!HU000006345T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 345
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 743972 (22) A bejelentés napja: 2005. 04. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050743972 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1745134 A1 2005. 11. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1745134 B1 2009. 02. 25.
(51) Int. Cl.: C12P 7/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05108593 PCT/IB 05/001556
(30) Elsõbbségi adatok: 8002004 2004. 05. 10.
(73) Jogosult: IEP GmbH, 65203 Wiesbaden (DE)
AT
(72) Feltalálók: GUPTA, Antje, 65207 Wiesbaden (DE); Tschentscher, Anke, 65347 Eltville-Hattenheim (DE); BOBKOVA, Maria, 65510 Idstein (DE) (54)
(74) Képviselõ: Kerény Judit, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Eljárás 2-butanol elõállítására
(57) Kivonat
HU 006 345 T2
A találmány tárgya eljárás 2¹butanol, különösen R¹2butanol és S¹2-butanol elõállítására 2¹butanon karbonil-reduktázzal és egy koenzimmel történõ enzimkatalizált redukálásával, amelynek során (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó vizes fázist érintkezésbe hozzák egy, a vizes fázissal
nem elegyedõ alkoholos fázissal, amely 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához, azzal a megkötéssel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy szekunder alkohol, amely alkalmas a koenzim regenerálására, és a víznél magasabb forrásponttal rendelkezik, majd (b) a keletkezett 2¹butanolt elválasztják.
A leírás terjedelme 6 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 345 T2
A találmány tárgya eljárás 2¹butanol, különösen R¹2butanol és S¹2-butanol elõállítására 2¹butanon karbonil-reduktázzal és egy koenzimmel történõ enzimkatalizált redukálásával. A 2¹butanol és különösen az aszimmetrikus R¹2butanol és S¹2-butanol fontos közbensõ termékek gyógyászatilag hatásos anyagok elõállításához. Az enantiomertiszta 2¹butanol, tehát az R¹2-butanol és S¹2-butanol elõállítása költséges, mert mindmáig nem lehetséges közvetlen kémiai úton a 2¹butanon katalitikus aszimmetrikus redukciója R¹, illetve S¹2-butanollá. Nincsenek eddig leírva közvetlen enzimes redukálási eljárások sem. Ipari méterekben csak kerülõúton, a racemáthasítással lehet enantiomertiszta R¹2butanolt és S¹2-butanolt elõállítani. A karbonil-reduktázok (további megjelölések: alkohol-dehidrogenázok, oxidoreduktázok) katalizátorként ismeretesek karbonilvegyületek redukálásához, illetve szekunder alkoholok oxidációjához. Ezekhez az enzimekhez egy koenzimre van szükség, például NAD(P)H¹ra. A ketonok redukciója a Lactobacillus kefirbõl nyert karbonil-reduktázzal és az NADPH koenzimmel, például az 5,342,767 számú USA szabadalmi leírásból ismert. Egy alkohol-dehidrogenáz tisztítása és jellemzése Moraxella sp.¹bõl az Eur. J. Biochem. 254, 356–362 (1998) irodalomból ismert. A 2¹butanon 2¹butanollá történõ redukciója egy karbonil-reduktáz segítségével vizes közegben nehézkes, mert a reakcióelegyet nem lehet könnyen feldolgozni, és a 2¹butanol vízben igen jól oldódik. Ezenkívül az extrakciós és desztillációs eljárások a 2¹butanol és a víz szétválasztására mûszakilag bonyolultak. A 2¹butanon 2¹butanollá történõ enzimes redukciója karbonil-reduktáz segítségével problémás azért is, mert az NADH, illetve NADPH kofaktor regenerálása szükséges. Manapság gyakran használják az NAD(P)H regenerálásához a 2¹propanolt, és ez a módszer ugyanúgy problémás, mert az R¹, illetve S¹2-butanol-termék izolálása tovább nehezíti az eljárást, és ezenkívül csak igen körülményesen lehet teljesen szétválasztani az R¹, illetve S¹2-butanolt egymástól. További problémát jelent a 2¹butanon enzimes redukciójánál vizes közegben egyidejûleg az NAD(P)H 2¹propanollal történõ koenzim regenerálása mellett a legtöbb enzim inaktiválódása 20%-nál nagyobb 2¹propanol- és 2¹butanoltartalom mellett. Ez azt jelenti, hogy az alkalmazandó 2¹butanon végsõ koncentrációjának messze 10 tömeg/térf.% felett kell lenni, hogy ha az alkalmazandó 2¹propanol feleslegébõl indulunk ki. Ezek a csekély realizálható anyag¹, illetve termékkoncentrációk megnehezítik viszont az R¹, illetve S¹2-butanol izolálását a reakcióelegybõl. A WO 93/18138 A dokumentum [(Forschungszentrum Juelich GmbH), 1993. szeptember 16.] leír egy eljárást 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimes katalitikus redukciójával egy karbonil-reduktáz segítségével Candida parapsilosisból és egy koenzimmel egy egyfázisú vizes rendszerben. A koenzim regenerálását nátrium-formiát/formiát-dehidrogenáz eleggyel történõ
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
összekapcsolással végzik. Az EP–A–1 323 827 számú [(Sumitomo Chemical Combani, Limited), 2003. július 2.] dokumentuma leír egy eljárást 2¹hidroxi-cikloalkánkarboxilsav-észter elõállítására 2¹oxo-cikloalkánkarboxilsav-észter karbonil-reduktázzal és koenzimmel kétfázisú rendszerben és szekunder alkohol jelenlétében történõ enzimkatalizált redukciójával, ahol a szekunder alkohol forráspontja legfeljebb 200 °C. A találmány szerinti eljárás a 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimkatalizált redukciójával karbonil-reduktázzal és koenzimmel azt a feladatot hivatott megoldani, hogy megoldja a fent említett problémákat, és azzal jellemezhetõ, hogy (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó vizes fázist egy alkoholos fázissal, amely nem elegyedik a vizes fázissal és 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához érintkezésbe hozzuk, azzal a megkötéssel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy szekunder alkohol, amely képes regenerálni a koenzimet, és egy olyan forráspontja van, amely a víz forráspontja feletti, majd (b) a képzõdött 2¹butanolt elválasztjuk. A találmány szerinti eljárás során a 2¹butanont karbonil-reduktázzal reagáltatjuk 2¹butanollá, ezáltal egy kétfázisú rendszerben hajtjuk végre az eljárást, amely az enzimet és a koenzimet oldott állapotban tartalmazó vizes fázisból és egy szekunder alkoholból és egy 2¹butanonból képzõdõ szerves fázisból áll. A koenzimregenerálást egy szekunder alkohollal hajtjuk végre, amely nem elegyedik vízzel, és egyidejûleg lényegesen magasabb a forráspontja, mint a vízé. Elõnyösek a 2¹pentanol, 2¹hexanol, 2¹heptanol, 2¹oktanol és a 4¹metil-2-pentanol, melyek közül elõnyös a 2¹heptanol és a 2¹oktanol. Koenzimként különösen az NADH és az NADPH alkalmas. Ezenkívül a szekunder, vízzel nem elegyedõ alkohol alkalmazása a találmány szerinti eljárásban a karbonil-reduktáz stabilizálásához vezet. Egy vízzel nem elegyedõ szekunder alkohol alkalmazásának elõnye a koenzimregenerálásnál abból áll, hogy nagyobb feleslegben lehet alkalmazni a redukálandó 2¹butanon anyagra vonatkoztatva. Ezáltal nagyobb konverzió érhetõ el egyidejûleg nagyobb alkalmazott 2¹butanonkoncentrációk mellett. Elõnyösen az alkoholos fázis szekunder alkoholját és a 2¹butanont 1:2–1:10 moláris arányban alkalmazzuk (2¹butanon:szekunder alkohol), és különösen elõnyös az 1:2,5–1:5 mólarány. A találmány szerinti eljárás további változata abból áll, hogy a 2¹butanont olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy az össz-reakcióelegyre vonatkoztatva a koncentráció legalább 5 térf.%, elõnyösen 10–25 térf.% legyen. A karbonil-reduktázt elõnyösen legalább 2000 egység, elõnyösen azonban legalább 10 000 egység karbonil-reduktáz per 2¹butanon kg mennyiségben használjuk, miközben a felsõ határ célszerûen 250 000 egység karbonil-reduktáz 1 kg 2¹butanonra vonatkoztatva. Az 1 U enzimegység olyan enzimmennyiségnek felel meg, amely 1 mmol 2¹butanon percenkénti reagáltatásához szükséges.
1
HU 006 345 T2
Karbonil-reduktázként, illetve alkohol-dehidrogenázként különösen elõnyösnek mutatkoznak olyanok, amelyek a Candida parapsilosisból származnak. Elõnyösen olyan karbonil-reduktázt alkalmazunk, amely lényegében enantiomertiszta S¹2-butanolt vagy R¹2butanolt eredményez. Azt találtuk, hogy a Candida parapsilosisból származó karbonil-reduktáz alkalmas a 2¹butanon S¹2-butanollá történõ sztereoszelektív redukálására, miközben a választott eljárási körülményektõl függõen több, mint 98% enantiomerfelesleg érhetõ el a kívánt enantiomerbõl. A találmány szerinti eljárás során keletkezõ 2¹butanol a szekunder alkohol fázisban található, és ezzel együtt dekantálható a vizes fázisról. Ezt követõen a 2¹butanolt egyszerû desztillációs úton kinyerhetjük. A találmány szerinti eljárásban a megfelelõ enantiomertiszta S¹alkoholt is alkalmazhatnánk a koenzim regeneráláshoz. A reakcióelegy össztérfogatában a vizes és szerves fázis megoszlása változtatható, miközben a vizes fázis legfeljebb 3 térf.%¹a redukálható, ami oda vezet, hogy az alkalmazott 2¹butanon több, mint 90%¹a, illetve az R¹, illetve S¹2-butanol a vízzel nem elegyedõ alkoholból képzett fázisban található. A találmány szerinti eljárás további elõnye abban áll, hogy összehasonlíthatóan egyszerûen lehet az R¹, illetve S¹2-butanolt nagy tisztaságú formában feldolgozni és izolálni. Az R¹, illetve S¹2-butanol-termék izolálása úgy történik, hogy a szerves fázist elválasztjuk, és a 2¹butanon/2¹butanol elegyet nagy forráspontú, vízzel nem elegyedõ szekunder alkoholból desztilláljuk. Ezt követõen desztilláció útján kinyerhetjük az aszimmetrikus R¹, illetve S¹2-butanol-terméket a 2¹butanol/2¹butanon elegybõl több, mint 99%¹os kémiai tisztasággal és több, mint 98%¹os enantiomerfeleslegben. A 2¹butanon anyag alkalmazandó koncentrációja a találmány szerinti eljárás során elõnyösen több, mint 5 térf.%, különösen elõnyösen 10 és 25 térf.% közé esik.
5
10
15
20
25
2
A vizes fázisra vonatkoztatva a koenzim NAD(P)H koncentrációja 0,01 mmol-tól 10 mmol¹ig, különösen 0,1 mmol-tól 1 mmol¹ig terjed. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott vizes fázishoz elõnyösen egy puffert adagolunk, ami lehet például kálium-foszfát¹, trisz/HCl- vagy trietanol-amin-puffer, melyeknek pH¹értéke 5–10, elõnyösen 6–9 között van. A találmány szerint a karbonil-reduktázt vagy teljesen tisztított vagy részben tisztított formában sejtlizátok vagy egész sejtek formájában alkalmazhatjuk. Az alkalmazott sejtek lehetnek természetesek vagy permeabilizáltak. A hõmérséklet például körülbelül 10–60 °C¹ig, elõnyösen 25–35 °C között változhat. A találmány szerinti eljárást például egy zárt reakcióedényben, amely lehet üvegbõl vagy fémbõl, hajthatjuk végre. Ehhez a komponenseket külön-külön bevezetjük a reakcióedénybe, és például nitrogén- vagy levegõatmoszférában keverjük. A reakcióidõ 1 órától 48 óráig, különösen 2¹tõl 24 óráig változhat. A Candida parapsilosisból származó karbonil-reduktáz helyett alkalmazhatunk más karbonil-reduktázokat is, melyek alkalmasak arra, hogy enantioszelektív redukálják a 2¹butanont S¹2-butanollá vagy R¹2-butanollá. A találmány további részleteit az alábbi példákkal írjuk le közelebbrõl.
1. példa Ebben a példában bemutatjuk az S¹2-butanol elõállítását 2¹butanonból, és az S¹2-butanol termelésének függését az alkalmazott 2¹butanon/szekunder alkohol (2¹heptanol) alkalmazott arányának függvényében. Karbonil-reduktázként a Candida parapsilosisból szár35 mazót alkalmazzuk. A koenzimregenerálást 2¹heptanollal végezzük. Az alábbi táblázatban bemutatjuk a három különbözõ arányban alkalmazott 2¹butanon/2¹heptanol eleggyel végzett termelési adatokat. 30
1. táblázat Összetétel
1. elegy
2. elegy
3. elegy
Puffer (100 mmol TEA pH=7,0)
1,ml
1,ml
1,ml
2-Butanon
2,5 ml (0,027 mol)
2,5 ml (0,027 mol)
2,5 ml (0,027 mol)
NAD
0,5 mg
0,5 mg
0,5 mg
2-Heptanol
10,ml (0,068 mol)
15,ml (0,103 mol)
20,ml (137,mol)
ADH Candida parapsilosisból
60,egység
60,egység
60,egység
Térfogat
13,5 ml
18,5 ml
23,5 ml
Mólarány
1:2,5
1:3,8
1: 5
A 2¹butanon térf.%¹os koncentrációja
18,5%
13,5%
10,6%
S-Butanol %¹os termelése
43%
61%
70%
S-Butanol enantiomerfeleslege
99% S
99% S
99% S
Paraméterek
2-Butanon/2¹heptanol
3
1
HU 006 345 T2
2
Az 1. táblázatból kitûnik, hogy növekvõ 2¹heptanolkoncentráció mellett lényegesen nõ az S¹2-butanol termelése.
A reakciót úgy hajtjuk végre, hogy elõször a reakcióedénybe vezetjük a puffert, amelyben fel van oldva az NAD és az enzim. Ezután hozzáadjuk az edénybe a 2¹heptanolt és a 2¹butanont. A reakcióelegyet ezután jól átkeverjük és 30 °C¹on inkubáljuk. A reakciót megszakítjuk, amikor már a 2¹butanon további reakcióját nem figyeljük meg, és ezzel elérjük a reakcióegyensúlyt.
5
2. példa Ebben a példában három elegy révén mutatjuk ki, hogy a vizes fázist úgy lehet redukálni, hogy közben a termelés lényegesen nem változik.
2. táblázat Összetétel
4. elegy
5. elegy
6. elegy
Puffer (100 mmol TEA pH=7,0)
2,5 ml
5,ml
2-Butanon
5,ml (0,054 mol)
5,ml (0,054 mol)
5,ml (0,054 mol)
NAD
1,mg
1,mg
1,mg
2-Heptanol
30,ml (0,206 mol)
Candida parapsilosisból származó ADH
500,egység
30,ml (0,206 mol) 500,egység
10,ml
30,ml (0,206 mol) 500,egység
Paraméterek Térfogat
37,5 ml
40,ml
Mólarány
1:3,8
1:3,8
2-Butanon koncentrációja térf.%-ban
13,3%
12,5%
S-Butanol termelése %¹osan
55%
58%
S-Butanol enantiomerfeleslege
98% S
98% S
45,ml 1:3,8
2-Butanon/ 2¹heptanol
3. példa Ebben a példában bemutatjuk, hogy a koenzim regenerálását különbözõ szekunder alkoholokkal lehet végrehajtani, a három kísérlet eredményét az alábbi 3. táblázat mutatja be.
11% 5,6% 98% S
35
3. táblázat Összetétel
Puffer (100 mmol TEA pH=7,0)
7. elegy
20,ml
8. elegy
20,ml
9. elegy
6,ml
2-Butanon
5,ml (0,054 mol)
5,ml (0,054 mol)
1,ml (0,0108 mol)
NAD
0,5 mg
0,5 mg
1,mg
Szekunder alkohol
30,ml
30,ml
4-metil-2-pentanol
ADH Candida parapsilosisból
2-hexanol
(0,23 mol)
(0,23 mol)
500,egység
500,egység
4,ml 2-pentanol (0,036 mol) 100,egység
Paraméterek Térfogat Mólarány
55,ml
55,ml
11,ml
1:4,3
1: 4,3
1:3,3
9%
9%
9%
S-Butanol %¹os termelés
78%
70%
68%
S-Butanol enantiomerfelesleg
96% S
98% S
98% S
2-Butanon/ 2¹heptanol 2-Butanon térf.%
4
1
HU 006 345 T2
2
sel, hogy az alkoholos fázisban lévõ alkohol egy sze4. példa kunder alkohol, amely alkalmas a koenzim regeneráláEbben a példában az S¹2-butanol ipari méretekben sára, és a víznél magasabb forrásponttal rendelkezik, történõ elõállítását mutatjuk be. majd Az S¹2-butanol elõállításához 4,96 1 puffert (TEA (b) a keletkezett 2¹butanolt elválasztjuk. 100 ml, pH=7,0) egy 30 °C¹on temperált keverõreaktor- 5 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ba adagolunk. Ezután 4,96 g NAD¹t feloldunk pufferhogy az alkoholos fázis alkoholja 2¹pentanol, 2¹hexaben, és hozzáadunk a pufferhez Candida parapsilosisnol, 2¹heptanol, 2¹oktanol vagy 4¹metil-2-pentanol. ból származó 300 000 egység karbonil-reduktázt. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, A reakcióelegyet befedjük 76,11 l (60,9 kg) 2¹heptanollal, és ezután a 10 kg (12,5 1) 2¹butanon anyagot adjuk 10 hogy az alkoholos fázis alkoholja 2¹heptanol vagy 2¹oktanol. hozzá. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, Ezután bekapcsoljuk a keverést, és a reakcióeleazzal jellemezve, hogy az alkoholos fázis szekunder algyet 12 órát alapos keverés közben inkubáljuk. 12 óra koholját és a 2¹butanont 1:2–1:10 (2¹butanon:szekunmúlva a 2¹butanon 68%¹át S¹2-butanollá reagáltatjuk, enantiomerfelesleg 98,4%. 15 der alkohol) mólarányban alkalmazzuk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, A reakció befejezése után a 2¹butanon/S¹2-butahogy a mólarány 1:2,5–1:5 között van. nol-tartalmú heptanol fázist elválasztjuk és szárítjuk. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, A 2¹butanon/S¹2-butanol elegyet elõször a heptanol fáazzal jellemezve, hogy a 2¹butanont legalább 5 térf.%, zisból desztilláció útján nyerjük ki (a forráspont körülbelül 158–161 °C), mielõtt egy második desztillációban 20 elõnyösen 10–25 térf.% mennyiségben alkalmazzuk az össz-reakcióelegyre vonatkoztatva. elválasztanánk egymástól a 80 °C¹on forró 2¹butanont 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, és a 97–100 fokon forró S¹2-butanolt. azzal jellemezve, hogy legalább 2000 egység, elõnyöIly módon több, mint 99% kémiai tisztaságú S¹2-busen azonban legalább 10 000 egység karbonil-reduktanolt lehet kapni. 25 tázt alkalmazunk 1 kg 2¹butanonra. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Candida parapsilosisból elõálSZABADALMI IGÉNYPONTOK lítható karbonil-reduktázt alkalmazunk. 9. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 1. Eljárás 2¹butanol elõállítására 2¹butanon enzimkatalizált redukciójával egy karbonil-reduktáz és egy 30 azzal jellemezve, hogy a keletkezett 2¹butanolt desztillációs úton választjuk el. koenzim segítségével, azzal jellemezve, hogy 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, (a) a karbonil-reduktázt és a koenzimet tartalmazó azzal jellemezve, hogy olyan karbonil-reduktázt alkalvizes fázist érintkezésbe hozzuk egy, a vizes fázissal mazunk, amellyel lényegében enantiomertiszta S¹2-bunem elegyedõ alkoholos fázissal, amely 2¹butanont tartalmaz, a 2¹butanon redukciójához, azzal a megkötés- 35 tanol vagy R¹2-butanol állítható elõ.
5
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
