8. Előadás Peptidek
Peptid szintézis: a koncepció 1. Probléma
H2N
CH
COOH
+
CH
H2N
- H2O
R H2N
CH
CO HN
CH
H2N
COOH
R,
COOH + H2N
CH
R'
CO HN
CH
R
CH
R,
R'
CH
CO HN
COOH +
H2N
R
CH
CO HN
R
R'
COOH
CH
COOH
R
Keverék, alacsony konverzió O
2. Megoldás
NH
Q
CH
C
+
NH2
CH
CO
OQ
2
-HX
X
R
R'
O Q
NH
CH R
C
O NH
CH
COOQ
2
NH2
R'
Egyféle termék, magas konverzió 3. Követelmények 3.1. Védőcsoportok, egyszerű beépítés, egyszerű eltávolítás 3.2. Hatékony kapcsolási reakció
CH R
C
NH
CH R'
COOH
Négy lépés 4.1. Védett (N-, C- és oldallánc) aminosavszármazékok CH
H2N
COOH
CH
H2N
R
Q
R'
CH
HN
COOH
H2N
COOH
CH
COOQ
vagy H2N
R'
R
CH
CO
R'
4.2. A C-terminálison „aktivált” aminosavszármazék szintézise O HN
Q
CH
C X
R
4.3. Kapcsolás O Q
HN
CH R
C
O HN
CH
COOQ
vagy Q
HN
C
HN
R
R'
4.4. Védőcsoportok eltávolítása
CH
H2N
CH R
CO
HN
CH R'
CH R'
COOH
CO
1. Védőcsoportok „All modern work in Peptide synthesis employs the following approach: the amino group of one amino acid is first stabilized by the introduction of a protecting group R, the carboxy group is modified so that it is capable of coupling, and finally the R group is removed to produce the finished peptide. The difficulty lies in finding a suitable group R, which can be removed so gently that the peptide is not significantly attacked.” Bergman, M., Zervas, L.: Berichte Chem. 65, 1192 (1932)
Csoportosítás 1. 2. 3.
Nα - védőcsoport Cα - védőcsoport Oldallánc védőcsoport
1.1. Nα-Amino csoport védelme 1.1.1. Benziloxi-karbonil (Z) Bergman, M., Zervas, L. : Berichte Chem. 65,1192 (1932)
Beépítés O
O
-HCl CH2
O
C
Cl
+
H2N
CH
CH2
COOH
O
C
HN
CH
COOH
R
R
Benziloxikarbonil aminosav
Benziloxikarbonil klorid
Eltávolítás
sav
bázis
H2/kat HBr
CH2H
+ CO2
CH2Br
+ H2N
CH R
+ CO2
COOH
Lewis sav (Me3SiI)
CH2I
+ CO2
Hasítási mechanizmus Benziloxi-karbonil O
(a)
O O
C
CH2Br
+ HO
NH
NH
H2N
CO2
CH2
(a) H Br (b) Me SiI 3 (Lewis sav)
C
MeCN (b)
CH2I
+
O
O
SiMe3
C
NH
+ MeOH CO2 + H2N
+
Me3SiOMe
1.1.2. t-Butiloxi-karbonil (Boc) Carpino, L.A. et al. JACS (1957)
Beépítés CH3 CH3
C
O O
C
CH3 N3
+
H2N
CH
CH3
COOH
C
R
CH3
O O
C
HN
CH3
terc-Butiloxikarbonil azid
R
terc-Butiloxikarbonil aminosav
Eltávolítás bázis
H2/kat TFA
H 3C CO2
CH
C
+
CH2
+ H2N
CH
H 3C
R
COOH
COOH + HN3
Hasítási mechanizmus CH3
terc-Butyloxycarbonyl H 3C
(Boc)
O O
CH3 CO2
CH3 H3C
O O
CH3
CH3
NH
H3C
H2N
OH O
NH (CH3)3C
H
CH3
H3 C C H3 C
CH2
1.1.3. 9-Fluorenilmetoxi-karbonil Carpino, L.A. et al. JACS 92, 5748 (1970)
Beépítés
H
H
O
O
-HCl CH2
O
C
Cl
+
H2N
CH
COOH
CH2
O
C
CH
HN
R'
Eltávolítás
COOH
R'
H2/kat bázis (20% piperidin/DMF) részleges
sav
CH2
+ CO2 +
H2N
CH R'
COOH
Hasítási mechanizmus O O
9-Fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc)
CO2
+H
N H
O
H O
-H CH2
O
C
CH2
O
C
H2 N -
HN
HN
+
CH2
1.2. Karboxi védelem Észter kötés kialakítása HO
Beépítés H2N
CH
COOH
C H2
O -H2O
+
H2N
-HCl
R
Cl
C H2
C
O
C H2
C H2
Eltávolítás H2/kat.
H2N
CH
COOH
sav (HF)
H2N
COOH
H2N
R
R
+ H
CH
bázis (pl. NH3)
C H2
+ F
CH R
C H2
+ HO
C H2
COOH
1.3. Oldallánc védelem 1.3.1. Glu, Asp 1.3.2. Lys 1.3.3. Ser, Thr, Tyr 1.3.4. Arg 1.3.5. His 1.3.6. Trp 1.3.7. Cys
-OH védőcsoport Benzil(éter) (Bzl)
CH2
CH3 H3C CH3
terc-Butil (éter) (t-Bu)
Tritil* (Trt)
Eltávolítás
H CH2
* csak Ser/Thr
O
CH2
+ HO
-SH védőcsoport
Tritil (Trt) I
Eltávolítás
S
S
Trt
S
S
+ Trt I
I-I
redukció
S
H+ (erős sav)
C
+
HS
Imidazol védőcsoport CH
HN
CO
CH2
π τ
N NH
(τ) H3C
Tritil (Trt)
H3CO
4-Metiltritil (Mtt)
4-Metoxitritil (Mmt)
Guanidino védőcsoport CH3
OCH3 H3C
H3C SO2
CH3 SO2
4-Toluolszulfonil* (Tos) * HF vagy Na/NH3
4-Metoxi-2,3,6-trimetilbenzolszulfonil (Mtr)
Eltávolítás
H 3C
CH3
NH HN
C
NH
NH
O2 S
TFA OCH3
H2N
C
NH
O2 S
H H 3C
H 3C
NH H2N
C
+
O 2S
CH3
OCH3
NH H 3C
elektrofil
Az optimális védőcsoport – összegzés
1.
Könnyű és hatékony beépülés.
2.
A peptidkötés érintetlensége a beépítés/eltávolítás alatt.
3.
Több mint egyféle eltávolítási lehetőség.
4.
Nincs racemizáció.
5.
A melléktermékek egyszerű és könnyű eltávolítása.
6.
A reakciók szobahőmérsékleten menjenek végbe.
2. lépés: Az aminosav „aktiválása” 2.1. A karbonsav származékok aktivitása O O R
>
C Cl
R
O R
>
C N3
O
C O
R
>
>
R OR'
C O
O
O
>
R OH
R NH2
2.2. A karbonsav származékok aktiválása 2.2.1. Acil azid (T. Curtius, Berichte Chem. 35, 3226,1902) O R
N H
O
H C
H2N
R
- R,-OH
OR'
Q
NH2
N H
O
H C Q
NaNO2 HN
NH2
R
N H
H
H C Q
N3
2.2.2. Actív észter
(M. Bodanszky, Nature, 175, 685, 1955; J. Kovacs, JACS, 89, 183, 1967; L. Kisfaludy, Liebigs Ann. 1421, 1973)
HO
NO2 Cl
O R
N H
H C Q
HO
+
C
Cl
OH
O
Cl Cl
Cl
F
F
HO
R
Q F
F
F
N H
H C
+ H2 O
C O
2.2.3. Anhidrid (vegyes)
(E. Fischer, Berichte Chem. 36, 2094,1903; T. Wieland, Liebigs Ann. 569, 122, 1950)
O R'
H C
N H
O
C
R' OH
Q
OH R
H C
N H
C O
Q -H2O
R
C O
C O
2.2.4. Anhidrid (szimmetrikus)
(F. Weygand et al., Z. Naturf. 22, 1084, 1967)
O R'
N H
H C
C
R'
OH
Q
OH R'
N H
H C
Q
C
N H
C H
O
C O
-H 2 O
R'
N H
H C Q
Q
O
C O
2.2.5. Karbodiimid
N
O R
N H
H C Q
+
C OH
(J.C. Sheenan, G.P. Hess, JACS, 77, 1067, 1955)
C N
DCC
HN
O R
N H
H C Q
C
O
C N
3. lépés: A peptidkötés kialakítása 3.1. Acil azid (nincs racemizáció) O R
C
+
H2N
R
R'
C
N
N
N
N
N
N
O
R'
O N
R
H
HN
H
+
C R'
3.2. Aktív észter (SN) O R
C
O
+ O
H 2N
R'
R
+
C HN
R'
HO-C6H5
HN3
3.3. Anhidrid szimmetrikus
O R
C
O
O R
+
H2N
R''
R
C
C HN
+
R -COOH
+
R'-COOH
R''
O
aszimmetrikus O
δ R
C
O O
R'
+
H 2N
R''
C
R
C HN
O
Térgátlás
R''
O
3.4. Karbodiimid
R
δ
N
C O
C HN
közvetlen +
H2N
közvetett
O-acilizourea
O
+
2
O
H
O R
C +
O
C
R
O R
R
N H HN
C
R2
HN
O
+
O
C
R
HN
O
anhidrid
C HN
R2
+ H2N
O R
C
O
N H
R2
+
R
C OH
Racemizáció Az enantiomer átalakulása enantiomer keverékké
sp3
H
NH
-H
CO R
NH
bázis
CO
sp2
R
+H
+H
H
R CO
NH NH
CO R
D
L H
A racemizáció mechanizmusa a: direkt enolizáció
B
H NH
α
O
C
C
NH
- HB
H
..
N
O
C
O
C
C X
H
b: oxazolon képződés* H
H α C
C
R
N
C
H R
C
- HB
HO
C X
NH
+H
X
R
B
C
C
X
R
R
O
X
O
- HX
C
N
O
α
C
R
C
O
O - H+
R
C
H
R
..N
C
O
HX
H
O
N
C
H
H+
C O
C O
C X
C
N
C
R
C O
O
* :B nélkül :N iniciálja a reakciót
Poláros fény
A racemizáció és a kormeghatározás
Halál után Halál után
Stratégiák: Szegmens kondenzáció Q - NH
CO – Q,
CO-X H 2 N
Q - NH
CO - Q,
Q - NH
Q - NH
Részleges hasítás / aktiválás
H2N
CO – Q,
Q - NH Hasítás H2 N
CO - Q,
Részleges hasítás
CO-X
Prot - NH
CO - Q,
CO-X H 2 N
COOH
CO – Q,
Stratégiák: Lépésenkénti hosszabbítás A) C-terminálison
CO-X H2 N
Q - NH
CO – Q, CO – Q,
Q - NH
Részleges hasítás / aktiválás CO – Q,
CO-X H2 N
Q - NH
CO – Q,
Q - NH
B) N-terminálison
etc.
Q -NH
CO-Q,
CO-XH2 N
Q -NH
CO-Q, N-terminalis hasítás
Q -NH
CO-X
H2 N etc.
CO-Q,
There is a need for rapid, quantitative, automatic method for the synthesis of long peptides. A possible approach may be the use of chromatographic columns, where the peptide is attached to the polymer packing and added to an activated amino acid followed by removal of protecting group, with repetition of the process until the desire peptide is built up. Finally the peptide must be removed from the supporting medium.
R.B.Merrifield
Laboratory note book (1959)
JACS 85, 2149 (1963)
Bruce R. Merrifield
A szilárd fázisú peptidszintézis elve Funkcionalizálás Gyanta
X
Módosítás Gyanta
.
Gyanta
Kapcsolás
.
H2 N S S
Gyanta
COOH
Láncnövekedés
Hasítás, tisztítás .
Célpeptid
. . .
.
.
Gyanta
A szilárd fázisú peptid szintézis főbb szempontjai A. A szilárd felszín 1. Tartalmazzon reaktív csoportokat funkcionalizálásra 2. Peptid-polimer kötés hasítható legyen 3. Stabil legyen a szintézis körülményei között 4. A peptidlánc hozzáférhető legyen az oldószer és a reagensek számára
B. Védőcsoport kombinációk 1. Peptid-polimer kötés stabil legyen a szintézis alatt 2. „Átmeneti” védőcsoport az α-amino csoporton 3. „Állandó” védőcsoport az oldalláncokon 4. Hatékony hasítás.
Védőcsoport típusok a szilárd fázisú szintézisben
b a
c R
α a. N - védőcsoport („átmeneti") b. Oldallánc védőcsoportok („állandó") c. Gyanta-peptid kötés
Boc/benzil stratégia - Merrifield módszer CH3 CH3
OCO-NH CH3
CH
CO
OCH 2
P
CH2 O
Erős savakra érzékeny (HF, TFMSA)
„közepesen” savérzékeny (TFA / CH2Cl 2)
Fmoc/t-butil stratégia - Sheppard módszer
H
OCO-NH
CH
CO OCH 2
OCH 2
CH2 O CH3
CH3 CH3
Bázisra érzékeny (piperidin / DMF)
TFA érzékeny
P
Lineáris szintézis
O
R
+
OH
O
Anchoring of first amino acid
X
R
α
N Deprotection
O H 2N O
+
X
R
O
OH Amino acid coupling
X
R
α
N Deprotection
O H 2N
O
X
R
+ O
OH Amino acid coupling Repetitive cycles of N
X
α
R
deprotection and amino acid coupling
O Resin-bound fully protected peptide
X
R
Acidolysis
O Free peptide
H 2N
XH
X=O for peptide acids X=NH for peptide amides
Konvergens szintézis R Detachment of protected peptide segment from resin, and purification
COOH
H2N
R
R Segment coupling on a solid support
COOH
Fully protected peptide on solid support
Free peptide
H2N
R
R
H2N
COOH
Szilárd fázisú peptid szintézis: Összegzés Solid phase peptide synthesis
Functionalized polymer
Fully protected peptide-resin deprotection *
AAA HPLC Characterization HPCE enzyme digestion MS
peptide-resin cleavage
purification Crude free peptide
Purified peptide (control by HPLC, AAA, etc.)
Mit találhatunk a szintézis „nyers” termékében ?
Terminated Wrong peptides Deleted
Ac-DEFGHIK Ac-HIK
ABCDEFHIK (minus G) ABCDFGHIK (minus E) ABCEFGHIK (minus D) ACDEFGHIK (minus B)
Incompletely deprotected peptide products
Non-peptide
Peptide
The desired peptide (!) Deprotection scavengers Protecting group derivatives Anything else...
Szintézis „formák” Multiple Keverék
Kombinatorikus vegyület tárak
Párhuzamos
T-bag szintézis Tűhegy – módszer Folt szintézis (1988) Fotolitográfia/csip
Kombinatorikus szintézis: keverés-osztás elv Furka et al. Int. J.Pept. Prot. Res. (1991)
T- R
1
2 A
1
3 D
2
4 E
3
6
5 F
4
G 5
7 H
6
8 I
7
9 K
8
10 L
9
11 M
10
12 N
11
13 P
15
14 Q
R
16 S
17 T
18
19
V
W
Y
12
13
14
15
16
17
18
19
12
13
14
15
16
17
18
19
X1T- R
1
2 A
1
3 D
2
4 E
3
F 4
6
5 G 5
7 H
6
8 I
7
9 K
8
10 L
9
11 M
10
N 11
X2X1T - R
X2X1T
P 12
Q 13
R 14
S 15
T 16
V 17
W 18
Y 19
A TX1TX2T peptidtár kombinatorikus szintézise T- R
1
2 A
1
3 D
2
4 E
3
6
5 F
4
G 5
7
8
H 6
I 7
9 K
8
10 L
9
11 M
10
12 N
13 P
11
15
14 Q
R
16 S
17 T
18
19
V
W
Y
12
13
14
15
16
17
18
19
12
13
14
15
16
17
18
19
X2T- R T TX2T- R
1
2 A
1
D 2
T T X2 T A T
3
4 E
3 T
T X2 T D T
F 4
T T X2 T E T
6
5
5 T
T X2 T F T
G
7 H
6 T
T X2 T G T
8 I
7 T
T X2 T H T
K 8
T T X2 T I T
9
10 L
9 T
T X2 T K T
11
10 T
T X2 T L T
N
M 11 T T X2 T M T
P 12
T T X2 T N T
Q 13
T T X2 T P T
14 T
T X2 T Q T
R
S 15
T T X2 T R T
T 16
T T X2 T S T
V 17
T T X2 T T T
W 18
Y 19
T
T
T X2 T V T
T X2 T W T
T T X2 T Y T
A TQTX2T alpeptid tárak szintézise T- R
1
2 A
1
3 D
2 T
1
T A T Q T
Q 2
T
Q
T
4 T T F T Q T
T
Q
T G T Q T
T
Q
T T I T Q T
M
T 10
Q 9
T
N
P
T
Q
10
Q
T T N T Q T
R
T
T 13
Q
14
T T P T Q T
T Q T Q T
T
T
15 16 Q
14 T
T
V
15 16 17 T
Q
17 18
S
14
11 12 13 T
T M T Q T
Q
15 16
14
13
11 12
T T L T Q T
13
11 12
T
Q
T K T Q T
11 12
10
9
8 T
L 9
8
7
10
K
T
Q
T H T Q T
9
8
7
6 T
I 7
6
5
8
H
T
Q
7
6
5
T T E T Q T
G 5
4
3
T D T Q T
F
T 3
6
5
4
T
Q
T
E 3
2
1
4
Q
T
Q
15 16 17 T
T R T Q T
T T S T Q T
W 18
T T T T Q T
T V T Q T
19 T 19
Q 18
T
Y
T
17 18 Q
19
T T W T Q T
Q 19 T T Y T Q T
Folt (spot) peptidszintézis
Alkalmazások
Néhány „fontos” peptid
H2N
CH2
CH2 CO
NH CH
COOH
CH2
Karnozin (N-b-alanilhisztidin)
C CH
N CH
Glutation
Glu Cys-Gly
Izolálás: 1921 Hopkins Szerkezet: 1930 Cisztin Szintézis: 1935
γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin
Oxitocin
NH
Cisztein
Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 Peptidhormon: tejelválasztás, uterus kontrakció Szerkezet: 1953 Duvigneaud (Nobel díj 1955) Szintézis: 1954 Duvigneau
Vazopresszin
Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2 Vérnyomás szabályozása, Duvigneau
Inzulin
Hasnyálmirigy hormonja A lánc B-lánc
1
6-7
1
7
11
20-21 19
30
Izolálás: 1922 Banting Primer Szerkezet: 1953 Sanger Szintézis: 1969 Zahn, Wang, Katsoyannis Térszerkezet: 1965 Hodgkin
ATCH
39 aminosav Sertés: szintézis Schwitzer, 1963 Humán: szintézis Bajusz, Kisfaludy, Medzihradszky 1971
