!HU000004149T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 149
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 31/70
(21) Magyar ügyszám: E 06 111971 (22) A bejelentés napja: 2004. 10. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060111971 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1733730 A1 2006. 12. 20. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1733730 B1 2008. 07. 09.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 03078375 2003. 10. 24. 04076877 2004. 06. 25.
(73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL)
EP EP
(72) Feltalálók: Stahl, Bernd, 61191, Rosbach (DE); M’Rabet, Laura, 3824 WK, Amersfoort (NL); Vos, Arjan Paul, 6721 RP, Bennekom (NL); Garssen, Johan, 3433 DA, Nieuwegein (NL); Boehm, Günther, 61209, Echzell (DE) (54)
A61K 31/732 A61P 37/08 A61K 31/702
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Immunmoduláló oligoszacharidok
(57) Kivonat
HU 004 149 T2
A találmány tárgya oligoszacharidok alkalmazása immunbetegségek kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmas gyógyászati készítmények elõállítására. Közelebbrõl a találmány tárgya savas és semleges oligoszacharidok együttes alkalmazása emlõsök immunrend-
szerrel összefüggõ rendellenességeinek – például 1¹es típusú, 2¹es típusú, 3¹as típusú és 4¹es típusú allergia – kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmas gyógyászati készítmények elõállítására.
A leírás terjedelme 12 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 149 T2
A találmány alkalmazási területe A találmány tárgyát oligoszacharidok alkalmazása képezi immunbetegségek kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmas készítmények elõállítására. 5 A találmány mûszaki háttere Az immunrendszer különbözõ módokon reagálhat valamely antigénre. Az immunválasz típusa szempontjából döntõ lépés különbözõ T¹sejt szubpopulációk stimulációja. Az úgy nevezett Th1-sejtek elsõsorban citokineket termelnek, amelyek a celluláris immunválaszt (IFN¹g, IL–12, IL–2) stimulálják. Ezzel szemben a Th2sejtek elsõsorban IL–4¹et, IL–5¹öt és IL–10¹et termelnek. Ezek a citokinek IgE által közvetített allergiás reakciót és gyulladásos választ erõsítenek, és feltételezik, hogy ugyancsak szerepet játszanak az eozinofil sejtek (azaz eozinofil festéket felvevõ leukociták) toborzásában, proliferációjában, differenciálódásában, fenntartásában és túlélésében, ami eozinofíliához vezethet. Az eozinofília számos Th2 által közvetített betegség, például asztma, allergia és atópiás dermatitisz jellemzõje. Th1- és Th2-sejtekkel összefüggõ citokinek antagonista módon hatnak, és a Th1/Th2 válaszok normális fiziológiás körülmények mellett jól szabályozott egyensúlyban vannak. Sem a Th1¹, sem a Th2-válasz nincs túlsúlyban. Az egyensúly felborulása esetén a Th1- vagy Th2immunválasz dominanciája több kóros állapot létrejöttében játszik szerepet vagy felelõs annak kialakulásáért. Túlzott Th1-válasz végsõ soron autoimmunitáshoz, az egyén saját szervezetét alkotó anyagok károsodásához vezethet, például inzulindependens diabetes vagy sclerosis multiplex, Crohn-betegség, pemphigus vulgaris, autoimmun trombocitopéniás purpura, autoimmun hemolitikus anémia kialakulásához. Túlzott Th2-válasz túlzott érzékenységhez vezet idegen komponensekkel szemben, amelyeknek egyébként nem kellene immunológiai választ kiváltaniuk, ilyenek például az allergiák és azzal kapcsolatos betegségek, például atópiás dermatitisz, asztma, foglalkozási asztma, élelmiszer-allergia, [például tehéntej-allergia, almaallergia, mogyoróvaj- és más vajallergiák, farkasbab (lupin)-allergia], allergiás rhinitis (szénanátha), (például pollenallergia), poratka-allergia és a hiperszenzitivitás egyéb formái, mint például szisztémás anafilaxiák és akut urticaria (csalánkiütés). Relatív eltolódás a fokozott Th2-válasz felé és/vagy csökkent Th1válasz figyelhetõ meg mindenféle stresszállapotban, következésképp torzulás jön létre a Th2-válasz felé. Ilyen relatív eltolódás figyelhetõ meg például az immunöregedéssel („immunosenescence”) kapcsolatosan, daganatos betegekben, krónikus fertõzésekben, túlzott kimerülés, szociális konfliktusok vagy munkatúlterhelés kapcsán, toxikus komponensekkel történõ érintkezés vagy sugárzás hatására, alultápláltsághoz vezetõ metabolikus stressz hatására, anorexia által kiváltott cachexia (sorvadás) vagy alultápláltság hatására. [Janeway: Immunobiology 5. kiadás, Garland publishing ISBN 0¹8153-3642¹x (2001); Roitt és munkatársai: Immunology 6. kiadás, Harcourt publishing limited, ISBN-0-7234-31892) (2001)].
10
15
20
25
30
2
Bifidogén hatásoknak tulajdonítanak szerepet például bakteriális fertõzések visszaszorításában és/vagy megelõzésében. Ismert, hogy az oligoszacharidok bifidogén hatást fejthetnek ki. Savas oligoszacharidok elõnyös hatásait leírták. A WO 02/42 484 számú nemzetközi közzétételi irat észterezett pektinhidrolizátumokat ismertet fertõzés kezelésére és/vagy káros anyagok eukarióta sejtekhez történõ adhéziójának megelõzésére. A DE 4 223 613 számú német szabadalmi leírás eljárást ír le telítetlen uronidok elõállítására pektinszerû anyagokból, anaerob fermentációval, például pektát-liáz alkalmazásával. A készítmény alkalmazható nehézfém-intoxikáció gyógykezelésére. Savas és semleges oligoszacharidok kombinációit is leírták. Az EP 1 105 002 számú európai szabadalmi leírásban transzgalaktooligoszacharidokat, inulint és galakturonsav oligoszacharidokat tartalmazó prebiotikus készítmény leírását találjuk. Az US 657 6251 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szialilált oligoszacharidok (diszialo-N-tetraóz) és galaktooligoszacharidok kombinációját ismertetik organizmusok, például influenza adhéziójával kapcsolatos tünetek megelõzésére. A WO 01/60 378 számú nemzetközi közzétételi iratban telítetlen pektinhidrolizátum és semleges oligoszacharidok elegyeit írják le patogének adhéziójának megakadályozására epiteliális felszínekhez. Ismertek infant formulák, amelyek tartalmaznak lipidet, proteint, szacharidokat, vitaminokat és legalább egy összetevõt, amely a következõk közül választott: galaktózt, vagy annak származékát tartalmazó di¹ vagy magasabb molekulatömegû szacharidot, N¹acetil-neuraminsavat és annak származékát tartalmazó szacharidot (EP 1 332 759).
35
40
45
50
55
60 2
A találmány összefoglalása Mostanáig azt feltételezték, hogy (savas) oligoszacharidok adagolása elõnyös hatását a bifidogén flóra stimulálásán keresztül, és patogének epiteliális szövetekhez történõ adhézióját megakadályozva fejti ki. Meglepõ módon azt találtuk, hogy (savas) oligoszacharidok adagolása hatással van az immunrendszer mûködését jellemzõ szisztémás markerekre. Ez a megfigyelés új távlatokat nyit az oligoszacharidok alkalmazása terén, közelebbrõl, olyan betegségekben, amelyek legelõnyösebben az immunrendszer modulálásával kezelhetõk. A leírás szerinti értelemben „modulálás” vagy „modulál” kifejezésen adott jellemzõ, minõség, aktivitás, anyag vagy válasz fokozását vagy csökkentését értjük. Más szóval, meglepõ módon azt találtuk, hogy a savas oligoszacharidok és semleges oligoszacharidok képesek a szisztémás immunválaszt stimulálni. Ugyancsak meglepõ módon azt találtuk, hogy a különbözõ oligoszacharidok különbözõ stimuláló hatást gyakorolnak az immunrendszerre. Azt találtuk, hogy savas oligoszacharidok adása (relatív módon) stimulálja a Th1-választ és csökkenti a Th2-citokinek felszabadulását (például IL–10, IL–4 és IL–5). Ugyancsak azt találtuk, hogy savas oligoszacharidok és semleges oli-
1
HU 004 149 T2
goszacharidok kombinációjának beadása szinergista módon stimulálja az immunrendszert, közelebbrõl, a Th2-válasz elnyomása és a Th1-válasz fokozása által. A találmány egy további szempontja szerint, azt találtuk, hogy oligoszacharidok elõnyösen alkalmazhatók a Th1/Th2 válaszok egyensúlyának helyreállítására és a Th1/Th2 egyensúly felborulásával járó rendellenességek kezelésére és megelõzésére. Közelebbrõl meglepõ módon azt találtuk, hogy savas oligoszacharid adagolása semleges oligoszachariddal kombinálva képes a Th1/Th2 válaszok egyensúlyának helyreállítására és/vagy kedvezõ Th1/Th2 egyensúly fenntartására. Megfigyeltük továbbá, hogy savas oligoszacharid adagolása semleges oligoszachariddal kombinálva képes a Th1-válasz stimulálására. Úgy véljük, savas és semleges oligoszacharidok adása Th3-stimuláló hatású, azaz fokozza a szabályozó T¹sejt-aktivitást. Feltételezzük, hogy a Th1-stimuláció részben a Th2-válasz gátlásán keresztül valósul meg. Ezért a találmány tárgyát képezi savas és semleges oligoszacharid, elõnyösebben savas oligoszacharid és két kémiailag különbözõ semleges oligoszacharidok alkalmazása: – az immunrendszer modulálására; – az immunrendszer fejlõdésének stimulálására, közelebbrõl 0–1 éves korú humán szervezetben, – a szisztémás immunválasz fokozására; – Th1/Th2 egyensúly felborulásának kezelésére és/vagy megelõzésére; és/vagy – legelõnyösebben immunrendszer modulálásával kezelhetõ betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmas készítmény elõállítására; ahol az eljárás savas oligoszacharid adagolását tartalmazza, elõnyösen savas és semleges oligoszacharid, elõnyösebben savas oligoszacharid és két kémiailag különbözõ semleges oligoszacharidok adagolását. Más szavakkal, kijelenthetõ, hogy az említett oligoszacharid elõnyös hatást gyakorol gyulladásos citokinekre (Th1-válaszra). Ezenfelül savas oligoszacharid és semleges oligoszacharid kombinációja elõnyös hatást gyakorol a gyulladásos citokinekre (Th2-válaszra). A találmány részletes ismertetése A jelen találmány az 1. igénypont szerinti alkalmazásra vonatkozik. Immunrendszerrel összefüggõ rendellenesség Azt találtuk, hogy savas oligoszacharidok adása, elõnyösen semleges oligoszacharidokkal kombinálva, az egyénre elõnyös szisztémás hatású. Szisztémás kifejezésen az egész szervezetet érintõ hatást értünk, a (szisztémás) vér- és/vagy nyirokkeringésre gyakorolt hatás révén. A találmány egy szempontja szerint a találmány tárgyát képezi savas és semleges oligoszacharidok alkalmazása az immunrendszer modulálására és/vagy stimulálására alkalmas készítmény elõállítására. Ez az alkalmazás elõnyös a Th1/Th2 válasz egyensúlyának biztosítására, elsõsorban a Th1-válasz stimulálása által. Ennek megfelelõen, ugyancsak a találmány tárgyát
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
képezik például az immunrendszer érésének stimulálására, az immunrendszer erõsítése által a kórokozókkal szemben mutatott ellenállás fokozására és/vagy az immunrendszer támogatására népszerûsített oligoszacharido(ka)t tartalmazó készítmények. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi eljárás immunrendszerrel kapcsolatos rendellenesség kezelésére és/vagy megelõzésére, amely eljárás savas oligoszacharid terápiásan hatékony mennyiségének beadását tartalmazza az említett emlõsnek. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi savas és semleges oligoszacharidok alkalmazása valamely emlõsben az immunválasz fokozására alkalmas készítmény elõállítására. Különösen meglepõ volt az a megfigyelés, hogy a jelen oligoszacharidok enterális adagolása kiváltja az elõnyös szisztémás hatást. Ennélfogva a találmány szerinti alkalmazás elõnyösen a savas és semleges oligoszacharid enterális, még elõnyösebben az orális adagolását tartalmazza. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány szerinti alkalmazás oligoszacharidok kisgyermekeknek, elõnyösen 0–6 év közti, elõnyösen 0 és 1 év közti humán egyéneknek történõ beadására vonatkozik. Mivel ebben a csoportban különösen jellemzõ a Th1/Th2 arány eltolódása (a Th2 számos esetben dominál), a találmány szerinti alkalmazás elõnyös lehet ebben a populációban az egyensúly helyreállítására. Savas oligoszacharid adása, elõnyösen semleges oligoszachariddal kombinálva, ugyancsak elõsegítheti az újszülöttek (gyomor¹)bél-rendszerének érését, ami a találmány szerinti alkalmazást különösen elõnyössé teszi koraszülött csecsemõknek történõ beadásra. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti alkalmazáson az immunrendszer érésének stimulálását értjük 0–6 év közti, elõnyösen 0 és 1 év közti humán egyéneknek. További elõnyös készítményjellemzõk, például a készítményben alkalmazható proteinek, szénhidrátok, lipidek, ozmolaritás, viszkozitás és energiatartalom leírását az alábbiakban adjuk meg. Az immunrendszerrel kapcsolatos rendellenesség 1¹es típusú allergia, 2¹es típusú allergia, 3¹as típusú allergia, 4¹es típusú allergia közül választott. Kezelhetõ allergiák közé tartoznak 1¹es típusú allergiák; atópia, asztma, szénanátha, ekcéma, ételallergia, gyógyszerallergia. 2¹es típusú allergiák: újszülöttek hemolitikus betegsége, autoimmun hemolitikus anémia, spondilitisz ankilopoetika, akut anterior uvetitis. 3¹as típusú allergiák: arthus reakció, szérumbetegség. 4¹es típusú allergiák: késõi típusú hiperszenzitivitás, kontaktérzékenység, cöliákia.
Savas oligoszacharidok A találmány szerinti alkalmazás savas oligoszacharidja 2 és 250 közti polimerizációs fokú, és pektinbõl vagy alginátokból van elõállítva. Savas oligoszacharidon legalább egy, a következõk 60 közül választott savas csoportot tartalmazó oligosza55
3
1
HU 004 149 T2
charidokat értünk: N¹acetil-neuraminsav, N¹glikoloilneuraminsav, szabad vagy észterezett karboxilsav, kénsavcsoport és foszforsavcsoport. A savas oligoszacharid elõnyösen polihexóz. Elõnyösen a fent említett savas csoportok legalább egyike a savas oligoszacharid terminális hexózánál található. Elõnyösen a savas oligoszacharid az 1. ábrán bemutatott struktúrájú, ahol a terminális hexóz (balra) elõnyösen kettõs kötést tartalmaz. Elõnyösen a savas oligoszacharid karboxilsavat tartalmaz a terminális hexózegységen, ahol az említett karboxilsavcsoport lehet szabad vagy észterezett. A jelen találmány szerinti alkalmazásban alkalmazható észterezett pektinhidrolizátumok elõállítására alkalmas eljárások ismertetését találjuk a WO 01/60 378 és/vagy WO 02/42 484 számú nemzetközi közzétételi iratokban. A terminális hexózegysége(ke)n kívüli további hexózegységek elõnyösen uronsavegységek, még elõnyösebben galakturonsavegységek. Ezeken az egységeken a karboxilsavcsoportok lehetnek szabadok vagy (részben) észterezettek, és elõnyösen legalább 10%ban metilált (lásd az alábbiakban). 1. ábra Polimer savas oligoszacharid
szacharidokra vonatkozó szabadalmi bejelentésünkben ismertettük (WO 0/160 378 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés). Elõnyösen a savas oligoszacharidok egy, elõnyö5 sen két terminális uronsavegységet tartalmaz, amely lehet szabad vagy észterezett. Elõnyösen a terminális uronsavegység a következõk közül választott: galakturonsav, glukuronsav, guluronsav, iduronsav, mannuronsav, riburonsav és alturonsav. Ezek az egységek le10 hetnek szabadok vagy észterezettek. A találmány egy még elõnyösebb megvalósítási módja szerint a terminális hexózegység kettõs kötést tartalmaz, elõnyösen a terminális hexózegység C4 és C5 pozíciója között. Elõnyösen a terminális hexózegység egyike tartalmazza a 15 kettõs kötést. A terminális hexóz (például uronsav) elõnyösen a 2. ábra szerinti általános képletû. 2. ábra Elõnyös terminális hexóz savas csoport 20
25
30
ahol: R jelentése elõnyösen az alábbi csoportból választott: hidrogén, hidroxi vagy savas csoport, elõnyösen hidroxi; és R2, R3, R4 és R5 közül legalább az egyik jelentése N¹acetil-neuraminsav, N¹glikoloil-neuraminsav, szabad vagy észterezett karboxilsav, kénsavcsoport és foszforsavcsoport, és a fennmaradó R2, R3, R4 és R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R2, R3, R4 és R5 egyikének jelentése N¹acetil-neuraminsav, N¹glikoloil-neuraminsav, szabad vagy észterezett karboxilsav, kénsavcsoport és foszforsavcsoport, és a fennmaradók jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben, R2, R3, R4 és R5 közül az egyik jelentése szabad vagy észterezett karboxilsav, és a fennmaradó R2, R3, R4 és R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; n egész szám, és a hexózegységek számát jelöli (lásd még „A polimerizáció mértéke” címû alpontot az alábbiakban), amely bármely hexózegység lehet. Elõnyösen n jelentése 1–5000 közötti egész szám. Elõnyösen a hexózegység(ek) uronsavegység(ek). Legelõnyösebben R1, R2 és R3 jelentése hidroxi, R4 jelentése hidrogén, R5 jelentése karboxilsav, n 1 és 250 közé, elõnyösen 1 és 10 közé esõ bármely szám, és a hexózegység galakturonsav. A jelen találmány szerinti alkalmazásban elõnyösen alkalmazható savas oligoszacharidok kimutatását, meghatározását és analizálását korábbi, savas oligo-
2
35
40
45
50
55
60 4
ahol: R jelentése elõnyösen hidrogén, hidroxi vagy savcsoport, elõnyösen hidroxi (lásd a fentiekben); és R2, R3, R4 és R5 közül legalább az egyik jelentése N¹acetil-neuraminsav, N¹glikoloil-neuraminsav, szabad vagy észterezett karboxilsav, kénsavcsoport és foszforsavcsoport, és a fennmaradó R2, R3, R4 és R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Elõnyösen az R2, R3, R4 és R5 egyikének jelentése N¹acetil-neuraminsav, N¹glikoloilneuraminsav, szabad vagy észterezett karboxilsav, kénsavcsoport és foszforsavcsoport, és a fennmaradók jelentése hidroxi és/vagy hidrogén. Még elõnyösebben, R2, R3, R4 és R5 közül az egyik jelentése szabad vagy észterezett karboxilsav, és a fennmaradó R2, R3, R4 és R5 jelentése hidroxi és/vagy hidrogén; n egész szám, és a hexózegységek számát jelöli (lásd még „A polimerizáció mértéke” címû alpontot az alábbiakban), amely bármely hexózegység lehet. Elõnyösen n jelentése 1–5000 közötti egész szám, amely a hexózegységek számát jelöli, ahol a hexózegység elõnyösen uronsav, még elõnyösebben galakturonsavegység. Ezeknek az egységeknek a karboxilsavcsoportja lehet szabad vagy (részlegesen) észterezett, és elõnyösen legalább részben metilált. Legelõnyösebben, R2 és R3 jelentése hidrogén, és R5 jelentése szabad vagy észterezett karboxilsav. A találmány egy további megvalósítási módja szerint, savas oligoszacharidok keverékét alkalmazzuk, amely különbözõ DP¹értékûek (polimerizációfok, Degree of polymerisation, DP) és/vagy mind telítetlen, mind telített terminális hexózegységet tartalmaz. Elõnyösen a savas oligoszacharidok terminális hexózegységeinek legalább 5%¹a, elõnyösebben legalább 10%¹a, még elõnyösebben legalább 25%¹a telítetlen hexózegység
1
HU 004 149 T2
(lásd 2. ábra). Mivel minden egyes savas oligoszacharid elõnyösen csak egy telítetlen terminális hexózegységet tartalmaz, elõnyösen a terminális hexózegységek nem több mint 50%¹a telítetlen hexózegység (azaz kettõs kötést tartalmaz). A savas oligoszacharidok keveréke elõnyösen 2–50%, elõnyösen 10–40% telítetlen hexózegységet tartalmaz a hexózegységek teljes számához képest. A jelen találmány szerinti alkalmazásban alkalmazott savas oligoszacharid polimerizációfoka („degree of polymerisation”, DP) 2 és 250 közé, elõnyösen 2 és 50 közé, legelõnyösebben 2 és 10 közé esik. Amennyiben különbözõ polimerizációfokú oligoszacharidok keverékét alkalmazzuk, a savas oligoszacharid keverék átlagos DP¹értéke 3 és 250 közé, elõnyösebben 3 és 50 közé esik. Lásd az 1. ábrát, ahol az „n” összeg és a terminális egység (azaz n+1) a polimerizációfokot jelenti. Azt találtuk, hogy az oligoszacharidok alacsonyabb DP¹értéke javítja az ízletességet, és alacsonyabb viszkozitással rendelkezõ terméket eredményez, amennyiben a savas oligoszacharidot folyadék formájában adjuk be. A savas oligoszacharid lehet homogén vagy heterogén szénhidrát. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott savas oligoszacharidot pektinbõl vagy alginátból állítják elõ. A savas oligoszacharidok elõállíthatók a WO 01/60 378 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint. Az alginátok b¹(1®4)-kötésû D¹mannuronsavat és a(1®4)-kötésû L¹glukuronsavat tartalmazó lineáris, el nem ágazó polimerek, amelyek molekulatömege széles (100–10 000 egység) tartományba eshet. Alginát elõállítható például hínárból és baktériumeredetû alginátokból. A pektint két fõ csoportba osztjuk: magas fokban metoxilált pektin, amelyet 50% feletti metoxilálási fok jellemez, alacsony fokban metoxilált pektin, amelyet 50% alatti metoxilálási fok jellemez. A leírás szerinti értelemben „metoxilálási fokon” (másképp DE vagy „észterezési fok”) azt értjük, hogy a poligalakturonsavláncban a szabad karboxilcsoportok milyen mértékben vannak észterezve (például metilálással). A találmány szerinti savas oligoszacharid elõnyösen magas fokban metoxilált pektinbõl készül. A savas oligoszacharidokat elõnyösen 20% feletti, elõnyösebben 50% feletti, még elõnyösebben 70% feletti metoxilálási fok jellemzi. Elõnyösen a savas oligoszacharidokat 20% feletti, elõnyösebben 50% feletti, még elõnyösebben 70% feletti metilálási fok jellemzi. A savas oligoszacharidot elõnyösen napi 10 mg és 100 gramm mennyiségben, elõnyösebben napi 100 mg és 50 gramm, még elõnyösebben napi 0,5 gramm és 20 gramm mennyiségben adjuk be. Semleges oligoszacharidok A leírásban használt értelemben semleges oligoszacharidokon 2 feletti, elõnyösebben 3 feletti, még elõnyösebben 4 feletti, legelõnyösebben 10 feletti monoszacharid polimerizácófokú szacharidokat értünk, amelyek a bélben nem vagy csak részben emésztõd-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
nek meg a humán gyomor-bél rendszer felsõ szakaszában (vékonybél és gyomor) jelen lévõ savak vagy emésztõenzimek hatására, a humán bélflóra által azonban fermentálódnak, és elõnyösen savas csoportokat nem tartalmaznak. A semleges oligoszacharid a savas oligoszacharidtól strukturálisan (kémiailag) eltér. A leírás szerinti értelemben a semleges oligoszacharid kifejezést 60 monoszacharidegység alatti, elõnyösen 40 alatti, még elõnyösebben 20 alatti, legelõnyösebben 10 alatti oligoszacharid polimerizációfokú szacharidokra vonatkoztatva használjuk. Monoszacharidegységen zárt gyûrûstruktúrájú egységeket értünk, elõnyösen hexózt, például a piranóz vagy furanóz formákat. A semleges oligoszacharid elõnyösen legalább 90%, elõnyösebben legalább 95% monoszacharidegységet tartalmaz, amely a következõk közül választott: mannóz, arabinóz, fruktóz, rukóz, rhamnóz, galaktóz, b¹D-galaktopiranóz, ribóz, glükóz, xilóz vagy azok származékai, az abban található monoszacharidegységek összes számát figyelembe véve. Az arra alkalmas semleges oligoszacharidokat a bélflóra fermentálja. A találmány szerint a semleges oligoszacharidok a következõk közül választottak: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek, galaktooligoszacharidok (transzgalaktooligoszacharidokat beleértve), xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glükooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok és azok keverékei. Legelõnyösebben a semleges oligoszacharidok a következõk közül választottak: fruktooligoszacharidok, galaktooligoszacharidok és transzgalaktooligoszacharidok. Alkalmazható oligoszacharidokat és elõállításukra alkalmas eljárásokat ismertet Laere K. J. M. [Laere, K. J. M.: Degradation of structurally different non-digestable oligosaccharides by intestinal bacteria: glycosylhydrolases of Bi adolescentis. PhD tézisek (2000), Wageningen Agricultural University, Wageningen, Hollandia]. Transzgalaktooligoszacharidokat (TOS) például Vivinal™ védjegy alatt forgalmaznak (Borculo Domo Ingredients, Hollandia). Emészthetetlen dextrin, amely gabonakeményítõ pirolízisével állítható elõ, a(1®4) és a(1®6) glikozidkötéseket tartalmaz, akár a natív keményítõ, és 1®2 és 1®3 kötéseket, valamint levoglukozánt tartalmaz. Az említett strukturális jellemzõk miatt az emészthetetlen dextrin jól kialakult, elágazó részecskéket tartalmaz, amelyeket a humán emésztõenzimek részben hidrolizálnak. Emészthetetlen oligoszacharidok számos más, kereskedelmi forgalomban levõ forrásból hozzáférhetõk, és szakember számára jól ismertek. Például, transzgalaktozidázt forgalmaz a Yakult Honsha Co., Tokió, Japán. Szójababoligoszacharid hozzáférhetõ a Calpis Corporation cégtõl, amelyet az Ajinomoto U. S. A. Inc., Teaneck, N. J. forgalmaz. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint, a jelen alkalmazás két, eltérõ kémiai szerkezetû oligoszacharid beadását tartalmazza. Úgy találtuk, hogy sa-
1
HU 004 149 T2
vas oligoszacharid két, kémiailag eltérõ semleges oligoszachariddal kombinálva optimális hatást biztosít. A találmány szerinti alkalmazás elõnyösen a következõk beadását tartalmazza: – savas oligoszacharidok (lásd fentebb); – galaktózalapú, semleges oligoszacharid (a monoszacharidegységek több mint 50%¹a galaktóz), amely elõnyösen lehet galaktooligoszacharid és transzgalaktooligoszacharid; és – fruktóz- és/vagy glükózalapú, semleges oligoszacharid (a monoszacharidegységek több mint 50%¹a fruktóz és/vagy glükóz, elõnyösen fruktóz), elõnyösen inulin, fruktán és/vagy fruktooligoszacharid, legelõnyösebben hosszú láncú fruktooligoszacharid (átlagos DP 10 és 60 között). Ez a készítmény különösen alkalmas 0–1 éves csecsemõknek történõ beadásra. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti alkalmazás két, (kémiailag) eltérõ struktúrájú oligoszacharid beadását tartalmazza, ahol a két, szerkezetileg (kémiailag) eltérõ oligoszacharid glikozidkötésük típusa alapján különböztethetõ meg. Elõnyösen az alkalmazás két, kémiailag eltérõ semleges oligoszacharid beadását tartalmazza, amely két, kémiailag eltérõ semleges oligoszacharid polimerizációfoka, és/vagy átlagos polimerizácófoka, elõnyösen átlagos polimerizácófoka különbözik. Eltérõ átlagos polimerizációfokú, kémiailag eltérõ semleges oligoszacharidok beadásának egy további megvalósítási módja még optimálisabb immunmoduláló hatást biztosít. Elõnyösen galaktózalapú semleges oligoszacharidok átlagos polimerizácófoka 2–10, és fruktóz- és/vagy glükózalapú semleges oligoszacharidok átlagos polimerizációfoka 10–60. A semleges oligoszacharidot elõnyösen naponta 10 mg és 100 g közötti mennyiségben, elõnyösebben 100 mg és 50 g közötti mennyiségben, még elõnyösebben 0,5 g és 20 g közötti mennyiségben adjuk be. Savas és semleges oligoszacharidok szinergista hatása Savas és semleges oligoszacharidok szinergista immunstimuláló hatását figyeltük meg. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti alkalmazás savas oligoszacharidok és semleges oligoszacharidok terápiásan hatékony mennyiségének a beadását tartalmazza. A savas oligoszacharidok és semleges oligoszacharidok elegyét elõnyösen naponta 10 mg és 100 g közötti mennyiségben, elõnyösebben 100 mg és 25 g közötti mennyiségben, még elõnyösebben 0,5 g és 20 g közötti mennyiségben adjuk be. Savas oligoszacharid és semleges oligoszacharid egy elõnyös kombinációja a 2. ábra szerinti savas oligoszacharidot, ahol: R jelentése hidrogén, hidroxi- vagy savcsoport, elõnyösen hidroxi; R2, R3, R4 és R5 egyikének jelentése szabad vagy észterezett karboxilsav, és a fennmaradó R2, R3, R4 és R5 jelentése hidroxicsoport vagy hidrogén; és galaktooligoszacharidot és/vagy transzgalaktooligoszacharidot tartalmaz.
2
A savas oligoszacharidokat és a semleges oligoszacharidokat elõnyösen 0,01:1 és 1:0,01, elõnyösebben 1,0:1 és 1:0,1 közötti tömegarányban adjuk be. LCPUFA Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a jelen alkalmazás hosszú láncú, többszörösen telítetlen sav („longchain polyunsaturated acid”, LCPUFA) beadását tartalmazza. Mivel úgy vélik, hogy a savas oligoszacharidok10 tól és a semleges oligoszacharidoktól eltérõ mechanizmus révén hatnak az immunválaszra, feltételezzük, hogy az LCPUFA-vegyületek oligoszacharidokkal kombinálva szinergista módon hatnak. A jelen alkalmazás naponta 0,1 és 100 g közötti, elõnyösen naponta 1 és 25 g közötti 15 mennyiségû LCPUFA beadását tartalmazza. 5
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
Élelmiszerek Úgy találtuk, hogy savas oligoszacharidok, és elõnyösen savas oligoszacharidok és semleges oligoszacharidok szinergista hatású elegyei elõnyösen alkalmazhatók élelmiszerben, például csecsemõtápszerben és gyógytápszerben. Az ilyen élelmiszerek elõnyösen lipidet, proteint és szénhidrátot tartalmaznak, és azokat elõnyösen folyadék formájában adják be. A leírásban „folyadék tápszer” kifejezésen olyan száraz tápszert (például porokat) értünk, amelyhez utasítást csatoltak arra nézve, hogyan kell a fenti száraz tápszerelegyet megfelelõ folyadékkal (például vízzel) elegyíteni. Ennek megfelelõen, ugyancsak a találmány tárgyát képezi tápszerkészítmény, amely elõnyösen 5–50 en% lipidet, 10–60 en% proteint, 15–90 en% szénhidrátot és a találmány szerinti savas oligoszacharidokat tartalmaz, elõnyösen a semleges oligoszacharidokkal kombinálva. Elõnyösen a találmány szerinti tápszerkészítmény 10–30 en% lipidet, 15–40 en% proteint, 25–75 en% szénhidrátot tartalmaz (az en% az energiaszázalék rövidítése, és az egyes összetevõk azon relatív mennyiségét jelöli, amellyel az hozzájárul a készítmény összes kalóriaértékéhez). Az ilyen tápszer elõnyösen folyadék formájú és korlátozott viszkozitású. Úgy találtuk, hogy a kívánt esetben semleges oligoszacharidokkal kombinált savas oligoszacharidokat tartalmazó tápszerek megfelelõen alacsony viszkozitású, folyékony élelmet képeznek, amely folyékony csecsemõtápszerként vagy gyógytápszerként alkalmazható, és amely csövön vagy szívószálon át beadható, amíg alacsony viszkozitását megtartja. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a jelen készítmény viszkozitása 600 mPa·s, elõnyösen 250 mPa·s, elõnyösebben 50 mPa·s és még elõnyösebben 25 mPa·s alatti érték, 100 s–1 nyírási sebesség mellett, 20 °C¹on. A leírásban a „viszkozitás” kifejezés arra a fizikai paraméterre utal, amelyet az alábbi eljárással határozunk meg: A viszkozitást Carri-Med CSL reométerrel határozhatjuk meg. Az alkalmazott geometria kúpos forma (akril kúp, 6 cm, 2 deg), és a lemez és a geometria közötti rést 55 mm¹re állítjuk. Lineáris, folyamatosan emelkedõ nyírási sebességet alkalmazunk, 0¹tól 150 s –1¹ig, 20 másodperc alatt.
1
HU 004 149 T2
Elõnyösen növényi lipideket alkalmazunk. A növényi lipid legalább egyike elõnyösen a következõk közül választott: szójaolaj, pálmaolaj, kókuszolaj, pórsáfrányolaj, napraforgóolaj, kukoricaolaj, kanolaolaj és lecitinek. Kívánt esetben, állati zsírok, például tejzsírok is hozzáadhatók a készítményhez. A tápszerkészítményben alkalmazott proteinek elõnyösen az alábbi csoportból választottak: nem humán állati proteinek (például tejproteinek, húsproteinek és tojásproteinek), növényi proteinek (például szójaproteinek, búzaproteinek, rizsproteinek és borsóproteinek), szabad aminosavak és azok elegyei. Igen elõnyösek a tehéntejproteinek, például kazein és savóproteinek. A tápszerkészítményhez hozzáadható emészthetõ szénhidrátforrás. Ez utóbbi elõnyösen a tápszerkészítmény energiatartalmának körülbelül 40–80%¹át teszi ki. Bármely megfelelõ szénhidrát (¹forrás) alkalmazható, például szacharóz, laktóz, glükóz, fruktóz, szilárd halmazállapotú gabonaszirup, maltodextrinek és azok elegyei. Elõnyösen a találmány szerinti készítmény lényegében élõ bifidogén baktériumoktól mentes. Sok folyékony tápszerrel táplált csecsemõnél komoly problémát jelentenek a széklet-rendellenességek, például túl kemény széklet, elégtelen székletmennyiség, hasmenés. Azt tapasztaltuk, hogy a székletproblémák (például hasmenés) csökkenthetõk a találmány szerinti oligoszacharidok olyan folyékony tápszerben történõ beadásával, amelynek ozmolaritása 50–500 mOsm/kg, elõnyösebben 100–400 mOsm/kg közé esik. A fentiek tükrében az is lényeges, hogy a folyékony élelmiszernek ne legyen túl magas energiatartalma, elegendõ kalóriát biztosítson azonban az egyén táplálásához. Ennek megfelelõen a folyékony élelmiszer elõnyösen 0,1–2,5 kcal/ml (0,42–10,5 kJ/ml), még elõnyösebben 0,5–1,5 kcal/ml (2,1–6,3 kJ/ml) energiatartalmú. Csecsemõtápszer-készítmény („infant formula”) Azt találtuk, hogy a készítmény elõnyösen alkalmazható csecsemõtápszerként. Az ilyen csecsemõtápszer elõnyösen lipidet, proteint és szénhidrátot tartalmaz és azt folyadék formájában alkalmazzák. A leírásban alkalmazott „folyékony tápszer” kifejezés magában foglal olyan száraz élelmiszert (például porokat), amelyhez utasítást csatoltak arra nézve, hogy az adott száraz élelmiszer-keveréket megfelelõ folyadékkal (például vízzel) kell elegyíteni. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi csecsemõtápszer-készítmény, amely 5–60 en% lipid, 5–40 en% protein, 15–90 en% szénhidrát és a találmány szerinti oligoszacharidok és LC¹PUFA kombinációját tartalmazza. Elõnyösen a találmány szerinti csecsemõtápszer-készítmény 30–60 en% lipidet, 6–15 en% proteint és 25–75 en% szénhidrátot tartalmaz (a leírásban az en% rövidítés energia%¹ot jelent, és azt a relatív mennyiséget jelöli, amellyel az egyes összetevõ hozzájárul a készítmény összes kalóriaértékéhez). Elõnyösen növényi lipidek és legalább egy, a következõk közül választott olaj kombinációját alkalmazzuk:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
halolajat, valamint omega¹3 zsírsavat tartalmazó növényi, alga- vagy baktériumeredetû olajakat. A tápszerkészítményben alkalmazott proteinek elõnyösen nem humáneredetû állati proteinek (például tejproteinek, húsproteinek és tojásproteinek), növényi proteinek (például szójaprotein, búzaprotein, rizsprotein és borsóprotein), szabad aminosavak és azok elegyei közül választottak. Különösen elõnyös a tehéntejbõl származó nitrogénforrás, közelebbrõl tehéntejeredetû proteinek, például kazein és savófehérjék. A tápszerkészítményhez emészthetõ szénhidrátforrás adható. Az emészthetõ szénhidrátok elõnyösen a tápszerkészítmény energiatartalmának körülbelül 40–80%¹át teszik ki. Bármely megfelelõ szénhidrát (¹forrás) alkalmazható, például szacharóz, laktóz, glükóz, fruktóz, szilárd halmazállapotú gabonaszirup, maltodextrinek és azok elegyei. Egy különösen elõnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti csecsemõtápszer 7–12 energia% proteint, 40–55 energia% szénhidrátot, és 35–50 energia% zsírt tartalmaz. Mivel a készítmény igen elõnyösen alkalmazható csecsemõ allergiás reakcióinak mérséklésére, a csecsemõtápszer proteinjei elõnyösen a következõk közül választottak: hidrolizált tejprotein (például hidrolizált kazein vagy hidrolizált savóprotein), növényi protein és/vagy aminosavak. Ezen proteinek alkalmazása tovább csökkentik csecsemõk allergiás reakcióit. Sok folyékony tápszerrel táplált csecsemõnél komoly problémát jelentenek a széklet-rendellenességek, például túl kemény széklet, elégtelen székletmennyiség, hasmenés). Azt tapasztaltuk, hogy a székletproblémák (például hasmenés) csökkenthetõk a találmány szerinti oligoszacharidok olyan folyékony tápszerben történõ beadásával, amelynek ozmolaritása 50–500 mOsm/kg, elõnyösebben 100–400 mOsm/kg közé esik. A jelen alkalmazásnak megfelelõ készítmény funkcionalitás és molekuláris struktúra tekintetében egyaránt nagymértékû hasonlóságot mutat a természetes, humán anyatejjel. Ennek megfelelõen a készítmény elõnyösen alkalmazható csecsemõtápszerként. A készítmény tartalmaz zsírt, szénhidrátot és proteint; és 100 ml folyadéktermékre vonatkoztatva tartalmaz 0,5–1 g, elõnyösen 0,7–0,9 g oldható, emészthetetlen oligoszacharidot. Ezenfelül a készítmény 100 ml folyadéktermékre vonatkoztatva tartalmaz 0,4–0,7 g transzgalaktooligoszacharidot [b-kötésû szacharidokat tartalmazó, emészthetetlen (galaktóz)n-glükózt; ahol n értéke 1–60 közti egész szám, például 2, 3, 4, 5, 6,…, 59, 60; elõnyösen n értéke 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 közül választott]; és 0,01–0,1 g inulint [legalább 10 b¹kötésû fruktóz egység láncot tartalmazó, emészthetetlen, poliszacharid szénhidrátot]; és 0,04–0,3 g savas oligoszacharidot, amint azt a 2. ábra mutatja. A folyadékterméket a fogyasztó megfelelõen elõállíthatja por formájú termékbõl. A folyadéktermék a leírásban fentebb és alább ismertetett összetevõket tartalmazza és jellemzõket mutatja, és a leírásban ismertetettek szerint alkalmazható.
1
HU 004 149 T2
A savas oligoszacharidot 0,1 tömeg%¹ot meghaladó, elõnyösen 0,2 tömeg%¹ot meghaladó, még elõnyösebben 0,5 tömeg%¹ot meghaladó és legelõnyösebben 1 tömeg%¹ot meghaladó mennyiségben adjuk a találmány szerinti készítményhez, a készítmény összes tömegére vonatkoztatva. Bár az oligoszacharidok jelentõs mennyiségének a beadása általában nem vezet nem kívánt mellékhatások kialakulásához, a találmány szerinti készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen 20 tömeg% alatt, elõnyösebben 10 tömeg% alatt, még elõnyösebben 5 tömeg% alatt marad. A semleges oligoszacharidot a 0,1 tömeg%¹ot meghaladó, elõnyösen 0,2 tömeg%¹ot meghaladó, még elõnyösebben 0,5 tömeg%¹ot meghaladó és legelõnyösebben 1 tömeg%¹ot meghaladó mennyiségben adjuk a találmány szerinti készítményhez annak összes tömegére vonatkoztatva. Bár az oligoszacharidok jelentõs mennyiségének beadása általában nem vezet nem kívánt mellékhatások kialakulásához, a találmány szerinti készítmény oligoszacharidtartalma elõnyösen 20 tömeg% alatt, elõnyösebben 10 tömeg% alatt, még elõnyösebben 5 tömeg% alatt marad.
negatív kontrollcsoportokba pedig 3 állat tartozott. Az állatok félszintetikus étrendet kaptak (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Hollandia). A kontrollétrend az AIN93G elõírásainak megfelelõen készült [Re5 eves és munkatársai: Development and Testing of the AIN93 purified diets for rodents: results on growth kidney calcification and bone mineralisation in rats and mice. J. Nutrition 123 (11), 1923–31 (1993)], az oligoszachariddal kiegészített étrend a fenti elõírásokon ala10 pult. A kiegészített étrendek szénhidráttartalmát állandó szinten tartottuk a teljes szénhidráttartalom tömegre számított megfelelõ részének oligoszacharidokkal történõ helyettesítésével. Az egyes szénhidrátkomponenseket normális arányuknak megfelelõen helyettesítet15 tük az étrendben. A normális étrend szénhidrátként kukoricakeményítõt (40% teljes tömegre számítva), dextrinezett kukoricakeményítõt (13,2%), szacharózt (10%) és cellulózt (5%) tartalmazott. 20
Példák 25 1. példa Kísérletes elrendezés Az oligoszacharidokat, adott esetben semleges oligoszacharidokkal kombinálva tartalmazó étrendek hatását késõi típusú hiperszenzitivitási (DHT) válaszon teszteltük, amely a Th1-immunválasz paramétere, és amelyet lokális antigénbehatást követõen kialakult fülduzzanat növekedésének mérésével mutattunk ki. Az alkalmazott, 2 és 4 közötti átlagos DP¹értékû savas oligoszacharidokat (AcO1) a WO 02/42 484 számú nemzetközi közzétételi iratban (lásd 1. példa) ismertetett eljárással kaptuk. Az étrend teljes tömegére számítva 1 tömeg%, 2,5 tömeg%, 5 tömeg%, és 10 tömeg%, AcO1-tartalmú étrendeket teszteltünk. Galaktooligoszacharidokat (GOS) (Vivinal-GOS™ (Borculo Domo Ingredients, Hollandia) és fruktooligoszacharidokat (FOS) (Raftiline HP™, Orafti, Tienen, Belgium) alkalmaztunk, tömegre számított 9:1 GOS:FOS arány mellett. A teljes tömegre számítva 1, 2,5 és 5 tömeg% GF¹et tartalmazó étrendeket vizsgáltunk. Savas és semleges oligoszacharidok kombinációjának (GF és AcO1) hatását a táplálék teljes tömegre számítva 1 tömeg% GF¹et és 1 tömeg% AcO1¹t tartalmazó étrenddel teszteltük. Valamennyi adatot kontrollértékekhez viszonyított százalékban adtunk meg, azaz az oligoszachariddal kiegészített étrendet kapó csoport relatív értékeit a kontrollétrendet (oligoszacharidok nélkül) kapó csoport értékeihez viszonyítva. Állatok és étrendek Hathetes, nõstény C57B1/6¹egereket (Harlan Nederland BV, Horst, Hollandia) csoportosan helyeztünk el 12 órás szabályos megvilágított/sötét periódusok mellett. Az egyes csoportok 10 állatot tartalmaztak, a
2
30
35
40
45
Vakcinázási rend A vakcinázást két–négy hét adaptációs idõszakot követõen kezdtük el, miután az új elhelyezést és étrendet bevezettük. A 0. napon, a vakcina beadását megelõzõen vérmintát vettünk. Az elsõ vakcinázást az 1. napon, szubkután végeztük. Három hét múlva vérmintát vettünk (21. nap), és megerõsítõ vakcinázást (booster) végeztünk (22. nap). Kilenc nappal a megerõsítõ injektálást követõen (31. nap) Digimatic külsõ mikrométerrel (Mitutoyo, Veenendaal, Hollandia) a kiindulási fülvastagságot lemértük, és késõi típusú hiperszenzitivitási választ (DHT) váltottunk ki oly módon, hogy antigén oldatot injektáltunk ic. (intrakután) az egér fülkagylójába. Huszonnégy órával ezután (32. nap) a DHT-választ lemértük, vérmintát vettünk, és az egereket leöltük. A lépeket eltávolítottuk, és ex vivo restimulációra elõkészítettük. A vakcinázás 100 ml antigén oldat és Stimune-adjuváns (Specol, Cedi-diagnostics BV, Lelystad, Hollandia) 1:1 arányú keverékének ic. (intrakután) injektálását tartalmazta. Az antigénoldat Influvac 2002/2003 (Solvay Pharmaceuticals, Weesp, Hollandia) 1:100 arányú hígítása volt PBS-ben. Az Influvac trivalens protein vakcina, amely három különbözõ influenzatörzsbõl 3×30 mg/ml hemagglutinint tartalmaz. A DHT-válaszokhoz, az egereket a DHT kiváltására ic. 25 ml dializált Influvac-kal injektáltuk mindkét fülbe.
Sejttenyészetek A lépekbõl a finom hálópórusú sejtszûrõ (Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium) alkalmazásával lépsejteket izoláltunk. A vörösvérsejteket 5 percig, jégen történõ inkubálással lizáltuk. Miután fenolvöröst nem tartalmazó sejttenyésztõ tápfolyadékkal mostuk, a 55 sejteket megszámoltuk (Coulter Counter, Beckman Coulter, Hollandia), és jégen tartottuk. Tenyészeteket indítottunk stimulánsként 0,1 mg/ml dializált Influvac alkalmazásával. A sejteket 96 lyukú tenyésztõlemezekre oltottuk, 1×106 sejt/lyuk koncentrációban. A tenyésztõ 60 tápközeg RPMI-1640 volt HEPES-pufferrel és 2 mmol/l 50
8
1
HU 004 149 T2
L¹glutaminnal (Invitrogen, Merelbeke, Belgium), valamint 10% fötális borjúszérummal (FCS) kiegészítve. A tenyészeteket 5 napig, 5% CO2 mellett 37 °C¹on inkubáltuk. Ezután felülúszókat gyûjtöttünk, és a vizsgálatig –80 °C¹on lefagyasztottuk. A sejtproliferációt párhuzamos tenyészetekben értékeltük a 3H-timidin-beépülés alapján, amelyet az utolsó 18 órában, 0,4 mCi/lyuk koncentrációban adtunk a tenyészetekhez. Öt nap múlva, a sejteket Filtermate harvester (Perkin–Elmer, Zaventem, Belgium) alkalmazásával összegyûjtöttük, és Micro-Beta (Perkin–Elmer, Zaventem, Belgium) számlálóban a beütésszámot lemértük. A radioaktív bomlást lyukanként egy-egy percen át mértük, és a percenkénti beütésszámot (cpm) a proliferáció sebességét jelzõ paramétereként feljegyeztük. Az Influvac-stimulált tenyészetek felülúszóiban analizáltuk a citokineket. Az IL–2, IL–5, IL–10 és IFNgamma mennyiségét a Bio-Plex rendszerrel mértük, az említett citokinek meghatározására használatra készen hozzáférhetõ gyöngykeverék alkalmazásával (BioRad, Veenendaal, Hollandia). A citokinek meghatározását a gyártó utasításai szerint végeztük. Az IL–4¹et ELISA-eljárással mértük, a „Pharmingen OptEIA mouse IL–4 kit” alkalmazásával (Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium), a gyártó utasításai szerint eljárva. Eredmények Savas oligoszacharidok hatása DTH-válaszra Egy (1) tömegszázalék, 2,5 tömeg% és 5 tömeg% AcO1 oligoszacharidot tartalmazó étrend a DTH-válasz statisztikailag szignifikáns emelkedését váltotta ki, amely dózisfüggõ emelkedést mutatott (lásd az 1. táblázatot). A megfigyelt hatás a savas oligoszacharidok jelen alkalmazás szerinti elõnyös alkalmazhatóságára utal. 1. táblázat Savas oligoszacharidok az étrendben (tömeg%)
DTH-válasz (%)
0,(kontroll)
100
1
122
2,5
136*
5
140*
2
2. táblázat Oligoszacharidok az étrendben (tömeg%)
5
10
0 (kontroll)
100
1 tömeg% GF
132*
1 tömeg% AcO1
122
2,5 tömeg% GF
129*
2,5 tömeg% AcO1
136*
1 tömeg% GF és 1 tömeg% AcO1
159*
* szignifikáns eltérést jelez a kontrollhoz képest (p<0,05)
15 Savas oligoszacharidok hatása az influvacspecifikus proliferációra Kettõ egész öt tized (2,5) tömeg% és 5 tömeg% savas oligoszacharidot (AcO1) tartalmazó étrend szignifi20 káns mértékben csökkentette az ex vivo Influvac-specifikus proliferációt (lásd a 3. táblázatot). A megfigyelt hatás a savas oligoszacharidok jelen alkalmazásban történõ elõnyös alkalmazhatóságára utal. Savas és semleges oligoszacharidok kombinációjának hatása az Influvac-specifikus proliferációra Egy (1) tömeg% GF és 1 tömeg% AcO1 kombinációjának adagolása az antigénspecifikus proliferáció 30 szignifikáns mértékû csökkenését váltotta ki (lásd a 3. táblázatot). Mivel a hatás a csak savas vagy csak semleges oligoszacharidokat tartalmazó étrend által kiváltott DTH-válaszokhoz képest szignifikáns mértékben javult, az eredmények a savas és semleges oligosza35 charidok által nyújtott szinergista hatásra utaltak. A megfigyelt hatás a savas és semleges oligoszacharidok kombinációjának jelen alkalmazásban történõ elõnyös alkalmazhatóságára utal. A csökkent proliferáció a Th2-válasz csökkenésére és a találmány szerinti al40 kalmazás Th1/Th2 egyensúlyt helyreállító hatására utal. 25
3. táblázat 45
Oligoszacharid az étrendben (tömeg%)
* szignifikáns eltérést jelez a kontrollhoz képest (p<0,05)
Savas és semleges oligoszacharidok hatása a DTH-válaszra Egy tömeg% GF és 1 tömeg% AcO1 kombinációja a DTH statisztikailag szignifikáns emelkedését váltja ki (lásd a 2. táblázatot). Mivel a hatás szignifikáns mértékben magasabb, mint a csak savas vagy semleges oligoszacharidok által kiváltott DTH-válasz, az eredmények a savas és semleges oligoszacharidok által mutatott szinergista hatásra utalnak. A megfigyelt hatás a savas és semleges oligoszacharidok kombinációjának a jelen alkalmazásban történõ elõnyös alkalmazhatóságára utal.
DTH-válasz (%)
50
55
Influvac-specifikus proliferáció (%)
0 (kontroll)
100
1 tömeg% GF
100
1 tömeg% AcO1
92
2,5 tömeg% AcO1
61*
5 tömeg% AcO1
54*
1 tömeg% GF és 1 tömeg% AcO1
50*
* szignifikáns eltérést jelez a kontrollhoz képest (p<0,05)
Th1/Th2 egyensúly: citokinprofilok savas oligoszacharidok beadását követõen 60 9
1
HU 004 149 T2
Citokinprofilokat mértünk tenyésztett Influvac-specifikus lépsejtek felülúszójában. Az adatokat a vakcinázott kontroll (azaz oligoszacharidot nem kapott) csoport értékeihez viszonyítva, százalékos arányban adtuk meg. A 2,5 tömeg% és 5 tömeg% AcO1¹et tartalmazó étrend a kontrollokkal összehasonlítva a Th2-vel összefüggõ IL–4¹, IL–5- és IL–10-citokinek csökkenését eredményezte, míg a Th1-asszociált IL–2-citokin szintje emelkedett, és az IFN¹g nem csökkent jelentõsen (lásd a 4. táblázatot). Ezek az eredmények a savas oligoszacharidok Th1/Th2 egyensúlyt biztosító hatására, valamint a savas oligoszacharidok jelen alkalmazásban történõ elõnyös alkalmazhatóságára utalnak, például relatív alacsony Th1-immunitással járó betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. Th1/Th2 egyensúly: citokinprofilok savas és semleges oligoszacharidok beadását követõen
2
A kontrollokkal összehasonlítva, az 1 tömeg% GT és 5 tömeg% AcO1 kombinációját tartalmazó étrend a Th2-vel összefüggõ IL–4¹, IL–5- és IL–10-citokinek csökkenését eredményezte, míg a Th1-asszociált 5 IL–2-citokin és az IFN¹g szintje nem csökkent [lásd a 4. táblázatot, ahol az adatokat a vakcinázott kontroll (azaz oligoszacharidot nem kapott) csoport értékeihez viszonyított százalékos arányban fejeztük ki]. Ezek az eredmények a savas és semleges oligoszacharidok 10 kombinációjának a Th1/Th2 egyensúlyozó hatására, valamint a savas oligoszacharidok jelen alkalmazásban történõ elõnyös alkalmazhatóságára utalnak, például relatív alacsony Th1-immunitással járó betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. Különösen az 15 IL–4/IFN arány tükrözi a Th2/Th1 egyensúlyt. Más szavakkal, alacsony arány Th1-stimulálásra és/vagy Th2gátlásra, és minden esetben a jelen oligoszacharidok Th1–Th2 egyensúlyt biztosító hatására utal.
4. táblázat Oligoszacharid a tápszerben (tömeg%)
Citokin
IFN¹g (%)
IL–2 (%)
IL–10(%)
IL–4 (%)
IL–5 (%)
IL–4/IFN¹g arány
0 (kontroll)
100
100
100
100
100
100
1 tömeg% AcO1
100
196*
70
83
72
85
2,5 tömeg% AcO1
75
116
58*
55
66
75
5 tömeg% AcO1
69
161*
44*
33*
56*
51*
1 tömeg% GF és 1 tömeg% AcO1
93
123
45*
44*
55*
45*
* szignifikáns eltérés a kontrollhoz képest (p<0,05)
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Savas oligoszacharid és semleges oligoszacharid alkalmazása emlõsök immunrendszerrel összefüggõ rendellenességeinek kezelésére és/vagy megelõzésére alkalmas készítmény elõállítására, ahol a rendellenesség következõkbõl álló csoportból választott: 1¹es típusú, 2¹es típusú, 3¹as típusú és 4¹es típusú allergia, amely készítmény savas oligoszacharidok és semleges oligoszacharidok terápiásan hatásos mennyiségét tartalmazza, ahol: – a savas oligoszacharid polimerizációfoka 2–250 közé esik, és pektinbõl vagy alginátból van elõállítva; és – a semleges oligoszacharid a következõkbõl álló csoportból választott: fruktánok, fruktooligoszacharidok, emészthetetlen dextrinek, galaktooligoszacharidok, beleértve transzgalaktooligoszacharidokat, xilooligoszacharidok, arabinooligoszacharidok, glükooligoszacharidok, mannooligoszacharidok, fukooligoszacharidok és azok elegyei. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a savas oligoszacharid legalább egy terminális uronsavegységet tartalmaz. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a semleges oligoszacharid a következõk-
35 bõl álló csoportból választott: galaktooligoszacharid, fruktooligoszacharid és transzgalaktooligoszacharid. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény két, kémiailag eltérõ semleges oligoszacharidot tartalmaz, amelybõl az egyik ga40 laktózalapú semleges oligoszacharid, és a másik fruktóz- és/vagy glükózalapú oligoszacharid. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény fruktooligoszacharidot, valamint a következõk közül legalább egyet tartal45 maz: transzgalaktooligoszacharid és galaktooligoszacharid. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítményt enterálisan alkalmazzák. 50 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítményt 0–1 éves humán személynek adják be. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, 1¹es típusú allergia, például atópia, asztma, 55 szénanátha, ekcéma, táplálékallergia és gyógyszerallergia kezelésére és/vagy megelõzésére. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely 0,1–100 g, hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsav naponta történõ beadását is magában 60 foglalja. 10
1
HU 004 149 T2
10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény csecsemõtápszer, amely 5–60 energia% lipidet, 5–40 energia% proteint, 15–90 energia% szénhidrátot, valamint hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmaz. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a csecsemõtápszer 7–12 energia% proteint, 40–55 energia% szénhidrátot és 35–50 energia% zsírt tartalmaz.
5
11
2
12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a protein a következõkbõl álló csoportból választott: hidrolizált tejprotein, növényi protein és/vagy aminosavak. 13. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény folyékony élelmiszer, amelynek ozmolaritása 50–500 mOsm/kg közé, és/vagy energiatartalma 0,1–2,5 kcal/ml (0,42–10,5 kJ/ml) közé esik.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
