12 III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1
Bahan Penelitian
3.1.1 Objek Penelitian Objek penelitian yang digunakan yaitu semen yang berasal dari lima ekor kambing PE umur 2-3 tahun. 3.1.2 Bahan dan Peralatan Penelitian a.
Penampungan Semen Bahan yang digunakan untuk penampungan semen yaitu air hangat dan
vaselin. Adapun peralatan yang digunakan dalam penampungan semen yaitu vagina buatan, thermometer, pompa udara, tabung penampung semen, dan corong air. b. Evaluasi Semen Bahan yang digunakan untuk evaluasi semen adalah NaCl fisiologis, NaCl 3% dan eosin. Peralatan yang digunakan untuk evaluasi semen diantaranya mikroskop, object glass, cover glass, pH meter, pipet haemocytometer, kamar hitung neubauer, dan batang pengaduk. c.
Pengenceran semen Bahan yang digunakan dalam pengenceran semen diantaranya adalah tris
aminomethane, asam sitrat, fruktosa, aquabides, kuning telur, penicillin, dan streptomycin.
Peralatan yang digunakan dalam pengenceran diantaranya
adalah timbangan analitik, kertas saring, aluminium foil, pipet, mikro pipet, tabung reaksi, rak tabung, dan gelas ukur.
13 d. Pembekuan Semen Bahan yang digunakan dalam proses pembekuan yaitu gliserol dan nitrogen cair. Peralatan yang digunakan diantaranya straw, serbuk Polyvinyl Alcohol, goblet, canister, lemari pendingin, pinset, dan penjepit besi. 3.2
Metode Penelitian
3.2.1 Perlakuan Penelitian Rancangan percobaan adalah dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK). Penelitian yang akan dilakukan terdiri dari 5 perlakuan dan 5 kelompok. Kelima perlakuan tersebut terdiri dari: P1 = Semen + Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur + Gliserol 5% P2 = Semen + Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur + Gliserol 6% P3 = Semen + Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur + Gliserol 7% P4 = Semen + Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur + Gliserol 8% P5 = Semen + Larutan pengencer Tris-Sitrat kuning telur + Gliserol 9% 3.2.2 Prosedur Penelitian A. Penampungan Semen Siapkan vagina buatan yang akan digunakan untuk menampung semen. Isi bagian silinder vagina buatan dengan air hangat dengan suhu berkisar 38oC sampai 40oC. Lalu selongsong vagina buatan diisi udara dengan menggunakan pompa. Pasang tabung penampung semen pada ujung corong penampung. Olesi vagina buatan dengan menggunakan vaselin secukupnya. Siapkan kambing betina sebagai pemancing dengan tujuan untuk merangsang kambing jantan.
Pejantan terlebih dahulu dirangsang untuk
14 melakukan false mount sebanyak satu atau dua kali, kemudian semen dapat ditampung. B. Penilaian Kualitas Semen Penilaian ini dilakukan sebelum semen diolah, pemeriksaan semen segar meliputi: 1.
Pemeriksaan makroskopik
a) Volume semen Volume semen dihitung dengan melihat skala yang tertera pada tabung penampung semen. Volume semen kambing yang dihasilkan bervariasi setiap penampungan yaitu berkisar 0,5–1,0 ml (Toelihere, 1981). Apabila semen yang dihasilkan pada ejakulat ke-1 kurang dari 0,5 ml, maka dilakukan penampungan kembali (ejakulat ke-2) dengan selang waktu 5-10 menit. b) pH semen pH semen dapat dilihat dengan cara mencocokkan warna dari kertas lakmus yang telah ditetesi semen dengan warna pada tabung kemasan kertas lakmus. pH semen kambing berkisar antara 6,4-7,2 (Toelihere, 1981). c) Warna semen Warna semen dari ejakulasi normal adalah putih susu dan berwarna krem. d) Konsistensi atau derajat kekentalan Kekentalan diamati dengan cara memiringkan tabung semen lalu ditegakan kembali, dan amati dinding tabung semen. Apabila semen yang mengalir pada dinding lambat, maka konsistensinya tinggi ditandai dengan semen yang kental. Namun jika sebaliknya maka konsistensinya rendah berarti semen tersebut encer atau cair.
15 2.
Pemeriksaan Mikroskopik
a) Mengamati gerakan massa sperma Semen hasil penampungan diteteskan sedikit ke atas objek glass kemudian amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 × 10. Gerakan massa diamati dengan melihat adanya kecenderungan bergerak bersama-sama ke satu arah, membentuk gelombang yang tebal atau tipis, dan bergerak cepat atau lambat. b) Menghitung konsentrasi sperma Penilaian konsentrasi spermatozoa bertujuan untuk menghitung jumlah spermatozoa.
Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan
menggunakan Hemocytoeter dan kamar hitung Neubaeur. Mula-mula isap semen dengan pipet erythrocyt yang belum diencerkan hingga tanda 0,5, lalu isap larutan NaCl 3% hingga tanda 101.
Kocok pipet dengan gerakan
membentuk angka delapan dengan tujuan agar sperma tercampur secara merata dan sel-selnya tidak rusak saat dilakukan pengocokan selama 2-3 menit. Buang beberapa tetesan pertama. Kemudian teteskan satu tetes semen pada sisi cover glass. Hitung jumlah sel spermatozoa dalam 5 kamar dihitung menurut arah diagonal. c)
Menghitung motilitas sperma Motilitas spermatozoa dihitung melalui cara yang sama dengan
perhitungan
konsentrasi sperma total, tetapi pengencernya menggunakan
larutan isotonik, sehingga diperoleh konsentrasi sperma mati. Motilitas dapat dihitung dengan rumus : ∑ Spermatozoa total - ∑ Spermatozoa yang mati Motilitas =
∑ Spermatozoa total
x 100%
16 Apabila setelah dilakukan evaluasi makroskopis dan mikroskopis data yang diperoleh yaitu motilitas lebih dari 70%, pH berkisar antara 6,4-7,2, abnormalitas kurang dari 10% dan konsentrasi spermatozoa 2-3 milyar/ml, maka semen layak untuk dilanjutkan ketahap pembekuan (Toelihere, 1981). d) Membran Plasma Utuh Spermatozoa (MPU) Evaluasi
keutuhan
membran
plasma
dilakukan
dengan
metode
hypoosmotic swelling test (HOS test). Larutan HOS test terdiri dari 1,351 gr fruktosa dan 0,735 gr Sodium Sitrat yang dilarutkan dalam 100 ml aquabidestilasi.
Larutan tersebut lalu diinkubasi dalam waterbath bersuhu
37oC selama 10 menit.
Setelah diinkubasi semen cair dapat ditambahkan
dengan larutan HOS test, lalu buat preparat ulas dengan penambahan eosin dan difiksasi. e) Recovery Rate Recovery rate merupakan perbandingan antara motilitas spermatozoa post thawing dengan motilitas semen segar. C. Pengenceran Semen a) Komposisi bahan pengencer (buffer) Buffer yang digunakan tris-sitrat kuning telur bahan yang digunakan untuk pembuatan buffer terdiri dari bahan tris (3,634 gr tris, 1,99 gr asam sitrat, dan 0,5 gr fruktosa) dan sitrat (2,9 gr natrium sitrat dan 0,5 gr fruktosa), kuning telur 20 ml serta gliserol yang berbeda. Perbandingan antara tris dan sitrat yaitu 75% larutan tris dan 25% larutan sitrat. b) Penyedia Kuning Telur Pecahkan telur yang akan di ambil kuning telurnya. Buang bagian putih telur, lalu kuning telurnya disimpan pada kertas saring agar sisa albumen pada
17 kuning telur menempel pada kertas saring. Apabila kuning telur telah bersih dari albumen pindahkan kuning telur ke kertas saring yang lain pecahkan kuning telur lalu alirkan kedalam beaker glass. c) Pembuatan Pengencer Larutan buffer tris-sitrat yang telah dibuat disiapkan sebanyak 80 ml, lalu tuangkan kuning telur sebanyak 20 ml. Aduk kedua bahan tersebut dengan menggunakan batang pengaduk secara perlahan hingga homogen. Kemudian tambahkan 100 mg streptomycin dan 100.000 IU penicillin kedalam larutan pengencer. Setelah selesai beaker glass ditutup dengan alumunium foil. d) Pembuatan Semen Cair Penambahan
volume
pengencer
dilakukan
dengan
perhitungan
menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan: V = Volume Semen (ml) KT = Konsentrasi Sperma Total M = Motilitas (%) KSM = Konsentrasi Sperma Motil yang diinginkan
Setelah dilakukan perhitungan seperti diatas, siapkan pengencer yang akan ditambahkan.
Cara penambahan pengencer dilakukan sedikit demi sedikit
melalui dinding tabung dengan menggunakan pipet tetes. Homogenkan kedua
18 larutan tersebut. Tabung yang berisi semen cair ditutup dengan alumunium foil. Masukkan semen cair kedalam lemari es dengan temperature 5oC. e) Penambahan Gliserol Setelah larutan pengencer dicampurkan dengan semen, lalu tambahkan gliserol pada masing-masing tabung sesuai dengan perlakuan (Gliserol 5%, Gliserol 6%, Gliserol 7%, Gliserol 8% dan Gliserol 9%). D. Pengemasan Semen (Filling dan Sealing) Pengemasan larutan semen ini menggunakan kemasan straw dengan volume 0,25 ml. Larutan semen dihisap dengan menggunakan alat penghisap hingga batas kapas putih. Selanjutnya sisi lainnya disumbat dengan tepung polyvinyl alcohol setelah straw terisi dengan larutan semen. E. Ekuilibrasi dan Pembekuan Semen cair yang telah dikemas dimasukkan ke dalam lemari es selama 4 jam dengan temperature 5oC. Hal tersebut bertujuan agar spermatozoa dapat beradaptasi dengan pengencer sebelum dilakukan proses pembekuan. Proses selanjutnya ialah proses pre freezing diatas permukaan Nitrogen Cair selama 9 menit pada suhu -80 sampai dengan -100 0C. Gas nitrogen akan menguapi straw dengan jarak antara straw dan permukaan nitrogen cair ialah 4 cm pada leher container. Goblet yang telah bersi straw dimasukan kedalam canister setelah dilakukan prefreezing dan selanjutnya disimpan didalam container yang berisi nitrogen cair untuk dibekukan. Suhu dalam container mencapai 196°C. F. Pencairan Kembali Semen Beku (Thawing) Semen yang telah di bekukan selama satu malam, dilakukan pencairan kembali untuk dilakukan evaluasi kualitas semen setelah pembekuan. Proses
19 thawing dilakukan selama 35-40 detik pada bejana yang telah diisi air dengan temperature 38oC. 3.2.3 Peubah yang Diamati a.
Membran Plasma Utuh (MPU) Membran plasma utuh yaitu ditandai dengan ekor yang membengkak,
melingkar dan menggembung, sedangkan membran plasma yang rusak ditandai dengan ekor yang lurus bila dipaparkan dalam larutan hipoosmotik (HOS). Perhitungan membran plasma utuh pada spermatozoa kambing dilakukan dengan menghitung sel spermatozoa pada preparat ulas sebanyak 200. Persentase membran plasma utuh dapat diketahui dengan menggunakan rumus:
b. Recovery Rate Recovery rate merupakan perbandingan antara motilitas spermatozoa post thawing dengan spermatozoa sebelum pembekuan.
3.2.4 Analisis Data Analisi data yang digunakan yaitu dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK) karena memiliki 5 perlakuan dan 5 kelompok, sehingga diperoleh 25 unit percobaan. Model matematika yang digunakan adalah : Yij = µ + γi + βj + εij Keterangan: Yij : respon hasil pengamatan perlakuan ke-i ulangan ke- j µ : rataan umum γi : pengaruh aditif perlakuan ke- i βj : pengaruh aditif dari kelompok ke-j
20 εij i j
: galat percobaan : banyaknya percobaan (1,2,3,4,5) : banyaknya ulangan (1,2,3,4,5)
Hipotesis : H0 : P2 ≤ P1; P2 ≤ P3; P2 ≤ P4; P2 ≤ P5 Berarti pengaruh perlakuan P2 lebih kecil atau sama dengan perlakuan lain terhadap membran plasma utuh dan recovery rate. H1 : P2 > P1; P2 > P3; P2 > P4; P2 > P5 Berarti ada minimal satu perlakuan P2 yang lebih besar dari pada perlakuan lain terhadap membran plasma utuh dan recovery rate.. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam untuk mengetahui pengaruh perlakuan penambahan berbagai level glierol terhadap membran plasma utuh dan recovery rate. Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan dengan uji Lanjut Jarak Berganda Duncan. Tabel 1. Analisis Sidik Ragam Sumber variasi db Kelompok (r-1) Perlakuan (p-1) Galat (p-1)(r-1) Total rp-1 Keterangan : db JK KT p r
JK JKk JKP JKG JKT
KT KTk KTP KTG
Fhit
Ftabel 0,05
KTP/KTG
: derajat bebas : jumlah kuadrat : kuadrat tengah : Total Perlakuan : Ulangan
Kaidah keputusan : 1. Bila Fhit ≤ Ftabel, maka Ho diterima (non significant = tidak berbeda nyata) 2. Bila Fhit > Ftabel, maka Ho ditolak (significant = berbeda nyata)
21 Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan, dilakukan dengan menggunakan Uji Jarak berganda Duncan (Gaspersz, 1995) dengan rumus sebagai berikut: Sx =
LSR = SSR × Sx Keterangan : Sx = Galat baku KTG = Kuadrat Tengah Galat r = Ulangan periode LSR = Least Significant Range (Jarak beda nyata terkecil) SSR = Student Significant Range Bila selisih antara perlakuan dibanding dengan LSR, kaidah keputusan : 1. Bila d ≤ nilai LSR, maka non signifikan 2. Bila d > nilai LSR, maka signifikan Keterangan : d = Selisih antar perlakuan 3.2.5 Tata Letak Percobaan Tabel 2. Tata Letak Kelompok 1 2 3 4 5 Total Perlakuan Rata-rata
1 P1K1 P1K2 P1K3 P1K4 P1K5 Y1 …
2 P2K1 P2K2 P2K3 P2K4 P2K5 Y2 …
Perlakuan 3 P3K1 P3K2 P3K3 P3K4 P3K5 Y3 …
4 P4K1 P4K2 P4K3 P4K4 P4K5 Y4 …
5 P5K1 P5K2 P5K3 P5K4 P5K5 Y5 …
Total Kelompok Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 … …
22 Berdasarkan tabel tata letak diatas dapat dibuat hasil pengacakan perlakuan adalah sebagai berikut :
P1K1
P3K1
P5K1
P2K1
P4K1
P2K2
P4K2
P3K2
P5K2
P1K2
P3K3
P5K3
P1K3
P4K3
P2K3
P4K4
P1K4
P2K4
P3K4
P5K4
P5K5
P2K5
P4K5
P1K5
P3K5
