(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000006436T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 006 436

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 718586 P 2005. 09. 19.

(73) Jogosult: Pfizer Products Incorporated, Groton, CT 06340 (US)

US

(72) Feltalálók: SUN, Changquan, Calvin, Thousand Oaks, CA 91362 (US); HAWLEY, Michael, Ann Arbor, MI 48105 (US) (54)

HU 006 436 T2

C07D 403/06

(21) Magyar ügyszám: E 06 795470 (22) A bejelentés napja: 2006. 09. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060795470 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1928858 A1 2007. 03. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1928858 B1 2009. 07. 22.

(2006.01) A61K 31/404 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07034272 PCT/IB 06/002506

(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Pirrolszubsztituált 2-indolin szilárd só formái

A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 006 436 T2

A találmány területe A találmány tárgyát képezik 3¹pirrolszubsztituált 2¹indolinvegyület, 5¹[5¹fluor-2-oxo-1,2-dihidroindol(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-karbonsav(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amid szilárd só formái. Az említett vegyületek protein-kinázok („PK”¹k) aktivitását modulálják. A találmány szerinti vegyületek ezért abnormális PK¹aktivitással összefüggõ rendellenességek kezelésére alkalmasak. A találmány tárgyát képezik ilyen vegyületek sóit tartalmazó gyógyászati készítmények és eljárások elõállításukra. A találmány tárgyát képezik az amid foszfátsó formájának polimorfjai is. A találmány mûszaki területe A következõket csak háttér-információnak szánjuk, és nem tekintjük a találmány szerinti megoldás vonatkozásában a technika állásának. Szilárd anyagok, beleértve gyógyszereket, gyakran rendelkeznek egynél több kristályformával, és ez polimorfizmusként ismert. Polimorfizmus akkor fordul elõ, ha egy vegyület több olyan szilárd fázisban kristályosodik, amelyek kristálycsomagolásban különböznek. Számos példát idéznek gyógyszerek szilárd állapotának tulajdonságait ismertetõ, standard hivatkozásokban, Byrn, S. R., „Solid-State Chemistry of Drugs”, New York, Academic Press (1982); Kuhnert-Brandstatter, M., „Thermomicroscopy in The Analysis of Pharmaceuticals”, New York, Pergamon Press (1971) és Haleblian, J. K. és McCrone, W., „Pharmaceutical applications of polymorphism”, J. Pharm. Sci. 58, 911 (1969). Byrn azt állítja, hogy a polimorfok általában különbözõ fizikai jellemzõket mutatnak, például különbözõ oldhatóságot, és fizikai és kémiai stabilitást. A WO 2004/076410 számú nemzetközi közzétételi iratban leírják pirrolszubsztituált 2¹indolinon protein-kináz-inhibitorok polimorfjait. A molekuláris csomagolás különbségei miatt, a polimorfok úgy különbözhetnek, hogy befolyásolják a drog felszabadulását, szilárd állapot stabilitását és a gyógyszergyártást. A polimorfok relatív stabilitása és egymásba való átalakulása különösen jelentõs hatással van piacra kerülõ gyógyszer kiválasztására. Alkalmas polimorf áthidalhatja a fizikai stabilitással kapcsolatos problémákat. Például piacra kerülõ gyógyszer kiválasztása függhet attól, hogy rendelkezésre áll¹e kívánt tulajdonságokkal, például kiváló fizikai stabilitással rendelkezõ, alkalmas polimorf, vagy nagyméretben gyárható¹e. A szilárd dózisforma hatékonyságát nem szabad korlátoznia polimorf transzformációknak a termék életideje alatt. Fontos megjegyezni, hogy nincsen megbízható módszer egy adott drog kristályszerkezeteinek megfigyelésére vagy kívánt fizikai tulajdonságokkal rendelkezõ polimorfok létezésének elõre jelzésére. PK¹k olyan enzimek, amelyek fehérjék tirozinjain, szerinjein és treoininjain lévõ hidroxilcsoportok foszforilációját katalizálják. Ennek a látszólag egyszerû aktivitásnak következményei meghökkentõk, mivel a sejtciklus lényegében valamennyi aspektusa (például sejtnövekedés, differenciálódás és proliferáció) egyfelõl vagy másfelõl PK¹aktivitástól függ. Továbbá abnormális

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

PK¹aktivitást összefüggésbe hozták egy sor rendellenességgel, a viszonylag nem életveszélyes betegségektõl, például pikkelysömörtõl kezdve az extrém módon virulens betegségekig, például a glioblasztómáig (agyrákig). Receptor tirozin-kinázok (RTK¹k), a PK¹k egy osztálya, kitûnõ jelöltek molekuláris célzóterápiákhoz, mert kulcsfontosságú szerepet játszanak sejtproliferáció és túlélés szabályozásában, és gyakran diszreguláltak különféle malignitásokban. A diszreguláció mechanizmusai közé tartozik a fokozott mértékû expresszió (Her2/neu mellrákban, epidermális növekedési faktor receptora nem kissejtes tüdõrákban), aktiváló mutációk [KIT gasztrointesztinális stromális tumorokban, fms-sel rokon szerkezetû tirozin-kináz 3/Flk2 (FLT3) akut mielogén leukémiában] és aktiváció autokrin hurkai [vaszkuláris endotél növekedési faktor/VEGF-receptor (VEGF/VEGFR) melanómában, vérlemezkébõl származó növekedési faktor/PDGF-receptor (PDGF/PDGFR) szarkómában]. Abnormálisan szabályozott RTK-kat leírtak összehasonlítható humán és kutyában elõforduló rákos betegségekben. Például a Met-onkogén abnormális expressziója elõfordul mind humán, mind kutyában fellépõ oszteokarcinómában. Érdekes, hogy c-kit juxtamembrán (JM) doménjében összehasonlítható aktiváló mutációkat tapasztaltak humán gasztrointesztinális sztrómatumorok (GIST¹k) esetén, és elõrehaladott, kutyában elõforduló MCT¹k (masztocita tumorok) 50–90%ában. Bár a mutációk humán GIST¹k esetén deléciókból állnak a JM¹doménben, és ugyanezek kutyában elõforduló MCT¹k esetén internális tandem duplikációkból (ITD¹k) állnak a JM¹doménben, mindkettõ KIT konstitutív foszforilációjához vezet ligandumkötés hiányában. Az RTK¹k és ligandumaik, VEGF, PDGF és FGF neovaszkularizációt mediálnak, amely angiogenezisként is ismert, szilárd tumorokban. Következésképpen, RTK¹k gátlásával új véredények tumorokba való növekedését lehet gátolni. Antiangiogeneziságensek, amelyek olyan molekulaosztályt alkotnak, amely véredények tumorokba való növekedését gátolja, sokkal kisebb toxicitást fejtenek ki a testre, mint a hagyományosan alkalmazott rákellenes gyógyszerek. A 6,573,293. számú USA-beli szabadalmi leírásban, melyet a kitanítás részének tekintünk, más vegyületek mellett leírják az 5¹[5¹fluor-2-oxo-1,2dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amidot (a leírásban „I. vegyület”). A következõ struktúrával rendelkezik:

50

55

60 2

I. vegyület

1

HU 006 436 T2

Az I. vegyület egy kisméretû molekula, amely PK¹moduláló aktivitást képes kifejteni. A vegyület ezért hasznosan alkalmazható abnormális PK¹aktivitással összefüggõ rendellenességek kezelésére. RTK¹k, PDGFR, VEGFR, KIT és FLT3 inhibitora. Az I. vegyületrõl kimutatták, hogy KIT foszforilációját gátolja, leállítja a sejtproliferációt, és sejtciklus leállását és apoptózist indukál malignus masztocita-sejtvonalakban in vitro expresszálva mutáns KIT különbözõ formáit. Az I. vegyület és rokon szerkezetû molekulák hatékonyak olyan tumorxenograftok ellen prekilinikai modellekben, amelyek különbözõ humán, tumoreredetû sejtvonalakból alakultak ki. Az I. vegyület hasznosan alkalmazható rákbetegségek kezelésére kedvtelésbõl tartott állatokban, fõleg kutyákban, és szintén alkalmazható, többek között emberekben elõforduló rákbetegségek kezelésére. Ilyen rákbetegségek lehetnek, anélkül, hogy erre korlátozódnánk, leukémia, agyrák, nem kissejtes tüdõrák, pikkelysejtes karcinóma, asztrocitóma, Kaposi-szarkóma, glioblasztóma, tüdõrák, hólyagrák, fej- és nyaki rák, kissejtes tüdõrák, glióma, kolorektális rák, genitourináris rák és gasztrointesztinális strómarák. Az I. vegyület masztociták (hízósejtek) túltermelésével összefüggõ betegségek kezelésére is alkalmas, ideértve, anélkül, hogy ezekre korlátozódnánk, masztocitózis emberekben és masztocita-sejttumorok kutyákban. Az I. vegyületrõl a közelmúltban kimutatták, hogy klinikailag hatékony számos spontán malignitás ellen kutyákban. A vizsgálatban 22 kutyában elõforduló MCT-esetbõl 11¹ben kimutattak tartós, objektív válaszokat (részleges válaszokat és teljes válaszokat) az I. vegyülettel végzett kezelésben; az említett MCT-esetekbõl 9¹ben voltak ITD¹k a c-kit JM¹doménjében. Az I. vegyület könnyen kristályosodik. Oldhatósága körülbelül 10 mg/ml, pH=6,0¹os foszfátpufferben 25 °C¹on. Ha a vegyületet szintetizáljuk, nagyon finom részecskék csapódnak ki az oldatból a szintézis utolsó lépésében. A finom részecskék ezt követõ izolálása szûréssel lassú, és kemény pogácsát eredményez szûrés után. Szükség van az 1. vegyület olyan sójára, amely fizikai stabilitással és kívánt fizikai tulajdonságokkal rendelkezik. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik az I. vegyület sóformái. Az I. vegyület öt különbözõ sóformáját szintetizáltuk és ismertetjük a leírásban (lásd az 1. táblázatot). Ezek az I. vegyület hidroklorid¹, fumarát¹, citrát¹, foszfát- és aszkorbátsói. A sók jellemzésére alapozva, az 1:1 arányú foszfátsót, az I. vegyület foszfátját azonosítottuk nagyon kívánatos tulajdonságokkal rendelkezõ sóformaként. Polimorf szkríneléssel kimutattuk, hogy az I. vegyület foszfátjának 10 polimorfja létezik, amit a leírásban I–X. számú formáknak nevezünk. A találmány tárgyát képezi egy aspektusában az I. vegyület két sóformája, ahol a sóforma citrátsó és foszfátsó, és ezek szolvátjai és polimorfjai közül van kiválasztva. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, C22H25FN4O2.H3O4P molekulaképlettel rendel-

5

2

kezõ foszfátsóforma van kiválasztva. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, körülbelül 285 és körülbelül 290 °C közötti olvadáspontú foszfátsóforma van kiválasztva. Az I. vegyület foszfátja az alábbi szerkezettel rendelkezik:

10

15

I. vegyület foszfátja

A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a citrátsó, az I. vegyület citrátja van kiválasztva, amely C22H25FN4O2.C6H8O7 molekulaképlettel rendel20 kezik. A találmány még egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, körülbelül 178 és körülbelül 183 °C közötti olvadáspontú citrátsóforma van kiválasztva. Az I. vegyület citrátja az alábbi szerkezettel rendelkezik: 25

30

35 I. vegyület citrátja A találmány második aspektusa gyógyászati készít40 mény, amely az I. vegyület foszfátsóját vagy citrátsóját, vagy ezek szolvátját vagy polimorfját, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. A találmány harmadik aspektusa az I. vegyület foszfátsója vagy citrátsója, vagy ezek szolvátjai vagy 45 polimorfjai protein-kinázok katalitikus aktivitásának modulálásában történõ alkalmazásra. A protein-kinázt az alábbiak által alkotott csoportból lehet kiválasztani: receptor tirozin-kinázok, nem receptor protein-tirozin-kinázok és szerin/treonin protein-kinázok. A találmány negyedik aspektusa az I. vegyület fosz50 fátsóját vagy citrátsóját, vagy ezek szolvátjait vagy polimorfjait, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmazó, gyógyászati készítmény alkalmazása egy organizmusban protein-kinázzal össze55 függõ rendellenesség prevenciójára vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amelyben beadunk az organizmusnak terápiásan hatásos mennyiséget. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az organizmus ember. A találmány más elõnyös meg60 valósítási módja szerint, az organizmus kedvtelésbõl 3

1

HU 006 436 T2

tartott állat. A találmány még egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a kedvtelésbõl tartott állat macska vagy kutya. A protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból választható: receptor tirozin-kinázzal összefüggõ rendellenesség, nem receptor protein-tirozin-kinázzal összefüggõ rendellenesség és szerin/treonin protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség. A protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból választható: EGFR-rel összefüggõ rendellenesség, PDGFR-rel összefüggõ rendellenesség, IGFR-rel összefüggõ rendellenesség, c¹kit-tel összefüggõ rendellenesség és FLK-val összefüggõ rendellenesség. Ilyen rendellenesség, anélkül, hogy ezekre korlátozódnánk, például leukémia, agyrák, nem kissejtes tüdõrák, pikkelysejtes karcinóma, asztrocitóma, Kaposi-szarkóma, glioblasztóma, tüdõrák, hólyagrák, fejrák, nyaki rák, melanóma, petefészekrák, prosztatarák, mellrák, kissejtes tüdõrák, glióma, masztocitózis, masztocita tumor, kolorektális rák, genitourináris rák, gasztrointesztinális rák, cukorbetegség, autoimmun rendellenesség, hiperproliferációs rendellenesség, resztenózis, fibrózis, pszoriázis, von Heppel–Lindau-féle betegség, oszteoartritisz, reumatoid arthritis, angiogenezis, gyulladásos rendellenesség, immunológiai rendellenesség és kardiovaszkuláris rendellenesség. A találmány ötödik aspektusa eljárás 5¹[5¹fluor-2oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1Hpirrol-3-karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amid-bázis foszfátsó-kristályainak elõállítására, amelyben beviszünk sztöchiometriás mennyiségû foszforsavat a bázishoz egy oldószert vagy oldószerkeveréket tartalmazó oldatban, a foszfátsót az oldatban kristályosodásra késztetjük, elválasztjuk a foszfátsókristályokat az oldószert tartalmazó oldattól és megszárítjuk a kristályokat. A foszforsavat bevihetjük olyan mennyiségben, amely 40%¹os moláris feleslegben van a bázishoz képest. Az oldószer tartalmazhat izopropanolt. Az a lépés, amelyben a kristályokat elválasztjuk az oldószert tartalmazó oldattól, tartalmazhat acetonitril hozzáadását az oldathoz, és az oldat rotációs bepárlóban való bepárolását. Az a lépés, amelyben a kristályokat elválasztjuk az oldószert tartalmazó oldattól, tartalmazhat szûrést is. A találmány hatodik aspektusa eljárás 5¹[5¹fluor-2oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1Hpirrol-3-karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amid-bázis citrátsókristályainak elõállítására, amelyben beviszünk sztöchiometriás mennyiségû citromsavat a bázishoz egy oldószert vagy oldószerkeveréket tartalmazó oldatban, a citrátsót az oldatban kristályosodásra késztetjük, elválasztjuk a citrátsókristályokat az oldószert tartalmazó oldattól és megszárítjuk a kristályokat. A citromsavat szintén bevihetjük olyan mennyiségben, amely 40%¹os moláris feleslegben van a bázishoz képest. Az oldószer tartalmazhat metanolt. Az a lépés, amelyben a kristályokat elválasztjuk az oldószert tartalmazó oldattól, tartalmazhat acetonitril hozzáadását az oldathoz, és az oldat rotációs bepárlóban való bepárlását. Az a lépés, amelyben a kristályokat elválasztjuk az oldószert tartalmazó oldattól, tartalmazhat szûrést.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

A találmány tárgyát képezi hetedik aspektusában az I. vegyület foszfátsóinak I–X. polimorf formái (a leírásban ismertetettek szerint). A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát az I. forma képezi. A találmány nyolcadik aspektusa gyógyászati készítmény, amely az I. vegyület foszfátjának I. polimorf formáját, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. A találmány kilencedik aspektusa az I. vegyület foszfátjának I. polimorf formája protein-kinázok katalitikus aktivitásának modulálásában történõ alkalmazásra. A találmány tizedik aspektusa az I. vegyületbõl képzett foszfát I. polimorf formájának alkalmazása egy organizmusban protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség prevenciójára vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az organizmus ember vagy kedvtelésbõl tartott állat. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a kedvtelésbõl tartott állat macska vagy kutya. Ilyen rendellenességek lehetnek például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk: masztocita tumor és masztocitózis. A találmány tizenegyedik aspektusa eljárás az I. vegyület foszfátjának I. polimorfjainak elõállítására, amelyben beviszünk a foszfátsót egy oldószert vagy oldószerkeveréket tartalmazó oldatba, adott esetben hídképzõ oldószert adunk az oldathoz, és elválasztjuk a polimorf kristályokat az oldószert tartalmazó oldattól. Az oldat tartalmazhat továbbá víz plusz acetonitrilt. Az oldat tartalmazhat metanolt. A hídképzõ oldószer lehet metanol. A találmány tizenkettedik aspektusa az I. vegyület foszfát- vagy citrátsójának, vagy a foszfátsó I. polimorf formájának alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely abnormális PK¹aktivitás által mediált betegség kezelésére alkalmas. Az ábrák leírása 1. ábra. Nedvességszorpciós adatok az I. vegyület sóira. 2. ábra. Por-röntgendiffrakciós mintázat az I. vegyület citrátjára és az I. vegyület foszfátjára. 3. ábra. Tíz olyan egyedi szilárd anyag porröntgendiffrakciós mintázata, amelyekhez a polimorf szkrínelési vizsgálattal jutottunk (lásd 5. példát). A jelölések az I–X. formáig az 5. és 6. táblázatban bemutatottak szerint történtek. 4. ábra. Szilárd anyagok TGA-görbéi, ahol az anyagok CH2Cl2-bõl (VI. forma, közvetlenül kicsapás után), hexánból (VII. forma, egy éjszakás állás után) és acetonitrilbõl (VIII. forma, 3 napos állás után) származtak. 5. ábra. A 7. példában értékelt MCT-kbõl származó PCR-termékek agaróz-gélelektroforézisének eredményei. Az 1–5. sávok megfelelnek a 8. táblázatban feltüntetett 1–5.

1

HU 006 436 T2

pácienseknek; a 6–14. sávok megfelelnek a 8. táblázatban feltüntetett 6–14. pácienseknek. Kontroll PCR-termékek: az egyik C2 jelû, kutyából származó masztocita sejtvonalból származott, és 48 bp méretû ITD¹t tartalmazott (15. sáv), a másik kutya normál kisagyából származott (vad típus; 16. sáv). 6. ábra. MCT-foszforilált KIT és foszforilált extracelluláris, szignál-szabályozott kináz (ERK)1/2 mennyiségének csökkenései egyetlen dózis I. vegyület foszfátja után. A találmány részletes leírása Definíciók. Hacsak másképpen nem állítjuk, a leírásban és a szabadalmi igénypontokban alkalmazott, következõ kifejezéseknek az alábbiakban ismertetett jelentése van: A „C” jelentése, ha hõmérséklet vonatkozásában alkalmazzuk, Celsius-fok vagy Celsius. A „katalitikus aktivitás” kifejezés a tirozin foszforilációjának sebességére utal, közvetlenül vagy közvetve RTK¹k és/vagy CTK¹k hatása alatt, vagy a szerin és treonin foszforilációjának sebességére, közvetlenül vagy közvetve STK¹k hatása alatt. A „kedvtelésbõl tartott állat” kifejezésen olyan háziasított állatokat értünk, amelyek az ember társai, ideértve, de nemcsak ezekre korlátozva, macskák és kutyák. Az „érintkeztetés” kifejezésen azt értjük, hogy egy találmány szerinti vegyületet és egy cél PK¹t összehozunk úgy, hogy a vegyület képes legyen hatással lenni a PK aktivitására, akár közvetlenül, azaz a kinázzal magával lép kölcsönhatásba, vagy közvetve, azaz egy másik molekulával lép kölcsönhatásba, amelytõl a kináz katalitikus aktivitása függ. Az „IC50” jelentése a tesztvegyületnek az a koncentrációja, amely a PK¹aktivitás maximális gátlásának a felét elõidézi. A „modulálás” vagy „modulál” kifejezések RTK¹k, CTK¹k és STK¹k katalitikus aktivitásának megváltoztatását jelentik. A modulálás RTK¹k, CTK¹k és STK¹k katalitikus aktivitásának konkrétan aktiválását vagy gátlását jelenti, elõnyösen RTK¹k, CTK¹k és STK¹k katalitikus aktivitásának aktiválását jelenti, annak a vegyületnek vagy sónak koncentrációjától függõen, amelyek hatása alá kerül az RTK, CTK vagy STK, vagy, elõnyösebben RTK¹k, CTK¹k és STK¹k katalitikus aktivitásának gátlását jelenti. A „PK” kifejezés receptor protein-kinázt (RTK), nem receptor vagy „celluláris” tirozin-kinázt (CTK) és szerintreonin-kinázokat (STK¹k) jelent. A „polimorf kifejezés egy anyag szilárd fázisát jelenti, amely számos különbözõ formában fordul elõ amiatt, hogy a molekulák különféleképpen helyezkednek el és/vagy szilárdulnak a kristályrácsban. A polimorfok tipikusan eltérõ kémiai és fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek. A „gyógyászatilag elfogadható segédanyag” kifejezés a találmány szerinti vegyülettõl eltérõ, bármilyen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

olyan anyagot jelent, amit hozzáadunk egy gyógyászati készítményhez. A „gyógyászati készítmény” kifejezés egy vagy több, találmány szerinti sót vagy az ilyen sók polimorfjait, a leírásban ismertetettek szerint, és más kémiai komponenseket, például fiziológiailag/gyógyászatilag elfogadható hordozókat és segédanyagokat tartalmazó keveréket jelent. A „fiziológiailag/gyógyászatilag elfogadható hordozó” kifejezés jelentése olyan hordozó- vagy hígítószer, amely nem okoz jelentõs irritációt egy organizmusban, és nem szünteti meg a beadott vegyület biológiai aktivitását és tulajdonságait. A „polimorf kifejezést úgy is definiálhatjuk, mint egy vegyület különbözõ, nem szolvatált kristályformái. A kifejezésen értünk szolvátokat (azaz oldószert vagy vizet tartalmazó oldatokat), amorf formákat (azaz nem kristályos formákat) és deszolvatált szolvátokat (azaz olyan formákat, amelyeket csak a oldószer eltávolításával állítottak elõ egy szolvátból). A „szolvát” kifejezést a leírásban olyan molekulakomplexek leírására alkalmazzuk, amelyek egy találmány szerinti vegyületet és egy vagy több, gyógyászatilag elfogadható oldószermolekulát, például etanolt tartalmaznak. A „hidrát” kifejezést akkor használjuk, ha az oldószer víz. A „lényegében mentes” kifejezés jelentése egy bizonyos polimorf mintában lévõ mennyiségének vonatkozásában azt jelenti, hogy más polimorfok kevesebb mint körülbelül 15 tömegszázalék mennyiségben vannak jelen. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a „lényegében mentes” kifejezés kevesebb mint körülbelül 10 tömegszázalékot jelent. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a „lényegében mentes” kifejezés kevesebb mint körülbelül 5 tömegszázalékot jelent. A találmány még egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, a „lényegében mentes” kifejezés kevesebb mint körülbelül 1 tömegszázalékot jelent. Szakember képes megérteni, hogy a „kevesebb mint körülbelül 15 tömegszázalék” kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses polimorf több, mint körülbelül 85 tömegszázalék mennyiségben van jelen. Ehhez hasonlóan, a „kevesebb mint körülbelül 10 tömegszázalék” kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses polimorf több, mint körülbelül 90 tömegszázalék mennyiségben van jelen. A „terápiásan hatásos mennyiség” kifejezés a vegyület olyan beadott mennyiségére utal, amely megelõz, enyhít vagy javít a kezelt rendellenesség tünetei közül egyet vagy többet, vagy meghosszabbítja a kezelt alany túlélését. Rák kezelésének vonatkozásában, a terápiásan hatásos mennyiség olyan mennyiségre utal, amely alábbi hatásokkal rendelkezik: (1) csökkenti a tumor méretét; (2) tumormetasztázist gátol (azaz bizonyos mértékig lelassítja vagy megállítja); (3) tumornövekedést gátol (azaz bizonyos mértékig lelassítja vagy megállítja), és/vagy (4) bizonyos mértékig enyhíti (vagy megszünteti) a rákkal társult egy vagy több tünetet.

1

HU 006 436 T2

Az I. vegyület különbözõ sóformáit szintetizálhatjuk, hogy jobb fizikai tulajdonságokkal rendelkezõ formához jussunk. A bázisvegyület oldatban lehet. Az oldat általában egy oldószert tartalmaz. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az oldószer egy alkohol. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, az oldószer lehet izopropanol, metanol, acetonitril vagy víz plusz acetonitril. Az oldat tartalmazhat oldószerkeveréket is. A sókat sztöchiometrikus adagolás/kristályosítási technika alkalmazásával lehet kristályosítani. Az ellenion sztöchiometrikus mennyiségét hozzáadjuk a bázishoz oldatban. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion mennyisége 1:1 arányban van a bázishoz viszonyítva. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion mennyisége 0% és körülbelül 60% moláris feleslegben van a bázishoz képest. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion mennyisége körülbelül 10% és körülbelül 50% moláris feleslegben van a bázishoz képest. A találmány még egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion mennyisége körülbelül 40% moláris feleslegben van a bázishoz képest. Az ellenionok lehetnek hidrogén-klorid¹, fumarát¹, citrát¹, foszfát- és aszkorbátionok. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion foszfátion. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, az ellenion citrátion. Az oldatban lévõ sót azután kristályosodásra késztetjük, általánosan ismert, különbözõ technikák alkalmazásával, például hûtéssel, bepárlással, beszárítással stb., amelyek szakember által ismertek. A feleslegben lévõ oldószereket a mintákból szakember által ismert módszerekkel lehet eltávolítani. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, az oldószereket az oldatból acetonitril (ACN) hozzáadásával és az oldat rotációs bepárlóban történõ bepárlásával távolítjuk el. Az oldatot körülbelül 40 °C és körülbelül 60 °C között lehet rotációs bepárlóban bepárolni. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, további oldószereket (például izopropanolt és metil-etil-ketont) lehet adagolni az oldathoz rotációs bepárlóban történõ bepárlás elõtt. A kristályosítást sötétben lehet végezni a fényindukált izomerizáció megelõzése céljából. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a kristályokat szûréssel távolítjuk el. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a szûrést laboratóriumi környezeti atmoszférában végezzük. Ezekkel a módszerekkel az I. vegyület aszkorbát¹, citrát¹, fumarát¹, hidroklorid- és foszfátsóit kristályosítottuk. A kristályosítási módszerekre konkrét példákat lentebb bemutatunk. HPLC-analízist lehet alkalmazni az eredményül kapott minta tisztaságának meghatározására. A vegyületek fizikai tulajdonságait szakember által ismert tesztekkel lehet meghatározni, például olvadáspont meghatározásával, por-röntgendiffrakcióval és dinamikus nedvességszorpciós gravimetriával. Az említett tesztek paramétereit lentebb ismertetjük. Ezt az öt sóformát a leírásban ismertetjük (lásd az 1. táblázatot). Az I. vegyület említett sói gyakran higro-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

szkóposak. Például, amint az 1. táblázatban láthatjuk, 80%¹os nedvességtartalomnál a hidrokloridsó körülbelül 20% vizet, a fumarátsó körülbelül 9% vizet és az aszkorbátsó körülbelül 6,5% vizet tartalmazott. Ez a tulajdonság megnehezíti a só gyógyászati készítményekben történõ alkalmazását és lerövidítheti a kiszerelés életidejét. Azonban két só, a foszfát- és a citrátsó nem várt módon kevés nedvességet vett fel, körülbelül 1% és körülbelül 3,8% vizet 80%¹os relatív nedvességtartalomnál, sorrendben. Az említett sók jellemzésére alapozva, az 1:1 arányú foszfátsót, az I. vegyület foszfátját azonosítottuk olyan sóként, amely nagymértékben kívánatos tulajdonságokkal rendelkezik, ideérte a jó kristályossági fokot, kismértékû nedvességfelvételt, könnyû kristályosíthatóságot, jó tisztaságot és a hidrát hiányát. Az I. vegyület foszfátjának tíz polimorfját le is írjuk, a leírásban I–X. formaként jelölve ezeket. A citrátsóról szintén kimutattuk, hogy kívánatos tulajdonságai vannak, például kismértékû nedvességfelvétel és jó kristályossági fok. A találmány szerinti vegyületek polimorfjai azért kívánatosak, mert egy vegyület adott polimorfja jobb fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkezhet, mint ugyanennek a vegyületnek másik polimorfja. Például az egyik polimorfnak fokozott mértékû oldhatósága lehet bizonyos oldószerekben. Ilyen fokozott oldhatóság elõsegítheti a találmány szerinti vegyületek gyógyszerészeti formázását és beadását. Különbözõ polimorfoknak különbözõ mechanikai tulajdonságai (például különbözõ mértékû összenyomhatóság, tömöríthetõség, tablettázhatóság) is lehetnek, amelyek befolyásolhatják a gyógyszer tablettázásának hatékonyságát, és így befolyásolják a gyógyszer kiszerelését. Egy adott polimorf eltérõ oldódási sebességet is mutathat ugyanabban az oldószerben, más polimorfhoz képest. Különbözõ polimorfoknak különbözõ fizikai (szilárd állapotú konverzió metastabil polimorfból stabilabb polimorfba) és kémiai (reaktivitásbeli) stabilitása is lehet. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgykörébe tartozik az I. vegyület foszfátjának I. polimorf formája, a leírásban ismertetettek szerint. A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint, a találmány tárgykörébe tartozik tiszta, egyetlen polimorfot, valamint két vagy több, különbözõ polimorfot tartalmazó keverék is. Egy tiszta, egyetlen polimorf lényegében mentes lehet más polimorfoktól. A találmány néhány elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgykörébe tartoznak olyan gyógyászati készítmények, amelyek az I. vegyület egy vagy több sóját vagy ilyen sók polimorfjait, a leírásban ismertetettek szerint, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaznak. A polimorfokat az I. vegyület foszfátjának tömény oldataiból állítottuk elõ. A tömény oldatokban az I. vegyület foszfátjának lehetséges koncentrációtartománya 60 és 100 közötti mg per ml oldat. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, körülbelül 70 mg I. vegyületet lehet feloldani 1 ml foszforsavban. A polimorf kristályokat különbözõ módszerekkel lehet kicsapni egy oldószerbõl, ilyenek például lassú be-

1

HU 006 436 T2

párlás, túltelített oldat lehûtése, kicsapás olyan oldószerbõl, amelyben az anyag nem oldódik stb., amelyek szakember számára ismertek. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a polimorf kristályokat úgy állítjuk elõ, hogy hozzáadjuk az oldatot egy olyan oldószerhez, amelyben az anyag nem vagy rosszul oldódik. Az oldószerek, amelyekben az anyag nem vagy rosszul oldódik („antioldószerek”) víz plusz acetonitril (ANC), etanol, metanol, aceton, acetonitril, THF, etilacetát, hexán, metilén-klorid (CH2Cl2), izopropil-alkohol (IPA), metil-etil-keton (MEK) és dioxán lehet. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, további oldószert (például metanolt) lehet hozzáadni. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a mintákat egy éjszakán át állni hagytuk a kristályok elválasztása elõtt. A találmány még egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a mintákat három napig hagytuk állni a kristályok eltávolítása elõtt. A kristályokat szakember által ismert, standard módszerekkel lehet jellemezni, például PXRD dinamikus nedvességszorpciós gravimetriával, differenciális pásztázó kalorimetriával, termogravimetriás analízissel és optikai mikroszkópiával. Ezeket a technikákat lentebb ismertetjük. A találmány szerinti vegyületek bevitelére alkalmas gyógyászati készítmények és elõállításukra szolgáló eljárások szakember számára könnyen érthetõek. Ilyen készítményeket és elõállításukra szolgáló eljárásokat találhatunk például „Remington’s Pharmacutical Sciences” címû kiadványban, 19. kiadás (Mack Publishing Company, 1995). A gyógyászatilag elfogadható segédanyag kiválasztása nagymértékben függ olyan faktoroktól, mint a beadás konkrét módja, a segédanyag hatása az oldhatóságra és stabilitásra és a dózisforma természete. Segédanyagok például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk, kalcium-karbonát, kalcium-foszfát, különbözõ cukrok és keményítõtípusok, cellulózszármazékok, zselatin, növényi olajok és polietilénglikolok. Az I. vegyületet tartalmazó, gyógyászatilag elfogadható készítmények kiszerelésére szolgáló hordozók és segédanyagok szakember számára jól ismertek, és ilyeneket leírtak például a 6,573,292. számú USA-beli szabadalmi leírásban, amelyet teljes egészében a kitanítás részének tekintünk. Ilyenek beadására szolgáló módszerek szakember által szintén ismertek, és le is írtak ilyeneket például a 6,573,293 számú USA-beli szabadalmi leírásban. Hasonló módszereket alkalmazhatunk a találmány szerinti, I. vegyület sóit, vagy ilyen sók polimorfjait tartalmazó, gyógyászatilag elfogadható készítmények kiszerelésére és beadására is. A megfelelõ kiszerelés a beadás választott módjától függ. Injekció céljára, a találmány szerinti vegyületeket vizes oldatokban lehet kiszerelni, elõnyösen fiziológiásan kompatibilis pufferekben, például Hanks-féle oldatban, Ringer-féle oldatban vagy fiziológiás nátriumkloridot tartalmazó pufferben. Transzmukozális beadás céljára, a kiszerelésben olyan penetránst (áthatolószert) alkalmazunk, amely megfelel az áthatolandó akadályhoz. Ilyen penetránsok szakember által jól is-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

mertek. Parenterális beadáshoz, például bóluszinjekcióhoz vagy folyamatos infúzióhoz, a kiszereléseket dózisegység formákra lehet hozni, például ampullákban vagy több dózist tartalmazó tárolóedényekben. A készítmények ilyen formákra hozhatók szuszpenzióként, oldatként vagy emulzióként olajos vagy vizes vivõanyagokban, és formázó anyagokat tartalmazhatnak, például szuszpendáló¹, stabilizáló- vagy diszpergálóágenseket. A találmány szerinti készítményeket be lehet adni közvetlenül a véráramba, izomba vagy egy belsõ szervbe. Alkalmas módszer parenterális beadásra például intravénás, intraarteriális, intraperitoneális, intratekalis, intraventrikuláris, intrauretális, intrasternális, intrakranális, intramuszkuláris, intraszinoviális és szubkután beadás. Alkalmas eszközök lehetnek parenterális beadásra például tûs (beleértve mikrotûs) injektorok, tûmentes injektorok és infúziós technikák. A parenterális formák tipikusan olyan vizes oldatok, amelyek segédanyagként sókat, szénhidrátokat és pufferelõágenseket (elõnyösen 3 és 9 közötti pH¹ra állítva) tartalmaznak, de néhány alkalmazásban még megfelelõbb kiszerelésük lehet steril, nemvizes oldat vagy szárított oldat, alkalmas vivõanyaggal együtt történõ alkalmazásra, amely például steril, pirogénmentes víz. A találmány szerinti vegyületek szuszpenzióit továbbá elõ lehet állítani lipofil vivõanyagban. Alkalmas lipofil vivõanyagok lehetnek zsíros olajok, például szezámolaj, szintetikus zsírsav-észterek, például etil-oleát és trigliceridek, vagy olyan anyagok, mint liposzómák. A találmány szerinti készítményeket be lehet adni orálisan. A beadás történhet nyeléssel, így a vegyület a gasztrointesztinális traktusba jut, és/vagy bukkálisan, linguálisan vagy szublinguálisan, amellyel a vegyület a véráramba jut közvetlenül a szájból. Orális beadáshoz a vegyületeket úgy lehet formázni, hogy a találmány szerinti vegyületeket szakember által jól ismert, gyógyászatilag elfogadható hordozókkal kombináljuk. Orális beadásra alkalmas kiszerelések például szilárd, félig szilárd és folyékony rendszerek, például tabletták; lágy vagy kemény kapszulák, amelyek multi- vagy nanorészecskéket, folyadékokat vagy porokat tartalmaznak; tabletták (beleértve a folyadékkal töltötteket); rágótabletták; gélek; gyorsan diszpergálódó dózisformák; filmek; kúpok; spray¹k; és bukkális/mukoadhezív tapaszok. A találmány szerinti vegyületeket be lehet adni helyileg is, (intra)dermálisan vagy transzdermálisan a bõrre vagy nyálkahártyára. Tipikus kiszerelési formák erre a célra lehetnek gélek, hidrogélek, borogatóoldatok, oldatok, krémek, kenõcsök, hintõporok, kötszerek, habok, filmek, bõrtapaszok, ostyák, implantátumok, szivacsok, rostok, kötések és mikroemulziók. Liposzómákat is lehet alkalmazni. Tipikus hordozó lehet alkohol, víz, ásványi olaj, folyékony vazelin, fehér vazelin, glicerin, polietilénglikol és propilénglikol. Penetrációt fokozó anyagokat is be lehet építeni, lásd például Finnin és Morgan, J. Pharm. Sci. 88, 955–958 (1999). A helyileg történõ beadás más módon történhet elektroporációval, iontoforézissel, fonoforézissel, szonoforézissel

1

HU 006 436 T2

és mikrotûs vagy tûmentes (például Powderject™, Bioject™ stb.) injekció. A találmány szerinti vegyületeket ki lehet szerelni rektális beadásra, például kúpként vagy retenciós beöntésként, például hagyományos kúpalapok, például kakaóvaj vagy más gliceridek alkalmazásával. A találmány szerinti vegyületek lehetnek szolvatálatlan és szolvatált formákban is. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, szintén a találmány tárgykörébe tartozik az I. vegyület egy vagy több sójának, vagy a találmány szerinti, ilyen sók polimorfjainak PK katalitikus aktivitásának modulálásában történõ alkalmazásra. Ilyen „érintkeztetést” lehet végezni „in vitro”, azaz kémcsõben, Petri-csészében, vagy hasonlókban. Kémcsõben történõ érintkeztetés esetén csak egy vegyület és a kérdéses PK van jelen, vagy tartalmazhat egész sejteket. A sejteket sejttenyésztõ edényekben is fenn lehet tartani vagy növeszteni, és ebben a környezetben lehet érintkeztetni. Ebben az összefüggésben, meg lehet határozni, hogy egy konkrét vegyület milyen mértékben képes befolyásolni egy PK¹val összefüggõ rendellenességet, azaz a vegyület IC50-értékét a lentebb definiáltak szerint, mielõtt a vegyületet megpróbáljuk in vivo alkalmazni összetettebb élõ organizmusban. Organizmuson kívül lévõ sejtekre több módszer létezik arra, és szakember számára jól ismertek, hogy a PK¹kat érintkeztessük a vegyületekkel, ilyenek lehetnek, anélkül erre korlátoznánk, direkt sejt-mikroinjektálás és számos transzmembránhordozó technika. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, szintén a találmány tárgykörébe tartozik az I. vegyület egy vagy több sóját, vagy a találmány szerinti, ilyen sók polimorfjait és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény alkalmazása egy organizmusban (például kedvtelésbõl tartott állatban) protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség kezelésére vagy prevenciójára szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: receptor tirozin-kinázzal összefüggõ rendellenesség, nem receptor tirozin-kinázzal összefüggõ rendellenesség és szerin-treonin-kinázzal összefüggõ rendellenesség. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: EGFR-rel összefüggõ rendellenesség, PDGFR-rel összefüggõ rendellenesség, IGFR-rel összefüggõ rendellenesség és FLK-val összefüggõ rendellenesség. A receptor protein-kináz, amelynek katalitikus aktivitását moduláljuk a találmány szerinti vegyülettel, az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF–1R, IRR, PDGFRa, PDGFRb, CSFIR, C¹Kit, C¹fms, Flk–1R, Flk4, KDR/Flk–1, Fit–1, FGFR¹1R, FGFR–2R, FGFR–3R és FGFR–4R. A celluláris tirozin-kináz, amelynek katalitikus aktivitását moduláljuk a találmány szerinti vegyülettel, az alábbiak által alkotott csoportból van kivá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

lasztva: Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hck, Fgr és Yrk. A szerin-treonin protein-kináz, amelynek katalitikus aktivitását moduláljuk a találmány szerinti vegyülettel, az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: CDK2 és Raf. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: pikkelysejtes karcinóma, asztrocitóma, Kaposi-szarkóma, glioblasztóma, tüdõrák, hólyagrák, fej- és nyaki rák, melanóma, petefészekrák, prosztatarák, mellrák, kissejtes tüdõrák, glióma, kolorektális rák, genitourináris rák, gasztrointesztinális rák, masztocitózis és masztocita tumorok. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: cukorbetegség, autoimmun rendellenesség, hiperproliferációs rendellenesség, resztenózis, fibrózis, pszoriázis, von Heppel–Lindau-féle betegség, oszteoartritisz, reumatoid arhtritis, angiogenezis, gyulladásos rendellenesség, immunológiai rendellenesség és kardiovaszkuláris rendellenesség. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható gyógyászati készítmények olyan készítmények lehetnek, amelyekben a hatóanyagok olyan mennyiségben vannak jelen, amely elegendõ a tervezett cél elérésére, például PK¹aktivitás modulálására vagy PK¹val összefüggõ rendellenesség kezelésére vagy prevenciójára. A terápiásan hatékony mennyiség meghatározása szakember számára jól ismert, különösen az itt bemutatott részletes leírás fényében. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott bármilyen vegyület esetén, a terápiásan hatásos mennyiséget vagy dózist eleinte becsülni lehet sejttenyésztési vizsgálati eljárások alapján. Azután a dózist állatmodellekben történõ alkalmazásra lehet kiszerelni úgy, hogy olyan koncentrációtartományt érjen el a keringésben, amelyben benne van a sejttenyészetben meghatározott IC50. Ilyen információkat azután arra lehet használni, hogy pontosabban meghatározzuk az emberekben vagy kedvtelésbõl tartott állatokban alkalmas dózisokat. A gyakorlatban a beadandó vegyület mennyisége körülbelül 0,001 és körülbelül 100 mg/testtömeg¹kg tartományokban van, ilyen összdózis beadható egyszeri alkalommal, vagy elosztva több dózisra. Egy beadott készítmény mennyisége természetesen függni fog a kezelendõ alanytól, a rendellenesség súlyosságától, a beadás módjától, a felíró orvos vagy állatorvos megítélésétõl stb. Helyi beadás vagy szelektív felvétel esetén a gyógyszer hatásos lokális koncentrációja valószínûleg nem függ össze a plazmakoncentrációval, és szakember által ismert, más eljárásokat lehet alkalmazni a helyesen alkalmazott dózis mennyiségének és beadási idõközeinek meghatározására. A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint, szintén a találmány tárgykörébe tartozik az I. vegyület egy vagy több sóját, vagy a találmány szerinti, ilyen sók polimorfjait és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény

1

HU 006 436 T2

alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely rák kezelésére alkalmas kedvtelésbõl tartott állatokban. Továbbá eljárhatunk úgy is, hogy az I. vegyület sóit vagy ilyen sók polimorfjait, az itt leírtak szerint, egy organizmus, például kedvtelésbõl tartott állat vagy ember testében lebontjuk enzimekkel, ezáltal olyan metabolitot állítunk elõ, amely képes a protein-kináz aktivitását modulálni. Ilyen metabolitok a találmány által igényelt oltalmi körbe tartoznak. A találmány szerinti vegyületeket be lehet adni egymagukban vagy kombinációban egy vagy több, más gyógyszerrel (vagy ezek bármilyen kombinációjaként). Eljárhatunk úgy is, hogy az I. vegyület sóit vagy ilyen sók polimorfjait, az itt leírtak szerint, kombinálni lehet más kemoterápiás ágensekkel a fentebb tárgyalt betegségek és rendellenességek kezelésére. Például a találmány szerinti vegyületet kombinálni lehet fluor-uracillal egymagában vagy további kombinációban leukovorinnal vagy más alkilálóágenssel. A találmány szerinti vegyületet kombinációban lehet alkalmazni más antimetabolit kemoterápiás ágenssel, például, anélkül, hogy ezekre korlátozódnánk, folsavanalógokkal vagy purinanalógokkal. A vegyületet kombinációban lehet alkalmazni kemoterápiás ágensekre, antibiotikus kemoterápiás ágensekre, enzimes kemoterápiás ágensekre, palatina koordinációs komplexekre és hormonokra és hormonantagonistákra alapuló természetes termékkel. Eljárhatunk úgy is, hogy a találmány szerinti vegyületet kombinációban alkalmazzuk mitoxantronnal vagy paclitaxellel szilárd tumoros rákbetegségek vagy leukémiák kezelésére. Anélkül, hogy további részletekbe belemennénk, feltételezzük, hogy szakember a megelõzõ leírás alkalmazásával teljes mértékben képes a találmány szerinti megoldás gyakorlati végrehajtására. Az alábbi részletes példákban leírjuk, hogyan lehet a találmány szerinti, különbözõ vegyületeket elõállítani és/vagy eljárásokat végrehajtani, és ezek kizárólag szemléltetés célját szolgálják, és semmilyen módon nem korlátozzák az elõzõekben leírt találmányt. Szakember azonnal képes felismerni alkalmas variációkat a folyamatokból, mind a reaktánsok, mind a reakciókörülmények és technikák vonatkozásában. Példák 1. példa. I. vegyület, azaz 5¹[5¹fluor-2-oxo-1,2dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol3-karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amid szintézise A 6,574,293. számú USA-beli szabadalmi leírás ismertetettek szerint (129. példa), 5¹fluor-1,3-dihidroindol-2-ont kondenzáltuk 5¹formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amiddal, így jutottunk az I. vegyülethez. Méretnövelési eljárás. 5¹formil-2,4-dimetil-1H-pirrol3-karbonsavat (61 g), 5¹fluor-1,2-dihidroindol-2-ont (79 g), etanolt (300 ml) és pirrolidint (32 ml) visszafolyós hûtõ alatt forraltuk 4,5 óra hosszáig. A keverékhez hozzáadtuk 24 ml ecetsavat, és tovább forraltuk visszafolyó hûtõ alatt 30 percig. A keveréket lehûtöttük

5

10

15

20

25

2

szobahõmérsékletre, és a szilárd anyagokat vákuumszûréssel elkülönítettük, és kétszer mostuk etanollal. A szilárd anyagokat 130 percig kevertettük 40% acetont tartalmazó vízben (400 ml), amely 12 N hidrogénklorid-savat (6,5 ml) tartalmazott. A szilárd anyagokat vákuumszûréssel elkülönítettük, és kétszer mostuk 40% acetont tartalmazó vízzel. A szilárd anyagokat vákuum alatt szárítottuk, így jutottunk 5¹[5¹fluor-2-oxo1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol3-karbonsavhoz (86 g, 79%¹os kitermelés), narancsszínû szilárd anyag formájában. 5-[5¹Fluor-2-oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]2,4-dimetil-1H-pirrol-3-karbonsavat (100 g) és dimetilformamidot (500 ml) kevertettünk, és hozzáadtunk benzo-triazol-1-il-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfóniumhexafluoro-foszfátot (221 g), 1¹(2¹amino-etil)-pirrolidint (45,6 g) és trietil-amint (93 ml). A keveréket 2 óra hosszán át kevertettük szobahõmérsékleten. A szilárd terméket vákuumszûréssel elkülönítettük, és etanollal mostuk. A szilárd anyagokat zagy állapotban mostuk etanollal kevertetve (500 ml) egy óra hosszáig, 64 °C¹on, és lehûtöttük szobahõmérsékletre. A szilárd anyagokat vákuumszûréssel elkülönítettük, és etanollal mostuk, és vákuum alatt szárítottuk, így jutottunk 5¹(5¹fluor-2-oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil)-2,4dimetil-1H-pirrol-3-karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)amidhoz (101,5 g, 77%¹os kitermelés). 2. példa. I. vegyület sóinak szintézise

30 2A. példa. I. vegyület foszfátja 2,67 mmol I. vegyületet bemértünk egy lombikba 40 ml, 0,092 M foszforsavval (körülbelül 40%¹os moláris feleslegben 1:1 arányú sót feltételezve) és 40 ml 35 izopropanollal. Azután a vizes oldathoz folyamatosan hozzáadagoltunk acetonitrilt 30 ml¹es aliquotokban, és az oldatból rotációs bepárlóban 60 °C¹on eltávolítottuk a vizet. Összességében 120 ml acetonitrilt használtunk fel a víz eltávolítására az oldatból. A kristályokat le40 szûrtük és levegõn szárítottuk. A kristályok szabadon folytak és narancsszínûek voltak; 1,09 grammot kaptunk, 83%¹os kitermeléssel. 2B. példa. I. vegyület citrátja 2,64 mmol I. vegyületet egy lombikba mértünk 34 ml, 0,1 M citromsavval (3,4 mmol) és 35 ml metanollal. Ezt az oldatot rotációs bepárlóban 50 °C¹on bepároltuk. Az oldat térfogatának csökkenésével gyenge kristályossági fokú kristályok képzõdtek, így 20 ml izo50 propanolt és 10 ml metil-etil-ketont adtunk a szilárd anyag feloldása céljából. Ezt a keveréket rotációs bepárlóban 60 °C¹on bepároltuk, és narancssárga kristályokhoz jutottunk. A kristályokat leszûrtük és levegõn szárítottuk. A kitermelés erre az eljárásra körülbelül 55 60%¹os volt, és javítani lehet az oldószer térfogatának további csökkentésével a szûrés elõtt. 45

3. példa. Az I. vegyület sóinak fizikai tulajdonságai Módszerek. Az I. vegyület sóinak fizikai tulajdonsá60 gainak meghatározására szolgáló tesztek: olvadáspont 9

1

HU 006 436 T2

meghatározása, HPLC-tisztaság, por-röntgendiffrakció és dinamikus nedvességszorpciós gravimetria. Por-röntgendiffrakció (PXRD). Por-XRD¹t Scintag X2 Advanced Diffraction System (lab 259–1088) alkalmazásával végeztünk, melyet Scintag DMS/NT 1.30a és Microsoft Windows NT 4.0 szoftverekkel kontrolláltunk. A rendszer „Copper” röntgenforrást alkalmaz (45 kV és 40 mA), ami 1,5406 Å CuKa1-emissziót biztosít, és szilárd fázisú Peltier hûtött detektort alkalmaz. A sugárnyaláb-szélességet 2 mm¹es és 4 mm¹es, csõdivergenciaés kollimátor („anti-scatter”) résekkel, és 0,5 mm és 0,2 mm szélességû, detektorkollimátor és fogadórésekkel szabályoztuk. Az adatokat 2 és 35° két-theta között vettük fel, lépésenként szkennelve (0,03°/lépés), ahol egy lépés egy másodpercig tartott. Scintag, körkörös, felsõ, rozsdamentes acél mintatartót alkalmaztunk a kísérletekhez, ami 9 mm átmérõjû betéttel volt felszerelve. A porokat a tartóba helyeztük, és finoman lenyomtuk egy üveg tárgylemezzel, hogy a minta felszíne és a mintatartó felszíne párhuzamos legyen.

2

Dinamikus nedvességszorpciós gravimetria (DMSG). DMSG-izotermákat vettünk fel hõmérsékletszabályozott, atmoszferikus mikromérlegen. Körülbelül 10 mg mintát helyeztünk a mérleg mintatartó tálkájába. 5 A nedvességet egymást követõen változtattuk a labor relatív nedvességtartamától (RH) a 0% RH¹ig, és azután 90% RH¹ra növeltük, azt követõen 0% RH¹ra csökkentettük, ismét 3% RH lépésekben. A tömeget azután 2 percenként mértük. Az RH¹t akkor léptettük a 10 következõ célértékre, ha a minta tömegének változása kisebb, mint 0,5 mg volt 10 percen belül. A „Visual Basic program dmsgsn2.exe” programot alkalmaztunk az adatgyûjtés szabályozására és az információ átvitelére Excel-táblázatba. 15 Eredmények. Az 1. táblázatban bemutatjuk az I. vegyület aszkorbát¹, citrát¹, fumarát¹, hidroklorid- és foszfátsóira kapott adatok összesítését. HPLC-analízis alapján feltételezzük, hogy a sók viszonylag nagy tisztaságúak voltak, és a tisztaságban nem történt jelentõs 20 változás a sóképzési folyamat alatt.

1. táblázat Az I. vegyülethez szintetizált sók összefoglalása Ellenion

Só kristályosodott

Olvadáspont (°C)

% víz 80% RH¹n

HPLC tisztaság*

% izomer*

Nincs (szabad bázis)

NA

257

kb. 1%

97,8

0,63

Hidroklorid

igen

96

kb. 20%

97,7

2,29

Fumarát

igen

NA

kb. 9%

97,3

1,96

Citrát

igen

181

kb. 3,8%

98,2

1,38

Foszfát

igen

288

kb. 1%

Aszkorbát

igen

245

kb. 6,5%

*csúcs görbe alatti területe HPLC-ben, RH=relatív nedvességtartalom.

A hidroklorid¹, fumarát- és aszkorbátsók nagyon higroszkóposak voltak (lásd az 1. ábrát). A két másik só (citrát és foszfát) alacsonyabb nedvességszorpciós profillal rendelkezett, kevesebb mint 3% vizet abszorbeált 70% relatív nedvességtartalomnál. A por-röntgendiffrakciós mintázat azt mutatta, hogy a foszfát- és citrátsók kristályosságának foka viszonylag magas (lásd 2. és 3. táblázatot; és 2. ábrát).

40

45

2. táblázat Az I. vegyület foszfátjának PXRD-csúcsai

Két-theta szög* (fok)

Relatív intenzitás** (önkényes)

15,4

15,0

16,5

7,5

17,2

27,7

17,8

9,5

18,3

16,6

19,4

11,6

19,6

11,2

19,8

9,8

Két-theta szög* (fok)

Relatív intenzitás** (önkényes)

20,8

58,2

11,1

23,5

21,6

11,8

11,5

24,0

22,0

9,5

11,6

19,9

22,7

9,2

12,0

8,9

22,9

12,4

13,0

22,0

23,2

12,8

14,0

25,9

23,4

10,3

14,5

7,0

24,4

48,8

50

55

60 10

1

HU 006 436 T2

2. táblázat (folytatás) Két-theta szög* (fok)

2

4. példa: Az I. vegyület foszfátjának elõállítása és jellemzése

Relatív intenzitás** (önkényes)

25,8

30,4

27,0

100,0

29,2

7,4

29,2

7,4

33,5

5,1

*: ±0,1° **: Az egyes csúcsokra a relatív intenzitást úgy határoztuk meg, hogy intenzitását a legerõsebb csúcs (27,0°-nál 100,0ként) intenzitására normalizáltuk.

3. táblázat Az I. vegyület citrátjának PXRD-csúcsai Két-theta szög* (fok)

Relatív intenzitás** (önkényes)

3,2

20,4

7,3

17,7

9,2

14,4

9,5

39,1

10,8

9,5

12,7

23,5

13,2

19,6

14,3

23,5

14,8

16,7

15,9

11,3

17,2

8,3

17,8

11,9

18,2

19,8

18,3

19,5

19,6

6,8

20,9

11,1

21,6

8,9

21,7

10,5

21,8

8,9

23,2

13,2

24,2

20,3

24,9

15,9

25,5

100,0

26,4

20,9

26,8

26,5

27,1

10,8

32,0

6,3

34,4

8,1

*: ±0,1° **: Az egyes csúcsokra a relatív intenzitást úgy határoztuk meg, hogy intenzitását a legerõsebb csúcs (25,5°-nál 100,0-ként) intenzitására normalizáltuk.

4A. példa: Az I. vegyület foszfátjának elõállítása Az I. vegyület szabad bázist alkalmaztuk a foszfátsó elõállítására. Az I. vegyület foszfátmintáját (lot. szám 35282-CS¹51) a fentebb leírtak szerint állítottuk elõ. 4 ml, 0,977 M foszforsavat adtunk 1,095 g sza10 bad bázishoz egy lombikban, és közvetlenül ezután hozzáadtunk 4 ml acetonitrilt. Egy szuszpenziót kaptunk. A szuszpenziót enyhén hevítettük melegítõlapon. Hozzáadtunk 40 ml vizet, és melegítettük, közben kevertettük körülbelül egy óra hosszáig, ami alatt 15 nem oldódott fel teljesen a szilárd anyag. A szilárd anyagot leszûrtük, és 10 ml acetonitrillel mostuk. PXRD-vel kimutattuk, hogy ez az I. vegyület foszfátsója volt. 5

4B. példa: Az I. vegyület foszfátjának jellemzése A 35282-CS¹51. lot. számú mintát az I. vegyületbõl képzett foszfát I. polimorf formájának neveztük. Kristályossági foka magas volt, folyékonysága (gördülékeny25 sége) jó volt, és a kristályok mérete nagy volt. Az alapján, hogy nem történt olvadás az I. vegyület szabad bázisának olvadáspontján (szabad bázis polimorf A¹forma, 256 °C; polimorf B¹forma, 259 °C), és magas olvadáspontú (281–297 °C) szilárd anyag jelenléte alapján 30 feltételeztük, hogy a 35282-CS¹51. lot. számú kristályok egy különbözõ sóformának felelnek meg, és nem az I. vegyület szabad bázisa. A lot tisztasága 99,6%¹os volt HPLC¹n. 20

35

40

45

50

55

60 11

4C. példa: Az I. vegyület foszfátjának oldhatósága 1–2 mg I. vegyület foszfátmintáit (lot 35282-CS¹51) bevittünk 10 ml¹es üvegedényekbe (táráltak), és lemértük (0,1 mg pontossággal). Az edényekhez lépésenként oldószereket adtunk (egy oldószer egy edényhez), az egyes lépésekben 0,5 ml oldószert adtunk. Az alkalmazott oldószer puffer (pH=2), puffer (pH=5), víz, metanol, tetrahidrofurán (THF), acetonitril és aceton volt. Az egyes adagolások után az edényeket kupakkal lezártuk és felráztuk. A szilárd anyag oldódását vizuálisan figyeltük meg. Ha nyilvánvalóan nem figyeltünk meg oldódást, azonnal több oldószert adtunk. Ha oldódás látható volt, az edényt az asztalon hagytuk legalább 30 percig, mielõtt hozzáadtuk a következõ adag oldószert. Ezt a lépést addig ismételtük, amíg a kristályok láthatók voltak fekete és fehér háttér elõtt. Az oldhatóságot azután úgy összegeztük, hogy a vegyület tömegét elosztottuk a végtérfogattal és az utolsó adagolás elõtti térfogattal. Ha szilárd anyag maradt 10 ml oldószer hozzáadása után, az oldhatóságot úgy fejeztük ki, hogy kevesebb mint az a tömeg, amit elosztottunk a végtérfogattal. Ha a szilárd anyag teljesen feloldódott az oldószer elsõ hozzáadása után, akkor az oldhatóságot úgy fejeztük ki, hogy több, mint az a tömeg, amit elosztottunk az oldószer térfogatával.

1

HU 006 436 T2

Valamennyi kísérletet szobahõmérsékleten végeztünk. Az I. vegyület foszfátjának becsült oldhatóságát a különbözõ oldószerekben bemutatjuk a 4. táblázatban, a szabad bázis oldhatóságával együtt, mg/mlben kifejezve. Az I. vegyület foszfátjának oldhatósága alacsonyabb, mint az I. vegyület szabad bázisáé ugyanabban az oldószerben, kivéve a vizet (különbözõ pH¹értékeken). Az I. vegyület foszfátjának oldhatósága függ egy oldószer pH¹értékétõl, és jelentõsen magasabb lesz (>3 mg/ml) pH 2¹n vagy alacsonyabb pH¹n. Az I. vegyület foszfátjának olvadáspontja (lot 35282-CS¹51) körülbelül 281–297 °C, amely lényegileg magasabb, mint az I. vegyület szabad bázisának olvadáspontja (szabad bázis polimorf A¹forma, 256 °C; polimorf B¹forma, 259 °C). Egy fontos eredmény, hogy az I. vegyület foszfátjának nedvesedõképessége vízzel sokkal jobb, mint az I. vegyület szabad bázisáé. 4. táblázat Az I. vegyület szabad bázis és I. vegyület foszfát becsült oldhatósága különbözõ oldószerekben 23 °C¹on

5

10

15

20

25 Oldószer

I. vegyület szabad bázis (polimorf A¹forma) oldhatósága (mg/ml)

I. vegyület foszfát oldhatósága (mg/ml)d

1.

Puffer (pH=2)a

3,11

5,9–7,4

2.

Puffer (pH=5)b

0,005

3.

Víz

NAc

30

kb. 0,29e (néhány részecske az edény falán ragadt és nem oldódott)

4.

Metanol

0,21–0,31

kb. 0,14

5.

THF

0,32–0,4

<<<0,19

6.

Acetonitril

<<0,08

<<<0,13

7.

Aceton

<<0,16

<<<0,2

35

5. példa: Az I. vegyületbõl képzett foszfát polimorfjainak elõállítása A 4C. példában látható módon, az I. vegyület foszfátjának kismértékû oldhatósága arra utal, hogy az I. vegyület nagyon tömény oldatai (60–100 mg/ml) kedvezõ hatásúak lehetnek az I. vegyületbõl képzett foszfát polimorfjainak kicsapására különbözõ oldószerek-

bõl. Ilyen tömény oldatokat úgy készítettünk, hogy feloldottunk I. vegyület szabad bázisát körülbelül 1 M foszforsavban. Például körülbelül 70 mg, I. vegyület szabad bázisát fel lehet oldani 1 ml, 1 M foszforsavban. Azonban az I. vegyület, szabad bázis és a foszforsav alkalmazott mennyisége a kívánt koncentrációtól és az oldat „batch”-méretétõl függött. Abban a példában, amelyben a csapadékot azonnal vákuumszûrõn leszûrtük kicsapás után, azt követõen körülbelül 1 ml kívánt oldatot csepegtettünk körülbelül 10 ml, tíz olyan oldószerbe, amelyekben nem vagy rosszul oldódik, a sókristályok kicsapása céljából. Ezek az oldószerek víz plusz acetonitril (ANC), etanol, metanol, aceton, acetonitril, THF, etil-acetát, hexán, metilén-klorid (CH2Cl2) és izopropil-alkohol (IPA) volt. Abban a példában, amelyben a csapadékot egy éjszakai vagy három nap állás után szûrtük le vákuumszûrõn, további oldószerként metil-etil-ketont (MEK) és dioxánt alkalmaztunk. Néhány szerves oldószer, például etil-acetát, hexán, CH2Cl2 nem keveredik vízzel, és két oldószerfázist lehet megfigyelni. Csak kevés csapadékot láttunk a határrétegen, még percekkel is a hozzáadás után. Azokban az esetekben körülbelül 1 ml metanolt adtunk hídképzõ oldószerként, hogy növeljük a keveredést a két fázis között. Úgy tûnt, hogy a metanol jól mûködött a keveredés javításában, mert a színtelen szerves fázis sárga lett, mihelyt hozzáadtuk a metanolt. A edényt azután kézzel intenzíven ráztuk körülbelül egy percig. A szerves oldószerekbõl kivált szilárd csapadékot vákuummal szûrtük, egyrészt rögtön a kicsapódás után (20 percen belül), és egy éjszakás vagy három napos állás után mind metastabil, mind stabil polimorfok izolálása céljából. A port azután analizáltuk. A különbözõ szilárd anyagokat az elõállításuk sorrendjében számoztuk. 6. példa: Az I. vegyületbõl képzett foszfát polimorfjainak jellemzése

40

45

a

pH=2, a puffer HCl-bõl és KCl-ból készült. b pH=2, a puffer kálium-ftálsavból és nátrium-hidroxidól készült. c Nem áll rendelkezésre, de várhatóan <0,005 mg/ml. d 1 g I. vegyület foszfátja ekvivalens 0,802 g I. vegyület szabad bázissal. e A végsõ oldat pH¹értéke 4,91.

2

50

55

60 12

6A. példa: Jellemzési módszerek A fentebb leírt polimorf szkrínelési eljárásokkal kapott valamennyi port PXRD-vel analizáltuk fentebb, a 3. példában leírtak szerint. Ha egy új PXRD-mintázatot figyeltünk meg, kiegészítõ technikákat is alkalmaztunk a szilárd anyagok jellemzésére, például dinamikus nedvességszorpciós gravimetriát (szintén a 3. példában leírtak szerint), differenciális pásztázó kalorimetriát, termogravimetriás analízis (ha szükséges) és optikai mikroszkópiát. Differenciális pásztázó kalorimetria (DSC). DSCadatokhoz DSC-kaloriméter (TA Instruments 2920) alkalmazásával jutottunk. A port (1–5 mg) egy alumínium DSC-tégelybe helyeztük. Egy alumíniumfedõt tettünk a tégelyre és lezártuk („krimpeljük”). A lezárt tégelyt a mintacellába helyeztük, referenciaként egy üres tégellyel együtt. A hõmérsékletet 300 vagy 350 °C¹ra növeltük 10 °C/perc sebességgel, hacsak másképpen nem specifikáljuk. Termogravimetria (TGA). TGA-kísérleteket nagy felbontású analizátor (TA Instruments model 2950) al-

1

HU 006 436 T2

kalmazásával végeztünk. A „TA Instruments Thermal Solutions™ for NT” (1.3L verzió) szoftvert alkalmaztuk adatgyûjtésre, és az „Universal Analysis™ for NT” (1.3L verzió) szoftvert alkalmaztuk az adatok feldolgozására. A mintákat (5–10 mg) egy alumíniumtégelybe helyeztük, amit azután egy platina mérõtégelybe tettünk felmelegítés elõtt. Az alumínium- és a platinatégelyek tömegét kitáráltuk, mielõtt ráhelyeztük a mintát. A hõmérsékletet 30 °C¹ról 300 °C¹ra növeltük lineárisan, 10 °C/perc sebességgel. Száraznitrogén-befúvást alkalmaztunk. Polarizált fénymikroszkópja. A mikroszkópiás vizsgálatokat Olympus BHSP polarizált fénymikroszkópon végeztük. A port szilikonolajban felszuszpendáltuk, és diszpergáltuk a mikroszkópiás tárgylemez és fedõlemez között. Megfigyelés elõtt a fedõlemezt gyengén eldörzsöltük a tárgylemezzel szemben, hogy a részecskék jól diszpergálva legyenek. 6B. Jellemzés közvetlenül kicsapás után Az eredményeket összefoglaljuk az 5. táblázatban. A kicsapódás megtörténik, mihelyt a savas oldatot összekevertük olyan oldószerekkel, amelyekben az anyag nem vagy rosszul oldódik. A csapadékok elõször laza pelyhekbõl álltak. A színek általában sárga vagy világosnarancs színûek voltak. Az eredményül kapott szilárd anyag tapadós volt. A szilárd anyagok mikroszkópos megfigyelése azt mutatta, hogy nagyon kis kristályokból épültek fel, polarizált fény alatt jó kettõs töréssel. Legalább hat különbözõ PXRD-mintázatot figyeltünk meg a szilárd anyagokon, amelyeket kilenc oldószerrendszerbõl kaptunk (lásd a 3. ábrát). Ezen a molekulán az amid-oldallánc flexibilis, és különbözõ konformációt vesz fel a szabad bázis B¹for-

5

10

15

20

25

30

2

májában és hidrogén-klorid-sójában. Ezért a molekula különbözõ szilárd formáiban konformációs polimorfok lehetnek. Etil-acetátból, hexánból és IPA-ból kicsapódott szilárd anyagok PXRD-mintázatai ugyanolyannak látszottak. Azonban más PXRD-mintázatokkal való részletes összehasonlítás nehéz volt az alacsony diffrakciós jelek miatt olyan szilárd anyagok esetén, amelyek ebbõl a három oldószerbõl származtak. Emiatt ezeket nem jelöltük új formának. A metanolból származó csapadék ugyanolyan, mint a 35282CS¹51 számú referencia lot (I. formának jelöltük). Valamennyi csapadék TGA-adata kimutatott oldószermaradványt 1,7–4,7% mennyiségben. Ezek közül egy szilárd anyag, a CH2Cl2-ból származó tûnt olyan szilárd anyagnak, amelyben a kristályokban maradt oldószer. A TGA-görbe azt mutatta, hogy a minta tömegében egy hirtelen csökkenés következett be körülbelül 125 °C hõmérsékleten (lásd a 4. ábrát). Ezt a folyamatot endotermként vette fel a DSC körülbelül ugyanezen a hõmérsékleten. Továbbá ez a por jól definiált morfológiával rendelkezõ kristályokból állt és szabadon folyó (gördülékeny) volt, ami nagyon eltérõ tulajdonsága volt a többi csapadék-lothoz képest. A pornak közepes kristályossági foka volt PXRD-vel, de polarizált fénymikroszkóppal megfigyelve jó kristályossági foka volt. Más lotok nagyon finom kristályokból álltak. Az említett porok DSC-görbéje szélesen és laposan endotermek voltak, mihelyt a mintát a mintacellába helyeztük. Ez a megfigyelés TGA-val fokozatos tömegvesztésre utal a TGA¹n történõ melegítés kezdetétõl. Ezért ezekre a lotokra, az oldószerek maradványa valószínûleg a felszínen adszorbeált oldószerek voltak, és olyan oldószerek, amelyek a kristályrácsban vannak.

5. táblázat Közvetlenül kicsapás után izolált szilárd anyagok fizikai jellemzése PXRD-mintázathoz rendelt név

Szerves oldószer

PXRD kristályosság

Mikroszkópos megfigyelés

TGA tömeg% veszteséga

Termikus folyamatok DSC-vel (°C)b

Szilárd anyag színe

Szabadon folyik igen/nem

I. forma

víz+ACN

magas

szabálytalan

0,3

296

narancs

igen

II. forma

EtOH

gyenge

aggregátume

2,5

81c, 226, 293

sárga

nem (tapad)

I. forma

MeOH

magas

szabálytalan

1,7

298

narancsvörös

igen

III. forma

aceton

közepes

aggregátume

2,5

88c, 155, 222, 228, 286

sárga

nem (tapad)

IV. forma

acetonitril (ACN)

magas

aggregátume

2,9

97c, 142, 156, 172, 227, 230, 281

sárga

nem (tapad)

V. forma

THF

magas

aggregátume

2,5

82c, 161, 175, 227, 292

sárga

nem (tapad)

13

1

HU 006 436 T2

2

5. táblázat (folytatás) PXRD-mintázathoz rendelt név

Szerves oldószer

PXRD kristályosság

Mikroszkópos megfigyelés

TGA tömeg% veszteséga

Termikus folyamatok DSC-vel (°C)b

Szilárd anyag színe

Szabadon folyik igen/nem

NDf

etil-acetát

gyenge

finom részecskék

4,7

98c, 196, 222

világosnarancs

nem (tapad)

NDf

hexán

gyenge

aggregátume

világosnarancs

nem (tapad)

VI. formaf

CH2Cl2

közepes

lemez+ egyenértékû+finom

3,3

123d, 164, 228, 296

narancsvörös

igen

NDf

IPA

gyenge

aggregátume

1,9

76d, 222, 229, 296

sárga

nem (tapad)

a

Tömegveszteség 160 °C¹ig. b Az érthetõség kedvéért: a táblázatban felsorolt hõmérsékletértékek csak csúcshõmérsékletek. c Széles endoterm folyamat csúcshõmérséklete egy DSC-futtatás kiindulási hõmérsékletétõl kiindulva. Ezekre a folyamatokra a TGA¹n tapasztalt fokozatos tömegveszteség is utal. Az ilyen típusú termikus folyamat felszínen adszorbeált oldószerre jellemzõ.d Viszonylag éles endoterm folyamat csúcshõmérséklete DSC¹n. Ezt a folyamatot rögzítettük TGA-val is, mint hirtelen tömegveszteséget a megfelelõ csúcshõmérsékletnél. Ez az ilyen típusú termikus folyamat egy szolvát deszolvatálódására jellemzõ. e Az aggregátumok nagyon finom részecskékbõl állnak. f ND jelentése: nem lehetett definiált formát hozzárendelni, mert a megfelelõ PXRD-mintázat diffrakciós csúcsainak alacsony jelerõssége bizonytalanná tett részletes összehasonlítást más formák PXRD-mintázataival. g VI. forma, oldószert tartalmazó szilárd anyag.

6C. Jellemzés azután, hogy három napig oldatban állt Ezeket az eredményeket összefoglaljuk a 6. táblázatban. Miután az anyagot állni hagytuk három napig az oldószerben, megjelent egy új, nem pelyhes, narancsszínû szilárd fázis. A pelyhes csapadék, ami valamennyi szerves fázisból kivált, a metanolból kicsapódott anyagon kívül, átalakuláson ment át. A kicsapódott szilárd anyagok közvetlenül a kicsapódás után látszólag metastabilak voltak ezekben az esetekben, amelyekben átalakultak egy stabilabb szilárd formává (I. forma) az idõ elõre haladásával. Ez a konverzió teljesnek tûnt néhány órán belül a legtöbb oldószerrendszerben. Azonban sokkal hosszabb idõtartamig hagytuk állni, hogy biztosítsuk a folyamat befejezõdését abból a célból, hogy elkerüljük két szilárd forma keverékének izolálását. A TGA-görbe hirtelen tömegvesztést mutatott körülbelül 124 °C¹nál és 153 °C¹nál olyan szilárd anyagok esetén, amelyeket hexánból, illetve acetonitril nyertünk ki, sorrendben, DSC¹n endoterm folyamattal kapcsolódva hasonló hõmérsékleten. Ezért szintén úgy tûnt, hogy oldószermaradványokat tartalmazott a kristályrács. A visszamaradt oldószerek sztöchiometriája körülbelül 0,6 volt acetonitrilre és körülbelül 0,14 hexánra. Tû alakú kristályok növekedtek acetonitrilbõl három napos állás után. Az acetonitrilt visszatartó szilárd anyag PXRD-mintázatai egyediek voltak, míg a hexán-szolvát PXRD-mintázata hasonló volt a korábban azonosított, CH2Cl2¹ot visszatartó szilárd anyaghoz (3. ábra). Mindkét, oldószert visszatartó anyag (hexánt és acetonitrilt) tömeget vesztett TGAtégelyen. Mindkét anyagra egyedi PXRD-mintázatot fi-

gyeltünk meg, miután a megfelelõ visszatartott oldó30 szert melegítéssel eltávolítottuk (7. táblázat, 3. ábra), ami azt mutatja, hogy az oldószer-molekulák eltávolítása a szilárd anyagokból a szolvátkristályok strukturális megváltozását okozták (ezért az oldószer-molekulák a kristályrácsban voltak, nemcsak a kristály fel35 színén). Azonban az acetonitriltõl mentesített deszolvát PXRD-mintázatában a jel intenzitása alacsony volt. Az acetonitril-deszolvát DSC-profilja két további termikus folyamatot mutatott ki 74 °C¹on és 174 °C¹on, az acetonitril-szolvát DSC-profiljához képest, míg a 40 deszolvatációs folyamat 153 °C¹nál nem volt jelen. A minta lehûtése deszolvatáció után megváltoztatta a szilárd anyagot, ami energetikai változáson ment át 174 °C¹on. Ha más szerves oldószereket alkalmaztunk, a csa45 padékok hosszabb állása ugyanolyan PXRD-mintázattal rendelkezõ szilárd anyagokat eredményezett, mint az I. formáé (Lot 35282-CS¹51), bár a kristályok morfológiája különbözött (6. táblázat). Ugyanolyan PXRDmintázatot mutatott, mint azoké az anyagoké, amelyek 50 ugyanolyan kristályrácsszerkezettel rendelkezek. Az eltérõ morfológia az oldószer hatásai miatt lehet. Nyilvánvaló, hogy az I. forma a legstabilabb szilárd fázis az itt leírt, valamennyi nem szolvatált polimorf közül. Más oldószermentes szilárd formák metastabilak voltak és 55 gyorsan I. formába alakultak, ha oldószerrel kerültek érintkezésbe. A CH2Cl2-ból származó szilárd forma látszólag könnyebben folyt, mint a hexánból származó forma. A TGA, a morfológia és a folyékonysági (gördülékenységi) képesség azt mutatta, hogy ezek két kü60 lönbözõ szilárd anyagnak felelnek meg. 14

1

HU 006 436 T2

2

6. táblázat Kicsapás után különbözõ ideig állni hagyott oldatokból izolált szilárd anyagok fizikai jellemzése PXRD-mintázathoz rendelt név

Szerves oldószer (állás ideje)

PXRD kristályosság

Mikroszkópos megfigyelés

TGA tömeg% veszteséga

Termikus folyamatok DSC-vel (°C)b

Szilárd anyag színe

Szabadon folyik igen/nem

I. forma

víz+ACN

magas

szabálytalan

0,3

296

narancs

igen

I. forma

etil-acetát (éjszakán át)

magas

táblák

narancsvörös

igen

VII. formag

hexán (éjszakán át)

közepes

lemezek

2,4

124c, 228, 295

narancsvörös

nem

I. forma

IPA (éjszakán át)

magas

egyenértékû (25 mm)+finom

0,4

297

narancsvörös

igen

I. forma

CH2Cl2 (éjszakán át)

magas

egyenértékû (25 mm)+finom

0,6

293

narancsvörös

igen

I. forma

etanol (3 nap)

magas

aggregátume

narancsvörösd

igen

I. forma

aceton (3 nap)

magas

lemezek

narancsvörösd

igen

VIII. formag

acetonitril (3 nap)

közepes

tûk

4,9

153c, 229, 231, 239, 291

narancsvöröse

nem

I. forma

THF (3 nap)

magas

lándzsahegy

0,3

295

világos narancsf

nem

I. forma

MeOH (éjszakán át)

magas

narancsvörös

igen

I. forma

MEK (éjszakán át)

magas

rudak

297

narancs

nem

I. forma

dioxán (éjszakán át)

magas

lemezek

295

narancs

nem

0,6

a

Tömegveszteség 160 °C¹ig. b Az érthetõség kedvéért: a táblázatban felsorolt hõmérsékletértékek csak csúcshõmérsékletek. c Viszonylag éles endoterm folyamat csúcshõmérséklete DSC¹n. Ezt a folyamatot rögzítettük TGA-val is, mint hirtelen tömegveszteséget a megfelelõ csúcshõmérsékletnél.d A konverzió 5 óra alatt lett teljes (sárgából narancsvörösbe).e A konverzió nem volt egyértelmû 5 óra alatt, de három napon belül többnyire teljes lett (sárga laza csapadékból narancsvörös, jól kialakult, tû alakú kristályok). f A konverzió 5 óra alatt lett teljes. A színváltozás nem volt egyértelmû (sárgából világos narancsba). g VII. és VIII. forma, oldószert tartalmazó szilárd anyagok.

7. táblázat Deszolvatáció után képzõdött szilárd anyagok fizikai jellemzése PXRD-mintázathoz rendelt név

Kristály elõállítására szolgáló eljárás

PXRD-kristályosság mértéke

Termikus folyamatok DSC-vel (°C)b

Szilárd anyag színe

IX. forma

ACN-szolvát deszolvatációja

gyenge

74, 174, 229, 231, 239, 291

narancs

X. forma

Hexán-szolvát deszolvatációja

közepes

7. példa: KIT-foszforiláció gátlása kutyákban kialakult masztocita tumorokban Cél. Célzott terápiák kifejlesztése rák ellen lehetõséget ad, hogy közvetlenül elemezzük egy gyógyszer hatásait a molekuláris célpontra és ezeket a hatásokat összhangba hozzuk a tumorbiológiával és drog-farmakokinetikával. Ez hozzájárulhat az onkológiai gyógyszerfejlesztéshez, mert farmakodinámiás/farmakokine-

narancs

tikai összefüggéseket tár fel, és döntõ információkat biztosít egy célzott ágens terápiás hatásáról. A vizsgá55 lat célja annak elemzése, hogy egyetlen dózis receptor tirozin-kináz-inhibitor, konkrétan az I. vegyület foszfátja milyen hatást fejt ki molekuláris célpontjára, KIT¹re kutyában elõforduló, masztocita tumorokban (MCT), kutyapáciensekben elõrehaladott állapotban lévõ MCT60 kben, közvetlen célgátlás markereként KIT-foszforilá15

1

HU 006 436 T2

ciót alkalmazva. Vizsgáltuk az ERK1/2 [mitogénaktivált protein-kináz (MAPK), a KIT-jeltovábbítási folyamatsorban késõbb elhelyezkedve] foszforilációját is, az I. vegyület plazmakoncentrációját és a c-kit mutációs állapotát annak meghatározására, hogy ezek a paraméterek összhangban vannak¹e KIT foszforilációs állapotával az I. vegyület foszfátjával végzett kezelés után. Vizsgált drog. Az I. vegyület foszfátja 20 mg¹os, bemetszett tabletta formájában állt rendelkezésre. Vizsgálati terv. Ez a vizsgálat célmoduláció igazolása volt kutyákban, kiújuló vagy metasztázisos, II/III-fokozatú MCT¹k esetén. A páciensek I. vegyület foszfátját kapták egyetlen orális, 3,25 mg/kg dózisban. 6 mm¹es tûszúrásos biopsziavevõ berendezés alkalmazásával mintákat vettünk a tumorból az I. vegyület foszfátjának beadása elõtt és 8 órával a kezelés után. Ha lehetséges volt, több biopsziát vettünk. Az egyes mintákat hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és –70 °C¹on tároltuk analízis elõtt. A tumorbiopsziákkal egyidejûleg vérmintákat vettünk az I. vegyületbõl képzett foszfát plazmaszintjének analízisére (lásd lentebb). Az I. vegyület foszfátjának plazmaszintje. Vérmintákat vettünk a nyaki (juguláris) vénából, és vörös kupakos szérumgyûjtõ vákuum üvegedénybe helyeztük azokat. A mintákat szobahõmérsékleten tartottuk, hagytuk megalvadni, 1500 rpm¹en, 4 °C¹on, 10 percig centrifugáltuk, átvittük fagyasztóedényekbe, és a plazmát –70 °C¹on fagyasztottuk az analízisig. Röviden összefoglalva, plazmamintákat (20 ml) vagy kutyából származó plazmában lévõ, I. vegyület foszfátjának standardjeit összekevertük DL¹propanolol-hidrokloridot (belsõ standard) tartalmazó metanollal (200 ml), 96 mérõhelyet tartalmazó, polipropiléntálcában (Orochem Technology, Westmont, IL). A tálcákat vortexen kevertettük 1 percig, és a mintákat 10 percig centrifugáltuk 4000 rpm¹en. A felülúszóból 10 mikrolitert injektáltunk LC/MS/MS-rendszerbe, amelyben az elválasztás BataBasic C¹18 (5 mm, 100×4,6 mm), fordított fázisú, nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás oszlopon (Keystone Scientific, Foster City, CA) történt. Az I. vegyület foszfátjának mennyiségét és az egyes, kutyából származó plazmamintákban lévõ belsõ standard mennyiségét standard görbe alkalmazásával határoztuk meg, amit ismert mennyiségû vegyülettel vettünk fel 0,2 és 500 ng/ml tartományban. c-kit mutációs analízis. A minták többsége esetén RNS¹t extraháltunk TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó által adott útmutató szerint. Azután elõállítottunk cDNS¹t az RNS-bõl dNTP¹k, random láncindító oligonukleotidok, 5X „elsõ szál” puffer, 0,1 M DTT és Superscript Taq-polimeráz (mind a Promega cégtõl származott, Madison, WI) alkalmazásával. Meghatároztuk a cDNS¹t az egyes mintákra. A maradék mintából genomi DNS¹t preparáltunk, leírt módszer szerint [Downing, S., Chien, M. B., Kass, P. H., Moore, P. F. és London, C. A., „Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c¹kit in mast cell tumors of dogs”. Am. J. Vet. Res. 63, 1718–1723 (2002); melyet teljes egészében a kitanítás

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

részének tekintünk]. Mindkét reakció esetén PCR-ben 40 ciklust futtattunk, amelyek a következõkbõl álltak: 94 °C (1 percig), 59 °C (1 percig) és 72 °C (1 percig), majd 5 perces, 72 °C¹on végzett lánchosszabbítással a reakció végén. A kutyából származó C2 jelû masztocita sejtvonalból elõállított c¹kit DNS¹t és kutya normál kisagyából elõállított cDNS¹t alkalmaztunk kontrollként. A PCR-termékeket elektroforézissel választottuk el, 4%¹os agarózgélen; a várható vad típusú c¹kit PCRtermék 196 bp méretû a cDNS-bõl végzett PCR-ben és 190 bp méretû a genomi DNS-bõl végzett PCR-ben. Azokban az esetekben, amelyekben ITD nem volt nyilvánvaló (csak egyetlen csík volt jelen), a PCR-termékeket gélen tisztítottuk „Promega PCR Wizard Clean¹Up kit” (Promega) alkalmazásával, és szekvenáltuk P1 (elõremenõ), és P5 vagy P2 (reverz) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával a központi szekvenáló részlegben „University of California” (Davis), hogy kizárjuk nagyon kisméretû ITD¹k, deléciók vagy pontmutációk jelenlétét. A szekvenciák egymás alá rendezését és összehasonlítását DNASIS szekvenciaanalízis program alkalmazásával végeztük. KIT és ERK foszforiláció analízise. Tumorbiopsziákat lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és késõbb porítottuk folyékony nitrogénnel hûtött „kriomozsár” és mozsártörõ alkalmazásával, azután –70 °C¹on tároltuk felhasználásig. KIT-analízis céljából a porított tumorokat homogenizáltuk, lízisnek vetettük alá és immunprecipitátumokat készítettünk 1 mg kiindulási tumorlizátumból, elõzõleg leírtak szerint [Abrams, T. J., Lee, L. B., Murray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M., „SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer”, Mol. Cancer Ther. 2, 471–478 (2003); melyet teljes egészében a kitanítás részének tekintünk], KIT¹re specifikus, agarózzal konjugált ellenanyag alkalmazásával (SC-1493AC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Ha több biopszia állt rendelkezésre, akkor ismételt immunprecipitációt/Western-blot-analízist végeztünk külön biopsziákon. Az egyes mintákban lévõ foszforilált KIT mennyiségét Western-blot-analízissel határoztuk meg olyan ellenanyag alkalmazásával, amely rágcsálóból származó KIT 719. foszfotirozinjára specifikus (3391; Cell Signaling Technology, Beverly, MA), amely megfelel a kutyából származó KIT 721. tirozinjának, és egy autofoszforilációs hely, és így KIT-kináz aktivitás pótlására szolgált. Az összes KIT analízisére a blotokat csíkokra vágtuk, újra blokkoltuk és újra vizsgáltuk KIT¹re specifikus ellenanyaggal (A¹4542; DAKO Corp., Carpinteria, CA). A p42/44 ERK analízisére ugyanazokat a tumorlizátumokat használtuk, mint amiket KIT-analízisre, ezeket Western-blot-analízisben „foszfo-Thr 202/Tyr 204 ERKI/2”¹re specifikus ellenanyaggal (9101B; Cell Signaling Technology) vizsgáltuk, azután csíkokra vágtuk és újravizsgáltuk összes ERK¹ra specifikus ellenanyaggal (9101; Cell Signaling Technology). Értékelhetõ tumorbiopszia-pároknak KIT¹re és ERK1/2¹re azokat tekintettük, amelyekre kimutatható összfehérje volt jelen a párban lévõ mindkét biopsziában. Célmodulációt

1

HU 006 436 T2

vizuálisan ítélte meg három megfigyelõ, akik nem tudták a JM¹állapotot és a plazmakoncentrációt. Ha a foszfoproteinben ³50%¹os csökkenés történt a kezelés után vett biopsziamintában lévõ összfehérje-mennyiséghez képest, akkor ezt pozitívnak értékeltük célmoduláció vonatkozásában, míg <50% csökkenést negatívnak értékeltünk. Eredmények. Tizennégy kutyát vontunk be ebbe a klinikai vizsgálatba, amelynek elsõdleges célja annak meghatározása volt, hogy vajon bekövetkezik¹e csökkenés KIT tirozin-foszforilációban azután, hogy orálisan beadtunk egyetlen dózis I. vegyület foszfátját. KIT tirozin-foszforilázt olyan foszfospecifikus ellenanyag alkalmazásával határoztunk meg, amely KIT-ben lévõ

2

autofoszforilációs helyre volt specifikus, ezáltal KIT-kináz aktivitás pótlására szolgált. Továbbá meghatároztuk a c-kit JM mutációs állapotot (ITD+ vagy ITD–) az alapállapothoz tartozó tumorbiopsziából, és mértük az 5 I. vegyület foszfátjának plazmakoncentrációját 8 órával a dózis beadása után, hogy összefüggést keressünk az említett paraméterek és a KIT-foszforiláció gátlása között. A 14 kutyából tizenegy értékelhetõ volt KIT-célmodulációra. Három, nem értékelhetõnek tartott kutyá10 ban nem volt kimutatható vagy nagyon lecsökkent az össz-KIT-fehérje mennyisége egy vagy mindkét biopsziában, és így nem lehetett értékelni célmodulációra. Minden kutyára kapott adatot bevontunk a vizsgálatba, és összefoglaltuk a 8. táblázatban.

8. táblázat Az összes, kísérletbe bevont páciensre kapott adatok összegzése

a

Páciens száma

Tumor foka

c-kit ITD mutáció jelen van

1.

III

igen

2.

III

igen

3.

II

igen

4.

III

5.

III

6.

I. vegyület foszfátja plazmakonc. dózis után (ng/ml)

P-KIT csökkenés dózis utána

P-ERK1/2 csökkenés dózis után

81,0

igen

nem

33,2

igen

nem

83,5

NE

igen

igen

98,0

igen

igen

igen

116,0

igen

igen

III

nem

121,0

igen

igen

7.

III

nem

186,0

NE

NE

8.

III

nem

0,3

igen

nem

9.

II

nem

103,0

NE

NE

10.

II

nem

111,0

nem

igen

11.

II

nem

158,0

nem

igen

12.

II

nem

65,3

igen

igen

13.

II

nem

95,4

nem

nem

14.

III

nem

119,0

igen

NE

NE: nem értékelhetõ, P¹KIT, foszfo-Tyr721 KIT, P¹ERK1/2, foszfo-Thr202/Tyr204 ERK1/2

A 14 vizsgált kutya közül 5 (36%) rendelkezett ITDvel, PCR-analízissel kimutatva (5. ábra, 1–5. sávok); mind az öt tumor bizonyítottan rendelkezett ITD-vel. Érdekes, hogy a 2. páciens látszólag elvesztette a vad típusú c-kit allélt. A többi 9 kutyából származó PCR-termékeket, amelyek nyilvánvalóan nem rendelkeztek ITD-vel (5. ábra, 6–14. sávok), rögtön szekvenáltunk, és nem mutattunk ki semmilyen típusú mutációt (inszerciót, deléciót vagy pontmutációt). A 3., 6., 8. és 9. sávokban genomi DNS¹t alkalmaztunk a PCR-reakcióba, ami valamivel kisebb (190 bp) vad típusú terméket eredményezett. Az MCT-kben expresszálódott összes és foszforilált KIT alap-szintje változó volt az állatokban. Nagyobb mértékû KIT-expresszió nagyobb tumor-fokozattal korrelált. A III. fokozatú, nyolc tumor közül négyben nagymértékû KIT-expresszió volt, a hat, II. fokozatú tumorok egyikéhez viszonyítva (6. ábra). A teljes KIT-expresszió mértéke a 2. páciensben kialakult tumorban

45

50

55

60

17

(III. fokozatú) jelentõsen magasabb, mint a 11. páciensben kialakult tumorban (II. fokozatú). III. fokozatú tumorokkal szenvedõ kutyákban szintén nagyobb gyakorisággal jelenik meg magas szintû foszforilált KIT az alapállapotban, mint II. fokozatú tumorokban, ami összhangban van elõrehaladott tumorokban c-kit ITDmutációk megnövekedett gyakoriságával és ennek következtében a ligandumfüggetlen foszforilált KIT megnövekedett szintjével. A hét értékelhetõ kutya közül ötben, amelyek III. fokozatú tumorokban szenvedtek, magas volt a foszforilált KIT szintje az alapállapotban; ezek közül négy pozitív volt ITD jelenlétére c-kitben. Csak egy, II. fokozatú tumorban volt jelentõs foszforilált KIT; ez az állat szintén ITD-mutáns c-kit¹et expresszált. A 11 értékelhetõ kutya közül nyolc pozitív lett célmodulációra, olyan kritérium alkalmazásával, hogy ³50%¹os csökkenés legyen a foszforilált KIT mennyiségében az összes KIT-hez viszonyítva az I. vegyület foszfátjával végzett kezelés után vett biopsziamintá-

1

HU 006 436 T2

ban, a kezelés elõtti mintához viszonyítva. Példákat a 6. ábrán mutatunk foszforilált KIT¹re és összes KIT¹re az I. vegyület foszfátjával végzett kezelés elõtt és után vett tumorbiopsziák immunprecipitátumaiban. Öt tumort (6. ábra, balra) értékeltünk pozitívnak célmodulációra, míg két tumort (6. ábra, jobbra) értékeltünk negatívnak. Azokat a biopsziapárok, amelyeket negatívnak értékeltünk KIT-foszforiláció gátlása tekintetében az I. vegyület foszfátjával végzett kezelés után, mind jelentõsen kevesebb foszforilált KIT¹et tartalmaztak az alaphelyzetben, mint azok, amelyeket pozitívnak értékeltünk (6. ábra). Abból a célból, hogy értékeljük az I. vegyület foszfátjának gátló hatásait a KIT-foszforiláció által szabályozott jeltovábbítási folyamatsorokra, a foszforilált MAPK ERK1/2 mennyiségét elemeztük úgy, hogy Western-blotban analizáltuk ugyanazokat a biopsziapárokat, mint amiket KIT-analízisre használtunk. 14 tumor közül 11 volt értékelhetõ foszfo-ERK1/2 célmodulációra (kettõ ezek közül szintén nem volt értékelhetõ KIT célmodulációra). A 11 értékelhetõ közül 7¹ben mutatkozott csökkenés a foszfo-ERK1/2 összes ERK1/2¹höz viszonyított arányában olyan tumorokban, amikbõl az I. vegyület foszfátjának beadása után vettünk mintát, az alaphelyzetben vett tumormintákhoz viszonyítva (lásd 6. ábrát). Az ERK célmodulációt nagyobb gyakorisággal mutattuk ki az alaphelyzetben magas ERK-expressziót és foszforilációt mutató MCTkben, mint azokban, amelyekben kevés ERK volt. Rágcsálómodellekben végzett, preklinikai vizsgálatokra alapozva, az I. vegyület terápiás tartománya célgátlásra 50–100 ng/ml-nek tekinthetõ 12 óra hosszáig egy 24 órás adagolási periódusban. Az I. vegyület foszfátjának plazmakoncentrációja egyetlen 3,25 mg/kg¹os dózis után 8 órával 33,2 és 186 ng/ml közötti tartományban volt, átlagosan 105±9 ng/ml (8. táblázat). Egy állatban az I. vegyület foszfátjának plazmakoncentrációja kívül esett a más minták által meghatározott tartományból (0,3 ng/ml). 14 kutya közül 12¹ben a plazmaszinteket olyannak tekintettük, hogy az abban a terápiás tartományban van, amit az I. vegyülettel végzett I. fázisú klinikai kísérletekben kialakítottak [London, C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien, M. B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post, G., Boucher., J., Shenoy, N., Mendel, D. B. and Cherrington, J. M., „Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies.”, Clin. Cancer Res. 2755–2768 (2003)]. Az átlagos plazmakoncentráció olyan kutyákban, amelyekben bizonyított volt a KIT célmoduláció (79,2±41 ng/ml), és olyanokban, amelyeket negatívan értékeltünk KIT célmoduláció tekintetében (137±36 ng/ml), szignifikánsan eltérõ volt (P=0,08). Diszkusszió. Ezt a korrelációs vizsgálatot abból a célból terveztük, hogy célmodulációt vizsgáljunk összehasonlítható klinikai populációban úgy, hogy vizsgáltuk az I. vegyület foszfátjának egyetlen, klinikailag hatásos dózisa által elõidézett hatásokat a KITfoszforilációra kutyában kifejlõdött MCT-kben, és az

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 18

2

azt követõ hatást az MAPK-kon keresztüli jeltovábbításra. Az I. vegyület foszfátjának vizsgálatban elért plazmakoncentrációit a várható Cmax közelében mértük, ami preklinikai farmakokinetikai vizsgálatokra alapult, és összhangban volt az I. fázisú klinikai vizsgálatokban mért drogszintekkel, amely vizsgálatok tárgya az I. vegyület hatásos dózisa és adagolási rendje volt (8. táblázat). A 11 értékelhetõ MCT biopsziapárból nyolcban (73%) volt kimutatható a KIT-aktiváció gátlása, amit foszforilált KIT mennyiségének csökkenésével mértünk az I. vegyület foszfátjának egyetlen orálisan beadott dózisa után. A három páciensben, amelyekben nem volt detektálható KIT célmoduláció a kezelés után, olyan MCT¹k voltak, amelyek alacsony szinten expresszáltak KIT¹et és foszfo-KIT¹et az alaphelyzetben. Ezekben a páciensekben szignifikáns mértékû célmoduláció hiánya a detektálási módszer technikai korlátainak tulajdonítható; a foszfospecifikus ellenanyag érzékenysége foszforilált KIT¹re a nem foszforilált KIT-hez képest valószínûleg nem volt elegendõ azokban a mintákban, amelyekben alaphelyzetben kismértékû volt a KIT-expresszió. KIT-aktivitás gátlása jobban korrelál az alaphelyzetben megfigyelt KIT-foszforilációval, mint a c-kit ITD-genotípussal. Celluláris vizsgálati eljárásokra alapozva elõre jelezhetjük, hogy mind a vad típusú, mint az ITD-mutáns KIT¹et gátolni lehet in vivo I. vegyület foszfátjával, mert az I. vegyület in vitro blokkolja a vad típusú és az ITD-mutáns KIT foszforilációját, összehasonlítható hatékonysággal. Az I. vegyület foszfátja a KIT-tõl kiinduló jeltovábbítási folyamatsort is befolyásolja. Leírták, hogy GIST és hematopoetikus malignitások esetén, c¹kit-ben mutációkat tartalmazó mutánsok különbözõ jeltovábbítási folyamatsorokat aktiválnak egymáshoz képest és vad típusú KIT-hez képest. Kutyákban elõforduló MCTkben egy kivételével valamennyi tumorminta kimutatható mennyiségû foszforilált ERK1/2¹t tartalmazott az alapállapotban. A 11 értékelhetõ tumor-biopsziapár közül 7¹ben az ERK1/2 gátolva volt, a foszforilált ERK1/2 mennyiségének csökkenésével mérve kezelés után. Az ERK1/2¹gátlás tekintetében pozitívnak értékelt tumorok nem mindegyike volt pozitív KIT-foszforiláció gátlására is. Az ERK1/2 cél-moduláció nem korrelált a tumor fokozatával vagy a c-kit ITD-mutációk jelenlétével vagy hiányával. Ahogyan KIT célmodulációt, úgy ERK1/2 célmodulációt is gyakrabban mutattunk ki olyan tumorokban, amelyek nagymértékben expresszáltak ERK1/2¹t és foszforilált ERK1/2¹t az alaphelyzetben. Ha kimutatunk gátlást az I. vegyület foszfátjának molekuláris célpontjára MCT¹k kezelése után, ez bizonyítékként szolgál az I. vegyület foszfátja által kifejtett célmodulálásra ebben a beállításban. Ennek a felismerésnek klinikai relevanciáját alátámasztja az összefüggés a molekuláris célpont gátlása és aközött, hogy a drog plazmakoncentrációi a terápiás tartományban vannak, és az elõzõleg leírt klinikai objektív válaszok az I. vegyületre MCT-kben szenvedõ olyan kutyapáciensekben, amelyekben aktiváló mutációk exp-

1

HU 006 436 T2

resszálódnak a célgénben, ezáltal bizonyított az I. vegyület foszfátjának koncepciója ebben a pácienspopulációban. Mivel a kutyákban más malignitásokat (például emlõkarcinóma, lágyszöveti szarkóma és mieloma multiplex) is tapasztaltunk, I. vegyülettel történõ kezelésre adott, tartós objektív válaszok, KIT-gátlás ilyen plazmakoncentrációnál ésszerûen extrapolálható az I. vegyület más, szerkezetileg nagyon hasonló, ilyen tumorok által expresszált receptor tirozin-kinázcélpontjainak sikeres gátlása céljából, az I. vegyület in vitro és in vivo hatékonysága alapján, ami ésszerû molekuláris alapot biztosít ilyen tumorokban elõidézhetõ objektív válaszokhoz. Például kutyában kialakult emlõtumorok VEGRF¹t expresszálnak, amelyet indolin-tirozin-kináz-inhibitorokkal lehet gátolni KIT-tel összehasonlítható koncentrációban celluláris in vitro vizsgálati eljárásokban [Liao, A. T., Chien, M. B., Shenoy, N., Mendel, D. B., McMahon, G., Cherrington, J. M. és London, C. A., „Inhibition of constitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors”. Blood 100, 585–593 (2002)]. Az I. vegyület foszfátja által kifejtett gátlás mind vad típusú, mind ITD-mutáns c¹kit¹re MCT-kben tehát pótlásként szolgálhat olyan rokon szerkezetû RTK-célpontok, VEGFR és PDGFR gátlására I. vegyület foszfátjával, amelyek rendellenesen expresszálódnak és/vagy szabályozottak különféle tumortípusokban. Végül, molekuláris célpont gátlása, összekapcsolva klinikai objektív válaszokkal kutyákban kialakult tumorok esetén, rokon szerkezetû vegyületek kifejlesztésére irányul humán rákbetegségekben olyan klinikai populációk esetén, amelyek aktivált KIT¹et, VEGFR¹t vagy PDGFR¹t expresszálnak. 8. példa: Az I. vegyület foszfátjának (orálisan beadva) multicentrikus, placebokontrollos, dupla vak, randomizált vizsgálata olyan kutyák kezelésében, amelyek kiújuló masztocita tumorokban szenvedtek Cél. Az I. vegyület foszfátját tartalmazó orális tabletták hatékonyságát elemeztük masztocita tumorok kezelésében ügyfelek által tartott állatokban, amelyek kiújuló, mérhetõ betegségben szenvedtek mûtét után, vak, negatív-kontrollált vizsgálatban. A vizsgálatban másnaponként adtunk I. vegyület foszfátból 3,25 mg szabad bázissal ekvivalens (FBE) mennyiségû dózisokat testtömeg-kg-ként, a betegség által adott választ értékeltük módosított válaszkritériumok (RECIST) alkalmazásával. A c-kit mutációk hiányát vagy jelenlétét masztocita tumorokban valószínûségi együtt-változóként elemeztük ebben a vizsgálatban. Döntéshozatali célokból a vizsgálat 6 hétig tartott. Százötvenhárom (153) kutyát random elosztottunk 4:3-arányban két kezelési csoport egyikébe: T01 (placebo, amelyben n=65) és T02 (I. vegyület foszfátja, amelyben n=88). Tíz állatorvosi onkológiai pacientúrát választottunk ki az USA-ban és felvettük az eseteket. A felvételhez a kutyáknak kiújuló masztocita tumorral kellett rendelkezniük (legalább egy célkárosodás leghosszabb átmérõjének minimálisan 20 mm¹nek kell

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

lennie)±beleértve a regionális nyirokmirigyet. Maximum három célkárosodást (mérhetõ masztocita tumorok) és minden nem cél károsodást (az összes többi károsodás, mérhetõ vagy nem méretõ) azonosítottunk az alapállapotban két elemzõ segítségével. A hatékonyság az objektív válaszra (teljes válaszra vagy részleges válaszra) alapult a 6 hetes vizitnél, ahol a célkárosodások leghosszabb átmérõinek összegét véve, a két elemzõ mérésének átlagát („Mean Sum LD”) viszonyítottuk az alapállapotban mért „Mean Sum LD”-értékhez, a százalékos csökkenés vagy növekedés számításához. A nem cél károsodások meghatározása szubjektív volt. A teljes választ (CR) úgy definiáltuk, hogy valamennyi cél- és nem cél károsodás eltûnt, és nem jelentek meg új károsodások; a részleges választ (PR) úgy definiáltuk, hogy a célkárosodások „Mean Sum LD”-értékében legalább 30% csökkenés volt az alapállapotban mért „Mean Sum LD”-értékhez képest, és nem cél károsodásokban progresszió nem történt, és nem jelentek meg új károsodások. A tumorból és távolabbról, normál bõrbõl szövetmintákat vettünk a randomizálás elõtt, és meghatároztuk a c-kit mutációs állapotot. Nyolcvanhat (86) T02- és 65 T01-állatot vettünk be a hatékonysági analízisbe. Az adatok analízise statisztikusan szignifikáns javulást mutatott a primer végpontban (objektív válasz) az I. vegyület foszfátja esetén (T02), a placebohoz (T01) viszonyítva. A T02-állatok szignifikánsan nagyobb objektív válaszaránnyal rendelkeztek (38,3%; 33/86) a T01-állatokhoz viszonyítva (7,9%; 5/63) (p<0,001). Közel kétszer annyi T01-állatban (66,7%; 42/63) tapasztaltunk progresszív betegséget a T02-állatokhoz képest (33,7%; 29/86). A T02csoportban lévõ kutyák, amelyek pozitívak voltak a ckit mutációra, majdnem kétszer akkora valószínûséggel adtak objektív választ azokhoz képest, amelyek negatívak voltak a c-kit mutációra (60%, 12/20, ezzel szemben: 32,8%, 21/64, sorrendben). Levonhatjuk azt a következtetést, hogy ez a vizsgálat kimutatta I. vegyület foszfátjának hatékonyságát orális tablettaként beadva kiújuló masztocita tumorok kezelésében, ügyfelek által tartott kutyákban. A fentebb bemutatott, szemléltetés célját szolgáló példákkal magyarázott találmány várhatóan számos módosítása és változata adódhat szakember számára. Emiatt ilyen korlátozásokat a következõ szabadalmi igénypontokban leírtak szerint kell alkalmazni a találmányra.

50 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Bázis sóformái, ahol a bázis 5¹[5¹fluor-2-oxo1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidén-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol55 3-karbonsav-(2¹pirrolidin-1-il-etil)-amid, és ahol a sóforma a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: citrát- és foszfátsók, és ezek szolvátjai és polimorfjai. 2. Az 1. igénypont szerinti sóforma, ahol a só a kö60 vetkezõ szerkezetû foszfátsó: 19

1

HU 006 436 T2

5

és ennek szolvátjai és polimorfjai. 3. A 2. igénypont szerinti sóforma, amely C22H25FN4O2.H3PO4 molekulaképlettel és körülbelül 285 és körülbelül 290 °C közötti olvadásponttal rendelkezik. 4. A 2. igénypont szerinti foszfátsó polimorfja (I. forma), ahol a polimorf por-röntgendiffrakciós spektruma által tartalmazott csúcsok két theta szög fokaiban kifejezve 20,8, 24,5, 25,9 és 27,0 (±0,1 fok), amelyhez CuKa1 emisszió (hullámhossz=0,15406 nm) alkalmazásával jutottunk. 5. Az 1. igénypont szerinti sóforma, ahol a só a következõ szerkezetû citrátsó:

10

15

20

25

30

35 és ennek szolvátjai és polimorfjai. 6. Az 5. igénypont szerinti sóforma, amely C22H25FN4O2.C6H8O7 molekulaképlettel, és körülbelül 178 és körülbelül 183 °C közötti olvadásponttal rendelkezik. 7. Az 5. igénypont szerinti sóforma, amelynek porröntgendiffrakciós mintázata által tartalmazott csúcsok két theta szög fokaiban kifejezve 9,1, 9,4, 14,2, 25,4 és 26,8 (±0,1 fok), amelyhez CuKa1 emisszió (hullámhossz=0,15406 nm) alkalmazásával jutottunk. 8. Gyógyászati készítmény, amely 2. igénypont szerinti foszfátsót, 5. igénypont szerinti citrátsót vagy ezek szolvátját vagy polimorfját, és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. 9. A 2. igénypont szerinti foszfátsó, az 5. igénypont szerinti citrátsó vagy ezek szolvátja vagy polimorfja,

40

45

50

20

2

protein-kinázok katalitikus aktivitásának modulálásában történõ alkalmazásra. 10. A 9. igénypont szerinti só, szolvát vagy polimorf, ahol a protein-kináz a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: receptor tirozin-kinázok, nem receptor protein-tirozin-kinázok és szerin/treonin protein-kinázok. 11. A 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, organizmusban protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség prevenciójában vagy kezelésében történõ alkalmazásra. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, ahol a protein-kinázzal összefüggõ rendellenesség masztocita tumor vagy masztocitózis. 13. Eljárás az 1. igénypont szerinti bázis foszfátsókristályainak elõállítására, amely magában foglalja a következõket: (a) sztöchiometriás mennyiségû foszforsav hozzáadása a bázishoz oldószert vagy oldószerek keverékét tartalmazó oldatban; (b) a foszfátsó kikristályosítása az oldatból; és (c) a foszfátsókristályok elválasztása az oldószert tartalmazó oldatból. 14. Eljárás a 2. igénypont szerinti foszfátsó polimorfjainak elõállítására, amely magában foglalja a következõket: (a) a foszfátsó hozzáadása oldószert vagy oldószerek keverékét tartalmazó oldathoz; (b) adott esetben hídképzõ oldószer hozzáadása az oldathoz; (c) a polimorf kristályok kikristályosítása az oldatból; és (d) a polimorf kristályok elválasztása az oldószert tartalmazó oldatból. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az (a) lépésbeli oldószer metanolt tartalmaz. 16. Eljárás az 1. igénypont szerinti bázis citrát-sókristályainak elõállítására, amely magában foglalja a következõket: (a) sztöchiometriás mennyiségû citromsav hozzáadása a bázishoz oldószert vagy oldószerek keverékét tartalmazó oldatban; (b) a citrátsókristályok kikristályosítása az oldatból; és (c) a foszfátsókristályok elválasztása az oldószert tartalmazó oldatból. 17. A 2. igénypont szerinti foszfátsó, az 5. igénypont szerinti citrátsó, vagy ezek szolvátjának vagy polimorfjának alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely abnormális PK¹aktivitás által közvetített betegség kezelésére alkalmas.

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

21

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

22

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

23

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

24

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

25

HU 006 436 T2 Int. Cl.: C07D 403/06

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest