Hmotnostní spektrometrie v analýze biomolekul • Kontrola kvality/čistoty • Určení MW • Identifikace • Sekvenování • Charakterizace modifikací • Studium nekovalentních komplexů • Analýza směsí • Kvantifikace • Studium 3D struktury s nízkým rozlišením
Strategie peptidového sekvenování ¾ Zefektivnění fragmentace ¾ Preferenční tvorba jedné iontové série ¾ Odlišení iontových sérií ¾ „de novo” sekvenování
¾ Derivatizace: Chemically Assisted Fragmentation CAF ¾ H218O značení ¾ Esterifikace (EtOH: 28 Da / COOH skupinu) ¾ Ladder Sequencing
Chemically Assisted Fragmentation ¾ Modifikace lysinu (guanidylace) ¾ CAF reagens (NHS-ester se sulfonovou skupinou) ¾ negativně-nabité N-koncové ionty ¾ Spektra obsahují především y-ionty ¾ Reakce: 1-2 min v 50 mM NH4HCO3/MeCN (1:1) při lab. teplotě těsně před analýzou
MW = 184 Da
N-konec
Δm = 184 Da
Chemically Assisted Fragmentation
Značení pomocí
18O
Štěpení ve směsi H2O:H218O (1:1) 18OH
H
+ trypsin 999.5
H2O
999.5 1001.5
H218O
Značení pomocí
Q
D
T
F
18O
D
Q
T
Esterifikace » Esterifikace směsí alkohol/acetyl chlorid » modifikace Glu, Asp, C-konce » COOH skupina změněna na COOCxHy » ∆m – ethanol - 28 Da na každou COOH skupinu v peptidu
Ethylesterifikace
Ethylesterifikace FTQDFTDQSVK
„Ladder Sequencing“ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
z N- nebo C-konce Chemická nebo enzymatická degradace Edmanova chemie (PITC) Karboxypeptidasy (Y, P, B) Aminopeptidasy Karboxypeptidasa Y Čistý peptid
PROTEOM
proteinový komplement genomu, ale mnohem složitější... soubor proteinů určité buňky, tkáně nebo organismu v konkrétním čase a za určitých podmínek
PROTEOMIKA
nástroj ke studiu proteomu
• Funkční proteomika • Differenční proteomika
Funkční proteomika
Charakterizace protein-proteinových, protein-DNA, atd. interakcí v buňce.
Funkční proteomika – Analýza komplexů aneb kdo s kým.. Nativní elektroforéza S40 Ribosome subunit
kDa 667
Proteasome S26
440 230
Clathrin
ATP synth. F1
140 67
MARKER
Calreticulin
RNK16
KIDNEY
Diferenční proteomika
Určení proteinů, které mění hladinu svojí exprese v závislosti na stavu buňky/organismu.
Diferenční proteomika – identifikace proteinů pH 3.0 250 kDa
MW
10 kDa
non-linear IPG
pH 10.0
Proteiny ovlivněné terapií 1
Protein Spot No. 6
2 6
Protein Disulfide Isomerase P55
No. 1 & 2: Calreticulin 3
4
5
No. 3, 4 & 5: ER p57 protein No. 6: Protein Disulfide Isomerase P55
Bottom up vs. Top down identifikace proteinů • Štěpení proteinu/směsi • MS, MS/MS (na úrovni peptidů) • LC-MS(/MS) • DTB prohledávání na bázi PMF, MS/MS
• • • • •
Pre-frakcionace Purifikace v plynné fázi Určení přesné MW MS/MS proteinu DTB prohledávání pomocí MW proteinu a sekvenčního „tagu“ • Zachována informace o PTM
TopDown
http://kelleher.scs.uiuc.edu/
Kvantifikace pomocí MS • ESI, (MALDI) • Interní standard – stejné podmínky ionizace • Izotopické značení – ICAT – Isotope Coded Affinity Tags – značí jen některé AK, zjednodušuje komplexitu směsi, izotopický efekt H/D – PhIAT – Phosphoprotein Isotope Coded Affinity Tags – kvantifikace Pproteinů – D3/H3 acrylamid – značí jen Cys, nezjednodušuje komplexitu, menší izotopický efekt – D3/H3 esterifikace – značí C-konec, D, E, nezjednodušuje komplexitu, malý izotopický efekt – SILAC – Stable Isotope Labelling – přídavek L/I (C12/13, N14/15), žádný izotopický efekt, mnoho různých peptidů je značeno, komplexita směsi zůstává – AQUA – Absolute Quantification of Abundance
Isotope Coded Affinity Tag (ICAT) reagens O N
XX
O N
S Biotin tag
XX
O
XX
O
O
O
XX N
Linker (těžký nebo lehký)
I
Thiol reaktivní skupina
100
Relative Magnitude
N
d0- or d8-ICAT (X= H nebo D)
LDQWLCEK d0 d8 1520 1525
50
0 800
1200
m/z 1600
1530 1535 1540
2000
2400
Kvantifikace a identifikace pomocí ICAT
ICAT-em značené cysteiny
Směs 2
y n rá ra l b o s m j ád o e t y m c Případná frakcionace
Směs 1
100
Light
0
550
100
Smíchat a štěpit
560
Heavy
570
m/z
580
NH2-EACDPLR-COOH
Afinitní separace 0
200
400
600
m/z
800
Kvantifikace a identifikace proteinů
ICAT
vs .
in vitro značení Stav 1
SILAC in vivo značení
Stav 2
značení
Sklízení buněk Stav 1
Sklízení buněk
Stav 2
značení Stav 2
Stav 1
1+2
Smíchání buněk Přečištění
1+2
Smíchání proteinů Přečištění
Štěpení trypsinem a analýza LC-MS/MS
Štěpení trypsin a analýza LC-MS/MS
AQUA
Absolute Quantification of Abundance
Gerber SA, PNAS 2003, 100:6940
Nutná znalost toho, co známe. Peptid vytipován na základě předchozích pokusů Vhodné pro “lovení” málo abundantních proteinů (SRM mode)
Výběr vhodného peptidu: Ne M, W, H Ne KK, KR, RR nebo i KXR, KXK, KXXK Vhodná velikost – Nábojový stav
Čichám Čichám PTMs PostTranslační Modifikace • Disulfidické můstky (CysCys) • Glykosylace • Fosforylace • Acylace
• • • • •
Oxidace Acetylace Zkrácení Ztráta N-konc.Met Glu -> pyro-Glu
Disulfidické můstky A - určení zda jsou nebo nejsou přítomné – diferenční alkylace B – určení kolik Cys je volných a kolik vázaných 1. denaturace, alkylace činidlem I (u menších proteinů lze rovnou měřit MS) 2. redukce a alkylace činidlem II 3. štěpení a MS, LC-MS/MS – určení C – přímá identifikace disulfidů - štěpení + LC-MS (FTICR) – hledání disulfidicky spojených peptidů podle přesné hmotnosti
Diferenční alkylace – celý protein
Glykosylace • Mnoho důležitých funkcí: stabilizace struktury, dobré poskládání, ochrana před degradací, interakce ligandreceptor, targeting, modulace aktivity • N-glykosylace na sekvenci: NXT/S/C – v β-strukturách nebo smyčkách sacharid: větvený, 3 typy: mannosový, komplexní, hybridní • O-glykosylace nemá klasický motiv S, T, ale také hydroxyPro, Lys, atd. sacharid: cokoliv od monosacharidu pro dlouhé, případně mírně větvené struktury
N-glykosylace • Určení zda protein je nebo není glykosylován a - podle mobility na gelu+deglykosylace b - lektin-blot – určuje terminální sacharidy c - přímo v MS
c)
b) 1 2 3 4 5 6
– – – – – –
ConA LCA PNA SBA WGA UEA
a) TMSF PNGase F
N-glykosylace 1. 2. 3. 1.
2.
3.
Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity Nalezení míst glykosylace Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa a) uvolnění glykanu(-ů) – enzymaticky – PNGasa F, Endo H, Endo F1-3, postupné odštěpování pomocí exoglykosidas, Pronasa chemicky – hydrazinolýza, alkalické štěpení, TMSF – (pouze deglykosyluje – ničí sacharid) b) charakterizace glykanů – NMR, MS, MS/MS, permethylace+MS/MS, exoglykosidasy+MS a) Edmanovo odbourávání – nejlépe glykopeptidy peptidy po EndoH b) deglykosylace PNGasouF v H216O a H218O (+ štěpení AspN) – PNGasa F mění Asn na Asp (vzniká zásahové místo pro AspN) Štěpení proteinu – izolace glykopeptidů a opakovaní postupu na jednotlivých glykopeptidech
Glycan MS/MS – nomenclature
Domon-Costello (1998)
Glycosylation: PSD-MALDI MS
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Infrared Multiphoton Dissociation (IRMPD) • CO2 laserový paprsek • Vibrační excitace funkčních skupin OH, COOH, NH2… • Fragmentace peptidové páteře: b- a y-iontové series • Určení / ověření sekvence • Za mírnějších podmínek pouze ztráta labilních skupin - PTM
(nejenom)
Peptidové sekvenování ve FTMS
Electron Capture Dissociation (ECD) • Záchyt „studeného“ elektronu (E ≤ 0.1 eV) preferenčně na S-S můstcích a vazbě N-Cα • Neutralizace H+; [M+2H]+. Vodíkem nabohacený radikálový iont • Štěpení vazby N-Cα; extensivní fragmentace • c- a z-iontové série; b- a y-ionty chybí • Prefenční štěpení peptidové vazby, jsou zachovány labilní skupiny modifikací
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
ECD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
IRMPD Glykopeptidu
Anal. Chem. 2001, 73; 4530
Kombinace IRMPD & ECD • Komplementární techniky pro řešení peptidové/proteinové sekvence a lokalizaci a identifikaci PTMs • Může být provedeno během jednoho experimentu • Analýza glykopeptidů, fosfopeptidů, lokalizace γkarboxyglutamové kys., rozlišení Ile/Leu…
Fosforylace Signalizace, aktivace,… S, T, Y,
H
Ztráta (P) skupiny: -98, -80 - Směrovaná MS analýza (neutrální ztráta, precursor ion scanning, negativní mód) Nabohacení – protilátky, IMAC, TiO2 Působení fosfatázy / alkalií + diferenční mapování „Vychytávání“ fosfopeptidů: eliminace, adice afinitní skupiny
Fosforylace A
4 3 .3 0
100 90
3 2 .8 2
Relative Abundance
80 70 60 3 7 .3 5
50 40 2 6 .6 5
30
2 8 .0 1
3 5 .9 3
3 0 .0 3
20
4 2 .4 2
3 9 .3 1
10
3 4 .1 1
2 8 .9 8
4 4 .3 3
4 1 .1 3
0 2 9 .9 6
100
B
90
49 Da neutrální ztráta
Relative Abundance
80
Možné fosfopeptidy
70 60 50 40 30 2 6 .1 2
20
3 5 .9 1
10 0
2 7 .7 1
2 4 .9 0 25
26
27
28
29
3 2 .9 0
3 1 .0 1
2 8 .8 6 30
31
32
33
3 4 .2 7 34
35
3 7 .3 8 36
T im e (m in)
37
38
3 9 .0 9 4 0 .3 34 1 .2 6 39
40
41
4 2 .4 5
42
43
4 3 .8 7 4 4 .9 4 44
45
Fosforylace GVVTNGLDLSPADEK * Ztráta fosfátu Rodičovský iont
IMAC – Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography • IDA (iminodiacetic acid) NTA (nitrilo-triacetic acid)
• Iont kovu – Ga3+, Fe3+ • Nespecifická vazba – esterifikace
Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO2
Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO2
Působení alkalického prostředí P-peptidy
P-peptidy po působení alkálií
Mol. Cell. Proteom. 2002, 1:186-196
“vychytání” fosfopeptidů •Oxidace Cys •Eliminace •Adice ethanedithiolu •Biotinylace •Afinitní purifikace •MS, MS/MS •POUZE PRO pS, pT !!!
Nat. Biotech. 2001, 19:379-382
Flavoprotein – lokalizace flavinu?
RP-HPLC tryptického/chymotryptického digestu
220 nm
450 nm
flavopeptide
Flavoprotein – lokalizace flavinu? MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu PSD
[M+H]+
Flavoprotein – lokalizace flavinu? PSD MALDI-MS
H
a3-NH3-H2O a3-NH3 b3-H2O
S-T-H-W
[M+H]+
b3 y 2
H W S T
y1
a2 b2
a4 a3 y3
b4
Flavoprotein – lokalizace flavinu? MALDI-MS intaktního (?) flavopetidu
PSD
[M+H]+
[f+2H]+ 348 [j+2H]+ 136 h+ 250
438
Struktura flavopeptidu
785 [d+2H]+ 428
O
H N
O HN
4
N
4a
5a 6
2
O
7
CH3
?
9
N
10a 1
N
8
9a
CH3
H
OH
H
OH CH2
5
HN
1
NH2
f O
6
N O
O P O P O HO
438 d
His
N
3 2
OH
Thr
4
CH2
H
5
Trp
OH
2
CH2 5
HO
h
N
5
4
O 4
3
N N
8
1 2
OH
j
Ser
QDPTDVGEAFANVEWSVAELKR 2461.2 did not fit + 17Da bigger
Gln
O NH2
C
C H2
C H2
O
H C
C
NH2
N H
R
(111)D PTDVGEAFANVEWSVAELKR
NH3 H2C
H C
H2C
NH
O C
N H
C O
pyro-Glu
R
128-17=111 pyro-Glu !!!
Určování 3D struktur pomocí FT-ICR MS – MS3D - proteiny jejichž str. není řešitelná krystalografií nebo NMR (MW > 30kDa, flexibilní domény, membránové proteiny, proteiny s PTMs,…) - Surface accessibility – povrchové značení a reaktivita AK – jedna reaktivní skupina O
O C CH3
N
O O
- Intramolekulární zesíťovací činidla (cross-linkers) – dvě a více reaktivních skupin, odděleny raménkem o různé délce – tzv. molekulární pravítka O
O
O N
O
O
C
11.4 Å DSS
O
N O
O
O
O
C
N
O
O
O
O
O
C
O C
7.5 Å DSG
O N
O
N O
O
OH
O C
C OH
O
5.8 Å DST
O
N O
