!HU000005678T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 678
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 772471 (22) A bejelentés napja: 2005. 08. 11. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050772471 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1776587 A1 2006. 05. 26. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1776587 B1 2008. 12. 31.
(51) Int. Cl.: G01N 33/574 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06053592 PCT/EP 05/008742
(30) Elsõbbségi adatok: 200409124 2004. 08. 13.
(73) Jogosult: Indivumed GmbH, 22297 Hamburg (DE)
EP
(72) Feltalálók: JUHL, Hartmut, 22609 Hamburg (DE); DAVID, Kerstin, 20535 Hamburg (DE); FENTZ, Anne-Kristin, 20253 Hamburg (DE) (54)
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
C3a és származékainak alkalmazása biomarkerként kolorektális adenomára és/vagy karcinómára; és alkalmazásuk diagnosztikai eljárásokban és vizsgálati eljárásokban
(57) Kivonat
HU 005 678 T2
A találmány tárgya C3a vagy származékának biomarkerként történõ alkalmazása kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személyben. A C3a-teszt érzékenysége és specifitása magas, és lehetõvé teszi adenomák korai specifikus detektálását kolonoszkópia nélkül, továbbá kolorektális
adenoma és kolorektális karcinóma közötti megkülönböztetést. Különösen C3a és transzthyretin biomarkerek kombinációban történõ alkalmazása teszi lehetõvé adenomák kimutatását kiváló érzékenységgel és magas specifitással.
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 678 T2
A találmány kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma területére vonatkozik. A kolorektális karcinóma a harmadik leggyakrabban diagnosztizált karcinóma (9,4%) a világon. 2003ban közel 945 000 új kolorektális karcinómás esetet diagnosztizáltak világszerte, és körülbelül 492 000 ember halt meg ebben a betegségben. A kolorektális karcinóma elõfordulási gyakorisága növekszik, miközben a kolorektális karcinóma mortalitási aránya csökken. A kolorektális karcinóma elõfordulási gyakorisága az életkorral növekszik, körülbelül 40 éves korban kezdõdik, és gyakoribb férfiakban, mint nõkben (40,6 férfi eset, ezzel szemben 30,6 nõi eset, per 100 000, évente) („World cancer report”, 2003, szerk. BW. Stewart és P. Kleihues, IARC Press, Lyon). A legtöbb páciensben a kolorektális karcinóma kifejlõdése többlépéses folyamatban zajlik, premalignus adenomából invazív (behatoló) malignitásokba, amelyek hajlamosak metasztázisra. Tény, hogy kolorektális karcinóma morbiditásának és mortalitásának csökkenését korai fázisban lévõ kolorektális karcinómák detektálásán és kezelésén, és olyan kolorektális adenomatózus polipok azonosításán és eltávolításán keresztül lehet elérni, amelyek prekurzorai a kolorektális karcinómának. Eddig csak invazív kolorektális szûrési tesztekrõl, például kolonoszkópiáról mutatták ki, hogy korai fázisú kolorektális karcinomát és prekurzorait, azaz adenomatózus polipokat és/vagy lapos neopláziás területeket lehet velük detektálni. Számos teszt áll rendelkezésre, amelyek kolorektális karcinóma szûrésére adott esetben alkalmasak. A szûrési tesztek közé tartozik székletvérvizsgálat (FOBT), flexibilis szigmoidoszkópia, FOBT flexibilis szigmoidoszkópiával és kolonoszkópiával kombinálva. A különbözõ szûrési tesztek teljesítmény, hatékonyság, lehetséges szûrési gyakoriság, a teszt szövõdményei, költség és páciensek általi elfogadottság vonatkozásában különböznek egymástól. Székletvérteszttel történõ szûrést tekintik jelenleg optimális szûrési stratégiának költséghatékonyság tekintetében. A székletben található alvadt vért kémiai ágensekkel, például gvajak-próbával, hematoporfirinen keresztül vagy immunológiai módszerekkel lehet detektálni. SmithKline Diagnostics cégtõl beszerezhetõ, tárgylemezen végezhetõ gvajak-teszt [Hemoccult(II)] a legelterjedtebb. Különbözõ technikai faktorok befolyásolják a klinikai hatékonyságot. A Hemoccult-tesztnek körülbelül 50%¹os érzékenysége van kolorektális karcinómára és körülbelül 98%¹os specifitása, azonban az érzékenység alacsony polipokra, körülbelül 10% [Simon, J. B., Gastroenterologist 6, 66–78 (1998), összefoglaló irodalom]. A székletvérteszttel való szûrés másik jelentõs hátránya az elõrejelzés pontatlansága, a pozitív reakcióknak csak 10%-áról bizonyosodott be, hogy oka kolorektális karcinóma volt [Simon, J. B., Gastroenterologist 6, 66–78 (1998), összefoglaló irodalom; Mandel J. S. és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst. 91, 434–437 (1999); Hardcastle, J. D. és munkatársai, Lancet 348,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
1472–1477 (1996); Kronburg, O. és munkatársai, Lancet 348, 1467–71 (1996); Winawer, S. J. és munkatársai, Gastroenterology 112, 594–642 (1997); Fletcher R. H., N. Engl. J. Med. 338, 1153–1154 (1998)]. A székletvérteszt továbbá csak akkor ad eredményt, ha a betegség elõrehaladása elért egy bizonyos stádiumot. Kívánatos lenne, ha olyan tesztrendszer állna rendelkezésre, amely korábbi idõpontban lenné lehetõvé kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatását. A közelmúltban kifejlesztett immunológiai teszteknek általában nagy az érzékenysége, azonban csekély specifitásuk továbbra is jelentõs probléma maradt. Más módszerek, például székletminták genetikai tesztjei KRAS-onkogénre és p53-fehérjére, még nem költséghatékonyak, és alacsony az érzékenységük [Calistri, D. és munkatársai, Clin. Gastroenterol. Hepatol. 1, 377–383 (2003); Schoen R. E., Nat. Rev. Cancer 2, 65–70 (2002)]. Az endoszkópja a leginkább döntõ detekciós módszer, de vannak korlátai. Ismertté vált a fals negatívok aránya lapos neopláziás elváltozásokra, és ez magas maradt [Kudo, S., Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 7, 87–98 (1997)]. Kolonoszkópiával úgy lehet vizsgálni a vastagbelet, hogy a fals negatívok aránya alacsony legalább 100 mm átmérõjû polipoid elváltozásokra. Emiatt lehetséges, hogy viszonylag hosszabb idõ (akár 10 év) múlva történjen újravizsgálat egy negatív eredményt adó vizsgálat után, vagy akár 5 évvel polipektómia után. Azonban a páciens együttmûködése az ajánlott kolonoszkópiás újravizsgálattal csekély. Továbbá a kolonoszkópia költséges és kellemetlen. A kiterjesztett vizsgálat magas költségét és a kolonoszkópia korlátozott elfogadottságát tekintve a lakosság körében ennek a vizsgálatnak korlátozott alkalmazási lehetõsége van. Izolált szövetmintákat, amelyek vételére sor került, kolorektális karcinómára és prekurzorára, kolorektális adenomára különbözõ módszerekkel lehet tesztelni. A DE 197 11 111 A. számú szabadalmi iratban leírnak egy eljárást intraepitél vastagbél-baktériumok, komponenseik és reakciótermékeik in vitro meghatározására. Egy másik, a DE 102 24 534 számú szabadalmi iratban leírt módszer szerint HERG-gén expresszióját alkalmazzák szövetmintákban. Vérmintákban lévõ CEA-szinteket (CEA: karcinoembrionális antigén) alkalmaztak vastagbél-karcinóma detektálására. Azonban a CEA-szintek emelkedése vastagbél-karcinómára nem specifikus, és kimutatták, hogy más malignus betegségekben (például gyomorrák, hasnyálmirigyrák és tüdõrák), és különbözõ nem malignus betegségekben (például alkoholos májbetegség, gyulladásos bélbetegség, erõs cigarettázás, krónikus bronchitis és pancreatitis) szenvedõ páciensekben is megemelkedik [Posner, M. R., Mayer, R. J., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 8, 533 (1994)]. Továbbá a CEA-szintek nem emelkednek meg vastagbél-adenomákban. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tûztük ki olyan eszközök biztosítását, ami lehetõ-
1
HU 005 678 T2
vé teszi vastagbél-adenoma és/vagy vastagbél-karcinóma korai detektálását. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célul tûztük ki olyan eszközök biztosítását, ami lehetõvé teszi vastagbél-adenoma és/vagy vastagbélkarcinóma szelektív és specifikus detektálását nem inváziós módszerrel. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célul tûztük ki olyan biomarker biztosítását, amit kolorektális adenoma és/vagy karcinóma detektálására lehet alkalmazni. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célul tûztük ki olyan tesztrendszer biztosítását kolorektális adenoma vagy karcinóma detektálására, ami költséghatékony és széles körben lehet alkalmazni. A tesztrendszernek továbbá könnyen kezelhetõnek és kényelmesnek kell lennie a kolorektális adenomára és/vagy karcinómára vizsgálandó személy számára. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során kitûzött célokat C3a vagy származékának biomarkerként történõ alkalmazásával oldottuk meg kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személyben. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során kitûzött célokat továbbá kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgáló eljárással oldottuk meg, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) elõállítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy származékának mennyiségét az izolált mintaanyagban, c) a C3a vagy származékának meghatározott mennyiségét egy vagy több referenciaértékhez viszonyítjuk. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során kitûzött célokat továbbá kolorektális adenoma és kolorektális karcinóma megkülönböztetésére szolgáló eljárással oldottuk meg, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) elõállítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy származékának mennyiségét az izolált mintaanyagban, c) a C3a vagy származékának meghatározott mennyiségét egy vagy több referenciaértékhez viszonyítjuk. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során kitûzött célokat kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kifejlõdésének és/vagy lefolyásának és/vagy kezelésének követésére szolgáló eljárással is megoldottuk, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) elõállítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy származékának mennyiségét az izolált mintaanyagban, c) a C3a vagy származékának meghatározott mennyiségét egy vagy több referenciaértékhez viszonyítjuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, mûtéti vagy terápiás eljárások hatékonysága kont-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
rollálva van abból a célból, hogy a kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma teljes mértékben meg lett¹e szüntetve. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, a kolorektális adenomában és/vagy kolorektális rákban szenvedõ páciens terápiája egy vagy több kémiai anyaggal, ellenanyaggal, antiszensz RNS-sel, besugárzással, például röntgensugárzással vagy ezek kombinációival van kontrollálva a kezelés hatékonyságának ellenõrzése céljából. A célokat olyan tesztrendszer elõállításával is megoldottuk, amely kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgál egy személytõl vett mintában, és az alábbiakat tartalmazza: a) ellenanyagot vagy receptort, amely C3a vagy származékának epitópjához képes kötõdni, b) szilárd hordozót, amely az ellenanyagot vagy receptort hordozza, c) reagenst, amely a C3a-epitóp vagy C3a-származék epitópjának az ellenanyaghoz vagy receptorhoz való kötõdését detektálja. A találmány szerinti megoldás során kitûzött célokat továbbá detekciós molekulákat tartalmazó mátrix („array”) elõállításával oldottuk meg kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személyben, amely detekciós molekulaként alábbiakat tartalmaz: a) nukleinsavpróbát egy szilárd hordozóra immobilizálva C3a¹t vagy származékát kódoló mRNS kötésére és detektálására, és/vagy C3a-fehérjék vagy származékaik kötésére és detektálására, vagy b) ellenanyagot egy szilárd hordozóra immobilizálva C3a-epitóp vagy C3a-származék epitópjának kötésére és detektálására, vagy c) receptort egy szilárd hordozóra immobilizálva C3aepitóp vagy C3a-származék epitópjának kötésére és detektálására, ahol az egyes detekciós molekulák elõnyösen különbözõ mennyiségben vannak immobilizálva a szilárd hordozóhoz a mérés pontosságának növelés céljából. A nukleinsavpróba például választható az alábbiak által alkotott csoportból: egyszálú vagy dupla szálú DNS vagy RNS, aptamerek és kombinációik. Az aptamerek egyszálú oligonukleotidok, amelyek specifikus, szekvenciafüggõ alakot vesznek fel, és fehérjecélpontokhoz képesek kötõdni nagy specifitással és affinitással. Aptamerek SELEX-eljárás [Tuerk, C. és Gold L., Science 249, 505–510 (1990); Ellington, A. D. és Szostak, J. W., Nature 346, 818–822 (1990)] alkalmazásával azonosíthatók. A találmány elõnyös megvalósítási módjait a függõ igénypontokban specifikáljuk. A találmány szerinti megoldásban a „mintaanyag” kifejezést „minta”-ként is használjuk. A találmány szerinti megoldásban a „biomarker” kifejezésen olyan fehérjét vagy fehérjefragmenst vagy nukleinsavat értünk, amely kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma elõfordulására utal. Ez azt jelenti, hogy a „biomarker”¹t kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgáló eszközként alkalmazzuk.
1
HU 005 678 T2
A „személy” vagy „személyek” kifejezésen a leírásban tágan véve emlõsszervezetet értünk. Az emlõsszervezet elõnyösen ember, például egy páciens. Az „egészséges személy” vagy „egészséges személyek” kifejezésen a leírásban olyan személyeket értünk, amelyek nem betegedtek meg kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában. Más szavakkal kifejezve, az „egészséges személy(ek)” kifejezést csak kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma patológiai állapotának vonatkozásában alkalmazzuk, és nem zárja ki, hogy a személy kolorektális adenomától és/vagy kolorektális karcinómától különbözõ betegségben szenved. A „származéka” kifejezésen bármilyen módosítást értünk DNS¹, mRNS- vagy fehérjeszinten, amely lehet például rövidített gén, a gén fragmensei, mutáns gén vagy módosított gén. A „gén” kifejezésen nukleinsavszekvenciákat értünk, például DNS¹, RNS¹, mRNSvagy fehérjeszekvenciákat vagy oligopeptidszekvenciákat vagy peptidszekvenciákat. A származék lehet egy módosítás, ami a gén egy deléciójának, szubsztitúciójának vagy inszerciójának eredménye. A gén módosulása lehet természetesen elõforduló génvariabilitás eredménye. A „természetesen elõforduló génvariabilitás” olyan módosulást jelent, amely nem géntechnológiai módosítás eredménye. A gén módosítása lehet a gén processzálásának eredménye a testben és/vagy egy lebomlási termék. A módosítás fehérjeszinten lehet enzimes vagy kémiai módosítás eredménye a testben. A módosítás lehet például glikozilálás vagy foszforilálás vagy farnezilálás. A származék elõnyösen legalább 5 aminosavat, elõnyösebben 10 aminosavat, a legelõnyösebben 20 aminosavat kódol vagy tartalmaz a módosítatlan fehérjében. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a származék az adott fehérje legalább egy epitópját kódolja. A „C3 vagy származéka” kifejezésen értünk a találmány szerinti megoldásban rövidített C3a¹t, C3a fragmenseit, mutáns C3a¹t, módosított C3a¹t vagy prekurzor C3¹at (1. ábra, 1. azonosító számú szekvencia) vagy C3 fragmenseit is. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a származék fehérjeszekvencia-azonossága 80%¹os, elõnyösen 90%¹os, elõnyösebben 98%¹os a 2. azonosító számú szekvenciával (2A. ábra, 2. azonosító számú szekvencia). „C3a” módosítása tulajdonítható enzimes vagy kémiai módosításnak. A „C3a vagy származéka” kifejezésen különösen olyan rövidített C3a-fehérjét értünk, amelynek molekulatömege elõnyösen 8950±25 Da; elõnyösebben 8950±20 Da tartományban van. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a rövidített C3a-fehérje molekulatömege 8939 Da. A C3a-fehérje elõnyösen nem tartalmaz C¹terminális arginint, és adott esetben molekulatömege 8950±20 Da tartományban van. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a C3a-származék C3a-dezArg (2B. ábra, 3. azonosító számú szekvencia). A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a C3a-származékhoz úgy jutunk, hogy C3a¹at masztocitából származó chymáz hasít. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
szerint, a C3a-származékhoz úgy jutunk, hogy C3a¹at C3¹konvertáz hasít. C3a az anafilatoxinokhoz tartozik. C3a, C4a és C5a a komplement rendszerhez tartozó szerin-proteázok proteolitikus termékei. C3a (2. azonosító számú szekvencia) a vérben lévõ komplement rendszer harmadik komponensébõl képzõdik (C3) (1. azonosító számú szekvencia) a komplement-aktiválás alatt. C3a egy helyi hatással rendelkezõ hormon. C3a-ban az aminosavak körülbelül 40%¹a helikális konformációban van. Szérum-anafilatoxinok sokféle celluláris immunválaszban játszanak szerepet, valamint potenciális proinflammációs ágensek. C3a jelentõs hatásokat képes kifejteni az erek falaira, simaizmok összehúzódására és növeli a vaszkuláris permeabilitást. C3a-ban a C¹terminális argininnek alapvetõ jelentõsége van biológiai aktivitásához. Az anafilatoxinokat a karboxipeptidáz¹N (anafilatoxin-inaktivátor) szabályozza, amely másodpercek alatt eltávolítja a karboxiterminális arginint. Ez a mechanizmus az intakt anafilatoxint kevésbé aktív C3a-dezArg-formába (3. azonosító számú szekvencia) konvertálja. Az „epitóp” kifejezés jelentése a leírásban egy fehérje vagy peptid vagy bármilyen fehérjeszerû struktúra bármilyen strukturális eleme, ami lehetõvé teszi ellenanyag vagy ellenanyagfragmens, egy fehérje- vagy peptidstruktúra vagy egy receptor kötõdését. A találmány szerinti eljárásokat egy mintaanyaggal végezzük, például testfolyadékkal vagy szövetmintával, amit az emberi testbõl izoláltunk. Ezt követõen a mintaanyagot frakcionálni és/vagy tisztítani lehet. A tesztelendõ mintaanyagot például fagyasztóban lehet tárolni, és a találmány szerinti eljárásokat alkalmas idõpontban lehet elvégezni az adott mintaanyag felolvasztása után. Meglepõ módon felismertük, hogy C3a-fehérjét vagy származékait biomarkerként lehet alkalmazni kolorektális adenoma és/vagy karcinóma detektálására. Meglepõ módon azt találtuk, hogy C3a-fehérje vagy származékának szintje megnövekedett egy olyan személy egy testfolyadékában, amely kolorektális adenomában és/vagy karcinómában szenved. A C3a-fehérje vagy származékának testfolyadékban mért szintjét továbbá egészséges emberek megkülönböztetésére lehet alkalmazni kolorektális adenomában és/vagy karcinómában szenvedõ emberektõl, valamint kolorektális adenomában szenvedõ emberek megkülönböztetésére lehet alkalmazni kolorektális karcinómában szenvedõ emberektõl. A találmány szerinti megoldásban a mintaanyag lehet szövet, sejt vagy testfolyadék. A mintaanyag elõnyösen egy testfolyadék, például vér, vérplazma, szérum, csontvelõ, széklet, ízületi folyadék, nyiroknedv, gerincvelõi folyadék, köpet, vizelet, anyatej, sperma, izzadmány és keverékei. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, a testfolyadékokat anioncserélõ kromatográfiával frakcionáljuk. A C3a-fehérje például pH=9,0 értéken eluálódik. A transzthyretin fehérje (p 13.776) például pH=4,0 értéken eluálódik. A testfolyadékot elõnyösen az elõtt végezzük, mielõtt a találmány szerinti eljárást végrehajtjuk. A ta-
1
HU 005 678 T2
lálmány szerinti eljárásokat elõnyösen in vitro végzi egy laboratóriumi technikus. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, C3a¹t vérplazmában vagy vérszérumban mérünk. Vérszérumhoz könnyen jutunk úgy, hogy vért veszünk egy orvosilag vizsgálandó személytõl, és elválasztjuk a felülúszót a kicsapott vértõl. C3a vagy származékának szintje a testfolyadékban, elõnyösen vérszérumban magasabb kolorektális karcinóma progresszív formájában. A kolorektális adenoma egy jóindulatú neoplazma, amely rosszindulatúvá válhat. Ha kolorektális rák fejlõdik ki jóindulatú kolorektális adenomából, C3a vagy származékának szintje testfolyadékokban, elõnyösen vérszérumban tovább emelkedik. Miután kolorektális adenoma kolorektális rákba transzformálódik, az ilyennel sújtott személy patológiás állapota tovább súlyosbodik metasztázis kialakulásával. A találmány szerinti megoldás olyan korai fázisra jellemzõ biomarkert biztosít, amely lehetõvé teszi neopláziás betegség detektálását egy korai és még jóindulatú állapotban, neopláziás betegség detektálását korai állapotban vagy jóindulatú állapotban és/vagy tumoros állapotokban. A korai detektálás lehetõvé teszi, hogy az orvos idõben eltávolítsa a kolorektális adenomát és a személy esélyét a túlélésre drámaian megnöveli. A találmány szerinti megoldás továbbá lehetõvé teszi a C3a-szint vagy C3a-származék-szint követését egy testfolyadékban, például vérszérumban hosszabb ideig, például évekig. A hosszú távú követés lehetõvé teszi egészséges személyek és kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ személyek megkülönböztetését. A C3a vagy származékának szintjét rutinszerûen lehet ellenõrizni, például évente egyszer vagy kétszer. Ha C3a vagy származékának szintjében növekedést detektálunk, ez kolorektális adenomára és/vagy korai kolorektális karcinómára utalhat. C3a vagy C3a-származék szintjének további növekedése malignus kolorektális karcinómába való transzformációra utalhat. Továbbá a betegség és/vagy kezelés lefolyását követni is lehet. Ha C3a vagy származékának szintje tovább növekszik, például a kolorektális adenoma eltávolítása után, ez utalhat a patológiás állapot súlyosbodására. Ez azt jelenti, hogy C3a vagy származékának szintje értékes klinikai paraméter kolorektális adenoma és/vagy karcinóma detektálására és/vagy követésére. C3a vagy származékának szintje testfolyadékokban magasabb kolorektális adenoma kialakulása után. Ezért C3a vagy származékának szintje egy fontos klinikai paraméter, ami lehetõvé teszi a betegség korai diagnosztizálását, és ennek következtében korai kezelését. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, olyan pácienseket, akikben a C3a vagy származékának szintje megemelkedett, ezután kolonoszkópiával vizsgálják.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
A találmány szerinti, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgáló eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: elõállítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, azután meghatározzuk a C3a vagy származékának szintjét az izolált mintaanyagban, és végül a C3a vagy származékának meghatározott szintjét egy vagy több referenciaértékhez viszonyítjuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, egy vagy több, további biomarkert pluszban detektálunk egy izolált mintaanyagban, amelyet egy személytõl vettünk, amelyben meghatározzuk a biomarker(ek) szintjét, és egy vagy több, megfelelõ referenciaértékhez viszonyítjuk. A referenciaértéket C3a vagy származékának átlagos szintjeként lehet számítani, amit egészséges személyektõl vagy kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ személyektõl vett, több izolált mintában határozunk meg. Ezeket a referenciaértékeket egy tartományként lehet kialakítani, amit normálnak tekintünk, ha a személy egészséges vagy kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában szenved. Egy konkrét érték a tartományon belül azután utalhat egészséges állapotra vagy kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma patológiás állapotára. A referenciaértékek ilyen tartományát egészséges személyektõl vett, statisztikailag releváns számú testfolyadék-mintából, például szérummintából lehet kialakítani, mint amit bármilyen más orvosi paraméter-tartomány, például vércukorszint esetén kialakítanak. Elõnyösen két referenciaértéket számítunk, amelyeket negatív kontrollnak és 1. pozitív kontrollnak jelölünk. A negatív kontrollnak megfelelõ referenciaértéket egészséges személyektõl vett minták alapján számítjuk, és a pozitív kontrollt kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ személyektõl vett minták alapján számítjuk. Elõnyösebben három referenciát számítunk, amit negatív kontrollnak, 1. pozitív kontrollnak és 2. pozitív kontrollnak hívunk. Az 1. pozitív kontrollt kolorektális karcinómában szenvedõ személyektõl vett minták alapján lehet számítani, és a 2. pozitív kontrollt kolorektális adenomában szenvedõ személyektõl vett minták alapján lehet számítani. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, a referenciaértékek lehetnek egyedi referenciaértékek, C3a vagy származékának átlagos szintjeként számítva, amelyek a személytõl egy idõtartam alatt vett, több izolált mintában vannak meghatározva. Ha C3a vagy származékának szintjét egy hosszabb idõtartam alatt, például hónapokig vagy évekig követjük, meg lehet határozni az átlagos szintet a személyben. A C3a- vagy származékának szintjét például ugyanabban a vérszérummintában lehet mérni, mint amelyben vércukrot mérünk, és ezt egyedi kalibrációs görbe felvételére lehet alkalmazni, ami C3a-szint vagy C3a-származék-szint bármilyen egyedi növekedésének specifikus detektálását teszi lehetõvé. További biomarkerekre is ugyanolyan módszerrel lehet referenciaértéket számítani, mint amit C3a¹ra leír-
1
HU 005 678 T2
tunk. C3a vagy további biomarkerek átlagszintjei lehetnek átlagos vagy középértékszintek. A találmány tárgyát képezi egy további vonatkozásában egy tesztrendszer kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személytõl vett izolált mintaanyagban. A tesztrendszer egy olyan ellenanyag vagy receptor specifitására épül, amely specifikusan képes C3a vagy származékának egy epitópjához vagy alkalmas strukturális eleméhez vagy fragmenséhez kötõdni. A receptor lehet bármilyen struktúra, ami specifikusan képes C3a-hoz vagy származékához kötõdni. A receptor lehet például egy ellenanyagfragmens, például Fab vagy F(ab’)2 fragmens vagy bármilyen peptidstruktúra, ami specifikusan képes C3a-hoz vagy származékához kötõdni. Az ellenanyag, ellenanyagfragmens vagy receptor egy szilárd hordozóhoz, például mûanyag felülethez vagy gyöngyökhöz van kötve, hogy lehetõvé tegye C3a vagy származékának kötõdését. Például hagyományos mikrotitertálcát lehet alkalmazni mûanyag felszínként. C3a vagy származékának kötõdését például úgy lehet detektálni, hogy detektálható csoporttal jelölt, szekunder ellenanyagot alkalmazunk. A detektálható csoport lehet például radioaktív izotóp vagy egy enzim, például tormaperoxidáz vagy alkalikus foszfatáz, amik alkalmas szubsztrát hozzáadásával detektálhatók, például színes vagy fluoreszcens jelet elõállítva. A tesztrendszer lehet immunológiai vizsgálati eljárás, például enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárás (ELISA) vagy radioaktív immunológiai vizsgálati eljárás (RIA) vagy lumineszcens vizsgálati eljárás (LIA). Azonban bármilyen más, ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek specifitását felhasználó immunológiai tesztrendszert lehet alkalmazni, például Western-blotot vagy immunprecipitációt. A találmány tárgyát képezi detekciós molekulákat tartalmazó mátrix is kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személyben, amelyben a detekciós molekula lehet nukleinsavpróba egy szilárd hordozóra immobilizálva C3a¹t, fragmenseit, mutánsait, variánsait vagy származékait kódoló mRNS kötésére és detektálására, vagy egy ellenanyag egy szilárd hordozóra immobilizálva C3a-epitóp vagy C3a-származék epitópjának kötésére és detektálására, vagy egy receptor egy szilárd hordozóra immobilizálva C3a-epitóp vagy C3a-származék epitópjának kötésére és detektálására. A mátrix elõnyösen további detekciós molekulákat tartalmaz, amelyek kolorektális adenoma és kolorektális karcinóma detektálására alkalmas biomarkerek. A nukleinsavpróba lehet bármilyen természetesen elõforduló vagy szintetikus oligonukleotid vagy kémiailag módosított oligonukleotidok, valamint cDNS, cRNS, apatamer és hasonlók. Ezzel alternatív módon, a találmány tárgyát képezi inverz mátrix, amely páciensbõl származó mintákat tartalmaz egy szilárd hordozóra immobilizálva, amelyeket a fentebb definiált detekciós molekulákkal lehet detektálni.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
A mátrix elõnyösen detekciós molekulákat tartalmaz, amelyek egy szilárd felületen azonosítható helyzetekben vannak immobilizálva. A mátrix kifejezést a találmány szerinti megoldásban egy csoportosításra vagy elrendezésre értjük, ami nem szükségszerûen szabályos elrendezést jelent. A mátrix elõnyösen legalább 2, elõnyösebben 5 különbözõ készletet tartalmaz detekciós molekulákból vagy páciensmintákból. A találmány szerinti mátrix elõnyösen legalább 50 készletet tartalmaz detekciós molekulákból vagy páciensmintákból, elõnyösebben legalább 100 készletet tartalmaz detekciós molekulákból vagy páciensmintákból. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti mátrix legalább 500 készletet tartalmaz detekciós molekulákból vagy páciensmintákból. A detekciós molekula lehet például nukleinsavpróba vagy ellenanyag vagy receptor. A leírt mátrixot a találmány szerinti tesztrendszerben lehet alkalmazni. A mátrix lehet „mikroarray” vagy „makroarray”. A detekciós molekulák egy szilárd felszínre vagy hordozóra vagy szilárd hordozófelszínre vannak immobilizálva. Ezt a mátrixot vagy „mikroarray”¹t azután olyan hibridizálódásra képes nukleionsavpróbákkal szkríneljük, amiket páciensmintákból preparáltunk, vagy a mátrixot olyan fehérjeszerû próbákkal érintkeztetjük, amiket páciensmintákból preparáltunk. A hordozó lehet polimer anyag, például nejlon vagy mûanyag vagy szervetlen anyag, például szilikon, például szilikonostya, vagy kerámia. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, üveget (SiO2) alkalmazunk szilárd hordozóanyagként. Az üveg lehet üveg tárgylemez vagy üvegchip. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módja szerint, az üvegszubsztrát atomosan sima felszínû. A mátrixot tartalmazhat például olyan immobilizált nukleinsavpróbákat, amelyek képesek C3a-nak vagy származékának megfelelõ mRNS-hez kötõdni, vagy ellenanyagokat, amelyek specifikusan képesek C3a-fehérjéhez vagy származékaihoz kötõdni, amelyek testfolyadékban, például szérumban jelen vannak. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint cDNS¹t állítunk elõ C3a¹t kódoló mRNS, vagy C3a-származékot kódoló mRNS reverz transzkripciójával, és specifikusan kimutatjuk a megfelelõ cDNS mennyiségét a mátrixszal. A mátrixot alkalmazó technológia szakember számára ismert. A mért mRNS vagy cDNS vagy fehérjék mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a mért értékeket egy standard vagy kalibrációs görbéhez viszonyítjuk, ami ismert mennyiségû C3a vagy származékának megfelelõ mRNS-sel vagy cDNS-sel vagy fehérjével lett felvéve. Elõnyösen az egyes detekciós molekulákból különbözõ mennyiséget immobilizálunk a szilárd hordozóra, hogy lehetõvé tegyük C3a vagy C3a-származék mennyiségének (szintjének) pontos meghatározását. A találmány más elõnyös megvalósítási módja szerint, C3a vagy származékának szintjét tömegspektroszkópiával határozzuk meg.
1
HU 005 678 T2
A tömegspektroszkópia lehetõvé teszi C3a vagy származékának specifikus detektálását molekulatömege alapján, és C3a vagy C3a-származék mennyiségének nagyon könnyû meghatározását. A tömegspektroszkópia területérõl bármilyen alkalmas, szakember által ismert ionizációs módszert lehet alkalmazni a C3a-nak vagy C3a-származéknak megfelelõ molekula, fragmensek, mutánsok, variánsok vagy származékok ionizálására. Az ionizációs módszer lehet elektronütközéses (EI), kémiai ionizációs (CI), térionizációs (FDI), elektrosprayionizációs (ESI), lézerdeszorpciós ionizációs (LDI), mátrix közvetítésével végzett („matrix assisted”) lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI) és felszínkatalizált („surface enhanced”) lézerdeszorpciós ionizáció (SELDI). A tömegspektroszkópia területén szakember által ismert, bármilyen alkalmas detekciós módszert lehet alkalmazni C3a vagy C3a-származék molekulatömegének meghatározására. A detekciós módszerek között szerepel quadropol tömegspektroszkópia (QMS), Fourier transzformációs tömegspektroszkópia (FT¹MS) és repülési idõ („time-of-flight”) tömegspektroszkópia. A tömegspektroszkópia elõnyösen felszínkatalizált lézerdeszorpciós ionizációs, repülési idõ („time-offlight”) tömegspektroszkópia (SELDI-TOF¹MS). SELDlTOF¹MS elvégzése elõtt egy izolált mintában lévõ C3a¹t vagy származékát elõnyösen egy chipre vagy aktivált felszínnel rendelkezõ, szilárd hordozóra immobilizáljuk. Az aktivált felszínen elõnyösen anti-C3a vagy anti-C3a-származék immobilizált ellenanyagok vannak, például amelyek nyúlban termeltetett, poliklonális ellenanyagok. Miután a C3a vagy származéka kötõdött az ellenanyagokhoz, repülési idõ („time-of-flight”) analízist végzünk SELDI-TOF tömegspektrométerben, ami intenzitásjeleket ad C3a vagy származékának meghatározásához. A tömegspektroszkópia továbbá lehetõvé teszi olyan más fehérjék egyidejû detektálását, amelyeknek jelentõsége van kolorektális adenoma és/vagy kolorektális rák kimutatásában. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatásának érzékenységét és/vagy specifitását további biomarker pluszban történõ detektálása fokozza. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatásának érzékenységét és/vagy specifitását különösen egy másik fehérje vagy nukleinsav C3a-val vagy származékával kombinációban történõ detektálása fokozza. A találmány szerinti eljárások, mátrixok, tesztrendszerek és alkalmazások érzékenységét és specifitását elõnyösen transzthyretin és származékainak C3a-val vagy származékával kombinációban történõ detektálása fokozza. A „transzthyretin vagy származéka” kifejezésen a találmány szerinti megoldásban rövidített transzthyretint, transzthyretin fragmenseit, mutáns transzthyretint vagy módosított transzthyretint is értünk. A „transzthyretin” módosítása lehet enzimes vagy kémiai módosí-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
tás eredménye. A „transzthyretin” kifejezést továbbá a transzthyretinmonomer vagy multimer formáira is használjuk. Például a „transzthyretin” kifejezésen különösen olyan monomer fehérjeláncot értünk, amely rendszerint része a homotetramer transzthyretin fehérjének. A transzthyretint prealbuminnak is hívják. A transzthyretin egy tetramer fehérje, amelynek molekulatömege körülbelül 54 000 Da, és amely elsõsorban a májban szintetizálódik. A transzthyretin normálisan homotetramer, amely négy fehérjeláncot tartalmaz, amelyek molekulatömege egyenként körülbelül 14 000 Da. Tömegspektroszkópia alkalmazásával a transzthyretin fehérjelánc számos variánsát kimutattuk, amelyek molekulatömege többek között 13 776 Da, 13 884 Da vagy 14 103 Da. Az találtuk, hogy különösen a 13 776 Da és 13 884 Da molekulatömegû traszthyretinmolekula-variánsok szintjei csökkennek testfolyadékban, például szérumban kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kialakulása esetén. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatásának érzékenységét és/vagy specifitását továbbá p53, CEA (karcinoembrionális antigén), és/vagy CA 19–9, CA 15–3, Kras, mutáns E¹kadherin, b¹katenin vagy származékaik C3a-val vagy származékával kombinációban történõ detektálása fokozza. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatásának érzékenysége és/vagy specifitása fokozható továbbá mutációk detektálásával párosodásra nem képes DNS-génekben, például MSH2¹, MSH3¹, MLH1¹, PMS1¹, PMS2¹, MSH6-génekben, például MLH1 vagy MLH2 mikroszatellit-instabilitásának detektálásával, SNP¹k (egyetlen nukleotid polimorfizmus) vagy C¹reaktív fehérje plazmakoncentrációinak detektálásával. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatásának érzékenysége és/vagy specifitása adott esetben fokozható CA15–3, CA–125 és/vagy Her-2/neu detektálásával C3a-val vagy származékával kombinációban. CA15–3 egy onkofetális antigén, amit számos karcinóma expresszál, és gyakran már tumormarkerekkel együtt mérik. CA15–3 és CA–125 egyaránt prognosztikus indikátor, elsõsorban mellrákra, de ezenkívül belsõ szervi metasztázisokra is. Her-2/neu amplifikálódása mellkarcinómában rossz prognózissal, rövid betegségmentes intervallummal és rövid túlélési idõvel társul. Jelenleg keveset tudunk Her-2/neu amplifikálódásának kiindulópontjáról és a folyamatról. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint, kolorektális adenomát és/vagy kolorektális karcinómát biomarkerként C3a és transzthyretin vagy származékaik kombinációjával mutatunk ki. Ez lehetõvé teszi kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma megnövelt érzékenységû és/vagy specifitású kimutatását. A kimutatási módszer továbbá jól elfogadható páciensek által, mivel a kimutatási módszer nem behatoló.
1
HU 005 678 T2
Az érzékenységet és a specifitást az alábbiak szerint definiáljuk: Az érzékenység a valódi pozitív páciensek száma (%) az összes páciens számára (100%) vonatkoztatva. A páciensek kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ személyek. A specifitás a valódi negatív személyek száma (%) valamennyi egészséges személy számára (100%) vonatkoztatva. Az érzékenységet és a specifitást alternatív módon lehet definiálni az alábbi képletekkel: Diagnózis + – teszt + TP FP – FN TN TP: valódi pozitív (teszt pozitív, diagnózis helyes); FP: fals pozitív (teszt pozitív, diagnózis nem helyes); TN: valódi negatív (teszt negatív, diagnózis helyes); FN: fals negatív (teszt negatív, diagnózis nem helyes). Az érzékenységet az alábbi képlettel számítjuk: TP/(TP+FN) és a specifitást az alábbi képlettel számítjuk: TN/(TN+FP). Az egyes analizált csoportok eredményeit, amely TP, FP, TN, FN bármelyike, egészséges személyekbõl álló, kolorektális adenomában szenvedõ páciensekbõl álló és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ páciensekbõl álló csoportból kiválasztott, több izolált mintára számítottuk. TP, FP, TN, FN a személyek számát jelenti, amelyek megfelelnek a valódi pozitív, fals pozitív, valódi negatív, fals negatív állapotnak, sorrendben. A találmány szerinti eljárásokat kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kimutatására szolgáló, más diagnosztikai módszerrel kombinációban lehet végezni az átfogó érzékenység és/vagy specifitás növelése céljából. C3a detektálása lehetõvé teszi kolorektális adenoma nagyon korai detektálását, és ezért nagyon korai markerként lehet alkalmazni. A találmány szerinti eljárásokat elõnyösen nagyon korai detektálási és/vagy követési eljárásként lehet alkalmazni. Ha a találmány szerinti eljárások eredményei kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma elõfordulására utalnak, további vizsgálatokat, például kolonoszkópiát kell végezni. Az alábbi poliklonális antitranszthyretin ellenanyagokat és anti-C3a ellenanyagokat lehet alkalmazni a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében: – Antitranszthyretin: PC 066, beszerezhetõ a „The Binding Site Ltd.” cégtõl, Birmingham, Nagy-Britannia, és A 0002, beszerezhetõ a DAKO cégtõl, Hamburg, Németország. – Anti-C3a-dezArg: rendelkezésre áll Quidel immunológiai vizsgálati eljárással (Quidel Corporation, 10165 McKellar Court, San Diego, CA 82121, USA). Ábrák 1. ábra: a C3¹fehérje szekvenciáját mutatja, 2. ábra: (A) a C3¹fehérje szekvenciáját és (B) a C3a-dezArg-fehérje szekvenciáját mutatja,
5
10
15
20
25
30
35
2
3. ábra: szérumminták frakcionálásának és jellemzésének vázlatos menetét mutatja, 4. ábra: C3a-dezArg mennyiségének meghatározása ELISA alkalmazásával. Nem rákos (n=28), adenomás (n=28) és kolorektális rákban szenvedõ páciensektõl (n=28) vett szérummintákat két párhuzamos alkalmazásával vizsgáltunk Quidel C3a enzimes immunológiai vizsgálati eljárásban (A=adenomás csoport, N=egészséges kontrollcsoport, T=rákos csoport), 5. ábra: C3a-dezArg analízisét mutatja A) ELISAval és B) SELDI-TOF MS¹sel. Az átlagos C3a-dezArg koncentrációk szignifikánsan magasabbak az adenomás és rákos csoportban, a nem rákos kontrollcsoporthoz viszonyítva (A=adenomás csoport, N=egészséges kontrollcsoport, T=rákos csoport), 6. ábra: transzthyretin analízisét mutatja A) radiális immundiffúzióval és B) SELDI-TOF MS¹analízissel. Az átlagos transzthyretinkoncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak az adenomás és rákos csoportban, a nem rákos kontrollcsoporthoz viszonyítva. Továbbá az átlagos transzthyretinkoncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak a rákos csoportban, az adenomás csoporthoz viszonyítva, radiális immundiffúzióval mérve. (A=adenomás csoport, N=egészséges kontrollcsoport, T=rákos csoport), 7. ábra: SELDI-TOF MS és immunológiai vizsgálati eljárás adatai közötti korrelációt mutatja. C3a-dezArg¹ot (A) ELISA-val, transzthyretint (B) radiális immundiffúzióval vizsgáltuk.
Példák Hacsak másképpen nem említjük, minden mód40 szert az analitikai rendszerek gyártója által kiadott protokoll szerint végeztünk.
45
50
55
60 8
Szérum vétele és szérum frakcionálása Három csoporthoz tartozó, humán páciensektõl vettünk és vizsgáltunk szérumot. Az 1. csoportba 28 páciens tartozott, akiket sebészi úton nem rákos betegségekre, például lágyéksérvre, epekövekre vagy divertikulumgyulladásra kezeltek. Ezeket, az 1. csoportba tartozó személyeket egészséges személyeknek tekintettük, azaz olyanoknak, akik nem szenvedtek kolorektális adenomában és/vagy kolorektális karcinómában. A 2. csoportba 28 páciens tartozott, akiket sebészi úton olyan nem meghatározott tumorokra kezeltek, amelyekrõl kiderült, hogy jóindulatú kolorektális adenomák. A 3. csoportba 28 olyan páciens tartozott, akiknek kolorektális karcinómája volt. Mind a 28 páciens III. fázisú TNM („Tumor Node Metastasis”) kolorektális karcinómában szenvedett.
1
HU 005 678 T2
Az etikai útmutatást és a páciensekkel kapcsolatos bizalmas információkezelést szigorúan betartottuk, és valamennyi páciens írásbeli beleegyezését adta a kísérletben való részvételhez. Valamennyi páciens mûtétre való felkészítése összehasonlítható volt, például koplalási idõ, és gyógyszerezés a mûtét idején. Az egyes páciensektõl vett szérumot anioncserélõ kromatográfiával (Serum Fractionation Kit, Q HyperD gyanta, Ciphergen Biosystems, Inc.) frakcionáltuk, 96 mérõhelyes formát tartalmazó, automata berendezéssel (Biomek2000, Ciphergen), a gyártó által megadott protokoll szerint, abból a célból, hogy csökkentsük a leggyakrabban elõforduló fehérjék zavaró hatását. A 3. ábrán bemutatottak szerint, a frakcionálás 6 frakciót eredményezett, amelyekben a fehérjék durván a fehérje pI¹értéke alapján voltak elválasztva. A C3A-dezArg fehérje (p 8.960 Da) az 1. frakcióban eluálódott pH=9,0¹es mosóoldattal (0,1% OGP¹t, azaz oktil-b-D-glükopiranozidot tartalmazó, 50 mM Tris-HCl, pH=9,0) (a Ciphergen Biosystems Inc. által definiált körülmények között, expressziós különbségeket térképezõ és szérumfrakcionáló reagenskészlet, kat. sz. K100–007). A transzthyretin fehérje (p 13.776 Da) a 4. frakcióban eluálódott pH=4,0¹en (0,1% OGP¹t tartalmazó, 100 mM nátrium-acetát, pH=4,0) (a Ciphergen Biosystems Inc. által definiált körülmények között, expressziós különbségeket térképezõ és szérumfrakcionáló reagenskészlet, kat. sz. K100–007). SELDI-TOF-MS-analízis CM10-„fehérje-array”¹k egy bioprocesszorban (Ciphergen Biosystems, Inc.) dolgoztunk fel, a gyártó által kiadott protokoll szerint. A chipeket CM10-kötõpufferrel (Ciphergen Biosystems, Inc.) ekvilibráltuk 2×5 percig, és azt követõen a szérumfrakciókkal (amelyeket 1:10arányban hígítottunk CM10-kötõpufferben) inkubáltuk. 45 perc elteltével a nem kötõdött anyagot eltávolítottuk, és a chipeket 3¹szor mostuk CM10-kötõpufferrel, és 2¹szer vízzel. Szobahõmérsékleten szárítottuk 10 percig, hozzáadtunk 2 adagban 0,05 M szinapinsavat (1 ml), és a chipeket „Ciphergen Protein ChipReader” leolvasóban (modell: PBSII) analizáltuk. A „Protein ChipReader” egy repülési idõ („time-offlight”) tömegspektrométer. A detektált fehérjékre kapott tömegértékeket és a jelek intenzitását bevittük egy szoftverbe, amelyet a Ciphergen cégtõl szereztünk be további „in-depth” analízis céljára, a „ProteinChip Data Analysis Program” és a „Biomarker Wizard Program” alkalmazásával. Az adatok variabilitásának minimalizálása céljából, a méréseket két napon belül elvégeztük valamennyi pácienscsoportból vett minták alkalmazásával, random elosztva a chipeken. Normalizálás céljából standard kontrollként egyesített („pooled”) normál szérumot alkalmaztunk párhuzamosan valamennyi méréshez. A fehérjék tömegspektrumait átlagosan 195 lézerlövés alkalmazásával állítottuk elõ, 185 lézerintenzitásnál. A detektort 7¹es érzékenységen futattuk. Adatgyûjtéshez a detekciós mérettartományt 2000 és 40 000 Da közé állítottuk. A lézert 10 000 Da¹ra fóku-
5
2
száltuk. Az adatokat ProteinChip Data Analysis Program (3.1 verzió, Ciphergen Biosystems) és Biomarker Wizard Program (3.1 verzió, Ciphergen Biosystems) alkalmazásával analizáltuk. A csúcsintenzitásokat a teljes ionáramra normalizáltuk. Meg kell jegyeznünk, hogy a mért molekulatömegek mérésrõl mérésre változhatnak, és az alkalmazott tömegspektroszkóp specifikációjától függhetnek. C3a-dezArg mért molekulatömege 8,950±25 Da tartományban lehet.
10
15
20
25
30
C3a ELISA vizsgálati eljárás A C3a-dezArg-fragmens mennyiségét szérumban enzimes immunológiai vizsgálati eljárás alkalmazásával mértük, amit a Quidel cégtõl (Quidel Corporation, 10165 McKellar Court, San Diego, CA) szereztünk be. Az ELISA¹t a gyártó utasításai szerint végeztük. A reagenskészletben található mikrotitercsíkok humán C3a-dezArg¹ra specifikus, monoklonális ellenanyaggal vannak burkolva (Quidel cégtõl beszerezhetõ immunológiai vizsgálati eljárás). A mintákat 1:500 arányban hígítottuk, és egy óra hosszáig inkubáltuk 18–25 °C¹on. Az inkubálás alatt a mintában lévõ C3a-dezArg kötõdik a monoklonális ellenanyaghoz. Miután elmostuk a nem kötõdött, natív C3¹at, peroxidázzal jelölt, nyúlban termeltetett, anti-C3a¹at alkalmaztunk a kötõdött C3a-dezArg detektálására. A feleslegben lévõ konjugátumot egy mosási lépéssel eltávolítottuk, és a szérummintában lévõ C3a-dezArg mennyiségét a peroxidázreakcióban mérjük és standard görbe alapján határozzuk meg.
Radiális immundiffúzió transzthyretin mennyiségi meghatározására A radiális immundiffúziós vizsgálati eljárást (Tina35 Quant Prealbumin vizsgálati eljárás, immunoturbidimetriás vizsgálati eljárás prealbumin meghatározására, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország, kat. sz. 11660519) egy klinikai laboratóriumban végeztük. A szérumokat henger alakú mérõhelyekre adagoltuk, 40 amelyeket egy olyan gélmátrixba vágtunk, ami egyenletes koncentrációban monospecifikus ellenanyagokat tartalmazott. A mérõhelyre adagolt antigén gyorsan diffundál, és precipitációs gyûrûk keletkeznek. A precipitációs gyûrûk egy éjszakás inkubálás után bármikor, vagy 45 végpontban leolvashatók. Az eredményekhez számszerûen úgy jutunk, hogy a mintánál keletkezett precipitációs gyûrû átmérõjét viszonyítjuk ismert koncentrációjú standardeknél keletkezett precipitációs gyûrûkhöz. Az adatok statisztikai kiértékelése A három pácienscsoportra küszöbértékeket C&RT (CART) algoritmussal számítottunk, döntési fa analízis alapján [Breiman, L. és munkatársai, „Classification and regression trees” címû könyv, Monterey, CA, 55 Wadsworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software (1984)]. A küszöbértékeket azért számítottuk, hogy kiválasszuk és specifikáljuk a limitáló értékeket a különbözõ analíziscsoportok között. A kiértékelést STATISTICA Software 7.1 verziójával végeztük, amely a 60 STATSOFT INC. cégtõl származott, a döntési fa analí50
9
1
HU 005 678 T2
zist „Data-Miner Modul subprogramm Standard Classification Trees” (CandRT) [StatSoft, Inc., (2005) alkalmazásával végeztük, STATISTICA (data analysis software system), 7.1 verzió, www.statsoft.com]. A statisztikai adatokat átlagérték és szórás (standard deviáció) alapján értékeltük ki. Továbbá az ábrákon átlag±95 konfidenciaintervallum látható, ami arra utal, hogy ebben az intervallumban 95%¹os valószínûséggel valódi középértékeket találtunk a gyógyulási esélyekkel rendelkezõ pácienscsoportra. A statisztikai kiértékelést T¹teszt alkalmazásával végeztük. A teszteket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha a p¹értékek p<0,05 voltak. A boxdiagramon, a boxokon lévõ karok mutatják a szórást. 1. példa Ebben a kísérletben C3a-dezArg expresszióját nem karcinómás páciensektõl vett szérumban (1. csoport, n=28) és kolorektális adenomában szenvedõ páciensektõl vett szérumban (2. csoport, n=28) és kolorektális karcinómában szenvedõ páciensektõl vett szérumban (3. csoport, n=28) azonosítottuk, két párhuzamos alkal-
2
mazásával ELISA-ban (Quidel C3a enzim immunológiai vizsgálati eljárás), és SELDI-TOF-MS-analízissel, a fentebb leírtak szerint. 5
2. példa Transzthyretin expresszióját radiális immundiffúzióval és SELDI-TOF MS¹analízissel mértük a fentebb leírtak szerint, ugyanabban a pácienskörben.
10
Eredmények és statisztikai kiértékelés A 4. ábrán bemutatottak szerint, C3a-dezArg koncentrációjának (ng/ml) intenzitása szignifikánsan különbözik a három csoportban. A C3a-dezArg-szint növekszik az egészséges személyektõl a kolorektális 15 adenomában szenvedõ pácienseken át a kolorektális karcinómában szenvedõ páciensekig. Az 1. táblázatban bemutatjuk C3a-dezArg (ng/ml) és transzthyretin (g/l) szérumszintjeinek eloszlását 84 szérummintában, SELDI-TOF MS és validáláshoz 20 immunológiai vizsgálati eljárások (C3a-dezArg-ELISA, transzthyretin immundiffuzió) alkalmazásával. Az egyes csoportokban 28 szérummintát mértünk meg.
1. táblázat Módszer
Átlag± szórás N
Átlag± szórás A
Átlag± szórás T
Átlag± szórás A+T
p érték N vs. A
Transzthyretin
immundiffúzió
0,250± 0,043
0,191± 0,035
0,154± 0,056
0,172± 0,05
0,000001 0,000001 0,000001
0,0046
Transzthyretin MG 13.776 Da
SELDI
1,728± 0,462
1,123± 0,287
0,996± 0,497
1,060± 0,407
0,000001 0,000001 0,000001
0,247
C3a-dezArg
ELISA
863,51± 678,93
1871,12± 1090,62
2513,33± 2060,46
2192,23± 1665,25
0,00011
0,000179 0,000117
0,150
C3a-dezArg MG 8.960 Da
SELDI
0,5724± 0,387
1,363± 1,012
1,552± 1,271
1,458± 1,143
0,00030
0,000268 0,00015
0,541
Változó
C3a-dezArg szérumban ELISA-val mért koncentrációi szignifikánsan magasabbak voltak adenomás és karcinómás páciensekben, a nem rákos kontrollcsoporthoz viszonyítva (5A. ábra). Az adatok szerint lehetséges volt megkülönböztetni egészséges személyeket a rákos páciensektõl. Továbbá meg lehetett különböztetni az egészséges személyeket az adenomás páciensektõl is. Az eredmények nagyon hasonlóak voltak a SELDI-TOF MS¹analízissel kapott adatokhoz (5B. ábra). A 7. ábrán egy szórásgörbe látható mindkét módszerre (SELDI-TOF MS és ELISA), ami jó korrelációt mutat (7A. ábra; r=0,7) a p8.960 SELDI-TOF MS¹sel mért intenzitása és a C3a-dezArg ELISA-val mért koncentrációja között minden egyes páciensre, valamint jó korrelációt mutat (7B. ábra; r=0,81) a p13.776 SELDI-TOF MS¹sel mért intenzitása és a transzthyretin ELISA-val mért koncentrációja között minden egyes páciensre. A transzthyerinadatokhoz SELDI-TOF MS¹analízissel (6B. ábra) jutottunk, és radiális immundiffúzióval erõsítettük azokat meg (6A. ábra). Kolorektális rákban
p érték N vs. T
P érték N vs. A+T
p érték A vs. T
40 szenvedõ páciensekben a transzthyretin szignifikánsan alacsonyabb volt nem rákos páciensekhez képest. Továbbá a transzthyerin koncentrációi adenomás páciensek szérumában még szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint normál szérumban. 45 A 2. táblázatban bemutatjuk C3a-dezArg érzékenységének és specifitásának összehasonlítását, SELDITOF MS¹sel és ELISA-val mérve, sorrendben, egészséges kontrollok és adenomás/tumoros páciensek közötti megkülönböztetés céljából. 50 2. táblázat C3a-dezArg (egészséges kontrollok adenomás+tumoros páciensekkel szemben) ELISA
55 Érzékenység
75%
Specifitás
78%
A 3. táblázatban bemutatjuk transzthyretin érzé60 kenységének és specifitásának összehasonlítását, 10
1
HU 005 678 T2
2
SELDI-TOF MS¹sel és radiális immundiffúzióval mérve, sorrendben, egészséges kontrollok és adenomás/tumoros páciensek közötti megkülönböztetés céljából.
6. táblázat Transzthyretin
3. táblázat Transzthyretin (egészséges kontrollok adenomás+tumoros páciensekkel szemben)
10 SELDI-TOF MS
Radiális immundiffúzió
Érzékenység
75%
88%
Specifitás
90%
70%
A 4. táblázatban bemutatjuk mindkét biomarker (C3a-dezArg/transzthyretin) érzékenységének és specifitásának összehasonlítását kombinációban alkalmazva. C3a-dezArg¹t és transzthyretint immunológiai vizsgálati eljárással mértünk, egészséges kontrollok és adenomás/tumoros páciensek közötti megkülönböztetés céljából. A küszöbértékek transzthyretinre (TTR) és C3a-dezArg¹ra zárójelben láthatók. 4. táblázat C3a-dezArg és transzthyretin kombinációja (egészséges kontrollok adenomás+tumoros páciensekkel szemben) SELDITOF MS
Radiális immundiffúzió/ELISA (TTR<0,22 és C3a-dezArg>1000)
70%
67%
100%
89%
Érzékenység Specifitás
Normál vs. adenoma
Normál vs. tumor
Normál vs. adenoma+tumor
Érzékenység
86% (0,225)
61% (0,165)
88% (0,22)
Specifitás
68%
100%
70%
5
Az 5. táblázatban bemutatjuk C3a-dezArg érzékenységét és specifitását egyetlen biomarkerként alkalmazva. C3a-dezArg szintjeit ELISA-val mértük egészséges kontrollok és adenomás és/vagy tumoros páciensek közötti megkülönböztetés céljából. A küszöbértékek zárójelben láthatók. 5. táblázat C3a-dezArg
A 7. táblázatban bemutatjuk C3a-dezArg és transzthyretin (TTR) érzékenységét és specifitását kombinációban. Transzthyretin és C3a-dezArg szintjeit ELISA-val és radiális immundiffúzióval mértük, sor15 rendben. A küszöbértékek zárójelben láthatók. 7. táblázat Transzthyretin (TTR) és C3a-dezArg kombinációja
Érzékenység
25
Normál vs. tumor
Normál vs. adenoma+tumor
Érzékenység
79% (990)
61% (1786)
75% (990)
Specifitás
78%
93%
78%
A 6. táblázatban bemutatjuk transzthyretin érzékenységét és specifitását egyetlen biomarkerként alkalmazva. Transzthyretin szintjeit radiális immundiffúzióval mértük egészséges kontrollok és adenomás és/vagy tumoros páciensek közötti megkülönböztetés céljából. A küszöbértékek zárójelben láthatók.
Specifitás
97% (0,225 TTR) és (1974 C3a-dezArg) 70%
Ezek az adatok azt mutatják, hogy C3a, adott esetben kombinációban transzthyretinnel kiváló biomarker(ek) kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására. A már ismert biomarkerekkel, 30 CEA-val és CA 19–9-cel szemben, különbséget lehet tenni egészséges személyek és adenomás páciensek között. A C3a-teszt érzékenysége és specifitása magas, és lehetõvé teszi adenomák korai specifikus detektálását kolonoszkópia nélkül. Különösen C3a és 35 transzthyretin biomarkerek kombinációban történõ alkalmazása teszi lehetõvé adenomák kimutatását kiváló érzékenységgel és magas specifitással.
40
45
Normál vs. adenoma
Normál vs. adenoma
20
50
55
60 11
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: a) biztosítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának szintjét az izolált mintaanyagban, c) összehasonlítjuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának meghatározott szintjét egy vagy több referenciaértékkel. 2. Eljárás kolorektális adenoma és kolorektális karcinóma megkülönböztetésére, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: a) biztosítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának szintjét az izolált mintaanyagban,
1
HU 005 678 T2
c) összehasonlítjuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának meghatározott szintjét egy vagy több referenciaértékkel. 3. Eljárás kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma kifejlõdésének és/vagy lefolyásának és/vagy kezelésének követésére, amely tartalmazza a következõ lépéseket: a) biztosítunk egy izolált mintaanyagot, amit egy személytõl vettünk, b) meghatározzuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának szintjét az izolált mintaanyagban, c) összehasonlítjuk a C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának meghatározott szintjét egy vagy több referenciaértékkel. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a C3a vagy származékának szintje a kolorektális adenomában vagy kolorektális karcinómában szenvedõ pácienstõl vett mintaanyagban magasabb, mint egy egészséges személytõl vett mintaanyagban. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol egy elsõ mintaanyagban C3a vagy C3a-származék szintjének elsõ növekedése kolorektális adenomára utal, és ahol egy második mintaanyagban C3a vagy C3a-származék szintjének második növekedése kolorektális karcinómára utal, ahol a második mintaanyagot a személybõl egy késõbbi idõpontban izolálták, mint az elsõ mintaanyagot, azzal a kikötéssel, hogy a második növekedés nagyobb mértékû, mint az elsõ növekedés. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (b) lépésben meghatározunk a kolorektális adenoma vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgáló egy vagy több további biomarkert az izolált mintaanyagban, és ahol a (c) lépésben a biomarker(ek) meghatározott szintjét összehasonlítjuk egy vagy több, megfelelõ referenciaértékkel. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására szolgáló legalább egy további biomarker adott esetben az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: transzthyretin, p53, CEA, CA 19–9, CA 15–3, CA–125, Kras, b¹katenin, Her-2/neu, C¹reaktív plazmafehérje és származékai, és mutációk E¹kadherin¹, MSH2¹, MSH3¹, MLH1¹, PMS1¹, PMS2¹, MSH6-génekben, és MLH1 vagy MLH2 mikroszatellit-instabilitása és SNP¹k és ezek kombinációi. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol C3a és/vagy származékának/származékainak referenciaértékét/¹értékeit, és adott esetben a további biomarker(ek) és/vagy származékának/származékainak referenciaértékét/¹értékeit úgy számítjuk, mint a C3a és/vagy származékának/származékainak, és adott esetben a további biomarker(ek) és/vagy származékának/származékainak átlagos szintjét személyek megfelelõ csoportjától vett több izolált mintában, ahol a személyek csoportját egészséges személyek, kolorektális adenomában szenvedõ páciensek és/vagy kolorektális karcinómában szenvedõ páciensek alkotják.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
9. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a referenciaérték egyedi referenciaérték(ek), amely(ek) a C3a és/vagy származékának, és adott esetben a további biomarker(ek) és/vagy származékának/származékainak átlagos szintjeként van(nak) számítva, a személytõl egy idõtartam alatt vett több izolált mintában. 10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az izolált mintaanyag testfolyadék, és adott esetben az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: vér, vérplazma, szérum, csontvelõ, széklet, ízületi folyadék, nyiroknedv, gerincvelõi folyadék, köpet, vizelet, anyatej, sperma, izzadmány és ezek keverékei. 11. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a C3a és/vagy származékának, és adott esetben a további biomarker(ek) szintje a mintaanyagban DNS¹, mRNS- és/vagy fehérjeszinten van meghatározva. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a C3a és/vagy származékának, és adott esetben a további biomarker(ek) szintje a mintaanyagban nukleinsavhibridizációs technikával, immunológiai módszerekkel vagy proteomikai technikával és/vagy tömegspektroszkópiával van meghatározva. 13. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az eljárást kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma diagnosztizálására szolgáló további diagnosztikai eljárással kombinálva hajtjuk végre, az érzékenység és/vagy specifitás növelése céljából. 14. C3a vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának alkalmazása biomarkerként kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személytõl vett izolált mintában. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma korai detektálására egy személytõl vett izolált mintában. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti alkalmazás egy vagy több, kolorektális adenomára és/vagy kolorektális karcinómára utaló további biomarkerrel kombinálva, az érzékenység és/vagy specifitás növelése céljából. 17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a legalább egy további biomarker adott esetben a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: transzthyretin, p53, CEA, CA 19–9, CA 15–3, CA–125, Kras, b¹katenin, Her-2/neu, C¹reaktív plazmafehérje és származékai, és mutációk E¹kadherin¹, MSH2¹, MSH3¹, MLH1¹, PMS1¹, PMS2¹, MSH6-génekben, és MLH1 vagy MLH2 mikroszatellit-instabilitása és SNP¹k és ezek kombinációi. 18. Immunológiai vizsgálati eljárás kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma detektálására egy személytõl vett izolált mintában, amely tartalmazza az alábbiakat: a) ellenanyag vagy receptor, amely C3a-epitóphoz vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ származékának epitópjához kötõdik, b) szilárd hordozó, amely az ellenanyagot vagy receptort hordozza,
1
HU 005 678 T2
c) reagens a C3a-epitóp vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ C3a-származék epitópjának az ellenanyaghoz vagy receptorhoz való kötõdésének detektálására, ahol az immunológiai vizsgálati eljárás egy vagy több ellenanyagot vagy receptort tartalmaz kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma egy vagy több további biomarkerének detektálására. 19. A 18. igénypont szerinti immunológiai vizsgálati eljárás, ahol a legalább egy további biomarker adott esetben az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: transzthyretin, p53, CEA, CA 19–9, CA 15–3, CA–125, Kras, b¹katenin, Her-2/neu, C¹reaktív plazmafehérje és származékai, és mutációk E¹kadherin¹, MSH2¹, MSH3¹, MLH1¹, PMS1¹, PMS2¹, MSH6-génekben, és MLH1 vagy MLH2 mikroszatellit-instabilitása és SNP¹k és ezek kombinációi. 20. Mátrix, amely kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma személyben történõ detektálására szolgáló detekciós molekulaként tartalmaz: a) szilárd hordozóra immobilizált nukleinsavpróbát a C3a¹t vagy származékát kódoló mRNS kötésére és detektálására, vagy
2
b) szilárd hordozóra immobilizált ellenanyagot a C3aepitóp vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ C3aszármazék epitópjának kötésére és detektálására, vagy 5 c) szilárd hordozóra immobilizált receptort a C3aepitóp vagy ugyanolyan funkcióval rendelkezõ C3a-származék epitópjának kötésére és detektálására, ahol elõnyösen az egyes detekciós molekulák különbö10 zõ mennyiségben vannak immobilizálva a szilárd hordozóhoz a mérés pontosságának növelés céljából, ahol a mátrix egy vagy több ellenanyagot vagy receptort tartalmaz kolorektális adenoma és/vagy kolorektális karcinóma egy vagy több további biomarkerének de15 tektálására. 21. A 20. igénypont szerinti mátrix, ahol a legalább egy további biomarker adott esetben az alábbiak által alkotott csoportból van kiválasztva: transzthyretin, p53, CEA, CA 19–9, CA 15–3, CA–125, Kras, b¹katenin, 20 Her-2/neu, C¹reaktív plazmafehérje és származékai, és mutációk E¹kadherin¹, MSH2¹, MSH3¹, MLH1¹, PMS1¹, PMS2¹, MSH6-génekben, és MLH1 vagy MLH2 mikroszatellit-instabilitása és SNP¹k és ezek kombinációi.
13
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
14
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
15
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
16
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
17
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
18
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
19
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
20
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
21
HU 005 678 T2 Int. Cl.: G01N 33/574
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
