!HU000004116T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 116
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA G01N 33/68
(21) Magyar ügyszám: E 03 735383 (22) A bejelentés napja: 2003. 05. 14. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030735383 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1508047 A2 2003. 12. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1508047 B1 2008. 08. 06.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20021025139 2002. 05. 29.
(73) Jogosult: Immatics Biotechnologies GmbH, Tübingen (DE)
DE
(72) Feltalálók: Weinschenk, Toni, Esslingen (DE); Rammensee, Hans Georg, Tübingen-Unterjessingen (DE) (54)
(2006.01) A61K 38/00 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) C07K 7/06 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) G01N 33/574 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03100432 PCT/EP 03/005038
(74) Képviselõ: DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás immunreaktív peptidek azonosítására
(57) Kivonat
HU 004 116 T2
A találmány tárgya eljárás immunreaktív peptidek azonosítására. Az eljárás szerint elõször mintát nyernek tumoros és a megfelelõ egészséges szövetbõl, ezt követõen meghatározásra kerül a tumorspecifikus exp-
ressziós profil, és a mintákból antigén peptidek izolálása és elemzése történik. A kapott adatok összehasonlítása alapján peptidek kerülnek azonosításra.
A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 116 T2
A bejelentés immunreaktív peptidek elõállítására és az így azonosított/elõállított peptidek termelésére szolgáló eljárást foglal magában. Az ilyen peptideket például daganatos betegségek immunterápiájában alkalmazzák. Abban, ahogy a tumorsejteket az immunrendszer megsemmisíti, kiemelkedõ szerepe van annak, hogy az úgynevezett tumorkapcsolt antigéneket (tumor associated antigens, TAA) az immunrendszer bizonyos komponensei felismerik. A folyamat azon alapszik, hogy a daganatos és normális sejtek között minõségi vagy mennyiségi eltérések állnak fent. A tumorellenválasz elõidézéséhez a daganatsejteknek olyan antigéneket kell expresszálniuk, melyek a tumor felszámolásához elegendõ mértékû immunológiai választ váltanak ki. A daganatok kilökõdésében mindenekelõtt a CD8¹at expresszáló citotoxikus T¹limfociták (a továbbiakban CTL) vesznek részt. A citotoxikus T¹sejtek ilyen válaszának kiváltásához a sejtek számára idegen fehérjéket, illetve peptideket kell prezentálni. A T¹sejtek a peptidtöredékeket csak akkor ismerik fel antigénként, ha azokat MHC-molekulák mutatják be sejtek külsõ felszínén. Az MHC (major histocompatibility complex) molekulák peptidreceptorok, melyek normálesetben a sejten belül kötnek meg peptideket, és azokat a sejtfelszínre szállítják. Ezt a peptid-MHC komplexet képesek a T¹sejtek felismerni. Az emberi MHC-molekulákat humán leukocitaantigéneknek (HLA) is nevezik. Az olyan daganatellenes immunterápia, mely antigénspecifikus és a T¹sejteken alapul, a múltban már sikeresnek bizonyult. A daganat ellen irányuló specifikus CTL-válasz kiváltása az olyan MHC 1 osztályú ligandok azonosításán alapszik, melyek a daganathoz társult (TAA) antigénekbõl származnak. Ilyen TAA antigének kizárólag rosszindulatú sejtekben lehetnek jelen, például mutálódott gének termékeként. A tumorkapcsolt antigének további fontos osztályai a szövetspecifikus struktúrák, mint például a CT (cancer testis, hererák) antigének, egy harmadik osztályt pedig a tumor által hiperexpresszált fehérjék képviselnek. A tumorvakcina kiindulópontjául szolgáló TAA¹k azonosításának és jellemzésének módszerei egyrészt a betegben már indukálódott CTL-ekre és antitestekre alapulnak. Ezt az immunológiai megközelítést vagy a génkifejezõdési profillal, vagy az azonosított peptidek tömegspektrometriás szekvenálásával kombinálják (lásd van der Bruggen et al, 1991, A gene encoding an antigén recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma, Science 254:1643–1647; valamint Cox et al, 1994, Identification of a peptide recognized by five melanomaspecific human cytotoxic T cell lines, Science 264:716–719). A TAA¹k daganatos és normális szövet transzkripciós profiljának összehasonlításán alapuló azonosítási módszerei közé tartozik például a hibridizálás és a DNS-csipek alkalmazása. Celis és munkatársai (Celis et al. 1994; Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105–2109) olyan mód-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
szert alkalmaztak, ami egy kiválasztott TAA-ból származó MHC 1 osztályú ligandok elõrejelzését használja ki, és amelyben ezután ezeket a ligandokat mint T¹sejtepitópokat azonosítják. Az ilyen, a betegbõl származó T¹sejtekre alapozó eljárásoknak hátránya, hogy a tenyésztés drága, illetve bonyolult, és hogy csak a már létezõ T¹sejtek alkalmazhatók. Ismert továbbá egy másik, a T¹sejtektõl független megközelítés, ahol az epitópok elõrejelzését az elõre jelzett peptideknek komplex peptidelegyekben való keresésével kombinálják, a peptideket pedig nagy érzékenységû kapilláris folyadékkromatográfiával és tömegspektrometriával (LC¹MS) azonosítják (lásd Schirle et al., 2000, Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T¹cell independent approach, Eur. J. Immunol. 30:2216–2225). A DNS-microarray technika egy újabb megközelítést kínál, a daganat és a megfelelõ saját normális szövet expressziós profiljának összehasonlítását. Young és munkatársai (Young et al. 2001; Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers, Am J. Pathol. 158:1639–1651) például kimutatták, hogy ezzel a módszerrel egyetlen tumorból nagyszámú tumorkapcsolt antigén azonosítható. A túlexpresszált vagy szelektíven kifejezõdõ fehérjékbõl származó MHC 1 ligandok ezáltal a specifikus CTL-felismerés lehetséges célpontjait jelentik. Egérben modellezve kimutatták (Mathiassen et al., 2001, Tumor-associated antigens identified by mRNA expression profiling induce protective anti-tumor immunity, Eur. J. Immuno. 31:1239–1246), hogy az expressziós elemzés és epitóp-elõrejelzés kombinálásával lehetséges hatékony vakcinát elõállítani. Ennek az epitóp-elõrejelzésnek megvan azonban az a hátránya, hogy már csupán néhány célgénhez is rengeteg lehetséges peptidet határozhatnak meg, melyek többségét valójában az MHC-molekulák egyáltalán nem mutatják be, és így ezek CTL-választ sem indukálnak. Jelen találmánynak tehát az a célja, hogy egy új in vitro eljárást bocsásson rendelkezésre, mellyel az immunreaktív peptidek egyszerûen és célzottan azonosíthatók. Ezt a célt a találmány egy MHC-ligandok azonosítására szolgáló in vitro eljárással éri el, mely a következõ lépéseket tartalmazza: a) Minta nyerése a daganatos és a megfelelõ egészséges szövetbõl. b) A tumorspecifikus expressziós profil meghatározása a levett mintákból. c) Az MHC-ligandok izolálása és azonosítása a tumorszövetbõl vett mintában. d) A b) és c) lépésben nyert adatok egyeztetése. e) Az MHC-ligandok azonosítása az egyeztetett adatok alapján. A feltalálók felismerték, hogy az expressziós analízist a daganat peptidantigénjeinek izolálásával és elemzésével kombinálva specifikus jelöltek azonosíthatók egy egyedi vakcina céljára.
1
HU 004 116 T2
Az antigéntulajdonságú peptidek elkülönítése és a tumorszövet génexpressziós profiljával való összevetés által elkerülhetõ, hogy túlzottan sok, potenciálisan immunreaktív peptidet nyerjenek ki. Ehelyett célzottan olyan peptideket azonosítanak, melyeket ténylegesen prezentálnak az MHC-molekulák, és így immunreaktív peptidekként szerepelhetnek. A találmány szerinti eljárással tehát lehetséges betegenként egyedi peptideket azonosítani, így a (például vakcinaként alkalmazandó) peptideket pontosan a beteghez igazítani, és célzott immunválaszt elõidézni. Ezt az eljárás, a betegminták beérkezését követõen, szisztematikus és hatékony módon (például nagylaborokban) végezhetõ, melyek az alkalmas immunreaktív peptidek azonosítását követõen azok szekvenciáit a kezelést végzõ klinikákhoz továbbítják, ahol végül a peptideket szintetizálják és alkalmazzák. De az is lehetséges, hogy egyazon laborban történjen a beteg számára megfelelõ peptidek azonosítása és elõállítása. Az új eljárás tehát mind szolgáltatás keretein belül, mind az azonosított immunreaktív peptidek szállításával egybekötve alkalmazható. A c) lépésben izolált peptidek MHC-ligandok. Sejtes immunválaszt csak MHC-molekulához kötött peptidek válthatnak ki. Egy tumorban hiperexpresszálódó génbõl eredõ peptidek például, ha nem kötõdnek MHC-molekulához, nem váltanak ki CTL-választ – ezért nem minden, például pusztán epitóp-elõrejelzéssel kiválasztott peptid immunreaktív. Egy további lehetséges megvalósításban a c) lépést microarray analízis és/vagy reverz transzkripció és PCR segítségével végzik el. A microarray analízisnél DNS¹, illetve géncsipek használatával hasonlítják össze a daganatszövet és a megfelelõ normális szövet expressziós profilját, és azonosítják a szelektíven vagy túlzott mértékben kifejezõdõ géneket. Ez az eljárás a technika jelen állása szerint jól ismert, és többen leírták, például Schena et al., 1995, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science 270:467–470. A reverz transzkripció és PCR (RT-PCR) alkalmas egy gén kifejezõdésének mennyiségi leírására. E célból a – például tumorsejtbõl származó – RNSrõl cDNS készül, melyet a következõ lépésben templátként használnak a PCR során. A megsokszorozott DNS alapján meghatározható, hogy melyik gén milyen mértékben íródott át. Egy ismét másik lehetséges megvalósításban a c) lépésben az elemzést tömegspektrométerrel végzik. Ezzel az eljárással az egyes peptidek pontosan, hatékonyan és nagy hatásfokkal azonosíthatók. A tömegspektrometria alkalmazását a tumorszövetbõl származó peptidek azonosításában például Schirle és munkatársai írták le (Schirle et al., 2000, Identification of tumorassociated MHC class I ligands by a novel T¹cell independent approach, Eur. J. Immunol. 30:2216–2225). Egy további lehetõség szerint a c) lépésben megfelelõ adatbank alkalmazásával az expressziós profil
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
alapján elõre jeleznek bizonyos peptideket, és a tömegspektrométert ezekre a megjósolt antigénekre kalibrálják. Az adatbankok alkalmazását a lehetséges antigének elõrejelzésére, illetve az így kapott adatok alkalmazását, például Schirle és munkatársai (in Schirle et al., 2001, Combining Computer algorithms with experimental approaches permits rapid and accurate identification of T¹cell epitopes from defined antigens, J. Immunol. Methods, 257:1–16.) írták le. Mindezekrõl további adatok az interneten, például http://www.syfpeithi.de vagy http://www.paproc.de cím alatt találhatóak. További lehetõség, hogy a c) lépést követõen egy újabb lépésben megállapítsák a perifériás fehérvérsejtek, mindenekelõtt T¹sejtek reakciókészségét az izolált antigénhatású peptidekkel szemben. Egy újabb lehetõség szerint a perifériás fehérvérsejtek reakciókészségét az izolált antigénhatású peptidekkel szemben az általuk szintetizált gamma-interferon- vagy citokin-mRNS mérésével határozzák meg. A gamma-interferon- vagy citokin-mRNS kimutatásával lehetséges a fehérvérsejteknek, mindenekelõtt T¹limfocitáknak az antigénpeptidekkel szembeni reaktivitását pontosan igazolni, mivel a megfelelõ antigénpeptidekkel történt aktiváció után az aktivált T¹sejtek ezt a két anyagot termelik. Ez a járulékos lépés lehetõvé teszi a szóba jöhetõ peptidek még célzottabb kiválasztását a már azonosított peptidek közül. Az eljárás egy további lehetséges megvalósításában a c) lépés után egy beiktatott lépésben a specifikus T¹limfociták meglétét mutatják ki. Ezen az úton specifikusan meghatározható, mennyire és milyen mértékben vannak jelen már a beteg szervezetében az izolált, illetve azonosított peptidek elleni T¹limfociták. Ez a lépés lehetõvé teszi, hogy csak azokat a peptideket alkalmazzuk vakcinaként, amelyek elleni T¹sejtek a betegben megvannak. A peptideket pedig ezen specifikus T¹sejtek aktiválására lehet felhasználni. Egy további lehetséges eljárásban a specifikus T¹limfociták létezésének bizonyítását a sejteknek antigénprezentáló molekulákból és antigénpeptidbõl rekonstruált komplexekkel való jelzésével végzik. Ebben az eljárásban az úgynevezett tetramertechnikát alkalmazzák. Az ilyen rekonstruált komplexek (tetramerek) készítése és alkalmazása megtalálható például az Altman et al., 1996, Phenotypic analysis of antigen-specific T¹lympnocytes, Science 274:94–96. címû közleményben. Leírásra kerülnek továbbá a találmány szerinti eljárással azonosítható, illetve elõállítható immunreaktív peptidek. Azonosítást követõen ezek a peptidek az egyes betegek számára célzottan és specifikusan állíthatók elõ. Leírásra kerül továbbá egy olyan gyógyszerkészítmény, mely egy vagy több – a találmányban leírt eljárással azonosított, illetve elkészített – peptidet tartalmaz. A készítmény beadható parenterálisan, például szubkután, intrakután vagy intramuszkuláris injektálással, vagy szájon át is. Ekkor a peptideket egy gyógy-
1
HU 004 116 T2
szertanilag megfelelõ, lehetõleg vizes vivõanyagban oldják fel, illetve szuszpendálják. A készítmény ezenfelül segédanyagokat, például puffert, töltõ¹, illetve kötõanyagot tartalmazhat. A peptidek immunstimuláló anyagokkal, például citokinekkel együtt is beadhatók. Az ilyen jellegû készítményekben használható segédanyagok teljes körû leírása megtalálható A. Kibbe: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press címû könyvében. A peptid használható daganatos betegségek kezelésére, illetõleg daganatos betegségek kezelésére szolgáló szer elõállítására is. A kezelhetõ daganatos betegségek körébe tartozik a vese¹, emlõ¹, hasnyálmirigy¹, gyomor¹, here¹, illetve bõrrák. A fenti felsorolásban szereplõ daganatos betegségek csupán példák, ezeken kívül még számos alkalmazási területen is felhasználható az eljárás. A peptid segítségével továbbá a rákbetegség kezelésének hatékonysága is megítélhetõ. A peptid más immunizálások, illetve kezelések esetén is használható a terápia nyomon követésére. A peptid tehát nemcsak terápiásan, hanem diagnosztikusan is felhasználható. A peptidek továbbá ellenanyag elõállítására is alkalmazhatóak. A poliklonális antitestek a szokásos módon, állatoknak a peptid injektálásával történõ immunizálása és ezután az immunglobulinok tisztítása útján állíthatók elõ. Monoklonális antitestek standard eljárás szerint készíthetõk, a leírás megtalálható például: Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Leírásra kerülnek továbbá nukleinsavmolekulák, melyek a találmány szerinti eljárással izolált peptideket kódolják. A nukleinsavmolekulák lehetnek DNS- vagy RNS-molekulák, és esetlegesen maguk is használhatók daganatos betegségek immunterápiájában. A nukleinsavmolekula vektorban is rendelkezésre állhat. Leírásra kerül továbbá egy sejt, melyet a nukleinsavmolekula segítségével oly módon változtathatunk meg, hogy az egy azonosított peptidet termeljen. Leírásra kerül továbbá egy immunreaktív peptid elõállítására szolgáló eljárás, ahol a leírt eljárás szerint egy peptidet azonosítanak, és az azonosított peptidet kémiailag szintetizálják in vitro vagy in vivõ. Peptidek elõállíthatók aminosavak kémiai összekapcsolásával, például a szakterületen ismert Merrifield-eljárással (lásd Merifield LB, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149–2154). In vitro a peptidek például sejtmentes rendszerekben állíthatók elõ, in vivo pedig sejtek alkalmazásával. Leírásra kerül továbbá egy oltóanyag-elõállítási eljárás, mely az alábbi lépésekbõl áll: a) A fent leírt eljárás megvalósítása. b) Az azonosított immunreaktív peptid elõállítása. c) Az elõállított immunreaktív peptid kémiai szerkezetének felderítése. A találmány megvalósításának példáit az alábbiakban az ábrák és a példaeset segítségével mutatjuk be, illetve magyarázzuk el.
5
2
Az 1. ábra kiválasztott gének kvantitatív RT¹PCR segítségével történõ expressziós elemzését mutatja. A 2. ábra keratin 18¹specifikus CD8+ T¹limfociták kimutatását ábrázolja. Példa
Betegminták A Tübingeni Egyetem urológiai osztályáról két, szövettanilag igazolt vesesejttumorban szenvedõ beteg mintáit kaptuk meg. Egyik beteg sem kapott preoperatív kezelést. Az 1. beteg (a továbbiakban RCC01) HLAtípusa: HLA–A*02 A*68 B*18 B*44; a 2. betegé 15 (RCC13) HLA–A*02 A*24 B*07 B*40. 10
Az MHC 1 osztályhoz kötõdõ peptidek izolálása A gyorsfagyasztott mintákat a már leírt (Schirle, M. et al., Identification of tumor-associated MHC class I li20 gands by a novel T cell-independent approach, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216–2225.) módon dolgozzuk fel. A peptideket standard eljárás szerint izoláltuk, méghozzá a HLA 1. osztályú molekulákra specifikus W6/32, vagy a HLA–A2¹re specifikus 25 BB7.2 monoklonális antitest segítségével. Ezen antitestek elõállítását és alkalmazását Barnstable, C. J. et al., Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis, 1978, Cell, 30 14:9–20., illetve Parham, P. & Brodsky, F. M., Partial purification and some properties of BB7.2. A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA–A2 and a variant of HLA–A28, 1981, Hum. Immunol, 3:277–299., írták le. 35 Tömegspektrometria Az RCC01 beteg tumorszövetébõl kinyert peptideket reverz fázisú HPCL-vel választottuk szét (SMARTSystem, mRPC C2/C18 SC 2.1/19, Amersham Pharma40 cia Biotech), és a kapott frakciókat nanoESI MS¹sel elemeztük, a Schirle (Schirle, M. et al., Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T cell-independent approach, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216–2225.) által már leírt eljárást követve. Az RCC13 betegbõl nyert peptideket az említett 45 módon kapilláris-LC¹MS segítségével azonosítottuk, az alábbi csekély módosításokkal: A mintákból mindig 100 ml¹t töltöttünk be, sótalanítottuk, és egy 300 mm×5 mm méretû C18 mikroelõoszlopon (LC Pac50 kings) elõtöményítettük. Az oldószert és a mintát fecskendõpumpával (PHD 2000, Harvard Apparatus, Inc.), egy tömített 100 ml¹es fecskendõvel (1710 RNR, Hamilton), 2 ml/min sebességgel adagoltuk be. A peptidek szétválasztásához az elõtöményítõ oszlopot egy 55 75 mm×250 mm¹es C–18 oszlop elé (LC Packings) iktattuk be. Biner gradiensben futtattunk, 70 percen belül 25–60% B¹t elérve, az átfolyást 12 ml/min értékrõl kb. 300 nl/min¹re csökkentve, mégpedig egy TEE-csatlakozó (ZT1C, Valco) és egy 300 mm×150 mm méretû 60 C–18 oszlop alkalmazásával. 4
1
HU 004 116 T2
Hogy biztosan tudjuk, a rendszerben nincs peptidmaradvány, mindig lemértünk egy üres mintát is. Az on line fragmentációt a leírt módon végeztük, a töredékek spektrumát kézi módszerrel elemeztük. Az adatbankban (NCBInr, EST) MASCOT segítségével kerestük ki a szükséges adatokat (http://www.matrixscience.com). Az RNS kinyerése A normál és malignus veseszövetbõl származó fragmentumokat aliquotáltuk, gyorsfagyasztottuk, és folyékony nitrogén alatt, mozsár és forgóhomogenizátor (Heidolph Instrumente) segítségével TRIZOL-ban (Life Technologies) homogenizáltuk. A teljes RNS¹t megtisztítottuk a gyártó által adott protokoll szerint, majd tovább tisztítottuk RNeasy (QIAGN) alkalmazásával. Az emberi szövetbõl eredõ össz-RNS¹t a Clontechnél szereztük be (Human total RNA Master Panel II). Nagy sûrûségû oligonukleotid microarray analízis A Superscript RT II (Life technologies) reverz transzkriptáz alkalmazásával az össz-RNS 40 mg-jából kétszálas DNS¹t állítottunk elõ. Az ehhez használt primerek (Eurogentec) az Affymetrix protokollja szerint lettek kiválasztva. Az in vitro transzkripciót a BioArray™ High Yield™ RNA Transcript Labeling Kit (ENZO Diagnostics, Inc.) alkalmazásával végeztük, ezt fragmentálás, majd az Affymetrix (HuGeneFL) géncsipen való hibridizálás követte. Sztreptavidin-fikoeritrinnel és biotinált antisztreptavidin antitesttel festettünk, a gyártó (Affymetrix) protokollja szerint. Az adatokat Affymetrix GeneArray Scannerrel, Microarray Analysis Software 4.0 alkalmazásával elemeztük.
5
10
15
20
25
30
35 Valós idejû PCR A microarray-hoz készített cDNS¹t alkalmaztuk a kvantitatív PCR-hez is. Minden gént két párhuzamosban futtattunk (40 ciklus, 95 °C×15 mp, 60 °C×1 perc), az ABI PRISM 7700 szekvenciadetektáló rendszert (Applied Biosystems) alkalmazva SYBRGreennel együtt. A mintákat egymástól függetlenül 2, illetve 3 alkalommal elemeztük. A primereket (MWG-Biotech) egy intron mindkét végéhez választottuk ki; a PCR hatásfokát minden primerpárra megvizsgáltuk, az eredmény mindig 1 körüli érték volt. A PCR-termékek tisztaságát 3%¹os agarózgélen vizsgáltuk. Szekvenciájukat a pCR4-TOPO-Vektorban, a TOPO TA klónozókészlet (Invitrogen) alkalmazásával történt klónozás után igazoltuk. Az adatelemzésbe beletartozott a relatív kvantifikálás delta CT-eljárása. Laser Capture Microdissection A beágyazott gyorsfagyasztott szövetmintákból 6 mm vastagságú metszeteket készítettünk, és kb. 15 percre 70%¹os etanolba helyeztük. A tárgylemezeket 90 mp¹re Mayer-féle hematoxilinben (Merck) inkubáltuk, vízzel lemostuk, majd 1 percre 70%¹os, újabb 1 percre 95%¹os alkoholba, 30 mp¹re 1% alkoholos eozinba (Sigma), 2×2 percre 95%¹os etanolba, végül
40
45
50
55
60 5
2
2×5 percre xilolba helyeztük. 15 perces, levegõn történõ szárítás után a tárgylemezeket száraz körülmények között tároltuk. A normális tubuláris epitélsejteket, illetve ráksejteket „laser capture microdissection” (LCM) módszerrel, a PixCell II LCM (Arcturus Engineering) rendszer alkalmazásával izoláltuk. Az össz-RNS¹t 400 ml TRIZOL¹ba vontuk ki. PBMC, tetramerek elõállítása, áramlási citometria Két egészséges, de szerológiailag CMV-pozitívnak talált véradótól (HD1, HD2) perifériás vérbõl származó mononukleáris sejteket (PBMC) különítettünk el gradienscentrifugálással (FicoLite H), és lefagyasztottuk. A HLA–A*0201 tetramer komplexeket Altman (Altman et al., 1996, Phenotypic analysis of antigenspecific T¹lympnocytes, Science 274:94–96) módszerével állítottuk elõ az alábbi módon: A rekonstitúcióhoz alkalmazott HLA–A2¹t kötõ peptidek a keratin 18¹ból származó ALLNIKVKL, és a pp65 HCMVA-ból származó NLVPMVATV voltak. A tetramerek elõállításához a biotinált monomereket Streptavidin-PE-vel vagy Streptavidin-APC-vel elegyítettük, és 2–3×106 sejtet inkubáltunk mindkét tetramerrel, 30 percig 4 °C¹on az alábbi közegben: 10 mg/ml mindkét monomerbõl PBS-ben, 0,01% NaN3, 2 mM EDTA, 50% fetal calf serum. Ezután 20 percre hozzáadtuk a Anti-CD4-FITC (Coulter-Immunotech) és Anti-CD8-PerCP (Becton Dickinson) monoklonális antitesteket. Háromszoros mosást követõen a mintákat FACS-pufferben és 1% formaldehidben fixáltuk. A négyszínelemzést FACS¹Caliburcytometer (Becton Dickinson) segítségével végeztük el. Eredmények Kb. 7000 gén expresszióját elemeztük két vesesejttumor tumoros és neki megfelelõ normális szövet sejtjeiben. Megállapítottuk, hogy a tumorszövet 400–50 gént túlzott mértékben vagy szelektíven expresszál. 70 gén mindkét beteg daganatában hiperexpresszálódott. Az 1. betegben 268 hiperexpreszált és 129 exkluzívan expresszált gént találtunk. A legtöbb hiperexpresszált gén daganatkapcsolt, azaz vagy onkogén, vagy tumorszuppreszor gén, vagy olyan, aminek túlzott kifejezõdését rákban már leírták, mint a CCND1, CA9, cerebrozid-szulfotranszferáz, és a paratireoidaszerû hormon. A tumorkapcsolt „adipose differentiation-related” protein (ADFP), más néven adipofilin adta a második legerõsebb hiperexpressziót. Errõl a fehérjérõl azt is kimutattuk, hogy más szervek normális szöveteihez képest is túltermelõdik, nem csak az egészséges veseszövethez képest. A microarray analízisben kapott adatok igazolására néhány kiválasztott gén kifejezõdését kvantitatív PCRrel is elemeztük. Az 1. ábrán látható a kiválasztott gének RT¹PCR¹es expressziós elemzése. Az RT¹PCT¹t ugyanazzal a cDNS-sel végeztük, amit a géncsipnél is alkalmaztunk. A másolatszámot a 18S rRNS-hez viszonyítva adtuk meg, mindkét beteg saját normális szövetére (=1) normalizálva. A fekete oszlopok az RCC01 beteg tumorszövetében, a fehér oszlopok az egészséges szövetben, a sávozott szürke oszlopok az
1
HU 004 116 T2
RCC13 beteg tumorszövetében kapott másolatszámot mutatják. Kiderült, hogy az adipofilin (ADFP) és cyclin D1 (CCND1) microarray segítségével kimutatott túltermelõdése a kvantitatív PCR által igazolható. Ugyancsak bizonyítani tudtuk, hogy az est¹1 (EST1) az egészséges és rákos szövetben ugyanolyan mértékben fejezõdik ki. Továbbá a két technikával kapott relatív kifejezõdési szintek nagyjából összehasonlíthatók voltak. Az adipofilin az RCC01 betegben a microarray analízis szerint 29,1-szeres, a kvantitatív PCR szerint 18,1-szeres mértékben hiperexpresszálódott (1. ábra). Az RCC13 betegnél a microarray analízis 11,4-szeres, a kvantitatív PCR 6,7-szeres értéket adott (1. ábra). A galektin 2 (LGALS2) az RCC01 betegben volt fejezõdött ki a normálisnál nagyobb mértékben, a keratin¹18 (KRT18) az RCC13-ban. A microarray analízissel, illetve kvantitatív PCR-rel kapott kifejezõdési adatok egyezése alól kivétel volt a KIAA0367 és a met-protoonkogén (MET) az RCC13 betegnél. Az MHC 1 osztályú ligandok azonosítása A tumorszövetekbõl összesen 85 olyan ligandot lehetett kinyerni, amelyek a HLA–A*02, HLA–A*68, HLA–B*18 vagy HLA–B*44 jelû HLA altípusokhoz kötõdtek. A HLA–A*02-höz kötõdõ peptidek az allélspecifikus (leucin, valin, izoleucin, alanin, metionin a 2¹es pozícióban, leucin, valin, izoleucin vagy alanin C¹terminálisan) peptidmintázatot mutattak. A legtöbb ligand úgynevezett housekeeping fehérjékbõl származott, de találtunk igazoltan a daganathoz társuló fehérjébõl származókat is, például YVDPVITSI a met-protoonkogénbõl, ALLNIKVKL a keratin-18-ból, vagy SVASTITGV az adipofilinbõl. A HLA–A*68 ligandjait a 2¹es pozícióban álló treonin, izoleucin, valin és alanin, illetve C¹terminális arginin vagy lizin horgonyaminosavak alapján azonosítottuk. A HLA–A*68 ligandjai között találtunk az adipofilinbõl származó további két peptidet, a MTSALPIIQK¹t és a MAGDIYSVFR¹t. A 2¹es helyen glutaminsavat tartalmazó ligandokat a HLA–B*44-hez soroltuk. A HLA–B*18 peptidmintázata egyelõre nem ismert, ezért e két HLA–B molekulához nem tudtunk ligandokat hozzárendelni. A microarray adatok és az izolált peptidek összevetésébõl kiderült, hogy az MHC-ligandok tíz túlkifejezõdõ gén termékei, ezek az adipofilin, a KIAA0367, a SEC14-szerû 1, a B¹sejt transzlokációs gén 1, az aldoláz A, a cyclin D1, az annexin A4, a katenin alfa 1, a galektin 2 és az LMP2. A felsorolt gének közül három már szerepel a SEREX adatbankban, ezek a KIAA0367, az aldoláz A és a katenin alfa 1. Az RCC13 betegben egy különösen érdekes ligandot (ALAAVVTEV) találtunk, mely olyan kereteltolódással kódolódik, ami a DEAD/H¹Box polipeptid 3 (DDX3) szekvenciájához képest csak egy nukleotiddal tér el. Az ALAAVVTEV¹t a DDX3 kódoló szálján a 317–343. nukleotid, míg a GIGSRGDRS aminosavszekvenciát ugyanezen DDX3¹as fehérjében a 316–342. nukleotidsor kódolja.
5
10
15
20
25
30
2
Specifikus T¹sejtek igazolása a normál CD8+ T¹sejt készleten belül Hat vesetumoros betegbõl származó PBMC sejteket vizsgáltunk négy kiválasztott releváns peptiddel szembeni reakcióra. A peptidek adipofilin, a keratin¹18, a KIAA0367 és a met-protoonkogén eredetû HLAA*02-höz kötõdõ peptidek voltak. Ehhez igen érzékeny kvantitatív RT¹PCR¹t alkalmaztunk, hogy 7 napos in vitro szenzibilizálást követõen a CD8+ T¹sejtek gammainterferon-mRNS-termelését ki tudjuk mutatni. Metprotoonkogén, adipofilin és keratin¹18 eredetû peptiddel stimulálva sporadikusan észleltünk válaszreakciót. A daganatos betegekbõl és egészségesekbõl vett PBMC¹k HLA–A0201 tetramerrel történõ festését adipofilinnel, keratin-18-cal agy met-protoonkogénnel összeállított tetramerrel végeztük. A 2. ábra a keratin-18¹ra specifikus T¹limfociták kimutatását ábrázolja. Ehhez négy egészséges HLA–A*02+-adótól (HD 1, 2, 4, 6) vett PBMC-ket egyszerre festettünk meg HLA–A2/keratin 18¹PE tetramerrel, HLA–A2/CMV-APC tetramerrel, CD8-PerCP-vel és CD4-FITC-vel. A pontgrafikon 1–3 független kísérlet eredményét ábrázolja 1×106 PBMC¹re. A pontgrafikonon a CD8+ CD4– populáción belül a tetramerpozitív sejtek százalékarányát mutatja. 22 egészséges egyén közül 4¹ben a CD8+ T¹limfociták közül meglepõen nagy populáció volt keratin18¹ra specifikus (a CD8+ T¹sejtek 0,02–0,2%¹a). Ezt a populáció nem festõdött CMV-tetramerrel, ennek értelmében a keratin¹18 tetramer kötõdése specifikus volt. Összefoglalva elmondható, hogy az emberi T¹sejtrepertoárban megtalálhatók a keratin¹18 peptidre specifikus CD8+ T¹sejtek.
35 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
40
45
50
55
60 6
1. In vitro eljárás MHC-ligandok azonosítására, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: a) minta nyerése tumoros és a megfelelõ egészséges szövetbõl, b) tumorspecifikus expressziós profil meghatározása a mintából, c) MHC-ligandok izolálása és elemzése a tumorszövetbõl vett mintából, d) a b) és c) lépésben nyert adatok egyeztetése, és e) MHC-ligandok azonosítása az egyeztetett adatok alapján. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, amelyben a b) lépés elvégzése microarray analízissel és/vagy reverz transzkripciós polimeráz-láncreakcióval történik. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, amelyben a c) lépésben az elemzés tömegspektrométerrel történik. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, amelyben a c) lépésben, alkalmas adatbank segítségével, az expressziós profil alapján potenciális antigénpeptidek elõrejelzése történik, és amelyben a tömegspektrométer ezekre lesz kalibrálva.
1
HU 004 116 T2
5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a c) lépés után, egy újabb lépésben, a perifériás fehérvérsejteknek, elõnyösen T¹limfocitáknak az izolált antigénpeptidekkel szembeni reaktivitása kerül megvizsgálásra. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, amelyben a reaktivitás meghatározása a fehérvérsejtek által termelt citokin-mRNS és/vagy gamma-interferon-mRNS mérése által történik.
5
7
2
7. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a c) lépést követõen egy további lépés kerül végrehajtásra a specifikus T¹limfociták létezésének igazolására. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, amelyben a specifikus T¹limfociták kimutatása fehérvérsejteknek antigénbemutató molekulákból és antigénpeptidekbõl képzett komplexekkel való megjelölése útján történik.
HU 004 116 T2 Int. Cl.: G01N 33/68
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
