folsav, (a pteroil-glutaminsav vagy B10 vitamin) O
OH CH2
N N H2N
N
C
H N
N
H C
H
CH2
COOH
CH2
N
COOH
pirimidin rész
pirazin rész
aminobenzoesav rész
glutaminsav rész
pteridin rész
dihidrofolsav O
OH CH2
N N H2N
N
C
H N
N
H C
H
CH2
COOH
CH2
N H
COOH
tetrahidrofolsav O
OH H N
N H2N
CH2
N
N H
N H
C
N
H C
H
CH2
COOH
CH2 COOH
A dihidrofolát-reduktáz (DHFR, EC 1.5.1.3) mind prokarióta, mind eukarióta szervezetekben életfontosságú enzim, nélkülözhetetlen a normális folsav-anyagcseréhez. Szerepe a tetrahidrofolsav szintjének fönntartása, 1) ez a purin- és pirimidinvázas vegyületek, és
2) egyes aminosavak bioszintéziséhez szükséges.
gyógyászati jelentősége kiemelkedő : számos hatóanyag, például a metotrexát és a trimetoprim ezt az enzimet gátolja, terápiás jelentősége hangsúlyos : rákellenes és antibakteriális szerek célpontja.
A FOLYAMAT SZEREPLŐI röviden
Dihidrofolsav (H2F) O
O N
N HN
HN
NH
NH R
H 2N
N
H 2N
N H
N
N H
COOH HOOC
N H
O
NADPH (NH) nikotinsavamid-adenin-dinukleotidfoszfát O H
N
H NH2 O N
O
O
P
O
P
O
O H
röviden
H NH2
N R'
N
O
OH
O H
OH
N
N
O
O OH
NH2
OH
O
P OH
OH
A reakció amely során a dihidrofolsav redukálódik és a kofaktor (NADPH) oxidálódik O
O
H
H
N HN
NH
NH2
+
R H2N
N
N H
N R'
Dihidrofolsav (H2F)
NADPH (NH)
O
O H N
HN
NH
NH2
+
R H2N
N
N H
Tetrahidrofolsav (H4F)
N R'
NADP+ (N+)
Dihidrofolsav (H2F)
NADPH (NH) H
O H
keto
O
Asp27
O
H
NHR
NH2
N
O
N H
O H
N
N
N H
N
R'
N
R'
N
R'
H
H
pro-R-H
H H
enol
O H
O Asp27
O
H
NH2
NHR N
O
N
H
O H
N
N
H
N H
pro-R-H
H
sztereospecifikus H átadás H H
O H
O Asp27
O
H
NHR N
NH2
O
N
O
H CH H
N H
N
N H
átmeneti állapot
A reakció a dihidrofolát-reduktáz enzimben történik
dihidrofolsav NADP
M-1 s-1
E
E.H2F
20 s-1
E.N+.H2F
50 s-1 1.7 s-1 5M-1 s-1
-1 -1 3.5 s-1 M s
E.NH
5M-1 s-1
M-1 s-1 -1
E.NH.H2F
Rövidítések:
40 s
dihidrofolát-reduktáz (E) -1
M-1 s-1
12.5 s
dihidrofolsav (H2F) 0.6 s-1
E.NH.H4F
-1
950 s
nikotinsavamid-adenindinukleotidfoszfát (NH) nikotinsavamid-adenindinukleotidfoszfát oxidált formája (N+)
85 s-1
M-1 s-1
E.H4F
tetrahidrofolsav (H4F)
M-1 s-1
E.N+.H4F
200 s-1 M-1 s-1
1.4 s-1
M-1 s-1
M-1 s-1
M-1 s-1 E
300 s-1
2.4 s-1 E.N+.H2F
E.N+ 6 s-1
A reakció a dihidrofolát-reduktáz enzimben nem megy, ha egyetlen extra CH3 jelen van metotrexát
Dihidrofolát reduktáz metotrexáttal
Metotrexát a kötőhelyen
dihidrofolsav O
OH N
CH2
N
N
C
H
H2N
N
N
H C
H
CH2
COOH
CH2
N H
COOH
metotrexát CH3
NH2 N N H2N
N
N
CH2
N
O C
N
H C
H
CH2
COOH
CH2 COOH
Az extra -CH3 és -NH2 biológiai jelentősége csak a fehérje szerkezetének ismeretében értelmezhető!
Hogyan világít a szentjánosbogár? Avagy a luciferin szubsztrát átalakulása Lucifer lux + fero fénythozó
A reakció folyamatának biokémiai áttekintése •
I. Aktiválási lépés:
•
Az enzim köti a luciferint, egy ATP felhasználásával pedig aktiválja a karboxilcsoporton keresztül a szubsztrátot.
Enzim + Luc-COOH MgATP
PPi
•
II. Oxidáció:
•
Az oxidáció α-peroxilaktámon keresztül megy végbe, mely az enzimhez kötött gerjesztett terméket eredményez.
Enzim:Luc-CO-AMP O2
AMP CO2 H 2O
•
III. Kisugárzás (relaxáció):
•
Az aktivált komplex a reakció végső lépéseként fénykibocsájtás révén relaxál, létrehozva az alapállapotú végterméket.
Enzim:Luc=O* h
Enzim + Luc=O
A luciferin gyűjtőnév a luciferináz enzim szubsztrátjait jelenti: oxigén jelenlétében az enzim biolumineszcenciát eredményez.
H
O
N
N H N
NH 2
N H NH N H
Cypridina Luciferin
O CHO
O Latia Luciferin
N
N
HO
N H
O
Renilla Luciferin
N
NH
N HO
Chromophore of Aequorin
Az aktiválás mechanizmusa R-luciferin 2-(6-Hydroxy-benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-thiazole-4-carb oxylic acid Az R forma a természetben elõforduló, de az S forma is mutatja a kemolumineszcencia H jelenségét HO COOH S N NH 3
1
6
3
4
2
1
N
+
S
N
N
4
40000 bogárból izoláltak néhány mg luciferint
O HO
P
O
O
P
P
O
N
O
OH
O
O
N
O
O
H
2+
Mg
H
H
OH
H OH
ATP
NH2 N
O HO
S
N
N
O O
O
P
H
S
H
H
OH
H OH
R-luciferin O
O
+
HO
N
O
OH N
N
P OH
O
P OH
pirofoszfát
OH
AMP
Az oxidációs lépés Aktivált R-luciferin
O
H
H
HO
S
N
AMP
N
CH3 CH2 O
lazitott hidrogén
S
C H
CH3 H
O2
O O
O2 (bázikus közeg)
H
CH3 CH2 O
O O
-
O
S
CH3
- EtOH
O
N
C H
O AMP N
O
S C H
CH3
polimerizáció
18
OH
H3C
nukleofil addició CH
H
O
O-
O S
N
AMP 18
N
S
O H
H O -
O
O S
O-
N
AMP
18
N
S
O H
elimináció és dekarboxileződés -
O
S
N
N
S
O
polimer peroxid (szilárd, robban)
O -
O
O
+ 18O
C
O
+ OH + AMP
H
n
A relaxáció -
O
az oxidált termék gerjesztett elektronállapota felelős a fénykibocsájtásért
S
N
N
S
O
Luc=O*
h sárgászöld fény -
O
S
N
N
S
Luc=O
• •
O
A pontos szint a fehérje, a luciferináz módosítja
N-terminális domén: kék (A β-réteg), lila (B β-réteg), zöld (β-hordó). C-terminális domén: sárga
Az elsődleges szerkezet
• •
Invariáns szekvencia (piros), 50%-nál nagyobb homológia: rózsaszín (Az összehasonlítás alapját 38 rokon fehérje szekvenciája képezi.)
A másodlagos szerkezet
A luciferáz aktív centruma
• •
Piros: invariábilis aminosavak (Lys206, Glu344, Asp422) Kék: variábilis aminosavak
A luciferin kötődése az árokba