!HU000004118T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 118
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/47
(21) Magyar ügyszám: E 04 743834 (22) A bejelentés napja: 2004. 06. 30. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040743834 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1641820 A1 2005. 01. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1641820 B1 2008. 05. 28.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20030483691P 2003. 06. 30.
(73) Jogosult: Universite de Lausanne, 1005 Lausanne (CH)
US
(72) Feltalálók: WIDMANN, Christian, 1010 Lausanne (CH); YANG, Jiang-Yang, 1012 Lausanne (CH); MICHOD, David, 1005 Lausanne (CH) (54)
(2006.01) A61K 38/17 (2006.01) A61K 47/42 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05000887 PCT/IB 04/002165
(74) Képviselõ: DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
RasGAP-eredetû peptid ráksejtek szelektív elpusztítására
(57) Kivonat
HU 004 118 T2
A találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmazza a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensének és genotoxinnak kombinációját,
ahol az N2 szekvencia legalább egy fragmense javítja a genotoxin ráksejteket szelektíven elpusztító képességét.
A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 8 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 118 T2
A találmány területe A találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmazza a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensének és genotoxinnak kombinációját, ahol az N2 szekvencia legalább egy fragmense javítja a genotoxin ráksejteket szelektíven elpusztító képességét. A találmány háttere A tumorok sokfélék és heterogének, de mindegyik megegyezik abban, hogy kontroll nélkül képes proliferálni. A szuppresszált apoptotikus érzékenységgel kapcsolt szabályozatlan sejtproliferáció adja azt a minimális követelményt, amelynek következtében történik a tumorfejlõdés. Az apoptózis egy olyan folyamat, amellyel a sejtek belépnek a programozott sejthalálba, ami egy élethez szükséges jelenség, amely az egyedfejlõdés során játszódik le, és amely esszenciális a homeosztázis fenntartásához. A kaszpázok (cisztein proteázok, amelyek aszparagin aminosavak után vágnak) aktiválása az a biokémiai esemény, amely irreverzíbilisen elkötelez egy sejtet az apoptózisra. Az apoptózisos sejtek jellemzõ morfológiai és biokémiai változásokat mutatnak, idetartozik a membrángyöngyözés, sejtlekerekedés, kromatinkondenzáció, DNS-hasítás, apoptotikus markerek kifejezõdése a sejtfelszínen és az apoptózisellenes útvonalak gátlása. Ezen események mindegyike blokkolható specifikus kaszpázinhibitorokkal. Tehát a kaszpáz szubsztrátok hasítása felelõs a legtöbb, ha nem az összes apoptózis során megfigyelt jellemzõ változásért. Az apoptózis végrehajtási szakasza akkor kezdõdik, ha a kaszpáz szubsztrátok elvágódnak a sejtben. Tucatnyi kaszpáz szubsztrátot azonosítottak már, és a lista fokozatosan növekszik (Earnshaw W. C. és munkatársai, „Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis” Annu. Rev. Biochem. 68, 383, 1999). Az elvágásuk után a kaszpáz szubsztrátok viszik végbe az apoptózis során megfigyelt morfológiai és biokémiai változásokat, mint amilyen a kaszpázok aktiválásának amplifikációja, a DNSfragmentálódás, a sejtmag összeomlása stb. Továbbá a mitogénaktivált fehérje kináz („Mitogenactivated protein kinase”, MAPK) útvonalakról bemutatták, hogy szabályozzák az apoptózist pozitív és negatív módon is (Jarpe M. B. és munkatársai, „Antiapoptotic versus pro-apoptotic signal transduction: checkpoints and stop signs along the road to death” Oncogene, 17, 1475, 1998; Widmann C. és munkatársai, „Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human” Physiol. Rev. 79, 143, 1999). Ez megmagyarázhatja, hogy az apoptotikus kaszpázok miért vesznek célba néhány olyan fehérjét, amelyek szabályozzák a MAPK¹t és/vagy a MAPK útvonalak komponenseit (Widmann C. és munkatársai, „Caspase-dependent cleavage of signaling proteins during apoptosis. A turn-off mechanism for anti-apoptotic signals” J. Biol. Chem., 273, 7141, 1998). Ezen fehérjék közé tartozik a MEKK1, PAK2, Mstl és a RasGAP. Nemrégiben Yang és Widmann (Yang J.¹Y. és Widmann C., „Antiapoptotic signaling generated by caspa-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
se-induced cleavage of RasGAP” Mol. Cell. Biol., 21, 5346, 2001; „A subset of caspase substrates functions as the Jekylland Hyde of apoptosis” Eur. Cytokine Netw., 13, 387, 2002a; „The RasGAP N¹terminal fragment generated by caspase cleavage protects cells in aRas/PI3K/Akt-dependent manner that does not rely on NFkappa B” J. Biol. Chem., 277, 14641, 2002b) bemutatta, hogy a RasGAP, amely a Ras és Rho GTPkötõ fehérjék szabályozója, egy nem hagyományos kaszpáz szubsztrát, mert a kaszpázok általi hasítása mértékétõl függõen tud anti- és proapoptotikus jeleket indukálni. Bemutatták, hogy alacsony kaszpázaktivitás esetén, a RasGAP¹ot a 455¹ös pozíciónál vágják el, ezáltal egy N¹terminális szekvencia (N szekvencia) és egy C¹terminális szekvencia (C szekvencia) jön létre. A C szekvencia, de nem a teljes hosszúságú RasGAP, indukál erõs apoptotikus válaszokat HeLa sejtekben, amelyet azon képessége alapján határoztak meg, hogy tud piknotikus sejtmagok megjelenését, kaszpáz3-aktivációt és PARP-hasítást indukálni. Ugyanebben a tanulmányban a szerzõk bemutatták azt is, hogy az N szekvencia, ahelyett hogy elõsegítené a sejthalált, úgy tûnik, hogy általánosan blokkolja az apoptózist a kaszpázaktivációt követõen. Nagyobb kaszpázaktivitások esetén szuppresszálódik az N szekvencia azon képessége, hogy ellene hasson az apoptózisnak, ha a 157¹es pozíciónál vágódik el. Ez utóbbi vágási esemény két szekvenciát hoz létre, az N1¹et és az N2¹t, amelyrõl bemutatták, hogy az N szekvenciával szemben érzékennyé teszi a sejteket arra, hogy nagy kaszpázaktivitásokat hozzanak létre a cisplatin által indukált apoptózis irányában, ami egy kemoterápiában rák kezelésre alkalmazott vegyület. Azonban Leblanc és munkatársai közleménye szerint (Leblanc V. és munkatársai, „Ras-GTPase activating protein inhibition specifically induces apoptosis of tumourcells” Oncogene, 18, 4884, 1999) a RasGAP N2 szekvenciájának SH3 doménje ellen célzott monoklonális antitest injekciója, hogy ezáltal ez a fehérje gátlódjon, specifikusan indukálja az apoptózist ráksejtekben. Az is ismert a WO 99/65947 számú nemzetközi szabadalmi közzétételi iratból (Parker és munkatársai), hogy a RasGAP SH3 domént kötõ fehérje, a G3BP ellen célzott monoklonális antitestek apoptózist indukálnak ráksejtekben, amelyekben a G3BP specifikusan túltermelt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a RasGAP növekedést szabályozó útvonal, a RasGAP SH3 doménjén keresztül, esszenciális néhány sejt számára a túléléshez. Ezek a felismerések, úgy tûnik, hogy szemben állnak a Yang és Widmann által kapott eredményekkel, és ahhoz a következtetéshez vezetnek, hogy a RasGAP SH3 domén meglehetõsen ambivalens funkcióval bír az apoptózis indukció és reguláció során a sejtekben. Ismert továbbá a WO 94/03597 számú nemzetközi közzétételi iratból (Duchesne és munkatársai) és Duchesne és munkatársai szakcikkébõl (Duchesne és munkatársai, „Identification of the SH3 domain of GAP as an essential sequence for RasGAP-mediated signa-
1
HU 004 118 T2
ling”, Science, 259, 525–528, 1993), peptidek képesek legalább részlegesen gátolni az aktivált p21 fehérjék transzformációs aktivitását. Ezen peptidek egyike egy RasGAP-eredetû peptid, amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: WMWVTNLRTD. Azonban nincs indikáció arra, hogy a peptid javítja az apoptózisérzékenységet vagy a szelektív sejtpusztulást a genotoxinkezelt tumorsejtekben. Ehhez hasonlóan, a WO 03/018630 számú nemzetközi közzétételi irat (French és munkatársai) ismertet egy 61 aminosavas peptidet (6. azonosító számú szekvencia, SEQ ID NO: 6), amely tartalmazza a WMWVTNLRTD polipeptidet, és az alkalmazását mellrákterápiára. Ismét nincs indikáció arra, hogy a peptid javítja az apoptózisérzékenységet vagy a szelektív sejtpusztulást a genotoxinkezelt tumorsejtekben. A kemoterápia önmagában vagy egyéb kezelésekkel kombináltan (például sugárterápia), egyike a jelenleg leggyakoribb és hatásosabb terápiás eszközöknek a rákok kezelésében. A kemoterápiában alkalmazott gyógyszerek hatásossága a rákkezelésben a ráksejteket elpusztító képességükön alapul. Azonban létezik egy korlát ezen gyógyszerek alkalmazásában, amely abból a ténybõl fakad, hogy hátrányosan befolyásolhatnak normális sejteket, nem rákos sejteket, különösen azokat a sejteket, amelyek gyorsan osztódnak. Ezért kihívás a klinikusok számára a gyógyszerek olyan dózisainak a kiválasztása, amely elég nagy a tumorok eltüntetéséhez, de nem túl nagy a súlyos mellékhatások, mint amilyen a hajhullás, szédülés és hányás, szívtoxikusság és másodlagos rákok, indukálásához a páciensben. A gyógyszereknek a rákos sejtek irányában mutatott szelektivitásának javítása nyilvánvalóan javítaná a kemoterápiás kezelések hatékonyságát, és ezáltal kisebb gyógyszerdózisokat tenne lehetõvé. Ez azt is eredményezné, hogy amennyire csak lehetséges, csökkennének a fent felsorolt súlyos mellékhatások. Ezért a találmány célja egy javított hozzáférés adása egy gyógyszerrel kombináltan rákok kezelésére és megelõzésére, amelynek nincsenek a fent ismertetett hátrányos tulajdonságai. A találmány összefoglalása Ezt a célt egy gyógyászati készítménnyel értük el, amely tartalmazza a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensének és genotoxinnak kombinációját, ahol az N2 szekvencia legalább egy fragmense javítja a genotoxin ráksejteket szelektíven elpusztító képességét. Továbbá a találmány tárgya készlet rák kezelésére vagy megelõzésére egy alanyban, amely készlet tartalmazza a találmány szerinti gyógyászati készítményt. Az ábrák ismertetése Az 1. ábra különbözõ gyógyszerek által kiváltott százalékos apoptózis indukciót mutat az N2 fragmenssel vagy egy üres pcDNS plazmiddal transzfektált HeLa sejtekben.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
HeLa sejteket (2×106) szélesztettünk 10 cm¹es Petri-csészékre, transzfektáltuk 1 mg GFP expresszáló plazmiddal (a transzfektált sejtek megjelölésére) és 2 mg üres pcDNS3 plazmiddal vagy 2 mg N2 fragmenst kódoló pcDNS3 plazmiddal együtt. Egy nappal a transzfekció után a sejteket 24 óráig inkubáltuk a jelölt koncentrációjú cisplatinnal, adriamycinnel vagy mitoxantronnal. A piknotikus sejtmagot mutató GFP pozitív sejtek számát határoztuk meg ezután. Az eredmények a három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A csillagok a kontrollsejtek és a cisplatinkezelt sejtek közötti szignifikáns különbségeket jelölik (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001). A 2A. ábra a vizsgálatban alkalmazott különbözõ konstrukciók sematikus bemutatása. Az SH az Src homológia domént jelöli. A 2B. ábra cisplatin által kiváltott százalékos apoptózis indukciót mutat a 2. ábrán ismertetett konstrukciókat kódoló plazmiddal transzfektált HeLa sejtekben. HeLa sejteket transzfektáltunk az 1. ábránál ismertetett módon a 2A. ábránál ismertetett konstrukciókat kódoló plazmidokkal. A HeLa sejteket ezt követõen vagy kezeltük 0,15 mM cisplatinnal, vagy nem, és meghatároztuk az apoptózis mértékét 20 óra múlva. Az eredmények a három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A csillagok a cisplatinnal nem kezelt sejtek és a 0,15 mM cisplatinnal kezelt sejtek közötti szignifikáns különbségeket jelölik (**, p<0,01; ***, p<0,001). A 3. ábra FITC-jelölt TAT-RasGAP317–326 peptiddel inkubált élõ sejtek fáziskontraszt és epifluoreszcens képeit mutatja. A következõ sejtvonalakat (HeLa, U2OS, H¹Meso1, MCF-7, HaCat és HUV-EC¹C) inkubáltuk 3 óráig 37 °C¹on, 5% CO2 mellett tenyésztõ tápközegben 20 mM FITC-jelölt TAT-RasGAP317–326 peptiddel, és ezután háromszor mostuk õket a tenyésztési tápközeggel. A 4A. ábra különbözõ gyógyszerek által kiváltott százalékos apoptózis indukciót mutat a TAT-RasGAP317–326 peptiddel kezelt vagy kezeletlen kétféle nem rákos sejtben. Két nem rákos sejtvonalat (HaCat és HUV-EC¹C) inkubáltunk cisplatin, adriamycin és mitoxantrone növekvõ koncentrációival 20 mM TAT-RasGAP317–326 jelenlétében vagy hiányában. Az apoptózis mértékét 20 óra múlva jegyeztük fel. A 4B. ábra különbözõ gyógyszerek által kiváltott százalékos apoptózis indukciót mutat a TAT-RasGAP317–326 peptiddel kezelt vagy kezeletlen négyféle rákos sejtvonalban. Négy rákos sejtvonalat (HeLa, U2OS, H¹Meso1 és MCF¹7) inkubáltunk 6 lyukú lemezekben cisplatin, adriamycin és mitoxantrone jelölt koncentrációival 20 mM HIV-TAT48–57 vagy TAT-RasGAP317–326 jelenlétében vagy hiányában 20 órát. A piknotikus sejtmagot mutató
1
HU 004 118 T2
sejtek számát rögzítettük. Az eredmények a három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A csillagok a genotoxinnal kezelt és TAT-RasGAP317–326 peptiddel indukált sejtek és a kezeletlen vagy HIV-TAT48–57 peptiddel indukált sejtek közötti szignifikáns különbségeket jelölik (**, p<0,01; ***, p<0,001). Az 5A. ábra az NFkB-aktivitást mutatja cisplatinkezelt U2OS sejtekben HIV-TAT 48–57 vagy TAT-RasGAP317–326 peptidek jelenlétében. U2OS sejteket (1×105) szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és transzfektáltuk õket 1 mg szentjánosbogár luciferáz riporter plazmiddal az NFkB-aktivitásra és 0,1 mg Renilla luciferázt kódoló plazmiddal. A sejteket egy nap múlva kezeltük a jelölt koncentrációjú cisplatinnal 20 mMHIV-TAT48–57 vagy TAT-RasGAP317–326 peptidek jelenlétében vagy hiányában 20 órát. Az adatok a Renilla luciferáz aktivitásra normalizált szentjánosbogár luciferáz aktivitást mutatják, és a nem kezelt kontrollsejtek NFkB-aktivitásának többszörözõdéseként van kifejezve. Az eredmények a három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A csillagok a jelölt állapotok közötti szignifikáns különbségeket jelölik (**, p<0,01; ***, p<0,001). Az 5B. ábra az NFkB-aktivitást mutatja cisplatinkezelt U2OS sejtekben HIV-TAT 48–57 peptid és IkBaDN2 vagy TAT-RasGAP317–326 peptid és IkBaDN2 jelenlétében. U2OS sejteket transzfektáltunk 1 mg szentjánosbogár luciferáz riporter plazmiddal az NFkB-aktivitásra, 0,1 mg Renilla luciferázt kódoló plazmiddal, 0,5 mg GFP expresszáló plazmiddal a transzfektált sejtek megjelölésére, 1 mg IkBaDN2¹t kódoló plazmiddal, ami gátolja az NFkB útvonalat, vagy 1 mg üres pcDNS3 vektorral. A sejteket egy nap múlva kezeltük a jelölt koncentrációjú cisplatinnal 20 mM HIV-TAT48–57 vagy 20 mM TAT-RasGAP317–326 peptidek jelenlétében vagy hiányában 20 órát. A sejteket ezt követõen lizáltuk, és az A résznél ismertetett módon meghatároztuk az NFkBaktivitást, azzal a különbséggel, hogy ezúttal a kontroll HIV-TAT48–57 peptiddel inkubált sejtekhez képest mértük az NFkB-aktivitás többszörözõdését. Az 5C. ábra az 5A. és 5B. ábra transzfektált sejtjeire mutatja a százalékos apoptózist. Alternatív megoldásként a piknotikus sejtmagot mutató GFP pozitív sejtek számát határoztuk meg. Az eredmények három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A 6. ábra Western-blotokat mutat, és cisplatinkezelt, HIV-TAT48–57 vagy TAT-RasGAP317–326 peptidekkel transzfektált U2OS sejtekben a JNK-foszforiláció százalékát. U2OS sejteket (2×105) szélesztettünk 6 lyukú lemezekre, és a jelölt ideig kezeltük a HIV-TAT48–57 vagy TAT-RasGAP317–326 peptidek kombinációival (20 mM koncentrációban) és cisplatinnal (30 mM koncentrációban). A JNK és p38 aktiváció pozitív kontrolljait a sejtek
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
1 mg/ml anisomycines 3 órás stimulálását és ezt követõen 30 perces 0,5 M szorbitolos kezelést követõen kaptuk. A Western-blotok alatti mennyiségi meghatározásokat a 12 órás szalagokon végeztük, és a pozitív kontrollokkal szemben normalizáltuk. Az eredmények három független meghatározás esetére mutatják az átlagot ±szórás. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmazza a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensét, amely tartalmazza a WXWVTXXRTX általános aminosavszekvenciát, ahol X jelentése aminosav, és genotoxinnak kombinációját, azzal jellemezve, hogy az N2 szekvencia legalább egy fragmense javítja a genotoxin ráksejteket szelektíven elpusztító képességét. Jelen leírásban a „peptid”, „fehérje”, „polipeptid”, „polipeptidszerû” és „peptidszerû” kifejezéseket egymással felcserélhetõen használjuk, és aminosavak sorozatát jelölik, amelyek egymással peptidkötéssel vannak összekapcsolva az egymás melletti aminosavak alfa-amino- és karboxicsoportjai között. A RasGAP, amely a Ras és Rho GTP-kötõ fehérjék szabályozója, egy nem konvencionális kaszpáz szubsztrát, mivel képes mind pro¹, mind antiapoptotikus jeleket indukálni, a kaszpázok általi elhasításának mértékétõl függõen. Alacsony kaszpázszintek esetén a RasGAP a 455¹ös pozícióban vágódik el, amelynek révén egy N¹terminális fragmens (N fragmens, körülbelül 56 kD) és egy C¹terminális fragmens (C fragmens, körülbelül 64 kD) jön létre. Úgy tûnik, hogy az N fragmens az apoptózisnak egy általános gátlószere a kaszpázaktivációt követõen (Yang J.¹Y. és Widmann C., Mol. Cell. Biol., 21, 5346, 2001 és J. Biol. Chem., 277, 14641, 2002b). Nagy kaszpázaktivitás esetén az N fragmens tovább hasítódik a 157¹es pozíciónál, és ezzel két fragmens jön létre, N1 (1–157. aminosavak) és N2 (158–455. aminosavak). A „rákos sejt” jelentése olyan sejt, amely állatban jön létre in vivo, és amelyik képes nemkívánatos és nem szabályozott sejtnövekedésre vagy rendellenes jelenlétre vagy szövetek rendellenes inváziójára. In vitro ez a kifejezés olyan sejtvonalra is utal, amely állandóan immortalizált megalapozott sejttenyészet, amely korlátlanul képes proliferálni, és nem szabályozott módon, feltéve, ha megfelelõ friss tápközeg és hely áll rendelkezésre. A kifejezés „gyógyszer” olyan gyógyszerekre utal, amelyek képesek emlõssejteket, elõnyösen humánsejteket elpusztítani. A különbözõ eredetû és különbözõ hatásmechanizmusú gyógyszereknek számos osztálya van. A találmány szerinti gyógyszerek tárgya olyan vegyület, amely gazda biológiai folyamatokat elõnyösen befolyásol vagy ezekbõl ered. Interferonok, tumor növekedési faktorok, tumor nekrózis faktorok, növekedési faktorok, mint amilyen a GM¹CSF és G¹CSF, és interleukinok, mint az interleukin–2, interleukin–6, interleukin–7 és interleukin–12, a példái az ilyen biológiai
1
HU 004 118 T2
gyógyszereknek, amelyeket jelenleg alkalmaznak a rákterápiában. A találmány szerinti gyógyszer tárgy lehet továbbá olyan vegyület, a mely károsítja a DNS¹t, és/vagy meggátolja a sejtszaporodást, mint amilyenek a genotoxinok. Genotoxinok választhatóak az alkilezõvegyületek, antimetabolitok, DNS-vágók, DNS-kötõk, topoizomerázmérgek és magorsómérgek csoportjából. Az alkilezõvegyületek példái a lomustine, carmustine, streptozocin, mechlorethamine, melphalan, uracil nitrogén mustár, chlorambucil, cyclosphamide, iphosphamide, cisplatin, carboplatin, mitomycin, thiotepa, dacarbazin, procarbazine, hexametil-melamin, trietilénmelamin, busulfan, pipobroman, mitotane és további platine származékok. A DNS-vágók egy példája a bleomycin. Topoizomerázmérgek választhatóak a topotecan, irinotecan, camptothecin nátrium só, daorubicin, doxorubicin, idarubicin, mitoxantrone teniposide, adriamycin és etoposide tartalmú csoportból. A DNS-kötõ vegyületek példái a dactinomycin és mithramycin, míg a magorsómérgek választhatóak a vinblastin, vincristin, navelbin, paclitaxel és docetaxel tartalmú csoportból. Gyógyszerként alkalmazható továbbá antimetabolit is, amely választható a következõ vegyületekbõl: methotrexate, trimetrexate, pentostatin, cytarabin, araCMP, fludarabin-foszfát, hidroxikarbamid (hidroxiurea), fluoruracil, floxuridine, klórdeoxiadenizin, gemcitabin, tioguanin és 6¹merkaptopurin. Gyógyszerként elõnyösen genotoxin, elõnyösebben cisplatin, mitoxantrone és adriamycin kerül alkalmazásra a találmányban. A genotoxinok alkalmazhatóak egyedül vagy egymással kombináltan. Abban az esetben, ha több mint egy genotoxin kerül alkalmazásra, akkor a genotoxinok alkalmas kombinációinak meghatározása a szakember képességeit egyáltalán nem haladja meg, és például az elpusztítani szándékozott rák típusától fog függeni. A „javítja” kifejezés a leírás szerinti értelemben a találmány szerinti peptid azon képességére utal, hogy növeli a genotoxin sejteket elpusztító hatását. Ez a képesség mérhetõ in vitro például az apoptotikus sejtek százalékának mérésével, amely sejtek tartalmazzák a találmány szerinti peptidet, és kezelve vannak legalább egy gyógyszerrel a piknotikus sejtmagot mutató sejtek számolásával (az apoptotikus sejtek markere). Jellemzõen az eredményeket olyan gyógyszerrel kezelt sejtekével hasonlítjuk össze, amelyek nem tartalmazzák a találmány szerinti peptidet. Az olyan peptidet, amely egy adott koncentráció esetén legalább kétszeres vagy nagyobb mennyiségû apoptózist okoz a sejtekben, vagy egy adott apoptotikus válasz eléréséhez szükséges gyógyszerdózist legalább felére csökkenti, tekinthetjük olyannak, ami egy gyógyszer ráksejteket elpusztító képességét javítja. A „szelektív” kifejezés a jelen leírás szerinti értelemben azt jelenti, hogy a találmány szerinti peptid, amely lényegében a RasGAP fehérje N2 szekvenciájá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
nak fragmensébõl áll, javítja egy genotoxin sejteket elpusztító képességét egy adott koncentráció esetén, specifikusan ráksejtekben, de meglepõ módon nem ráksejtekben nem. A genotoxin in vitro koncentrációtartományai, amelyekben a találmány szerinti peptid javítja a genotoxin szelektív sejtpusztító hatását, általában az alkalmazott genotoxintól függ. Például általában a genotoxin koncentrációja in vitro 0,1–100 mM, elõnyösen 0,15–30 mM. A RasGAP fehérje N2 szekvenciája elõnyösen humáneredetû, és egy 36 kD¹os fehérjét jelöl, ami 297 aminosavból áll, amely két SH2 és egy SH3 domént foglal magában, ahogy ezt a 2A. ábrán mutatjuk. Általánosan a Src homológia 2 (SH2) domének a foszforilált tirozin felismerésében játszanak szerepet, míg a Se homológia 3 (SH3) domének gyakran azt jelölik, hogy a fehérje szerepet játszik a citoszkeleton szervezéshez kapcsolódó jelátvitelben. A „fragmens” olyan szekvenciát jelöl, amely kevesebb aminosavat tartalmaz, mint a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának hossza. Ez a szekvencia alkalmazható mindaddig, amíg ugyanazon tulajdonságokat mutatja, mint az a natív szekvencia, amelybõl származik. Elõnyösen ez a szekvencia kevesebb mint 90%¹át, elõnyösebben kevesebb mint 60%¹át, különösen elõnyösen kevesebb mint 30%¹át tartalmazza a megfelelõ RasGAP fehérje N2 szekvenciája hosszának. Az N2 szekvencia, valamint a fragmense és a variánsa számos a szakterületen ismert eljárással és technikával elõállítható, mint amilyen például a kémiai szintézis vagy a Maniatis és munkatársai, 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, laboratóriumi kézikönyvben ismertetett rekombináns technikák. Elõnyösen a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmense tartalmazza az N2 szekvencia SH3 doménjének aminosavszekvenciáját. A feltalálók meglepetésre jellemezték a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának egy rövidebb szekvenciáját, amely még javítja gyógyszer azon képességét, hogy szelektíven elpusztít ráksejteket és azt, hogy azzal az elõnnyel is bír, hogy könnyebben szintetizálható. A feltalálók elkészítették az N fragmens csonkolt változatainak egy sorozatát, amint a 2A. ábrán mutatjuk, és meghatározták a képességüket, hogy képesek e elõsegíteni a genotoxin indukálta apoptózist rákos sejtvonalakban (2B. ábra). Az N2 szekvencia ezen fragmensei egy vektorba lettek klónozva, és egy rákos sejtvonalba (HeLa) lettek transzfektálva. A feltalálók bemutatták, hogy az üres konstrukcióval vagy csupán az N2 SH2 doménjét kódoló konstrukcióval transzfektált HeLa sejtek nem javítják a cisplatin indukálta pusztulást. Ezzel szemben az SH3 domént tartalmazó konstrukciókat expresszáló sejtek esetében megnövekedett a cisplatin indukálta apoptózis, ahogy az a 2B. ábrán látható. A feltalálók ezt követõen elõállították az SH3 domén fokozottan csonkolt változatait, azért, hogy meghatározzák a minimális javító szekvenciát. Ezen konst-
1
HU 004 118 T2
rukciók vagy N2 fragmensek mindegyike (2A. ábra), még a legrövidebb is (317–326.), amely a találmány szerint 10 aminosav hosszúságú peptidet kódolja, elõsegítette a cisplatin HeLa sejteket elpusztító képességét (2B. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az N2 fragmens sejtpusztulást elõsegítõ aktivitásához nem szükséges a teljes SH3 domén, hanem az SH3 doménnek egy részlete váltja ki, mint amilyen egy rövid peptidszekvencia.
5
2
Az SH3 domén fragmense 70 vagy ennél kevesebb, elõnyösebben 30 vagy ennél kevesebb, még elõnyösebben 10 vagy ennél kevesebb aminosavat tartalmaz az SH3 domén aminosavszekvenciájából. Különösen a találmány magában foglal egy gyógyászati készítményt, amely tartalmazza a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensét, amely az 1. táblázat DNS-szekvenciái által kódolt aminosavszekvenciákból áll.
1. táblázat Szekvenciák
Név
DNS-szekvenciák
SEQ ID N°1
RasGAP284–351
gaagatagaaggcgtgtacgagctattctacctta cacaaaagtaccagacactgatgaaataagtttct taaaaggagatatgttcattgttcataatgaatta gaagatggatggatgtgggttacaaatttaagaac agatgaacaaggccttattgttgaagacctagtag aagaggtgggccgggaagaagatccacatgaagga aaaatatggttccatgggaagatttccaaacagga agct
–EDRRRVRAILPYTKV PDTDEISFLKGDMFI VHNELEDGWMWVTNL RTDEQGLIVEDLVEE VGREEDPHEGKIWFH GKISKQEA
SEQ ID N°2
RasGAP284–341
gtacgagctattctaccttacacaaaagtaccaga cactgatgaaataagtttcttaaaaggagatatgt tcattgttcataatgaattagaagatggatggatg tgggttacaaatttaagaacagatgaacaaggcct tactgttgaagacctagtagaagaggtgggccggg aagaagatccacacgaaggaaaaatatgg
RVRAILPYTKVPDTD EISFLKGDMFIVHNE LEDGWMWVTNLRTDE QGLIVEDLVEEVGRE EDPHEGKIW
SEQ ID N°3
RasGAP284–336
gtacgagctattctaccttacacaaaagtaccaga cactgatgaaataagtttcttaaaaggagatatgt tcattgttcataatgaattagaagatggatggatg tgggttacaaatttaagaacagatgaacaaggcct tattgttgaagacctagtagaagaggtgggccgg
RVRAILPYTKVPDTD EISFLKGDMFIVHNE LEDGWMWVTNLRTDE QGLIVEDLVEEVGR
SEQ ID N°4
RaSGAP317–326
tggatgtgggttacaaatttaagaacagat
WMWVTNLRTD
Abban az esetben, ha az N2 szekvencia SH3 doménjének fragmense a 4. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 4), RasGAP317–326, akkor az eredményül kapott, a 4. azonosító számú szekvencia által kódolt aminosavszekvencia a humán WMWVTNLRTD. Különbözõ fajok közötti összehasonlítás felfedte, hogy különbözõ aminosavak vannak, amelyek konzerváltak a fajok között, ahogy ezt a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat Fajok
RasGAP317–326 aminosavszekvenciák
Humán
WMWVTNLRTD
Bos taurus
WMWVTNLRTD
Egér
WMWVTNLRTD
Rattus norvegicus
WMWVTNLRTD
Anopheles
WLWVTAHRTG
Drosophilia
WLWVTAHRTG
Egymás alá rendezés
WxWVTxxRTx
A fajok közötti konzervált aminosavakat félkövér aláhúzott betûtípussal jelöltük, míg az X jelentése olyan aminosav, amely konzervatív vagy nem konzer-
Aminosavszekvenciák
35 vatív aminosavszubsztitúcióval cserélhetõ, anélkül hogy sérülne az N2 SH3 doménjének ezen 10 aminosavas részleteinek a találmány szerinti tulajdonságai. A konzervatív aminosavszubsztitúciót az alábbi öt csoport szerinti cserék egyikeként definiáljuk: 40 I. Kis alifás, nem poláros vagy enyhén poláros aminosavak: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly. II. Poláros, pozitív töltésû aminosavak: His, Arg, Lys. III. Poláros, negatív töltésû aminosavak: and their 45 amides: Asp, Asn, Glu, Gln. IV. Nagy, aromás aminosavak: Phe, Tyr, Trp. V. Nagy, alifás, nem poláros aminosavak: Met, Leu, Ile, Val, Cys. A humán N2 SH3 doménjének ezen 10 aminosavas 50 peptidváltozatait, és különösen a közös szekvenciát WXWVTXXRTX, szintén magában foglalja a találmány, és olyan peptidekre utalnak, amelyek aminosavszekvenciája bizonyos mértékig különbözik a WMWVTNLRTD natív szekvenciától, konzervatív és 55 nem konzervatív aminosavszubsztitúciókkal, amivel egy vagy több aminosav egy másik azonos karakterisztikájú és konformációs szerepû aminosavval van szubsztituálva. Elõnyösen a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmense tartalmazza a WMWVTNLRTD 60 aminosavszekvenciát. 6
1
HU 004 118 T2
Általában a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmense, amely tartalmazza a találmányban ismertetett WXWVTXXRTX általános szekvenciát, konjugálva van egy olyan vegyülettel, amely növeli a peptid akkumulációját a sejtben. Ilyen vegyület lehet egy olyan vegyület, amely indukálja a receptor irányította endocitózist, mint amilyen például a membrán transferrin-receptor irányított endocitózisa a terápiás gyógyszerekhez konjugált transferrinnek (Qian Z. M. és munkatársai, „Targeted drug delivery via the transferrin receptormediated endocytosis pathway” Pharmacological Reviews, 54, 561, 2002) vagy egy sejtmembrán-permeábilis karrier, amely választható például a zsírsavak, mint amilyen a dekánsav, mirisztinsav és sztearinsav alkotta csoportból, amelyek már voltak alkalmazva a protein kináz C peptid inhibitorainak intracelluláris bejuttatására (Ioannides C. G. és munkatársai, „Inhibition of IL–2 receptor induction and IL–2 production in the human leukemic cell lineJurkat by a novel peptide inhibitor of proteinkinase C” Cell Immunol., 131, 242, 1990) és protein-tirozin foszfatáz (Kole H. K. és munkatársai, „A peptide-based protein-tyrosine phosphatase inhibitor specifically enhances insulin receptor function in intact cells” J. Biol. Chem. 271, 14302, 1996) vagy peptidek között. Elõnyösen sejtmembrán-permeábilis karriereket alkalmazunk, még elõnyösebben egy sejtmembrán-permeábilis peptid karriert alkalmazunk. Abban az esetben, ha a sejtmembrán-permeábilis karrier peptid, akkor elõnyösen arginingazdag peptid. Nemrégiben Futaki és munkatársai bemutatták (Futaki S. és munkatársai, „Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular proteindelivery” J. Biol. Chem., 276, 5836, 2001), hogy az arginingazdag aminosavak száma a sejtmembrán-permeábilis karrierben peptidben, szignifikáns hatással van az internalizáció módjára, és úgy tûnik, hogy létezik egy optimális száma az arginin aminosavaknak az internalizációra, elõnyösen több mint 6 arginint tartalmaznak. A találmány szerinti peptid általában egy távtartóval van a sejtmembrán-permeábilis karrierhez konjugálva. Ebben az esetben a sejtmembrán-permeábilis karrier elõnyösen peptid. Általában az arginingazdag peptidek a HIVTAT48–57 peptidet, a FHV-coat35–49 peptidet, a HTLV¹II Rex4–16 peptidet és a BMV gag7–25 peptidet tartalmazó csoportból kerülnek kiválasztásra. Elõnyösen az arginingazdag peptid a HIV-TAT48–57 peptid. Abban az esetben, ha a HIV-TAT48–57 peptid van konjugálva RasGAP szekvenciához, mint amilyen például a RasGAP317–326, akkor két glicin aminosav kerül inzertálásra a TAT és a RasGAP szekvenciák közé távtartónak és rugalmasságot biztosítónak. Mivel a natív peptidek egy inherens problémája (az L¹formában) a természetes proteázok általi lebontás, ezért a találmány szerinti peptid elõállítható oly módon, hogy tartalmazzon D¹formákat és/vagy a peptid „retroinverz izomerjeit”.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
Ebben az esetben a találmány szerinti peptid fragmenseinek retroinverz izomerjeit állítjuk elõ. A peptid védelme a természetes proteolízistõl tehát növeli a specifikus heterobivalens vagy heteromultivalens vegyület hatásosságát. Magasabb biológiai aktivitás jelezhetõ elõre a retroinverz formát tartalmazó peptidre, ha összehasonlítjuk a retroinverz formát nem tartalmazó analóggal, ami a natív proteinázok általi lebontástól való védelemnek a következménye. Továbbá bemutatták róluk, hogy megnövelt stabilitással bírnak, és alacsonyabb immunogenitással (Sela M. és Zisman E., „Different roles of D¹amino acids in immune phenomena” FASEB J. 11, 449, 1997). A retroinverz peptidek ismert szekvenciájú peptidekre készíthetõek például a Sela és Zisman, (1997) által ismertetett módon. A „retroinverz izomer” alatt egy lineáris peptid olyan izomerjét értjük, amelyben a szekvencia iránya fordított, és minden egyes aminosav kiralitása is fordított; ennek megfelelõen nem lehet végcsoport-komplementaritás. A jelen találmány magában foglalja a peptid módosításait (amelyek normálisan nem változtatják meg az elsõdleges szekvenciát), ideértve a peptidek in vivo vagy in vitro kémiai származékoltatását, például acetilezését vagy karboxilezését. Idetartoznak továbbá a glikozilezéses módosítások, például azok, amelyeket a peptid glikozilezési mintázatának módosítására végzünk a szintézise vagy a feldolgozása során vagy a további feldolgozási lépések során, például a peptid olyan enzimekkel való kezelése révén, amelyek befolyásolják a glikozilezést, például emlõs glikozilezõ vagy deglikozilezõ enzimek. Idetartoznak továbbá az olyan szekvenciák, amelyek poszforilált aminosavakkal bírnak, például foszfotirozin, foszfoszerin vagy foszfotreonin. A találmány magában foglal analógokat, amelyekben egy vagy több peptidkötés alternatív kovalens típusú kötésre van cserélve („peptidomimetikus” kötésre), ami nem érzékeny a peptidázok általi hasításra. Ahol probléma az alanynak történõ injekciózást követõen a peptidek proteolitikus lebontása, ott a különösen érzékeny peptidkötésnek egy nem hasítható peptidomimetikus kötésre való cseréje az eredményül kapott peptidet stabilabbá teszi, és ezáltal hatásosabb hatóanyaggá. Az ilyen mimetikumok és a peptidekbe történõ beépítésük jól ismert a szakterületen. Szintén alkalmasak az aminoterminális blokkolócsoportok, mint a t¹butil-oxi-karbonil, acetil, etil, szukcinil, metoxi-szukcinil, suberil, adipil, azelail, dansil, benziloxi-karbonil, fluorenil-metoxi-karbonil, metoxi-azelail, metoxi-adipil, metoxi-suberil és 2,4,¹dinitro-fenil. A peptidek töltött amino- és karboxivégeinek a blokkolása azzal az addicionális elõnnyel is járhat, hogy javítja a peptid átjutását a hidrofób sejtmembránon a sejtbe. Amennyiben rekombináns technikák kerülnek alkalmazásra a lényegében a RasGAP fehérje N2 szekvenciájából álló peptid elõállítására, amely tartalmazza a WXWVTXXRTX általános aminosavszekvenciát a találmánynak megfelelõen, akkor a polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciák alkalmazása elõnyös. A rekom-
1
HU 004 118 T2
bináns technikák gyakorlati megvalósítása érdekében lásd például Maniatis és munkatársai laboratóriumi kézikönyvét, 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, és a kereskedelemben elérhetõ eljárásokat. Ezért a találmány tárgyát képezik a fent ismertetett WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, lényegében a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmenseibõl álló peptidet kódoló tisztított és izolált nukleinsavszekvenciák. Általában a WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensét kódoló nukleinsav DNS, RNS vagy DNS/RNS hibrid. Az itt alkalmazható DNS lehet bármilyen polidezoxinukleotidszekvencia, ideértve például a következõket: duplaszálú DNS, egyszálú DNS, duplaszálú DNS, amelyben egy vagy mindkét szál kettõ vagy több fragmensbõl áll, duplaszálú DNS, amelyben egy vagy mindkét szál foszfodiészterváza megszakítás nélküli, egy vagy több egyszálú rész(eke)t és egy vagy több duplaszálú rész(eke)t tartalmazó DNS, duplaszálú DNS, amelyben a DNS-szálak teljesen komplementerek, duplaszálú DNS, amelyben a DNS-szálak csak részben komplementerek, cirkuláris DNS, kovalensen zárt DNS, lineáris DNS, kovalensen keresztkötött DNS, cDNS, kémiailag szintetizált DNS, félszintetikus DNS, bioszintetikus DNS, természetbõl izolált DNS, enzim emésztett DNS, vágott DNS, jelölt DNS, mint amilyen a radiológiailag jelölt DNS és a fluorokróm jelölt DNS, egy vagy több természetben nem elõforduló nukleinsavfajtát tartalmazó DNS. A WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, lényegében a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensébõl álló peptidet kódoló DNS-szekvenciák szintetizálhatók standard kémiai technikákkal, például a foszfotriésztereljárással vagy automatizált szintéziseljárásokkal és PCR-eljárásokkal. A WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensét kódoló DNS-szekvencia a találmány szerint elõállítható enzimatikus technikákkal. Így restrikciós enzimek, amelyek nukleinsavakat egy elõre meghatározott szekvenciánál vágnak alkalmazhatóak nukleinsavak izolálására a nukleinsavat tartalmazó nagyobb nukleinsavmolekulákból, mint amilyen az a DNS (vagy RNS), amely a WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, lényegében a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensébõl álló peptidet kódol. A találmány magában foglal poliribonukleotid (RNS) formában lévõ nukleinsavat, ideértve például a következõket: egyszálú RNS, cRNS, duplaszálú RNS, duplaszálú RNS, amelyben egy vagy mindkét szál kettõ vagy több fragmensbõl áll, duplaszálú RNS, amelyben egy vagy mindkét szál foszfodiészterváza megszakítás nélküli, egy vagy több egyszálú rész(eke)t és egy vagy több duplaszálú rész(eke)t tartalmazó RNS, duplaszálú RNS, amelyben az RNS-szálak teljesen komplementerek, duplaszálú RNS, amelyben az RNS-szálak csak részben komplementerek, kovalensen keresztkö-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
tött RNS, enzim emésztett RNS, vágott RNS, mRNS, kémiailag szintetizált RNS, félszintetikus RNS, bioszintetikus RNS, természetbõl izolált RNS, jelölt RNS, mint amilyen a radiológiailag jelölt RNS és a fluorokróm jelölt RNS, egy vagy több természetben nem elõforduló nukleinsavfajtát tartalmazó RNS. Elõnyösen a nukleinsav tisztított és izolált DNSszekvencia, amely a következõkbõl álló csoportból választott: 1. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 1), 2. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 2), 3. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 3), 4. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 4). A találmány tartalmazza a fent említett szekvenciák variánsait, amelyek egy olyan nukleotidszekvenciák, amelyek a referenciaszekvenciától konzervatív nukleotidszubsztitúciókban különböznek, miszerint egy vagy több nukleotid ugyanolyan jellemzõkkel bíró másik nukleotidra van cserélve. A találmány magában foglalja az ismertetett tisztított és izolált nukleinsavak allélikus változatait is; tehát az izolált és tisztított nukleinsavak természetben elõforduló alternatív formái, amelyek szintén kódolnak peptideket, amelyek megegyeznek, homológok vagy rokonságban vannak a tisztított és izolált nukleinsavszekvenciák által kódolt peptidekkel. Alternatív esetben természetben nem elõforduló variánsok is elõállíthatóak mutagén eljárásokkal vagy közvetlen szintézissel. A fent említett, WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmensét kódoló tisztított és izolált nukleinsavszekvencia tartalmazhat továbbá sejtmembrán-permeábilis karrier peptidet kódoló nukleotidszekvenciát. A WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának fragmense adott esetben konjugálva lehet olyan vegyülettel, amely növeli a peptid sejtbeli akkumulációját, ahogy azt itt ismertettük, elõnyösen rekombináns módon sejt expressziós rendszerben kerül elõállításra. A találmány szerinti DNS-szekvenciák expressziójára számos egysejtû gazdaszervezet alkalmas. Ezen gazdák közé tartozhatnak jól ismert eukarióta és prokarióta gazdaszervezetek, mint amilyen törzsek az E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, gomba, mint amilyen az élesztõ, és állati sejt, mint amilyen a CHO,YB/20, NSO, SP2/0, RI. 1, B¹W és L¹M sejt, afrikai zöldmajom vese sejt (például COS 1, COS 1, BSC1, BSC40, és BMT10), rovar sejt (például Si9), és humán sejtek és növényi sejtek szövettenyészetben. Elõnyösen a gazdasejt baktériumsejt, elõnyösebben E. coli sejt. Elõnyösen a WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmensén és genotoxinon kívül a gyógyászati készítmény tartalmazhat egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót, diluenst és adjuvánst. Az elfogadható hordozók, diluensek és adjuvánsok, amelyek megkönnyítik a hatóanyag feldolgozását a készítménybe, és amelyek gyógyszerészetileg alkalmazhatóak és nem toxikusak a recipiens számára az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban, közé tartoz-
1
HU 004 118 T2
nak pufferek, mint amilyen a foszfát, citrát és további szerves savak; antioxidánsok, mint amilyen a metionin; tartósítószerek (mint amilyen az oktadecil-dimetilbenzil-ammónium-klorid; hexametónium-klorid; benzalkónium-klorid; benzetónium-klorid; fenol, butil- vagy benzil-alkohol; alkil-parabének, mint amilyen a metilvagy propil-parabén; cathecol; rezorcinol; ciklohexanol; 3¹pentanol; és m¹krezol); kis molekulatömegû (kevesebb mint körülbelül 10 aminosav) polipeptidek, fehérjék, mint amilyen az albumin, zselatin, vagy immunglobulinok; hidrofil polimerek, mint amilyen a poli(vinil-pirrolidon); aminosavak, mint a glicin, glutamin, aszparagin, hisztidin, arginin, vagy lizin; monoszacharidok, diszacharidok és további szénhidrátok, ideértve a glükózt, mannózt vagy dextrineket; kelálóvegyületek, mint amilyen az EDTA; cukrok, mint amilyen a szacharóz, mannit, trehalóz vagy szorbit; sóképzõ ellenionok, mint amilyen a nátrium; fémkomplexek (például ZN¹fehérje komplexek); és/vagy nemionos felületaktív anyagok, mint amilyen a TWEEN®, PLURONICS® vagy polietilénglikol (PEG). A gyógyászati készítmény beadási módja lehet szisztémás vagy topikális. Például egy ilyen készítmény beadása történhet különbözõ parenterális utakon, mint amilyenek a szubkután, intravénás, intradermális, intramuszkuláris, intraperitoneális, intranazális, transzdermális, bukkális útvonalak vagy egy implantált eszköz révén, és bejuttatható perisztaltikus eszközökkel. Az itt ismertetett, a WXWVTXXRTX általános szekvenciát tartalmazó, a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmensét és genotoxint tartalmazó gyógyászati készítmény, hatóanyagként beépíthetõ vagy impregnálható biabszorbálható mátrixba, ahol a mátrixot a mátrix szuszpenziójaként adjuk be, gélbe vagy szilárd hordozóba. Továbbá a mátrix állhat biopolimerbõl. Elnyújtott kibocsátású készítmények is elõállíthatóak. A fenntartott kibocsátású készítmények megfelel példái közé tartoznak szilárd hidrofób polimerek féligáteresztõ mátrixai, amely mátrixok formázott alakban vannak, például filmek, vagy mikrokapszulák. Az elnyújtott kibocsátású mátrixok példái közé tartoznak poliészterek, hidrogélek [például poli(2¹hidroxi-etil-metakrilát) vagy poli(vinil-alkohol)], polilaktidok (3773919 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), L¹glutaminsav és [gamma]-etil-L-glutamát kopolimerei, nem degradábilis etilén-vinil-acetát, degradábilis tejsav-glikolsav kopolimerek, mint amilyen a LUPRON DEPOT ™ (injekciózható mikrogömbök, amelyek tejsav-glikolsav kopolimerbõl és leuprolid-acetátból állnak), és poliD¹(–)-3-hidroxi-butirátsav. Az in vivo beadásra szánt kiszereléseknek sterilnek kell lenni. Ez könnyen elérhetõ például steril membránszûréssel. Értelemszerûen a találmány szerinti gyógyászati készítmény megfelelõ dózisa függ az életkortól, nemtõl, a recipiens egészségi állapottól és tömegétõl, az egyidejûleg zajló kezelések fajtájától, ha vannak ilyenek, és a kívánt hatás természetétõl.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
A megfelelõ dózisalak függ a betegségtõl, a találmány szerinti peptidtõl, a genotoxintól és a beadás módjától; a lehetõségek közé tartoznak a tabletták, kapszulák, szögletes tabletták, dentális paszták, kúpok, inhalálószerek, oldatok, kenõcsök és parenterális depó. Mivel a peptid aminosavainak az aminosavmódosításai szintén a találmány tárgyát képezik, ezért ez alkalmas lehet a találmány szerinti peptid keresztkötéséhez egy vízoldható mátrixhoz vagy egyéb makromolekuláris hordozóhoz, hogy ezáltal javuljon az oldhatóság, adszorpció és az agy-vér gáton történõ permeabilitás. Az ilyen módosítások jól ismertek a szakterületen, és adott esetben eltüntethetnek vagy csillapíthatnak lehetséges nemkívánatos mellékhatásait a peptidnek és a hasonlóknak. Miközben az elõnyös találmány szerinti gyógyászati készítmény a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensét és a genotoxint tartalmazza hatóanyagként, ezért egy alternatív gyógyászati készítmény tartalmazhatja hatóanyagként a RasGAP fehérje N2 szekvenciája fragmensét kódoló tisztított és izolált nukleinsavszekvenciát, ahogy azt itt ismertettük. Ez a gyógyászati készítmény tartalmazhatja továbbá csupán a tisztított és izolált DNS-szekvenciát, egy expressziós vektort, amely tartalmazza a tisztított és izolált DNS-szekvenciát vagy egy olyan gazdasejtet, amely elõzõleg egy itt ismertetett expressziós vektorral volt transzfektálva vagy transzformálva. Ez utóbbi esetben a gazdasejt valószínûleg a kezelni kívánt páciensbõl lesz izolálva, hogy ezáltal elkerüljünk bármilyen antigenitás problémát. Ezek a gén- és sejtterápiás eljárások különösen megfelelõek az olyan páciensek esetében, akiknek szükséges a gyógyászati készítmény ismételt beadása, mivel a tisztított és izolált DNS-szekvencia, expressziós vektor vagy az elõzõleg expressziós vektorral transzfektált vagy transzformált gazdasejt, beépíthetõ a páciens sejtjében, amely ezt követõen a fehérjét endogén módon termeli. Általában az itt ismertetett gyógyászati készítmény alkalmas rák kezelésére vagy megelõzésére. Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása rák kezelésére vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A „rák” kifejezés egy olyan fiziológiai állapotra utal vagy olyan fiziológiai állapotot ismertet emlõsökben, amelyre tipikusan jellemzõ a nem szabályozott sejtnövekedés. Általában a kezelt vagy megelõzött rák a következõkbõl álló csoportból választott: karcinóma, limfóma, blasztóma, szarkóma, liposzarkóma, neuroendokrintumor, mezotelióma, schwannoma, meningioma, adenokarcinóma, melanoma, leukémia, limfoikus malignancia, pikkelysejtes rák, epithelialis pikkelysejtes rák, tüdõrák, kissejtes tüdõrák, nem kissejtes tüdõrák, tüdõadenokarcinóma, tüdõ pikkelysejtes rákja, hashártyarák, hepatocelluláris rák, gasztrikus vagy gyomorrák, gasztrointesztinális rák, hasnyálmirigyrák, glioblasztóma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, hólyagrák,
1
HU 004 118 T2
hepatóma, emlõrák, vastagbélrák, végbélrák, kolorektális rák, méhnyálkahártya- vagy méhkarcinóma, nyálmirigy-karcinóma, vese- vagy veseeredetû rák, prosztatarák, vulvaris rák, pajzsmirigyrák, hepatikus karcinóma, anális karcinóma, péniszkarcinóma, hererák, nyelõcsõrák, epevezeték-rendszer rákja, és fej- és nyakrák. Elõnyösen a rák mezotelióma, hererák vagy hasnyálmirigyrák. A találmány szerinti gyógyászati készítmény általánosan az elérendõ cél eléréséhez szükséges mennyiségben kerül alkalmazásra. A rák kezelésére vagy megelõzésére a gyógyászati készítményeket terápiásan hatásos mennyiségben adjuk be vagy visszük fel, hogy ezáltal csökkentsük vagy megelõzzük a tüneteket, vagy megnöveljük a kezelt alany túlélését. A terápiásan hatásos mennyiség meghatározása a szakterületen jártas szakemberek képességeit egyáltalán nem haladja meg, különösen az itt adott részletes leírás fényében. A szisztémás beadásra a terápiásan hatásos mennyiség vagy dózis kezdetben in vitro vizsgálatokból becsülhetõ. Például állatmodellekben meghatározható egy dózis, hogy egy adott keringési koncentrációtartományt érjünk el, amely tartalmazza a sejttenyészetben meghatározott IC50 értéket. Az ilyen információk alkalmazhatóak a megfelelõ humán dózisok pontosabb meghatározására. A kezdeti dózisok meghatározhatóak továbbá in vivo adatokból, például állatmodellekkel a szakterületen jól ismert eljárások alkalmazásával. Egy átlagos szakember könnyen optimalizálhatja az embereknek történõ beadást az állati adatokon alapulva, és a beadás természetesen függ a kezelni kívánt alanytól, az alany tömegétõl, a rendellenesség súlyosságától, a beadás módjától és a felíró orvos ítéletétõl. A találmány egy további célja készlet adása egy alanyban rák kezelésére vagy megelõzésére, amely készlet tartalmazza az itt ismertetett gyógyászati készítményt adott esetben reagensekkel és instrukciókkal az alkalmazásra. Általánosan a készlet tartalmaz tárolóedényt, címkét vagy belsõ címkét a tárolóedényen vagy a tárolóedényben. A megfelelõ tárolóedények közé tartozik például az üveg, ampulla, fecskendõ stb. A tárolóedények számos anyagból készülhetnek, mint amilyen az üveg és a mûanyag. A tárolóedényben van a készítmény, amely hatásos a rák kezelésére, és amelynek lehet egy steril hozzáférést biztosító nyílása (például a tárolóedény lehet intravénás oldattasak, vagy egy olyan ampulla, amelynek egy olyan lezárórésze van, amely átlyukasztható hipodermiás injekciós tûvel). A címke vagy csomagbetét azt jelzi, hogy a készítményt a választott rák kezelésére alkalmazzák. Adott esetben a készlet tartalmazhat továbbá különálló gyógyászati dózisalakot, amely további rákellenes vegyületet tartalmaz, amely vegyület a fent ismertetett gyógyszerek, antiepidermális növekedési faktor receptor antitestek, radioimmunoterápiás vegyületek és kombinációk által alkotott csoportból választott.
2
Példák
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1. példa Sejtek és transzfekció HeLa és MCF¹7 sejteket tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben (Sigma; kat. szám: 8758), amely tartalmazott 10% újszülött borjúszérumot (Sigma; kat. szám: N4637), 37 °C¹on és 5% CO2-ban. U2OS sejteket tartottunk fenn DMEM tápközegben (Sigma; kat. szám: 5796), amely tartalmazott 15% magzati borjúszérumot (Sigma; kat. szám: F7524) 37 °C¹on és 5% CO2-ban. H¹Meso¹1 sejteket tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot tartalmazott, 37 °C¹on és 5% CO2-ban. HUVEC¹C sejteket tartottunk fenn humán endothelialis SFM tápközegben (Gibco; kat. szám: 11111–044), amely 10% újszülött borjúszérummal, 20 ng/ml bázikus fibroblaszt növekedési faktorral (Gibco; kat. szám: 13256–029), 10 ng/ml epidermális növekedési faktorral (Gibco; kat. szám: 13247–051), 10 mg/ml fibronektinnel (Gibco; kat. szám: 33016–015) volt kiegészítve 37 °C¹on és 5% CO2-ban. HaCat sejteket tartottunk fenn keratinocita SFM tápközegben, amely tartalmazott 1–53 epidermális növekedési faktort és borjú hipofízis kivonatot (Gibco; kat. szám: 17005–075) 37 °C¹on és 5% CO2-ban. HeLa sejteket transzfektáltunk korábban ismertetett módon (Yang J.¹Y. és Widmann C., Mol. Cell. Biol., 21, 5346, 2001). Genotoxinkezelést végeztünk 6 lyukú lemezeken. A sejteket a kezelés elõtti napokon megosztottuk 2,5×105 sejt/lyuk koncentrációban. U2OS sejteket transzfektáltunk 6 lyukú lemezeken a kalcium/foszfát kicsapási eljárás alkalmazásával (Jordan M. és munkatársai, „Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitateformation” Nucleic Acids Res., 24, 596, 1996). Röviden, plazmidokat hígítottunk 90 ml H2O-ban, kevertük õket 10 ml 2,5 M¹os CaCl2-dal, és 10 percet inkubáltuk õket szobahõmérsékleten. Ezután 100 ml HEP-oldatot (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4, 12 mM D¹glükóz, 50 mM HEPES) kevertünk össze gyorsan a DNS-oldattal, pontosan 1 percet inkubáltuk szobahõmérsékleten, és végül áthelyeztük a sejttenyésztési tápközegre. 37 °C¹on és 5% CO2-ban 8 óra eltelte után a tápközeget friss tenyésztési tápközegre cseréltük, és a sejteket további 16–24 órát inkubáltuk a vizsgálatok elõtt.
Vegyszerek A cisplatin és a mitoxantrone a Sigmától volt (kat. szám, rendre: P4394 és M6545). A cisplatint DMSOban hígítottuk 100 mM végkoncentrációra és –20 °C¹on tároltuk. A mitoxantrone¹t 100%¹os etanolban hígítottuk 10 mM végkoncentrációra és –80 °C¹on 55 tároltuk. Az adriamycin a Calbiochemtõl volt (kat. szám: 324380). Vízben hígítottuk 10 mM végkoncentrációra és –20 °C¹on tároltuk. A Hoechst 33342 a Roche-tól volt (kat. szám: H–1399). Vízben hígítottuk 10 mM végkoncentrációra és 4 °C¹on sötétben tá60 roltuk. 50
10
1
HU 004 118 T2
Peptidszintézis és jelölés A HIV-TAT48–57 (GRKKRRQRRR) és a TAT-RasGAP 317–326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD) peptideket a Lausanne¹i Egyetem Biokémia Intézetében szintetizálták, University of Lausanne, Svájc, FMOC technológia alkalmazásával, HPLC-vel tisztítva és tömegspektrometriával tesztelve. A fluoreszcein-izotiocianát (FITC)-jelölést a b¹alanin-GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD szekvencián végeztük, amelynek az Fmoc-védett oldalláncú aminosavai az Arg (bpf), Lys (Boc), Gln (Trt), Trp (Boc), Thr (tBu), Asn (Trt) és Asp (OtBu) voltak. A peptidet lépésenként szintetizáltuk 0,2 mmol Rink Amide AM gyantán Fmoc-kémia alkalmazásával. A szintézist ninhidrinvizsgálattal monitoroztuk. A b¹alanin kapcsolását követõen az Fmoc-csoportot eltávolítottuk dimetilformamidban (DMF) lévõ 20% piperidinnel. Ebben a szakaszban a peptid N¹terminusához konjugáltunk egy fluoreszceincsoportot FITC-vel (5¹szörös felesleg a gyantaszubsztitúcióhoz képest 4 ml DMF-ben és 1 ml N¹etil-diizopropil-aminban), hogy megkapjuk a fluoreszceinszármazékolt peptidet. A peptideket ionmentesített vízben 1 mM végkoncentrációban hígítottuk és –20 °C¹on tároltuk a további felhasználásig. Plazmidok A dn3 kiterjesztés a plazmid nevében azt jelöli, hogy a gerincvektor a pcDNA3 (Invitrogen) expressziós vektor. Az összes konstrukciót a HA szekvenciával (MGYPYDVPDYAS) jelöltük az N aminoterminális végen. Az N2.dn3 plazmid a humán RasGAP N2 fragmenst kódolja, az SH2-SH3.dn3 plazmid a humán RasGAP 158–361. aminosavait kódolja, az SH2.dn3 plazmid a humán RasGAP 158–277. aminosavait kódolja, az SH3.dn3 plazmid a humán RasGAP 279–361. aminosavait kódolja. Az IkBaDN2 plazmidok az IkBa egy olyan formáját kódolják, amely gátolja az NFkB-aktiválódást (Yang és Widmann, 2002b). A pEGFP¹C1 plazmid, amely a GFP fehérjét kódolja, a Clontechtõl volt. A pRL¹TK, amely egy vektor, amely a Renilla renifornis luciferázt kódolja, a Promegától volt. A prLUC egy riporterplazmid, amely hordozza a szentjánosbogár luciferázt cDNS¹t NFkB-reszponzív elemek szabályozása alatt (Yang J¹Y. és Widmann C., Mol. Cell. Biol., 21, 5346, 2001). Apoptózismérések Az apoptózist a piknotikus sejtmagokat mutató sejtek számlálásával határoztuk meg. Élõ sejtek sejtmagjait Hoechst 33342-vel jelöltük meg (10 mg/ml végkoncentráció) körülbelül 5 percig, és a sejteket ezt követõen egy fluoreszcencia és transzmittált fény optikával felszerelt Leica DMIRB mikroszkóp alkalmazásával vizsgáltuk (alkalmanként legalább 400 sejtet). Az apoptózismeghatározást a sejtek transzfekcióját vagy kezelését követõen egy nappal végeztük. A transzfektált sejteket érintõ kísérletekben pEGFP-Cl¹t tettünk a transzfekciós oldatba a transzfektált sejtek GFP-vel történõ megjelölésére. Ebben az esetben az apoptózis
2
mértékét csak a transzfektált sejtekben határoztuk meg. Luciferáz-riportervizsgálat A luciferázvizsgálatot a Promega Dual-Luciferase Reporter Assay nevû vizsgálati rendszerrel végeztük (kat. szám: E1910). A sejteket 100 ml PLB lizispufferrel lizáltuk a 6 lyukú lemezekrõl, ami része volt a Promega készletének, és harminc percig jégen inkubáltuk. A li10 zátumot ezt követõen 16 000 g, 15 perces centrifugálással tisztává tettük. A szentjánosbogár luciferáz aktivitást 20 ml lizátum és 25 ml LARII reagens összekeverésével rögzítettük, és a Renilla luciferáz aktivitást az elõzõ keverékhez 25 ml Stop & Glo reagens hozzáadá15 sával rögzítettük. Minden egyes méréshez a fénykibocsátást 12 másodpercig határoztuk meg egy Lumat LB 9501 luminomérõ készülék alkalmazásával (Berthold Technologies, Zürich, Svájc). 5
20
25
30
35
40
Western-blot vizsgálat Sejteket lizáltunk lízispufferben [25 mM Hepes, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,1 mM Na3VO4, 1% TritonX100, teljesen EDTA-mentes proteáz inhibitor koktél tabletták (Roche; kat. szám: 1873580)]. A fehérjéket SDS-PAGE¹n választottuk el, és nitro-cellulóz-membránra blotoltuk õket (BioRad; kat. szám: 162–0115). Ezt követõen a membránokat TBS-sel blokkoltuk (18 mM HCl, 130 mM NaCl, 20 mM Tris), 5% zsírmentes száraz tej 30 percig szobahõmérsékleten és éjszakán át inkubáltuk a megfelelõ elsõdleges antitesttel. Ezeket az antitesteket Alexa Fluor 680 konjugált másodlagos antitestekkel detektáltuk (Molecular Probes; kat. szám: A21109) 1:2500 arányban hígítottuk TBS-ben, 5% zsírmentes száraz tej és ezt követõen az Odyssey infravörös képalkotó rendszerrel jelenítettük meg (Licor, Homburg, Németország). A foszfo-38-ellenes elsõdleges antitestet (Cell Signaling Technology; kat. szám: 9211L) 1:500 arányban hígítottuk TBS-ben lévõ 5% BSA-ban. A foszfoJNK-ellenes elsõdleges antitestet (Cell Signaling Technology; catn 9551L) 1:1000 arányban hígítottuk TBSben lévõ 5% BSA-ban. Az Odyssey infravörös képalkotó szoftver alkalmazásával végeztük a mennyiségi meghatározást.
45 Statisztikai elemzés Az összes statisztikai elemzést a Microsoft Excel (XP kiadás) programmal végeztük, student t¹próba alkalmazásával. 50 2. példa Az N2 RasGAP fragmens elõsegíti a különbözõ genotoxinok által indukált apoptotikus választ. Jelen feltalálók nemrégiben bemutatták, hogy az 55 N2 fragmens elõsegíti a cisplatin HeLa tumorsejtvonal ölõ hatását (Yang J.¹Y. és Widmann C., Mol. Cell. Biol., 21, 5346, 2001). Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy az N2 fragmens elõsegíti¹e az apoptotikus választ egyéb genotoxinok hatására, az N2 fragmenst 60 expresszáló vagy nem expresszáló HeLa sejteket tet11
1
HU 004 118 T2
tünk ki adriamycin és mitoxantrone növekvõ koncentrációinak (és cisplatinnak kontrollként). Az 1. ábra azt mutatja, hogy az N2 fragmens jelenléte a HeLa sejteket a kontrollsejtekhez képest legalább 10¹szer érzékenyebbé tette a különbözõ gyógyszerekkel szemben. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az N2 fragmens egy széles spektrumú genotoxinra érzékenyítõ szer. Az N¹fragmensen belül egy olyan minimális szekvencia azonosítása, amely javítja egy gyógyszer ráksejteket elpusztító hatását. Az N2 fragmens egy 36 kDa¹os fehérje, amelyet nehéz kémiailag szintetizálni. Egy olyan rövidebb szekvencia jellemzése, amely még hordozza a genotoxin érzékenység növelõ képességet, egy kritikus lépés az N2 fragmensbõl egy terápiás eszköz kifejlesztésében. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy vajon egy ilyen rövid szekvencia izolálható¹e, az N2 fragmens csonkolt verzióinak egy sorozatát hoztuk létre (2A. ábra), és meghatároztuk azon képességüket, hogy elõsegítik¹e a cisplatinindukált apoptózist HeLa sejtekben (2B. ábra). Az N2 fragmens két SH2 domént és egy SH3 domént tartalmaz (2A. ábra). Elõször azt határoztuk meg, hogy ezen domének közül melyik tartalmazta az N2 fragmens proapoptotikus aktivitását. HeLa sejteket transzfektáltunk a különbözõ SH doméneket kódoló plazmidokkal 0,15 mM cisplatin jelenlétében vagy hiányában, olyan koncentrációban, amelynél a gyógyszerrel szembeni érzékenységkülönbség az N2 fragmenst expresszáló és a nem expresszáló sejtek a maximális (lásd az 1. ábrát). Az üres konstrukció vagy az SH2 domént kódoló konstrukció nem segítette elõ a cisplatinnak az ezen konstrukciókkal transzfektált HeLa sejteket elpusztító képességét. Ezzel szemben az SH3 domént tartalmazó konstrukciók elõsegítették a cisplatin apoptózis révén történõ sejtpusztítását (2B. ábra). Az SH2 doménnek önmagában azon képességének a hiánya, hogy elõsegíti a sejtpusztulást HeLa sejtekben, nem volt a lecsökkent fehérjeexpresszió következménye, mert a Western-blot vizsgálat felfedte, hogy az SH2 domén ugyanolyan hatásosan lett expresszálva, mint a többi konstrukció (adatokat nem mutatjuk). Jelen feltalálók ezt követõen létrehozták az SH3 domén fokozatos csonkolásait, egy olyan próbálkozás során, amelyben azonosítani szerették volna a minimális genotoxinra érzékenyítõ szekvenciát. Ezen konstrukciók mindegyike (lásd a 2A. ábrát), ideértve a legrövidebbet (317–326), amely egy 10 aminosavas peptidet kódol, elõsegítette a cisplatin HeLa sejteket ölõ képességét (2B. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az N2 fragmens sejthalál érzékenyítõ képességéhez nem szükséges a teljes SH domén, hanem ezt csak egy nagyon rövid peptidszekvencia közvetíti. A 317–326 RasGAP szekvenciával konjugált HIVTAT48–57 peptid sejtpermeábilis, genotoxinra érzékenyítõ peptidként hat. Ha a RasGAP 317–326. aminosavait kódoló plazmid egy gyógyszer ráksejteket elpusztító hatását ké-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
pes növelni, akkor a 316–326. aminosavaknak megfelelõ szintetikus peptidnek is ezt a hatást kellene mutatnia, feltéve, hogy be tud jutni sejtekbe. Már bemutatták, hogy egy HIV-TAT fehérje eredetû rövid szekvencia addíciója (HIV-TAT48–57) lehetõvé teszi, hogy polipeptidek hatásosan akkumulálódjanak sejtekben (Schwarze S. R. és munkatársai, „In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse” Science, 285, 1569, 1999). Feltalálók ezért a RasGAP 317–326. aminosavait tartalmazó peptidet szintetizáltak, amely kovalensen volt kötve a HIV-TAT48–57 aminosavhordozó peptidhez. Két glicin aminosavat inzertáltunk a TAT és a RasGAP szekvenciák közé, hogy lehetõvé tegyék a hajlékonyságot. Ennek a peptidnek (ezt követõen TAT-RasGAP317–326 peptidnek nevezzük) a celluláris felvételének meghatározása eszközeként, a FITC fluorofórral jelöltük. A jelölt peptidet négy különbözõ tumorsejtvonallal inkubáltuk: méhnyakeredetû humán adenokarcinóma (HeLa sejtek), humán oszteoszarkóma (U2OS sejtek), emlõráksejtvonal (MCF¹7 sejtek) és humán malignus mezothelomia (HMeso¹1 sejtek) és két nem rákos sejtvonallal (HaCat humán bõrkeratinocita sejtvonal és a HUV-EC¹C humán köldökzsinór endothelialis sejtek). Amint azt a 3. ábrán mutatjuk, a TAT-RasGAP317–326 peptid hatásosan bejutott ezen sejtvonalak mindegyikébe. Nem vettünk észre különbséget a peptid transzlokációjában a rákos sejtek és a nem rákos sejtek esetében. Elõször a rákos sejtvonalak érzékenységét határoztuk meg a három genotoxin növekvõ koncentrációjára (adatokat nem mutatjuk). Ez lehetõvé tette számunkra, hogy minden egyes vizsgált sejtvonalra meghatározzuk a szubletális genotixin koncentrációt. Meglepõ módon, jelen feltalálók bemutatták, hogy a TAT-RasGAP317–326 peptid, szemben a RasGAP nélküli kontroll HIV-TAT48–57 peptiddel, elõsegítette a cisplatin, adriamycin és mitoxantrone vizsgált sejteket elpusztító képességét, és azt, hogy nem, vagy csak elenyészõ mértékben indukált apoptózist kontrollkörülmények esetén. Ezzel szemben a cisplatin, adriamycin és a mitoxantrone által a két nem rákos sejtvonalban indukált apoptotikus válaszra nem volt hatása a peptidek jelenlétének (4B. ábra). Ezért azonosítottunk egy minimális szintetikus peptidet, amely képes specifikusan bejutni és gyógyszerek ráksejteket elpusztító képességét javítani.
Az NFkB és a SAPK útvonalak nem érintettek a TAT-RasGAP317–326 tulajdonságaiban. Ras modulátorként a RasGAP tudta befolyásolni a 50 sejthalált szabályozó Ras-függõ útvonalak némelyikét, mint amilyen a Ras-PI3K-Akt-NFkB útvonal (Datta S. R. és munkatársai, „Cellular survival: a play in three Akts” Genes Dev., 13, 2905, 1999). Ezért meghatároztuk, hogy az NFkB-aktivitás megváltozása részt vesz¹e 55 a TAT-RasGAP317–326 közvetítette elõsegített aktivitásban. Amint azt az 5A. ábrán mutatjuk, az NFkB aktiválódott U2OS sejtekben cisplatin vagy TAT-RasGAP317–326 kezelést követõen, de nem aktiválódott a HIV-TAT 48–57 kontroll peptides stimulálás esetén. 60 A sejtek cisplatin és TAT-RasGAP317–326 együttes in12
1
HU 004 118 T2
kubációja additív NFkB-aktivációt eredményezett (5A. ábra). Az NFkB útvonal részt vesz számos sejttípus esetén a sejttúlélési válaszok indukciójában (Van Antwerp D. J. és munkatársai, „Suppression of TNFalpha-induced apoptosis by NF¹kappaB” Science, 274, 787, 1996; Beg A. A. és Baltimore D., „An essential role for NF¹kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death” Science, 274, 782, 1996), de szükséges lehet néhány esetben az apoptotikus válaszok indukciójában is (Ryan K. M. és munkatársai, „Role of NF¹kappaB inp53-mediated programmed cell death” Nature, 404, 892, 2000). Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy az NFkB TAT-RasGAP317–326 általi aktiválása szükséges¹e az elõsegítõ aktivitás funkcióhoz, egy nem degradábilis IkB formát (IkBaDN2) expresszáltunk a sejtekben. Ahogy az várható volt, ez a konstrukció hatásosan meggátolta az NFkB cisplatin és TAT-RasGAP 317–326 általi aktiválását (5B. ábra). Az IkBaDN2 enyhén növelte a cisplatin által kiváltott apopto-
2
tikus választ (5C. ábra). A TAT-RasGAP317–326 peptidnek a cisplatinnak az U2OS sejtek apoptózis általi elpusztítását elõsegítõ képességét nem befolyásolta az NFkB inhibitor (5C. ábra). Ezek az eredmények azt 5 mutatják, hogy az NFkB útvonal nem érintett a TATRasGAP317–326 általi sejthalál elõsegítõ aktivitásban. A stressz aktivált protein kinázok („stress-activated protein kinases”, SAPKs) – a JNKs és a p38 MAPKs – a különbözõ stimulusok által indukált apoptotikus vála10 szok velejárói (Jarpe M. B. és munkatársai, Oncogene, 17, 1475, 1998). A 6. ábra azt mutatja, hogy sem a kontroll HIV-TAT 48–57 peptid, sem a TAT-RasGAP317–326 peptid nem aktiválta ezeket a MAPK útvonalakat. Ezek a peptidek szintén nem voltak képesek a 15 cisplatine JNK vagy p38 MAPKs stimuláló aktivitásának növelésére (6. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a stressz aktiválta MAPK útvonalak nem érintettek a TAT-RasGAP317–326 genotoxinok ráksejteket elpusztító aktivitásának elõsegítésében.
Szekvencialista <110> Université de Lausanne <120> RasGAp derived peptide for selectively kill cancer cells <130> 14673/PCT <140> PCT/IB04/¹ <141> 2004-06¹29 <150> US 60/483,691 <151> 2003-06¹30 <160> 14 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 249 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1
gaagatagaa ataagtttct tgggttacaa gtgggccggg caggaagct
ggcgtgtacg taaaaggaga atttaagaac aagaagatcc
agctattcta tatgttcatt agatgaacaa acatgaagga
ccttacacaa gttcataatg ggccttattg aaaatatggt
aagtaccaga aattagaaga ttgaagacct tccatgggaa
cactgatgaa tggatggatg agtagaagag gatttccaaa
60 120 180 240 249
gtacgagcta ttctacctta cacaaaagta ccagacactg atgaaataag tttcttaaaa ggagatatgt tcattgttca taatgaatta gaagatggat ggatgtgggt tacaaattta
60 120
<210> 2 <211> 204 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2
13
HU 004 118 T2
agaacagatg aacaaggcct tattgttgaa gacctagtag aagaggtggg ccgggaagaa gatccacatg aaggaaaaat atgg
180 204
<210> 3 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3
gtacgagcta ttctacctta cacaaaagta ccagacactg atgaaataag tttcttaaaa ggagatatgt tcattgttca taatgaatta gaagatggat ggatgtgggt tacaaattta agaacagatg aacaaggcct tattgttgaa gacctagtag aagaggtggg ccgg
60 120 174
<210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4
tggatgtggg ttacaaattt aagaacagat
30
<210> 5 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Glu Asp Arg Arg Arg Val Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Thr Lys Val Pro 1 5 10 15 Asp Thr Asp Glu Ile Ser Phe Leu Lys Gly Asp Met Phe Ile Val His 20 25 30 Asn Glu Leu Glu Asp Gly Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp 35 40 45 Glu Gln Gly Leu Ile Val Glu Asp Leu Val Glu Glu Val Gly Arg Glu 50 55 60 Glu Asp Pro His Glu Gly Lys Ile Trp Phe His Gly Lys Ile Ser Lys 65 70 75 80 Gln Glu Ala <210> 6 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Arg Val Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Thr Lys Val Pro Asp Thr Asp Glu 1 5 10 15 Ile Ser Phe Leu Lys Gly Asp Met Phe Ile Val His Asn Glu Leu Glu 20 25 30
14
HU 004 118 T2
Asp Gly Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu 35 40 45 Ile Val Glu Asp Leu Val Glu Glu Val Gly Arg Glu Glu Asp Pro His 50 55 60 Glu Gly Lys Ile Trp 65 <210> 7 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Arg Val Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Thr Lys Val Pro Asp Thr Asp Glu 1 5 10 15 Ile Ser Phe Leu Lys Gly Asp Met Phe Ile Val His Asn Glu Leu Glu 20 25 30 Asp Gly Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp Glu Gln Gly Leu 35 40 45 Ile Val Glu Asp Leu Val Glu Glu Val Gly Arg 50 55 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 9
Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10
Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp 1 5 10 <210> 11 <211> 10 15
HU 004 118 T2
<212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11
Trp Met Trp Val Thr Asn Leu Arg Thr Asp 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Anopheles albimanus <400> 12
Trp Leu Trp Val Thr Ala His Arg Thr Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 13
Trp Leu Trp Val Thr Ala His Arg Thr Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Az X egy olyan aminosav, amely megváltoztatható konzervatív és nem konzervatív aminosavszubsztitúcióval. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Az X egy olyan aminosav, amely megváltoztatható konzervatív és nem konzervatív aminosavszubsztitúcióval. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Az X egy olyan aminosav, amely megváltoztatható konzervatív és nem konzervatív aminosavszubsztitúcióval. <400> 14
Trp Xaa Trp Val Thr Xaa Xaa Arg Thr Xaa 1 5 10
16
1
HU 004 118 T2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Gyógyászati készítmény, amely tartalmazza az alábbiak kombinációját: i) a RasGAP fehérje N2 szekvenciája legalább egy fragmensét, amely tartalmazza a WXWVTXXRTX általános aminosavszekvenciát, amelyben X jelentése aminosav, és ii) genotoxin, azzal jellemezve, hogy az N2 szekvencia legalább egy fragmense javítja a genotoxin ráksejteket szelektíven elpusztító képességét. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmense az 1., 2., 3. vagy 4. azonosító számú DNS-szekvenciák (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) által kódolt aminosavszekvenciák közül legalább egyet tartalmaz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmense tartalmazza a WMWVTNLRTD aminosavszekvenciát. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmense D¹formában van és/vagy retroinverz izomer formában van. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a RasGAP fehérje N2 szekvenciájának legalább egy fragmense az N2 szekvencia legalább egy fragmensének sejtes akkumulációját elõsegítõ vegyülethez konjugált. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a vegyület sejtmembrán-permeábilis karrier. 7. A 6. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a sejtmembrán-permeábilis karrier peptid. 8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a sejtmembrán-permeábilis karrier peptid D¹formában van és/vagy retroinverz izomer formában van. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a sejtmembrán-permeábilis karrier peptid arginingazdag peptid, amely a HIV-TAT48–57 peptidet, az FHV-coat35–49 peptidet, a HTVL¹II Rex4–16 peptidet és a BMV gag7–25 peptidet tartalmazó csoportból választott. 10. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az arginingazdag peptid a HIVTAT48–57 peptid. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a genotoxin az alkilezõvegyületeket, antimetabolitokat, DNS-vágókat, DNS-kötõket, topoizomerázmérgeket és magorsómérgeket tartalmazó csoportból választott. 12. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkilezõvegyület a lomustine, carmustine, streptozocin, mechlorethamine,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
melphalan, uracil nitrogén mustár, chlorambucil, cyclosphamide, iphosphamide, cisplatin, carboplatin, mitomycin, thiotepa, dacarbazin, procarbazine, hexametilmelamin, trietilén-melamin, busulfan, pipobroman, mitotane és további platine származékok tartalmú csoportból választott. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkilezõvegyület a cisplatin és más platine származék tartalmú csoportból választott. 14. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a DNS-vágó bleomycin. 15. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a topoizomerázméreg a topotecan, irinotecan, camtotechin nátrium só, daorubicin, doxorubicin, idarubicin, mitoxantrone, teniposide, adriamycin és etoposide tartalmú csoportból választott. 16. A 15. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a topoizomerázméreg a mitoxantrone és adriamycin tartalmú csoportból választott. 17. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a DNS-kötõ a dactinomycin és mithramycin tartalmú csoportból választott. 18. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a magorsóméreg a vinblastin, vincristin, navelbin, paclitaxel és docetaxel tartalmú csoportból választott. 19. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az antimetabolit a methotrexate, trimetrexate, pentostatin, cytarabin, araCMP, fludarabin-foszfát, hidroxikarbamid, fluorouracil, floxuridine, klórdeoxiadenozin, gemcitabin, tioguanin és 6¹merkaptopurin tartalmú csoportból választott. 20. A 11. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a genotoxin a cisplatin, mitoxantrone és adriamycin tartalmú csoportból választott. 21. Az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény rák gyógyítására vagy megelõzésére. 22. Az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása rák gyógyítására vagy megelõzésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a rák a karcinóma, limfóma, blasztóma, szarkóma, liposzarkóma, neuroendokrintumor, mezotelióma, schwannoma, meningioma, adenokarcinóma, melanoma, leukémia, limfotikus malignancia, pikkelysejtes rák, epitéliális pikkelysejtes rák, tüdõrák, kissejtes tüdõrák, nem kissejtes tüdõrák, tüdõadenokarcinóma, tüdõ pikkelysejtes rákja, hashártyarák, hepatocelluláris rák, gasztrikus vagy gyomorrák, gasztrointesztinális rák, hasnyálmirigyrák, glioblasztóma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, hólyagrák, hepatóma, emlõrák, vastagbélrák, végbélrák, kolorektális rák, méhnyálkahártya- vagy méhkarcinóma, nyálmirigy-karcinóma, vese- vagy veseeredetû rák, prosztatarák, vulvalis rák, pajzsmirigyrák, hepatikus karcinóma, anális karcinóma, péniszkarcinóma, hererák, nyelõcsõrák, epeve-
1
HU 004 118 T2
zeték-rendszer rákja, és fej- és nyakrák alkotta csoportból választott. 24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a rák mezotelióma, hererák vagy hasnyálmirigyrák. 25. Készlet alanyban rák kezelésére vagy megelõzésére, amely készlet tartalmazza az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítményt adott
5
18
2
esetben reagensekkel és/vagy alkalmazási instrukciókkal. 26. A 25. igénypont szerinti készlet, amely tartalmaz továbbá további rákellenes vegyületet tartalmazó különálló gyógyászati dózisformát is, amely rákellenes vegyület a gyógyszerek, antiepidermiális növekedési faktor receptor antitestek, radioimmunoterápiás vegyületek és ezek kombinációi alkotta csoportból választott.
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
19
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
20
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
21
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
22
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
23
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
24
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
25
HU 004 118 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
