!HU000005087T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 087
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C08B 37/10
(21) Magyar ügyszám: E 05 769509 (22) A bejelentés napja: 2005. 07. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050769509 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1773890 A1 2006. 02. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1773890 B1 2008. 11. 05.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: MO20040199 2004. 07. 29.
(73) Jogosult: Biofer S.p.A., 41036 Medolla (IT)
IT
(72) Feltalálók: SACCHI, Stefania, I-41012 Carpi (Modena) (IT); MONTORSI, Mauro, I-41100 Modena (IT); MARCHI, Egidio, I-40033 Casalecchio di Reno (Bologna) (IT) (54)
(2006.01) A61K 31/727 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06011179 PCT/IT 05/000448
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás kis molekolatömegû heparin elõállítására
(57) Kivonat
HU 005 087 T2
Az elõállítási eljárás tartalmazza heparin depolimerizációját nitrozilálással, amely kis molekulatömegû heparint ad, amelynek az N¹nitróz-amin-tartalma a Farmacopea Europea IV. kiadása által megszabott határértékek alatt van. A találmány tárgya továbbá eljárás tisztított kis molekulatömegû heparin elõállítására. Részletezve, az eljárást nitrozilálással elõállított kis molekulatömegû heparinra alkalmazzák, amely eljá-
rásban a nitrózus csoportok eltávolítása kis molekulatömegû heparint tartalmazó vizes oldat melegítésével történik 3,0–13,0 pH¹értéken, 40 °C–90 °C hõmérsékleten, 15 perc–180 perc ideig, vagy kis molekulatömegû heparint tartalmazó vizes oldat mikrohullámú sugárzással történõ kezelésével 900–2450 MHz frekvencián, 600–1000 watt teljesítménnyel, 30 másodperc–300 másodperc ideig.
A leírás terjedelme 6 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 087 T2
Mûszaki terület A heparin és a származékai a tromboembolikus események megelõzése és kezelése során a leggyakrabban alkalmazott termékek között találhatóak. Ez a hatóanyag, a heparin, nagyon fontos hatással bír a koagulációra és emiatt trombotikus események megelõzésére alkalmazzák sebészeti operációt követõen és a tüdõembóliák vagy a mélyvénás trombózis kezelése során. A heparin antikoagulációs hatása annyira nyilvánvaló, hogy az ezen gyógyszerrel végzett kezelés során szükséges a hemokoagulációs folyamatok folytonos ellenõrzése, ami a páciens kórházi kezeléséhez vezet, vagy legalábbis napi kórházi járóbeteg kezeléshez vezet.
5
10
15 Háttérismeretek A heparin molekulatömegének csökkentése frakcionálással [L. O. Andersson és munkatársai, Throm. Res. 9: 575 (1976)] vagy depolimerizációval olyan hatóanyagokat eredményezett, amelyeknek kisebb az antikoagulációs hatása, de még mindig jó a maradék antitrombotikus aktivitásuk. Például az EP 0014184, EP 0040144, EP 0076279 és EP 0121067 számú európai szabadalmak különbözõ heparindepolimerizációs eljárásokat ismertetnek és különbözõ típusú kis molekulatömegû heparint kapnak, amelyet jellemzõen az LMWH rövidítéssel jelölnek. Az ilyen típusú LMWH¹k különbözõ molekulatömeget és kémiai szerkezetet mutatnak, ami különbözõ módon módosítva van, különösen a terminális csoportjaikban, és különbözõ farmakológiai aktivitásuk is van. Részletezve, a molekulatömeg csökkentése a depolimerizált terméknek összességében kisebb antikoagulációs aktivitást ad (APTT- „Activated Parttal Plastin Time”, aktivált részleges plasztinidõ) a kezdeti heparinhoz képest, miközben az Axa-aktivitás (anti-Xa-aktivitás) fennmarad jó szinteken, csakúgy, mint a termék antitrombotikus aktivitása [F. A. Ofosu és munkatársai „Mechanism of action of low molecular weight heparins and heparinoids” Ballicre’s Clin. Haematol. 3: 505–529 (1990)]. A US 4,804,652 és US 4,351,938 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak mindegyike ismertet eljárásokat az említett LMWH elõállítására és antikoagulánsként és antotrombotikumként történõ alkalmazását. A molekulatömeg csökkentése a farmakodinamikára is pozitív hatással van, mivel a hatóanyag tovább marad a vérkeringésben, nagyobb hematikus szintekkel, mint a nem frakcionált heparin [L. Bara és munkatársai, „Increased anti Xa bioavailability for a low molecular weight heparin compared with unfractionated heparin! Semin. Thromb. Hemost., 11: 316–317 (1985)]. AZ LMWH fent ismertetett jellemzõi a terület szakértõit olyan elõállítási eljárásainak a kutatásaihoz vezették, amelyek során különösen változó heparindepolimerizációs eljárásokat alkalmaztak. Olyan eljárások lettek alkalmazva, amelyek kihasználják a radikális hidrolizálási reakciókat (oxigénezett víz- és rézkatalizátor, vagy persavak) oxidációs hidrolízisreakció perjodáttal vagy enzimatikus hidrolízis heparinázzal, vagy b¹elimi-
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
nációs reakciók a heparin-észter lúgos hidrolízisével, vagy nátrium-nitrites kezelés savas környezetben. Az utolsónak említett eljárás, amelyet az EP 0014184 és EP 0076279 számú európai szabadalmak ismertetnek és igényelnek olyan LMWH¹t adnak, amelynél szükséges további frakcionálás és tisztítás. A nátrium-nitrit alkalmazása a depolimerizált heparinnak olyan molekulatömeget ad, amely többé-kevésbé kicsi az alkalmazott nátrium-nitrit mennyiségétõl függõen, de sok óvatosságot és figyelmet igényel, mert a végtermék nem tartalmazhat néhány milliomodrésznél (ppm) több nitritiont és kevesebb mint 0,25 ppm N¹nitrozo- (N–NO) csoportot. Amennyiben egyrészrõl a végtermék nátrium-nitrittartalma [J. C. Lormeau és munkatársai, US 5,019,649 amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1991)] és a meghatározása nem okoz problémát, másrészrõl mind az N–NO csoport-tartalom mind a mennyiségi meghatározás végrehajtása nehéz. Mivel elvileg nem kellene másodlagos aminoknak jelen lenniük a heparin szerkezetében, ezért az egyetlen olyan funkcióscsoport, amely képes megfelelõen stabilis N¹nitrozo-származékokat létrehozni, az N¹acetil-glükózamin-csoportok. Egy érvényes hipotézis szerint az N¹nitrozo-csoportok, amelyek néhány ppm mennyiségben megjelennek a depolimerizációs termékben a tisztítás elõtt, a heparinban jelen lévõ N¹actetil-glükózamin nitrozilációjából származik. A nitrozilációból származó N–NO csoportok nagyon stabilisak, ezért esszenciális olyan depolimerizációs eljárás alkalmazása, amely olyan N¹nitrozo-amin-koncentrációt eredményez, amely az elõírt határ alatt van vagy alternatív megvalósítási mód esetén el kell távolítani a jelen lévõ összes N–NO csoportot annak érdekében, hogy a Farmacopea Europea IV. kiadása által elõírt korlátok ki legyenek elégítve. Jól ismert, hogy az N–NO csoportok különösen érzékenyek a nagy energiájú sugárzásoknak, mint amilyen az ibolyántúli sugárzás és a g¹sugárzás, és az, hogy a terméknek (nitrozilációval depolimerizált heparin) a kezelése oldatban vagy akár szilárd állapotban ezekkel a sugárzásokkal a termékben lévõ nitritek és N–NO maradékok teljes eltûnéséhez vezethetnek. Az UV sugárzást széleskörûen alkalmazzák sterilitás fenntartására steril vízben vagy ivóvízben a nitrózus származékok mennyiségének a csökkentésére. J. F. Branellec és munkatársai US 5,599,801 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmában ismertetnek eljárást és készüléket nitrózus csoportok eltávolítására kis molekulatömegû heparinok csoportjaiból, amelyek nitrozilációs eljárás alkalmazásával lettek elõállítva. Ezen eljárás korlátja az UV sugárzás kicsi penetrációs ereje, mind az oldatok, mind a szilárd anyagok esetében: ennek a ténynek hatása van a tisztításra alkalmazott készülékre és tisztítási idõkre. A sugárkezelésnek kitett termék stabilitása a legnagyobb probléma g¹sugárzás esetén. Ezért szükség van olyan eljárásra, amely csökkenti a nitritek és/vagy N–NO csoportok mennyiségét az
1
HU 005 087 T2
LMWH-ban, amely eljárás hatásos, gazdaságosabb a korábban ismert eljárásokhoz képest és nagyon hatékony. Jelen találmány fõ céljainak egyike olyan depolimerizációs eljárás megvalósítása, amely olyan LMWH elõállítását teszi lehetõvé, amelynek a maradék N–NOszintje 0,25 ppm alatt van. Jelen találmány céljainak egyike olyan depolimerizációs eljárás, amely 5 ppm alatti nitrittartalmú LMWH¹t ad. Jelen találmány egy további célja olyan nátrium-nitrit alkalmazásával elõállított depolimerizált heparint tisztító eljárás, amely képes a depolimerizált heparin tisztítására a maradék nitritek és N–NO csoportok mennyiségének csökkentésével. Ezek a célok és mellettük még több is elérésre került a jelen találmánnyal, ahogy ez láthatóvá válik majd a részletes leírásból, amely találmány kifejlesztett egy LMWH elõállítási eljárást és ugyanennek a tisztítási eljárását. A találmány tárgya továbbá eljárás LMWH elõállítására, amelynek a nitrit szintje és ezzel egyidejûleg az N–NO nitrozocsoport szintje a Farmacopea Europea IV. kiadása által szabott korlátokon belül van, amely eljárásnak a jellemzõit az 1–7. igénypontokban vázoltuk fel. A találmány további célja tisztítási eljárás, amely képes a nitrit és ezzel egyidejûleg az N–NO nitrozocsoportok csökkentésére, amelyek jelen lehetnek az LMWH-ban, olyan szintekre, amelyek a Farmacopea Europea IV. kötete által szabott korlátokon belül van, hõ vagy mikrohullámú kezeléssel. A Farmacopea Europea IV. kiadása hivatkozásként a jelen leírás részét képezi. Különösen az 1296. oldal, amely a heparinokkal foglalkozik általánosan; az 1297–1299. oldal, amely az LMWH-val foglalkozik; az 1610–1612. oldal, amely a Nadroparinnal foglalkozik (depolimerizált heparin, amely nitrozilációval lett elõállítva); a 999–1000. oldal, amely a Dalteparinnal foglalkozik (depolimerizált heparin, amely nitrozilációval lett elõállítva).
5
10
15
20
25
30
35
40 A találmány ismertetése A találmány szerinti eljárás a következõ módon valósul meg: a piacon található standard típusú heparin koncentrációjának alkalmazása, amely 1% és 25% között tartalmaz heparint (gramm heparin az oldat össztömegére vetítve); elõnyösen 5% és 20% között; és még specifikusabban elõnyösen 5% és 16% között. A piacon található heparin általában fagyasztva szárított nátriumsó-heparinicum natricum-Farmacopea Europea IV. kiadás 1296. oldal. A bejelentõ azt találta, hogy a heparindepolimerizáció nátrium-nitrit jelenlétében elvégezhetõ 60:1–45:1 heparin:nátrium-nitrit tömegaránnyal. Elõnyösen a bejelentõ azt találta, hogy a 60:1–45:1 heparin:nátrium-nitrit tömegarány olyan LMWH¹t hoz létre, amelynek a nitrittartalma kisebb, mint 5 ppm és ezzel egyidejûleg az N–NO csoport-tartalma kisebb, mint 0,25 ppm. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a heparin:nátrium-nitrit tömegarány 52:1–47:1.
45
50
55
60 3
2
A fent említett tömegarányok esetén a nátrium-nitritet önmagában tekintjük az alkalmazott só titerjétõl függetlenül; például analízis során a nátrium-nitrit tiszta, ha körülbelül 97% a nátrium-nitrit titerje. Az alkalmazásban a fagyasztva szárított formában lévõ nátrium-heparint feloldjuk, például 25 °C hõmérsékleten, egy edényben, amely melegítésre és rázatásra való eszközökkel van felszerelve. Elõnyösen a depolimerizációs eljárást 15 °C–30 °C hõmérsékleten, például 23 °C–27 °C, elõnyösen 25 °C hõmérsékleten végezzük. Az oldathoz nátrium-nitritet adunk, például 97%¹os nátrium-nitritet, és egy savanyítóanyagot, például sósavat, hogy az oldat pH¹értékét 2,0–4,0 pH¹értékre állítsuk. A nitrit eltûnését keményítõ/jód papírral követjük. Ezt követõen az oldat pH¹értékét 10–13 értékre állítjuk alkáli anyag hozzáadásával. Végül NaBH4-vegyületet adunk 0,5%–2,5% tömegmennyiségben, a heparin kiindulási tömegéhez viszonyítva. Ekkor az oldatot 20–30 °C hõmérsékleten, például 25 °C hõmérsékleten hagyjuk 10–30 óráig, például 20 óráig. A felesleges NaBH4-vegyületet savas anyag hozzáadásával távolítjuk el, amelynek a pH¹értéke 2–4, például pH=3. A fenti eljárást követve olyan depolimerizált terméket kapunk, amely megfelel a Farmacopea Europea IV. kiadásának kémiai-fizikai és biológiai elõírásainak a depolimerizált heparinra nitrózus savval, amelynek az N¹nitróz-amin-tartalma kisebb, mint 0,25 ppm és a végsõ mennyiség nem kevesebb mint 70% (gramm depolimerizált heparin a heparin kiindulási tömegére vetítve), például 75%–85% mennyiségben. A 45:1 aránynál kisebb heparin:nátrium-nitrit tömegarány esetén olyan terméket kapunk, amelynek az N¹nitróz-amin-tartalma a meghatározott korlátok felett van és a kívántnál kevesebb termék keletkezik. Ezt a terméket tovább kell tisztítani. A 60:1 aránynál nagyobb heparin:nátrium-nitrit tömegarány esetén nem kaptunk elfogadható mértékû depolimerizációt. A nitrozilációval elõállított depolimerizált heparin tisztítási eljárás, amely jelen találmány célja, elvégezhetõ melegítéssel vagy mikrohullámú kezeléssel. Azt találtuk, hogy mind a melegítés, mind a 900–2450 megaherzes (MHz) mikrohullámok képesek drasztikusan csökkenteni mind a nitritek, mind az N¹nitrozo-csoportok jelenlétét 3,0–13,0 pH¹értéken, elõnyösen 4,0–12,0 pH¹értéken, például 10–12 pH¹értéken. A melegítés és a mikrohullámok alkalmazhatóak külön-külön, habár az LMWH-tartalmú vizes oldatok mikrohullámú kezelés a vizes oldat felmelegedéséhez vezet és ezáltal szinergisztikus melegítési és mikrohullámú hatások vannak a nitrozilációval végzett depolimerizációból eredõ LMWH-ban jelen lévõ nitrózus csoportok eltávolítása során. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a tisztítási eljárást melegítéssel végezzük. Tisztítandó, 1%–20% (tömeg:tömeg) LMWH¹t (nitrozilációval elõállítva) tartalmazó vizes oldatot melegí-
1
HU 005 087 T2
tünk és rázatunk addig, míg 40 °C–90 °C hõmérsékletet nem ér el, 3,0–13,0 pH¹értéken, elõnyösen 4,0–12,0 pH¹értéken, 0,5–3 óra idõszakig. Ezt követõen az oldat pH¹értékét 11–13¹ra állítjuk, elõnyösen pH=12 értékre, 70 °C–90 °C hõmérsékletre, rázatással. Az oldatot ismert módon tisztítjuk membránultraszûréssel. Egy megvalósítási mód szerint a tisztítási eljárást mikrohullámokkal valósítjuk meg. A nitriteket és N¹nitózus-csoportokat tartalmazó LMWH tisztítása elvégezhetõ az 1%–20% LMWH¹t tartalmazó vizes oldat 7,0–13,0 pH¹értéken, elõnyösen 10,0–12,0 pH¹értéken, mikrohullámú sugárzással történõ kezelésével, 60–300 másodpercig tartó ideig, 900–2450 MHz frekvenciájú mikrohullámok alkalmazásával, 600–1000 watt
2
teljesítménnyel, inert szilikát jelenlétében, amely elõnyösen a montmorillonitosztályba tartozik, por alakú és 5%–15% mennyiségben van jelen az LMWH tömegére vetítve. Az inert szilikát jelenléte erõsítõ hatással van a 5 mikrohullámokra. Az oldatban lévõ LMWH¹t és az inert szilikátot tartalmazó szuszpenziót szobahõmérsékletre hûtjük, leszûrjük, hogy eltávolítsuk az inert anyagot, a pH¹értékét 6,5–7 értékre állítjuk, az oldatot ultraszûrjük, hogy 10 ezzel eltávolítsuk az oldatban jelen lévõ sókat és a hatóanyagot fagyasztva szárítjuk. Különösen tiszta LMWH¹t kaptunk, ahogy azt az 1. táblázat mutatja, 96% és 98% közötti mennyiségekkel, és gyakorlatilag nem változtak a farmakológiai aktivitá15 saik.
1. táblázat A tisztítási lépés elõtti és utáni minták vizsgálata Aktivitás
AIIa
Aktivitás
(IU)
Axa
–NO2
–NO2
N–NO
N–NO
(IU)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
elõtte
utána
elõtte
utána
elõtte
utána
elõtte
utána
1. minta (2. példa)
36,93
31,18
124,46
128,14
2,57
0,12
0,13
0,05
2. minta (3. példa)
36,93
38,57
124,46
118,35
2,57
n. é.*
0,13
0,07
3. minta (4. példa)
38,93
32,61
144,46
152,74
0,79
n. é.*
0,18
0,03
4. minta (5. példa)
39,23
33,18
107,33
100,11
0,38
n. é.*
0,21
0,08
5. minta (6. példa)
39,23
36,64
107,33
11,64
0,38
n. é.*
0,16
n. é.*
*n. é.: nem értékelhetõ
A biológiai paraméterek, például az anti-IIa-aktivitás (AIIa) és az anti-Xa-aktivitás (Axa), a kémiai paraméterek, például a nitrit és az N¹nitrozo-csoport-tartalom elemzését a Farmacopea Europea IV. kiadásában ismertetett módon végeztük el az LMWH¹ra (999., 1297. és 1610. oldal). Amint az az 1. táblázatban látható a találmány szerinti depolimerizációs eljárás lehetõvé teszi olyan LMWH elõállítását, amelyben a nitritek mennyisége kisebb vagy egyenlõ, mint 5 ppm (folyadékkromatográfiával meghatározva, Farmacopea Europea IV. kiadás 999. oldal) és a nitrozocsoportok mennyisége kisebb vagy egyenlõ, mint 0,25 ppm (az N–NO kötések hidrobrómsavval történõ feltörésével meghatározva, etil-acetátban, visszaáramoltatásos kondenzálókészülékben, az NO¹kibocsájtást kemiluminesszenciával mérve, Farmacopea Europea IV. kiadás 1611. oldal – EPS-oldatként is ismert). Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az EPS-oldatot a találmány szerinti tisztítási eljárásnak lehet alávetni azzal a céllal, hogy tisztított Dalteparint vagy Nadroparint kapjunk. Alternatív esetben egy további megvalósítási mód szerint az EPS-oldatot szeparálni lehet Dalteparinra vagy Nadroparin. Ezt követõen a szeparációval kapott Dalteparin és Nadroparin frakciók tisztítása történik, azzal a céllal, hogy tisztított Dalteparint vagy Nadroparint kapjunk.
Az itt alább ismertetett példákat a találmány további 35 jellemzésének tekintjük, és ezért szándékunk szerint nem korlátozzák a találmányt.
40
45
50
55
60 4
1. példa: Kis molekulatömegû heparin elõállítása depolimerizációval nátrium-nitrit alkalmazásával 100 g nátrium-heparint, amelynek az antikoagulációs aktivitása <160 IU/mg, oldunk fel 900 ml desztillált vízben 25 °C hõmérsékleten. 2,07 g NaNO2 (97%) vegyületet adunk hozzá az oldathoz, és ezután 5 N HCl¹ot adunk hozzá pH=2,5 értékig. A reakciót szabályozzuk, hogy detektáljuk a nitrit eltûnését keményítõjód-papír alkalmazásával. Az oldat pH¹értékét 10,5¹re állítjuk tömény NaOH-oldattal és NaBH4¹et adunk hozzá 1,5% mennyiségben a heparin kiindulási tömegére vetítve. Az oldatot 20 órát hagyjuk szobahõmérsékleten és ezután lesavanyítjuk 5 N HCl-dal, és a pH¹értéket 3,2¹re állítjuk annak érdekében, hogy lebontsuk a felesleges NaBH4¹et. Az oldatot ezt követõen semlegesítjük 5 N NaOH-dal, a pH¹értékét 6,8¹re állítva. A kapott oldatot ultraszûréssel tisztítjuk annak érdekében, hogy eltüntessük az olyan sókat és anyagokat, amelyeknek nagyon alacsony a molekulatömegük, a Farmacopea Europea IV. kiadás 999. és 1610. oldalán közölt specifikációknak megfelelõen.
1
HU 005 087 T2
Az oldatot ezt követõen fagyasztva szárítjuk, ezzel a kis molekulatömegû heparint nem kevesebb mint 70%-ban kapjuk a kiindulási heparintömegre vetítve. A kapott terméknek, további tisztítás nélkül, az N¹nitróz-amin-tartalma kisebb, mint a Farmacopea Europea IV. kiadása által meghatározott korlát (0,25 ppm), ahogy ezt a találmány leírásban említettük és az 1. táblázatban mutattuk. Habár a találmány szerinti depolimerizációs eljárással kapott termék a Farmacopea Europea IV. kiadása által megszabott korlátokon belül van a nitrit és az N¹nitróz-amin tekintetében, mégis egyidejûleg tisztítási eljárásnak vetjük alá annak érdekében, hogy igazoljuk ezen eljárás hatásosságát, ahogy azt a következõ példákban bemutatjuk. A tisztítási eljárás egy általános eljárás, amely alkalmazható a nitrozilációval végzett depolimerizációval elõállított LMWH tisztítására. 2. példa: Tisztítás melegítéssel 50 gramm LMWH¹t, amelyet az 1. példában ismertetett módon állítottunk elõ, oldottunk fel 1000 ml nitritmentes desztillált vízben, és a pH¹értékét 4,5¹re korrigáltuk 1 N HCl-dal, az oldatot ezt követõen 50 °C hõmérsékletre melegítettük 30 percre, rázatás. Az oldatot lehûtöttük és a pH¹értékét 12,0¹re állítottuk 5 N NaOHdal, melegítés 80 °C¹ra, rázatás, 30 percig. A pH¹értékét korrigáltuk 2 N HCl-dal 2 N egészen pH=6,7 értékre. Ezt követõen elimináltuk a nátrium-kloridot az oldatból ultraszûréssel, 600 dalton levágási tartományú membrán alkalmazásával és nitrit- és nitrátmentes kétszer desztillált vízzel. A tisztított heparint fagyasztva szárítottuk és 48,35 g kis molekulatömegû heparint kaptunk 96,7% végsõ mennyiségben. 3. példa: Tisztítás mikrohullámú sugárzással 70 gramm LMWH¹t, amelyet az 1. példában ismertetett módon állítottunk elõ, oldottunk fel 1400 ml nitrités nitrátmentes kétszer desztillált vízben, és a pH¹értékét 12¹re állítottuk 1 N NaOH-dal, 5 g montmorillonitport adtunk az oldathoz, amelyet ezt követõen 2450 MHz¹es mikrohullámú sugárzásnak tettünk ki 100 másodpercig 600 watt teljesítménnyel, és hagytuk 25 °C¹ra hûlni, a pH¹értékét 6,5¹re korrigáltuk HCl-dal. Az inert anyagot leszûrtük, az oldatot tisztítottuk és fagyasztva szárítottuk; 68,7% terméket kaptunk, amely 98,14% összmennyiséget adott. 4. példa: Tisztítás mikrohullámú sugárzással 65 gramm LMWH¹t, amelyet az 1. példában ismertetett módon állítottunk elõ, oldottunk fel 800 ml nitrités nitrátmentes kétszer desztillált vízben, 4 g montmorillonitport adtunk az oldathoz, amelynek a pH¹értékét 11¹re állítottuk 2 N NaOH-dal, ezt követõen 2450 MHz¹es mikrohullámú sugárzásnak tettük ki 100 másodpercig 600 watt teljesítménnyel. Az oldatot ezt követõen lehûtöttük és a pH¹értékét 6,5–7,0¹re állítottuk 1 N HCl-dal, az inert anyagot leszûrtük és az eredményül kapott oldatot 600 dalton levágási tartományú membránnal ultraszûrtük. Az ultraszûrt oldatot fa-
2
gyasztva szárítottuk, 63,3 gramm terméket kaptunk, azaz 97,38%¹ot. 5. példa: Tisztítás mikrohullámú sugárzással A 4. példa szerinti eljárást megismételtük 60 gramm LMWH alkalmazásával, amelyet az 1. példa szerint állítottunk elõ, feloldottuk 1000 ml vízben. 9 gramm montmorillonitport adtunk hozzá az oldathoz, amelynek a pH¹értékét 12¹re állítottuk 2 N NaOH-dal és 60 másod10 percig sugároztuk 2450 MHz¹es mikrohullámokkal, 600 watt teljesítménnyel. A pH¹értékét 2 N HCl-dal korrigáltuk, 7,1¹re. Az inert anyagot leszûrtük és az eredményül kapott oldatot ultraszûrést követõen fagyasztva szárítottuk, ezzel 59,1 gramm terméket kaptunk, azaz 15 98,5%¹ot. 5
6. példa: Tisztítás mikrohullámú sugárzással A 4. példa szerinti eljárást megismételtük 65 gramm LMWH alkalmazásával, amelyet az 1. példa szerint állí20 tottunk elõ, feloldottuk 1000 ml vízben. 8 gramm montmorillonitport adtunk hozzá az oldathoz, amelynek a pH¹értékét 10,5¹re állítottuk 2 N NaOH-dal és 60 másodpercig sugároztuk 2450 MHz¹es mikrohullámokkal, 600 Watt teljesítménnyel. Az oldatot 24 °C hõmérsék25 letre hûtöttük és a pH¹értékét korrigáltuk 2 N HCl-dal, 6,9¹re. Az inert anyagot leszûrtük és az eredményül kapott oldatot 600 dalton levágási tartományú membránnal ultraszûrtük és sótlanítottuk a fagyasztva szárítás elõtt. 64,1 gramm tisztított terméket kaptunk, azaz 30 98,6%¹ot. 7. példa: Kis molekulatömegû heparin elõállítása nátrium-nitrites depolimerizációval 20 gramm nátrium-heparint, amelynek az antikoa35 gulációs aktivitása <160 IU/mg volt, oldottunk fel 133 ml desztillált vízben 25 °C¹on. 0,427 g NaNO2¹ot, 97%, adtunk hozzá, valamint 5 N koncentrációjú sósavat, hogy 2,5 pH¹értéket érjünk el. A következõ reakció alatt keményítõ-jódos papírt alkalmaztunk a 40 nitrit eltûnésének a kontrollálására. Az oldat pH¹értékét ezt követõen 10,5¹re állítottuk nátrium-hidroxid tömény oldatával és 0,3 g NaBH4¹et adtunk hozzá, 1,5%-ban. Az oldatot szobahõmérsékleten hagytuk 20 órát, és 45 ezt követõen lesavanyítottuk, hogy a pH¹értékét 2,8¹re állítsuk, hogy ezzel eltûntessük a felesleges NaBH4¹et. A kapott oldatot ultraszûréssel tisztítottuk. 8. példa: Kis molekulatömegû heparin elõállítása nátrium-nitrites depolimerizációval 20 gramm nátrium-heparint, amelynek az antikoagulációs aktivitása <160 IU/mg volt, oldottunk fel 133 ml desztillált vízben 15 °C¹on. 0,412 g NaNO2¹ot, 97%, adtunk hozzá, valamint 5 N koncentrációjú só55 savat, hogy 2,5 pH¹értéket érjünk el. A következõ reakció alatt keményítõ-jódos papírt alkalmaztunk a nitrit eltûnésének a kontrollálására. Az oldat pH¹értékét ezt követõen 10,5¹re állítottuk nátrium-hidroxid tömény oldatával és 0,3 g NaBH4¹et adtunk hozzá, 60 1,5%-ban. 50
5
1
HU 005 087 T2
Az oldatot szobahõmérsékleten hagytuk 20 órát, és ezt követõen lesavanyítottuk, hogy a pH¹értékét 3,0¹re állítsuk, hogy ezzel eltûntessük a felesleges NaBH4¹et. A kapott oldatot ultraszûréssel tisztítottuk.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás depolimerizált tisztított heparin oldatának elõállítására, amely tartalmazza a következõ szakaszokat: i) kis molekulatömegû heparin (LMWH) elõállítása vizes oldatban heparin nátrium-nitrites depolimerizációjával, és ii) a vizes oldatban lévõ depolimerizált heparin kezelése 40 °C–90 °C hõmérsékleten, 0,5–3 óra ideig, 3,0–13,0 pH¹értéken, és ezután iii) az oldat pH¹értékének beállítása 11–13 értékre és a hõmérséklet beállítása 70 °C–90 °C¹ra. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az oldat pH¹értéke a ii) szakaszban 12¹re van állítva.
2
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol membránultraszûrés van alkalmazva a iii) szakaszban kapott oldatból az LMWH tisztítására. 4. Eljárás depolimerizált tisztított heparin elõállítá5 sára, amely tartalmazza a következõ szakaszokat: kis molekulatömegû heparin elõállítása vizes oldatban heparin nátrium-nitrites depolimerizációjával, és a vizes oldatban lévõ depolimerizált heparin kezelé10 se 900–2450 MHz frekvenciájú mikrohullámokkal és 600–1000 watt teljesítménnyel, 60–300 másodperc ideig. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol inert szilikát van a depolimerizált heparinhoz adva, elõnyösen a szi15 likátok montmorillonitosztályából származó szilikát. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol az inert szilikát 5–20 tömeg% mennyiségben van a heparinhoz adva a heparin tömegére vetítve. 7. A 4–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 20 ahol a depolimerizált heparin 1–25% koncentrációban van vizes oldatban, 6–13 pH¹értéken.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
