JST Kesehatan, April 2011, Vol.1 No.1 : 68 – 76
ISSN 1411-4674
ANALISIS POLIMORFISME GEN NUCLEOTIDA BINDING OLIGOMERIZATION DOMAIN 2 (NOD2) PADA PENDERITA TUBERCULOSIS DI MAKASSAR Analysis Of Nucleotida Binding Oligomerization Domain 2 (NOD2) Gene Polymorphism In Tuberculosis Patients In Makassar Adriani, Moch. Hatta, Nasrum Massi Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Unhas, Makassar (Email:
[email protected]) ABSTRAK Penyakit tuberculosis (TB) merupakan penyakit menular mematikan di dunia yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis). Gen Nucleotida binding oligomerization domain 2 (NOD2) merupakan kandidat gen untuk infeksi M. tuberculosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui polimorfisme gen NOD2 pada penderita TB dan orang normal dan mengetahui polimorfisme gen NOD2 berdasarkan indeks bakteri. Sebanyak 30 sampel diperoleh dari penderita TB berupa darah dan sputum. Sputum diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN) dan dikultur dalam medium Lowenstein-Jensen (LJ). Analisis polimorfisme gen NOD2 dari darah menggunakan metode polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP). Nilai statistic (fisher exact) menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan antara polimorfisme penderita TB dengan orang normal, nilai (P>0.05). Polimorfisme pada penderita TB sebesar 6,7% sedangkan orang normal 0%, tidak ditemukan hubungan yangbermakna antara penderita TB dan orang normal. Terdapat hubungan antara polimorfisme gen NOD2 dengan indeks bakteri (P=0,002). Kata Kunci: Polimorfisme, Gen NOD2, Indeks Bakteri, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
ABSTRACT Tuberculosis (TB) is contagious and deadly disease in the world caused by Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis). Nucleotida binding oligomerization domain 2 (NOD2) is candidate gene for M.tuberculosis infection. Objectives was to observe the polymorphisms of NOD2 gene in TB patiens and normal persons and to find out the polymorphic difference of NOD2 gene based on the bacterium index at TB patients. Thirty samples from patiens (sputum and blood) were examined. Sputum was stained by using Ziehl-Neelsen (ZN) method and cultured with Lowenstein-Jensen (LJ) medium. Analysis of NOD2 gene polymorphisms from blood was performed by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR- RFLP) method. The results show that from fisher exact value the difference of polymorphism of NOD2 gene in TB patiens and normal persons is 0,246 (P >0,05). Polymorphisms in TB patiens was 6.7% as compared to normal persons (0%), there was no significant difference between TB patients and normal person. There was a relationship between NOD2 gene polymorphisms with bacterial index with a value of P = 0.002. Key Words: Polymorphism, NOD2 gene, Bacterial index, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
68
Polimorfisme, Gen NOD2, Indeks Bakteri, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
ISSN 1411-4674
3’- AGTGTCCGCATCGTCATTG -5’, (reverse) Enzim retriksi : BamHI 5’ – G^GATCC - 3’ 3’ – CCTAG^G - 5’ Produk PCR-RFLP adalah 186 bp pada suhu 60oC dengan pemotongan pita DNA pada 103 bp dan 83 bp
PENDAHULUAN Penyakit tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular mematikan di seluruh dunia yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Indonesia merupakan negara terbesar ketiga dalam hal jumlah penderita TB setelah India dan Cina. M. tuberculosis telah menginfeksi sekitar 2 milyar penduduk, sepertiga dari total populasi dunia, dengan tingkat kematian 2 juta penduduk per tahun. Pada tahun 2005 terdapat sekitar 8,8 juta kasus TB baru dan pada tahun 2007 meningkat menjadi 9,3 juta kasus TB (WHO, 2007). Gen NOD2 merupakan kandidat gen yang penting untuk infeksi mycobacteria termasuk M. tuberculosis serta penyakit infeksi lainnya, berperan dalam memediasi respon sistem imun alami terutama makrofag sehingga dapat menjaga kekebalan host terhadap infeksi bakteri (Stockton et al., 2002; Divangahi et al., 2008; Coulombe et al., 2009). Banyak faktor yang dapat mempengaruhi polimorfisme gen pada seseorang diantaranya faktor keturunan ataupun karena lingkungan. Jika keberadaan gen NOD2 tersebut dapat dibuktikan bersesuaian dengan infeksi M. tuberculosis, hal ini menunjukkan bahwa gen NOD2 ini merupakan gen spesifik yang berperan penting dalam mekanisme pertahanan tubuh terhadap penyakit TB, dan akan ditemukan bentuk polimorfisme yang berbeda antara gen NOD2 yang ada pada penderita TB dan orang normal.
b. Prosedur Kerja Pewarnaan Ziehl Neelsen (BTA) Sampel sputum diambil dari 30 pasien suspek TB berdasarkan hasil diagnosis BTA positif dengan pewarnaan Ziehl Neelsen pada sputum. Dasar penegakan diagnosis BTA positif adalah bila dalam sputum ditemukan lebih dari tiga bakteri TB. selanjutnya dibiakkan dalam medium khusus M. tuberculosis. Sebanyak 1 mL sampel sputum diambil dan diratakan di atas kaca preparat steril dengan ukuran 3 x 2 cm dan dibiarkan beberapa saat hingga kering. Selanjutnya ditetesi dengan carbol fuchsin hingga seluruh sediaan tergenang. Sediaan kemudian dipanasi sampai mengeluarkan uap dan didinginkan selama 5 menit. Setelah dingin, carbol fuchsin dibuang dan sediaan dicuci dengan air mengalir. Sediaan ditetesi dengan HCl-alkohol sampai tergenang, selanjutnya sediaan dicuci kembali dengan air mengalir. Ditambahkan methylen blue di atas permukaan sediaan dan dibiarkan selama 30 detik selanjutnya dicuci dengan air mengalir. Sediaan dibiarkan beberapa saat sampai kering. Untuk pengamatan di bawah mikroskop maka terlebih dahulu permukaan sediaan ditetesi dengan minyak imersi.
BAHAN DAN METODE a. Bahan Penelitian Sampel sputum, darah penderita TB diambil dari Balai Besar Penyakit Kesehatan Paru Makassar (BBPKPM). Sampel darah orang normal diperoleh dari Palang Merah Indonesia (PMI) kota Makassar Primer gen NOD2 lokus Exon4 802 (Takara Bio, Inc. Japan) 5’- CAGTCTCGCTTCCTCAGTACC 3’, (forward)
Kultur pada media LJ Sputum ditambahkan dengan larutan dekontaminasi dengan perbandingan 1:1 dan dibiarkan 15 menit
69
Adriani
ISSN 1411-4674
pada suhu kamar. Selanjutnya sputum disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang kemudian sedimennya ditambahkan dengan 18 mL PBS (phosfat buffer saline) steril dan disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan dibuang dan sedimennya disuspensikan dengan 1 mL larutan PBS dan selanjutnya divorteks. Sedimen yang telah divorteks dipipet ke dalam tabung yang berisi medium LJ dan digerakkan supaya sedimen tersebar merata di atas permukaan medium. Tabung selanjutnya diinkubasi dengan posisi miring sekitar 300 pada suhu 35-37o C. Dilakukan pengamatan setiap minggu untuk mengetahui pertumbuhan bakteri M. tuberculosis. Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu.
Selanjutnya campuran divortex dan disentrifus kecepatan 12.000 rpm selama 20 detik. Penambahan L2 dilakukan 2 kali. Setelah disentrifus maka supernatant dibuang dan sedimen ditambahkan 60 µL larutan etanol Selanjutnya divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 20 detik, penambahan etanol dilakukan sebanyak 2 kali, dilanjutkan dengan penambahan aseton. Sedimen yang diperoleh kemudian dikeringkan di dalam oven sampai berbentuk bubuk, dan ditambahkan 60 µL larutan Rnase-free water kemudian divortex dan dilanjutkan sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik dan supernatant dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang baru. DNA akan diperoleh dari supernatant ini dan disimpan pada suhu 20°C sebelum dilakukan analisa PCR. Deteksi DNA dengan PCR dan elektroforesis PCR mix dimasukkan ke tabung PCR berisi 2 µL MgCl2, 2 µL dNTPs, (Takara Bio, Inc, Japan) dan Taq DNA polymerase, Ampli Taq GOLD (Applied Biosystems, Foster City, California). Pada teknik PCR ini digunakan primer dari gen NOD2 lokus Exon4 802. Bagian dasar tabung ditambahkan 5 µL ekstrak DNA dan selanjutnya dilakukan amplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (Hybaid Omm-E, England) dengan siklus sebagai berikut : 95°C selama 5 menit untuk proses denaturasi DNA, dan dilanjutkan dengan 35 siklus masing masing : 94° C selama 45 detik, 57° C selama 45 detik dan 72° C selama 45 detik. Hasil produk amplifikasi sebanyak 10 µL akan dilewatkan dalam agarose gel 2 % elektroforesis dalam buffer TBE 1x dalam arus listrik 100 A selama 40 menit untuk melihat ada tidaknya pita DNA yang terbentuk dari sampel dan dipakai pula untuk hibridisasi DNA selanjutnya.
Ektraksi DNA (Metode Boom) 100 µL sampel darah dari masingmasing pasien yang dicurigai menderita TB (suspek TB) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi 900 µL larutan L6 yang mengandung 120 gram Guanidium thyocianate (GuSCN) (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) dalam 100 mL 0.1 M Tris HCl, pH 6.4; 22 mL 0.2 M Ethylen Diamine Tetra Acetat (EDTA) pH 8.0 dan 2.6 gram Triton X100 (Packard, Instrumens) dengan konsentrasi akhir 50 mM Tris HCl, 5 M GuSCN, 20 mM EDTA, 0.1 % Triton X100, selanjutnya dihomogenkan semalam. Ditambahkan diatom 30 µL (suspensi diatom terdiri dari 50ml H2O dan 500 µl dari 32 % (w/v) Celite (diatom) (Jansen Chimica, Beerse, Belgium). Suspensi diatom ini dapat mengikat 10 µg DNA bakteri. Campuran divortex dan disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 20 detik dan diambil sedimennya untuk ditambahkan larutan L2 (terdiri dari 120 gram GuSCN dalam 100 mL 0.1 M Tris HCl, pH 6.4) sebanyak 100 µL. 70
Polimorfisme, Gen NOD2, Indeks Bakteri, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
ISSN 1411-4674
dari PCR-RFLP, hasil kultur dan pewarnaan BTA dengan tingkat kemaknaan p < 0,05.
Pemotongan Produk PCR dengan Enzim Restriksi Sebanyak 2 µL DNA hasil PCR, 0,5 µL NEB buffer, dan 0,5 µL enzim restriksi (BamH1) serta dH2O 7 µl dicampur dalam tabung PCR kemudian dihomogenkan selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung kecil dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam pada suhu ruangan. Hasil pemotongan dipisahkan melalui elektroforesis agarose gel 2% dalam buffer TBE 1x.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Hasil pewarnaan BTA dapat dilihat pada gambar 1. Sputum selanjutnya dikultur untuk meyakinkan bahwa bakteri yang diwarnai dengan BTA adalah M. tuberculosis. Pada pemeriksaan PCR-RFLP suspek TB dan orang normal, ditemukan adanya mutasi pada suspek TB sebesar 6,7% dan tidak ditemukan adanya mutasi pada orang normal (100% tidak mutasi).
Analisis Statistik Data dianalisis dengan menggunakan statistik Uji Chi-square
Tabel 1. Distribusi frekuensi hasil pewarnaan BTA dengan metode ZN pada suspek TB
Suspek TB
Gambar 1.
1+ 19
Pewarnaan BTA 2+ 9
3+ 2
Bakteri M.tuberculosis dalam sputum
Gambar 2. Koloni M.tuberculosis ditandai dengan basil berwarna merah pada medium LJ
71
Adriani
ISSN 1411-4674
Tabel 2. Distribusi frekuensi polimorfisme gen NOD2 pada suspek TB dan orang normal Suspek TB
PCR-RFLP
n 2 28
Mutasi Tidak mutasi
Orang normal % 6,7 93,3
n 0 30
% 100 100
P = 0,246
Gambar 3. Hasil PCR RFLP suspek TB
Gambar 4. Hasil PCR RFLP orang normal
Tabel 3. Distribusi frekuensi polimorfisme gen Nod2 pada suspek Tb berdasarkan indeks bakteri
PCR-RFLP Mutasi Tidak mutasi
Indeks bakteri 2+ n % 0 0 9 100 P = 0,02
1+ n 0 9
% 0 100
72
3+ n 2 0
% 100 0
Polimorfisme, Gen NOD2, Indeks Bakteri, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
ISSN 1411-4674
Tabel 4. Distribusi pemeriksaan indeks bakteri pada suspek TB
Indeks Bakteri 1+ 2+ 3+
Jumlah (n) 19 9 2
Persentasi (%) 63,3 30 6,7
penderita memproduksi droplet infeksi yang beterbangan di udara, droplet ini mampu bertahan di udara selama beberapa jam. Apabila terhisap oleh orang sehat dan masuk ke dalam paruparunya dapat menyebabkan penyakit TB paru. (Anonim,2007; Varaine, et al., 2008). Penyakit TB menyerang siapa saja, dapat dideteksi dengan cepat menggunakan pewarnaan BTA maupun tuberculin test (Kenyorini et al., 2004). M. tuberculosis dapat bersifat dorman di dalam tubuh, jika kondisi lingkungan menguntungkan maka bakteri yang tadinya dorman dapat menjadi aktif kembali (Anonim, 2007). Untuk melihat adanya gen NOD2 dalam sampel yang mengalami mutasi maka dilakukan pemeriksaan molekuler melalui PCR-RFLP. Terlebih dahulu dilakukan ekstraksi DNA dari sampel darah dengan metode Boom. Keunggulan metode ini adalah sampel yang dibutuhkan hanya sedikit namun dapat diperoleh DNA dalam jumlah yang cukup besar. Umumnya RFLP digunakan untuk mengidentifikasi polimorfisme genetik termasuk polimorfisme genetik yang dideteksi melalui PCR amplifikasi. Metode ini sangat simpel yaitu memotong untai ganda DNA menjadi fragmen yang lebih kecil dengan menggunakan enzim restriksi (Verkuil & Pelt, 2008). Enzim restriksi yang digunakan pada penelitian ini adalah BamH I merupakan enzim yang diisolasi dari bakteri Bacillus amyloquefaciens dan mampu memotong untai ganda DNA dan
Pembahasan Penelitian ini menggunakan sampel sebanyak 60 yang terdiri dari 30 sampel darah orang normal dan 30 sampel darah dari suspek TB. Sampel penelitian diperoleh dari BBPKPM, sedangkan sampel orang normal diperoleh dari PMI kota Makassar dengan tujuan memperoleh sampel dari individu yang sehat. Jenis pemeriksan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah pewarnaan BTA untuk melihat jumlah bakteri dalam sputum (tabel 1 & gambar 1). Untuk memastikan bakteri yang diwarnai adalah M.tuberculosis maka dilakukan kultur bakteri menggunakan medium LJ (Loweinstein Johnson) (gambar 2). Kultur merupakan gold standar dalam pemeriksaan TB karena nilai sensitivitas dan spesifisitasnya yang cukup tinggi, Namun dibutuhkan waktu yang cukup lama sekitar 4 -8 minggu untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri. Adanya sifat hidrofobik pada permukaan sel menyebabkan bakteri M.tuberculosis cenderung tumbuh berkoloni sehingga nutrisi tidak mudah masuk ke dalam sel akibatnya pertumbuhan bakteri lambat (Forbes et al., 2002). Pertumbuhan bakteri M.tuberculosis ditandai dengan koloni yang berwarna kuning, bentuknya menyerupai bunga kol, permukaan koloni kasar dan tepi koloni kasar. Penyakit TB disebabkan oleh M. tuberculosis. Cara penularannya melalui droplet (percikan dahak) yang mengandung basil tuberculosis paru di udara (Varaine et al., 2008). Ketika batuk, berbicara maupun bersin,
73
Adriani
ISSN 1411-4674
pada penderita kusta dengan jumlah sampel sebanyak 40. Pada tabel 4 ditemukan adanya polimorfisme gen NOD2 pada penderita TB berdasarkan indeks bakteri sebesar 6,7% dan sampel yang mengalami mutasi adalah sampel dengan indeks bakteri (IB) 3+. Diperoleh nilai P sebesar 0,002, hal ini mengindikasikan adanya hubungan antara IB dengan polimorfisme gen NOD2 pada suspek TB karena nilai P ≤ 0,005. Gen NOD2 merupakan penyusun protein NOD2 yang berperan mengaktifkan NFkβ (nuclear factor kappa-beta) yang dapat mengaktivasi pembentukan respon imun dan memicu terjadinya apoptosis, banyak ditemukan dalam sel makrofag, monosit dan sel dendritik (Ogura et al., 2001; Akagawa, 2004). NOD2 mampu mengenali lipopolisakarida (LPS) dan peptidoglikan pada dinding sel M. tuberculosis (Barnich et al., 2005; Coulombe et al, 2009). Jumlah bakteri yang dikeluarkan dari paru penderita dengan IB 3+ sangat banyak yaitu >10 per lapangan pandang dan derajat penularannya sangat tinggi terhadap orang disekitarnya. Makin tinggi derajat positif hasil pemeriksaan sputum, makin tinggi penularan dan kerusakan makrofage pada penderita. (Anonim, 2007). Jika terjadi kerusakan pada makrofag maka sel tidak mampu lagi mengenali dinding sel bakteri M. tuberculosis akibatnya NFkβ tidak mampu mengaktifkan respon imun, sehingga jumlah bakteri yang masuk ke dalam sel semakin banyak dan berpotensi menimbulkan inflamasi (Barnich et al, 2005).
mengenali sequense spesifik DNA (biasanya 6 untaian DNA). Jika sequens molekul DNA telah diketahui ukuran dan jumlah fragmennya, maka hasil pemotongan dengan enzim restriksi dapat diprediksikan. Jika ukuran dan jumlah fragmen tidak sesuai dengan yang diprediksikan maka fragmen DNA tersebut mengalami polimorfisme dan variasi (mutasi) (Verkuil & Pelt, 2008) Tehnik RFLP dapat membantu untuk menentukan bagian DNA yang mengalami mutasi. Pada penelitian ini, urutan nukleotida gen yang normal adalah 186 bp. Namun jika terjadi mutasi maka akan terpotong menjadi 103 dan 83 base pair. Pada tabel dapat dilihat bahwa terdapat 2 mutasi pada suspek TB dari total 30 sampel dengan persentase sebesar 6,7%. Sampel yang tidak mengalami mutasi adalah 28 dengan persentase sebesar 93,3%. Pada sampel orang normal tidak ditemukan adanya mutasi (gambar 3 dan 4). Nilai P yang diperoleh sebesar 0,246 (P > 0,05), hal ini menunjukkan bahwa secara statistik tidak ada perbedaan polimorfisme gen NOD2 pada suspek TB dengan orang normal. Penelitian yang dilakukan oleh Moller (2006) di Afrika Selatan dengan jumlah sampel 434 penderita TB juga memperlihatkan hasil bahwa tidak ditemukan adanya hubungan yang signifikan antara polimorfisme gen NOD2 dengan kasus TB di Afrika Selatan dengan nilai p=0,46 dan disimpulkan bahwa NOD2 bukan gen yang susceptible terhadap penyakit TB. Penelitian lain tentang gen NOD2 pada penyakit lain selain TB dilakukan oleh Rose et al (2005) yang menemukan adanya mutasi gen NOD2 pada pasien Blau syndrom yang menyebabkan perubahan asam amino arginin menjadi triptofan pada posisi kodon ke 334. Penelitian Pugazhendi et al (2008) tidak menemukan polimorfisme gen NOD2 pada pasien Chron’s disease di India. Sedangkan Mustafa (2010) menemukan adanya mutasi gen NOD2 sebesar 10%
Keterbatasan penelitian Pada penelitian ini sampel yang digunakan sedikit yaitu 30 sampel dan mutasi yang diperoleh hanya 2. Sehingga belum dapat ditarik kesimpulan apakah gen NOD2 berpengaruh terhadap kerentanan seseorang terhadap penyakit TB
74
Polimorfisme, Gen NOD2, Indeks Bakteri, PCR-RFLP, Mycobacterium tuberculosis
ISSN 1411-4674
and Adaptive Immunity. The Journal of Immunology, 181, 7157-7165 Forbes, B., Sahm Daniel F., Weissfeld Alice S., Louis, st., Mosby, 2002. Diagnostic Microbiology Eleventh Edition . American Association for Clinical Chemistry, Inc. 1069 pp. ISBN 0-323-01678-2. Kenyorini, Suradi, Eddy Surjanto. 2006. Uji Tuberkulin. Jurnal Tuberkulosis Indonesia, Vol. 3 No. 2 Moller, M., Nebel, A., Kwiatkowski, R., et al 2006. Host susceptibility to tuberculosis: CARD15 polymorphisms in a South African population. Molecular and Cellular Probes 21 (2007) 148–151 Mustafa, H, 2010. Polimorfisme Gen Nucleotide Binding Oligomerization Domain 2 (NOD2) Lokus exon 4 (802) Pada Penderita Kusta di Makassar. Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Ogura, Y., Bonen, D.K., Inohara, N., et al, 2001. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature |Vol 411 | 31 May 2001 www.Nature.Com Pugazhendhi, S., Amte, A., Balamurugan, R., Subramanian, V., Ramakrishna, B.S., 2009. Common NOD2 mutations are absent in patients with Crohn’s disease in India. http://www.indianjgastro.com on Wednesday, February 04, 2009 Rose, Carlos D., et al, 2005. Blau Syndrome Mutation of CARD15/NOD2 in Sporadic Early Onset Granulomatous Arthtritis. The Journal of Rheumatology. Page 373 - 375 Stockon, J.C., Awomoyi, A., Mcadam, Kp., et al, 2002. Polymorphism in NOD2 and Susceptibility to Tuberculosis. NLM gathway, Cambridge, United Kingdom Stockon, J.C. Houson, J., Awomoyi, A., et al, 2004. Polymorphism in NOD2, Crohn’s disease, and susceptibility to Tuberculosis. NLM
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Pada penderita TB ditemukan adanya polimorfisme sebesar 6,7%,dan polimorfisme gen NOD2 pada penderita TB dengan orang normal (p = 0,246). Indeks bakteri yang paling banyak ditemukan pada penderita TB adalah indeks bakteri +1, dan ada hubungan polimorfisme gen NOD2 dengan indeks bakteri (P = 0,002). Saran Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan sampel orang normal dari keluarga penderita TB dan juga orang serumah yang bukan keluarga. untuk mengetahui variasi genetik suatu keluarga terhadap gen NOD2 kaitannya dengan penyakit TB DAFTAR PUSTAKA Akagawa. K., The Activation of Bactericidal Mechanism of Macrophage A gaint Intracellular Bacteria. Molecular medicine, 991-998 Anonim, 2007. Genes NOD2. NCBI Pubmed http://ghr.nlm.nih.gov/gene=nod2 Barnich, N., Aguirre, JE., Reinecker, HC., Xavier, R.,and Podolsky, DK., 2005. Membrane recruitment of NOD2 in intestinal epithelial cells is essential for nuclear factor– B activation in muramyl dipeptide recognition. JCB, Volume 170, Number 1, 21-26 Coulombe, F., Divangahi, M., Veyrier, F., et al, 2009. Increased NOD2mediated recognition of N-glycolyl muramyl dipeptide. The Journal of Experimental Medicine, Vol. 206, No. 8, 1709-1716 The Rockefeller University Press Divangahi, M., Mostowy, S., Coulombe, F., et al, 2008. NOD2-deficient Mice Have Impaired Resistance to Mycobacterium tuberculosis Infection through Defective Inate
75
Adriani
ISSN 1411-4674
gathway,Cambridge, United Kingdom Varaine, F., Henkes, M., Grouzard, V., 2008. Tuberculosis. Medicines Sans Frontieres-Medical Departement. Email :
[email protected]
Verkuil, Pelt Van E., 2008. Principles and Technical Aspects of PCR Amplification, 141 © Springer Science + Business Media B.V. World Health Organization. 2007. Tuberculosis. WHO Fact sheet; 104.
76
