ONTVANGST STALEN VOOR SEQUENERING 1
BESTELBON OPMAKEN
Maak een interne bestelbon ten gunste van 'Vakgroep Pediatrie en Genetica' (leveranciersnummer: GE02) voor een 'interne wetenschappelijke dienst' (artikelnummer: 3000038). Maak hierin gebruik van de aangewezen product- of service code (zie Overzicht) en vul het juiste aantal in. Deze bestelbon met als nummer 4 3XX XXX XXX dient goedgekeurd te worden door het diensthoofd en afgegeven te worden samen met afleveren van de stalen. De GSU-operator van dienst zal uw stalen ontvangen en u een ontvangstbewijs geven. De juiste werkwijze voor het aanmaken van een bestelbon, zie document: Aanmaak sequeneringsbestelbon op CMGG-website: faciliteiten/dienstverlening. We raden nieuwe gebruikers aan om contact op te nemen met een persoon van de GSU (tel: 09/322 46 71 of via e-mail:
[email protected]) om samen de eerste ingave van de te sequeneren stalen uit te voeren om tot een succesvolle ingave te komen. Bel het nummer 24671 bij de ingang van het MRB gebouw en een GSU-medewerker zal u binnenlaten. Services Code GSUs001 GSUs002 GSUs008
Beschrijving Sequeneren (just run) Reacties + sequeneren Cleanup + run(sequeneren)
Prijs 2,00 € 4,00 € 3,00 €
Eenheid 1 well 1 well 1 well
Producten Code GSUp001 GSUp002 GSUp003 GSUp004
Beschrijving Big Dye Terminator (ready reaction mix) 96-well plaat (AB-0600) + seal (AB-0588) strip-8 (AB-0266) Roche 384-well plaat
Prijs 67,00 € 4,90 € 0,90 € 6,50 €
Eenheid 80µl plaat strip plaat
2
JUST RUN SETTING
2.1 Sequeneren (just run) Indien de stalen al opgezuiverd zijn door de externe klant zelf, kiest men in Finch bij het ingeven van de stalen bij “Service” voor “Just Run”. Zie voor het gebruik van Finch het document: Het gebruik van Finch voor sequenering.
De opgezuiverde producten dienen afgegeven te worden in het bureautje van de GSU (lokaal 110.018). De opzuivering kan gebeurd zijn met de Ethanol-precipitatie of met beads. Bij afleveren van de stalen moet dit duidelijk vermeld worden op de stalen. De opgezuiverde producten kunnen in de volgende formaten aanvaard worden: • in een 96-well plaat (ABgene AB-0600), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met een eenvoudig verwijderbare seal. Er wordt aangevuld in kolommen. • in strips van 8 (ABgene AB-0266), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met de bijhorende afsluitstrips. Plaats de strips in de juiste volgorde en oriëntatie in het doosje.Er wordt aangevuld in kolommen 2.2 Cleanup + run (sequeneren) De externe klant kan er ook voor kiezen om gesequeneerde producten bij de GSU te laten opzuiveren. In Finch wordt er bij het ingeven van de request gekozen voor “Sequencing cleanup + run” bij Service. Zie document: Het gebruik van Finch voor sequenering De gesequeneerde producten kunnen in de volgende formaten aanvaard worden: • in een 96-well plaat (ABgene AB-0600), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met een eenvoudig verwijderbare seal. Er wordt aangevuld in kolommen. • in strips van 8 (ABgene AB-0266), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met de bijhorende afsluitstrips. Plaats de strips in de juiste volgorde en oriëntatie in het doosje. Er wordt aangevuld in kolommen
3 BIDIRECTIONEEL/UNIDIRECTIONEEL SEQUENERING 3.1 Eisen aan de startproducten 3.1.1 PCR producten De sequencingfaciliteit kan enkel PCR-producten aanvaarden die aan de volgende voorwaarden voldoen: • minimaal volume: 10 µl (dit zowel voor unidirectionele als bidirectionele sequenering) • concentratie: 10-20 ng/µl !! • lengte: 100-800 bp • Controle op agarose gel geeft een specifieke band van de juiste lengte • Negatieve controle geeft geen amplificatie Indien niet aan deze voorwaarden wordt voldaan, of bepaalde kwaliteitstesten niet werden uitgevoerd kan geen enkele garantie gegeven worden op het resultaat van de sequenering en zal ook niet gereageerd worden op klachten. 3.1.2 Primers Custom primers dienen aangeleverd te worden aan 1 µM. Standaard primers, opgenomen in onderstaande lijst hoeven en mogen niet aangeleverd worden. Primernaam M13_F_A M13_R_A M13_F_B M13_R_B
Primersequentie TGTAAAACGACGGCCAGT CAGGAAACAGCTATGACC CACGACGTTGTAAAACGAC GGAAACAGCTATGACCATG
3.2 Afleveren van de producten Zowel PCR-producten als primers dienen afgegeven te worden in het bureautje van de GSU (lokaal 110.018). Plaats je PCR-producten in een blauw doosje, en de bijhorende primers in een geel doosje. Vermeld duidelijk de request ID nr met een alcoholstiftje boven op het deksel van de doosjes. Let op: Uitvulling moet in kolommen zijn gebeurd!!!!
Voor bidirectionele requests dient 1 blauw doosje afgegeven te worden waarop beide request-ID’s vermeld staan, alsook 2 afzonderlijke gele doosjes met hun bijhorende request-ID. Plaats de gelabelde blauwe en gele doosjes in het “holding requests”-vak van de koelkast in lokaal 110.018. Let op: Uitvulling moet in kolommen zijn gebeurd!!!!
Stalen en primers kunnen in de volgende formaten aanvaard worden: • PCR stalen in een 96-well plaat (ABgene AB-0600), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met een eenvoudig verwijderbare seal. • PCR stalen in strips van 8 (ABgene AB-0266), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met de bijhorende afsluitstrips. Plaats de strips in de juiste volgorde en oriëntatie in het blauwe doosje. Maak ook een aanduiding van de welnamen zoals deze zouden zijn in een 96-well plaat, bv. A1 voor de eerste wel van de eerste strip en A3 voor de eerste wel van de derde strip. • Primers ENKEL in strips van 8 (ABgene AB-0266), al dan niet volledig gevuld, en afgesloten met de bijhorende afsluitstrips. Plaats de strips in de juiste volgorde en oriëntatie in het gele doosje. Maak ook een aanduiding van de welnamen zoals deze zouden zijn in een 96-well plaat, bv. A1 voor de eerste wel van de eerste strip en A3 voor de eerste wel van de derde strip. Primers kunnen niet afgeleverd worden in een plaat! PCR stalen en primers dienen steeds per kolom uitgevuld te worden zonder lege plaatsen te laten. Het minimale volume voor PCR producten is 10µl, voor primers is 3µl per reactie vereist + extra dood volume van 30µl. Vb. 8 stalen moeten met dezelfde primer worden gesequeneerd:af te geven volume: ( 8 x 3µl)+ 30µl = 54 µl
Het maximaal volume dat in één enkel epje kan afgegeven kan worden is 240 µL. Zie punt 3.2 voor grotere volumes PCR stalen dienen afgegeven te worden in de posities zoals opgegeven in de request. Voor primers geldt de volgorde zoals bepaald door het primerscript. (zie 5.3.3)
3.2 Bepalen van primerposities In de Finch-software kan de positie van al je PCR-producten worden opgegeven, maar voor primers is dit niet mogelijk zonder elke primer meermaals aan te leveren. Er is een tool aangemaakt die automatisch de volgorde bepaalt. Dit primerscript (ExtractPrimerlist.xls) kan gedownload worden van de website http://medgen.ugent.be/CMGG/ faciliteiten/dienstverlening In Finch kan een export van je request gemaakt worden door” Requests” onder “Sequencing” te selecteren, je request op te zoeken en aan te klikken, en onderaan op” Export Requests” (as a tab-delimited PC file) te klikken. Open het sequencing script (macro's aanvaarden!), klik op de knop (Create primer list) en selecteer het bestand dat je zonet vanuit Finch geëxporteerd hebt. Het script bepaalt welke primer op welke positie komt. Let op: Uitvulling moet in kolommen zijn gebeurd!!!!
Indien meer dan 64 stalen met éénzelfde unieke primer dienen gesequeneerd te worden of indien het totaal volume van éénzelfde unieke primer 240 µl overschrijdt, wordt dit met een kleurcode in de ExtractPrimerList aangegeven. (zie figuur 1) Gelieve in dit geval uw unieke primer aan te leveren in een volledig opgevulde 8-well strip.
Figuur 1:
3.3 Aanvaarding van de stalen De requestor moet zelf de stalen en primers overbrengen in de blauwe/gele doosjes en in de GSU-koelkast plaatsen. Sequeneringsaanvragen worden in de Finch-software automatisch op “holding” geplaatst tot wanneer
de bijhorende producten fysisch afgeleverd worden. Bij ontvangst van de stalen vult de GSU-operator een bon voor beide partijen in als bewijs van afgifte. Van zodra de producten goed ontvangen werden (volledig en vergezeld van een bestelbon), verandert hun status naar “pending” wat betekent dat ze vanaf dan in een “run” terecht kunnen komen. Deze statuswijziging wordt in Finch door de GSU-operator uitgevoerd. PCR-doosjes en primers worden door de GSU-verantwoordelijke vervolgens in de diepvries geplaatst tot verder afwerking.
4
VERWERKINGSTERMIJN
Voor PCR-stalen van normale prioriteit geldt dat sequeneringsresultaten beschikbaar zijn na 5 werkdagen tellend vanaf de status wijziging naar “pending”. Indien er door geplande onderhoudswerkzaamheden of technische problemen grotere termijnen gelden zal hiervoor melding gemaakt worden op de Finch website als een “Message of the day”
5
AFHALEN VAN DE SEQUENERINGSRESULTATEN
Zie document: Afhalen van sequeneringsresultaten
