imobilizována DNACT opět stejným způsobem. Nejprve ředěním zásobního roztoku DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1. V druhém experimentu byla DNACT naředěna ještě 10x ve stejném pufru - tzn. na koncentraci 0,5 μg·ml-1. Triethoxy-(3-glycidyloxypropyl)-triethoxysilan (GOPS) a triethylamin: Modifikace povrchu slídy pomocí GOPS za účasti triethylaminu byla opět provedena vystavením slídy parám tohoto silanu podle následujícího postupu: 1.

Čerstvě očištěná slída byla vloţena v otevřené Petriho misce do exsikátoru nad sušidlo.

2.

Následně bylo do exsikátoru vloţeno 25 μl GOPS v otevřené mikrozkumavce a v další mikrozkumavce 25 μl triethylaminu (důleţité je aby byl GOPS vţdy čerstvý).

3.

V dalším kroku byl exsikátor uzavřen a ponechán na 10 minut připojený ke zdroji vakua (vakuová rotační pumpa).

4.

Po uplynutí této doby byl přívod vakua uzavřen a slída byla ponechána na 2 hodiny v exsikátoru, kde byla vystavena působením par GOPS.

5.

Posléze byly páry GOPS z exsikátoru v digestoři pomalu vypuštěny a slída byla připravena po opláchnutí cca 1000 μl destilované vody k imobilizaci DNACT. 53

5. Materiál a metody Na takto modifikovanou slídu pomocí GOPS a triethylaminu byla imobilizována DNACT následujícím způsobem: 1. Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v 10 mM TRIS-HCl pufru na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1. 2. Připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 20 μl napipetován na střed čerstvě nasilanizované slídy pomocí GOPS a triethylaminu a umístěné v Petriho misce (roztok nesmí přesahovat přes okraj slídy). 3. Poté byla slída i s roztokem DNACT v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout). 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody. 5. V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro měření AFM mikroskopem.

5.5.3 Slída / ethanolamin-HCl / DNA Modifikace povrchu slídy byla provedena i za pomoci ethanolaminu rozpuštěném v dimethylsulfoxidu (DMSO) podle následujícího návodu: 1. 6,6 g ethanolamin-HCl bylo rozpuštěno ve 12 ml DMSO. Tato směs byla vloţena do kádinky, do které bylo navíc přidáno molekulové síto a čerstvě očištěná slída. 2. Kádinka se směsí byla následně ponořena do olejové lázně a zahřívána při 100°C přes noc. 3. Druhý den po ochlazení směsi na pokojovou teplotu byla slída pomocí pinzety ze směsi vytaţena a 3x střídavě opláchnuta v DMSO a ethanolu. 4. Poslední fázi přípravy povrchu na imobilizaci DNACT bylo osušení povrchu pomocí stlačeného vzduchu [32]. V další fází byla na povrch slídy imobilizována DNACT jiţ ověřeným způsobem shodným s minulými postupy: 54

5. Materiál a metody 1. Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci 0,5 μg·ml-1. 2. Takto připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 20 μl napipetován na střed čerstvě modifikované slídy pomocí ethanolamin-HCl a umístěné v Petriho misce (roztok nesmí přesahovat přes okraj slídy). 3. Poté byla slída i s roztokem DNACT v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout). 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody. 5. V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro měření AFM mikroskopem.

5.6

Pasivní imobilizace IgG1 a DNA vazebného proteinu Srs2 Imobilizace samotné protilátky IgG1 a proteinu Srs2 byla provedena pro oba

vzorky zvlášť pasivní adsorpcí na slídový povrch shodným způsobem: 1. Zásobní roztok IgG1 (případně Srs2) byl naředěn na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1 v PB pufru. 2. Takto připravený roztok byl následně v objemu 3 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce (roztok nesmí přesahovat přes okraj slídy). 3. Poté byla slída i s roztokem IgG1 (případně Srs2) v uzavřené Petriho misce vloţena na 5 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout). 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 5. V posledním kroku imobilizace IgG1 (případně Srs2) vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem [33].

55


5.7

Imobilizační postupy pro nespecifickou interakci mezi DNA a IgG1 Modifikace povrchu slídy pro následnou imobilizaci nespecifické interakce

mezi DNACT a IgG1 byla realizována pomocí silanizační techniky a v druhé variantě úpravou slídového povrchu ethanolaminem.

5.7.1 Slída / silanizace / DNA a IgG1 Silanizace povrchu slídy byla provedena pomocí APDMES za současné katalýzy triethylaminem v parách v exsikatoru postupem, který je podrobně popsán v kapitole 5.5.2. Následná imobilizace DNACT a IgG1 na slídu byla uskutečněna dvěma způsoby - postupně nebo v druhém případě rovnou ve směsi. a) Postupné nanášení: 1. Zásobní roztok DNACT o koncentraci 1 mg·ml-1 byl zředěn v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci 0,5 μg·ml-1. 2. Takto připravený naředěný roztok DNACT byl následně v objemu 5 μl napipetován na střed čerstvě modifikované slídy pomocí APDMES a triethylaminu umístěné v Petriho misce. 3. Poté byla slída i s roztokem DNACT v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky (nenechat roztok zaschnout). 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody. 5. V posledním kroku imobilizace DNACT vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem upravený vzorek byl připraven pro nanesení protilátky IgG1. 7. Zásobní roztok IgG1 (byl naředěn na výslednou koncentraci 5 μg·ml-1 v PB pufru. 8. Takto připravený roztok byl následně v objemu 5 μl napipetován na střed slídy s jiţ naimobilizovanou DNACT umístěné v Petriho misce. 9. Poté byla slída i s roztokem IgG1 v uzavřené Petriho misce vloţena na 10 minut k inkubaci do chladničky.

56

5. Materiál a metody 10. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 11. V posledním kroku imobilizace IgG1 vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 12. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem b) Nanášení přímo ve směsi: 1. Mikrozkumavka obsahující směs DNACT o koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) a IgG1 o koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v PB) byla vloţena k inkubaci do chladničky na 1 hodinu. 2. Posléze byl takto připravený roztok DNACT a IgG1 v objemu 5 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce. 3. Poté byla slída i s roztokem v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky. 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 5. V posledním kroku imobilizace vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem. 5.7.2 Slída / ethanolamin-HCl / DNA a IgG1 Modifikace povrchu slídy pomocí ethanolaminu byla provedena stejným způsobem jako v kapitole 5.5.3. Následná imobilizace DNACT a IgG1 na slídu byla poté uskutečněna dvěma způsoby - postupně nebo v druhém případě rovnou ve směsi. Obě metody byly realizovány shodným způsobem jako v kapitole předcházející - 5.7.1.

5.8

Imobilizační postupy pro specifickou interakci mezi DNA a Srs2 Imobilizace specifické interakce mezi DNACT a DNA vazebným proteinem

Srs2 byla realizována buď přímo na čerstvě očištěný slídový povrch bez jeho předchozí

57

5. Materiál a metody modifikace a v druhé variantě s vyuţitím uchycení DNA k povrchu pomocí dvojmocných iontů.

5.8.1 Slída / DNA a Srs2 V případě imobilizace DNACT a Srs2 na slídu bez modifikace povrchu se vycházelo z přímého nanesení této směsi podle následujícího postupu:

1. Mikrozkumavka obsahující směs DNACT o koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) a Srs2 o koncentraci 5 μg·ml-1; (ředěno v PB) byla vloţena k inkubaci do chladničky na 24 hodin. 2. Posléze byl takto připravený roztok DNACT a Srs2 v objemu 5 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce. 3. Poté byla slída i s roztokem v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky. 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 5. V posledním kroku imobilizace vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem

5.8.2 Slída / dvojmocné ionty / DNA a Srs2

Dalším způsobem imobilizace pro specifickou interakci mezi DNACT a proteinem Srs2 byla metoda vyuţívající uchycení DNA na slídový povrch prostřednictvím Ni2+ kationtů:

1. Mikrozkumavka obsahující směs DNACT o koncentraci 0,05 μg·ml-1 (ředěno v 1 mM roztoku NiCl2·6H2O) a Srs2 o koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v PB) byla vloţena k inkubaci do chladničky na 1 hodinu. 2. Posléze byl takto připravený roztok DNACT a Srs2 v objemu 5 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce.

58

5. Materiál a metody 3. Poté byla slída i s roztokem v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky. 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 5. V posledním kroku imobilizace vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem

5.9

Imobilizační postup pro komplex DNA-Srs2 Pro imobilizaci byly k dispozici 2 komplexy tvořené z DNA (s přesahem) a

DNA vazebného proteinu Srs2 lišící od sebe pouze koncentrací proteinu. Postup imobilizace byl následující:

1. Komplex 1: DNA-Srs2 o koncentraci DNA 4,5 nM a koncentraci Srs2 25 nM byl naředěn v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci proteinu Srs2 0,05 μg·ml-1. 2. Posléze byl takto připravený komplex DNA-Srs2 v objemu 5 μl napipetován na střed čerstvě očištěné slídy umístěné v Petriho misce. 3. Poté byla slída i s roztokem v uzavřené Petriho misce vloţena na 30 minut k inkubaci do chladničky. 4. Po uplynutí inkubační doby byla slída uchopena pinzetou a místo aplikace bylo opláchnuto 2 aţ 3x cca 1000 μl destilované vody 5. V posledním kroku imobilizace vzorku byl mokrý povrch slídy osušen pistolí se stlačeným vzduchem. 6. Tímto způsobem byl vzorek připraven pro měření AFM mikroskopem. Stejným způsobem byl připraven pro práci s AFM mikroskopem i komplex 2: DNA-Srs2 o koncentraci DNA 4,5 nM a koncentraci Srs2 50 nM. Komplex byl naředěn v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru na výslednou koncentraci proteinu Srs2 0,05 μg·ml-1 a dále byl postup shodný jako v případě komplexu 1.

59


5.10 Nastavení AFM mikroskopu NTEGRA Vita Základní nastavení mikroskopu AFM bylo provedeno pro všechny experimenty vţdy stejným způsobem v suchém atmosférickém měřícím prostředí podle následujícího postupu:

1.

Nejprve byla slída s příslušným imobilizovaným vzorkem umístěna na měřící základnu, přesněji na speciální podloţku s uzemňovacím svodem (obr. 27). Pro veškerá měření byla pouţita měřící hlava pro skenování vzorkem.

Obr. 27: Podloţka se zemnícím drátkem [28].

2.

V dalším kroku byla do drţáku skenovací hlavy vloţena pomocí pinzety AFM sonda (obr. 28).

Obr. 28: Umístění AFM sondy do drţáku na skenovací hlavě [28].

3.

Následně bylo provedeno ruční ladění laseru na měřící hlavě s vizualizací prostřednictvím pomocného mikroskopu tak, aby bylo dosaţeno maximálního odrazu paprsku od hrotu AFM sondy (obr. 29).

60


Obr. 29: Příklad obrazu odrazu laseru na pomocném mikroskopu [28].

4.

Dále bylo opět ručně provedeno nastavení obrazu laserového paprsku na střed fotodiody na měřící hlavě (obr. 30).

obraz laseru na středu fotodiody

maximální odraz laseru od hrotu

Obr. 30: Příklad vycentrovaného laserového paprsku [28].

5.

Po naladění laseru byla hlava pro skenování vzorkem umístěna na měřící základnu a vzorek byl manuálně posunut pomocným kolečkem na měřící základně ke hrotu ve vzdálenosti 0,5 aţ 1 mm.

6.

V poslední fázi přípravy AFM mikroskopu na měření bylo provedeno nasazení ochranného krytu proti elektroakustickému šumu na celou měřící základnu a poté aktivace antivibračního stolku.

7.

Takto byl mikroskop připraven na měření. Další obsluha byla provedena pouze za pomocí software NOVA RC1 (1.0.26.1297) na počítači.

61

5. Materiál a metody V případě měření AFM mikroskopie bylo nastavení základních podmínek pomocí software AFM mikroskopu realizováno následovně:

1.

Po správném nastavení pevných součástí AFM mikroskopu byl nejprve v příslušném programu NOVA RC1 (1.0.26.1297) zvolen typ měřícího reţimu - poklepový reţim (pouţívaný pro všechna měření) a nastavena automatická kalibrace stroje.

2.

V dalším kroku byla nastavena optimální hodnota rezonanční frekvence kantileveru - cca 250 kHz a jiné nutné parametry měření.

3.

Po tomto nastavení bylo zahájeno přibliţování kantileveru s hrotem k povrchu vzorku („landing“), jehoţ ukončení bylo sledováno prostřednictvím měřené veličiny MAG [nA] (relativní hodnota amplitudy kantileveru) v čase (obr. 31), která vycházela z přednastavených parametrů.

Obr. 31: Přistávání hrotu - křivka závislosti MAG vs. čas [28]. 4. Pro správné a kvalitní zobrazení povrchu vzorku bylo však nutno pro kaţdou nově pouţitou AFM sondu vypočítat a nastavit reálnou amplitudu kmitu kantileveru (odpovídá reálné velikosti objektu), která byla určena v reţimu AFM spektroskopie z křivky MAG [nA] vs. výška [nm] (obr. 32) a vţdy vypočítána podle vzorce: AMPreal [nm] = (dX /dY) · SetP, kde hodnota SetPointu [nA] odpovídala polovině hodnoty volné amplitudy oscilace kantileveru a byla zjištěna ze základních vlastností měření.

62

6. Výsledky a diskuze

tahem myší byla proloţena lineární část křivky

parametry lineární regrese pro výpočet

Obr. 32: AFM spektroskopie - křivka závislosti MAG na výšce [28]. 5. V další fázi nastavení jiţ bylo zahájeno samotné skenování vzorku, kde byly nastaveny individuální hodnoty, jako je rychlost skenování (0,35 aţ 0,7 Hz), velikost zobrazované oblasti (10 nm aţ 6 μm) a směr skenování [28]. 6. Posléze bylo v mateřském programu provedeno vyhodnocení a zpracování naměřených dat, jejichţ výsledky se podrobně zabývá kapitola 6. 7. Naměřená data získaná z AFM mikroskopu se v originále nenacházejí ve stavu rovnoběţném se skenovací rovinou (prohnutí snímku je způsobeno nelineárním průběhem závislosti prodlouţení piezočlenů na aplikovaném napětí), proto bylo u kaţdého snímku provedeno odečtení pozadí formou polynomální regrese 2. aţ 3. stupně. Snímky byly dále podle potřeby probarvovány vhodnou paletou barev a v konečné fázi byla získána podle potřeby např. topografie vzorku, 3D zobrazení povrchu, fázový profil, popřípadě profilové řezy jednotlivými rastrovými linkami.

6. Výsledky a diskuze Základem dobrých výsledků AFM mikroskopu byla u všech experimentů správným způsobem očištěná slída, která poté vytváří atomárně rovný a čistý povrch

63

6. Výsledky a diskuze vhodný pro následnou modifikaci a imobilizaci vzorků. Na AFM snímku topografie povrchu (obr. 33) je jiţ zobrazena čerstvě očištěná slída bez další modifikace. Pro zhodnocení její kvality byla pouţita efektivní hodnota statistické veličiny RMS (Root Mean Square) - tzn. střední kvadratické odchylky drsnosti povrchu. Ve výsledku tato hodnota drsnosti povrchu, která byla získána z AFM snímku nemodifikované slídy a vypočítaná samotným AFM programem z naměřených dat, dosahovala velikosti 0,08 nm. Výsledek RMS, kterého se podařilo dosáhnout je téměř srovnatelný s hodnotou RMS 0,07 nm dosaţené ve studii [33]. Z tohoto výsledku vyplývá, ţe je slídový povrch očištěný podle postupu popsaném v kapitole 5.4 tedy natolik rovný, aby mohl být pouţit pro imobilizaci tak malých molekul jako jsou proteiny, DNA nebo jejich komplexy a to navíc s dostatečným rozlišením na AFM mikroskopu.

Obr. 33: Topografie čerstvě očištěné nemodifikované slídy (6 x 6 μm).

6.1

AFM snímky DNA

6.1.1 DNA imobilizovaná přes dvojmocné ionty Mg2+ Z AFM snímku DNA (obr. 34b) imobilizované na slídový povrch v koncentraci 1 μg·ml-1 prostřednictvím kladného náboje Mg2+ je patrné, ţe interakce nebyla natolik silná, aby byla DNA udrţena na slídě v dostatečném mnoţství

64

6. Výsledky a diskuze odpovídající její nanesené koncentraci. Imobilizace DNA nebyla příliš zdařilá i přesto, ţe bylo měření provedeno pro jistotu silnější interakce ne přímo ředěním v 1mM roztoku MgCl2 a přímým nanesením na čerstvě očištěný slídový povrch, ale postupně aţ po předcházející modifikaci povrchu samotným roztokem 1 mM MgCl2·6H2O (obr. 34a) jako je to uvedeno ve studii [20]. Ve výsledku se tedy potvrdila úvaha o vlivu velikosti iontového poloměru na sílu vazebné interakce DNA vycházející ze studie [19]. Důvodem sníţené efektivity vazby DNA na slídu, tzn. slabé vazebné interakce je zřejmě velký iontový poloměr Mg2+, tzn., ţe čím je iontový poloměr větší, tím je vazba DNA slabší. Na povrchu navíc zůstaly kromě DNA i zbytky krystalků soli (některé vyznačeny na obr. 34b - krystalky soli jsou zde zřetelné jako bílé body), coţ je další nevýhoda imobilizace DNA přes tyto kationty. a)

b)

Obr. 34: Topografické snímky (1,4 x 1,4 μm); a) slídy modifikované 1 mM roztokem MgCl2·6H2O; b) slídy s imobilizovanou DNA (1 μg·ml-1) přes Mg2+ kationty.

65

6. Výsledky a diskuze Z topografických snímků byl pořízen i profilový řez rastrovou linkou AFM snímku (obr. 35a), díky kterému byl zjištěn přesný výškový profil DNA rozlišené na slídovém povrchu (osa z) i její parametry v 2D (osa x, y) z detailního topografického snímku (obr. 35b).

a)

b) 2,0049 nm 1,9560 nm

15 nm

Obr. 35: Určení velikosti rozlišení DNA při imobilizaci přes Mg2+; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

Z obr. 35 je patrné, ţe DNA dosáhla rozlišení v ose z - 1,96 nm a 2,00 nm, zatímco v osách x, y detailního topografického snímku bylo maximální rozlišení DNA v jejím průměru (průřezu) 15 nm. Důvodem takového rozdílu je nezávislost rozlišení AFM mikroskopu ve směru osy z na ostrosti hrotu, proto se tedy v profilovém řezu DNA blíţí zobrazenou velikostí reálné molekule. Co2+ a Ni2+

V případě imobilizace DNA o koncentraci 1 μg·ml-1 přímo ředěním v 1mM roztoku NiCl2 nebo CoCl2 bez předchozí modifikace povrchu byla potvrzena silná vazebná interakce stejně jako ve studii [20]. Výsledné AFM snímky imobilizované DNA (obr. 36) jsou, co do vazebné interakce u obou dvojmocných iontů v podstatě shodné. DNA se navázala lépe neţ u Mg2+ díky menšímu iontovému poloměru.

66


a)

b)

Obr. 36: Topografické snímky (1 x 1 μm); a) slídy s imobilizovanou DNA (1 μg·ml-1) přes Co2+ kationty; b) slídy s imobilizovanou DNA (1 μg·ml-1) přes Ni2+ kationty.

Na obr. 37 jsou zobrazeny výsledky profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku s imobilizovanou DNA přes Co 2+ kationty, kde DNA dosáhla v ose z maximální hodnoty pouze 1,61 nm, v tomto případě byla DNA zřejmě deformována silami hrotu, nebo při imobilizaci dochází k silnému přitaţení řetězce DNA k povrchu slídy a k jeho deformaci, proto je velikost menší. V osách x, y bylo maximální rozlišení průměru DNA z detailního topografického snímku 16,5 nm.

67

6. Výsledky a diskuze a)

b) 1,6137 nm 1,5159 nm

16,5 nm

Obr. 37: Určení velikosti rozlišení DNA při imobilizaci přes Co2+; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

V profilovém řezu rastrovou linkou AFM snímku s imobilizovanou DNA přes Ni2+ kationty na slídu DNA dosáhla v ose z maximální hodnoty pouze 1,51 nm, DNA byla i v tomto měření deformována silami hrotu. V osách x, y bylo maximální rozlišení průměru DNA z detailního topografického snímku 14,5 nm (obr. 38). Z detailního vyobrazení (obr. 38a) je navíc poměrně dobře zřetelný artefakt způsobený naštípnutým AFM hrotem – dvojitý, mírně rozostřený obraz DNA řetězce. Jiným vysvětlením by mohla být di- případně multimerizace DNA molekul působením dvojmocných iontů.

a)

b) 1,5159 nm 1,4181 nm 14,5 nm

Obr. 38: Určení velikosti rozlišení DNA při imobilizaci přes Ni2+; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

68


6.1.2 DNA imobilizovaná silanizačními technikami 3-(2-aminoethylamino)propyltriethoxysilan APTES Na obr. 39a a 39b je zobrazen AFM snímek silanizované slídy prostřednictvím tzv. „vapour“ APTES metody bez další imobilizace DNA popsané v kapitole 5.5.2. Tento výsledek se v mnohém neliší od AFM snímků s jiţ v další fázi imobilizovanou DNA v koncentraci 5 μg·ml-1 na silanizovaném slídovém povrchu s ředěním v destilované vodě [30] (obr. 40a), v dalším pokusu v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru [31] (obr. 40b) a poslední variantou bylo ředění v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru [18] (obr. 40c). Jelikoţ je právě tato metoda silanizace a následné imobilizace DNA ve všech dostupných publikacích nejpopulárnější pouze s obměnami pouţívaných pufrů a přináší dobré výsledky s pevnou vazebnou interakcí DNA a v našem případě se DNA na silanizovaném povrchu vyskytovala minimálně nebo vůbec, je vina přisuzována jiné šarţi pouţívaného APTES. Ve všech provedených experimentech došlo k tzv. self-polymerizaci APTES, kdy se na slídovém povrchu vytvořilo

několik

silanových

vrstev

vzniklých

kříţovými

vazbami

mezi

ethoxyskupinami APTES, které jiţ dále neumoţnili další vazbu samotné DNA, a to i přesto, ţe byla slída uchována po téměř celou dobu práce v exsikátoru, kde byla chráněna od vlhkosti způsobující tuto polymerizaci. Potvrdilo se tedy, ţe i minimální manipulace se silanizovanou slídou během aplikace vzorku na vzduchu, kde je vystavena působení vzdušné vlhkosti následně ruší AFM topografii zkoumaného povrchu DNA (kapitola 3.1.2). a)

Obr. 39a: Topografický snímek slídového povrchu silanizovaného metodou „vapour“ APTES (2 x 2 μm).

69


b)

Obr. 39b: Topografický snímek slídového povrchu silanizovaného metodou „vapour“ APTES u stejného vzorku (500 x 500 nm).

a)

b)

c)

Obr. 40: Topografické snímky slídového povrchu silanizovaného metodou „vapour“ APTES s následnou imobilizací DNA (5 μg·ml-1) v rozměrech (1 x 1 μm) a ředěnou; a) v destilované vodě; b) v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru; c) v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru.

70

6. Výsledky a diskuze 3-(ethoxydimethylsilyl)propylamin (APDMES): Silanizace slídového povrchu prostřednictvím par APDMES v exsikátoru opět vedla k spuštění self-polymerizace, a to přesto, ţe APDMES obsahuje pouze 1 ethoxyskupinu, proto u něj nedochází ke vzniku kříţových vazeb. Výsledné AFM topografické snímky povrchu pouze silanizovaného (obr. 41a) a povrchu jak upraveného silanizací tak následně imobilizovaného DNA (obr. 41b) v koncentraci 5 μg·ml-1 s ředěním v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru se opět liší minimálně. Pouţití tohoto pufru se zdálo podle výsledků silanizace pomocí APTES z AFM snímku na obr. 40b nejvhodnější, jelikoţ self-polymerizace zde byla v porovnání s ostatními pufry nejmenší. Při tomto typu silanizace zřejmě došlo k vazbě APDMES vodíkovými vazbami s hydroxylovými skupinami na povrchu slídy oběma konci své molekuly - jak ethoxyskupinou, tak aminopropylovou skupinou. Z čehoţ plyne neschopnost další vazby DNA. a)

b)

Obr. 41: Topografické snímky slídového povrchu (1 x 1 μm); a) silanizovaného pouze metodou „vapour“ APDMES; b) silanizovaného stejným způsobem s následnou imobilizací DNA (5 μg·ml-1) ředěnou v 10 mM TRIS-HCl/15 mM NaCl/5 mM EDTA pufru.

71

6. Výsledky a diskuze 3-(2-aminoethylamino)propyltriethoxysilan (APTES) a triethylamin Elegantním řešením předchozích neúspěchů bylo zařazení triethylaminu jako katalyzátoru do silanizačních technik. V případě silanizace s APTES za současné katalýzy triethylaminem, který se váţe na povrch slídy silněji naţ aminopropylové skupiny silanu a tím zvýší počet právě aminopropylových skupin vyčnívajících z povrchu slídy a umoţňujících vazbu s DNA, byly výsledné AFM snímky (obr. 42) opět rušeny probíhající self-polymerizací stejně jako ve studii [23]. V tomto případě jiţ byla DNA na povrchu slídy imobilizována ve větší míře (pro zvýraznění vyznačena šipkami na topografii - obr. 42a), ale i přesto neodpovídala vysoké koncentraci, ve které byla nanesena (5 μg·ml-1, ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru).

a)

b)

Obr. 42: AFM snímky téhoţ slídového povrchu (2,5 x 2,5 μm) silanizovaného pomocí APTES a triethylaminu s následnou imobilizací DNA o koncentraci 5 μg·ml-1, (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) ve formě; a) topografického snímku; b) fázového profilu pro zvýšení kontrastu (naznačeno místo polymerizace).

72

6. Výsledky a diskuze 3-(ethoxydimethylsilyl)propylamin (APDMES) a triethylamin

Z předešlého způsobu imobilizace DNA byla optimalizována metoda vyuţívající namísto APTES, který stále způsobuje i v přítomnosti triethylaminu selfpolymerizaci, APDMES. Stejně jako ve studii [23] bylo potvrzeno, ţe i v tomto případě hraje významnou roli mnoţství ethoxyskupin v silanu. APDMES, který má pouze jednu ethoxyskupinu se díky triethylaminu navázal na povrch způsobem, který umoţnil silnou vazebnou interakci s DNA. Silanizovaný povrch slídy pomocí této metody je zobrazen na topografickém AFM snímku na obr. 43a. DNA byla v tomto případě nanášena v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěna v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru), kde se potvrdila dobrá vazebná interakce vytvořením několika vrstev DNA na takto silanizovaném povrchu (obr. 43b a 43c).

a)

b)

c)

Obr. 43: Topografické AFM snímky téhoţ slídového povrchu silanizovaného pomocí APDMES a triethylaminu; a) bez imobilizované DNA (750 x 750 nm); b) s imobilizovanou DNA v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěna v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) (1,5 x 1,5 μm); c) detailní snímek téhoţ povrchu (1 x 1 μm).

73

6. Výsledky a diskuze Jelikoţ byly AFM snímky při tomto způsobu imobilizace DNA velmi zdařilé, byla pro získání ještě kvalitnějšího rozlišení povrchu, který se co nejvíce blíţí jeho reálnému obrazu, vypočítána a následně na AFM nastavena reálná amplituda kmitu kantileveru odpovídající reálné velikosti objektu (jednotky nm). Reálná amplituda kmitu kantileveru byla pro zvýšení kvality rozlišení zobrazované DNA určena v reţimu AFM spektroskopie z křivky MAG [nA] vs. výška [nm] (obr. 44) z určité vybrané oblasti slídového povrchu. Hodnota SetPointu [nA], která je pro výpočet také nutná byla zjištěna zpětně ze základního měřícího nastavení daného AFM snímku.

Obr. 44: Křivka MAG [nA] vs. výška [nm], která platí pro měření na obr. 45.

Z této křivky byla následně spočítána hodnota reálné amplitudy pomocí lineární regrese, kde dX = 80,3 nm, dY = 4,6 nA a SetPoint odpovídá hodnotě 2,2 nA.

AMPreal [nm] = (dX /dY) · SetP AMPreal = (80,3/ 4,6) · 2,2 AMPreal = 38,3 nm

74

6. Výsledky a diskuze AFM snímky s DNA imobilizovanou stejným způsobem přes APDMES (katalýza triethylaminem) a s potřebným naředěním na koncentraci 0,5 μg·ml-1 v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru jsou znázorněny na obr. 45. Jedná se o snímky, které byly pořízeny s reálnou amplitudou kmitu kantileveru 38,3 nm. a)

b)

Obr. 45: Topografické AFM snímky DNA imobilizované v koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) na slídovém povrchu silanizovaném pomocí APDMES a triethylaminu s reálnou amplitudou kmitu kantileveru 38,3 nm; a) (1 x 1 μm); b) (650 x 650 nm).

Na obr. 46 jsou zobrazeny výsledky profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku s imobilizovanou DNA přes APDMES a triethylamin při reálné amplitudě 38,3 nm, kde DNA dosáhla v ose z maximální hodnoty pouze 0,97 nm, v tomto případě byla DNA deformována silně silami hrotu, proto je velikost menší. V osách x, y bylo maximální rozlišení průměru DNA z detailního topografického snímku 17,1 nm. Vysoká hodnota amplitudy, která je výrazně v nepoměru k velikosti DNA v průřezu, vedla k viditelně špatnému (neostrému) zobrazení imobilizovaných řetězců DNA 75


a)

b) 0,9682 nm 0,9536 nm 17,1 nm

Obr. 46: Určení velikosti rozlišení DNA při imobilizaci přes APDMES a triethylamin při reálné amplitudě kantileveru 38,3 nm; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

Pro dosaţení opravdu vysokého rozlišení obrazu bylo třeba provést stejný krok v reţimu AFM spektroskopie několikrát, dokud nebyla hodnota reálné amplitudy v rozmezí 5-15 nm, toto rozmezí je doporučované ve studii uţivatelského manuálu AFM mikroskopu [34]. Na obr. 47 je znázorněna nově dosaţená křivka MAG [nA] vs. výška [nm], ze které byla vypočítána hodnota reálné amplitudy kmitu kantileveru 7,9 nm. Niţší hodnota amplitudy jiţ nebyla s pouţitým typem kantileveru dosaţitelná – usuzováno dle velikosti konkrétního píku v rezonančním spektru a šumu signálu.

Obr. 47: Křivka MAG [nA] vs. výška [nm], která platí pro měření na obr. 48.

76

6. Výsledky a diskuze Z rovnice lineární regrese byla následně spočítána hodnota reálné amplitudy, kde dX = 8,9 nm, dY = 225,8 pA a SetPoint odpovídá hodnotě 0,2 nA.

AMPreal [nm] = (dX /dY) · SetP AMPreal = (8,9/ 0,2258) · 0,2 AMPreal = 7,9 nm

AFM snímky DNA které byly pořízeny s vypočítanou reálnou amplitudou kmitu kantileveru 7,9 nm jsou znázorněny na obr. 48. Na první pohled je vidět velký rozdíl ve výsledném kontrastu a rozlišení oproti AFM snímkům (obr. 45) s reálnou ampitudou 38,3 nm.

a)

b)

Obr. 48: Topografické AFM snímky DNA imobilizované v koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) na slídovém povrchu silanizovaném pomocí APDMES a triethylaminu s reálnou amplitudou kmitu kantileveru 7,9 nm; a) (1 x 1 μm); b) (250 x 250 nm).

77

6. Výsledky a diskuze Na obr. 49 jsou potom zobrazeny výsledky profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku s imobilizovanou DNA přes APDMES a triethylamin při reálné amplitudě kmitu kantileveru 7,9 nm, kde DNA dosáhla v ose z maximální hodnoty pouze 1,24 nm, v tomto případě byla DNA deformována silami hrotu, proto je velikost menší. V osách x, y bylo maximální rozlišení průměru DNA z detailního topografického snímku 8,1 nm, coţ je velký rozdíl oproti předcházejícím měřením. a)

b)

1,2372 nm 1,0856 nm 8,1 nm

Obr. 49: Určení velikosti rozlišení DNA při imobilizaci přes APDMES a triethylamin při reálné amplitudě kantileveru 7,9 nm; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

Z těchto výsledků je patrný velký vliv velikosti reálné amplitudy kantileveru na výsledné rozlišení zobrazovaného vzorku pod AFM mikroskopem, a to zejména v osách x, y. Na obr. 50 jsou pro větší přehled znovu zobrazeny AFM snímky stejně připravovaného vzorku při dvou výrazně se lišících hodnotách amplitudy. a)

b)

Obr. 50: Topografické snímky DNA při imobilizaci přes APDMES a triethylamin (1 x 1 μm) při reálné amplitudě kantileveru; a) 7,9 nm; b) 38,3 nm.

78

6. Výsledky a diskuze Triethoxy-(3-glycidyloxypropyl)-triethoxysilan (GOPS) a triethylamin

Polymerizace, která byla největším problémem silanizačních technik proběhla i v případě modifikace slídového povrchu pomocí GOPS a triethylaminem parami v exsikátoru. Při tomto experimentu nebyla DNA na AFM mikroskopu zobrazena vůbec i přesto, ţe byl při reakci pouţit právě triethylamin a koncentrace DNA byla zvýšena na 5 μg·ml-1 (ředěno v 10 mM TRIS-HCl) stejně jako při modifikaci za vyuţití APTES a triethylaminu (zde k imobilizaci DNA došlo). Výsledné topografické AFM snímky jsou při dvou různých rozměrech skenovaného povrchu zobrazeny na obr. 51. Příčinou mohla být hydrolýza epoxidových skupin ve struktuře GOPS (podpořená přítomností silné báze) nebo naopak příliš silná vazba DNA při vzniku kovalentní vazby (vysoká reaktivita epoxidové skupiny) vedoucí ke vzniku kulovitých útvarů tvořených zdeformovaným DNA řetězcem.

a)

b)

Obr. 51: Topografické AFM snímky DNA imobilizované v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v 10 mM TRIS-HCl pufru) na slídovém povrchu silanizovaném pomocí GOPS a triethylaminu; a) (1 x 1 μm); b) (500 x 500 nm).

79


6.1.3 DNA imobilizovaná přes ethanolamin

Ačkoliv byl tento způsob modifikace slídy a následné imobilizace DNA pouţíván v odborné studii [32] pro modifikaci hrotu při měření silových křivek v silové spektroskopii, podařilo se metodu optimalizovat i pro vyuţití v AFM mikroskopii. Výsledné topografické AFM snímky s DNA naředěnou na výslednou koncentraci 0,5 μg·ml-1 v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru se nachází na obr. 52 a 53. I přesto, ţe byla

nanášená koncentrace DNA nízká a v ostatních případech se při této koncentraci nikdy nenavázalo na slídový povrch takové mnoţství DNA, vazebná interakce byla velmi silná, jak je patrné z obr. 52. Na obr. 53 je navíc opět dobře zřetelný artefakt způsobený naštípnutým AFM hrotem, tzn. dvojitý, mírně rozostřený obraz DNA řetězce a)

b)

Obr. 52: Topografické AFM snímky DNA imobilizované v koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) na slídovém povrchu modifikovaném ethanolaminem v rozměrech; a) (2 x 2 μm); b) (1 x 1 μm).

80


a)

b)

Obr. 53: Další topografické AFM snímky DNA imobilizované v koncentraci 0,5 μg·ml-1 (ředěno v 40 mM HEPES/10 mM MgCl2 pufru) na slídovém povrchu modifikovaném ethanolaminem v rozměrech; a) (500 x 500 nm); b) (500 x 500 nm).

6.2 AFM snímky protilátky IgG1 Výsledné topografické AFM snímky pasivní adsorpce monoklonální protilátky IgG1 na slídový povrch v koncentraci 5 μg·ml-1 ředěné v PB pufru (pH 6,8), a to bez potřeby předchozí modifikace povrchu, se nachází na obr. 54. Zachycení protilátky na povrch bylo zajištěno pouze díky vhodně zvolenému pH pufru stejně jako ve studii, ze které se při imobilizaci vycházelo [33].

81


a)

b)

Obr. 54: Topografické AFM snímky IgG1 imobilizované v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v 0,1 M PB) na slídovém povrchu pasivní adsorpcí v rozměrech; a) (1,4 x 1,4 μm); b) (500 x 500 nm).

Kromě topografických AFM snímků byla protilátka IgG1 zobrazena i v trojrozměrném reţimu, který vychází z upravené topografie AFM snímku (obr. 55). Z 3D profilu byla zjištěna přibliţná velikost protilátky v ose z, tj. cca 3 nm. Tato skutečnost byla následně potvrzena i prostřednictvím profilového řezu rastrovou linkou (obr. 56).

82


a)

b)

Obr. 55: AFM snímky IgG1 imobilizované v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v 0,1 M PB) na slídovém povrchu pasivní adsorpcí; a) topografie (250 x 250 nm); b) 3D zobrazení téhoţ povrchu (250 x 250 nm).

Na obr. 56 jsou zobrazeny výsledky profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku s pasivně imobilizovanou protilátkou IgG1 na slídovém povrchu, na kterém se dosáhlo maximálního rozlišení v ose z 2,98 nm. V tomto případě je hodnota velikosti IgG1 deformována při imobilizaci, kdy dochází k jejímu silnému přitaţení k povrchu slídy a proto je velikost menší. V osách x, y bylo maximální rozlišení v průměru IgG1 z detailního topografického snímku 17,7 nm, coţ velice dobře koreluje s velikostí zjištěnou pomocí rentgenové krystalografie (15 nm). a)

b) 2,983 nm

17,7 nm

Obr. 56: Určení velikosti rozlišení IgG1 při pasivní imobilizaci; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

83


6.3 AFM snímky proteinu Srs2 Výsledné topografické AFM snímky DNA vazebného proteinu Srs2 imobilizovaného na slídový povrch pasivní adsorpcí, tedy stejným způsobem jako v případě protilátky IgG1, v koncentraci 5 μg·ml-1 ředěného v PB pufru (pH 6,8) se nachází na obr. 57. Uchycení proteinu na povrch bylo zajištěno opět pouze díky vhodně zvolenému pH pufru stejně jako ve studii [33]. Zobrazovaný DNA vazebný protein, který se dále pouţíval i v komplexu DNA-protein je velikostně menší neţ samotná protilátka IgG1, proto jsou i výsledné rozměry proteinu získané ze stejného nastavení AFM mikroskopu cca o polovinu menší. a)

b)

Obr. 57: Topografické AFM snímky proteinu Srs2 imobilizovaného v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v 0,1 M PB) na slídovém povrchu pasivní adsorpcí v rozměrech; a) (1,4 x 1,4 μm); b) (500 x 500 nm).

84

6. Výsledky a diskuze Protein Srs2 byl zobrazen i v trojrozměrném reţimu, který vychází z upravené topografie AFM snímku (obr. 58). Z 3D profilu byla zjištěna přibliţná velikost proteinu v ose z, tj. cca 2,5 nm.

a)

b)

Obr. 58: AFM snímky proteinu Srs2 imobilizovaném v koncentraci 5 μg·ml-1 (ředěno v 0,1 M PB) na slídovém povrchu pasivní adsorpcí; a) topografie (250 x 250 nm); b) 3D zobrazení téhoţ povrchu (250 x 250 nm).

Na obr. 59 jsou potom zobrazeny výsledky profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku s pasivně imobilizovaným proteinem Srs2 na slídovém povrchu, na kterém se dosáhlo maximálního rozlišení v ose z 2,54 nm, v tomto případě je hodnota deformována silami hrotu. V osách x, y bylo maximální rozlišení v průměru Srs2 z detailního topografického snímku 9,5 nm. b)

a) 2,543 nm

9,5 nm

Obr. 59: Určení velikosti rozlišení Srs2 při pasivní imobilizaci; a) z profilového řezu rastrovou linkou AFM snímku; b) z detailního topografického snímku.

85


6.4 AFM snímky nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 6.4.1 DNA a IgG1 - imobilizace pomocí silanizace a) Postupné nanášení: Na obr. 60 se nachází AFM snímky z nespecifického testování vazby DNA (0,5 μg·ml-1) a protilátky IgG1 (5 μg·ml-1), která má vazebnou specifitu k lidskému sérovému albuminu. Imobilizace prováděná postupně, tzn., ţe byla nejprve nanesena DNA a poté protilátka, neposkytla očekávané výsledky, jejichţ cílem bylo zobrazit DNA a IgG1 současně na slídovém povrchu. Postupným nanášením byla DNA, která byla imobilizovaná na slídový povrch prostřednictvím silanizovaného povrchu APDMES (katalýza triethylaminem), zcela překryta vrstvou IgG1. Proto se na výsledných AFM snímcích podařilo zobrazit pouze protilátku. a)

b)

Obr. 60: Topografické AFM snímky z testování nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 na slídovém povrchu modifikovaném silanizací; a) (1 x 1 μm); b) (500 x 500 nm).

86

6. Výsledky a diskuze b) Nanášení přímo ve směsi V případě nanášení DNA a IgG1 ve stejných koncentracích jako při postupném nanášení byly výsledky téměř totoţné s předcházejícími, a to i kdyţ byly obě biomolekuly nanášeny na silanizovaný povrch současně. Výsledné AFM snímky (obr. 61) zobrazily pouze protilátku, coţ vypovídá o její vyšší vazebné síle k slídovému povrchu oproti DNA.

a)

b)

Obr. 61: Topografické AFM snímky z testování nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 na slídovém povrchu modifikovaném silanizací; a) (1 x 1 μm); b) (500 x 500 nm).

87


6.4.2 DNA a IgG1 - imobilizace pomocí ethanolaminu a) Postupné nanášení Stejně jako v kapitole 6.4.1, kde se nachází výsledky imobilizace DNA a IgG1 prostřednictvím silanizační modifikace povrchu, byla pro tuto vazebnou interakci vyuţita i druhá metoda imobilizace biomolekul - modifikace povrchu ethanolaminem, která poskytla při imobilizaci samotné DNA na slídový povrch velmi dobré výsledky. Ovšem i v tomto případě byly výsledky z postupného nanášení DNA a IgG1 na slídu špatné a neodpovídaly očekávání, kterým bylo současné zobrazení těchto biomolekul. Výsledné AFM snímky topografie se nachází na obr. 62.

a)

b)

Obr. 62: Topografické AFM snímky z testování nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 na slídovém povrchu modifikovaném ethanolaminem; a) (1 x 1 μm); b) (500 x 500 nm).

88

6. Výsledky a diskuze b) Nanášení přímo ve směsi Nanesení DNA a IgG1 přímo ve směsi na slídový povrch upravený modifikací ethanolaminem poskytlo jako jediné ze všech pokusů testování nespecifické interakce výsledek, při kterém byla současně na povrchu zobrazena DNA i protilátka IgG1. I přes úspěch metody bylo ovšem mnoţství nanesené DNA v kontrastu s koncentrací nanesené DNA minimální. Výsledné AFM snímky se nacházejí na obr. 63 (místo imobilizace DNA je vyznačeno šipkami). a)

b)

Obr. 63: Topografické AFM snímky z testování nespecifické interakce mezi DNA a IgG1 na slídovém povrchu modifikovaném ethanolaminem; a) (1,1 x 1,1 μm); b) (450 x 450 nm).

89


6.5 AFM snímky specifické interakce mezi DNA a Srs2 6.5.1 DNA a Srs2 - pasivní imobilizace Topografické AFM snímky pasivně imobilizované DNA a k ní specifickému DNA vazebnému proteinu Srs2 se nacházejí na obr. 64. I přesto, ţe byly obě biomolekuly smíchány a ponechány v koncentraci DNA 0,5 μg·ml-1 a koncentraci Srs2 5 μg·ml-1 na 24 hodin v chladničce s cílem vytvoření dostatečně pevného komplexu,

nedošlo k vytvoření očekávané vazby mezi DNA a proteinem, která by byla vidět pod AFM mikroskopem. Na výsledných AFM snímcích byl zobrazen pouze protein Srs2 bez DNA, který se na slídu navázal pasivní adsorpcí díky vhodně zvolenému pH. a)

b)

Obr. 64: Topografické AFM snímky z testování specifické interakce mezi DNA a Srs2 na slídovém povrchu; a) (1,4 x 1,4 μm); b) (500 x 500 nm).

90


6.5.2 DNA a Srs2 - imobilizace přes dvojmocné ionty

Ani v případě opačném, kdy byl povrch nejprve modifikován prostřednictvím kladného náboje Ni2+, na který měla být navázána DNA a na ni specificky protein Srs2, nedošlo k vytvoření vazby mezi DNA a proteinem, a to i přestoţe opět proběhla inkubace vytvořené směsi DNA a proteinu (tentokráte v koncentraci DNA i proteinu 10x sníţené) na 24 hodin v chladničce s cílem vytvoření co nejsilnější vazby mezi nimi. Výsledné AFM snímky se nacházejí na obr. 65 (oproti předchozím AFM snímkům v kapitole 6.5.1 se zdají být biomolekuly menší ve stejném rozlišení - důvodem je pouţití nového hrotu, který umoţnil vyšší kvalitu obrazu). a)

b)

Obr. 65: Topografické AFM snímky z testování specifické interakce mezi DNA a Srs2 na slídovém povrchu modifikovaném Ni2+ kationty; a) (1,4 x 1,4 μm); b) (500 x 500 nm).

91


6.6 AFM snímky komplexu DNA-Srs2 a) Komplex 1 Na obr. 66 se nachází AFM topografické snímky komplexu DNA-Srs2. Protein, který byl pro AFM mikroskopii vyuţit je shodný s DNA vazebným proteinem pouţívaným v předchozích aplikacích, DNA je ovšem v tomto případě kratší. V předchozích experimentech byla pouţívána DNA dlouhořetězcová, kdeţto komplex 1 i komplex 2 obsahuje DNA s přesahem (49 mer + 22mer; 71bp ~ 24,1 nm), proto je DNA v podstatě na nadcházejících AFM snímcích „zastíněna“ na ní specificky navázaným proteinem Srs2. Imobilizace byla provedena pasivní adsorpcí na slídový povrch prostřednictvím vhodně zvoleného pH pufru. a)

b)

Obr. 66: Topografické AFM snímky komplexu DNA-Srs2 na slídovém povrchu bez předchozí modifikace; a) (3 x 3 μm); b) (1,4 x 1,4 μm).

92

6. Výsledky a diskuze Na následujících AFM snímcích (obr. 67) jsou pro větší rozlišení jednotlivých částí komplexu 1 zobrazeny trojrozměrné obrazy, díky kterým jsou vidět jednotlivé molekuly proteinu Srs2 (na topografickém i 3D snímku jsou tyto molekuly naznačeny šipkami) navázaném na DNA. Z 3D zobrazení je také patrná přibliţná výška komplexu DNA-protein, která v tomto případě dosahuje na AFM mikroskopu maximální výšky v ose z cca 12 nm. Tato výška, která je několika násobně vyšší ve srovnání se samotným imobilizovaným proteinem (kapitola 6.3) jasně ukazuje, ţe se nejedná o samotný vazebný protein Srs2 imobilizovaný na slídovém povrchu. Ten totiţ dosahuje podle výsledků přibliţné velikosti 2,5 nm v ose z.

a)

b)

c)

d)

Obr. 67: AFM snímky komplexu DNA-protein imobilizovaném na slídovém povrchu pasivní adsorpcí; a) topografie (1000 x 1000 nm); b) 3D zobrazení téhoţ povrchu (1000 x 1000 nm); c) topografie (500 x 500 nm); d) 3D zobrazení téhoţ povrchu (500 x 500 nm).

93

6. Výsledky a diskuze b) Komplex 2

Na obr. 68 se opět nachází AFM topografické snímky komplexu DNA-Srs2. Toto měření se od předcházejícího lišilo pouze v koncentraci DNA pouţité v komplexu, jak je uvedeno v metodické části práce v kapitole 5.9. Výsledky byly shodné s předchozím případem. DNA byla i při tomto měření „zastíněna“ díky své malé velikosti specificky navázaným DNA vazebným proteinem Srs2.

a)

b)

Obr. 68: Topografické AFM snímky komplexu DNA-Srs2 na slídovém povrchu bez předchozí modifikace; a) (3 x 3 μm); b) (1,4 x 1,4 μm).

94

6. Výsledky a diskuze Na AFM snímcích na obr. 69 jsou pro větší rozlišení jednotlivých částí komplexu 2 zobrazeny trojrozměrné obrazy, díky kterým jsou vidět jednotlivé molekuly proteinu Srs2. Z 3D zobrazení byla také změřena přibliţná výška komplexu DNA-protein, která v tomto případě dosahuje v ose z cca 8 nm. Touto výškou se jako u předchozího případu potvrdilo, ţe se jedná o komplex DNA-protein, a ne o samotný protein. a)

c)

b)

d)

Obr. 69: AFM snímky komplexu DNA-protein imobilizovaném na slídovém povrchu pasivní adsorpcí; a) topografie (500 x 500 nm); b) 3D zobrazení téhoţ povrchu (500 x 500 nm); c) topografie (250 x 250 nm); d) 3D zobrazení téhoţ povrchu (250 x 250 nm).

Ve studii [35], ze které se při zobrazovaní komplexů DNA-protein 1 a 2 vycházelo, došlo k zachycení DNA vazebných proteinů pouze v některých místech molekuly DNA a to takovým způsobem, ţe šla zřetelně vidět a odlišit samotná DNA a na ní navázaný protein. Tohoto výsledku, jak jiţ bylo zmíněno a je patrno zejména z obr. 67 a 69, se tedy nepodařilo docílit. Hlavním důvodem je délka pouţívané DNA, která činí pouze 71 bp. Díky tomu se veškerý protein, který byl v komplexu obsaţen,

95

6. Výsledky a diskuze navázal na vazebná místa v molekule DNA a došlo k jiţ zmiňovanému „ zastínění“ DNA. Vedle délky samotné DNA hraje důleţitou roli při AFM mikroskopii také vhodně zvolený typ DNA vazebného proteinu, který se pro tento typ vazebné interakce zdá být nevhodným.

96

Souhrn

Souhrn Práce je zaměřena na optimalizaci metod vhodných pro imobilizaci DNA, proteinů a komplexů DNA-protein na slídový povrch. Slída pouţívána v experimentální části práce pro uchycení biomolekul má při fyziologickém pH ovšem stejně jako DNA záporný náboj, který tedy její následnou imobilizaci na tento nosič komplikuje. Problém byl vyřešen modifikací slídového povrchu zavedením kladného náboje ještě před samotnou imobilizací DNA. Pro tuto úpravu povrchu byly vyuţívány různé techniky. Ve výsledku se zdálo být nejvhodnější zavedení kladného náboje prostřednictvím dvojmocných iontů, kde se potvrdila závislost velikosti iontového poloměru pouţívaných sloučenin na síle vazebné interakce s DNA. Tzn. čím je iontový poloměr menší, tím je síla vytvořené vazby větší. Další úspěšnou technikou, která následně umoţnila pevnou vazbu DNA na slídu, byla aktivace povrchu silanizací. Tato metoda ovšem poskytla příznivé výsledky pouze při pouţití APDMES (3-aminopropyldimethylethoxysilan), který obsahuje pouze jednu alkoxyskupinu, a proto mezi sebou a dalšími molekulami nevytváří boční kříţové vazby, které by rušily celkovou topografii zobrazovaného povrchu. V tomto případě bylo úspěchu dosaţeno pouze za současného pouţití silné bazické katalýzy triethylaminem,

který

aminopropylových

umoţnil

skupin

zvýšení

vyčnívajících

počtu ze

pro

vazbu

slídového

DNA povrchu.

důleţitých Poslední

optimalizovanou technikou, která také umoţnila vytvoření silné vazebné interakce DNA, byla modifikace povrchu prostřednictvím ethanolaminu. V případě imobilizace proteinů, jejichţ celkový náboj má podle pH prostředí kladné nebo záporné hodnoty v závislosti na izoelektrickém bodu daného proteinu, byla potvrzena důleţitost pH pufrů pouţívaných při měření. Optimální bylo vyuţití pH pufru v rozmezí pKa slídy a izoelektrického bodu proteinu. Při nespecifické či specifické interakci DNA s proteinem, popřípadě při zobrazování komplexu DNA-protein se následně vycházelo z poznatků zjištěných při samotné imobilizaci jednotlivých biomolekul a byly vyuţity ty techniky modifikace povrchu, které poskytly silné vazebné interakce (tzn. modifikace pomocí Ni2+, silanizace s vyuţitím APDMES za současné katalýzy triethylaminem, modifikace povrchu ethanolaminem a pasivní imobilizace molekul). Kromě vhodné modifikace hrálo při celé optimalizaci velmi důleţitou roli také

samotné nastavení jednotlivých měřících parametrů AFM mikroskopu, zejména potom reálné amplitudy kmitu kantileveru. Její hodnota měla významný vliv na celkovou

97

Souhrn kvalitu a výsledné rozlišení zobrazovaných objektů, které se při jejím vhodném zvolení blíţily reálné velikosti biomolekul skenovaných AFM mikroskopem.

98

Summary

Summary The work is focused on the optimization of methods suitable for the immobilization of DNA, proteins and DNA-protein complexes on the mica surface. Mica is used in the experimental part of the work for attaching biomolecules at physiological pH has, however, as well as DNA negative charge. This makes direct immobilization of DNA on the surface difficult. The problem was solved by modifying the mica surface by introducing a positive charge alone before DNA immobilization. For this surface treatment different techniques were used. The most positive charge was obtained through the introduction of divalent ions, which confirmed the size dependence of the ionic radius of the compounds used in the binding strength of interaction with DNA. I.e., ionic radius generates the greater force created links. Silanization of surface was found to be another successful technique, which enabled the firm binding of DNA to mica. This method, however, gave positive results only when APDMES (3-aminopropyldimethylethoxysilane) containing only one alkoxy-group was used, and therefore does not produce lateral cross-linking, which would interfere with the overall topography of the displayed surface. Successful silanization process was achieved only in case, when strong basic catalysis of triethylamine was employed. This catalysis enables an increase in DNA binding aminopropyl groups situated on the mica surface. Last optimized technology enabling also enabled a strong DNA binding interactions with mica surface, was surface modification through the ethanolamine. pH of the buffer was found to be a key parameter for immobilization of proteins, as the total charge of protein molecule depends on isoelectric point. Use of the buffer of optimal pH in the range pak of mica and isoelectric point of protein was found to be essential for proper protein immobilization. The either nonspecific or specific interaction of DNA with protein and imaging DNA-protein complex is subsequently based on the findings identified in the immobilization of various biomolecules themselves and those findings were used for the surface modification techniques, which provided strong binding interactions with the mica surface (modifying the mica surface by introducing a positive charge Ni2+, silanization of surface by APDMES with strong basic catalysis of triethylamine, modifying surface by ethanolamin and pasive immobilization of molecules). In addition to appropriate modifications techniques optimization of the measuring setup and experimental parameters (especially real oscillation amplitude of

99

Summary cantilever) of the AFM microscope were found to visualization of immobilized biomolecules. visualization of immobilized biomolecules. Value of the amplitude had a significant impact on the overall quality of captured images and moreover the final resg resolution of objects (molecules) visualization is close to the real size of biomolecules.

100

Seznam použité literatury

Seznam pouţité literatury [1]

T. Prnka, K. Šperlink, Bionanotechnologie Nanobiotechnologie Nanomedicína, Repronis, Ostrava (2006), ISBN 80-7329-134-7.

[2]

H. K. Wickramasinghe, Progress in Scanning Probe Microscopy, Acta Materialia 48 (2000) 347-358.

[3]

L. Machala, M. Vůjtek, R. Kubínek a M. Mašláň, Mikroskopie skenující sondou, (2003) Univerzita Palackého Olomouc.

[4]

K. D. Jandt, Development and perspectives of scanning probe microscopy (SPM) on organic materials systems, Materials Science and Engineering R21 (1998) 221-295.

[5]

S. O. Vansteenkiste, M. C. Davies, C. J. Roberts, S. J. B. Tendler, P. M. Williams, Scanning probe microscopy of biomedical interfaces, Progres in Surface Science, Vol. 57, No. 2 (1998) 95-136.

[6]

Yi Yin, M. Zech, T. L. Williams, J. E. Hoffman, Scanning tunneling microscopy and spectroscopy on iron-pnictides, Physica C 469 (2009) 535-544.

[7]

N. C. Santos a M. A. R. B. Castanho, An overview of the biophysical applications of atomic force microscopy, Biophysical Chemistry 107 (2004) 133-149.

[8]

K. Tománková, H. Kolářová, R. Kubínek, M. Vůjtek a H. Dušková, Mikroskopie atomárních sil v biologických aplikacích, Čs. čas. fyz. 56 (2006).

[9]

J. M Edwardson, R. M. Henderson, Atomic force microscopy and drug discovery, DDT Vol. 9, No. 2 January (2004).

[10] P. C. Braga, D. Ricci, Methods in Molecular Biology: Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications, vol. 242, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 394. [11] Národní centrum pro výzkum biomolekul a Ústav biochemie, Masarykova univerzita,

Letní

škola

2011,

AFM

při

studiu

biomolekul:

http://www.nanobio.cz/sschool-2011/cd/prezentace/R1_AFM_instrumentace.pdf [online] [10. 5. 2012] [12] N. Hilal, W. R. Bowen, L. Alkhatib, O. Ogunbiyi, A review of atomic force microscopy applied to cell interactions with membranes, Trans IChemE, Part A, Chemical Engineering Research and Design (2006) 282-292. [13] J. L. Alonso, W. H. Goldmann, Feeling the forces: atomic microscopy in cell biology, Life Sciences 72 (2003) 2553-2560.

101

Seznam použité literatury [14] K. D. Jandt, Atomic force microscopy of biomaterials surfaces and interfaces, Surface Science 491 (2001) 303-332. [15] Národní centrum pro výzkum biomolekul a Ústav biochemie, Masarykova univerzita,

Letní

škola

2011,

AFM

při

studiu

biomolekul:

http://www.nanobio.cz/sschool-2011/cd/prezentace/P3_Pokrocile-AFM.pdf [online] [17. 3. 2012] [16] S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie. První díl, čtvrté vydání, Brno (2006), ISBN 80-902562-5-2. [17] Z. Vodráţka, Biochemie. Academia, Praha (2002), ISBN 80-200-0438-6. [18] Y. L. Lyubchenko, L. S. Shlyakhtenko, T. Ando, Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods 54 (2011) 274–283. [19] M. Bezanilla, S. Manne, D. E. Laney, Y. L. Lyubchenko, H. G. Hansma, Adsorption of DNA to Mica, Silylated Mica, and Minerals: Characterization by Atomic Force Microscopy, Langmuir (1995) 11, 655-659. [20] M. N. Savvateev, Preparation of samples of DNA molecules for AFM measurements: http://www.ntmdt.com/spm-notes/view/preparation-of-samples-of-dna-moleculesfor-afm-measurements [online] [24. 3. 2012] [21] P. Skládal, Biosensory, Masarykova univerzita, Brno (2002). [22] JPK Instruments: Tutorials - Surface chemistry in BioAFM: http://www.jpk.com/functionalized-surfaces-aptes-method.445.en.html [online] [29. 3. 2012] [23] L. D. White, C. P. Tripp, Reaction of (3-Aminopropyl)dimethylethoxysilane with Amine Catalysts on Silica Surfaces, Journal of Colloid and Interface Science 232 (2000) 400–407. [24] L. S. Shlyakhtenko, A. A. Gall, A. Filonov, Z. Cerovac, A. Lushnikov, Y. L. Lyubchenko, Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, proteinDNA complexes and other biological materials, Ultramicroscopy 97 (2003) 279–287.

[25] JPK Instruments: Tutorials - Surface chemistry in BioAFM: http://www.jpk.com/aps-method-and-other-silanized-surfaces.446.en.html [online] [30. 3. 2012] [26] JPK Instruments: Tutorials - Surface chemistry in BioAFM: http://www.jpk.com/dna-and-protein-adsorption.447.en.html [online] [30. 3. 2012]

102

Seznam použité literatury [27] J. L. Ortega-Vinuesa, P. Tengvall, I. Lundstrom, Molecular packing of HSA, IgG, and fibrinogen adsorbed on silicon by AFM paging, Thin Solid Films 324 (1998) 257–273. [28] Národní centrum pro výzkum biomolekul a Ústav biochemie, Masarykova univerzita,

Letní

škola

2011,

AFM

při

studiu

biomolekul:

http://www.nanobio.cz/sschool-2011/cd/prezentace/LR2_AFM_mikroskop.pdf [online] [2. 4. 2012] [29] NT-MDT: AFM sondy http://www.ntmdt.ie/data/media/files/accessories/etalon_next_generation_of_afm _probes.pdf [online] [7. 4. 2012] [30] Zhanwen Xiao, Mingxiang Xu, Keisuke Sagisaka, Daisuke Fujita, AFM observations of self-assembled lambda DNA network on silanized mica, Thin Solid Films, Vol. 438–439 (2003) 114–117. [31] Y. L. Lyubchenko, L. Shlyakhtenko, R. Harrington, P. Odent, S. Lindsayt, Atomic force microscopy of long DNA: Imaging in air and under water, Biophysics: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2137-2140. [32] Ch. K. Reiner, C. M. Stroh, A. Ebner, Ch. Klampfl, A. A. Gall, Ch. Romanin, Y. L. Lyubchenko, P. Hinterdorfer, H. J. Gruber, Simple test system for single molecule recognition force microscopy, Analytica Chimica Acta 479 (2003) 5975. [33] O. Ouerghi, A. Touhami, A. Othmane, H. B. Ouada, C. Martelet, C. Fretigny, N. Jaffrezic-Renault, Investigating antibody-antigen binding with atomic force microscopy, Sensors and actutators B 84 (2002) 167-175. [34] NT-MDT: AFM study of macromolecules structure and organization: http://www.ntmdt.com/spm-notes/view/afm-study-of-macromolecules-structureand-organization [online] [20. 4. 2012] [35] L. Hamon, D, Pastré, P. Dupaigne, C. Breton, E. Cam, O. Piétrement, Highresolution AFM paging of single-stranded DNA-binding (SSB) protein-DNA complexes, Nucleid Acids Research, Vol. 35, No. 8 (2007).

103

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE NOVÉ NANOBIOTECHNOLOGICKÉ METODY PRO VÝZKUM POŠKOZENÍ DNA NA ÚROVNI JEDNOTLIVÝCH MOLEKUL

Recommend Documents