!HU000004683T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 683
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 5/06
(21) Magyar ügyszám: E 03 725273 (22) A bejelentés napja: 2003. 03. 07. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030725273 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1483369 A1 2003. 09. 18. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1483369 B1 2008. 09. 10.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0202945 2002. 03. 08.
(73) Jogosult: Vivalis, 49450 Roussay (FR)
FR
(72) Feltalálók: PAIN, Bertrand, F-69003 Lyon (FR); GUEHENNEUX, Fabienne, 44700 Orvault (FR) (54)
(2006.01) C12N 5/10 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03076601 PCT/FR 03/000735
(74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Madársejtvonalak hasznos anyagok elõállítására történõ alkalmazásra
(57) Kivonat
HU 004 683 T2
A találmány tárgya eljárás madársejtvonalak elõállítására, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: a) madár embrió õssejteket olyan közegben tenyésztenek, amely tartalmaz: – legalább az SCF, IGF–1 és bFGF növekedési faktorokat és legalább egy citokint a következõk közül választva: LIF, IL–11, IL–6, IL–6R, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin; – egy STO-sejt inaktivált réteget és – borjú magzati szérumot 12–8% koncentrációban, b) mintegy 20 passzálás után a tenyésztõközeget módosítják az említett növekedési faktor és a citokin vagy a tápréteg fokozatos leválasztásával, vagy úgy, hogy a borjú magzati szérum kon-
centrációját csökkentik egészen alacsony 2%¹os koncentráció eléréséig, c) adherens vagy nem adherens sejtvonalakat alapítanak, amelyek képesek egy alapközegben szaporodni exogén növekedési faktorok és citokin, szérum és/vagy inaktivált tápréteg nélkül, ahol a nem adherens sejtvonalak alapítását úgy érik el, hogy legalább 1×106 sejt/ml-rel bakteriológiai csészében beojtást végeznek, majd ezt követõen több passzálást végeznek egyszerû hígításban. A találmány a sejtek vagy sejtvonalak hasznos anyagok elõállítására történõ alkalmazását is magában foglalja.
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 683 T2
A találmány tárgya eljárás madársejtvonalak elõállítására, közelebbrõl madárõssejtek elõállítására, amely abból áll, hogy fokozatosan leválasztjuk a növekedési faktorokat, a szérumot vagy a tápréteget. Ezek a spontán módon keletkezõ sejtvonalak adherens vagy nem adherens sejtek, amelyek az alap tenyésztõközegben végtelenül képesek szaporodni. A találmány az ilyen sejtvonalakból származó sejtekre is vonatkozik, amelyek különösen hasznosak vakcinák és hasznos anyagok elõállítására. Az õssejtek olyan sejtek, amelyeket úgy azonosítunk, hogy in vitro tenyésztésbe fogjuk ezeket egy embrióból, egy embrió részbõl vagy akár egy felnõtt szövetbõl. Õssejten minden olyan embrionális vagy felnõtt eredetû pluripotens sejtet értünk, amely rendelkezik az önmegújulás képességével, és specializált differenciált sejteket képes elõállítani. Más szóval minden olyan nem rákos sejt, amely képes tenyésztéskor végtelenül osztódni, és olyan leánysejtet képezni, amely ugyanolyan szaporodási és differenciálódási képességgel rendelkezik, mint az az anyasejt, amelybõl származik. Ezek az izolált sejtek jellegzetes morfológiai és immuno-citokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. Megkülönböztethetjük a: – Embrionális õssejteket (CES-sejtek), ezek olyan õssejtek, amelyeknek az a jellegzetességük, hogy egy nagyon korai egész embrióból (blastula stádium) vagy embrió részbõl azok tenyésztésével lehet elõállítani ezeket. A CES-sejtek in vitro valamennyi õssejt tulajdonsággal rendelkeznek, és in vivo az az egyedi képességük van, hogy hozzájárulnak egy embrió morfogeneziséhez és részt vesznek a sejt kolonizációban, amikor ezeket bármely módon egy fogadó embrióba visszaültetik. – Szomatikus õssejtek (CSS), ezek olyan sejtek, amelyek rendelkeznek valamennyi õssejt tulajdonsággal, amikor ezeket in vitro tenyésztik, de amelyek a CES-sejtekkel ellentétben nem képesek egy embrióba történõ injektálás után a gonádok kolonizálására in vivo. Ezek kizárólag a szomatikus szövetek morfogeneziséhez járulnak hozzá az embrióban. A már differenciálódott primer sejtekkel ellentétben az õssejtek nem mutatnak könnyen azonosítható jellegzetes morfológiai differenciálódási állapotot (fibroblaszt, adipocita, makrofág stb.), hanem ezekre inkább egy burjánzásos és nem differenciálódott állapot jellemzõ. Ez az állapot különbözõ viselkedésekben jelenik meg, például gyors in vitro szaporodás, jellegzetes morfológia, különbözõ markerek jelenléte, változó növekedési faktor igények és képesség különös differenciálódási indukciós ingerekre reagálni. Nem érzékenyek a replikatív öregedésre, amely kritikus periódus számos differenciálódott primer sejt számára, mint amilyenek például a fibroblasztok. Ahhoz, hogy hosszú ideig in vitro tartsunk madárõssejteket, speciális tenyésztési és karbantartási körülményeket kell betartani, mint amilyeneket például a Pain és munkatársai (1996); US 6,114,168 és EP 787 180 irodalmi helyen ismertettek.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Ezek a szabadalmi iratok, amelyek tartalma egyenértékû a WO 96/12793 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés tartalmával, ismertetnek egy olyan tenyésztõközeget madár totipotens embrió sejtek számára, amely tartalmaz növekedési faktorokat és citokineket, és amely közeg lényegében mentes aktív retinsavtól. Megemlíthetjük a WO 99/06534 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést is, amelyben tenyészközeget ismertetnek madár embrió germinális sejtvonalak termeléséhez, amely közeg növekedési faktorként LIF¹et (leukémiát gátló faktor), bFGF¹et (alap fibroblaszt növekedési faktor), IGF¹et (inzulinra megjelenõ növekedési faktor) és SCF¹et (õssejt faktor) tartalmaz. Ugyancsak megemlíthetjük a WO 00/47717 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést, amelyben különösen eljárást ismertetnek madár germinális embrió sejtvonalak kialakítására elsõdleges germinális sejtekbõl, amelyeket olyan közegben tenyésztenek, amely növekedési faktorokat, például SCF¹et, bFGF¹et, IGF–1¹et vagy IL–11¹et (interleukin–11), valamint egy differenciálódást gátló faktort, például LIF¹et tartalmaz. Ha egy primer sejtet in vitro tenyészteni kezdünk olyan körülmények között, amelyek megfelelnek a közegnek és a növekedési faktoroknak, akkor ezt csak bizonyos számú passzálásig lehet szaporítani. Ezt a sejtet közvetlenül lehet kinyerni egy disszociált szövetbõl vagy ennek a szövetnek egy részébõl. A passzálások száma azonban nagymértékben függ az adott állatfajtól, a szövet eredetétõl, a donor organizmus életkorától és egyebektõl. A legtöbb esetben az in vitro megfigyelt sejtszaporodás fokozatosan lassul, majd a sejtek szaporodása megszûnik. Ez a leállás gyakran egy replikatív elöregedésnek felel meg, amelyet Hayflick-korlát néven ismerünk. Ez a leállás valószínûleg egy valódi molekulaóra hatásának az eredménye, amelynek az egyik kulcsszereplõje valószínûleg a telomerek hosszúsága. A telomerek a kromoszómák szélén elhelyezkedõ ismétlõdõ szekvenciák. Ezen ismétlõdõ nukleotidszerkezetetek megrövidülése a DNS-replikáció következménye félig konzervatív módon. A telomeráz enzim hiányában – mivel a kromoszómák széleire ismétlõdõ szekvenciákat kell hozzátenni – elérünk egy a telomerek méretét tekintve visszatérést már nem biztosítót pontot, amely pont után mûködésbe lép egy egyelõre még ismeretlen molekuláris mechanizmus, amelyben a sejtciklus szabályozásában szerepet játszó gének aktiválódnak. A sejtek ekkor valószínûleg az osztódásuk G1 fázisában blokkolódnak, és többé már nem szaporodnak. Számos szereplõ valószínûleg szerepet játszik a sejtciklus ezen negatív szabályozásában, ilyenek a különbözõ ciklinek, a specifikus kinázok, az RB, P53 fehérjék, a specifikus transzkripciós faktorok, például az E2F és számos egyéb (mdm2, BTG, p21,…). Ezzel szemben a telomeráz enzim a sejt halhatatlanság központi tényezõjeként tekinthetõ, mivel ez fenntartja a telomerek hosszúságát, tehát a sejtet érzéketlenné teszi az egymást köve-
1
HU 004 683 T2
tõ osztódások által létrehozott említett veszteséggel szemben. Egy fejlõdésben lévõ szervezetben és ennek a szervezetnek az élete során mindössze néhány sejttípus, mint amilyenek bizonyos limfociták, mutatja a telomeráz állandó expresszióját. Úgy tûnik, ez az aktivitás az õssejtek egyik jellemzõje is, mind a szomatikus szinten (CSS), mind germinális szinten. Ez az expressziós tulajdonság az expresszió fenntartásának tulajdonsága vagy más szóval a telomerázaktivitás expressziójának „felébresztése” ugyancsak gyakran társul egy in vitro tartott sejt halhatatlan jellegéhez. Napjainkig számos ráksejtrõl ugyancsak kimutatták, hogy telomerázaktivitással rendelkezik. Valószínûleg részben ez az aktivitás felelõs a tumorsejtek in vivo kontrollálatlan burjánzásának képességéért. Ez a telomerázaktivitás minden esetben kiváló markere az õssejt jellegnek, valamint a germinális sejtvonalnak, és egy sejt azon képességének, hogy halhatatlanná tud válni. Két kritériumot alkalmazunk tehát: a telomerázaktivitást és a telomerek méretét. A szakirodalom és a számos laboratóriumban már rendelkezésre álló eredmények alapján nagyon vázlatosan azt mondhatjuk, hogy a sejtvonalak alapítása két módon történhet: spontán alapítás, amely nem kiváltott saját genetikai károsodás eredménye, vagy provokált alapítás, amelyet vírus, retrovírus alkalmazásával vagy egyéb módon, például vegyszerekkel, besugárzással, UV (ultraibolya) sugárzással stb. váltunk ki. Emlõsöknél például rágcsáló sejtek (egér, patkány stb.) alapítását spontán módon elég könnyûnek tartják, ezzel szemben a helyzet egészen más emberi sejtek esetén, akármilyen is azok szöveti eredete [lásd Smith és Pereira-Smith (1996)]. Tehát amikor a fent említett madárõssejt sejtvonalakat kívánunk származtatni abból a célból, hogy nagy mennyiségû hasznos anyagot állítsunk elõ in vitro, a probléma a sejtek megtartása tenyészetben gazdaságos közegben, a nehézségek, például a differenciálódás és a sejt elöregedés elkerülésével. A madarak esetén általában azt tartják, hogy primer sejtek alapítása ritka, sõt gyakorlatilag nem létezõ esemény. Az egyetlen megjegyzésre érdemes publikált kivétel valószínûleg a DF–1-sejtvonal, amely csirke fibroblasztok spontánnak leírt halhatatlanná válásából származik [lásd Foster és munkatársai (1991); 5,672,485 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, N° ATCC CRL 12203]. Ezzel a sejtvonallal kapcsolatban a közelmúltban szakcikkekben említették a megfigyelt dereguláció elsõ elemeit (lásd Kim és munkatársai 2001 a; Kim és munkatársai 2001b). Az immortalizációs folyamatban egy elsõ lépés vezeti a szaporodó sejtet a Hayflick-határig, ami a sejttípustól függõen 10 és 50 passzálás között található. Ekkor egy elsõ spontán mutációs esemény történik, amely lehetõvé teszi, hogy a sejt áthatoljon ezen az elsõ akadályon, ez az esemény gyakran érinti a p53, pRb stb. géneket. A sejtek tehát szaporodnak addig a pillanatig, amikor egy második blokkolás lép közbe,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
ami általában egyéb génekben új mutációk és a gyakran megfigyelt telomerázaktiváció révén lép fel. A madaraknál általában azt tartják, hogy halhatatlan primer sejtek alapítása lényegében nem létezõ esemény. Ezért számos sejtvonalat kaptak úgy, hogy tumorsejteket tenyésztettek, amelyeket gyakran közvetlenül vettek tumor biopsziából. Ez az in vitro elõállítás tulajdonképpen bizonyos gének in vivo elváltozásának az eredménye, amely gének a tumor megjelenéséért felelõsek. Erre egy példa az SB¹CEV–1 fibroblaszt sejtvonal, amelyet egy állat belsõ részében lévõ daganat tenyésztésébõl izoláltak (ATCC N° CRL 10497, 5,846,527 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Ezt a megközelítést nagymértékben megkönnyíti, hogy nagyszámú madárvírus és retrovírus létezik, amelyeket azonosítottak, izoláltak és gyakran molekuláris szinten jellemeztek. Ezek a vírusok, amelyek gyakran direkt vagy indirekt hatásuk révén onkogének (egy transzformáló endogén gént aktiválnak integrációjuk során endogén onkogén fehérjét vagy fehérjéket expresszálva a vírusba), daganatokat, sérüléseket váltanak ki, így lehetséges sejtvonalak elõállítása állati fertõzött sejtek tenyészetével. Ezen in vivo izolált vírusok és retrovírusok in vitro alkalmazását kiegészítésképpen fejlesztették ki. Ezzel kapcsolatban megemlíthetjük például – de nem a teljesség igényével – az alábbiakat: – DT40 és DT95 limfoblasztoid vonalak, amelyeket madár leukózis vírus jelenlétében (ALV) nyertek, és amelyekben a myc lokusz aktiválva van (Baba és munkatársai, 1985, ATCC, N° CRL 2111, CRL N° 2112), – MDTC–RP19 pulyka limfoblasztoid vonal, amelyet a Marek betegség vírusával alapítottak (US N° 4,388,298, ATCC N° 8135), – ConA¹C1 limfoblasztoid vonal, amelyet az REV vírussal (retikuloendotélium vírus, ATCC N° 12135, US N° 5,691,200) alapítottak, – BM2 mielomonocita vonal, amelyet az MH2 vírussal alapítottak (Liu és munkatársai, 1977, brevet US N° 5,388,680), – és egy sorozat különbözõ vírusokkal kapott hematopoietikus vonal, – HD4 eritroblaszt vonal (6C2), amelyet az AEV vírussal kaptak, – HD11 monocita vonal (Beug és munkatársai, 1979), amelyet az MC29 vírussal kaptak, – HD13 granulocita vonal (Golay és munkatársai, 1988), amelyet az E26 vírussal kaptak, – HD57 vegyes hematopoietikus vonal (Metz és Graf, 1991), ugyancsak az E26 vírussal elõállítva. Az ilyen átalakítási megközelítéseknél azonban a probléma az olyan sejtek elõállítása, amelyek vírust termelnek, és az alkalmazott vírus és retrovírus aktivált genomját hordozzák. Ezek az aktiválások és ez a vírus jelenlét gátolja ezek ipari felhasználását replikációs hordozóként az érdeklõdésre számot tartó vírusokhoz vagy speciális fehérjék termeléséhez optimális biztonsági körülmények között.
1
HU 004 683 T2
Egy másik onkogén túlexpresszióval halhatatlanná tevõ génekkel (az adenovírus E1A génje, az SV40 poliom „széles T¹je” stb.) vagy génfragmensekkel kapcsolatos megközelítéssel ugyancsak elõ lehet állítani sejtvonalakat már differenciálódott primer sejtekbõl. Ezeket az elemeket a sejtbe be lehet vinni egyszerû vektor transzfektálással, ami lehetõvé teszi a halhatatlanná tevõ rész expresszálását, de be lehet vinni a genetikailag módosított vírus vagy retrovírus útján is ezen halhatatlanná tevõ elemek expresszálására. A halhatatlanná tevõ sejtek eredhetnek madárból vagy másból, lehetnek vírusos vagy nem vírusos eredetûek is. A madársejtekhez a tropizmus lehet egyébként az originális vírushoz kötött vagy lehet ugyancsak módosított. Például elõállították így a kacsa fibroblaszt TDF–2A sejtvonalát úgy, hogy elõször egy halhatatlanná tevõ gént, majd egy apoptózis ellenes gént vittek be (Guilhot és munkatársai, 1993, US 6,255,108). Más eljárásokat is kifejlesztettek, ilyen például a p53 túlexpresszálása (Foster és munkatársai, 5,830,723 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Egyébként kémiai karcinogén anyagok közvetlen állatra történõ hatásával különbözõ adagolási módokkal sikerült többek között az alábbiakat elõállítani: – fürj fibroblaszt QT6 és QT35 sejtvonala (Moscovici és munkatársai, 1977, ATCC N° CRL 1708), – csirke LMH hepatocita sejtvonala (Kawaguchi és munkatársai, 1989, ATTC N° CRL 2117), – csirke fibroblaszt CHCC¹OU2 sejtvonala (ATCC, N° CRL 12302, Brevet US N° 5,989,805). Halhatatlanná tevési eseményen különbözõ hatásokat értünk, ilyenek az alábbiak: – oxidatív, termikus, kémiai stressz hatás, amely képes sejtek és/vagy mutációk fiziológiájának módosításait kiváltani, – specifikus gének termékeinek hatása a sejt fiziológiájában, mint például bizonyos halhatatlanná tevõ géneké (onkogének, protoonkogének, sejtciklus gének, apoptózisellenes gének stb.), – antionkogének, apoptózisgének, tumorszuppresszorgének, burjánzásellenes gének rekombinációjával vagy funkcionális inaktiválásával történõ célzott lerombolása, amely a sejtciklus vagy a sejt fiziológiájának funkcionális deregulációjához vezet, – burjánzó gének szabályozása funkcionális blokkolásokkal stb., – sugárzások (UV, gamma, röntgen stb.) hatása, – kémiai mutagének (DNS¹t károsító anyagok, növekedési faktorral analóg anyagok stb.) hatása, – ezen egyes különbözõ hatások együttes hatása. A találmány értelmében azt tapasztaltuk, hogy a növekedési faktorok, a szérum és/vagy a tápréteg leválasztása az alap tenyésztõközegben végtelenül növekedni képes õssejtek populációi izolálásához vezet. Egyébként, a hematopoietikus õssejteken kívül, amelyek legnagyobb részt nem tapadó (adherens) sejtek, a sejtek többsége, amelyeket a fent említett ismert eljárásokkal állítanak elõ (fibroblasztok, hepatociták stb.) adherens fenotípust mutatnak. A sejtek vírusrepli-
2
káció-hordozóként történõ ipari alkalmazásához azonban elõnyösebbek a nem adherens sejtek. Ez a fenotípus figyelemre méltó mindazért, mert könnyû kezelni, mert nem szükséges disszociációs proteolitikus enzim 5 alkalmazása hozzá, mindazért, mert az in vitro tenyésztett nem adherens sejtekkel jelentõs sûrûségeket lehet elérni. A találmány szerint ismertetjük olyan sejtvonalak elõállítását, amelyek spontán módon képesek nem ad10 herenssé válni, vagy amelyeknél a nem tapadást a tápréteg leválasztásával érjük el. Mivel ezek a sejtvonalak szuszpenzióban növekednek, könnyen adaptálhatók ipari felhasználáshoz bioreaktorokban történõ hasznos anyagok termelésére. Azonkívül, hogy ezek a sejtvonalak képesek alap te15 nyésztõközegen növekedni, felismertük, hogy lehetõvé teszik bizonyos vírusok replikációját olyan kitermeléssel, amely ekvivalens, sõt nagyobb, mint az ismert eljárásokkal elért kitermelések; ami ezeket a sejteket külö20 nösen hasznossá teszi vakcinák tömeggyártásánál.
25
30
35
40
45
50
55
60 4
Leírás Tehát, egy elsõ vonatkozásban a találmány tárgya eljárás madársejtvonalak elõállítására, azzal jellemezve, tartalmazza az alábbi lépéseket: a) madár embrió õssejteket olyan közegben tenyésztünk, amely tartalmaz: – legalább az SCF, IGF–1 és bFGF növekedési faktorokat és legalább egy citokint a következõk közül választva: LIF, IL–11, IL–6, IL–6R, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin; – egy STO-sejt inaktivált réteget és – borjú magzati szérumot 12–8% koncentrációban, b) mintegy 20 passzálás után a tenyésztõközeget módosítjuk az említett növekedési faktor és a citokin vagy a tápréteg fokozatos leválasztásával, vagy úgy, hogy a borjú magzati szérum koncentrációját csökkentjük egészen alacsony 2%¹os koncentráció eléréséig, c) adherens vagy nem adherens sejtvonalakat alapítunk, amelyek képesek egy alapközegben szaporodni exogén növekedési faktorok és citokin, szérum és/vagy inaktivált tápréteg nélkül, ahol a nem adherens sejtvonalak alapítását úgy érjük el, hogy legalább 1×106 sejt/ml-lel bakteriológiai csészében beojtást végzünk, majd ezt követõen több passzálást végzünk egyszerû hígításban. A találmány értelmében „egy vonal alapításán” azt értjük, hogy a sejteket tenyészetben tartjuk in vitro jelentõs idõtartamon keresztül. Elõnyösen a c) lépésben kapott sejtvonalakból származó sejtek képesek legalább 50 napon, 100 napon, 150 napon, 300 napon vagy elõnyösen legalább 600 napon keresztül szaporodni. A 600 nap nem jelent idõbeli korlátot, mivel a kapott sejtvonalak még ennél jóval hosszabb idõtartam után is élõk. Innen kezdve ezeket a sejteket úgy tekintjük, hogy ezek képesek olyan alap tenyésztõközegben végtelenül növekedni, amely mentes exogén növekedési faktoroktól, szérumtól és/vagy inaktivált tápréteg-
1
HU 004 683 T2
tõl. „Vonalon” minden olyan sejtpopulációt értünk, amely képes végtelenül szaporodni in vitro tenyészetben úgy, hogy többé-kevésbé megõrzi ugyanazon morfológiai és fenotípus jellemzõit. A találmány szerinti vonalakból származó sejtek lehetnek madárõssejtek, különösen madár embrionális õssejtek, ahol a találmány szerinti eljárás a) lépésében a tenyésztõközeg citokinjét a következõk közül választjuk: LIF, IL–11, IL–6, IL–6R, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin. Ismertetjük, hogy a találmány szerinti õssejtek használhatók differenciált sejtvonalak származtatására. Tulajdonképpen ezek az õssejtek pluripotensek, vagyis képesek arra, hogy több differenciálódási útra be legyenek vive, és különbözõ specifikus markerekkel jellemezhetõk. Ezek a sejtek lehetnek prekurzorsejtek is, amelyek megfelelnek egy részlegesen differenciálódott felnõtt vagy embrionális szövetbõl származó sejteknek, szemben az õssejttel, amely képes osztódni és differenciáltabb sejteket eredményezni. „Differenciált sejt”¹en olyan specializált felnõtt vagy embrionális szövetbõl származó sejteket értünk, amelyek specifikus markereket mutatnak, vagy amelyek specifikus fiziológiai funkciókat töltenek be. A találmány egyik különös aspektusában, nevezetesen az egyedi izolátumoknál vagy egy alapítás során kapott egyedi izolátumból származó klónoknál lehetséges, hogy ezek az õssejtek hozzájárulhatnak a germinális sejtvonalhoz. Ebben az esetben a vonalban alapított ezen õssejtek embrionális õssejtek. Természetesen a fent említett eljárással elõ lehet állítani alapított sejtvonalakból származó sejtekbõl eredõ sejt klónokat. Ezek a klónok genetikailag azonos sejtek, mint az a sejt, amelybõl osztódással származtak. A találmány egyik megvalósítási módjában egy olyan fentebb meghatározott eljárásra vonatkozik, amelyben az alapított sejtvonalak adherens õssejtek, amelyek az inaktivált tápréteg nélkül szaporodnak. Ennek értelmében a fentebb ismertetett eljárásban a b) lépés abból áll, hogy a közeg komponenseit leválasztjuk (növekedési faktorok és citokin csupán vagy szérum csupán vagy növekedési faktorok és citokin majd szérum vagy szérum majd növekedési faktorok). Egy másik megvalósítási módban a találmány olyan fenti eljárásra vonatkozik, amelyben az alapított vonalak nem adherens õssejtek, amelyek szuszpenzióban szaporodnak exogén növekedési faktoroktól mentes közegben. Ilyen értelemben a fentebb ismertetett eljárásban a b) lépés abból áll, hogy a tápréteget fokozatosan vagy teljesen leválasztjuk, majd adott esetben leválasztjuk a közeg egyéb komponenseit (növekedési faktorok, citokin és szérum). Egy további megvalósításban a találmány olyan fentebb meghatározott eljárásra vonatkozik, amelyben az alapított sejtvonalak nem adherens õssejtek, amelyek szuszpenzióban szaporodnak olyan közegben, amely magzati szérumot tartalmaz 2% koncentrációban.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
Egy további megvalósítási módban a találmány olyan fentebb meghatározott eljárásra vonatkozik, amelyben az alapított vonalak nem adherens õssejtek, amelyek szuszpenzióban szaporodnak olyan közegben, amely mentes exogén növekedési faktoroktól és citokintõl, és tartalmaz 2% koncentrációban magzati szérumot. Egy további változatban a b) lépés abból áll, hogy a növekedési faktorokat fokozatosan vagy teljesen leválasztjuk, majd csökkentjük a borjú magzati szérum koncentrációt mindaddig, amíg a 2% koncentrációt elérjük. Egy további változatban a b) lépés abból áll, hogy a növekedési faktorokat és a citokint fokozatosan leválasztjuk és/vagy a szérum koncentrációt 2%¹ig csökkentjük, majd adott esetben leválasztjuk a tápréteget. Ezenkívül az alapított vonalak lehetnek olyan sejtek, amelyek 2% koncentrációra csökkentett magzati szérumot tartalmazó közegben szaporodnak. A csökkentett szérum koncentráción azt értjük, hogy a szérum koncentrációját fokozatosan, idõben elosztva csökkentjük. Ezzel az eljárással lehetõvé válik olyan klónok kiválasztása, amelyek alkalmazkodnak az egyre drasztikusabb új körülményekhez, egészen az olyan stabil vonalak elõállításáig, amelyek képesek a szérumban szegény közegben, sõt a teljesen szérummentes közegben növekedni. A fentebb ismertetett eljárás tartalmazhat ezenkívül egy olyan lépést, amelyben a c) lépésben kapott sejteket egy szelekciónak vetjük alá olyan tenyésztõközegekben, amelyeket nagy mennyiségû termelésre használunk, így olyan klónokat tudunk elõállítani, amelyek alkalmasak humán vagy állatgyógyászatra szánt vakcina termelésre. A találmány szerinti sejtek rendelkeznek legalább egy alábbi jellemzõvel: – jól látható nukleollal és nagyon gyenge citoplazmával, – endogén alkalikus foszfatáz aktivitással, – endogén telomerázaktivitással, – az SSEA–1 (TEC01), SSEA–3 és EMA–1 antitestekbõl választott specifikus antitestekkel való reakcióképességgel. Elõnyösen a találmány szerinti sejtek a fent említett jellemzõk mindegyikével rendelkeznek. Ismertetünk egy eljárást a fentebb említett madár vonalak elõállítására, amelyben a c) lépésben kapott vonalból származó sejteket módosítjuk abból a célból, hogy in vitro jobban fel lehessen használni ezeket, ilyen módosítás az élettartam megnövelése vagy nagyobb növekedési sûrûség vagy kisebb tápanyagigény. Elõnyösen az alapított vonalakból származó sejteket úgy módosítjuk, hogy egy hasznos anyag termelésére, például egy hasznos polipeptid, egy antitest vagy egy gyengített vírus termelésére alkalmasak legyenek. Ezeket a sejteket bármely a szakember által ismert eljárással módosíthatjuk, ilyenek például a homológ, irányított és/vagy feltételes rekombináció (Cre-Lox vagy FLP-FRT rendszer), bármely vektorral, plazmiddal, így retrovírussal történõ transzformáció.
1
HU 004 683 T2
Az a) lépésben alkalmazott közeg tartalmaz legalább egy következõk közül választott citokint: LIF, IL–11, IL–6, IL–6R, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin, és SCF, IGF–1 et bFGF növekedési faktorokat. Az a) lépésben alkalmazott inaktivált táprétegvonalban alapított egér fibroblasztból áll, STO-sejtekbõl, amelyeket adott esetben módosíthatunk, vagy expressziós vektorokkal transzfektálhatunk (Pain és munkatársai, 1996). Ebben az eljárásban az a) lépésben alkalmazott sejtek olyan sejtek, amelyeket úgy állítunk elõ, hogy megtermékenyített tojás blasztoderma lemezekbõl származó sejteket szuszpendálunk olyan tenyésztõközegben, amely tartalmaz legalább egy citokint, b¹FGF¹et és SCF¹et. Ezeket a sejteket egy tápláló, inkubált, majd levett sejt rétegre ojtjuk. A b) lépés abból áll, hogy az a) lépés közegéhez hozzáadott egyes növekedési faktorokat és citokint fokozatosan leválasztjuk, ahol az a) lépés tartalmaz egy passzálást egy új közegben, amely mentes legalább egy említett faktortól vagy citokintól, és különbözõ egymást követõ passzálást ismétlünk mindaddig, amíg a közeg valamennyi faktortól és citokintól mentes lesz. Fokozatos leválasztáson azt értjük, hogy a tenyésztõközegben egyenként kihagyjuk a faktorokat. Úgy is eljárhatunk, hogy drasztikus vagy teljes leválasztást végzünk, vagyis egyszerre távolítjuk el valamennyi említett faktort. Így a b) lépésben a leválasztás állhat abból, hogy csökkentjük fokozatosan egy vagy több faktor koncentrációját, vagy a madárõssejteket közvetlenül olyan közegben tenyésztjük, amely mentes egy vagy több faktortól, vagy amely valamennyi említett faktortól mentes. A b) lépés tartalmazhatja a szérum leválasztását is. Ezzel kapcsolatban a leválasztás lehet fokozatos úgy, hogy minden passzálás során csökkentjük a szérum koncentrációt, például 10%-ról 7,5%¹ra, majd 3,75%¹ra és 2%¹ra. Amint azt ismertettük, úgy is eljárhatunk, hogy drasztikus leválasztást végzünk. A b) lépés tartalmazhatja a tápréteg leválasztását is. A tápréteg leválasztása ugyancsak lehet fokozatos úgy, hogy csökkentjük minden passzálás során az inaktivált tápsejtek számát. Úgy is eljárhatunk, hogy drasztikus leválasztást végzünk. A leválasztások sorrendje természetesen változhat. Például végezhetjük elõször a növekedési faktorok és a citokin leválasztását, majd ezután a tápréteg leválasztását. A találmány tárgya tehát egy másik vonatkozásban alapított sejtvonalak és a sejtvonalakból származó sejtek, amelyeket a fent említett eljárással állítottunk elõ, ahol a sejtek képesek legalább 50 napig, 100 napig, 150 napig, 300 napig vagy elõnyösen legalább 600 napig szaporodni olyan közegben, amely mentes exogén növekedési faktortól és citokintól, és szérumban szegény, mindössze 2%, és/vagy mentes táprétegtõl. Ezek a sejtvonalak és az ezekbõl származó sejtek képesek legalább 50 napig, 100 napig, 150 napig, 300 napig vagy elõnyösen legalább 600 napig szaporodni egy alap közegben, nevezetesen olyan közegben, mint amilyen a DMEM, GMEM, HamF12 vagy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
McCoy, amelyek különbözõ, a szakember által szokásosan alkalmazott adalékokkal ki vannak egészítve. Az adalékok közül megemlíthetjük a nem esszenciális aminosavakat, a vitaminokat és a nátrium-piruvátot. A találmány további tárgya a fent említett sejtvonalak és az ilyen vonalakból származó sejtek, azzal jellemezve, hogy madárõssejtek, különösen madár embrionális õssejtek. Ezek az õssejtek lehetnek adherensek, amelyek szaporodnak az inaktivált tápréteg jelenléte nélkül. Egy változatban ezek az õssejtek nem adherensek, és szuszpenzióban szaporodnak egy fentebb ismertetett alap közegben. Ezekre a sejtekre az is jellemzõ, hogy rendelkeznek legalább egy alábbi jellemzõ tulajdonsággal: – jól látható nukleollal és nagyon gyenge citoplazmával, – endogén alkalikus foszfatáz aktivitással, – endogén telomerázaktivitással, – az SSEA–1 (TEC01), SSEA–3 és EMA–1 antitestekbõl választott specifikus antitestekkel való reakcióképességgel. Elõnyösen ezek a sejtek genetikailag módosítottak úgy, hogy képesek egy hasznos anyagot, így hasznos polipeptidet, antitestet vagy gyengített vírust termelni. Ezek a sejtek például támogathatják az élõ vagy gyengített vírus replikációt, különösen a következõk közül választott vírusokét: adenovírus, hepadnavírus, herpeszvírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, pikornavírus, poxvírus, reovírus és retrovírus. Elõnyösen az ezen sejteken replikált vírus az ortomixovírus családba tartozik, különösen az influenza vírus vagy a paramixovírus családba tartozik, különösen a kanyaró, a mumpsz és a rubeolavírus. A találmány tárgya tehát a fent említett sejtvonalak, az ezen vonalakból származó sejtek, valamint a genetikusan módosított sejtekbõl kapott sejtvonalak is. Elõnyösen a találmány tárgya az olyan fentebb ismertetett eljárás c) lépésébõl származó sejtvonalak, amelyekre jellemzõ, hogy olyan madárõssejtek, amelyek végtelenül képesek növekedni alapközegben, amely mentes exogén növekedési faktoroktól és citokintól, szérum koncentrációja egészen 2%¹ig le van csökkentve, és/vagy mentes táprétegtõl. Egy további változatban a találmány szerint a c) lépés végén kapott sejtek genetikusan módosítva lehetnek. Ismertetünk egy olyan sejttenyészetet is, amely tartalmaz fentebb ismertetett sejtvonalakból származó sejteket, különösen madárõssejteket vagy madár embrionális õssejteket, és egy alapközeget, amely mentes exogén növekedési faktoroktól, csökkentett a szérum koncentrációja vagy mentes szérumtól és/vagy inaktivált táprétegtõl. Egy további vonatkozásában a találmány tárgya a fentebb ismertetett sejtvonalak és sejtek alkalmazása hasznos anyagok termelésére, különösen gyógyászatilag használható fehérjék termelésére, élõ vagy gyengített vírusreplikációra, különösen az adenovírus, hepadnavírus, herpeszvírus, ortomixovírus, papovavírus, pa-
1
HU 004 683 T2
ramixovírus, pikornavírus, poxvírus, reovírus és retrovírus csoportba tartozó vírusreplikációra. Elõnyösen a fentebb ismertetett sejtvonalakat és sejteket az ortomixovírus családba tartozó vírus termelésére használjuk, különösen az influenzavírus termelésére, valamint a paramixovírus családba tartozó vírus, különösen a kanyaró, a mumpsz- és a rubeolavírus termelésére. Az élõ vagy gyengített vírus replikációjának elõsegítésére használt sejtvonalakba bevihetjük az egy vagy több olyan komponenst, amely a vírus teljes vírus ciklusa megvalósításához szükséges úgy, hogy például a sejt felszínén nyerjük a vírus receptor túlexpresszálását. A leírás további részében az ábrákat ismertetjük. Az ábrák magyarázata 1–3. ábrák: A találmány szerinti sejtvonalak növekedési görbéi (a szérum leválasztásával a 2. ábrán és a tápréteg leválasztásával a 3. ábrán). 4. ábra: Fénykép, amely madárõssejtek jellegzetes morfológiáját mutatja N: mag, n: nukleol és C: citoplazma (S86N 99 izolátum, 40¹szeres nagyítás, a fényképet Sony Cyber-shot digitális fényképezõgéppel készítettük) 5. ábra: Fénykép, amely adherens vagy szuszpenzióban lévõ õssejtvonalak alkalikus foszfatáz aktivitását mutatja Fixálás után (0,1% formaldehid/0,5% glutáraldehid, 30 perc 4 °C¹on) a sejteket kétszer öblítjük PBS 1X¹szel, és 10–30 percen keresztül inkubáljuk 37 °C¹on egy NBT/BCIP (nitro-kék-tetrazólium-klorid 3,375 mg/ml, 5¹bróm-4-klór-3-indolil-foszfát 0,188 mg/ml, 0,1 mol Trisz pH 9,5, 0,05 mol MgCl2, 0,1 mol NaCl) oldatban. A reakciót két PBS 1X mosással leállítjuk, és elkészítjük a fényképeket. A: Az endogén alkalikus foszfatáz aktivitás jellegzetes lila színezõdését illusztrálja, amelyet az S86N45 p87 adherens vonalra kaptunk, amely vonalat tápréteg és faktor nélkül tenyésztettünk (40-szeres nagyítás, Sony Cyber-shot digitális fényképezõgép). B: Az EB14 sejtvonalra kapott endogén alkalikus foszfatáz aktivitás jellegzetes lila színezõdését mutatja be, ezt a sejtvonalat 8 passzálás után szuszpenzióban tartottuk, a sejtvonal S86N 45 sejtekbõl származik, szuszpenzióban tenyésztve tápréteg és faktor nélkül (20-szoros nagyítás, Sony Cyber-shot digitális fényképezõgép).
2
rokonság elkerülése lenne pontosan a fontos. A jelen találmányban a tenyészetbe vont sejtek eredeti forrásai a tojások. A tojásokat elõnyösen inkubálatlanul alkalmazzuk, azonban néhány órás inkubálás szükséges lehet az 5 embrió kifejlõdésének elsõ stádiumai eléréséhez. A kapott sejtek különbözõ csirke törzsekbõl származnak. Az alkalmazott törzsek közül megemlíthetjük az S86N törzset, amely kereskedelmi törzs a Label csirke gyártásához, a CNR törzset, amelyet a Label és a Maren csirke 10 termeléséhez való, ez helyi törzs, genetikailag és fenotípus szempontjából jól jellemezve van, továbbá a White Leghorn törzset, amely inkább fogyasztásra szánt tojástermeléshez való, és kutató laboratóriumok referencia törzse stb. Ez utóbbi törzsben különbözõ eredetûeket 15 vizsgáltunk, amelyek közül bizonyos tojásokat (ezeket Valo-nak nevezik) és a White Leghorn törzsbõl származnak, Lohmanntól (Németország) „SPF” tojásoknak tekintenek (SPF=Specific Pathogen Free) egészségügyi szempontból nagyon különös körülmények között tarta20 nak. Különbözõ törzsekbõl számos sejt izolátumot nyertünk, ez az eljárás általános jellegére utal.
25
30
35
40
45
50
1. példa: Az alkalmazott élõ anyag változó eredete A sejtvonal-alapítás gyakran nagyon kapcsolódik a sejtanyag genetikai minõségéhez. Így az egér példájá- 55 nál arányosan kevés genetikai alap megengedõ az embrionális ES õssejtek befogadására, és gyakran magában foglalja az állati vérrokonság fogalmát. Ami a madarat illeti, nehéz vérrokon állatot találni törtélelmi okok miatt és kereskedelmi törzsek kiválasztása miatt; a vér- 60 7
2. példa: Adherens sejtek kinyerése és alapítása A tojásokat felnyitjuk, és a felnyitás során a sárgáját elválasztjuk a fehérjétõl. Az embriókat levesszük a sárgájáról vagy közvetlenül egy Pasteur pipettával vagy egy kis itatóspapír szûrõvel (Whatman 3M papír), amelyet elõzetesen egy perforálóeszközzel perforált gyûrû formára kivágtunk. A perforálási átmérõ körülbelül 5 mm. Ezeket a kis gyûrûket száraz meleggel sterilizáljuk körülbelül 30 percig kemencében. Ezt a kis papír gyûrût a sárgája felületére helyezzük, és az embrió közepére tesszük, amelyet így körülvesz a papírgyûrû. Ez utóbbit ezután kis olló segítségével felvágjuk, az egészet levesszük, és Petri-csészébe helyezzük, amelyben PBS vagy fiziológiai folyadék van. Az ily módon a gyûrûvel bevitt embriót megtisztítjuk a sárgája feleslegtõl a közegben, és az embrió lemezt, amely így mentes a tojássárgától, Pasteur-pipettával levesszük. Mindkét esetben az embriókat fiziológiás közeget tartalmazó (PBSIX, Trisz-glükóz közeg stb.) kémcsõbe helyezzük. Az embriókat ekkor mechanikusan disszociáljuk, és egy tenyésztõközegben egy „feeder”¹re helyezzük. A tenyészetbe helyezéshez alkalmazott elõnyös körülmények közül megemlítjük a MacCoy közegbõl álló tenyésztõközeget, mint olyan alap közeget, amely ki van egészítve borjú magzati szérummal kezdetben 12–8% koncentrációban, nem esszenciális aminosavakkal 1% koncentrációban, kereskedelmi eredetû vitaminkeverékkel 1%¹osan, nátrium-piruváttal végül 1 mmol koncentrációval, béta-merkapto-etanollal 0,2 mmol¹os végsõ koncentrációval, glutaminnal 2,9 mmol¹os végsõ koncentrációval, egy kezdeti antibiotikum eleggyel, amely tartalmaz gentamicint 10 ng/ml végsõ koncentrációban, penicillint 100 U/ml végsõ koncentrációban és sztreptomicint 100 mg/ml végsõ koncentrációban. Az elsõ sejtpasszálások után hamarosan az antibiotikum elegyet már nem adjuk hozzá a közeghez. „Hamarosan”¹on általában azt értjük, hogy az elsõ 3–5 passzálásról van szó. Ugyancsak
1
HU 004 683 T2
adagolhatunk egy nukleozid elegyet, ez az elegy a fentiekben már ismertetett összetételû (Pain és munkatársai, 1996). Azon alapközegek közül, amelyeket azonos körülmények között teszteltünk, és amelyek hasonló eredményeket szolgáltatnak, megemlíthetjük a HamF12, a Glasgow MEM és a DMEM közegeket, ez utóbbi ki van egészítve 8 mg/l végsõ koncentrációjú biotinnal. Összehasonlításul a biotin koncentrációja 0,2 mg/l a MacCoy közegben, 0,0073 mg/l a Ham F12 közegben és 0 a DMEM és a GMEM kereskedelmi forgalomban kapható közegekben. A tenyésztõközegekhez adagolt növekedési faktorok és citokinek elõnyösen rekombináns faktorok és citokinek, ide tartoznak a következõk: egér SCF 1 ng/ml végsõ koncentrációban, IGF–1 1–5 ng/ml végsõ koncentrációban, CNTF 1 ng/ml végsõ koncentrációban, IL–6 1 ng/ml végsõ koncentrációban és az IL–6 oldható receptora 0,5 ng/ml – 1 ng/ml végsõ koncentrációban. Bizonyos kísérletekben bizonyos egyéb faktorok is adagolhatók az elsõ passzálások alatt. Például a 3. vagy 10. passzálásig a közeghez adagolhatunk bFGF¹et 1 ng/ml végsõ koncentrációban és IL–11¹et 1 ng/ml végsõ koncentrációban. A beojtást ebben a közegben végezzük az inaktivált „feeder”¹en, amely az STO-sejtekbõl a sejtvonalban alapított egér fibroblasztokból áll. Bizonyos esetekben ezeket a sejteket transzfektáltuk egyszerû expressziós vektorokkal, amelyek lehetõvé teszik növekedési faktorok, például a madár SCF expresszióját alkotó módon az STO-sejtekben. Ily módon ez a „feeder” a faktort oldható formában és/vagy a sejtek plazmamembránjában tapadó formában termeli. A sejteknek kezdetben közvetlenül a közegbe történõ beojtása után a közeget másnap részlegesen kicseréljük, majd részlegesen vagy teljesen kicseréljük az ezt követõ napokban, függõen a primer sejtek megfigyelt tapadási sebességétõl. Az esettõl függõen körülbelül 4–7 nap után a kezdeti tenyészetet disszociáljuk és passzáljuk új csészékben ugyanabban a kezdeti közegben az inaktivált „feeder”¹en. Három–öt passzálás után a sejteket olyan STO-sejtek inaktivált „feeder”¹én tenyésztjük, amelyek nem transzfektáltak vagy olyan expressziós vektorral transzfektáltak, amely antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát kódol, mint például a neomicinnel, higromicinnel, puromicinnel szemben re-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
zisztens gén. Körülbelül húsz passzálás után a sejteket fokozatosan leválasztjuk növekedési faktorokra és citokinekre. Fokozatos leválasztáson azt értjük, hogy a faktorokat egyenként vesszük ki a tenyésztõközegbõl. Így egy passzálásnál elõször levesszük az SCF¹et, majd két vagy három passzálás után az IGF–1¹et. Ha a sejtek nem mutatnak morfológiai eltéréseket vagy az átlagos szaporodásuk sebességében változást, azután eltávolítjuk a többi faktort, így a CNTF¹et, az IL–6¹ot. Ez a leválasztás lehet drasztikus is. Ilyenkor egyszerre vesszük el valamennyi faktort. Ekkor megfigyeljük a sejteket, és csak több nappal késõbb passzáljuk, ha a szaporodási sebességük módosul. Általában ez utóbbi megoldást alkalmazzuk a gyakorlatban. Ily módon különbözõ izolátumokat kapunk, és nagyon hosszú idõtartamon keresztül megtartjuk ezeket. Nagyon hosszú idõtartamon több hét körüli idõtartamot értünk, legalább 50 napot, elõnyösen 200–400 napnál is hosszabb idõtartamot, idõbeli korlátozás nélkül. Megfigyelhetünk 600 napnál hosszabb idõtartamokat. Függetlenül az alkalmazott hordozótól valamennyi adherens sejtet disszociáljuk egy disszociációs proteolitikus enzimmel, mint amilyen a pronáz, a kollagenáz, a diszpáz, a tripszin stb. Elõnyösen baktérium eredetû proteolitikus enzimet alkalmazunk, hogy elkerüljük az esetleges állati eredetû szennyezést. Ezek a sejtek embrionális õssejt jellemzõkkel rendelkeznek, amelyek speciális morfológiáját például a 4. ábrán lévõ fénykép illusztrálja, vagyis kis méret, jelentõs nukleocitoplazma arány, legalább egy jól látható nukleollal rendelkezõ mag és egy nagyon gyenge citoplazma. Ezekre a sejtekre jellemzõ, hogy többé-kevésbé kontakt módon tömegben növekednek. Az anherens és nem adherens sejtek keresztezett reaktivitást mutatnak bizonyos számú antitesttel, amint azt a közelmúltban az alábbi irodalmi helyeken ismertették: Pain és munkatársai, 1996, és 6,114,168 számú amerikai egyesült államokbeli, valamint a EP 787 180 számú európai szabadalmi leírásokban. Ugyancsak jelen van az endogén telomeráz hatás komponens, és ez ezen sejtek „õssejt” jellegének fontos elemét alkotja. Különbözõ izolátumsejteket kapunk és tartunk fenn hosszú ideig. Az 1. táblázatban ezen izolátumok néhány jellemzõjét mutatjuk be.
1. táblázat Név
Faj
Kezdet
„Leállás”
Napok száma
Passzálás
Generáció
S86N 16
S86N csirke
26–01–2000
05–08–2001
559
207
692
WL3
WL csirke
28–06–2000
09–08–2001
403
153
333
Valo4
Valo csirke
26–09–2000
07–02–2002
401
135
317
S86N 45
S86N csirke
29–01–2001
12–11–2001
287
118
329
Megemlítjük, hogy a „leállás” kifejezés nem a sejtek szaporodásának végét jelenti, hanem a kísérletezõ részérõl a sejt tenyésztés szándékos leállítását. A generáció n számát az X=2n képlettel kapjuk meg, ahol X je-
lentése a sejtek elméleti felhalmozott száma. Ez a szám rendelkezésünkre áll, mivel a sejteket minden passzálásnál és minden beojtásnál megszámoljuk. Ily 60 módon rendelkezésre áll a tenyészet teljes története. 8
1
HU 004 683 T2
3. példa: Sejtek passzálása Az õssejtek, különösen a szomatikus õssejtek és az embrionális õssejtek egyik jellemzõje, hogy jelentõs idõtartamon keresztül képesek in vitro szaporodni. A sejtek terjesztéséhez és passzálásához a tenyésztõközeget kicseréljük, és új közeggel helyettesítjük néhány órával a passzálás elõtt. Az elsõ ábrán bemutatott görbe sejtek növekedési és alapítási profilját illusztrálja. 4. példa: Megkétszerezõdés ideje és átlagos osztódási idõ A tenyészetben alapított és az elõzõ példákban bemutatott sejtekbõl számítható egy átlagos osztódási
2
idõ. Valamennyi kapott független izolátum esetén a szaporodási sebesség enyhén növekszik az egymást követõ passzálások során, és így a sejtek alapítása során növekszik az átlagos osztódási idõ. Adherens fá5 zisban a sejteket elõször egy inaktivált táprétegre ojtjuk (ezt „feeder”-nek nevezzük), és ezeket szabályos idõközönként passzáljuk állandó kezdeti beojtási sûrûséggel, amely 1¹2×106 sejt per 100 mm¹es csésze A 2. táblázatban illusztráljuk a megkétszerezõdési idõt (d) 10 és az átlagos osztódási idõt (TMD órában kifejezve) 3 alapított sejttípusra a tenyésztési idõ függvényében. Megfigyelhetõ, hogy az alapítás során csökken a megkétszerezõdési átlagos idõ.
2. táblázat Sejt/nap
S86N 16 (d) S86N 16 (TMD) S86N 45 (d) S86N45 (TMD) Valo 4 (d) Valo 4 (TMD)
50
0,30 80 0,49 49 0,03 >48
100
0,63 38 0,89 26,8 0,61 39,3
150
1,00 24 0,89 27 1,00 24
200
0,86 27,9 1,45 16,5 1,17 20,5
250
1,13 21,2
350
400
450
1,15
1,47
1,70
1,94
20,9
2,15 11,1 1,26 19
300
16,3
14,1
12,4
500
1,50 16
550
1,9 12,6
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
1,03* 23,3
1,08* 22,2
1,25* 19,2
A d átlagos megkettõzõdési idõt állapítjuk meg a napokban kifejezett idõtartamra az alábbi képlettel: d=(1/Log2×(LogX2/X1))×1/(T2–T1) ahol X2 és X1 a sejtek összes száma T2 és T1 pillanatban. Ez a képlet az N generáció szám számítás közvetlen következménye az X=2n képlettel, amelyet az elsõ példában mutattunk be. Az átlagos osztódási idõt (TMD) ekkor órában kapjuk meg, ha 24 órát d¹vel elosztunk. * A Valo-sejteket passzáljuk ezen alapítás során feeder jelenléte nélkül mûanyag hordozón. A megkettõzõdési idõ csökken, majd újra növekszik, amikor a sejtek ehhez az új környezethez ismét hozzászoknak.
5. példa: A szérumszint szabályozása sejtvonalak szaporodásához Ezen sejtvonalak elõállítása során az alkalmazott tenyésztõközegek hagyományos közegek, amelyek tartalmaznak egy alapot (DMEM, GMEM, HamF12, McCoy stb.), amelyek különbözõ adalékokkal vannak kiegészítve, ilyenek például a nem esszenciális aminosavak, a vitaminok, a nátrium-piruvát. Ez az összetett közeg tartalmaz borjú magzati szérumot, amely a tenyészet egyik központi eleme marad, akkor is, ha különbözõ eredetû, köztük növényi eredetû komponenseket is fokozatosan alkalmazni lehet. Bemutatunk egy eljárást a sejtek szabályozására, és a viszonylag alacsony borjú magzati szérum koncentrációkhoz történõ hozzászoktatására. Így eljutunk ahhoz, hogy a sejteket nagymértékû szaporodási állapotban tartjuk (osztódási idõ >1) alacsony szérumkoncentrációknál (2% például az S86N 16 sejtek esetében). A 2. ábrán bemutatott görbék illusztrálják egy adott sejttípusnál a szérum relatív csökkenését: ez a sejt az S86N 16 sejt. A megkettõzõdési idõt és az átlagos osztódási idõt is kiszámítottuk, és ezt a 3. táblázatban adjuk meg. Megjegyezzük, hogy az átlagos osztódási idõ növekszik a szérum relatív csökkenésének függvényében. Egy újranövekedési fázis azonban megfigyelhetõ bizonyos tenyésztési idõ után az említett körülmények között. Ez az idõ azonban kisebb, mint 24 óra (d>1),
ami igen figyelemre méltó szaporodást jelent ipari 35 szempontból akkor is, ha a szérum koncentráció csak 2%, ami már viszonylag alacsonynak számít. Ez még javítható, szóba jöhetnek bizonyos metabolitok ezen idõ növeléséhez, és ahhoz, hogy a tenyésztés körülményeit tovább lehessen optimalizálni. 40 3. táblázat Körülmény
45
d TMD
10%
2,02 11,9
7,5%
1,51 15,8
3,75%
1,47 16,3
2%
1,08 22,2
A példákat a p204 és p179 passzálás között vettük a 10%¹os körülményhez, a p198 és p176 között a 7,5%-hoz, a p224 és p201 között a 3,75%-hoz és a 50 p216 és p199 között a 2%¹hoz. 6. példa: Sejtek leválasztása a táprétegrõl A tenyésztés kezdeti körülményei között egy inaktivált sejtekbõl álló réteg jelenléte szükségesnek látszik 55 az embrionális õssejtek elõállításához, amint azt korábban már említettük. Ez a táplálóréteg vagy „feeder” bizonyos számú passzálás után már nem tûnik szükségesnek. Csupán a „tenyészettel kezelt” mûanyag látszik fontosnak. Tulajdonképpen bizonyos eukarióta 60 sejtek egyik tulajdonsága, hogy adherens formában 9
1
HU 004 683 T2
szaporodik. A sejtek tapadásának megkönnyítésére a különbözõ felhasznált mûanyagokat „tenyészettel” kezeljük. Gyártásuk során olyan kezelésen mennek át, amely a mûanyag felületére töltéseket visz be, amely töltések elõsegítik a sejtek extracelluláris mátrixának a tapadását. Ezzel szemben a sejttenyészet céljára nem kezelt mûanyag, amelyet gyakran bakteriológiai minõségû mûanyagnak neveznek, specifikus töltések hozzáadásával végzett felületkezelésen nem megy keresztül. A sejtek erre történõ tapadása általában nagyon nehéz, sõt lehetetlen, vagy gyakran drasztikus morfológiai viselkedési változásokat indukál. A kétféle minõségû mûanyag ilyen megkülönböztetése az ott végzett ojtástól függõen eltérõ viselkedésû sejtek elõállítását teszi lehetõvé. Ha az inaktivált „feeder”¹en lévõ tenyészeteket fokozatosan leválasztjuk, akkor néhány passzálás után homogén õssejt tenyészeteket nyerhetünk, amelyek közvetlenül a „tenyészethez kezelt” mûanyagra vannak ojtva. Inaktivált „feeder” jelenlétében vagy enélkül tartott sejtek növekedésének összehasonlító görbéit mutatjuk be a 3. ábrán az S86N 16 sejtek esetére. A sejtek ilyen adaptálása fokozatos azért, hogy ne vesszen el az eredetileg „feeder”¹en tartott sejtek õssejt jellege. Ily módon fokozatos származékokat készítünk. A leválasztási folyamat végén mûanyagon szaporodó sejteket kapunk. A 4. táblázatban az osztódási idõk azt mutatják, hogy a sejtek érzékenyek a környezetükre. Hasonlóan a szérum fokozatos leválasztásának esetéhez, adaptáció figyelhetõ meg, a sejtek néhány passzálás után az adott körülmények között fokozatosan módosulni képesek.
megfigyelt szaporítóhatás növelését. Korábban már kimutattuk, hogy legalább egy ilyen citokin hozzáadása valószínûleg szükséges az embrionális õssejtek elõállításához. A trofikus faktorok fõként az SCF, az IGF–1, a 5 bFG, amelyeket ugyancsak alkalmazunk a tenyésztés kezdetén, amint korábban már leírtuk. Ezek jelenléte szintén szükséges a sejtek elõállításához és terjesztéséhez. Ha fokozatosan csökkentjük ezeket a növekedési 10 faktorokat, akkor néhány passzálás után olyan tenyésztési körülményeket kaphatunk, amelyek lehetõvé teszik az embrionális vagy szomatikus õssejtek szaporodását exogén növekedési faktor hozzáadása nélkül. 15 Az ezen sejtek jellemzéséhez használt különbözõ markerek mindig pozitívak a faktorok nélkül tartott sejtekre. 8. példa: Az alkalmazott közegek összehasonlítása Ha a sejteket különbözõ közegekbe ojtjuk, akkor 20 nem azonos frekvenciával kapjuk meg ezeket. A közegek összetételének összehasonlításával nehéz valamelyik egyedi komponens azonosítása. Valószínûbbnek tûnik, hogy a kombináció egyike se hat pozitívan a sejtek fiziológiájára. Az elõnyös közegek közül megem25 lítjük a Ham F12, MacCoy, DMEM és egy biotinnal dúsított DMEM közeget. Egy azonos izolátumból különbözõ közegekben végeztünk adaptációs kísérleteket.
30
4. táblázat Körülmény
1,2
0,5
0,3
d
1,95
1,84
1,39
TMD
12,3
13
17,3
Mûanyag
2
35
1,42 16,9
A példákat mindhárom körülményre, az 1,2×106, 0,5×10 6 és 0,3×10 6 sejt feeder¹re p154 és p131 passzálás között vettük, és a csak mûanyag körülmény esetén a p161 és p139 között.
40
7. példa: Sejtek leválasztása növekedési faktorokban A tenyésztés kezdeti körülményei között a növekedési faktorok jelenléte szükséges. Sematikusan két faktor családot különböztethetünk meg: a citokineket és a trofikus faktorokat. A citokinek fõként olyan citokinek, amelyek hatása egy a gp130 fehérjéhez kapcsolódó receptoron keresztül történik. Így az LIF, az interleukin–11, az interleukin–6, a CNTF, az onkosztatin, a kardiotrofin hasonló módon hat úgy, hogy a receptoron egy speciális láncot és ez utóbbinak a gp130 proteinnel való asszociációját gyûjti össze monomer formában vagy néha heterodimer formában. Néhány esetben a receptorok egy oldható formája, amely formát többek között leírták az interleukin–6 és a CNTF receptoraira, lehetõvé teszi a
45
50
55
60 10
9. példa: Nem adherens sejtek alapítása Õssejtek egymást követõ passzálása során egy közvetlenül a bakteriológiai csészébe történõ nagy sûrûségû ojtással néhány passzálás után olyan embrionális sejteket kaphatunk, amelyek a szubsztrátumuktól elválnak, és szuszpenzióban szaporodnak szabályos kis aggregátumok formájában. Ezt a szaporodást elõsegítjük több passzáláson egyszerû hígítással mechanikai disszociációval és proteolitikus enzim nem alkalmazásával. A tenyészetek keverését általában elvégezzük, de ez nem jelent egy megkülönböztetõ elemet nem adherens sejtek elõállításához. Az adherens sejtekhez hasonlóan ezeknek a sejteknek is õssejtre jellemzõ morfológiájuk van, vagyis méretük kicsi, jelentõs a nukleocitoplazma arányuk, és legalább egy jól látható nukleollal rendelkezõ maguk és nagyon gyenge citoplazmájuk van. Ezekre a sejtekre jellemzõ, hogy többékevésbé kompakt kis aggregátumokban növekednek. Ezeknek a nem adherens sejteknek keresztezett reaktivitásuk van bizonyos számú antitestekkel, amint az korábban már említettük, lásd Pain és munkatársai, 1996. Ezeknek a sejteknek ugyancsak pozitív az endogén telomerázaktivitásuk (amint azt a 10. példában bemutatjuk az EB1, EB4 és EB5 sejtekre). Nem adherens fázisban a sejtek jelentõs szaporodást mutatnak különbözõ közegekben. Az ojtás kezdeti sûrûsége, valamint a szabályos idõközökben történõ friss közeg adagolása nagy sûrûségeket biztosít, ez elérheti a milliliterenkénti 1×106 sejtet, sõt ennél nagyobb értéket is. Az 5. táblázatban összefoglaljuk néhány izolátum fõ jellemzõit (szülõsejtek, szuszpenzióba vitelnél kezdeti passzálás, a szuszpenzióban tenyésztésben tartási napok
1
HU 004 683 T2
száma, passzálások száma és a fenntartás önkéntes leállítása elõtt kapott generációk száma). Megjegyezhetjük, hogy a passzálás a szuszpenzióba vitelhez
2
egyik izolátumról a másikra változhat (lásd EB1 és EB14 izolátumot), ugyanígy függ a szaporodás sebessége (lásd RB3 és EB14 izolátumot.
5. táblázat Név
Szülõi sejtek
Kezdeti passzálás
Kezdés
Napok száma
Passzálások száma
Generációk száma
EB1
S86N 16
p111
20–01–2001
184
41
120
EB3
S86N 16
p118
23–01–2001
381
17
40
EB4
S86N 45
p100
25–09–2001
44
17
40
EB5
S86N 45
p100
25–09–2001
44
17
40
EB14
S86N 45
p81
5–09–2002
70
24
65
Megjegyezzük, hogy a „Kezdet” a sejtek nem adherenciába vitelének felel meg.
10. példa: Alapított sejtek jellemzése A hosszú ideig tenyészetben tartott õssejteket ugyanolyan kritériumok szerint jellemezzük, mint amelyeket már korábban ismertettünk (Pain és munkatársai, 1996). Így rendszeresen detektálhatjuk az endogén foszfatáz lúgos aktivitást, amelyet az 5. ábrán lévõ fénykép illusztrál, az endogén telomerázaktivitást és a bizonyos specifikus antitestekkel mutatott reaktivitást, mint amilyenek az SSEA–1 (TEC–01) és az EMA–1 antitestek. A sejtek alapításakor az egyik fontos kritérium a telomeráz jelenléte. A sejtek tenyészetben tartása során különbözõ teszteket végeztünk a TRAP (Telomerase PCR Elisa, Roche) detektálási kit segítségével. A sejteket pozitívnak detektáltuk különbözõ tenyészetben végzett passzálás után. Így a telomerázaktivitás detektálható az S86N 16 sejtekre, az S86N 45 sejtekre, valamint az EB1, EB4 és EB5 sejtekre, amelyek ezekbõl származnak nem adherens formában (lásd a 6. táblázatot). A primer tenyészetben tartott CEF-eket (Chicken Embryonic Fibroblasts) negatívnak tekintjük. A D.O. <0,2 küszöböt ajánlja a kit a negatív küszöbnek. Valamennyi analízist 2000 sejtekvivalensen végeztük. 6. táblázat Telomerázaktivitás meghatározása különbözõ sejtvonalakban különbözõ passzálásoknál Sejt
S86N 16
Passzálás
Telomeráz D.O.
p12
1,7
p29
2,8
p185
0,97
p204
0,95
S86N 16 EB1
p134
1,1
S86N 45
p50
0,87
p58
1,1
p66
0,96
p94
1,2
p112
1,4
S86N 45 EB 4
Sejt
20
S86N 45 EB5 CEF*
25
30
35
40
45
50
Passzálás
Telomeráz D.O.
p112
0,94
p4
0,07
11. példa: Sejtek transzfektálása és indukciója A hosszú ideig növekedésben tartott õssejteket különbözõ expressziós plazmidokkal transzfektáljuk. Kimutatták, hogy a madárõssejtek transzfektálhatók (Pain és munkatársai, 1999). Különösen a nem adherens sejteket transzfektáljuk, és különbözõ tri rendszerekkel lehetséges stabilan transzfektálni a sejteket (tri sejtes, határhígítás stb.). Ezeket a genetikai módosításokat az õssejt nem differenciálódott stádiumában végezhetjük. Ezen módosítás után a sejtet azután hagyjuk spontán módon differenciálódni, vagy a differenciálódás induktor hozzáadásával történik. Ebben az esetben használhatjuk a retinsavat 10–8 M–10–6 M közötti koncentrációban, vagy a dimetil-szulfoxidot 1¹2% végsõ koncentrációban, vagy a nátrium-butirátot 10–4–10–8 M koncentrációban, vagy a forbol-észtert (TPA, PMA stb.), vagy a lipopoliszacharidokat (LPS) 1–5 mg/ml végsõ koncentrációban. Egy másik példában a sejtek alkothatnak embrióid testeket szuszpenzióban, amelyeket mûanyagra lehet tapasztani az ezeket alkotó sejtek disszociációja után vagy anélkül. Ezek a differenciálódott sejtek ekkor szaporodnak, de hosszú idõt tekintve korlátozottabb a szaporodási képességük. Ha egy olyan génen, amely a sejtek szaporodását befolyásolja, genetikai módosítást végzünk, akkor a differenciálódott sejteket képesnek tudjuk tenni hosszú ideig tartó szaporodásra.
12. példa: Sejtek infektálása (fertõzése) Az adherens és nem adherens sejtek fertõzhetõk különbözõ vírusokkal és retrovírusokkal, többek között 55 a madárvírusokkal és retrovírusokkal. Ezek a sejtek replikációs hordozóként is szolgálhatnak víruskészletek gyártásához, amelyek élõ, gyengített vagy inaktivált humán és állatgyógyászati vakcinák gyártásához valók. A figyelemre méltó vírusok közül megemlíthetjük 60 az adenovírus családot (mint amilyenek a Humán Ade11
1
HU 004 683 T2
novirus C, Fowl Adenovirus A, Ovine adenovirus D, Turkey Adenovirus B), a cirkovírusokat (például a Chicken Anemia Virus, CAV), bizonyos koronavírusokat, mint amilyen a madár fertõzõ bronchitis vírus (IBV), a flavivírust (például a Yellow fever vírus és hepatitis C vírus), a hepadnavírusokat (mint amilyen Hepatitis B vírus és a Avihepadna vírust, például a kacsa hepatitis B vírus); a herpeszvírust (például a Gallid herpeszvírus, a HSV (Herpes simplex vírus) és a Humán herpeszvírus 1, 3 és 5), az ortomixovírust (például az influenza vírust: Influenzavírus A, Influenzavírus B és Influenzavírus C), a papovavírust (például a poliomavírust és különösen a Simian vírus 40), a paramixovírust (például a kanyaró¹, a mumpsz¹, a rubeolavírust, és például a respirovírus és pneumovírust, mint amilyen a Humán respiratory syncytial vírus és Metapneumovírust, mint amilyen a madár pneumovírus), a pikornavírust (például a poliovírust, hepatitisz A vírust és az Encephalomyocarditis vírust és Foot-and-mouth disease virust), a poxvírusokat, (például a fowlpoxvírus és az avipoxvírusokat, például a kanári pox¹, a Juncopox vírusokat, a Mynahpox vírust, a galamb poxvírust, a Psittacinepox vírust, az Quailpox vírust, a Sparrowpox vírust, a Starlingpox vírust, a Turkeypox vírust), a reovírusokat (például a rotavírusokat), a retrovírusokat (például az ALV¹t, a madár leukózis vírust, a Gammaretrovírusokat, például az egér leukémia vírus, a Lentivírusokat, például a humán immunhiány vírus 1 és 2) és a Togavírusokat, például a Rubivirust, különösen a Rubella vírust. 13. példa: egy nem adherens madársejtvonal (EB1) vírussal történõ fertõzésének protokollja Sejtterjesztés Az EB1 vagy EB14 sejteket egy közegbe ojtjuk, elõnyösen MacCoy’s 5A, HAMF12, DMEM közegbe vagy bármely olyan alkalmas közegbe, amely tartalmaz 5% szérumot 0,2×106 sejt/ml koncentrációban, általában 50 ml kezdeti térfogatra. A sejteket tenyészetben tartjuk 39 °C¹on 7,5% CO2-vel keverés mellett. 3¹4 napon keresztül minden nap friss közeget adagolunk, eddig tart a terjesztés, míg elérünk egy 1–3×106 sejt/ml sejtkoncentrációt 100–250 ml végsõ tenyésztõközeg térfogatra. A szuszpenzióban lévõ sejteket levesszük és 10 percig körülbelül 1000 ford./perccel centrifugáljuk. Az üledéket újraszuszpendáljuk 20–50 ml PBS 1X (foszfátpuffersóban). A sejteket ekkor megszámláljuk, centrifugáljuk, és az üledékben lévõ sejteket újra felvesszük szérum nélküli közegben 3–5,106 sejt/ml koncentrációban. Több kémcsövet készítünk ilyen körülményekkel, ezek 3–5×106 sejt per kémcsõ tartalmúak. Vírus elkészítése és fertõzés Ismert koncentrációjú víruskészletet gyorsan felolvasztunk 37 °C¹ra, és szérum nélküli közegben hígítjuk a végsõ fertõzéshez szükséges koncentráció 10¹szeresére–1000-szeresére. A sejteket a szóban forgó vírussal fertõzzük, a vírus típusától függõen 0,01–0,5 m.o.i.¹vel (multiplicity of infection), ami azt jelenti, hogy 0,1 és 10%
2
(térfogat/térfogat) közötti vírus szuszpenziót adagolunk a sejt üledékhez. 1 órán keresztül a vírus számára optimális hõmérsékleten, általában 33–37 °C¹on inkubáljuk, majd a sejteket ismét centrifugáljuk, és a közeget óvato5 san elvesszük. Ez a lépés gyakran szükséges ahhoz, hogy a kezdeti vírus hatását a késõbbi folyamatban korlátozzuk. Az egyik lehetõség, hogy a sejteket közvetlenül hígítjuk újabb centrifugálás nélkül a közeggel, amely szérumot tartalmaz (5% szérum) 0,2–1,106 sejt/ml vég10 sõ koncentrációra, majd ismét inkubáljuk.
15
20
25
30
A felülúszó és a sejtek kinyerése A vírus kinetikája és bizonyos vírusok esetleges citopatikus hatása függvényében 2–4 napig történõ inkubálás után a sejteket vagy a sejttöredékeket tartalmazó közeget kigyûjtjük. A vírustól függõen lehetséges, hogy a vírusrészecskéket csak az üledék vagy csak a felülúszó tartalmazza. A sejteket kinyerjük és centrifugáljuk. A felülúszót összegyûjtjük és ismét centrifugáljuk 5–10 percen keresztül 2500 ford./perccel, és a részecskék tisztítása elõtt –80 °C¹on tároljuk. Aliquot mennyiséget kiveszünk a titrálás elvégzéséhez. A sejt üledéket 5 ml szérum nélküli közeggel felvesszük, ultrahanggal kezeljük és 5–10 percig 2500 ford./perccel centrifugáljuk. A kapott felülúszót –80 °C¹on tároljuk tisztításig, és egy aliquot mennyiség titrálásáig. Összehasonlítjuk a különbözõ kísérleti körülmények között kapott fertõzési és vírustermelési hatékonyságot. A citopatikus hatású vírusok esetén a titrálást általában lizálásos technikával végezzük.
14. példa: Adherens madársejtvonal (S86N 45) vírussal történõ fertõzésének protokollja Sejtek elõállítása 35 A sejteket fertõzés elõtt 48 órával ojtjuk T150¹es flakonokban 0,03 és 0,06×106 sejt/cm2 közötti koncentrációval egy közegbe, a közeg elõnyösen MacCoy’s 5A, HAMF12, DMEM vagy bármely más alkalmas kö40 zeg, amely 5% szérumot tartalmaz. A sejteket 39 °C¹on és 7,5%¹os CO2-vel tartjuk.
45
50
55
60 12
Fertõzés Ismert titerû vírus készletet gyorsan felolvasztunk 37 °C¹ra, és a szérum nélküli közeggel hígítjuk a végsõ fertõzéshez szükséges koncentráció 10¹szeresére–1000-szeresére. A sejteket megfertõzzük a szóban forgó vírussal, a vírus típusától függõen 0,01–0,5 m.o.i.¹vel (multiplicity of infection), ami azt jelenti, hogy a sejt üledékhez 0,1 és 10% közötti (térfogat/térfogat) vírusszuszpenziót adagolunk. A fertõzést általában minimális közegben (5–10 ml egy 75 cm2¹es flakonhoz) 0% szérumot tartalmazó közegben végezzük. A vírus számára optimális hõmérsékleten, általában 33–37 °C¹on, 1 órán keresztül végzett inkubálás után a flakonokba 20 ml 5%¹os közeget adagolunk. Különös esetben a sejteket moshatjuk is PBS-sel az olyan részecskék eltávolítása céljából, amelyek nem kapcsolódtak esetleg a sejtekhez. Citopatikus vírus esetén a
1
HU 004 683 T2
sejteket a fertõzés után naponta megfigyeljük, hogy kövessük a sejt lízis sáv megjelenését, ami a fertõzés megfelelõ lefolyásának a jelzése.
Levétel (fertõzés után, óra)
Felülúszó
2
50 óra
5,56
74 óra
5,8
97 óra
6,29
A felülúszó és a sejtek kinyerése 5 (Log PFU/ml) A vírus kinetikájától és bizonyos vírusok esetleges ciÖsszesen 5,78 5,94 6,31 topatikus hatásától függõen 2–4 napon keresztül végzett (Log PFU/ml) inkubálás után a felülúszót, a sejteket és a sejt töredékePFU/sejt 2,2 3,2 7,2 ket tartalmazó közeget kinyerjük. A vírustól függõen lehet csak az üledék vagy csak a felülúszó érdekes, és 10 Referenciák tartalmazhatja ez a vírusrészecskéket. A sejteket kinyerBaba T. W., Humphries EH. (1985). Formation jük és centrifugáljuk. Az összegyûjtött felülúszót ismét of a transformed follicle is necessary but not centrifugáljuk 5–10 percig 2500 ford./perccel, majd a résufficient for development of an avian leukosis virusszecskék tisztítása elõtt –80 °C¹on tároljuk. Aliquot mennyiséget kiveszünk a titrálás elvégzéséhez. A sejt 15 induced lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:213–216. üledéket 5 ml szérum nélküli közegben felvesszük, ultraBeug H., von Kirchbach A., Doderlein G., Conscienhanggal kezeljük és 5–10 percig 2500 ford./perccel centce J. F., Graf T. (1979). Chicken hematopoietic cells rifugáljuk. A kapott felülúszót –80 °C¹on tároljuk a tisztítransformed by seven strains of defective avian leuketásig és egy aliquot mennyiség titrálásáig. A különbözõ körülmények között kapott fertõzés és 20 mia viruses display three distinct phenotypes of differentiation. Cell 18:375–390. vírustermelés-hatékonyságot összehasonlítjuk. Guilhot C., Benchaibi M., Flechon J. E., Samarut J. A citopatikus hatású vírusoknál a titrálást általában (1993). The 12S adenoviral E1A protein immortalizes a lízissávok technikával végezzük. avian cells and interacts with the avian RB product. On15. példa: Rekombináns avipox replikációia az 25 cogene 8:619–624. Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa EB1 sejtvonal nem adherens madárõssejtjein T. (1987). Establishment and characterization of a chicA 138¹as passzálásnál az EB1 nem adherens õsken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Cancer sejteket terjesztjük, majd fertõzzük egy hasznos proRes 1987 47:4460–4464. teint termelõ rekombináns avipoxszal 0,1 m.o.i.¹vel. Kim H., You S., Farris J., Foster L. K., Foster D. N. Fertõzés után a sejteket spinnerben tartjuk 4 napon 30 (2001). Post-transcriptional inactivation of p53 in imkeresztül, eddig tart a fertõzés. Aliquot mennyiséget kimortalized chicken embryo fibroblast cells. Oncogene veszünk a második naptól kezdve, majd a két követke20:3306–3310. Kim H., You S. zõ napon, hogy követni tudjuk a vírustartalmat mind a Kim I. J., Foster L. K., Farris J., Ambady S., Ponce felülúszóban, mind az intracelluláris tartalomban, a sejttartalom lízise után. A titrálást a lízissávok techniká- 35 de Leon F. A., Foster D. N. (2001). Alterations in p53 and E2F–1 function common to immortalized chicjával végezzük. ken embryo fibroblasts. Oncogene 20:2671–2682. A 7. táblázatban adjuk meg a kapott eredményeket. Liu J. L., Klein P. A., Moscovici M. G., Moscovici C. Az eredményekbõl nyilvánvaló, hogy a rekombináns (1992). Monoclonal antibodies recognizing normál and avipox nagyon kielégítõen replikálódik az EB 1 õssejteken. Így a fertõzési titer növekszik a tenyészet teljes 40 retrovirus-transformed chicken hematopoietic cells. Virology 189:583–591. idõtartama és a fertõzés lefolyása alatt, végül 4 napig Moscovici C., Moscovici M. G., Jimenez H., tartó inkubálás után maximális 7,2 PFU/sejt értéket ér Lai M. M., Hayman M. J., Vogt P. K. (1977). el (PFU=Plating Forming Unit). Ez a titer legalábbis ekContinuous tissue culture cell lines derived from chevivalens azzal, amit ugyanezzel a rekombináns avipoxszal csirke embrionális primer sejtjein kapunk. 45 mically induced tumors of Japanese quail. Cell 11:95–103. Ez a titer még javítható sajátos tenyésztési körülPain B., Clark M. E., Shen M., Nakazawa H., Sakuményekkel és optimalizáló eljárásokkal. rai M., Samarut J., Etches R. J. (1996). Longterm in vitUgyancsak megjegyezzük, hogy ezeket a legalábbro culture and characterisation of avian embryonic is ekvivalens fertõzési titereket megkapjuk nagyobb léptékben is 3 literes bioreaktorokban. 50 stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development 122:2339–2348. 7. táblázat Pain B., Chenevier P., Samarut J. (1999). Chicken Rekombináns avipox titrálásának kinetikája nem embryonic stem cells and transgenic strategies. Cells adherens EB1 õssejteken Tissues Organs 165:212–219. Samarut J., Gazzolo L. (1982). Target cells infected 55 by avian erythroblastosis virus differentiate and becoLevétel (fertõzés 50 óra 74 óra 97 óra után, óra) me transformed. Cell 28:921–929. Smith J. R. and Pereira-Smith O. M. (1996). RepliSejt frakció 6,40 6,37 5,99 cative senescence: implications for in vivo aging and (Log PFU/ml) 60 tumor suppression. Science 273, 63–67. 13
1
HU 004 683 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás madársejtvonalak elõállítására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi lépéseket: a) madár embrió õssejteket olyan közegben tenyésztünk, amely tartalmaz: – legalább az SCF, IGF–1 és bFGF növekedési faktorokat és legalább egy citokint a következõk közül választva: LIF, IL–11, IL–6, IL–6R, CNTF, onkosztatin és kardiotrofin; – egy STO-sejt inaktivált tápréteget és – borjú magzati szérumot 12–8% koncentrációban, b) mintegy 20 passzálás után a tenyésztõközeget módosítjuk: – az említett növekedési faktor és a citokin fokozatos leválasztásával; vagy – a tápréteg fokozatos leválasztásával; vagy – úgy, hogy a borjú magzati szérum koncentrációját csökkentjük egészen alacsony, 2%¹os koncentráció eléréséig, c) adherens vagy nem adherens sejtvonalakat alapítunk, amelyek képesek egy alapközegben szaporodni exogén növekedési faktorok és citokin, szérum és/vagy inaktivált tápréteg nélkül, ahol a nem adherens sejtvonalak alapítását úgy érjük el, hogy legalább 1×106 sejt/ml-lel bakteriológiai csészében beojtást végzünk, majd ezt követõen több passzálást végzünk egyszerû hígításban. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejtek képesek legalább 50 napon, elõnyösen legalább 600 napon keresztül szaporodni. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott sejteket szelekciónak vetjük alá nagy léptékben történõ termeléshez használt tenyésztõközegekben, így olyan klónokat kapunk, amelyek alkalmasak humán vagy állati terápiában használatos vakcina termelésére. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejtek madárõssejtek. 5. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejtek embrionális madárõssejtek. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés végén tartalmaz egy olyan lépést, amelyben az adherens õssejtek szaporodása történik inaktivált tápréteg jelenléte nélkül. 7. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés végén tartalmaz egy olyan lépést, amelyben a c) lépésben szuszpenzióban kapott sejtvonalakból származó nem adherens õssejtek szaporodnak. 8. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés végén tartalmaz egy olyan lépést, amelyben a c) lépésben szuszpenzióban kapott sejtvonalakból származó nem adherens õssejtek szaporodnak exogén növekedési faktoroktól és citokintól mentes közegben.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejtek 2% arányú magzati szérumos közegben szaporodnak. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejtek rendelkeznek legalább egy alábbi jellemzõvel: – jól látható nukleollal és nagyon gyenge nukleoplazmával, – endogén alkalikus foszfatáz aktivitással, endogén telomerázaktivitással, – az SSEA–1 (TEC01), SSEA–3 és EMA–1 antitestekbõl választott specifikus antitestekkel való reakcióképességgel. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben alkalmazott sejteket úgy állítjuk elõ, hogy megtermékenyített tojás blasztoderma lemezébõl származó sejteket szuszpendálunk olyan tenyésztõközegben, amely tartalmaz legalább egy citokint, b¹FGF¹et és SCF¹et, ahol a sejteket inkubált, majd levett tápsejtekbõl álló rétegre ojtjuk. 12. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépés az a) lépés közegéhez adagolt mindegyik növekedési faktor fokozatos levételébõl áll, tartalmaz egy passzálást egy olyan új közegben, amely mentes legalább az említett faktorok egyikétõl, majd a különbözõ egymást követõ passzálásokat addig ismételjük, amíg a közeg mentes lesz valamennyi említett faktortól. 13. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés végén tartalmaz egy olyan lépést, amelyben a c) lépésben alapközegben kapott vonalakból származó sejtek szaporodnak, ahol az alapközeget a DMEM, GMEM, HamF12 és McCoy közül választjuk, amely közeg ki van egészítve különbözõ adalékokkal, például nem esszenciális aminosavakkal, vitaminokkal és nátrium-piruváttal. 14. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejteket genetikailag módosítjuk úgy, hogy ezek hasznos anyagot, például hasznos polipeptidet, antitestet vagy gyengített vírust termeljenek. 15. Az 1–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kapott vonalakból származó sejteket genetikailag módosítjuk úgy, hogy azok támogassák élõ vagy gyengített vírusok replikációját, különösen a következõk közül választott vírusokét: adenovírusok, hepadnavírusok, herpeszvírusok, ortomixovírusok, papovavírusok, paramixovírusok, pikornavírusok, poxvírusok, reovírusok és retrovírusok. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteken replikált vírusok az ortomixovírusok családjába tartoznak, különösen a vírus az influenzavírus. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a replikált vírusok a paramixovírusok családjába tartoznak, különösen a vírusok a kanyaró¹, a mumpsz- és a rubeolavírusok.
1
HU 004 683 T2
18. Egy 1–17. igénypontok szerinti eljárással kapott sejtvonalak vagy ezen sejtvonalakból származó sejtek alkalmazása hasznos anyagok, különösen gyógyhatású hasznos fehérjék, antitestek termelésére. 19. Egy 1–17. igénypontok szerinti eljárással kapott sejtvonalak vagy ezen sejtvonalakból származó sejtek alkalmazása élõ vagy gyengített vírus replikációjára, különösen az alábbi csoportba tartozó vírusokéra: adenovírusok, cirkovírusok, koronavírusok, flavivírusok, hepadnavírusok, herpeszvírusok, ortomixovírusok, papovavírusok, paramixovírusok, pikornavírusok, poxvírusok, különösen Avipoxvírusok, így Fowlpox vírus, Juncopox vírus, Mynahpox vírus, galambpox vírus, kanáripox vírus, Psittacinepox vírus, Quailpox vírus,
2
Sparrowpox vírus, Starlingpox vírus és Turkeypox vírus, reovírusok, retrovírusok és togavírusok replikációjára. 20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás az ortomi5 xovírusok családjába tartozó vírusok termelésére, ahol a vírus különösen az influenzavírus, így az influenza A, influenza B és influenza C vírus. 21. A 19. igénypont szerinti alkalmazás a paramixovírusok családjába tartozó vírusok termelésére, ahol a 10 vírus különösen a kanyaró¹, a mumpsz¹, a rubeolavírus, a respirovírus és pneumovírus. 22. A 19–21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás élõ, gyengített vagy inaktivált humán vagy állatgyógyászati vakcinák termelésére.
15
HU 004 683 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
16
HU 004 683 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
17
HU 004 683 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
18
HU 004 683 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
19
HU 004 683 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
