!HU000008067T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 067
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 422356 P 2002. 10. 30.
(73) Jogosult: MERCK SHARP & DOHME CORP., Rahway, New Jersey (US)
US
(72) Feltalálók: GOKLEN, Kent, E., Rahway, NJ 07065-0907 (US); NTI-GYABAAH, Joseph, Rahway, NJ 07065-0907 (US); ANTIA, Firoz, D., Rahway, NJ 07065-0907 (US); DAHLGREN, Mary, Ellen, Rahway, NJ 07065-0907 (US) (54)
HU 008 067 T2
B01D 15/00
(21) Magyar ügyszám: E 03 776553 (22) A bejelentés napja: 2003. 10. 24. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030776553 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1558354 A2 2004. 05. 21. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1558354 B1 2010. 02. 17.
(2006.01) B01D 15/08 (2006.01) C07K 1/16 (2006.01) C07K 14/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04042350 PCT/US 03/033978
(74) Képviselõ: Kerény Judit, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Aminok, aminosavak vagy aminosav-észterek alkalmazása a kromatográfiában mobilfázis-módosítókként
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 067 T2
Kereszthivatkozás rokon bejelentésekre Ez a bejelentés a 2002. október 30¹án benyújtott, 60/422356 sz. ideiglenes USA bejelentés elsõbbségét igényli. 5 A találmány területe A találmány tárgya aminok, aminosavak vagy aminosav-észterek mobilfázis-módosítókként történõ alkalmazása lipopeptidvegyületek normál fázisú kromatográfiájában. A találmány háttere Régebben az olyan kulcsszennyezõdések, mint a Pneumocandin B5 és E0 Pneumocandin B0-ból történõ rezolválása szilikagél HPLC tisztításnál gyenge volt. Bizonyos analógok csak részben reszolválódtak a fõ termékcsúcsból preparatív körülmények között. A kívánt terméktisztaság eléréséhez a korlátozott reszolválás miatt a tisztítási lépést alacsony oszlopterhelés mellett kellett végezni, ami csökkentette a termelékenységet. A lipopeptidek, pl. a Pneumocandin B0, gyakran fermentációs eljárás termékei. Az ilyen fermentációs eljárás során sok nagyon hasonló analógot állítanak elõ a kívánt termékkel egyidejûleg. Gyakran normál fázisú kromatográfiás rendszereket használnak a nyers fermentációs termék tisztítására. Egy normál fázisú kromatográfiás rendszer rendszerint egy állófázisból és egy mobilfázisból áll. Egy peptid vagy lipopeptid tisztí-
10
15
20
25
2
tásához az állófázis lehet szilikagél vagy alumíniumoxid, a mobilfázis pedig lehet egyetlen oldószer vagy oldószerek elegye, ami szerves oldószerekbõl és vízbõl áll. A szilikagél-kromatográfia és a normál fázisú kromatográfia más típusai használhatók ezen analógok szétválasztására. A gyakorlatban azonban bizonyos közeli analógoknak a kívánt terméktõl történõ reszolválása gyakran gyenge és nem kielégítõ, mert a reszolválódás nem hatékony, és gyakran átfedés van. Annak érdekében, hogy a fõ terméket a kívánt tisztaságban és ésszerû termeléssel kapjuk, korlátozni kell a ciklusonként az oszlopra töltött anyag mennyiségét (gyakran töltésnek vagy oszloptöltetnek is nevezik), ami viszont gátat szab a mûvelet termelékenységének. A Pneumocandin B0 tisztítása ebbe a kategóriába tartozik. A kromatográfia során oldószerek, különösen etil-acetát (EtOAc), metanol (MeOH) és víz elegyébõl álló mobilfázist alkalmaznak egy szilikagél oszlopon. Az 1065 dalton molekulatömegû Pneumocandin B0 egy természetes termék, és intermedierként szolgál a Caspofungin-acetát (Cancidas®) elõállításánál. A Pneumocandin B0¹t szekunder metabolitként állítják elõ a Glarea lozoyensis gomba fermentációja során. Lásd az 5 194 377 és 5 202 309 sz. USA szabadalmakat. A Pneumocandin B0 és két kulcs analóg szennyezõdés szerkezetét, melyek mindegyike dimetil-mirisztátoldallánccal kondenzált ciklusos hexapeptidbõl áll, az (I) képletben és az 1. táblázatban mutatjuk be.
(I) képlet 1. táblázat Pneumocandin B0 és két analógia R1
R2
R3
R4
R5
R6
Pneumocandin B0
OH
OH
Me
OH
H
OH
Pneumocandin B5
OH
H
Me
OH
H
OH
Pneumocandin E0
OH
OH
Me
OH
H
H
Vegyület
A szilikagél-kromatográfia a kívánt termék hidroxilcsoportban gazdag ciklusos hexapeptid magjának és az analóg szennyezõdéseknek, beleértve a B5 és E0 Pneumocandint, kötõdési affinitásában megmutatkozó 60 2
árnyalatnyi eltéréseket használja ki az elválasztáshoz. A szilikagél HPLC tisztítás során a B5 és E0 Pneumocandin, kettõ a Pneumocandin B0 fermentálásakor keletkezõ kulcs analóg szennyezõdések közül, a Pneu-
1
HU 008 067 T2
mocandin B0-hoz nagyon közel eluálódik. Ezért annak érdekében, hogy ezen és hasonló analóg vegyületek esetében a tisztított anyagban a szennyezõdés célzott szintje teljesíthetõ legyen, az oszlopra tölthetõ nyers Pneumocandin B0 mennyisége korlátozott. Ennek eredményeképpen jelentõs erõfeszítések történtek a kulcsszennyezõdések reszolválásának javítása érdekében. Így például a hármas etil-acetát–metanol–víz mobilfázist kiegyensúlyozták a Pneumocandin B0 és a kulcs analóg szennyezõdések közötti reszolválás optimalizálására: D. J. Roush, F. D. Antia, K. E. Göklen J. Chromagraphy A, 827 (1998) 373–389. T. Yoshida és T. Okada a J. Chromatography A, 840 (1999) 1–9 irodalomban leírják a mobilfázis hatását a peptidszétválasztásokra normál fázisú folyadékkromatográfia alkalmazásakor. Hasonló hatásokról számolnak be a JP 11–023558 irodalomban. A találmány összegzése A jelen találmány tárgya mobilfázis-módosítók, ideértve az aminosavakat, aminosav-észtereket vagy aminokat, alkalmazása lipopeptid HPLC-vel történõ tisztítása során. A mobilfázis-módosítók az állófázishoz kötõdnek, és módosítják az állófázis kötõdési jellemzõit, ezáltal javítva a kívánt lipopeptid rokon szennyezõdéseibõl történõ reszolválását és/vagy tisztítását. Ez a találmány hasznos az analitikai kromatográfiában, és még értékesebb a preparatív kromatográfia (azaz a kromatográfia ipari méretû tisztítási módszerként történõ alkalmazása) számára. Közelebbrõl, aminosavakat, aminosav-észtereket vagy aminokat használhatunk mobilfázis-módosítókként a lipopeptidek kromatográfiás tisztítása során, például Pneumocandin B0 tisztításához, ami a természetes eredetû kiindulási anyag (fermentációs termék) Caspofungin-acetát (Cancidas®) elõállításához. A találmány más lipopeptidek, pl. Micafungin, Anidulafungin, Cilofungin és Daptomycin fermentációs termék prekurzorának tisztítására is alkalmazható.
5
4. ábra Mobilfázisként 20% etil-acetát és 80% etil-ace20 tát–metanol–víz 87/9/7 térfogatarányú elegy alkalmazásával nyersen eluált Pneumocandin B0 szilikagél HPLC kromatogramja. Ez a mobilfázis-elegy növeli a Pneumocandin B0 retenciós idejét, de anélkül, hogy javítaná az analógjaitól történõ reszolválást, mint ahogy 25 az megfigyelhetõ volt, amikor prolint adtunk a mobilfázishoz (lásd a 3. ábrát). (A Pneumocandin B0 retenciós ideje 23 perc.) 5–11. ábrák Szilikagél HPLC-kromatogramok (A) mobilfázis-módosító nélkül (kontroll) és (B) a különbözõ aminosavak mobilfázishoz történõ adagolásával nyersen eluált Pneumocandin B0 esetében. Az ábrák azt mutatják, hogy az aminosavak hozzáadása hatással van a Pneu35 mocandin B0 retenciójára és/vagy analógjaitól történõ reszolválására (analitikai skála 5 m YMC szilícium-dioxid-oszlop 87/9/7 térfogat% etil-acetát/metanol/víz felhasználásával). 30
40
2. ábra 2A. ábra: a Pneumocandin B0 retenciós idejének diagramja a prolintartalmú oldat oszlopra történõ injektálását követõen, mely diagram megnövekedett retenciós idõt mutat, ami visszatér az eredeti retenciós idõre, ahogy a prolin lassan deszorbeálódik az oszlopról. 2B. és 2C. ábra: Egy tipikus
futtatás kromatogramja közvetlenül a prolin oszlopra történõ injektálása elõtt (2B) és után (2C) (analitikai skála 5 m YMC szilícium-dioxid-oszlop 87/9/7 térfogat% etil-acetát/metanol/víz felhasználásával).
3. ábra Mobilfázissal nyersen eluált Pneumocandin B0 szilikagél HPLC kromatogramjai: (3A) L¹prolin nélkül, (3B) 10 0,26 mmol L¹prolin hozzáadásával, és (3C) 0,65 mmol L¹prolin hozzáadásával. Az ábra demonstrálja a Pneumocandin B0 megnövekedett retenciós idejét és az analóg szennyezõdésektõl történõ megnövelt reszolválást a hozzáadott prolin növekvõ szintjeivel. (A Pneu15 mocandin B0 retenciós ideje 22 perc 0,65 mmol L¹prolin jelenlétében.)
A rajzok rövid leírása 1. ábra Nyers Pneumocandin B0 szilikagél-kromatográfiájának preparatív HPLC kromatogramja, ahol az oszloptöltet kis mennyiségû prolint tartalmaz. 1A. ábra: elsõ futtatás az oszlopon; 1B. ábra: 18. futtatás az oszlopon. A késõbbi futtatásban az analóg szennyezõdések javított reszolválódása látható, ami a prolinnak a betáplált oldatból az oszlopra történõ adszorpciójának a következménye.
2
45
5. ábrák 5A. ábra: Kontroll a transz-4-hidroxil-L-prolinnak az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 5B. ábra: transz-4-hidroxil-L-prolinnal módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a Pneumocandin B0 esetében a kontrolléhoz hasonló retenciós idõt mutat, ugyanakkor az analóg szennyezõdéseitõl történõ reszolválás eltérõ.
50
55
60 3
6. ábrák 6A. ábra: Kontroll az L¹valinnak az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 6B. ábra: L-valinnal módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen.
1
HU 008 067 T2
7. ábrák 7A. ábra: Kontroll az L¹lizinnel az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 7B. ábra: L-lizinnel módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen. 8. ábrák 8A. ábra: Kontroll az L¹metioninnel az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 8B. ábra: L-metioninnal módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen. 9. ábrák 9A. ábra: Kontroll a D¹prolinnak az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 9B. ábra: D-prolinnal módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen. 10. ábrák 10A. ábra: Kontroll az L¹treoninnak az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 10B. ábra: L¹treoninnal módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen. 11. ábrák 11A. ábra: Kontroll a glicinnek az oszlopra történõ felvitelét megelõzõen. 11B. ábra: Glicinnel módosított mobilfázisnak az oszlopra történõ felvitelét követõen felvett kromatogram, amely a kontrollhoz képest változásokat mutat mind a Pneumocandin B0 retenciós idejét, mind az analóg szennyezõdésektõl történõ reszolválást illetõen.
erõs hatással van a Pneumocandin B0 retenciójára és az analógjaitól történõ reszolválására (analitikai skála 5 m YMC szilícium-dioxid-oszlop 87/9/7 térfogat% etilacetát/metanol/víz felhasználásával). 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 12. ábra Szilikagél HPLC-kromatogramok (A) dietil-amin nélkül (kontroll) és (B) dietil-amin mobilfázishoz történõ adagolásával nyersen eluált Pneumocandin B0 esetében. Az ábra azt mutatja, hogy a dietil-amin nagyon
2
60 4
A találmány részletes leírása Egy eljárást ismertetünk lipopeptid tisztítására mobilfázis módosító alkalmazásával normál fázisú kromatográfiás rendszerben, melynek célja a tisztítás szelektivitásának és/vagy termelékenységének javítása, ahol a mobilfázis módosítót amint, aminosavat vagy aminosav-észtert tartalmazó csoportból választjuk ki, a normál fázisú kromatográfiás rendszer mobilfázist és állófázist tartalmaz, az állófázist szilikagélbõl és alumínium-oxidból választjuk ki, a mobilfázis egy vagy több oldószerbõl álló oldószerrendszer, és ahol az amint metil-amin, etil-amin, diizopropil-amin, dietilamin, dimetil-amin, etil-metil-amin, trietil-amin, propilamin, anilin és dietil-anilin közül választjuk ki. A fentiek szerinti eljárás, ahol a mobilfázis-módosító egy aminosav vagy aminosav-észter. A fentiek szerinti eljárás, ahol az aminosav vagy aminosav-észter mobilfázismódosítót az alábbi vegyületekbõl álló csoportból választjuk ki: L¹aminosavak, D¹aminosavak, L¹aminosav-észterek és D¹aminosav-észterek. A fentiek szerinti eljárás, ahol az aminosav vagy aminosav-észter mobilfázis-módosítót az alábbiak közül választjuk ki: L¹prolin, D¹prolin, transz-4-hidroxi-L-prolin, transz-4hidroxi-D-prolin, glicin, L¹treonin, D¹treonin, L¹lizin, D¹lizin, L¹metionin, D¹metionin, D¹valin, L¹valin és a fent említett L¹ és D¹aminosavak észterei. A fentiek szerinti eljárásban az aminosavat L¹prolin és D¹prolin közül választjuk ki. A találmány egy további megvalósítása a fentiek szerinti eljárás lipopeptid tisztítására, ahol a lipopeptidet Caspofungin, Micafungin, Andulifungin, Cilofungin és Daptomicin fermentációs termék prekurzorai közül választjuk ki. A fentiek szerinti eljárás, ahol a lipopeptid Pneumocandin B0. A fentiek szerinti eljárás, ahol a mobilfázis-módosító egy amin, melyet a következõ vegyületekbõl álló csoportból választjuk ki: metil-amin, etilamin, diizopropil-amin, dietil-amin, dimetil-amin, etilmetil-amin, trietil-amin, propil-amin, anilin és dimetilanilin. A fentiek szerinti eljárás, ahol a mobilfázis-módosító egy aminosav vagy aminosav-észter. A fentiek szerinti eljárás, ahol az aminosav vagy aminosav-észter mobilfázis-módosítót az alábbi vegyületekbõl álló csoportból választjuk ki: L¹aminosavak, D¹aminosavak, L¹aminosav-észterek és D¹aminosav-észterek. A fentiek szerinti eljárás, ahol az állófázis szilikagél. A fentiek szerinti eljárás, ahol az aminosav vagy aminosavészter mobilfázis-módosítót az alábbiak közül választjuk ki: L¹prolin, D¹prolin, transz-4-hidroxi-L-prolin, transz-4-hidroxi-D-prolin, glicin, L¹treonin, D¹treonin, L¹lizin, D¹lizin, L¹metionin, D¹metionin, D¹valin, L¹valin és a fent említett L¹ és D¹aminosavak észterei. A fentiek szerinti eljárás, ahol a mobilfázis vizet, metanolt és etil-acetátot tartalmazó oldószer-rendszer. A fentiek szerinti eljárás, ahol az aminosav mobilfázis-módosítót L¹prolin és D¹prolin közül választjuk ki.
1
HU 008 067 T2
A tisztítási eljárással elõnyösen tisztítható lipopeptidek lehetnek például echinocandinszármazékok, pl. Pneumocandin B0, Caspofungin, Cilofungin és Micafungin, valamint Nidulafungin és Daptomyicin, és különösen a Caspofungin, Micafungin, Cilofungin, Anidulafungin és Daptomyicin természetes termék prekurzorai. A Caspofungin esetében a természetes termék/fermentációs termék prekurzor a Pneumocandin B0. A Caspofungin-acetát (CANCIDAS) egy félig szintetikus lipopeptid-echinocandin-B-származék, melyet jelenleg intravénás adagolásra szolgáló gombaellenes szerként forgalmaznak az Egyesült Államokban. Az Anidulafungin egy félig szintetikus lipopeptid-echinocandin-B-származék Eli Lilly/Versicor fejlesztésében, intravénás adagolásra szolgáló gombaellenes szerként. Az Anidulafungint az 5 965 525 és 6 384 013 sz. USA szabadalmakban írják le. A Cilofungin egy echinocandin-lipopeptid, melyet Eli Lilly írt le a 4 293 489 sz. USA szabadalomban gombaellenes szerként történõ alkalmazásra. A Micafungin (FUNGARD) egy echinocandinszerû lipopeptid Fujisawa fejlesztésében, intravénás adagolásra szolgáló gombaellenes szerként. A Micafungint a 6 107 458 sz. USA szabadalomban írták le. A Daptomycin (CIDECIN) egy félig szintetikus lipopeptidszármazék Cubist fejlesztésében, antibakteriális szerként. A Daptomycint Eli Lilly a 4 537 717 sz. USA szabadalomban írta le. Egy normál fázisú kromatográfiás rendszer egy mobilfázist és egy állófázist mûködtet. A mobilfázis egy vagy több oldószerbõl álló oldószerrendszer, melynek összetétele vagy állandó az egész tisztítási folyamat alatt, vagy egy gradiens, ahol az oldószer összetétele idõvel változik a tisztítási folyamat során. A mobilfázis oldószerei közé tartozik például, korlátozás nélkül, a víz, metanol, etanol, izopropanol, hexán, etil-acetát, acetonitril és metilén-klorid. Az állófázist szilikagél és alumínium-oxid közül választjuk ki. A jelen találmány tárgya kromatográfiás eljárás lipopeptid tisztítására oly módon, hogy a mobilfázishoz mobilfázis-módosítót adunk. Az oszloptérfogatot az oszlopon történõ áthaladáshoz szükséges oldószer térfogataként definiáljuk. Az oszloptöltet (oszloptöltés vagy nyersanyagtöltet) arra az anyagmennyiségre utal (nyers lipopeptid), amely egyidejûleg tisztítható. A mobilfázis-módosító lehet aminosav, aminosav-észter vagy amin. A jelen találmány szerint a mobilfázis-módosítót vagy az eluálószerhez (mobilfázis oldószerrendszer), vagy adalékként az oszloptöltethez adagoljuk. A találmány szerint az aminosav lehet bármilyen természetes vagy nem természetes aminosav, beleértve mind az L¹, mind a D¹konfigurációkat. Az eljárásban alkalmazható aminosav mobilfázis-módosítók a következõk: L¹ és D¹prolin, transz-4-hidroxi-L-prolin, glicin, L¹treonin, L¹lizin, L¹metionin és L¹valin. A találmány szerinti amin mobilfázismódosítók lehetnek primer, szekunder vagy tercier rövid szénláncú alkil-(1–6 szénatomos alkil)- és/vagy aromás (6–10 szénatomos aril)-aminok. Az ilyen aminok lehetnek például a következõk: metil-amin, etilamin, diizopropil-amin, dietil-amin, dimetil-amin, etilmetil-amin, trietil-amin, propil-amin, anilin és dimetilanilin.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
A találmány szerint bizonyos aminok, aminosavak vagy aminosav-észterek alacsony koncentrációinak mobilfázishoz történõ adagolásával változtatható a rendszer felbontása és szelektivitása, jelentõsen növelve azt. Közelebbrõl, a Pneumocandin B0 szilikagél-kromatográfiájában alkalmazott EtOAc–MeOH–víz elegyhez adott prolin jelentõsen növeli a vegyület reszolválását annak közeli szennyezõdéseitõl, beleértve a B5 és E0 Pneumocandint. Ez a megnövekedett reszolválás lehetõvé teszi, hogy az oszlopra tölthetõ termék mennyisége két-háromszorosára növekedjen, miközben a termékben gazdag frakció tisztasága és a kitermelés megmarad. Nagyobb termékmennyiségek tisztíthatók azonos tisztaságban azonos termeléssel, ugyanazon a szilikaoszlopon, kevesebb oldószer alkalmazásával és rövidebb idõ alatt. Azt is kimutattuk, hogy a mobilfázis-módosítónak az oszloptöltetben való jelenléte hasonló hatású. A Fisher Scientifictõl (Pittsburgh, PA, USA) vásárolt oldószereket használtuk. A normál szilícium-dioxiddal töltött, analitikai HPLC oszlopokat (250×4,6 mm belsõ átmérõ), 5 mm részecskeméret és 120 Å pórusátmérõ, YMC-tõl szereztük be (Wilmington, NC, USA). A félig preparatív kísérletben az Amicontól származó (Beverly, MA, USA) speciális szilícium-dioxidot alkalmaztunk: Grade 631, Si¹60, 20 mm névleges részecskeméret. Az analitikai kísérletekhez valamennyi, a hármas mobilfázisban levõ oldószer és a töltet hígítószere (etilacetát, metanol és víz) HPLC tisztaságú volt. A félig preparatív kísérletben használt mobilfázist Enrontól (Houston, TX, USA) származó, 99,9 tömeg/tömeg% tisztaságú metanolból és Eastmantõl (Perth Amboy, NJ, USA) származó, uretán fokozatú etil-acetátból, valamint az Osmonicstól (Minnetonka, MN, USA) beszerzett tisztítóegység alkalmazásával elõállított alacsony iontartalmú vízbõl állítottuk elõ. A mobilfázis-készítmény mind az analitikai, mind a félig preparatív kísérletben 87/9/7 térfogat% etil-acetát/metanol/víz elegy volt. A mérõoldatok nem indokolják a nem ideális keverési hatásokat. Az egyszerûség kedvéért a mobilfázist WEAM-nek nevezzük (víz/etil-acetát/metanol). A kísérletekben használt kiindulási anyag 79,3/13,3/7,4 térfogat% etil-acetátból, metanolból és vízbõl álló oldószerelegyben feloldott Pneumocandin B0¹t tartalmazott. Az L¹prolint Kyowa Hakko Kogyo Ltd-tõl (Japán) szereztük be. A glicint, L¹treonint, D¹prolint, L¹metionint, L¹lizint, L¹valint, transz-4-hidroxi-L-prolint, dietil-amint és prolinmetil-észtert Sigma-Aldrich Cheme GmbH-tól (Steinheim, Németország) szereztük be. Az analitikai kísérleteket egy oszlop termosztáttal és egy változtatható hullámhosszú detektorral felszerelt Hewlett Packard (Waldbronn, Németország) HP 1100 HPLC rendszeren végeztük, a detektálást 278 nm¹nél figyeltük meg. A félig preparatív kísérletekhez egy Dorr Oliver C modellt (1 LPM szivattyúteljesítmény, Biotage Division of Dyax) és egy 50 cm×6 cm belsõ méretû tengelyes kompressziós oszlopot alkalmaztunk (Prochrom, Indianapolis, IN). A módosító hatást elõször az L¹prolint tartalmazó nyers Pneumocandin B0 termék egy bizonyos mennyi-
1
HU 008 067 T2
ségének tisztítása alatt figyeltük meg, mely terméket a fermentációs elegyhez adagoltunk a fermentációs eljárás elõsegítésére. Amikor a nyers Pneumocandin B0 fermentációs terméket elõször töltöttük fel a HPLC oszlopra, a Pneumocandin B0 reszolválása korlátozott volt. A Pneumocandin E0 a Pneumocandin B0 csúcsa alatt rejtõzött, és a Pneumocandin B5 Pneumocandin B0-tól történõ szétválasztása nem volt kiemelkedõ. Lásd 1a. ábra, amely a szilikagél HPLC elsõ ciklusának UV (278 nm) nyomait mutatja. Azonban ezen Pneumocandin B0 fermentációs termék néhány egymást követõ HPLC tisztítási ciklusa után a Pneumocandin B0 visszatartási idejének tízszeres növekedését figyeltük meg. Ezenkívül a Pneumocandin E0, az a Pneumocandin B0, amely a korábbi ciklusokban együtt eluált, most a fõ csúcs elõtt eluált. Továbbá, a Pneumocandin B0 közeli eluense, a Pneumocandin B 5 reszolválása drámaian javult. Az 1B. ábra mutatja a HPLC sorozat 18. ciklusát, és világosan látszik a retenciós idõ növekedése és a fokozott reszolválás. A fokozott szétválasztást az oszlop metanolos mosásával fordítottuk meg, melyet minden 12. ciklusban elvégeztünk abból a célból, hogy eltávolítsuk a szorosan megkötött szennyezõdéseket. Néhány további ciklus után ismét visszatértek a jobb tisztítási eredmények. A további vizsgálat kiderítette, hogy a hatást az oszloptöltetben (a nyers Pneumocandin B0-ban) a prolin jelenléte idézte elõ, amely minden injektálással adszorbeálódott az oszlopra. Ezt a jelenséget általánossá tettük prolin és hasonló adalék anyagok mobilfázishoz történõ adagolásával annak érdekében, hogy a hatásfokot szabályozni tudjuk, ami javította a reszolválást és a termelékenységet a példákban leírtak szerint. Az itt leírt példák a találmány további megértését segítik elõ. Az alkalmazott anyagok, fajták és feltételek a találmány további illusztrálását szolgálják, és nem korlátozó jellegûek.
2
lásával. A retenciós idõ azonban visszatért a normál értékre (RRT1) kb. 5 ciklus után, és a javult szelektivitás is eltûnt, feltehetõen annak köszönhetõen, hogy az L¹prolin folyamatos eluálás közben deszorbeálódott a 5 prolinmentes mobilfázist tartalmazó oszlopról. A 2B. és 2C. ábra tipikus kromatogramok képei, melyeket az L¹prolinos kezelés elõtti és utáni injektálásokból kaptunk. A visszatartás változása szembetûnõ, ugyanígy a Pneumocandin B0 és a B5 és E0 Pneumo10 candinok közötti reszolválás változása is észrevehetõ. 2. példa Kísérleteket végeztünk egy 5 Tm YMC szilícium-dioxiddal töltött analitikai oszlopon, ahol az L¹prolint köz15 vetlenül a mobilfázishoz adagoltuk. A 3A., 3B. és 3C. ábrán látható az L¹prolin nélküli kromatogram és a mobilfázisban 0,26 mmol (–30 mg/l), illetve 0,65 mmol (75 mg/l) L¹prolint tartalmazó kromatogram. Az oszlopot 2 órán keresztül 1,2 ml/perc mellett egyensúlyoztuk 20 ki a prolintartalmú mobilfázisokkal az injektálások elõtt. A 3C. ábrán a Pneumocandin B0¹t éppen megelõzõ csúcsot Pneumocandin E0-ként határoztuk meg. L¹prolin nélkül végzett kromatográfia esetén a Pneumocandin E0¹t nem lehetett szétválasztani. 25 3. példa A szelektivitás fokozását úgy vizsgáltuk, hogy megnöveltük a Pneumocandin B0 retenciós idejét kb. 23 percre, ami összemérhetõ azzal a kb. 22 perces re30 tenciós idõvel, amit akkor tapasztaltunk, amikor a 2. példában 0,65 mmol L¹prolint használtunk, oly módon, hogy 20% etil-acetátot és 80% 87/9/7 térfogat etil-acetát/metanol/víz elegyet tartalmazó mobilfázissal eluáltuk. Bár a Pneumocandin B0 retenciós ideje megnõtt, a 35 Pneumocandin E0 továbbra is a Pneumocandin B0 csúcsa alatt maradt. A reszolválás nem fokozódott. Lásd a 4. ábrát. 4. példa Egy félig preparatív kísérletben egy 6 cm¹es belsõ átmérõjû Prochrom oszlopot megtöltöttünk 390 g Amicon Grade 631-gyel, 18–20 m, 60 Å szilícium-dioxidot [87/9/7 térfogatarányú víz/etil-acetát/metanol (WEAM) mobilfázisban szuszpendálva; töltési nyomás 40 bar; 45 oszlophosszúság 25 cm] használtunk. 40
1. példa Egy analitikai YMC 5 m szilícium-dioxid-oszlopon, mobilfázisként 87/9/7 térfogat etil-acetát/metanol/víz elegyet alkalmazva, L¹prolint nem tartalmazó Pneumocandin B0 termék 8 injektálásból álló sorozatát végeztük el, egy nem változó, összehasonlításul szolgáló kontroll felállítására. Ezt követõen 10 rövid L¹prolin-oldat injektálást végeztünk (1,3×10–2 M L¹prolin 79,3/13,3/7,4 térfogat etil-acetát/metanol/víz elegyben, 60 ml¹es injektálás, kb. 5 perces futamidõ 1,2 ml/percnél), és kilenc további injektálást végeztünk L¹prolint nem tartalmazó Pneumocandin B0 termékkel. Az eljárást szükség esetén megismételtük. A 2A. ábra mutatja a Pneumocandin B0 csúcs rendszerben történõ visszatartási idejét a prolin injektálását követõen azonnal elvégzett injektálások esetében, összevetve a prolin injektálása elõtti retenciós idõvel. Látható, hogy az L¹prolinnal történõ kezelés után azonnal jelentõsen növekszik a retenció. Ez együtt járt a Pneumocandin B0 és azonnali korai eluáló csúcsa közötti szelektivitás javu-
Teljesítményértékelõ ciklus Betöltõ oldatot készítettünk 90 g nyers, L¹prolin nélküli Pneumocandin B0 1,5 liter betöltõ oldószerben 50 (79,3/13,3/7,4 térfogatarányú etil-acetát/metanol/víz elegy) történõ feloldásával, így 34,9 g/l kísérleti Pneumocandin B0 betöltõ oldatot kaptunk. A kísérlet kontrolljának felállítására a töltetbõl 80 ml¹t (2,8 g Pneumocandin B0) beinjektáltunk, és a WEAM mobilfázissal 55 90 ml/perc áramlási sebesség mellett eluáltuk. Összegyûjtöttük a frakciókat ebbõl a ciklusból, és egy összevont reprezentatív dús frakció analitikai eredményei azt jelezték, hogy a szennyezési profil megfelelt az elõzõ sarzsokénak [mind normál fázisú (NP), mind reverz fá60 zisú (RP) HPLC kísérletek alapján]. 6
1
HU 008 067 T2
L-Prolint tartalmazó mobilfázisú ciklusok (a teljesítményértékeléshez hasonló betáplálás): A WEAM mobilfázist L¹prolinnal módosítottuk 75 mg/liter koncentrációnál (0,650 mmol). Az oszlopot ennek az oldatnak 5 oszloptérfogatával (CV) állítottuk be, és egy ciklust futtattunk végig a módosított mobilfázissal, a teljesítményértékelõ ciklusoknak egyéb szempontból megfelelõ körülmények között. A reten-
5
2
ciós idõnek az ebben a rendszerben megfigyelt változása nem volt olyan drámai, mint az analitikai rendszerben. A 2. táblázatban összegezzük a két ciklusból származó dús frakciók szennyezési profiljait: a Pneumocandin B0 és a Pneumocandin E0 szintjei lényegesen alacsonyabbak a prolinnal módosított ciklusban, ami azt mutatja, hogy ezzel a rendszerrel jobb eredményt lehetett elérni.
2. táblázat Laboratóriumi ciklusokból származó dús frakciószennyezési profilok összegzése standard betöltés mellett, a mobilfázisban 0,15 g/liter (1,3 mol) L¹prolinnal vagy anélkül Ciklus
Töltet, Pneumocandin B0 g/szilícium-dioxid kg¹ként kifejezve
Pn B5 %¹os terület
Pn E0 %¹os terület
Termelés %
Tömegkiegyenlítés
Teljesítményértékelõ ciklus
7,2
0,44
0,42
82
99
L-Prolin-rendszer
7,2
0,16
0,05
84
98
Oszlop teljesítményének megkétszerezése az L¹prolinnal módosított mobilfázis alkalmazásával Egy ciklust futtattunk végig a fentiekben leírt, prolinnal módosított rendszer alkalmazásával, kétszeres telje- 25 sítményértékelõ töltettel: 5,6 g Pneumocandin B0¹t injektáltunk be (14,4 g/szilícium-dioxid kg¹ja) az injektált töltési oldat térfogatának megkétszerezésével, az egyéb fel-
tételek változatlanul hagyásával. A dús frakció szennyezési profilját, valamint a termelést és a tömegkiegyenlítést a 3. táblázatban összegezzük. Az eredmények azt jelzik, hogy ezen módszer alkalmazásával megkétszerezhetõ a kromatográfiás lépés termelékenysége, mivel ebben a példában a termelés megmaradt, miközben a kétszeres teljesítményértékelõ töltet tisztasága nõtt.
3. táblázat Laboratóriumi ciklusokból származó dús frakciószennyezési profilok összegzése kétszeres betöltés mellett, a mobilfázisban 0,075 g/liter (0,65 mol) és 0,15 g/liter (1,3 mol) L¹prolinnal vagy anélkül Ciklus
Töltet: Pneumocandin B0 g/szilícium-dioxid kg
Pn B5 %¹os terület
PnE0 %¹os terület
Termelés %
Tömegkiegyenlítés
Teljesítményértékelõ ciklus
7,2
0,44
0,42
82
99
L-Prolin-rendszer
7,2
0,16
0,05
84
98
L-Prolin-rendszer
14,4
0,27
0,08
86
99
6. példa Egyéb aminosavak mint mobilfázis-módosítók A jelenség mélyebb megismerése érdekében analitikai kísérletsorozatokat végeztünk 25×0,46 cm YMC 5 m szilícium-dioxid-oszlop, és a mobilfázisban aminosavmódosítók széles skálájának alkalmazásával, beleértve a transz-4-hidroxil-L-prolint, L¹valint, L¹lizint, L¹metionint, D¹prolint, L¹treonint és glicint, 0,65 mmol koncentráció mellett. Lásd az 5–11. ábrákat. A 4. táblázatban soroljuk fel az aminosavakat a csökkenõ retenció sorrendjében. Az 5–10. ábrákon láthatók az ezekbõl a ciklusokból nyert kromatogramok példái, melyek a retencióidõre és a szelektivitásra gyakorolt hatásukat illusztrálják. Valamennyi aminosav esetében, kivéve a 4¹hidroxi-L-prolint, csökkent a retenció az aminosavmentes cikluséhoz viszonyítva, és a szelektivitás minden esetben egyértelmûen módosult. Így például, bár a transz-4-hidroxi-L-prolin nem okozott
45
50
55
60 7
eltolódást a Pneumocandin B0 retenciójában, befolyással volt a Pneumocandin B0 reszolválására a korán eluáló csúcsból, ahogy az az 5. ábrán látható. A glicinnek nincs oldallánca, de a retenciós idõt szintén növeli. Ez arra enged következtetni, hogy a retenciós idõ eltolódása és a reszolválás javulása nem egyedül az aminosav-oldallánc hatása. Az aminosav helyett alkalmazott L¹prolin-metilészter is növelte a retenciós idõt (a Pneumocandin B0 kontrollhoz viszonyított retenciós ideje 1,65 volt), és változást eredményezett a szelektivitásban. Az egyes aminosavakkal 3 vagy 4 ciklusból álló sorozatot futtattunk végig, és az oszlopot minden sorozat után 36 ml (kb. 8 oszloptérfogat, a továbbiakban CV) metanollal mostuk, majd 10 CV tiszta WEAM mobilfázissal újra kiegyensúlyoztuk, és ezután három (30 perc) injektálást végeztünk annak igazolására, hogy az aminosav eltávozott (azaz hogy visszaállt a
1
HU 008 067 T2
kiindulási teljesítmény). Ezt követõen az oszlopot egy új aminosavat tartalmazó 72 ml (17 CV) mobilfázissal újra kondicionáltuk, és új injektálásokat végeztünk. A megadott retenciós idõk minden esetben a 3. ciklusra vonatkoznak. Minthogy nem világos, hogy mekkora a szilícium-dioxid telítési kapacitása a különbözõ aminosavak esetében, ez a protokoll biztosította, hogy az oszlop minden esetben ugyanolyan mólszámú aminosavnak volt kitéve. Az oszlop nem tudott megfelelõen regenerálódni az L¹lizinnel való kezelés után (melyet szándékosan utolsó aminosavként teszteltünk), feltehetõen a két primer aminnak köszönhetõen. 4. táblázat Pneumocandin B0 retenciós idõ értékei YMC 5 m, 120 Å, 25 cm×0,46 cm belsõ átmérõjû szilícium-dioxidoszlopon, 1,2 ml/perc áramlási sebesség mellett Aminosav (65 mmol) WEAM-ban
Pneumocandin B0 retenciója a kontrollhoz viszonyítva
L-Prolin-metil-észter
1,65
L-Prolin
1,44
Glicin
1,38
L-Treonin
1,35
D-Prolin
1,25
L-Metionin
1,16
L-Lizin
1,13
L-Valin
1,10
transz-4-Hidroxi-L-prolin
1,00
Semmi (kontroll)
1,00
7. példa Mobilfázis-módosítóként dietil-aminnal végzett kromatográfia Kb. 0,1 g/liter dietil-amint adtunk a mobilfázishoz, és a kísérleti körülmények megegyeztek a 6. példában alkalmazottakkal. Ahogy az a 12. ábrán látszik, a retenciós idõ a dietil-amin esetében még nagyobb mértékben növekedett, mint a prolin esetében. Ezért úgy tûnik, hogy a retencióra és a szelektivitásra gyakorolt hatást az aminfunkcionalitás közvetíti oly módon, hogy akár amin, akár aminosav/aminosav-észter használható mobilfázis-módosítóként ebben a rendszerben.
2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
5
10
15
20
25
30
35
40
45
8
1. Eljárás lipopeptid tisztítására mobilfázis-módosító alkalmazásával normál fázisú kromatográfiás rendszerben, a tisztítás szelektivitásának és/vagy termelékenységének javítása céljából, azzal jellemezve, hogy a mobilfázis-módosítót a következõ csoportból választjuk ki: amin, aminosav és aminosav-észter, a normál fázisú kromatográfiás rendszer egy mobilfázist és egy állófázist tartalmaz, a mobilfázis egy vagy több oldószerbõl álló oldószerrendszer, az állófázis lehet szilikagél vagy alumínium-oxid, és az amint az alábbi csoportból választjuk ki: metil-amin, etil-amin, diizopropilamin, dietil-amin, dimetil-amin, etil-metil-amin, trietilamin, propil-amin, anilin és dimetil-anilin. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid Caspofungin, Mikafungin, Cilofungin, Andulifungin és Daptomicin fermentációs termék prekurzora. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid Pneumocandin B0. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mobilfázis-módosítót az alábbi csoportból választjuk ki: metil-amin, etil-amin, diizopropil-amin, dietil-amin, dimetil-amin, etil-metil-amin, trietil-amin, propil-amin, anilin és dimetil-anilin. 5. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mobilfázis-módosító egy aminosav vagy aminosav-észter. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosav vagy aminosav-észter mobilfázismódosítót a következõ csoportból választjuk ki: L¹aminosavak, D¹aminosavak, L¹aminosav-észterek és D¹aminosav-észterek. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosav vagy aminosav-észter mobilfázismódosítót a következõk közül választjuk ki: L¹prolin, D¹prolin, transz-4-hidroxi-L-prolin, transz-4-hidroxi-Dprolin, glicin, L¹treonin, D¹treonin, L¹lizin, D¹lizin, L¹metionin, D¹metionin, D¹valin, L¹valin és a fent említett L¹ és D¹aminosavak észterei. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosav mobilfázis-módosító lehet L¹prolin vagy D¹prolin. 9. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az állófázis szilikagél. 10. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a mobilfázis vizet, metanolt és etil-acetátot tartalmazó oldószerrendszer.
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
9
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
10
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
11
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
12
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
13
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
14
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
15
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
16
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
17
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
18
HU 008 067 T2 Int. Cl.: B01D 15/00
19
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
