Bilirubin Odbourávání krevního barviva Po rozpadu erytrocytů (průměrná doba existence 120 dní) podléhá hemoglobin enzymově katalyzovanému odbourávání, které probíhá ve fagocytujících buňkách sleziny, kostní dřeně a jater (RES). V těchto buňkách se v průběhu několika reakcí z hemoglobinu odštěpuje proteinová sloţka globin a z hemu vzniká lineární tetrapyrrolové barvivo bilirubin. Bilirubin je pro tělo odpadní látka. Je to velmi nepolární látka, v krvi musí být transportována ve vazbě na albumin. Přenáší se do jater a zde je vychytáván. Navázáním glukuronové kyseliny je přeměněn na tzv. konjugovaný bilirubin. V této formě je bilirubin podstatně rozpustnější a vylučuje se ţlučí do střeva. Bilirubin je zde redukován enzymy střevní bakteriální flóry na bezbarvé chromogeny urobilinogeny (Ubg). Většina z nich se vstřebává do krve a je z ní játry vychytána a odbourána, nepatrná část (průměrně 4 mol/den) se vylučuje močí. Zbytek Ubg neresorbovaný ve střevě se vylučuje stolicí. COOH COOH bilirubin
O
N H
Hyperbilirubinemie
N H
N H
N H
O
Fyziologické rozmezí koncentrace bilirubinu v krvi je u dospělých 5-20 mol/l. Zvýšené hodnoty se označují jako hyperbilirubinemie, barvivo při nich difunduje do tkání, které se naţloutle zbarví (žloutenka, ikterus). Příčinou můţe být 1) zvýšená tvorba bilirubinu (hemolýza) 2) sníţené vychytávání bilirubinu hepatocyty (jaterní poruchy) 3) sníţená konjugace bilirubinu (jaterní porychy) 4) porucha vylučování bilirubinu do ţluče (jaterní poruchy) 5) extrahepatální porucha odtoku ţluče (kámen, nádor)
V závislosti na příčině poruchy můţe být v krvi zvýšen konjugovaný i nekonjugovaný bilirubin. Konjugovaný bilirubin je na albumin vázán jen slabě a při zvýšené koncentraci v plazmě volně proniká do moči. Je-li hladina konjugovaného bilirubinu zvýšena dlouhodobě, vzniká tzv. -bilirubin. Představuje podíl bilirubinu, který neenzymovou reakcí vytváří s albuminem a v menší míře s jinými plazmatickými proteiny kovalentní peptidovou vazbu. Hladina -bilirubinu je mírou předchozího trvání konjugované hyperbilirubinemie. Odbourává se rychlostí albuminu, tj. s poločasem 19 dní. Komplex neprochází normálně glomerulární membránou. Novorozenci mohou být ohroţeni novorozeneckou žloutenkou. Při ní dochází ke zvýšení hladiny nekonjugovaného bilirubinu, jehoţ příčinou je nezralost jaterního systému a jeho dočasná neschopnost přijímat,
konjugovat
a
vylučovat
bilirubin.
Nekonjugovaný
bilirubin
můţe
pronikat
hematoencefalickou bariéru a vyvíjí se toxická encefalopatie (jádrový ikterus, kernikterus). Při terapii se pouţívá ozařování modrým fluorescenčním zářením (fototerapie), které izomeruje bilirubin do forem, které jsou rozpustnější a mohou být játry vyloučeny bez konjugace.
bilirubin
fotobilirubiny
fotoizomerizace
(polární)
ţluč
stolice
bez konjugace
v koţních kapilárách Nedostatečná konjugace bilirubinu můţe být také způsobena vrozeným defektem enzymového systému. Kompletní deficit bilirubin-UDP transferasy vyvolává Criglerův-Najjarův (výsl. kri’glerův nah’jahrův) syndrom typu I. Toto vzácné recesivně vrozené onemocnění vede k masivní hyperbilirubinemii a končí fatálně několik dní po narození. Criglerův-Najjarův syndrom typu II je méně závaţná porucha, při níţ je aktivita bilirubin-UDP transferasy částečně zachovaná. Gilbertův (výsl. ž(i)lber(t)ův) syndrom je další porucha spojená s poruchou v konjugaci bilirubinu. BilirubinUDP transferasa je funkční asi ze 30 %, koncentrace bilirubinu v krvi je trvale mírně zvýšena. Příčinou je mutace v TATA boxu genu enzymu, která omezuje rozpoznání promotorové oblasti transkripčními faktory, následkem čehoţ je exprese enzymu sníţená. Prognóza této choroby je velice příznivá a terapie většinou není nutná.
Stanovení bilirubinu Bilirubin reaguje s diazoniovými solemi (podobně jako aromatické aminy a fenoly) za vzniku intenzivně zbarvených azosloučenin, vhodných k fotometrickému stanovení. Reakce nekonjugovaného bilirubinu probíhá velmi pomalu, značně ji urychlí přídavek alkoholu nebo jiných látek (benzoát sodný, kofein, močovina atd.), které se souhrnně označují jako akcelerátory reakce.
COOH COOH
O
N H
N H
N H
N H
O
Nekonjugovaný bilirubin
Frakce bilirubinu, která vyţaduje akcelerátor, se označuje jako „nepřímý bilirubin“. Konjugovaný bilirubin reaguje i bez akcelerátorů rychle („přímý bilirubin“). Nekonjugovaný bilirubin se vypočítá jako rozdíl mezi celkovým a konjugovaným bilirubinem. V metodě se pouţívá nejčastěji diazotace sulfanilové kyseliny, jako akcelerátor kofein a benzoát, barevný produkt se měří v silně alkalickém prostředí. V přítomnosti akcelerátoru reagují všechny formy bilirubinu, stanovujeme celkový bilirubin.
U novorozenců lze pouţít přímé spektroskopické stanovení při dvou vlnových délkách 450 a 540 nm (bilirubinometry), avšak jen do koncentrace 300 mol/l. Referenční interval koncentrace celkového bilirubinu v krevním séru pro novorozence starší 1 měsíce a dospělé je 5–20 mol/l. Koncentrace konjugovaného bilirubinu je nejvýše 5 mol/l. Hodnoty nekonjugovaného bilirubinu 17–70 µmol/l spolu s normálním nálezem ostatních vyšetření jsou charakteristické pro chronickou hemolýzu (hemolytická anémie) a pro benigní hyperbilirubinemii Gilbertova typu (pokles aktivity UDP-glukuronyltransferázy). Do určité míry je fyziologická postnatální hyperbilirubinemie (donošení novorozenci ve 2.-3. dnu ţivota mohou mít v séru aţ 135 mol/l nekonjugovaného bilirubinu, do 170 mol/l celkového bilirubinu), rychle se upravující na hodnoty obvyklé u dospělých.
Zjištění bilirubinu v moči V moči zdravého člověka se můţe vyskytovat nepatrné mnoţství konjugovaného bilirubinu (aţ 0,5 mol/l), které běţnými zkouškami není prokazatelné. Moč k důkazům bilirubinu musí být čerstvá, bilirubin se na vzduchu snadno oxiduje. K důkazu se obvykle pouţívá některý z diagnostických prouţků obsahující zónu pro detekci bilirubinu. Tato zóna je nasycena vhodnou diazoniovou solí, s níţ bilirubin poskytne barevnou azosloučeninu. Hodnocení Zkoušky na bilirubin v moči jsou pozitivní, zvýší-li se koncentrace konjugovaného bilirubinu v krevní plazmě asi nad 30 mol/l. Nekonjugovaný bilirubin je v plazmě vázán na albumin a do glomerulárního filtrátu proto neproniká. Zjištění bilirubinu v moči je tedy známkou neschopnosti hepatocytů vyloučit konjugovaný bilirubin do ţluče nebo známkou uzávěru ţlučových cest, patří proto k příznakům hyperbilirubinemie hepatocelulární nebo obstrukční. Při déletrvajících poruchách však nemusí být v moči prokazatelný ani kojugovaný bilirubin, neboť se v séru přeměňuje na delta formu.
Zjištění urobilinogenů v moči Bilirubin vylučovaný játry do ţluče je redukován enzymy střevní bakteriální flóry na bezbarvé chromogeny urobilinogeny (Ubg). Většina z nich se vstřebává do krve a je z ní játry vychytána a odbourána, nepatrná část (průměrně 4 mol/den) se vylučuje močí. Zbytek Ubg neresorbovaný ve střevě se vylučuje stolicí. Zkoušky na přítomnost urobilinogenů se provádějí jen v čerstvé (a zchladlé) moči (vhodná polední nebo odpolední moč), během
prvních dvou hodin po vymočení; delším stáním se urobilinogeny přeměňují na své oxidační produkty - urobiliny. Princip: Průkazem Ubg je specifická barevná kopulační reakce urobilinogenů s vhodnou diazoniovou solí v kyselém prostředí. Srovnání s barevnou stupnicí umoţní semikvantitativní vyhodnocení. Slabě růţové zabarvení zóny, odpovídající prvnímu políčku srovnávací stupnice (přibliţně 17 mol/l), lze povaţovat za horní mez fyziologických koncentrací urobilinogenů v moči v průběhu dne.
Přehled metabolismu K zajištění svých funkcí a struktury vyţadují ţivé organismy kontinuální přísun volné energie. Pochody, kterými ţivý organismus získává a vyuţívá volnou energii, se souhrnně označují jako metabolismus. Metabolické děje zahrnují dva typy reakcí. Při exergonických reakcích se uvolňuje volná (Gibsova) energie. Jsou to obvykle reakce, při nichţ uhlíkaté sloučeniny s vysokým obsahem vodíku jsou oxidovány na energeticky chudý oxid uhličitý a vodu. Poněvadţ tyto reakce jsou spojeny s přeměnou sloţitějších struktur na jednoduché produkty, označují se jako katabolické. Endergonické reakce probíhají pouze tehdy, jsou-li spřaţeny s reakcemi exergonickými. Jedná se o převáţně o biosyntetické pochody, při nichţ vznikají sloţitější molekuly z látek jednodušších, tj. rekce anabolické. Endergonický charakter má také řada transportních dějů a buněčné pohyby. Ze ţivých organismů pouze zelené rostliny a některé jednobuněčné organismy obsahující barevné pigmenty, jsou schopny získávat volnou energii ze slunečního záření a provádět endergonickou syntézu sacharidů z oxidu uhličitého a vody v procesu fotosyntézy. Označují se jako fototrofy. Chemotrofy jsou organismy získávající energii metabolismem ţivin. Při fotosytéze v rostlinách je energie slunečního záření přeměňována na energii chemické vazby. Energeticky chudé sloučeniny, např. CO2 a H2O jsou přeměňovány na glukosu za uvolnění kyslíku Souhrnný pochod fotosyntézy, jehoţ se jako katalyzátor zúčastní chlorofyl, lze vyjádřit obecnou rovnicí: 6 CO2 + 6H2O
sluneční záření
C6H12O6 + 6 O2
Sacharidy potom slouţí jako zdroj energie jak pro organismy, v nichţ jsou syntetizovány, tak i pro organismy, které vyuţívají zelené rostliny jako potravu. Veškerá volná energie ţivých organismů má tak svůj původ ve sluneční energii, která je procesem fotosyntézy transformována energii chemické vazby.
Exergonické reakce nemusí být bezprostředně spřaţeny s pochody endergonickými. Volná energie uvolňovaná během exergonických reakcí můţe být přechodně uchovávána syntézou „energeticky bohatých (makroergických) sloučenin Nejuniversálnější zásobní formou volné energie je adenosin trifosfát (ATP – struktura viz str…..), který je syntetizován z adenosindifosfátu (ADP) a anorganického fosfátu (Pi) za vyuţití volné energie uvolněné v průběhu exergonických reakcí. Štěpení ATP na ADP a anorganický fosfát je silně exergonická reakce :
ATP
ADP + H2PO4-
G0´ = - 33,5 kJ.mol-1
Kromě ATP mohou jako zásoba energie slouţit i další pyrimidinové a purinové nukleosidtrifosfáty, nemají však jiţ tak universální charakter. V buňkách mohou vznikat i další metabolity s vysokým obsahem energie; jsou to sloučeniny obsahující vazby esterové, amidové, nebo anhydridové nejčastěji s kyselinou fosforečnou (fosfoenolpyruvát, fosfokreatin, 1,3-bisfosfoglycerát apod.) nebo některé thioestery (acetyl-CoA). Ţivočichové získávají volnou energii oxidací energeticky bohatých základních ţivin, zejména sacharidů a lipidů, částečně i bílkovin. Základní ţiviny jsou uhlíkaté sloučeniny s vysokým obsahem vodíku. Při jejich oxidaci se spotřebovává kyslík, vytváří se jednodušší oxidační produkty a v konečné fázi vzniká voda a oxid uhličitý. Tato postupná degradace ţivin je provázena stupňovitým uvolňováním energie.
Procesy odbourání všech ţivin lze rozlišit do tři fází: První fáze zahrnuje hydrolýzu sloţitých molekul ţivin na jednodušší jednotky. U ţivočichů probíhá v trávícím traktu. Polysacharidy jsou štěpeny na monosacharidy, proteiny na aminokyseliny, triacylglyceroly na mastné kyseliny a glycerol. V této fázi se nezískává ţádná volná energie ve formě ATP. Ve druhé fázi jsou monosacharidy, aminokyseliny i lipidové sloţky v několikastupňových enzymových pochodech postupně oxidovány na tzv. amfibolické meziprodukty, např. pyruvát z monosacharidů, glycerolu a některých aminokyselin a acetylkoenzym A z mastných kyselin a některých aminokyselin. Jako amfibolické jsou označeny proto, ţe mohou slouţit jako výchozí materiál pro některé anabolické pochody: z pyruvátu můţe znovu vzniknout glukosa (glukoneogeneze), z acetylkoenzymu A mastné kyseliny nebo steroidy. V této fázi vzniká přímo jen
malé mnoţství ATP pouze při odbourání glukosy. Vodíkové atomy získané dehydrogenačními pochody se však navazují na kofaktory oxidoredukčních enzymů, zejména NAD+ a FAD za vzniku redukovaných forem NADH a FADH2. Další podíl ATP vznikne po reoxidaci těchto kofaktorů v dýchacím řetězci. Největší energetický zisk z odbourání ţivin přináší aţ třetí fáze, která je nevratná. V cyklickém sledu reakcí označovaném jako citrátový cyklus je acetylová skupina acetylkoenzymu A postupně oxidována na 2 molekuly oxidu uhličitého. Vzniklé redukované kofaktory NADH a FADH2 jsou reoxidovány v dýchacím řetězci.
Schéma přeměny základních ţivin:
Principem odbourávání základních ţivin (lipidy, cukry a bílkoviny) je tedy jejich postupná oxidace aţ na CO2, která se nejčastěji odehrává formou dehydrogenace. V tomto odbourání lze rozpoznat analogii s anorganickým pochodem spalování, který, jak ze zkušenosti víme, je významným zdrojem energie. Rozdíl mezi anorganickým a biochemickým „spalováním“ je však v tom, ţe uţitečná energie uvolněná procesem oxidace při biochemických procesech se uvolňuje postupně a je proto maximálně vyuţita. Chemická energie konservovaná v ATP je hnací silou většiny forem práce spojené s ţivotními projevy organismů
Metabolismus sacharidů Glukosa obsaţená v celulose, škrobu a oligosacharidech nebo volná je nejrozšířenější organickou sloučeninou v přírodě. Pro chemotrofní organismy jsou sacharidy hlavní ţivinou, přičemţ v potravě člověka je převaţujícím sacharidem škrob. Doporučený denní příjem sacharidů je přibliţně 4–6 g/kg/den, v závislosti na výdeji energie. Optimální poměr hlavních ţivin v celkové energetické hodnotě Bílkoviny: 12-14%. Sacharidy: 58-60%. Tuky: 28-30%. Trávení sacharidů Trávení škrobu je zahájeno v ústech a je dokončeno v tenkém střevě. Ve slinách i v pankreatické šťávě je obsaţen enzym -amylasa, který katalyzuje štěpení (1 4) glykosidové vazby mezi glukosovými podjednotkami. Škrob je nejprve štěpen na kratší jednotky zvané dextriny, konečnými produkty jeho štěpení působením
-amylasy jsou maltosa, isomaltosa, D-glukosa a malé mnoţství tzv. limitních
dextrinů. Ve štěpení disacharidů včetně laktosy a sacharosy z potravy pak pokračují specifické disacharidasy, které jsou lokalizovány v kartáčovém lemu enterocytů. Monosacharidy jsou po té transportovány do portální ţíly. Celulosa není na rozdíl od škrobu a glukagonu štěpena
-amylasou a prochází trávicím traktem
nezměněna. Je to hlavní sloţka potravinové vlákniny. Metabolismus glukosy Glukosa podléhá v buňkách řadě metabolických přeměn. Hlavní cestou jejího odbourávání je glykolýza. Probíhá v cytoplazmě téměř všech buněk a slouţí jako zdroj energie. Můţe probíhat za přítomnosti nebo nepřítomnosti kyslíku (aerobní nebo anaerobní glykolýza).
ATP
CH2OH
ADP
CH2O P
O
O
OH HO
P O CH2 O
CH2OH
OH OH OH
HO
glukosa
OH OH OH
glukosa-6-fosfát
COO
NAD+
NADH + H+
COO
OH
OH
fruktosa-6-fosfát
H
C
O
H C OH
C O
CH OH
CH3
CH3
CH2
laktát
pyruvát
O P
glyceraldehyd-3-fosfát
Glykolýza je zahájena přeměnou glukosy na glukosa-6-fosfát. Ten izomeruje na fruktosa-6 fosfát, který je v další reakci fosforylován na fruktosa-1,6-bisfosfát. Při obou fosforylačních reakcích je spotřebováno ATP. Fruktosa-1,6-bisfosfát se štěpí na dvě tříuhlíkaté sloučeniny - glyceraldehyd-3fosfát a dihydroxyacetonfosfát, které jsou v rovnováze. Glyceraldehyd-3-fosfát podléhá sérii přeměn, při nichţ vzniká redukovaný pyridinový nukleotid (NADH) a 2 ATP. Konečným produktem je pyruvát. V důsledku posunu rovnováhy mezi triosami se na pyruvát přemění postupně i dihydroxyacetonfosfát. Souhrnně můţe být přeměna glukosy na pyruvát, která je společná pro aerobní i anaerobní glykolytické odbourání, popsána sumární rovnicí: C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi
2 CH3-CO-COOH + 2 NADH + 2H+ + 2 ATP
Za anaerobních podmínek je kyselina pyrohroznová redukována na kyselinu mléčnou. Tento děj se ve značné míře uplatňuje v buňkách intenzívně namáhaného kosterního svalu. V klidu nebo při mírné práci jsou svalové buňky dostatečně zásobeny kyslíkem a proto NADH vznikající v první fázi glykolýzy můţe být dehydrogenován v dýchacím řetězci. Při intenzívní práci však sval není kyslíkem dostatečně rychle zásoben, v buňkách se hromadí NADH. Je zde naopak nedostatek NAD+, který je potřebný k tomu, aby glykolýza mohla kontinuálně pokračovat. V tomto případě se NAD+ regeneruje reakcí pyruvátu s NADH za vzniku laktátu. Reakce je katalyzována enzymem laktátdehydrogenasou (LD). CH3-CO-COOH + NADH + H+
CH3-CH(OH)-COOH + NAD+
Uvedený způsob získávání energie pro svalovou buňku se označuje jako práce na kyslíkový dluh a můţe probíhat jen po omezený, velmi krátký časový úsek (doba záleţí na trénovanosti jedince a dalších faktorech). Hromadění laktátu v buňkách a jeho přesun do krve vyvolá acidózu, která se projeví svalovou bolestí a vyčerpáním. Po ukončení nebo zmírnění intenzity svalové práce, kdy sval je opět dostatečně zásoben kyslíkem, se část laktátu přemění zpět na pyruvát a NADH je reoxidováno v dýchacím řetězci. Anaerobní glykolýza probíhá rovněţ v erytrocytech. Příčinou je, ţe erytrocyty nemají mitochondrie a chybí jim proto dýchací řetězec, v němţ je za aerobních podmínek oxidováno NADH. Laktát je uvolňován do krve a reoxidován na pyruvát v játrech. Tvorba kyseliny mléčné z glukosy je rovněţ charakteristická pro mléčné kvašení, které probíhá u řady mikroorganismů, zejména u mléčných bakteriií (laktobacily, laktobakterie).
Za aerobních podmínek je kyselina pyrohroznová oxidačně dekarboxylována na acetyl-CoA. Jedná se o sloţitý proces, katalyzovaný multienzymovým komplexem. Jeho součástí jsou kofaktory thiamindifosfát (TDP), kyselina lipoová, koenzym A, FAD a NAD+. Děj probíhá v matrix mitochondrií a sumárně jej lze popsat rovnicí: CH3-CO-COOH + CoA-SH
CH3-CO-S-CoA + CO2 + 2 H
Dva vodíkové atomy, které se při reakci získají, jsou vázány ve formě NADH, který můţe být reoxidován v dýchacím řetězci. Acetyl-CoA vstupuje do citrátového cyklu. Na jednu molekulu glukosy jsou tedy v této fázi získány 2 NADH (2 3 ATP v dýchacím řetězci) a 2 acetyl-CoA. Kaţdý z acetyl CoA poskytne při oxidaci v citrátovém cyklu 12 ATP. Připočteme-li 2 NADH (6 ATP) a 2 ATP získané v počáteční fázi glykolýzy, je maximální energetický zisk při odbourání 1 molu glukosy 38 ATP. Úplné odbourání glukosy aerobní glykolýzou lze charakterizovat sumární rovnicí: C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP + 38 Pi
6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP.
Všiměte si shody s rovnicí spalování glukosy v prostředí kyslíku, kde se ovšem veškerá energie uvolní jako teplo.
