A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja - I 0. BEVEZETÉS A molekuláris biológia fogalmát kétféle értelemben használjuk. Az egyik értelmezés szerint a molekuláris biológia egy tudományterület, amely az életfolyamatokat egy adott hierarchia szinten* vizsgálja, konkrétan, a DNS és termékeinek (RNS-ek és fehérjék) működését tanulmányozza. Tehát, a molekuláris biológia az atomok (vagy egyszerű molekulák) feletti és a sejtek alatti szerveződési szint tudományterülete. A másik értelemben a molekuláris biológia az a technológiai eszközrendszer, amely az alap és az alkalmazott biológiai kutatások szinte minden területén használható. Ebben a fejezetben ez utóbbi értelmezéssel, a molekuláris biológia eszközrendszerével fogunk megismerkedni. A molekuláris biológiai jelenleg is zajló forradalmának alapjait azok a felfedezések teremtették meg, amelyek bebizonyították, hogy a genetikai anyag a DNS, ill. amelyek felfedték a DNS szerkezetét és a DNS működésének alapmechanizmusait. A rekombináns géntechnológia* kialakulásában alapvető szerepet játszott a restrikciós endonukleázok és a DNS ligázok felfedezése, ill. annak a metodikának a kidolgozása, amely lehetővé tette idegen DNS-ek baktériumsejtekbe történő bejuttattatását és azokban való felszaporítását (molekuláris klónozás). A DNS szerkezetének vizsgálatában a Sanger-féle DNS szekvenálási módszer hozott áttörést, a DNS és géntermékek genomszintű vizsgálatát pedig a mikrochip technikák megjelenése tette lehetővé. A molekuláris biológia jelen fejlődési ütemét, mind az alap, mind az alkalmazott kutatásokban, sokkal inkább a rendelkezésre álló technológiák határozzák meg, mint az elméleti ismeretek, ezért az ezen a területen elért haladás rendkívüli fontossággal bír. A molekuláris genetika a molekuláris biológiának az a részterülete, amely a nukleinsavak szerkezetével és működésével foglalkozik. A molekuláris biológiai forradalom főként a molekuláris genetika berkein belül zajlik. Megjegyzés: a két értelmezés oka az, hogy a molekuláris biológia minden más tudományterület alapja. A molekuláris biológia technológiáit hármas bontásban tárgyaljuk. Ennek az előadásnak az első részében olyan technikákról lesz szó, amelyekkel (1) egy vagy néhány féle makromolekula (DNS, RNS, fehérje) vizsgálható egyidőben. Szűkebb értelemben ezt a tudományterületet nevezzük molekuláris genetikának. Az előadás második felében pedig (2) a genomikai témákat tárgyaljuk. A genomika többféle makromolekula egyidejű vizsgálatával foglalkozik (tágabb értelemben a genomika is a molekuláris biológiához tartozik). (3) A komplex technikák több metodika együttes bevonását igénylik, s különféle egyéb előadásokban kerülnek bemutatásra. Ilyen megközelítések pl. az őssejt technika, a knock-out és transzgénikus technikák, a gén- és tumor terápia, stb.
I. MOLEKULÁRIS GENETIKAI TECHNIKÁK 1. Molekuláris klónozás A molekuláris klónozás lényege az, hogy egy általunk kiválasztott DNS szakaszt élő sejtekben megsokszorozzuk. E folyamatban alapvető szerepet játszanak a restrikciós endonukleázok, a DNS ligázok és a plazmid vektorok. 1
A restrikciós enzimek (= restrikciós endonukleázok; RE-ek) egy rövid, meghatározott bázissorrendű DNS szakaszt ismernek fel és vágnak el. A vágás módjától függően: 5’ túlnyúló (pl. BamHI vagy EcoRI RE-ek képeznek ilyet), 3’ túlnyúló (pl. KpnI hasítása), vagy tompa (pl. SmaI hasítása) DNS végek keletkeznek. A restrikciós felismerő helyek ún. palindrom szekvenciák (a másik szálon szintén 5’→3’ irányban olvasva, ugyanazt a bázissorrendet kapjuk). A restrikciós felismerő hely rendszerint 4, 6 vagy 8 bázispár hosszúságú. Egy RE elnevezése arra a baktériumra utal, amiből először izolálták; pl. EcoRI: az Escherichia coli RY13 törzséből származó elsőként izolált (RI) enzimféleség (az EcoRV ugyanebből a törzsből szárnazó 5. féle RE). ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
1
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I Egy RE vágásának eredményeként kaphatunk tompa vagy ragadós véget, a ragadós véh tartalmazhat 5’ vagy 3’ kinyúló végeket. A RE-ek természetes funkciója a bakteriofágokkal szembeni védekezés. A baktériumok a DNS-üket úgy védik a saját RE-jeikkel szemben, hogy a restrikciós felismerő helyeiket metilálják (metiláz enzimekkel). E két folyamat együttesen alkotja a baktériumok ún. restrikciós modifikációs rendszerét. A REok felfedezéséért 3 kutató (Daniel Nathans, Werner Arber és Hamilton Smith) Nobel Díjat kapott 1970-ben. A restrikciós endonukleázok felfedezése mérföldkő volt a molekuláris klónozás és a részben ezen alapuló rekombináns géntechnológia kialakulásában. Manapság már több száz RE-et árulnak a kereskedelemben. 5’ - GAATTC - 3’ EcoRI felismerő hely 3’ - CTTAAG - 5’ 2
A DNS ligázok olyan enzimek, amelyek a szabad DNS végeket kapcsolják össze foszfodiészter kötések kialakításával. Szemben a restrikciós enzimekkel, melyek csak a baktériumokban fordulnak elő, a ligázok megtalálhatóak a legegyszerűbb szervezetektől (pl. egyes bakteriofágok) kezdve az emlőssejtekig. A DNS ligázok az emlősökben szerepet játszanak pl. a DNS replikációban (az Okazaki fragmensek összekapcsolásában) és a kivágásos hibajavításban. A molekuláris klónozásban, többek között, a T4 fágból vagy az E. coli-ból származó DNS ligázokat használunk a DNS végek összekapcsolására.
3
Plazmidok (I.) A plazmidok a baktériumok genomiális DNS-én kívüli gyűrű alakú DNS darabok. Egyes plazmidok képesek a genomba integrálódni, majd kivágódni, mások nem. Egy másfajta csoportosítás szerint vannak relatíve nagyméretű kis kópiaszámú ill., kisméretű, de nagy kópiaszámú plazmidok. A plazmidok különféle géneket tartalmaznak, s viszonylag könnyen átkerülhetnek egy másik baktériumba, amely akár egy másik fajhoz is tartozhat. A plazmidok sokszorozódását az ún. replikációs origó irányítja azáltal, hogy ezt a szekvenciát ismeri fel a DNS polimeráz. (1) Az F (fertilitás) plazmidok tra (transzfer) operonja kódolja a pilust, melynek révén a baktériumok képesek a konjugációra, ezáltal a plazmid más baktériumsejtekbe való átjuttatására. Az F plazmidok képesek beépülni a fogadó baltériumsejr genomiális DNS-ébe. Gyakran megesik, hogy az F plazmid a genomiális DNS-ből egy vagy több vele szomszédos gént is magával visz, s ezeket beépíti a fogadó baktériumba. Ezt a horizontális géntranszferen alapuló folyamatot nevezzük transzdukciónak. (2) A rezisztencia plazmidok különféle antibiotikum rezisztencia géneket tartalmaznak. A rezisztencia plazmidok rendszerint episzómális elemek (nem épülnek be a genomiális DNS-be). (3) A virulencia plazmidok egy baktériumot patogénné tesznek. (II.) Plazmid vektorok nevezzük a rekombináns DNS technológiában alkalmazott genetikailag módosított plazmidokat. A vektor plazmidok csak a minimálisan szükséges DNS szekvenciákat tartalmazzák, melyek a következők: replikációs origó, antibiotikum rezisztencia gén, több egyedi restrikciós helyet tartalmazó poliklónozó hely, esetleg más egyéb szekvenciák. Az idegen DNS szekvenciák megsokszorozására használatos plazmidokat (1) klónozó vektoroknak, a DNS szekvenciák eukarióta sejtekbe való bevitelére használatosakat (2) génbeviteli vektoroknak, a gének kifejezésére használatos plazmidokat pedig (3) génexpressziós vektoroknak nevezzük. Az ún. BAC klónt (Bacterial Artificial Chromosome, mesterséges bakteriális kromoszóma) az F plazmidból állították elő úgy, hogy minden fölösleges DNS szekvenciát eltávolítottak, szinte csak a replikációs origó maradt meg az eredetileg óriási méretű plazmidból. A BAC klón kis méretű lett, de akár 100-300 kb nagyságú DNS fragmens befogadására is alkalmas vektor lett belőle. A Humán Genom Projekt során ezt a technikát alkalmazták a génkönyvtárak elkészítéséhez. BAC vektorok használatával a teljes humán genom kb. 10,000 élesztőklónban tárolható.
4
A molekuláris klónozás legismertebb és legáltalánosabban használt technikája az ún. restrikciós/ligálásos klónozás, melynek első lépése egy DNS valamilyen restrikciós enzimmel való megemésztése. Ezt követi az adott DNS fragmens izolálása az összes kapott DNS fragmensek közül. Az izolálás nem mindig lehetséges vagy célszerű, pl. ha egy magasabbrendű élőlény teljes genomját vagy annak egy fragmensét akarjuk beépíteni plazmid vektorokba. Ilyenkor válogatás nélkül mindent beépítünk (ez az ún. shot gun technika; ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
2
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I shot gun = sörét), majd utólag azonosítjuk a kívánt DNS szakaszokat. A DNS fragmens beépítése ligáz enzimekkel történik kémcsőben (in vitro). A ligálást követően a DNS-t bejuttatjuk a baktérium sejtekbe. Ezt a folyamatot transzformációnak nevezzük, ami történhet elektromos „impulzussal” (elektroporációval) vagy különböző kémiai módszerek alkalmazásával (lipofektamin, CaPO4–al való kicsapás, stb.). Ezt követően a baktérium (E. coli) sejteket optimális környezetben (37ºC, O2-dús közeg, amit intenzív rázatással érünk el) szaporítjuk. A baktériumokban való szaporítás lényege az, hogy az eredetileg egy kópiában lévő plazmid a baktérium sejtben felszaporodik, ill, ami sokkal fontosabb, maga a baktérium is megsokszorozódik, természetesen a bekerült plazmiddal együtt (a plazmid megsokszorozódása a klónozás). A plazmidban lévő antibiotikum rezisztencia gén lehetővé teszi, hogy kiszelektáljuk azokat a baktérium sejteket, amelyek tartalmazzák a transzformált plazmidot. A rezisztencia gén által kódolt fehérje ugyanis inaktiválja az antibiotikumot, s ezáltal lehetővé teszi, hogy a baktérium szaporodhasson, s telepeket alkosson (egy telep egyetlen baktériumból származik). A DNS ligálás csak bizonyos gyakorisággal eredményez rekombináns plazmidot, sokkal gyakoribb a plazmid gyűrűvé záródása az idegen DNS beépülése nélkül. A klónozási folyamat másik lépése ezért az, hogy különbséget tegyünk az idegen DNS-t tartalmazó és nem-tartalmazó plazmidok között. Erre a megkülönböztetésre több módszer is létezik, melyek közül az egyik leggyakrabban használt ún. kék/fehér szelekciós módszert mutatjuk be. E módszerben a lac operon egyik génje, a lacZ gén játszik főszerepet. A lacZ gén termékének (β-galaktozidáz) kimutatására egy kromogén szubsztrátot, az XGal-t alkalmazzuk. Az X-Gal egy színtelen molekula, amely β-galaktozidáz hatásra kék színű terméket produkál, (sem a termék, sem az X-Gal nem fejtenek ki semmilyen hatást (indukció, represszió) a lac operonra. A lacZ gén expresszió indukciójára laktóz helyett ún. IPTG-t használunk, mert ezt az anyagot a βgalaktozidáz nem bontja el, s így a mennyisége állandó a közegben. Tehát, a laktóz két funkcióját két molekula között „osztottuk szét”: (1) az X-Gal a β-galaktozidáz szubsztrát, de nem induktor; (2) az IPTG viszont induktor, de nem szubsztrát. Érdekes módon, a lacZ gén két fragmensre bontható (alfa: egy rövid fragmens az 5’ végen, és omega: a gén többi része) úgy, hogy a két génfragmensről külön képződő alfa és omega peptidek a sejtben összekapcsolódnak és működőképes enzimet hoznak létre. A nagyobb méretű omega peptidet kódoló DNS szakaszt a baktérium kromoszómában a lacZ gén eredeti helyén van (tulajdonképpen, egy deléciós mutációt okoztak), az alfa peptidet kódoló DNS-t pedig a plazmid vektorba építették. Az alfa szakaszt úgy alakították át, hogy az több egyedi restrikciós helyet tartalmazzon, de közben a funkcióját ne veszítse el. Ezt úgy érték el, hogy egyrészt, az aminosavakat kódoló tripletek néma helyein cserélték ki a bázisokat, másrészt, olyan tripleteket szúrtak be, amelyek nem voltak hatással a keletkezett peptid funkciójára. Ha egy idegen DNS szakaszt ligálunk be ebbe a régióba, az inaktiválni fogja az alfa peptid funkcióját, ezért X-Gal és IPTG jelenlétében a rekombináns plazmidot tartalmazó baktériumkolóniák fehérek maradnak, szemben a kék kolóniát kialakító eredeti plazmidot tartalmazó baktériumokkal. Megjegyzések: (1) a molekuláris biológiában használatos E. coli baktérium DNS-ét úgy alakították át molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával, hogy az a kutatás számára optimális sajátságokkal rendelkezzen, s a baktérium ne válhasson patogénné. (2) Nem csak baktériumokban lehet klónozni, hanem élesztőben, növényekben és állatokban is.
5
Egyéb enzimek a klónozásban A DNS polimeráz Klenow fragmense Ha az E. coli DNS polimeráz enzimét egy proteázzal (szubtilizin) elvágjuk, a keletkező Klenow fragmens megtartja az eredeti enzim több funkcióját, melyek molekuláris genetikai módszerekkel tovább fokozhatók, ill. bizonyos nemkívánatos sajátságok eltüntethetőek. A molekuláris klónozásban a Klenow enzimet arra használjuk, hogy a restrikciós enzimek által produkált 5’ kinyúló végeket feltöltsük, melynek eredményeképpen tompa véget kapunk. Ezt a technikát például akkor alkalmazzuk, amikor két eltérő restrikciós enzim által produkált véget akarunk összeligálni. Az S1 nukleáz egyszálú DNS-t vág. Az enzim egyik alkalmazási területe a restrikciós enzimek által produkált kinyúló végek levágása, s ezáltal a szabad DNS végek tompává alakítása. Az alkalikus foszfatázok olyan enzimek, amelyek eltávolítják a foszfát csoportokat a nukleinsavakról és a fehérjékről. A molekuláris klónozásban ezek az enzimek, többek között, arra használhatóak, hogy egy restrikciós enzimmel megemésztett DNS szabad végeiről eltávolítják a foszfát csoportokat, ami azt eredményezi, hogy a két DNS véget a ligáz enzim nem lesz képes kémialag összekötni. A folyamat értelme az, hogy a transzformáció után csak rekombináns baktérium kolóniákat kapunk, újra összezáródott plazmidokat tartalmazó baktériumokat viszont nem. Ennek oka az, hogy a plazmid vektor csak akkor képes gyűrűvé záródni, ha beépül egy, a két végén foszfát csoportot tartalmazó idegen DNS darab a megfelelő restrikciós helyekre (megjegyzés: a plazmidok csak gyűrű alakban képesek szaporodni).
ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
3
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I 6
2. A polimeráz láncreakció (PCR; polymerase chain reaction) egy adott DNS szakasz sokszorozására alkalmas technika. A PCR a molekuláris klónozástól abban különbözik, hogy itt nem élő sejtekben (E. coli vagy más szervezet) szaporítjuk az adott DNS-t, hanem in vitro, DNS polimeráz enzim alkalmazásával. A PCR technikát Kary Mullis dolgozta ki, amelyért 1993-ban Nobel Díjjal jutalmazták. Egy PCR reakció véghezviteléhez a következő komponensek szükségesek: (1) DNS templát, ami tartalmazza a felszaporítandó DNS szakaszt. A DNS templát lehet akár egy teljes genom, vagy egy plazmidba klónozott DNS darab, stb. (2) DNS polimeráz, amely az új DNS szál szintézisét végzi. Mullis eredeti eljárásában olyan enzimet használt, amely minden denaturációs ciklusban inaktiválódott a magas hőmérséklet miatt, ezért ezt az enzimet később egy magas hőmérsékleten is működőképes polimerázzal, az ún. Taq polimerázzal helyettesítették. A Taq polimerázt egy hőforrásokban élő baktériumból (Thermus aquaticus) izolálták, majd a későbbiekben molekuláris genetikai módszerekkel optimalizálták a működését. Ma már más eredetű polimerázokat is alkalmaznak a PCR technikában. (3) Két primer forward (előre) és reverz (vissza) , melyek rövid (18-25 bázisnyi) egyszálú DNS szálak, s szekvenciájuk komplementer a felszaporítandó DNS szál egy-egy szakaszával. A primerek indítják el az egyszálúvá tett (denaturált) DNSről, mint templátról az új DNS szál szintézisét, melynek oka az, hogy a DNS polimeráz duplaszálú DNS-eket ismer fel (in vivo RNS primer kell a DNS szintézishez!). A primerek megválasztásával megtervezhetjük a felszaporítandó DNS szakasz két végpontját. (4) Dezoxiribonukleotid trifoszfátok (dNTP-k), amelyek biztosítják az épülő szál anyag (nukleotid) és energia szükségletét. (5) Továbbá, a polimeráz reakció csak megfelelő oldatban (puffer) megy végbe. Egy PCR reakció rendszerint 20-40 ciklust tartalmaz, melyek mindegyike három lépésből áll: (1) Denaturáció: magas hőmérsékleten (94-96 ºC) a két DNS szál elválik egymástól (a H-hidak felbomlanak). (2) Összekapcsolás (annealing): a hőmérséklet csökkentésével a primerek hozzá kapcsolódnak a templát DNS komplementer szakaszához. (3) Szintézis: az összekapcsolástól magasabb hőmérsékleten a DNS polimeráz a primer/templát kettősszálú DNS-hez kötődik, majd elkezdi az új DNS lánc szintézisét. A két primerről egymással szemben (de két különböző szálon) folyik a DNS szintézis, melyet az első ciklusban a követező ciklus denaturációs lépése állít le. A második ciklusban azonban az előzőleg szintetizált szálról a szintézis végpontja meghatározott: ez a szemben lévő primer kezdőpontja. A ciklusok számának növekedésével a két primer közötti DNS szakaszok száma exponenciálisan nő, míg az eredeti DNS-ről történő hosszú DNS szakaszoké csak lineárisan: ez utóbbiak 30 ciklus alatt csupán 30 darab hosszú szálat produkálnak, míg a két primer közötti DNS szakaszok száma optimális körülmények között 230. Az optimalitás azt jelenti, hogy minden egyes reakcióban duplázódik a keletkezett fragmensek (amplikonok) száma. A valóságban az amplifikáció hatékonysága mindig 100% alatt van. A PCR reakciót automatizált PCR készülékkel végzik. A PCR alkalmazása: (1) A molekuláris klónozás (in vivo sokszorozódás) alternatívája is lehet a PCR (in vitro sokszorozódás), de a két technika kombinálható is abban az esetben, amikor plazmid vektorokba építünk be PCR által előállított DNS fragmenseket. (2) PCR-el mutációkat hozhatunk létre egy DNS szakaszon. (3) A PCR használható diagnosztikai célokra is, mint például genetikai betegségek kimutatására, fertőző betegségek diagnosztizálására, bűnözők azonosítására, apasági vizsgálatokban stb.
7
3. A gél elektroforézis rendszerint más metodikák (pl. molekuláris klónozás, PCR) járulékos technikái. A gél elektroforézist DNS, RNS vagy fehérje molekulák elválasztására használjuk. Az elválasztáshoz használt gél mátrix szerkezetű: az agaróz gél hosszú el-nem-ágazó szénhidrátokból áll, a poliakrilamid gélt pedig keresztkötésekkel összekapcsolódó akrilamid molekulák alkotják. A makromolekulák elektromos erőtérben vándorolnak: a nukleinsavak és a fehérjék negatív töltésűek, ezért a negatív pólustól a pozitív pólus felé mozognak. A fehérjéket és a kis molekulasúlyú nukleinsavakat poliakrilamid gélen, a nagyobb molekulasúlyú nukleinsavakat pedig agaróz gélen választjuk el. A kisebb molekulasúlyú molekulák gyorsabban futnak, mint a nagyobbak. A futtatásokhoz ún. molekulasúly markereket használunk, melyek ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
4
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I ismert molekulasúlyú nukleinsav vagy fehérje molekulák. A vizsgált molekula méretét a molekulasúly markerek gélen való pozíciójához viszonyítva állapítjuk meg. Az elválasztást analitikus vagy preparatív céllal végezhetjük. (1) Az analitikus célú elválasztáskor információkat szerzünk az adott molekulákról (jelen van-e, milyen a molekulasúlya, stb.), (2) a preparatív elválasztáskor pedig először izoláljuk, majd valamilyen célra felhasználjuk az adott molekulákat. A gélen megfuttatott DNS és RNS molekulákat különféle festékekkel tehetjük láthatóvá. Az etidium bromid a nukleinsavakhoz kapcsolódik, s ultraibolya fény hatására fluoreszkál. Ez a festék azonban rákkeltő hatású, ezért újabban más fluoreszcens festékeket is alkalmaznak a DNS és RNS molekulák kimutatására. A fehérjéket pl. a kékszínű Coomassie blue festékkel tesszük láthatóvá. Ez a festék azonban minden fehérje molekulát megjelöl. Egy adott fehérje molekulát antitestekkel tudunk specifikusan megjelölni. A fehérjéket futtathatjuk natív állapotban vagy SDS (sodium dodecyl sulfate)-el való denaturációt követően. Az SDS, a denaturáló hatása mellett, a fehérjék külső felszínéhez kapcsolódva elfedi az aminosavak saját töltéseit, s így az egész fehérje molekula egységesen negatív töltésű lesz. Tehát, az SDS használata azt eredményezi, hogy fehérjék futási sebessége csak a molekulasúlytól függ, de független mind a molekulaszerkezettől (denaturáció) mind az aminosav összetételtől (maszkírozó hatás). Az SDS a fehérje alegységeket is eltávolítja egymástól. Megjegyzés: a natív fehérje futási sebessége függ az aminosav összetételtől (sok netagtív töltésű aminosavból álló fehérje gyorsabban fut a pozitív pólus felé) és a 3D-s szerkezettől is.
4. Makromolekulák kimutatása 8
9
10
A Southern blot technikát arra használjuk, hogy egy sokféle DNS szekvenciát tartalmazó mintában kimutassunk egy adott DNS szekvenciát. A módszert a feltalálójáról, Edwin Southern-ről nevezték el. A többi égtájak neveivel illetett technikák elnevezéséit (Northern, Western, Eastern) viccesen a Southern-ből képezték. A módszer első lépéseként a DNS mintából kisebb fragmenseket állítunk elő restrikciós emésztéssel vagy PCR technikával, ezt követően gél elektroforézissel elválasztjuk a különböző méretű DNS darabokat. Következő lépésként a gélen elválasztott DNS fragmenseket különféle módszerekkel (kapilláris erő vagy elektromos erőtér alkalmazásával) egy membránra visszük át (ez az ún. blottolás); a membránon a DNS csíkok elhelyezkedése megegyezik a gélen való pozíciójukkal. Ezt követően a vizsgálandó DNSünkkel komplementer rövid, radioaktívan jelölt DNS szekvenciát (ez az ún. próba) hibridizáltatunk a membránhoz kötött DNS-ekhez. A próba csak a komplementer DNS szekvenciákat jelöli meg. Autoradiográfiás* módszerekkel tesszük láthatóvá a megjelölt DNS csíkot, melyet a membránon való elhelyezkedésével lehet azonosítani, ill. jellemezni. Az autoradiográfiához használhatunk Röntgenfilmeket vagy modernebb, ún. foszfoimidzs analizáló (phosphoimage analizer) készülékeket. A radioaktív anyagokkal való munka veszélyes és körülményes, ezért nem-radioaktív módszereket is alkalmaznak (ld. in situ hibridizációnál alkalmazott metodikák). Megjegyzés: a DNS gélről membránra való átvitelének értelme az, hogy a membrán, szemben a géllel kétdimenziós szerkezetű (a DNS is egy csíkban helyezkedik el), s ezért a próbával való hibridizációt sokkal hatékonyabban tudjuk elvégezni. A gél szerkeze sem sem optimális a hibridizációhoz, mert megkötheti a próbát. A Northern blot technikát RNS oldatban lévő minta specifikus RNS molekuláinak kimutatására használjuk. Ez a módszer alkalmas egy vagy kisszámú gén kifejeződésnek a vizsgálatára. A protokoll hasonlít a Southern blot módszeréhez. A folyamat lépései a következők: gél elektroforézis, blottolás, radioaktív próbával való hibridizálás, autoradiográfia, majd értékelés. Próbaként nem csak DNS-t, hanem RNS-t is szoktak használni. Az RNS-el való munka sokkal nagyobb tisztaságot és odafigyelést igényel, mint a DNS kezelése, melynek oka az, hogy a bőrünkről sok rendkívül stabil ribonukleáz (RNáz) molekula kerülhet a laboreszközökre, ami könnyen degradálja az RNS molekulákat. A Western blot technikát egy mintában lévő specifikus fehérjék kimutatására használjuk. Első lépésként, natív vagy denaturált fehérje molekulákat gél elektroforézissel elválasztunk egymástól. A denaturációt SDSel végezzük. Az elektroforézist követően a gélről egy membránra blottoljuk a fehérje molekulákat (elektroblottal), majd a membránt olyan oldatba tesszük, amely a vizsgálandó fehérje ellen termelt ellenanyagot
ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
5
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I tartalmaz. A kimutathatóság végett az ellenanyaghoz valamilyen fluoreszcens festéket, vagy kromogén szubsztrátot bontó enzimet kötünk kémiailag (az ellenanyag jelölését részletesebben ld. immunhisztokémia). Az Eastern blot analízis különféle poszt-transzlációs módosítások detekciójára alkalmas technika, főként a fehérjékhez kapcsolt szénhidrátok kimutatására használják. 11
5. Gél retardáció
12
6. Footprint analízis (lábnyom analízis)
13
7. Immunhisztokémia, immuncitokémia Az immunhisztokémia (IHC) technikával egy adott fehérje
(gél visszatartás) Ezzel a technikával kimutatható, hogy egy adott DNS szakaszhoz kapcsolódik-e valamilyen fehérje (rendszerint, egy feltételezett transzkripciós faktor). Az alapelv egyszerű: ugyanazon a gélen megfuttatunk fehérjéket tartalmazó és nem tartalmazó DNS mintákat (pl. restrikciós enzimekkel megvágott DNS-eket), majd Southern blot technikával láthatóvá tesszük a vizsgálandó DNS-t. Ha a fehérjéket tartalmazó mintából vett DNS vizsgált szekvenciát tartalmazó csíkja lassabban fut a fehérjementes DNS-nél, akkor ez azt jelenti, hogy egy fehérje molekula hozzákapcsolódott a DNS-hez, s lassította annak futását a gélen. A lassabban futó DNS izolálható a gélből, s DNS szekvenálással megállapítható, hogy pontosan melyik régió felelős az adott fehérje kötődéséért. Ha magának a DNS-kötő fehérjének a meghatározása a feladat, akkor az adott fehérjéhez kapcsolódó antitestet is adhatunk a rendszerhez (ez az ún. supershift assay), ami még jobban lelassítja a DNS futását (ha a futtatás előtt adjuk a mintához) és egyben azonosítja is a DNS-hez kötődő fehérje faktort. A footrpint analízis, hasonlóan a gél retardációs technikához, szintén a DNS – fehérje kölcsönhatást mutatja ki. A módszer lényege az, hogy a fehérje megvédi azt a DNS régiót, amihez kapcsolódik a dezoxiribonukleáz (DNáz) enzim hasításától, szemben a kontroll mintával, amely fehérjéktől mentes. A DNS fragmensek végét radioaktívan megjelöljük, részlegesen (nem teljes mértékben) megemésztjük DNázzal, megfuttatjuk gélen, blottoljuk, majd autoradiográfiát végzünk. A részleges emésztés miatt a DNáz különböző méretű, ugyanazt a véget tartalmazó DNS fragmenteket produkál. Csak a DNS eredeti végeit is tartalmazó szekvenciákat tudjuk detektálni, mivel ezek vannak radioaktívan megjelölve. A fehérje kapcsolódás által védett DNS terület radioaktivitástól mentes lesz, ami a Röntgen filmen egy lábnyom benyomását kelti, innen a név. A védett DNS darabokat a gélből izoláljuk, majd DNS szekvenálással megállapítjuk, hogy mely szakaszok felelősek az adott transzkripciós faktor kötődéséért.
sejten belüli elhelyezkedését mutatjuk ki jelölt antitestek (IgG) alkalmazásával szöveti metszeteken. Ha ezt a protokollt tenyésztett sejteken, sejtszuszpenzión, vagy vérmintán végezzük, akkor immuncitokémiáról beszélünk. Az antitestekhez köthetünk fluoreszcens festékeket vagy különféle enzimeket, amelyek kromogén szubsztrátokból színes termékeket képeznek. Az előbbi esetben (1) immunfluoreszcenciáról beszélünk. Ennél a módszernél az antitestek által megjelölt struktúrákat fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk. Ha az antitesthez kötött enzimet kötünk, s ezt egy kromogén szubsztráttal mutatjuk ki akkor (2) immunenzim módszerről beszélünk. Ez utóbbi technika egy fontos fajtája az immunperoxidáz festés, ahol az alkalmazott enzim a peroxidáz. A peroxidáz a diaminobenzidin (DAB) szubsztrátot, hidrogén peroxid (H2O2) jelenlétében, barna színű termékké oxidálja, amely az enzimreakció környezetében kicsapódván megjelöli a vizsgált fehérje pontos sejten belüli (szubcelluláris) vagy szöveten belüli (pl. adott agyrégiók) elhelyezkedését. A jelölés intenzitása növelhető NiSO4 hozzáadásával (nikkel intenzifikáció). Ha a jelölt antitest közvetlenül kapcsolódik a vizsgált fehérjéhez, közvetlen immunhisztokémiai módszerről beszélünk. Jóval érzékenyebb (és kevesebb nem-specifikus jelölődést eredményező) azonban a közvetett módszer, amikor a fehérjéhez közvetlenül kötődő elsődleges antitesthez egy másodlagos jelölt antitest kapcsolódik. Ennek okaz az, hogy a jelölt másodlagos antitest az elsődleges antitest több epitópjához* is kapcsolódhat, amely jelamplifikációt (jelsokszorozódást) eredményez. A másodlagos antitest egy másik fajban az elsődleges antitest ellen termelt IgG molekula (pl. az elsődleges antitestet, - amely a vizsgált antigénhez kapcsolódik -, nyúlból izolálják, míg a másodlagos, nyúl antitest elleni antitestet, kecskében állítják elő). Az immunhisztokémiában gyakran alkalmazzák a biotin és az avidin molekulákat. A biotin a B7 vitamin másik neve, az avidin pedig a madarak tojásfehérjéjében található fehérje molekula, amely a biotin megkötéséért felelős. Avidin helyett gyakran a Streptococcus baktériumból származó sztreptavidint használják, amely szintén megköti a biotint. Az antitestekhez hozzáköthető a biotin, amelyet peroxidáz enzimmel konjugált (kötött) avidin ismer fel. Az ún. ABC (avidin-biotin-complex) technika még érzékenyebb. Ennél a módszernél az antitesthez szintén biotint kötünk, a szabad biotinokhoz kötjük a peroxidázt is (ld. ábra). Az alkalikus foszfatáz enzim használata az IHC egy alternatív módszere. Ezt az enzimet köthetjük közvetlenül a másodlagos antitesthez, vagy a digoxigenin (DIG) ellen termelt antitesthez. Ez utóbbi esetben a DIG-et kötjük az (elsődleges, vagy sokkal gyakrabban a másodlagos) antitesthez, s ezt fogja felismerni az enzimmel kötött anti-DIG antitest. Az alkalikus foszfatáz megfelelő szubsztrát jelenlétében színes terméket képez. Az ebben a fejezetben ismertetett technikák szabadon kombinálhatók egymással: pl. a DIG-alapú rendszer használható peroxidáz enzimmel is.
14 ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
6
A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja -I 8. In situ hibridizáció
Az in situ hibridizáció (ISH) technikával a sejten belül (in situ = helyben) mutatjuk ki bizonyos DNS szakaszok vagy RNS molekulák elhelyezkedését jelölt DNS vagy RNS próba alkalmazásával. A próbát jelölhetjük radioaktívan vagy fluoreszcens festékekkel, az utóbbi esetben fluoreszcens in situ hibridizációról (FISH) beszélünk. A FISH technikát kezdetben nagy sikerrel alkalmazták különböző gének kromoszómán való lokalizációjának megállapítására. Manapság, az ISH-t leggyakrabban mRNS-ek kimutatására alkalmazzák, a nagyobb érzékenység miatt radioaktív próbát használva a jelöléshez.
15
9. FRET (fluoreszcencia rezonancia energia transzfer) A FRET két fluoreszcens molekula közötti energiaátadás. Ha gerjesztjük a donor molekulát, akkor az képes átadni a gerjesztési energia egy részét az akceptor molekulának, feltéve, ha az egy bizonyos távolságon belül van. A nagyobb energiájú fluoreszcens fényt kibocsátó molekula képes gerjeszteni a kisebb energiát kibocsátó molekulát, tehát pl. a kék színt kibocsátó fluoreszcens molekula a sárga színűt, de fordítva nem. A FRET technikához főként a zöld fluoreszcens protein (GFP) genetikailag módosított színváltozatait használjuk: CFP (cyan fluorescent protein) és YFP (yellow fluorescent protein). A FRET kitűnően alkalmazható pl. annak eldöntésére, hogy két fehérje összekapcsolódik-e a sejtben, vagy sem. Ehhez első lépésként, a két fehérjét molekuláris genetikai módszerekkel (molekuláris klónozás) fuzionáltatni kell a két különböző színű fluoreszcens molekulával (egyiket a CFP-vel, a másikat a YFP-vel). Ezt követően megvizsgáljuk, hogy a kék molekulát gerjesztve kapunk-e sárga fény emissziót (kibocsátást). Ha igen, akkor a két molekula fizikailag kölcsönhatásban áll egymással. A technika alkalmazható intracelluláris vizsgálatokra is, ilyenkor megmondható, hogy a sejten belül pontosan hol történik a molekulák kölcsönhatása. A FRET sohasem 100%-os hatékonyságú, tehát a kék molekula gerjesztésekor kék és sárga színű emissziót is mérhetünk. A két szín aránya a molekulák közötti kölcsönhatás erősségét és/vagy gyakoriságát jelzi: minél nagyobb az akceptor molekula fénykibocsátásának aránya a donor molekuláéhoz képest, annál erősebb vagy gyakoribb a kölcsönhatás.
16
17
10. Áramlási citometria (Flow cytometry)
E technikával sejtekről (ritkábban egyéb részecskékről, pl. kromoszómákról) nyerhetünk nagy mennyiségű információt rövid idő alatt. A módszer lényege az, hogy a vizsgálandó sejt valamilyen jellemző markeréhez (pl. sejtfelszíni receptor) fluoreszcens festékkel jelölt antitesteket kötünk. Az áramlási citométerben található monokromatikus (egy hullámhosszú) lézer megvilágítja az antitesthez kapcsolt festéket, ami egy rá jellemző spektrumú fényt bocsát ki, mely speciális tükrök és szenzorok segítségével detektálható. A diagnosztikában egyszerre általában két- vagy háromféle jelölést alkalmaznak. E módszer alkalmazásával megállapítható, hogy a vizsgált sejtpopuláció hány százaléka tartozik egy adott kategóriába (sejttípus, tumorosan transzformált, stb.). Emellett a sejtek nagyságára és granuláltságára vonatkozóan is információk nyerhetők. Az áramlási citometriát gyakran alkalmazzák a klinikumban, pl. leukémia diagnosztikában.
11. FACS (Fluorescence-activated cell sorting; fluoreszcencia-által aktivált sejt elválasztás) A FACS az áramlási citometria azon fajtája, amely egy biológiailag heterogén sejtpopulációk elválasztására alkalmas. A FACS berendezésben van egy olyan egység, amely a sejtek szétválogatását végzi.
Szótár Autoradiográfia egy technika, amely Röntgen filmet (vagy korszerűbb technikát) alkalmaz radioaktívan megjelölt molekulák láthatóvá tételére. Epitóp (másképpen antigén determináns) a makromolekulák azon része, amelyet az immunrendszer felismer. Hierarchia (szerveződési) szintek és az azzal foglalkozó tudományok: ökoszisztéma, populációk: ökológia; szervezet, szervek, szövetek: élettan; sejtek: sejtbiológia; makromolekulák: molekuláris biológia, molekulák: kémia; atomok, szubatomi részecskék: kvantum fizika. JEGYZETEIM:
ALAPKÖVETELMÉNY
13. Előadás
Boldogkői Zsolt ©
7
