(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000006467T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 006 467

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12P 13/08

(21) Magyar ügyszám: E 06 767909 (22) A bejelentés napja: 2006. 06. 29. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060767909 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1896599 A1 2007. 01. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1896599 B1 2009. 08. 05.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 2005189106 2005. 06. 29. 2006119334 2006. 04. 24.

(73) Jogosult: Ajinomoto Co., Inc., Tokyo 104-8315 (JP)

JP JP

(72) Feltalálók: JOE, Yuji, AJINOMOTO CO., INC., Kawasaki-shi, Kanagawa, 210-8681 (JP); KOYAMA, Naoto, AJINOMOTO CO., INC., Kawasaki-shi, Kanagawa, 210-8681 (JP); KATO, Naoto, AJINOMOTO CO., INC., Kawasaki-shi, Kanagawa, 210-8681 (JP); TSUJI, Yuichiro, AJINOMOTO CO., INC., Kawasaki-shi, Kanagawa, 210-8681 (JP) (54)

(2006.01) A23K 1/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07001097 PCT/JP 06/313450

(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Eljárás L-treonin termelésére

(57) Kivonat

HU 006 467 T2

A találmány tárgya L¹treonin termelésére szolgáló eljárás Escherichia nembe tartozó mikroorganizmus szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó tápkö-

zegben való tenyésztésével, miközben a tápközeg kénkoncentrációja 0,35 g/l vagy alacsonyabb értéken marad.

A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 006 467 T2

A találmány mûszaki területe A jelen találmány a fermentációs iparban alkalmazható technológiával kapcsolatos. Közelebbrõl a találmány az L¹treoninnak egy Escherichia baktériumot alkalmazó fermentációval való hatékony termelésével kapcsolatos. Az L¹treonin az esszenciális aminosavak egyike, és orvosi célra szolgáló táplálékkeverékek alkotórészeként használatos. Emellett változatos módokon kerül felhasználásra állati takarmányok kiegészítõjeként, valamint reagensként a gyógyszer- és kémiai iparban. A találmány mûszaki háttere Az iparban az L¹aminosavakat, így az L¹treonint és az L¹izoleucint fermentációval állítják elõ aminosavtermelõ baktériumok, így korineform baktériumok vagy Escherichia baktériumok segítségével, melyek képesek ezen L¹aminosavak termelésére. Aminosavtermelõ baktériumként a természetbõl izolált baktériumtörzsek, vagy ezen baktériumtörzsek mesterséges mutánsai használatosak. Rekombináns baktériumtörzsek, melyekben az L¹aminosavak bioszintézisenzimjei génrekombináció után fokozottan termelõdnek, szintén használatban vannak a termelékenység javítására. Közelebbrõl az L¹treonint termelõ Escherichia baktériumoknak ismertek mutáns törzsei, így egy 6¹dimetilamino-purinra rezisztens törzs [5–304969 sz. japán szabadalmi közzétételi irat (Kokai)], és egy borrelidinrezisztens törzs (nemzetközi szabadalmi közzétételi irat WO98/04715). Ismeretesek eljárások rekombináns Escherichia baktériumok felhasználására L¹treonin termelése céljából, jelesül egy olyan törzs használata, melyben a treonin-operont egy plazmid segítségével amplifikálták (US 5 175 107 sz. amerikai szabadalmi leírás); vagy amelyben a foszfoenol-piruvát-karboxiláz génjét és az aszpartáz génjét egy plazmiddal amplifikálták (2002/0110876 sz. amerikai szabadalmi bejelentés). Az Escherichia coliban a L¹treonin bioszintézisében részt vevõ enzimeket kódoló génekként ismertek az aszpartokináz III génje (lysC), az aszpartát-szemialdehid-dehidrogenáz génje (asd), az aszpartokináz L¹homoszerin-dehidrogenáz génje (thrA), a homoszerin-kináz génje (thrB) és a treonin-szintetáz génje (thrC), és mások. A thrA, thrB és thrC (thrABC) alkotják a treoninoperont. A treonin-operon egy attenuátorstrukturát alkot, ennek expresszióját a tápfolyadékban lévõ izoleucin és treonin gátolja. Ismeretes, hogy a fermentáció hozama javítható, ha ezen attenuátorrégió vezérszekvenciáját vagy az attenuátort eltávolítjuk a treonin-operonból (US5 538 873. sz. amerikai szabadalmi leírás, Biotechnology Letters 24. kötet 21. szám, 2002. november, és a WO05/049808 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat). Az L¹treonin termelésére eddig kifejlesztett eljárások között vannak szakaszos (batch) tenyésztési eljárások, melyek esetében a fermentor kezdettõl tartalmazza valamennyi tápanyagot; rátöltéses (fed-batch) tenyészetek, melyek esetében a fermentor kezdetben meghatározott tápanyagokat tartalmaz, utána folyamatosan kap egy vagy többféle további tápanyagot

2

(US5 538 873 sz. amerikai szabadalmi leírás, 593 792 sz. európai szabadalmi leírás); valamint egy, a szacharidkoncentráció szabályozásán alapuló eljárás, melynek esetében az egy meghatározott szinten vagy 5 az alatt marad (WO05/014840 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat és WO05/014843 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat). Ezek mellett egy másik, az L¹treonin termelésére kifejlesztett eljárás az, mely szerint a tápközeghez úgy adnak tápanyagokat, hogy a 10 foszforsav és a szénforrások szolgálnak növekedéslimitáló faktorként (US5 763 230 sz. amerikai szabadalmi leírás). Az US 2005/0025878 A1 sz. amerikai szabadalmi bejelentés takarmánykiegészítõ, így aminosav- és vita15 mintartalmú fermentációs termék granulálására ismertet eljárást. A kén esszenciális faktor a baktériumok növekedéséhez, és rendszerint ammónium-szulfát formájában adagolják az L¹treonin fermentációjára szolgáló tápkö20 zegbe. Az L¹treonin fermentációval történõ elõállítására vonatkozóan azonban a kénkoncentráció szabályozása a fermentációs médiumban, és a kénkoncentráció csökkentésének hatása nem ismert. 25

30

35

40

45

50

55

60 2

A találmány ismertetése A jelen találmány tárgya L¹treonin hatékony termelésére szolgáló eljárás, L¹treonin termelésére képes Escherichia baktérium alkalmazásával. A jelen találmány feltalálói intenzív kutatásokat folytattak a fenti cél elérése érdekében. Ennek eredményeképpen azt találták, hogy a tápközeg kénkoncentrációja befolyásolhatja a fermentáció eredményét, és hogy az L¹treonin kitermelése a fermentáció alatt javulhat, ha a kén koncentrációja a fermentációs közegben egy elõre meghatározott értéken vagy az alatt marad, és ily módon alkották meg a jelen találmányt. A jelen találmány tárgya L¹treonin termelésére szolgáló eljárás, mely eljárás L¹treonin termelésére képes, az Escherichia nembe tartozó mikroorganizmus szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó tápközegben való tenyésztésébõl, az L¹treoninnak a tenyészetbõl való összegyûjtésébõl áll, miközben a tápközeg kénkoncentrációját oly módon szabályozzák, hogy az 0,35 g/l vagy alacsonyabb értéken marad. A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, amelyben a mikroorganizmus az Escherichia coli. A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, amelyben az L¹treonin bioszintézisének valamely enzimje módosításra kerül oly módon, hogy az enzim ne legyen alanya az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak. A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, melyben az L¹treonin bioszintézisenzimje az aszpartokináz, homoszerin-kináz, treonin-szintetáz valamelyike, vagy ezek kombinációja. A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, amelyben a kénforrás a szulfátok, tioszulfátok, szulfitok, a cisztein, a cisztin, a glutation valamelyike, vagy ezek kombinációja.

1

HU 006 467 T2

A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, amelyben a tenyésztési eljárás rátöltéses szakaszos tenyésztési eljárás, vagy folyamatos tenyésztési eljárás, amelyben a fermentorban lévõ tenyészetre rátöltött közeg tartalmazza a kénforrást. A jelen találmány tárgya továbbá a fentiekben leírt eljárás, amelyben az említett rátöltött közeg emellett szénforrást és növekedésserkentõ hatású tápanyagot is tartalmaz, és amelyben az említett rátöltött közeget a fermentorba folyamatosan vagy szakaszosan adják úgy, hogy a szénforrás koncentrációja a tápközegben 30 g/l¹en vagy az alatt marad a mikroorganizmus logaritmikus növekedési fázisának vége után. A jelen találmány tárgya továbbá fermentleven alapuló takarmánykiegészítõ elõállítására szolgáló eljárás, mely eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: A) az Escherichia nembe tartozó, L¹treonin termelésére képes mikroorganizmus tenyésztése szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó fermentációs közegben; B) a fermentáció folytatása oly módon, hogy a közegben a kénkoncentráció 0,35 g/l¹en vagy az alatt maradjon; C) a nyers fermentlé szárítása 10 tömeg% vagy kisebb víztartalomig. Az ábra rövid leírása Az 1. ábra a kezdetben a közegbe adott kén mennyisége és az L¹treonin hozamának összefüggését mutatja. Az elõnyös megvalósítási módok részletes leírása <1> A jelen találmány szerinti eljárás A jelen találmány tárgya L¹treonin termelésére szolgáló eljárás, mely eljárás L¹treonin termelésére képes, az Escherichia nembe tartozó mikroorganizmusnak szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó tápközegben való tenyésztésébõl áll, miközben a tápközeg kénkoncentrációját oly módon szabályozzák, hogy az egy elõre meghatározott értéken vagy az alatt marad. A jelen találmány vonatkozásában a kénkoncentráció alatt a kénforrás koncentrációja értendõ, a kénatomok koncentrációja értelmében. A jelen találmány szerinti tápközeg bármely tápközeg lehet, amennyiben folyékony tápközeg, amely szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmaz tápanyagként, és a tápközeg nem különösebben limitáló, kivéve, hogy úgy van beállítva, hogy a kénkoncentráció egy elõre meghatározott szinten vagy az alatt maradjon. A kénforrás bármilyen kéntartalmú forrás lehet. Elõnyösek a kénsav sói, így szulfátok, tioszulfátok és szulfitok, valamint kéntartalmú aminosavak, mint a cisztein, cisztin és glutation. Ezek közül az ammóniumszulfát különösen elõnyös. A sók nem különösebben korlátozottak, és ammóniumsók, kalciumsók, nátriumsók, káliumsók, magnéziumsók, mangánsók és vassók használhatók. Továbbá a tápközeg tartalmazhat csak egyféle, ill. két- vagy többféle ilyen vegyületet. Az „elõre meghatározott szint vagy az alatt” kifejezésnek meg-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

felelõ koncentráció 0,35 g/l vagy kevesebb, elõnyösen 0,25 g/l, különösen elõnyösen 0,10 g/l vagy kevesebb kén a fermentációs közegben. A jelen találmány egy jellegzetessége, hogy a fermentálóközeg kénkoncentrációja szabályozott. A jelen találmány eljárásához szakaszos tenyészet, rátöltéses szakaszos tenyészet, és/vagy folyamatos tenyészet alkalmazható, és a közegben a kénkoncentráció szabályozható egy elõre meghatározott szintig vagy az alá a kezdeti tápközegben, vagy korlátozható egy elõre meghatározott szintre vagy az alá a rátöltött közeg kénkoncentrációjának korlátozásával, vagy ezen technikák kombinált használatával. Ugyanazon kénforrás használható a kezdeti tápközegben és a rátöltött tápközegben, vagy a rátöltött tápközegben lévõ kénforrás különbözhet a kezdeti tápközegben használttól. A jelen találmány vonatkozásában a rátöltéses szakaszos tenyészet olyan tenyésztési eljárásra utal, amelyben tápközeget töltenek egy edénybe a tenyésztés alatt, folyamatosan vagy idõszakosan, és nem vonnak ki tápközeget az edénybõl a tenyésztés befejezése elõtt. A folyamatos tenyészet olyan eljárásra utal, amelyben tápközeget töltenek, egy edénybe a tenyésztés alatt, folyamatosan vagy idõszakosan, és ki is vonnak tápközeget az edénybõl (általában a rátöltött tápközeggel azonos mennyiségben). A „kezdeti tápközeg” kifejezés szakaszos tenyészetre alkalmazható, mielõtt a rátöltött tápközeg a tenyészetbe kerül a rátöltéses szakaszos vagy folyamatos tenyészet esetében, és a „rátöltött tápközeg” kifejezés olyan tápközeget jelöl, amelyet egy fermentorba töltenek, amikor rátöltéses szakaszos vagy folyamatos tenyésztést végeznek. A rátöltött tápközeg tartalmazhatja a mikroorganizmus növekedéséhez szükséges összes tápanyagot vagy csak egyeseket. A jelen találmány vonatkozásában a „fermentációs közeg” valamely fermentorban lévõ tápközeget jelenti, és az L¹treonint ezen fermentációs közegbõl gyûjtik le. Továbbá a jelen találmány vonatkozásában a „fermentor” kifejezés olyan edényt jelent, amelyben az L¹treonin fermentációja végbemegy, és amelynek alakja nem korlátozott. Fermentortartály vagy befõttesüveg-fermentor is használható. Továbbá a fermentor térfogata nem korlátozott, feltéve, hogy L¹treonint lehet benne termeltetni és legyûjteni. Bár a kén koncentrációját elõnyös a teljes tenyésztési eljárás alatt egy elõre meghatározott szinten vagy az alatt tartani, elegendõ lehet azt csak az eljárás egy adott szakaszában korlátozni. Például, ha a jelen találmány szerinti eljárás magában foglal egy olyan fázist, amikor a sejtek szaporodnak (növekedési fázis) és egy olyan fázist, amikor az L¹treonin termelõdik (L¹treonintermelési fázis), elegendõ a kén koncentrációját az elõre meghatározott szintre vagy az alá korlátozni az L¹treonin-termelési fázisban. A növekedési fázisban (a sejtproliferáció alatt) a kén az elõre meghatározott mennyiség felett is jelen lehet, vagy korlátozva lehet az elõre meghatározott szintre vagy az alá. Továbbá abban a szakaszban, amikor az L¹treonin termelõdik, a kéntartalom nem feltétlenül kell, hogy ezen szakasz teljes idõtartama alatt az elõbb említett tartományban le-

1

HU 006 467 T2

gyen, és a kéntartalom az elõbb említett szinten vagy a fölött lehet a szakasz korai részében, és a tenyésztési idõ elõrehaladásával lehet csökkenteni. Továbbá a ként lehet idõszakonként adagolni, ha elfogy. A „növekedési fázis” kifejezés a jelen találmány vonatkozásában egy 3 órán, elõnyösen 6 órán, még elõnyösebben 10 órán belüli idõtartamot jelöl a tenyésztés kezdetétõl számítva, mely idõszakban a szénforrás elsõdlegesen a sejtszaporodás céljaira kerül felhasználásra, azaz a sejtek logaritmikusan proliferálnak. Az „L¹treonin-termelési fázis” kifejezés a jelen találmány vonatkozásában a tenyésztés kezdetétõl számított elsõ 3 óra, elõnyösen 6 óra, még elõnyösebben 10 óra elteltével bekövetkezõ idõszakot jelöli, amikor a szénforrás elsõdlegesen az L¹treonin termelésére kerül felhasználásra. Elegendõ, ha a fermentációs közeg a kén minimális mennyiségét tartalmazza, ami a mikroorganizmus növekedéséhez szükséges; azonban a kén mennyisége idõlegesen elfogyhat. Az „elfogy” kifejezés azt jelenti, hogy a kén koncentrációja lecsökken a tenyésztés korábbi idõpontjaihoz képest, és akár „0” is lehet. Az „idõlegesen” kifejezés azt jelenti, hogy például a kén a teljes fermentációs periódus mintegy 20%¹a, mintegy 40%¹a, vagy legfeljebb mintegy 60%¹a alatt fogyhat el. Azon idõtartam alatt, amikor a kén elfogy, bár a koncentráció lehet idõlegesen 0, elõnyös, ha a kén jelen van a fermentációs közegben 1 mg/l vagy magasabb koncentrációban, 10 mg/l vagy magasabb koncentrációban, vagy 100 mg/l vagy magasabb koncentrációban. Ily módon, még ha a kén koncentrációja idõlegesen 0 is lesz, a bármely idõszakban ként tartalmazó tápközegben történõ tenyésztés megfelel az „Escherichia nembe tartozó mikroorganizmus szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó tápközegben való tenyésztésébõl” kifejezésnek. A kén koncentrációját a tápközegben ionkromatográfiás eljárással és a forró palackos eljárással lehet mérni. Továbbá a jelen találmány szerint a tápközeg kénkoncentrációja szabályozható úgy, hogy egy elõre meghatározott értéken vagy az alatt maradjon, amikor rátöltéses szakaszos tenyésztést lehet alkalmazni. Például, ha a kénkoncentrációt rátöltéses szakaszos tenyésztés alkalmazásánál korlátozzuk, elõnyös a kénkoncentrációt a tápközegben 0,35 g/l¹en vagy az alatt, még elõnyösebb 0,25 g/l¹en vagy az alatt, még elõnyösebb 0,10 g/l¹en vagy az alatt tartani. A jelen találmányban alkalmazott szénforrások például a szénhidrátok, így a glukóz, glicerin, fruktóz, szukróz, maltóz, mannóz, galaktóz, keményítõhidrolizátum, és a melaszok. A glukóz és a szukróz különösen elõnyösek. Emellett szerves savak, így az ecetsav és a citromsav, alkoholok, így az etanol használhatók önmagukban vagy más szénforrással kombinálva. Továbbá a szénforrás nyersanyaga lehetnek cukornádmelasz, cukorrépamelasz, magas cukortartalmú, részlegesen invertált nehéz cukornádmelasz (high test), citrusmelasz, valamint természetes nyersanyagok, így cellulóz, keményítõ, kukorica, gabonafélék és tápióka hidrolizátumai. Továbbá a tápközegben oldott szén-dioxid is alkalmazható szénforrásként. Ezen szénforrá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

sokat a kezdeti tápközegben, és/vagy a rátöltött tápközegben lehet alkalmazni. A tápközeg ezen szénforrásokból egyet vagy többet is tartalmazhat. Továbbá lehet ugyanazon szénforrást alkalmazni a kezdeti tápközegben és a rátöltött tápközegben, vagy a rátöltött tápközeg szénforrása különbözhet a kezdeti tápközegétõl. Például lehet glukózt alkalmazni a kezdeti tápközegben, és szukrózt a rátöltött tápközegben. A jelen találmányban alkalmazott nitrogénforrások például az ammónia, ammóniumsók, így az ammónium-szulfát, ammónium-karbonát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát, ammónium-acetát, valamint a karbamid, nitrátok és így tovább. A pH beállítására alkalmazott ammóniagáz és vizes ammónia szintén alkalmazhatók nitrogénforrásként. Emellett pepton, élesztõkivonat, húskivonat, malátakivonat, kukoricacsíra-likõr, szójahidrolizátum és így tovább, szintén alkalmazhatók. Ezen nitrogénforrásokat a kezdeti tápközegben, és/vagy a rátöltött tápközegben lehet alkalmazni. A tápközeg ezen nitrogénforrásokból egyet vagy többet is tartalmazhat. Továbbá lehet ugyanazon nitrogénforrást alkalmazni a kezdeti tápközegben és a rátöltött tápközegben, vagy a rátöltött tápközeg nitrogénforrása különbözhet a kezdeti tápközegétõl. Továbbá a jelen találmány szerinti tápközeg elõnyösen foszforsavforrást is tartalmaz a szénforrás, nitrogénforrás és a kén mellett. Foszforsavforrásként kálium-dihidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, és foszfátpolimerek, így pirofoszforsav alkalmazhatók. Továbbá a jelen találmány szerinti tápközeg tartalmazhat növekedésserkentõ faktort (növekedést serkentõ hatást mutató tápanyagot) a szénforrás, nitrogénforrás és a kén mellett. Alkalmazható növekedésserkentõ faktorok például a nyomelemek, aminosavak, vitaminok, zsírsavak, nukleinsavak, valamint a pepton, a kazein hidrolizálásával nyert kazaminosavak, az élesztõkivonat, a szójafehérje-hidrolizátum. Nyomelemek például a vas, mangán, magnézium, kalcium, kálium, nátrium és így tovább. A vitaminokra példa a B1¹vitamin, B2¹vitamin, B6¹vitamin, a nikotinsav, a nikotinsavamid, a B12-vitamin és így tovább. Ezen növekedésserkentõ faktorokat a kezdeti tápközegben vagy a rátöltött tápközegben lehet alkalmazni. Továbbá ha egy auxotróf mutáns kerül alkalmazásra, amely valamely aminosavat vagy hasonló anyagot igényel a növekedéshez, elõnyös a szükséges tápanyagot a tápközegbe adni. Különösen, minthogy az L¹treonin bioszintézis-útvonalát gyakran stimulálják, az L¹treonin-lebontó képességet pedig az alább leírtak szerint gátolják az L¹treonin-termelõ baktériumokban, melyek a jelen találmány szerint alkalmazhatók, L¹lizint, L¹homoszerint, L¹izoleucint, L¹metionint vagy ezek kombinációját elõnyös a tápközeghez hozzáadni. A kezdeti tápközeg és a rátöltött tápközeg összetétele azonos vagy különbözõ lehet. Továbbá a kezdeti tápközeg és a rátöltött tápközeg kénkoncentrációja lehet azonos vagy különbözõ. Továbbá amikor a rátöltött tápközeget több szakaszban adagolják, a rátöltött tápközeg összetétele minden egyes fázisban lehet azonos vagy különbözõ.

1

HU 006 467 T2

A tenyésztést elõnyösen levegõztetve végzik, elõnyösen 20 és 45 °C közötti fermentációs hõmérsékleten, különösen elõnyösen 33 és 42 °C között. Az oxigénkoncentrációt elõnyös 5 és 50% közé állítani, még elõnyösebb 10% köré. Továbbá a levegõztetést 5 és 9 közé állított pH mellett elõnyös végezni. Ha a pH a tenyésztés alatt csökken, például kalcium-karbonát vagy valamely lúg, így ammóniagáz vagy vizes ammónia adható a tenyészet semlegesítése céljából. Ha a tenyésztést ilyen körülmények közt végzik, elõnyösen kb. 10 és 120 óra idõtartam között, az L¹treonin jelentõs mennyisége halmozódik fel a tápközegben. A felhalmozódott L¹treonin mennyisége nem korlátozott mindaddig, amíg az L¹treonint a közegbõl izolálni lehet és ki lehet gyûjteni, és 50 g/l vagy magasabb, elõnyösen 75 g/l vagy magasabb, még elõnyösebben 100 g/l vagy magasabb. A jelen találmány szerint a mikroorganizmus tenyésztését beoltótenyészetben (inokulum) és/vagy üzemi tenyészetben lehet végezni az L¹treonin adott szintet meghaladó felhalmozódásának céljából. A beoltótenyészetet rázógépen, flaska vagy hasonló alkalmazásával, vagy szakaszos tenyészetben lehet elõállítani. Az üzemi tenyészetet rátöltéses szakaszos tenyészetként vagy folyamatos tenyészetként lehet elõállítani. Más módon mind a beoltótenyészetet, mind az üzemi tenyészetet szakaszos tenyészetként lehet elõállítani. Ezen tenyésztési eljárásokban, amikor az L¹treonin koncentrációja elér egy elõre meghatározott szintet, a fermentlé egy részét ki lehet vonni, és friss tápközeget lehet adni a tenyésztés megismétlése céljából. Friss tápközegként valamely szénforrást és növekedésserkentõ faktort tartalmazó tápközeg az elõnyös, mely ként elõnyösen egy meghatározott koncentrációban vagy az alatt tartalmaz. Az „elõre meghatározott szint vagy az alatt” kifejezésnek megfelelõ koncentráció 0,35 g/l vagy kevesebb, elõnyösen 0,25 g/l, különösen elõnyösen 0,10 g/l vagy kevesebb kén a fermentációs közegben. Szénforrásként glukóz, szukróz és fruktóz az elõnyös. Növekedésserkentõ faktorként nitrogénforrások, foszforsav, aminosavak és így tovább az elõnyösek. Nitrogénforrásként ammóniát, ammóniumsókat, így ammónium-szulfátot, ammónium-karbonátot, ammónium-kloridot, ammónium-foszfátot, ammóniumacetátot, valamint a karbamidot, nitrátokat és így tovább lehet alkalmazni. Foszforsavforrásként kálium-dihidrogén-foszfátot és dikálium-hidrogén-foszfátot lehet alkalmazni. Ami az aminosavakat illeti, amikor auxotróf mutáns törzsek kerülnek alkalmazásra, a tenyészetet a szükséges aminosavakkal elõnyös ellátni. Amikor a jelen találmány szerint szakaszos rátöltéses vagy folyamatos tenyésztés történik, a tápfolyadék rátöltését idõközönként meg lehet szakítani úgy, hogy a szacharidok vagy tápanyagok ellátása idõlegesen felfüggesztésre kerüljön. A tápközeg hozzáadását a rátöltési idõ legfeljebb 30%-ára, elõnyösen 20%-ára, még elõnyösebben 10%-ára lehet felfüggeszteni. A „rátöltési idõ” a rátöltött tápközeg hozzáadásának kezdetétõl a rátöltött tápközeg hozzáadásának végéig eltelt idõtartamot jelenti. A rátöltött tápközeg hozzáadásának

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

felfüggesztése 30%-nál kisebb idõtartamú lehet, legelõnyösebben 10%-nál kisebb idõtartam. Amikor a rátöltött tápközeget szakaszosan adagolják, a rátöltött tápközeget kezdetben egy elõre meghatározott idõtartam alatt lehet adni, és a második és további hozzáadásokat lehet úgy vezérelni, hogy akkor kezdõdjenek, amikor a számítógép a pH növekedését vagy az oldott oxigén koncentrációjának növekedését érzékeli. Ilyen jel jellemzõen a tápközegben lévõ szénforrás kimerülése alkalmával fordul elõ egy rátöltési/felfüggesztési szakaszban, egy bizonyos rátöltési szakasz elõtt, így a fermentorban a szubsztrátkoncentráció automatikusan és következetesen egy alacsony szinten tartható (US5 912 113 sz. amerikai szabadalmi leírás). A rátöltéses szakaszos tenyészetben alkalmazott tápközeg elõnyösen valamely szénforrást és növekedésserkentõ faktort tartalmaz, és ként is tartalmazhat oly módon, hogy a kén koncentrációja a fermentációs közegben egy meghatározott szinten vagy az alatt maradjon. Az „elõre meghatározott szint vagy az alatt” kifejezésnek megfelelõ koncentráció 0,35 g/l vagy kevesebb, elõnyösen 0,25 g/l, különösen elõnyösen 0,10 g/l vagy kevesebb kén a fermentációs közegben. Bár a rátöltött közeg kénkoncentrációja az imént említett koncentrációtartományon belül vagy azon kívül is lehet, elõnyösen az imént említett koncentrációtartományon belül marad. Szénforrásként a glükóz, szukróz, és a fruktóz az elõnyös. Növekedésserkentõ faktorként a nitrogénforrások, a foszforsav, aminosavak és így tovább az elõnyösek. Nitrogénforrásként ammóniát, ammóniumsókat, így ammónium-szulfátot, ammónium-karbonátot, ammónium-kloridot, ammónium-foszfátot, ammóniumacetátot, valamint a karbamidot, nitrátokat és így tovább lehet alkalmazni. Továbbá foszforsavforrásként kálium-dihidrogén-foszfátot és dikálium-hidrogén-foszfátot lehet alkalmazni. Ami az aminosavakat illeti, amikor auxotróf mutáns törzseket alkalmaznak, a tenyészetet a szükséges aminosavakkal elõnyös ellátni. Továbbá a rátöltött közeg lehet egy típusú, ill. két vagy több típusú közeg keveréke. Amikor két vagy több típusú rátöltött közeget használnak, a közegeket egyetlen rátöltõedény alkalmazásával, ill. két vagy több rátöltõedény alkalmazásával lehet összekeverni. Továbbá, amikor rátöltéses szakaszos tenyésztés folyik, a rátöltés elõnyösen úgy történik, hogy a szacharidkoncentráció ne haladja meg a 30 g/l¹t, elõnyösen 20 g/l¹t, még elõnyösebben 10 g/l¹t a teljes rátöltéses szakaszos tenyésztõközegben vagy fermentációs közegben. Különösen a mikroorganizmus logaritmikus növekedésének befejeztével elõnyös a szacharidkoncentrációt az imént említett koncentrációtartományban tartani. A szénforrás rátöltési ütemét az US5 912 113 sz. amerikai szabadalmi leírásban közzétett eljárás szerint lehet vezérelni. Továbbá a szacharidot és a foszforsavat elõnyösen oly módon töltik rá, hogy a koncentrációk alapján a szacharid és a foszforsav lesznek a bakteriális sejtnövekedés limitálófaktorai. A foszforsav oly módon van jelen a rátöltött közegben, hogy a foszfor/szén arány 2 vagy alacsonyabb, elõnyö-

1

HU 006 467 T2

sen 1,5 vagy kisebb, még elõnyösebben 1 vagy kisebb (US5 763 230 sz. amerikai szabadalmi leírás). Amikor a folyamatos tenyésztési módszert alkalmazzák a jelen szabadalom szerint, a közeget lehet azonos idõben kivonni és rátölteni, vagy a közeg egy részét ki lehet vonni, majd a közeget rátölteni. Továbbá az eljárás lehet olyan folyamatos tenyésztés, melynek során az L¹treonin-tartalmú tenyészközeget és a baktériumsejteket kivonják, és csak a sejteket adják vissza a fermentorba (2669935 sz. francia szabadalom). A tápanyagforrás folyamatos vagy szakaszos rátöltéséhez az eljárás ugyanaz, mint a rátöltéses szakaszos tenyésztésnél. Amikor a tenyészközeg szakaszosan kerül kivonásra, az L¹treonin egy részét legyûjtik, amikor az L¹treonin koncentrációja elér egy elõre meghatározott szintet, és friss közeget töltenek rá a tenyésztés folytatásához. Továbbá ami a rátöltendõ friss közeg mennyiségét illeti, a teljes közeg mennyisége a tenyészetben a friss közeg rátöltése után egyenlõ lesz a kivonás elõtti tápközegmennyiséggel. Az „egyenlõ” kifejezés, ahogyan itt használjuk, a kivonás elõtti közegmennyiség kb. 93–107%¹át jelenti. Amikor a tenyészközeg folyamatosan kerül kivonásra, a kivonás elõnyösen azonos idõben vagy késõbb kezdõdik, mint a tápközeg rátöltése. Például a kezdeti idõpont legfeljebb 5 óra, elõnyösen 3 óra, még elõnyösebben 1 óra, a rátöltés megkezdésétõl számítva. Továbbá a tápközeg kivonásának mennyisége elõnyösen egyenlõ a rátöltött közeg mennyiségével. A baktériumsejtek újraalkalmazásának folyamatos tenyésztéses eljárása során a fermentációs közeg szakaszosan vagy folyamatosan kivonásra kerül, amikor az aminosav-koncentráció egy elõre meghatározott szintet elér, csak az L¹treonin kerül kivonásra, és a baktériumsejteket tartalmazó szûrési maradék a fermentorba visszatöltésre kerül, és például a 2 669 935 sz. francia szabadalmi leírás szerint hajtható végre. Az L¹treonin és más aminosavak analízise anioncserés kromatográfiával és ninhidrines elõhívással hajtható végre, amint azt Spackman és mtsi. leírják [Analytical Chemistry 30:1190–1206 (1958)], vagy fordított fázisú HPLC-vel, amint azt Lindroth és mtsi. leírják (Analytical Chemistry 51:1167–1174). <2> Eljárás állati takarmánykiegészítõ elõállítására a jelen szabadalom szerinti fermentlé alapján A jelen szabadalom szerinti fermentlé alapján állati takarmánykiegészítõt lehet elõállítani a következõ elválasztási eljárással. A biomassza csökkentése vagy eltávolítása céljából L¹treonin-elválasztó eljárásokat, így centrifugálást, szûrést, leöntést, flokkulációt vagy ezek kombinációját lehet alkalmazni. A jelen találmánnyal nyert fermentlevet sûríteni vagy koncentrálni lehet ismert módszerek, így forgóbepárló, vékonyréteg-bepárló, reverz ozmózis vagy nanofiltrálás alkalmazásával (FR8613346B, US4 997 754, EP410005B, JP1073646B).

2

A koncentrált fermentlevet azután fagyasztva szárításos, permetezve szárításos, permetezve granulálásos vagy bármely más eljárással lehet tovább feldolgozni állati takarmányhoz alkalmas, elõnyösen tapa5 dásmentes, finom por elõállítása céljából. Ezen tapadásmentes, finom por átalakítható durván granulált, nagyon tapadásmentes, stabil és nagyrészt pormentes termékké, megfelelõ tömörítési vagy granulálási eljárások alkalmazásával. Mindösszesen a víz 90%¹a kerül 10 eltávolításra e módon, úgyhogy a takarmánykiegészítõ víztartalma 10% alatt van, elõnyösen 5 tömeg% alatt. A takarmánykiegészítõ fehérjetartalma 10%-nál kisebb lehet, elõnyösen 5 tömeg% alatt, és az L¹treonin koncentrációja 50% felett, elõnyösen 85% felett, még 15 elõnyösebben 95% felett (US5 431 933, JP1214636B, US4 956 471, US4 777 051, US4 946 654, US5 840 358, US6 238 714, US2005/0025878). A fent leírt elválasztási lépés nem feltétlenül hajtandó végre, de technikailag célszerûen kombinálható. 20 <3> A jelen találmány szerint alkalmazható Escherichia baktériumok A jelen találmány szerint alkalmazható Escherichia baktériumok L¹treonin termelésére képes Escherichia 25 baktériumok, és az „L¹treonin termelésére képes” kifejezés a jelen találmány vonatkozásában azon képességet jelenti, hogy a baktérium valamely közegben való tenyésztésekor a közegbe, azaz a sejten kívülre, szabad L¹treonint képes termelni oly mértékben, hogy az 30 L¹treonin a közegbõl legyûjthetõ. Elõnyösen a jelen találmány szerint alkalmazott Escherichia baktérium olyan törzs, melyet oly módon tenyésztettek ki, hogy a törzs a vad típusú törzsekkel vagy a szülõi törzsekkel összehasonlítva több L¹treonint tud termelni. Közelebb35 rõl elõnyös, ha az Escherichia baktérium 30 g/l vagy több L¹treonint termel, elõnyösebben 50 g/l¹t vagy többet, különösen elõnyösen 75 g/l¹t vagy többet, valamely szokásos tenyésztési eljárás alkalmazása esetén, amelyben a kénkoncentráció nincs szabályozva. A jelen találmány szerint alkalmazott Escherichia 40 baktériumok létrehozásához alkalmazható szülõi Escherichia-törzsek nem különösebben korlátozottak, és a konkrét példák közé tartozik a Neidhardt és mtsai. munkájában említettek (Neidhardt, RC. és mások: Escheri45 chia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1029, 1. táblázat). Ezek közül például az Escherichia coli alkalmazása elõnyös. Az Escherichia coli konkrét példái között szerepel az Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) és 50 az Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), melyek a vad K12 prototípustörzsbõl származnak, és így tovább. Ami az ilyen törzsek beszerezhetõségét illeti, ezek elérhetõk például az American Type Culture Collectionból (cím: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, Ameri55 kai Egyesült Államok). Minden egyes baktériumtörzs egy nyilvántartási számot kap, és minden egyes törzset ezen nyilvántartási szám alkalmazásával lehet megrendelni. A baktériumtörzseknek megfeleltetett nyilvántartási számokat az American Type Culture Collection 60 katalógusa tartalmazza. 6

1

HU 006 467 T2

<3–1> Az L¹treonin-termelõ képesség átvitele Innentõl kezdve leírásra kerül az L¹treonin-termelõ képesség átvitele egy Escherichia baktériumba. Az L¹treonin-termelõ képesség átviteléhez az Escherichia baktériumok vagy korineform baktériumok nemesítéséhez hagyományosan alkalmazott eljárások alkalmazhatók, így valamely auxotróf mutáns, analógrezisztens törzs, vagy metabolizmuskontrollált törzs elõállítása, melyek mindegyike L¹treonin-termelõ képességgel rendelkezik, valamint egy rekombináns törzs elõállítása, melyben az L¹treonin-bioszintézis valamely enzimje fokozottan termelõdik. Például egy mutáns vagy rekombináns törzset módosítani lehet úgy, hogy az L¹treonin bioszintézisének valamely enzimje többé ne legyen alanya a visszacsatolásos gátlásnak, vagy egy rekombináns törzset módosítani lehet úgy, hogy az L¹treonin bioszintézisének valamely enzimje fokozottan termelõdjék. Az L¹treonint termelõ baktériumok nemesítésének folyamán ezen eljárásokkal bizonyos tulajdonságokat, így auxotrófiát, analógrezisztenciát, vagy valamely metabolikus kontrollmutációt lehet bevinni önmagában vagy kombinációban. Amikor az L¹treonin bioszintézisének valamely enzimje fokozottan termelõdik, ezen enzim aktivitása fokozódik. Továbbá, a fent említett tulajdonságok bevitele és a fent említett enzimaktivitás növelése kombináltan is megvalósításra kerülhet. Az L¹treonin-termelõ képességnek egy Escherichia baktériumba történõ bevitelére, vagy az L¹treonin bioszintézisében részt vevõ valamely enzim aktivitásának megnövelésével az L¹treonin-termelõ képesség növelése szolgáló eljárásra egy példát az alábbiakban magyarázunk el. Valamely enzim aktivitása megnövekedhet egy mutációnak az enzimet kódoló génbe történõ bevezetésével, vagy a gén amplifikálásával úgy, hogy az enzim intracelluláris aktivitása nõ. Ezek gén rekombinációs technikák segítségével érhetõk el. Az L¹treonin bioszintézisének enzimjeit kódoló génekre példa az aszpartokináz III gén (lysC), az aszpartát-szemialdehid-dehidrogenáz-gén (asd), a thr operonban található aszpartokináz I gén (thrA, az 1. szekvencialista 337–2799. nukleotidjai), a homoszerin-kináz-gén (thrB, az 1. szekvencialista 2801–3733. nukleotidjai), és a threonin-szintetáz-gén (thrC, az 1. szekvencialista 3734–5020 nukleotidjai). Zárójelben a gének rövidített nevét tüntettük fel. Ezen génekbõl egyet vagy többet is be lehet vinni egy baktériumba. L¹treonin bioszintézisgéneket lehet bevinni egy Escherichia baktériumba, amelyikben a treoninlebontás el van nyomva. Az Escherichia baktériumokra, melyekben a treoninlebontás el van nyomva, példa a TDH6-törzs, amelyik deficiens a treonin-dehidrogenáz aktivitásra (EP1149911A), és így tovább. Az L¹treonin bioszintézisenzimjeinek enzimaktivitását az L¹treonin, mint végtermék, gátolja. Ennek okáért egy L¹treonin-termelõ baktérium elõállításához elõnyös úgy módosítani az L¹treonin bioszintézisrendszerének génjeit, hogy a kódolt enzimek ne legyenek alanyai az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak. Az imént említett thrA, thrB és thrC gének alkotják a treo-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

nin-operont, és a treonin-operonban van egy attenuátorstruktúra. A theronin-operon expresszióját a tápfolyadékban jelen lévõ izoleucin és treonin gátolja, és attenuálás útján elnyomja. Az imént említett módosítást el lehet érni az attenuátorrégió (6. szekvencialista) vezérszekvenciájának eltávolításával, vagy az attenuátor eltávolításával (1. szekvencialista) (WO02/26993 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés; Biotechnology Letters, 24. kötet, 21. szám, 2002 November; WO05/049808, WO98/04715, WO03/097839 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentések). Különösen elõnyös úgy módosítani a treonin-operont, hogy az 1. szekvencialistából a 188–310. nukleotidok kerüljenek eltávolításra. Emellett szintén elõnyös a treonin-operon módosítása oly módon, hogy az 1. szekvencialistából a 148–310. nukleotidok kerüljenek eltávolításra. A treonin-operon upstream régiójában található egy natív promoter, és ezt ki lehet cserélni egy nem natív promoterre (lásd a WO98/04715¹öt). Emellett a treonin-operont úgy is fel lehet építeni, hogy a treonin bioszintézisében részt vevõ gének expresszióját a lambda-fág represszora és promotere szabályozza (lásd a 0593792. sz. európai szabadalmi bejelentést). Továbbá úgy is elõ lehet állítani egy Escherichia baktériumot, mely nem alanya az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak, hogy a¹amino-b-hidroxi-valeriánsavra (AHV) rezisztens törzset szelektálunk (lásd a WO03/097839¹et). Továbbá az olyan treonin-operon, mely módosításra került oly módon, hogy az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak nem alanya, elõnyösen több példányban is jelen lehet. Emellett az operon lehet egy erõs promoterhez kötve úgy, hogy az expressziója nõjön. Az L¹treonin-operon kópiaszámát meg lehet növelni plazmidban történõ amplifikálással és/vagy kromoszómába való átvitelével transzpozon, Mu¹fág és hasonlók alkalmazásával (US5 175 107 sz. amerikai szabadalmi leírás). Továbbá elõnyös olyan aszpartokináz III gén (lysC) alkalmazása, amelyik módosításra került oly módon, hogy az L¹lizin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak nem alanya. Ilyen lysC gént az 5 932 453 sz. amerikai szabadalmi leírásban ismertetett eljárással lehet nyerni. Az L¹treonin bioszintézisének enzimjei mellett szintén elõnyös a glikolitikus anyagcsereút, a trikarbonsavciklus, vagy a légzési lánc, egy gén expresszióját szabályozó gének, és a szacharidfelvétel génjei expressziójának növelése. Az L¹treonin-termelésre hatással bíró génekre példa a transz-hidrogenáz-gén (pntAB) (733712 sz. európai szabadalmi leírás), a foszfoenol-piruvát-karboxiláz-gén (pepC) (WO95/06114 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat, US2005–0136518), a foszfoenol-piruvát-szintetáz-gén (pps) (877090 sz. európai szabadalmi leírás), a korineform vagy Bacillus baktériumok piruvát-karboxiláz-génje (WO99/18228 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat; 1092776 sz. európai szabadalmi leírás). Továbbá elõnyös valamely olyan gén expressziójának növelése, mely valamely gazdaszervezetbe L¹treonin-rezisztenciát, vagy L¹homoszerin-rezisztenciát visz

1

HU 006 467 T2

át, vagy kombinációban mindkettõt. Rezisztenciahordozó génekre példa az rhtA gén [Res. Microbiol., 2003. március, 154(2): 123–35], az rhtB gén (0994190 sz. európai szabadalmi leírás), az rhtC gén (1013765 sz. európai szabadalmi leírás), az yfiK gén, és a yeaS gén (1016710 sz. európai szabadalmi leírás). Továbbá a 0994190 sz. európai szabadalmi leírás és a WO90/04636 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat írja le L¹treonin-rezisztencia átvitelét valamely gazdaszervezetbe. Az imént említett gének által kódolt enzimek aktivitását a gének expressziójának növelésével lehet fokozni, például a gének kópiaszámának növelésével a sejtekben, génrekombinációs technikák alkalmazásával. Például a célgént tartalmazó DNS-szakaszt valamely gazda-mikroorganizmusban mûködõ vektorhoz, elõnyösen többszörös kópiaszámú vektorhoz lehet ligálni, és a gazda-mikroorganizmust ezen vektor-DNS-sel lehet transzformálni. Amikor valamely Escherichia coli gén kerül alkalmazásra célgénként, a kinyeréséhez a primereket a GenBankban nyilvántartott MG1655 vagy W3110 Escherichia coli ismert génszekvenciái alapján lehet elõállítani, majd polimerázreakciót (PCR) lehet végezni az Escherichia coli kromoszomális DNS-ével, mint templáttal [ld. White, T. J. és mtsai., Trends Genet. 5, 185 (1989)]. Más mikroorganizmusok célgénjeit szintén a mikroorganizmusok kromoszomális DNS-ébõl vagy kromoszomális DNS-könyvtáraiból lehet kinyerni PCRrel, a GenBankból nyert szekvenciainformáció vagy a mikroorganizmus ismert géninformációja alapján elõállított primerek alkalmazásával, vagy az imént említett szekvenciainformáció alapján elõállított oligonukleotid, mint próba alkalmazásával, hibridizálással. Kromoszomális DNS¹t egy donor mikroorganizmusból példának okáért Saito and Miura eljárásával lehet elõállítani [ld. H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963); Text for Bioengineering Experiments, Szerk.: Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97–98, Baifukan, 1992] és így tovább. Továbbá, minthogy egy adott célenzimet kódoló gének nukleotidszekvenciái változhatnak az Escherichia baktérium fajától vagy a baktériumtörzstõl függõen, a jelen találmány megvalósításához alkalmazott célgén nem korlátozódik ismert génekre vagy a GenBankban nyilvántartott génszekvenciákra, és lehet mutáns vagy mesterségesen módosított gén is. Egy ilyen mutáns vagy módosított gén kódolhat olyan fehérjét, melynek szekvenciája egy vagy több aminosavmaradékra nézve helyettesítéseket, kihagyásokat, beillesztéseket, hozzátoldásokat és hasonlókat tartalmaz egy vagy több pozícióban mindaddig, míg a kódolt célfehérje mûködése, vagyis az L¹treonin-termelõ kapacitása a gén amplifikációjával növelhetõ. A „több” kifejezés jelen alkalmazásával jelölt szám függ az aminosavmaradékoknak a fehérje háromdimenziós szerkezetében elfoglalt pozícióitól, és az aminosavmaradékok típusaitól. Mindazonáltal ez a szám elõnyösen 1 és 20, még elõnyösebben 1 és 10, legelõnyösebben 1 és 5 között van.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

Az imént említett helyettesítés elõnyösen valamely konzervatív helyettesítés, azaz egy semleges mutáció, mely nem okoz mûködésbeli változást. A konzervatív mutáció olyan mutáció, melyben a helyettesítés a Phe, Trp és Tyr között megy végbe, amikor a helyettesített pozíció valamely aromás aminosav, a Leu, Ile és Val között, amikor a helyettesített pozíció valamely hidrofób aminosav, a Gln és An között, amikor a helyettesített pozíció valamely poláros aminosav, a Lys, Arg és His között, amikor a helyettesített pozíció valamely lúgos aminosav, az Asp és Glu között, amikor a helyettesített pozíció valamely savas aminosav, és a Ser és Thr között, amikor a helyettesített pozíció valamely hidroxicsoportot tartalmazó aminosav. Közelebbrõl a konzervatív helyettesítés példái közé tartoznak az Ala helyettesítése Ser és Thr aminosavakkal, az Arg helyettesítése Gln, His és Lys aminosavakkal, az Asn helyettesítése Glu, Gln, Lys, His vagy Asp aminosavakkal, a Cys helyettesítése Ser vagy Ala aminosavakkal, a Gln helyettesítése Asn, Glu, Lys, His, Asp vagy Arg aminosavakkal, a Cys helyettesítése Ser vagy Ala aminosavakkal, a Gln helyettesítése Asn, Glu, Lys, His, Asp vagy Arg aminosavakkal, a Glu helyettesítése Gly, Asn, Gln, Lys vagy Asp aminosavakkal, a Gly helyettesítése Pro aminosavval, a His helyettesítése Asn, Lys, Gln, Arg vagy Tyr aminosavakkal, a Ile helyettesítése Leu, Met, Val vagyr Phe aminosavakkal, a Leu helyettesítése Ile, Met, Val vagy Phe aminosavakkal, a Lys helyettesítése Asn, Glu, Gln, His vagy Arg aminosavakkal, a Met helyettesítése Ile, Leu, Val vagy Phe aminosavakkal, a Phe helyettesítése Trp, Tyr, Met, Ile vagy Leu aminosavakkal, a Ser helyettesítése Thr vagy Ala aminosavakkal, a Thr helyettesítése Ser vagy Ala aminosavakkal, a Trp helyettesítése Phe vagy Tyr aminosavakkal, a Tyr helyettesítése His, Phe vagy Trp aminosavakkal, és a Val helyettesítése Met, Ile vagy Leu aminosavakkal. Továbbá alkalmazható valamely homológ gén mindaddig, amíg ugyanaz a funkciója, mint a célgénnek. Közelebbrõl a homológ génnek olyan fehérjét kell kódolnia, mely valamely ismert fehérjével 80%¹os vagy magasabb homológiát mutat, elõnyösen 90%-osat vagy magasabbat, még elõnyösebben 95%-osat vagy magasabbat, különösen elõnyösen 97%-osat vagy magasabbat. Továbbá minthogy valamely gén degenerációja változik a gazdaszervezettõl függõen, melybe a gén átvitelre került, olyan gént lehet alkalmazni, melynek kodonhelyettesítéseit a gazdaszervezet könnyen használja. Hasonlóképpen mindaddig, amíg a célgén L¹treonin-termelõ képességét a gén amplifikációjával növelni lehet, a gént ki lehet egészíteni vagy meg lehet rövidíteni akár az N¹terminális, akár a C¹terminális végén. A kiegészítés vagy rövidítés hossza például 50 vagy kevesebb, elõnyösen 20 vagy kevesebb, még elõnyösebben 10 vagy kevesebb, különösen elõnyösen 5 vagy kevesebb, az aminosavmaradékok számát illetõen. Közelebbrõl a fehérje aminosavsorrendje rövidebb lehet 5–50 aminosavval akár az N¹terminális, akár a C¹terminális végén. A célgénnel homológ gént lehet nyerni a nukleotidszekvencia módosításával, például célzott mutagenezissel úgy, hogy a kódolt fehérjében valamely pozíció-

1

HU 006 467 T2

ban aminosavhelyettesítések, ¹kihagyások, ¹beillesztések vagy ¹hozzátoldások legyenek. Továbbá egy ilyen gén ismert mutagén kezelésekkel is elõállítható, amint az alább leírásra kerül. Ilyen mutagén kezelési eljárásokra példa a célgén nukleotidszekvenciájának kezelése hidroxil-aminnal vagy hasonlóval, a gént hordozó mikroorganizmus, például valamely Escherichia baktérium kezelése UV¹besugárzással vagy valamely tipikus mutagén ágenssel, így N¹metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidinnel (NTG) vagy etil-metánszulfonáttal (EMS), valamint mutáció bevitele hibageneráló PCR-rel. Továbbá az imént említett aminosavhelyettesítések, ¹kihagyások, ¹beillesztések, ¹hozzátoldások és hasonlók közé tartoznak a természetben elõforduló mutációk (mutánsok vagy variánsok), így a célgént hordozó mikroorganizmus egyedi és/vagy faji különbségeken alapuló mutációi. Hogy az ilyen gének olyan fehérjéket kódolnak¹e, melyek L¹treonin-termelõ képessége javul, ha az expressziójuk szintje nõ, eldönthetõ például az ilyen géneknek az Escherichia coli vad típusú törzsébe vagy L¹treonin termelésének képességét mutató törzsébe való bevitellel, és annak vizsgálatával, hogy az L¹treonin-termelõ képesség javult¹e. A célgén lehet továbbá DNS, mely hibridizál valamely cél-nukleotidszekvenciával, vagy annak komplementer szekvenciájával, vagy ezen szekvenciákból szigorú körülmények között készített próba, mely olyan fehérjét kódol, mely fehérje expressziójának növelése javítja az Escherichia baktériumok L¹treonin-termelõ képességét. A „szigorú körülmények között” kifejezés olyan körülményeket jelöl, melyek között úgynevezett specifikus hibrid képzõdik, és nemspecifikus hibrid nem képzõdik. Nehéz dolog ezen körülményeket egyetlen mérõszám alkalmazásával világosan kifejezni. Mindazonáltal például a szigorú körülmények közé tartoznak azok, amelyek között magas homológiával rendelkezõ DNS¹ek, például 50% vagy magasabb, elõnyösebben 60% vagy magasabb, még elõnyösebben 70% vagy magasabb, még elõnyösebben 80% vagy magasabb, még elõnyösebben 90% vagy magasabb, még elõnyösebben 95% vagy magasabb, legelõnyösebben 97% vagy magasabb homológiával rendelkezõ DNS¹ek hibridizálnak egymással, de a fentieknél kisebb fokú homológiával rendelkezõ DNS¹ek nem hibridizálnak egymással. Emellett a szigorú körülményekre példa az egyszeri mosás, elõnyösen 2 vagy 3 mosás, a Southern-hibridizáció során alkalmazott mosás jellemzõ sókoncentrációján, azaz 1×SSC, 0,1% SDS, 60 °C, elõnyösen 0,1×SSC, 0,1% SDS, 68 °C. Ezután rekombináns DNS készül a PCR-rel amplifikált célgén ligálásával valamely vektor-DNS-hez, mely vektor képes a gazda-mikroorganizmus sejtjeiben mûködni. Az ilyen vektorok közé tartoznak a gazda-mikroorganizmus sejtjeiben autonóm módon szaporodni képes vektorok. Az Escherichia coli-sejtekben autonóm módon szaporodni képes vektorokra példa a pUC19, pUC1d, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (a pHSG és a pACYC a Takara Bio Inc. vállalattól szerezhetõ be), RSFlOlO, rBR322, pMW219 (az MW a Nippon Gene vállalattól szerezhetõ be), és így tovább.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

A fent leírtak szerint elõállított rekombináns DNS¹t valamely ismert transzformáló eljárással lehet egy mikroorganizmusba bevinni. A példák közé tartozik az eljárás, melynek során recipiens sejteket kezelnek kalcium-kloriddal a DNS permeabilitásának növelésére, amit az Escherichia coli K–12¹re vonatkozóan közöltek [Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], a növekedési fázisban lévõ sejtekbõl kompetens sejtek elõállításának és azokba a DNS bejuttatásának eljárása, melyet a Bacillus subtilis esetében közöltek [Duncan, C. H., Wilson, GA. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)], és így tovább. Ezek mellett lehet használni azon eljárást is, melynek során a DNS-recipiens sejtekbõl protoplasztokat vagy szferoplasztokat állítanak elõ, melyek könnyen felveszik a rekombináns DNS¹t, majd bejuttatják a rekombináns DNS¹t a DNS-recipiens sejtekbe, mely eljárás a Bacillus subtilis, az aktinomiceták és élesztõk esetében alkalmazható [Chang, S. és Cohen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111, 1979; Bibb, M. J., Ward, J. M. és Hopwood, O. A., Nature, 274, 398, 1978; Hinnen, A., Hicks, J. B. és Fink, G. R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]. Valamely gén kópiaszámát emellett úgy is lehet növelni, hogy a mikroorganizmus kromoszomális DNS-ébe a gén több kópiáját juttatjuk be. Több kópia bejuttatása céljából homológ rekombinációt lehet végrehajtani, megcélozva egy olyan szekvenciát, amelybõl a kromoszomális DNS-ben több kópia található. A kromoszomális DNS-ben több kópiában található szekvenciaként a repetitív DNS és egy transzpozon végén található inverz repeat alkalmazhatók. Egy célgént emellett a kromoszómán található valamely szükségtelen génbe is be lehet vinni homológ rekombinációval, vagy a célgént be lehet vinni egy szükségtelen régióba tandemben. Más módon, amint azt a 109985 sz. japán szabadalmi közzétételi irat nyilvánosságra hozza, a célgént valamely transzpozonba is be lehet építeni, és át lehet vinni a kromoszomális DNS¹re több példányban (lásd az 5 595 889 sz. amerikai szabadalmi leírást). Hogy a célgént sikerült¹e a kromoszómára átvinni, Southern-hibridizációval lehet megállapítani, a célgén valamely részét használva próbaként. Továbbá, a kópiaszám növelése mellett, a célgén expresszióját az expresszióvezérlõ szekvencia, így a kromoszomális DNS¹en vagy egy plazmidon elhelyezkedõ célgén promoterjének erõsebbre cserélésével, az expressziót növelõ regulátor amplifikációjával, vagy az expressziót csökkentõ regulátor deléciójával/attenuálásával is meg lehet növelni, amint azt a WO00/18935 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat leírja. Például ismert erõs promoterek a lac-promoter, trp-promoter, trc-promoter, a lambda-fágból származó Pr¹promoter és így tovább. Továbbá a célgén promoterjét erõsebbé lehet módosítani a promoterrégióban egy nukleotid cseréjével. A promoter erõsségének értékelését, valamint az ismert erõs promoterek leírását Goldstein és mtsi. közleményében találjuk (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105–128). Ismert továbbá, hogy a riboszómakötõ hely

1

HU 006 467 T2

(RBS) és a startkodon közé egy távtartó beiktatása, különösen számos nukleotid beiktatása közvetlenül a startkodontól upstream irányba, nagymértékben befolyásolja az mRNS transzlációs hatékonyságát, és ezen nukleotidok módosíthatók. Egy expresszióvezérlõ régió, így egy promoter azonosítása promoterkeresõ vektorral vagy génelemzõ szoftverrel, így a GENETYX programmal lehetséges. A célgén expressziója növelhetõ ezen promoterek helyettesítésével vagy módosításával. Az expresszióvezérlõ szekvencia például egy hõmérséklet-érzékeny plazmid alkalmazásával helyettesíthetõ. Az ilyen eljárások esetében az enzimaktivitás növekedése legalább 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 400%, 600% vagy 1000% a vad típusú törzshöz vagy nem módosított törzshöz képest. Továbbá az enzimaktivitás növelésére szolgáló ezen technikákat egymással kombinálva is lehet alkalmazni, vagy egy enzimaktivitás csökkentésével kombinálva. A referenciaként szolgáló Escherichia baktériumokra, mint vad típusú törzsekre példa az Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), és így tovább, melyek a vad típusú törzsek prototípusából, a K12-bõl származnak. Továbbá a jelen találmány szerinti baktériumban az L¹treonin bioszintézisétõl elágazó reakciót katalizáló, nem L¹treonint termelõ enzim aktivitása lehet csökkent, vagy nulla. Ilyen enzimekre példa a treonin-dehidrogenáz, treonin-deamináz, és a treonin-dehidratáz. Ezen enzimek csökkent vagy hiányzó aktivitásával rendelkezõ törzsek a WO95/23864, WO96/17930, WO03/080843, WO04/087895 és így tovább sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi iratokban vannak leírva. Továbbá a jelen találmány szerinti baktériumban a glikolitikus anyagcsereút, a trikarbonsavciklus, vagy a légzési lánc valamely, az L¹treonin-termelést negatívan befolyásoló enzimjének, a génexpressziót szabályozó valamely enzimnek, vagy a melléktermék-bioszintézis valamely enzimjének aktivitása csökkent vagy hiányzó lehet, az L¹treonin-degradáló enzim mellett. Ilyen enzimeket kódoló génre példa a s¹faktor RNS-polimeráz génje (rpoS, WO01/05939 and WO03/074719 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat), a foszfoenol-piruvát-karboxiláz génje (pckA, WO02/29080 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat), a foszfoglukóz-izomeráz génje [pgi, Molecular and General Genetics, 217(1): 126–31 (1989)], a piruvát-oxidáz génje (poxB, WO02/29080 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat) és így tovább. Valamely, a fentiekben leírt enzim aktivitásának csökkentése vagy megszüntetése céljából az említett enzim kromoszomális génjébe tipikus mutációs kezeléssel lehet mutációt bevinni, mely csökkenti vagy megszünteti az enzim sejten belüli aktivitását. Például az enzim kromoszomális génjét génrekombinációval ki lehet vágni, egy expresszióvezérlõ szekvenciát, így promotert és a Shine–Dalgarno-szekvenciát (SD) lehet módosítani és így tovább. Továbbá el lehet érni ezt a célt egy vagy több aminosavhelyettesítéssel (értelemzavaró mutáció), beleértve a stopkodont (értelmetlen

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

mutáció), beleértve a kereteltoló mutációt, mely hozzáad vagy kivág egy vagy több nukleotidot, vagy a génrégió egészének vagy egy részének kivágását [Journal of Biological Chemistry, 272: 8611–8617 (1997)] egy kromoszómán, egy enzimet kódoló régióban. Továbbá az enzimaktivitást csökkenteni lehet vagy meg lehet szüntetni egy olyan gén elõállításával, mely egy mutáns enzimet kódol, melyben egy kódolószakasz kivágásra került, ezen génnel helyettesítve a kromoszómán lévõ normálgént homológ rekombinációval vagy hasonlóval, vagy transzpozont vagy IS¹faktort illesztve a génbe. Továbbá antiszensz RNS-sel is lehet az expressziót gátolni [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511–5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20 833–20 839 (1991)]. Valamely, a fentiekben leírt enzim aktivitásának csökkentése vagy megszüntetése céljából például a következõ génrekombinációs eljárást lehet alkalmazni mutáció bevitelére. Egy kromoszómán lévõ célgént mutáns típusú génnel lehet helyettesíteni oly módon, hogy a célgén szekvenciájának egy részét módosítjuk úgy, hogy normális, mûködõ enzimet ne tudjon termelni, és egy Escherichia baktériumot transzformálunk ezen gént tartalmazó DNS-sel, hogy a kromoszómán lévõ gén és a mutáns gén rekombinációját idézzük elõ. Az ilyen célzott mutáció, mely homológ rekombinációs génhelyettesítést alkalmaz, ismert, és példái között szerepel egy lineáris DNS¹t alkalmazó eljárás, egy hõmérséklet-érzékeny replikációs kezdõpontot tartalmazó plazmidot alkalmazó eljárás (6 303 383 sz. amerikai szabadalmi leírás; 05–007491 sz. japán szabadalmi közzétételi irat) és így tovább. Továbbá az imént említett, génhelyettesítésen alapuló, homogén rekombinációt alkalmazó célzott mutáció a gazdaszervezetben replikálódni képtelen plazmid alkalmazásával is végrehajtható. Az ezen eljárások következtében elálló aktivitáscsökkenés vagy expressziócsökkenés eredményeképpen az enzimaktivitás 75%, 50%, 25% vagy 10% mértékben csökken a vad típusú törzshöz vagy a módosítatlan törzshöz képest, vagy az aktivitás teljesen megszûnik. Továbbá az enzimaktivitás csökkentésére irányuló két vagy több módszer kombinációban is alkalmazható, vagy a fent leírt enzimaktivitás-növeléssel kombinálva is alkalmazható. A referenciaként szolgáló Escherichia baktériumokra, mint vad típusú törzsekre példa az Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), és így tovább, melyek a vad típusú törzsek prototípusából, a K12-bõl származnak. A jelen találmány szerint alkalmazott L¹treonin-termelõ baktérium lehet olyan törzs, mely módosításra került oly módon, hogy szukrózt tud felvenni szénforrásként. Például szukrózt felvenni képes törzset lehet nyerni az E. coli H155-törzsbõl P1¹transzdukció útján, markerként használva, hogy szénforrásként kizárólag szukrózon is képes nõni. L¹treonin-termelõ baktérium, mely szukrózt tud felvenni szénforrásként, a WO90/04636 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat szerint állítható elõ.

1

HU 006 467 T2

2

nek, melyekbõl az attenuátorrégiót és a natív transzkTovábbá, az imént említett génmanipulációk mellett, ripcióvezérlõ régiót törölték, a lambda-fág Cro fehérjéje valamely L¹treonin-termelõ baktérium elõállítására szolN¹termilis régiógénjétõl downstream irányban helyezgáló eljárásra példa egy Escherichia baktérium kezelése kednek el. Továbbá a törzs tartalmaz egy rekombináns UV¹besugárzással vagy egy tipikus mutagén ágenssel, mint az N¹metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (NTG) és a 5 plazmid-DNS¹t, melyet úgy állítottak össze, hogy a treonin bioszintézisében érintett géneket a lambda-fág salétromossav, L¹aminosavra vagy L¹aminosav-analógrepresszora és promoterje szabályozza. ra rezisztens, vagy L¹aminosavra auxotróf törzsek elõálAz Escherichia coli 427T23 (US5 631 157 sz. amelítása céljából, és a javított L¹treonin-termelõ képességrikai szabadalmi leírás) szintén példaként hozható az gel rendelkezõ törzs kiválasztása. Ezekre példa a borrelidinrezisztens mutáns törzs (US5 939 307 sz. amerikai 10 L¹treonin-termelõ elõnyös baktériumra. A 427T23-törzs olyan homoszerin-dehidrogenázzal rendelkezik, mely szabadalmi leírás), a diamino-szukcinilsavra rezisztens nem alanya az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos mutáns törzs (WO00/09661 sz. nemzetközi szabadalmi gátlásnak. Ezen törzs emellett attenuált treonin-deamiközzétételi irat), az a¹metil-szerinre rezisztens mutáns náz-aktivitással rendelkezik, és képes szukrózt hasztörzs (WO00/09661 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat), a fluor-piruvátra rezisztens mutáns törzs 15 nálni szénforrásként. A 427T23-törzs az American Type Culture Collectionban került elhelyezésre az (WO00/09661 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi ATCC 98082 elérési szám alatt. irat), az ecetsavra rezisztens mutáns törzs Az Escherichia coli kat¹13 (US5 175 107 sz. ameri(US5 919 670 sz. amerikai szabadalmi leírás), a treoninkai szabadalmi leírás) szintén elõnyösen alkalmazható ra rezisztens mutáns törzs (WO90/04636 sz. sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi irat), és az AHV¹re re- 20 L¹treonin-termelõ baktériumként. A kat¹13 rezisztens borrelidinre, olyan homoszerin-dehidrogenázzal rendelzisztens mutáns törzs [Genetika, 16: 206 (1978)]. kezik, mely nem alanya az L¹treonin által kifejtett vissza<3–2> Példák a jelen találmány szerint csatolásos gátlásnak, attenuált treonin-deamináz-aktivialkalmazható L¹treonin-termelõ baktériumra tást mutat, és képes szukrózt használni szénforrásként. Az alábbiakban a jelen találmány szerint alkalmaz- 25 A treoninbioszintézis enzimjeivel transzformált Esható, L¹treonin-termelési képességgel felruházott Escherichia coli TDH6-törzs (2001–346578 sz. japán szacherichia baktériumok példái kerülnek leírásra. Mindbadalmi közzétételi irat) szintén elõnyösen használható azonáltal a jelen találmány szerint alkalmazható baktéL¹treonin-termelõ baktériumként. A TDH6 törzs treoninriumok nem korlátozódnak ezen példákra, amíg a bakdehidrogenáz-aktivitásra deficiens, és a B–3996-törzstérium képes L¹treonint termelni. 30 bõl (US5 631 157 sz. amerikai szabadalmi leírás) a A jelen találmány szerint alkalmazható, L¹treonintreoninbioszintézis-enzimeket kódoló géneket hordozó termelõ baktériumokra példaként mutatjuk be az EspVIC40 eltávolításával készítették, és az orosz nemzeti cherichia coli VKPM B–3996 törzset (US5 175 107 sz. ipari mikroorganizmus-gyûjteményben (VPKM) amerikai szabadalmi leírás). Ez a VKPM B–3996 törzs (117545 Moszkva l, Dorozsnyij projezd 1, Oroszoraz orosz nemzeti ipari mikroorganizmus-gyûjtemény- 35 szág) került elhelyezésre a VPKM B–3420 nyilvántartáben (VPKM) (117545 Moszkva l, Dorozsnyij projezd 1, si szám alatt. Oroszország) került elhelyezésre 1987. november Továbbá a jelen szabadalom szerint az L¹treonin 19¹én, a VPKM B–3996 nyilvántartási szám alatt. termelésére alkalmazható baktériumokra más példák: Ez a VKPM B–3996 törzs a pVIC40-plazmidot Escherichia coli MG–442 (CMIMB–1628, (WO90/04636 sz. nemzetközi szabadalmi közzétételi 40 US4 278 765 sz. amerikai szabadalmi leírás); irat) tartalmazza, melyet a treoninbioszintézis génjeiEscherichia coli VL334/pYN7 (US4 278 765 sz. nek (a thrABC operonnak) a pAYC32¹be való beilleszamerikai szabadalmi leírás); tésével állítottak elõ, mely utóbbi egy széles gazdaEscherichia coli H–4225 (FERM BP–1236, spektrumú, streptomicinrezisztencia-markert hordozó US5 017 483 sz. amerikai szabadalmi leírás); plazmid [ld. Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., 45 Escherichia coli H–7256 (FERM BP–2137); Plasmid, (1986, 16, 161–167)]. A pVIC40-ben a treoEscherichia coli DSM9807 (KCCM–10168). nin-operonban a thrA által kódolt aszpartokináz-I-homoszerin-dehidrogenáz L¹treonin általi visszacsatoláPéldák sos gátlása kiiktatásra került. A jelen találmány közelebbi magyarázatát adják az A jelen találmány szerint alkalmazható, L¹treonin- 50 alábbi példák. Mindazonáltal a jelen találmány nem termelõ baktériumokra szintén példaként mutatjuk be korlátozódik ezen példákra. az Escherichia coli VKPM B–5318 törzset (0594792 sz. 1. példa: Az indításkor adott kén szabályozásának európai szabadalmi leírás). Ez a VKPM B–5318 törzs hatása szakaszos tenyészetben az orosz nemzeti ipari mikroorganizmus-gyûjteményElõször szakaszos tenyészetben került vizsgálatra ben (VPKM) (117545 Moszkva l, Dorozsnyij projezd 1, 55 a tenyészet kezdeti közegében a kén elõre meghatáOroszország) került elhelyezésre 1990. május 3¹án, a rozott koncentrációra vagy az alá korlátozásának a VPKM B–5318 nyilvántartási szám alatt. Ez a VKPM hatása. B–5318 törzs nem igényel izoleucint, hõmérséklet-érA VKPM B–5318 törzset egy 20 mg/l streptomicinzékeny Cl represszorral, PR¹promoterrel, és egy treonin-operonnal rendelkezik. A treoninszabályozott gé- 60 szulfátot tartalmazó LB agar (10 g/l tripton, 5 g/l élesz11

1

HU 006 467 T2

tõkivonat, 5 g/l NaCl, 15 g/l agar) tálcán tenyésztettük 37 °C¹on 24 óráig, majd egy tálcáról a sejtek 1/10¹ét levettük, és 50 ml 20 mg/l streptomicin-szulfátot tartalmazó LB közegbe (10 g/l tripton, 5 g/l élesztõkivonat, 5 g/l NaCl) oltottuk egy bordás rázóflaskába a beoltótenyészet elõállítása céljából; 40 °C¹on 144 percenkénti fordulattal rázattuk 6 óra hosszat. A beoltótenyészet elõállítása után az üzemi tenyészet 16%¹át kitevõ beoltótenyészetet 300 ml üzemi kultúraközeget tartalmazó 1 l¹es befõttesüveg-fermentorba oltottuk, és 40 °C¹on pH=7,0¹n tenyésztettük. Az üzemi tenyészet közegének összetétele a következõ volt: Szukróz 27,g/l Élesztõkivonat 1,8 g/l KH2PO4 1,5 g/l NaCl 0,6 g/l MgSO4·7H2O 0,36 g/l FeSO4·7H2O 18,mg/l MnSO4·4H2O 18,mg/l Streptomicin-szulfát 20,mg/l Ammónium-szulfátot annak megfelelõen adagoltunk, hogy a kezdeti kénkoncentráció 0,78 és 0,10 g/l között legyen kénre vonatkoztatva. A tenyészetet a tenyésztés alatt pH=7,0¹n tartottuk ammóniagáz adagolásával. Miután a szacharid a közegben elfogyott, szukróz vizes oldatából 600 g/l¹t adtunk rátöltéses tenyészet végrehajtása céljából. 42 óra tenyésztés után az L¹treonin-koncentrációt HPLC-vel határoztuk meg. Az eredmény az volt, hogy az L¹treonin kitermelése a kén csökkentésével nõtt, különösen jelentõsen nõtt 0,29 g/l vagy az alatti kénkoncentrációk esetén, amint azt az 1. táblázat mutatja.

5

10

15

20

25

30

35 1. táblázat Kezdeti hozzáadott (NH4)2SO4 (g/l)

Kezdeti hozzáadott S (g/l)

Kitermelés (%)

3,0

0,78

35,7

2,0

0,54

36,6

1,0

0,29

38,6

40

2

Kezdeti hozzáadott (NH4)2SO4 (g/l)

Kezdeti hozzáadott S (g/l)

Kitermelés (%)

0,8

0,25

39,9

0,4

0,15

40,8

0,2

0,10

43,6

2. példa: A rátöltött közegben adott kén szabályozásának hatása rátöltéses szakaszos tenyészetben Elõször, hasonlóan az 1. példához, a VKPM B–5318 törzset egy 20 mg/l streptomicin-szulfátot tartalmazó LB agar (10 g/l tripton, 5 g/l élesztõkivonat, 5 g/l NaCl, 15 g/l agar) tálcán tenyésztettük 37 °C¹on 24 óráig, majd egy tálcáról a sejtek 1/10¹ét levettük, és 50 ml 20 mg/l streptomicin-szulfátot tartalmazó LB közegbe (10 g/l tripton, 5 g/l élesztõkivonat, 5 g/l NaCl) oltottuk egy bordás rázóflaskába a beoltótenyészet elõállítása céljából; 40 °C¹on 144 percenkénti fordulatszámmal rázattuk 6 óra hosszat. A beoltótenyészet elõállítása után a üzemi tenyészet 16%¹át kitevõ beoltótenyészetet 300 ml fõkultúraközeget tartalmazó 1 l¹es befõttesüveg-fermentorba oltottuk, és 40 °C¹on pH=7,0¹n tenyésztettük. Az üzemi tenyészet tápközege ugyanolyan összetételû volt, mint az 1. példában alkalmazott. A tenyészetet pH=7,0¹n tartottuk a tenyésztés alatt ammóniagáz adagolásával. Miután a szacharid a közegben elfogyott, a fermentációt szukrózt tartalmazó tápközeg hozzáadásával folytattuk, és úgy állítottuk be, hogy a fermentációs közegben a kénkoncentráció egy elõre meghatározott értéken vagy az alatt maradjon. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja. A rátöltött közegben a kén koncentrációját 0 és 1,22 g/l között tartottuk, és a tenyészetet úgy vezéreltük, hogy a fermentációs közeg 0,144 és 0,548 g/l ként tartalmazzon a teljes üzemi tenyésztési idõszak alatt. Az eredmények megerõsítették, hogy az L¹treonin kitermelése rátöltéses szakaszos tenyészetben is javul a kénkoncentráció 0,35 g/l¹en vagy az alatt tartásával.

2. táblázat (NH4)2SO4 a rátöltött közegben (g/l)

S a rátöltött közegben (g/l)

Összes S (g/l)

Kitermelés (%)

0,0

0,00

0,144

41,8

1,0

0,24

0,225

39,1

2,0

0,49

0,305

38,8

5,0

1,22

0,548

37,5

Ipari alkalmazhatóság A jelen találmány szerint az L¹treonin fermentációs kitermelését javítani lehet egy L¹treonin-termelõ képes-

séggel rendelkezõ, az Escherichia nembe tartozó mikroorganizmust alkalmazó, L¹treonin termelésére szol60 gáló fermentációs eljárással. 12

HU 006 467 T2

A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása <210> 1 <223> Sigma 70 faktor; kikövetkeztetett start (+1): 106-nál <223> Sigma 70 faktor; kikövetkeztetett start (+1): 139-nél <223> Sigma 70 faktor; kikövetkeztetett start (+1): 219-nél <223> vezetõpeptid <223> thrA <223> thrB <223> thrC <210> 6 <223> vezetõszekvencia SZEKVENCIALISTA <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for producing L¹threonine <130> C586–C6078 <150> JP2005–189106 <151> 2005–06–29 <150> JP2006–119334 <151> 2006–04–24 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5040 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> promoter <222> (71)..(99) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 106 <220> <221> promoter <222> (104)..(132) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 139 <220> <221> promoter <222> (139)..(219) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 219

13

HU 006 467 T2

<220> <221> CDS <222> (190)..(255) <223> leader peptide <220> <221> attenuator <222> (273)..(307) <220> <221> CDS <222> (337)..(2799) <223> thrA <220> <221> CDS <222> (2801)..(3733) <223> thrB <220> <221> CDS <222> (3734)..(5020) <223> thrC <400> 1

agcttttcat tctgactgca tgatagcagc ttctgaactg tcactaaata ctttaaccaa acaacatcc atg aaa cgc Met Lys Arg 1

acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac att agc acc acc att acc acc acc atc acc att Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile 5 10

60 120 180 231

acc aca ggt aac ggt gcg ggc tga cgcgtacagg aaacacagaa aaaagcccgc Thr Thr Gly Asn Gly Ala Gly 15 20

285

acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc aaaggtaacg aggtaacaac c atg cga Met Arg

342

gtg ttg aag ttc ggc ggt aca tca gtg gca aat gca gaa cgt ttt ctg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg Phe Leu 25 30 35

390

cgt gtt gcc gat att ctg gaa agc aat gcc agg cag ggg cag gtg gcc Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln Val Ala 40 45 50 55

438

acc gtc ctc tct gcc ccc gcc aaa atc acc aac cac ctg gtg gcg atg Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val Ala Met 60 65 70

486

att gaa aaa acc att agc ggc cag gat gct tta ccc aat atc agc gat Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile Ser Asp 75 80 85

534

gcc gaa cgt att ttt gcc gaa ctt ttg acg gga ctc gcc gcc gcc cag Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala Ala Gln 90 95 100

582

14

HU 006 467 T2

ccg ggg ttc ccg ctg gcg caa ttg aaa act ttc gtc gat cag gaa ttt Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln Glu Phe 105 110 115

630

gcc caa ata aaa cat gtc ctg cat ggc att agt ttg ttg ggg cag tgc Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly Gln Cys 120 125 130 135

678

ccg gat agc atc aac gct gcg ctg att tgc cgt ggc gag aaa atg tcg Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys Met Ser 140 145 150

726

atc gcc att atg gcc ggc gta tta gaa gcg cgc ggt cac aac gtt act Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn Val Thr 155 160 165

774

gtt atc gat ccg gtc gaa aaa ctg ctg gca gtg ggg cat tac ctc gaa Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr Leu Glu 170 175 180

822

tct acc gtc gat att gct gag tcc acc cgc cgt att gcg gca agc cgc Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala Ser Arg 185 190 195

870

att ccg gct gat cac atg gtg ctg atg gca ggt ttc acc gcc ggt aat Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala Gly Asn 200 205 210 215

918

gaa aaa ggc gaa ctg gtg gtg ctt gga cgc aac ggt tcc gac tac tct Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp Tyr Ser 220 225 230

966

gct gcg gtg ctg gct gcc tgt tta cgc gcc gat tgt tgc gag att tgg Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu Ile Trp 235 240 245

1014

acg gac gtt gac ggg gtc tat acc tgc gac ccg cgt cag gtg ccc gat Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val Pro Asp 250 255 260

1062

gcg agg ttg ttg aag tcg atg tcc tac cag gaa gcg atg gag ctt tcc Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu Leu Ser 265 270 275

1110

tac ttc ggc gct aaa gtt ctt cac ccc cgc acc att acc ccc atc gcc Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro Ile Ala 280 285 290 295

1158

cag ttc cag atc cct tgc ctg att aaa aat acc gga aat cct caa gca Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro Gln Ala 300 305 310

1206

cca ggt acg ctc att ggt gcc agc cgt gat gaa gac gaa tta ccg gtc Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu Pro Val 315 320 325

1254

aag ggc att tcc aat ctg aat aac atg gca atg ttc agc gtt tct ggt Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val Ser Gly 330 335 340

1302

15

HU 006 467 T2

ccg ggg atg aaa ggg atg gtc ggc atg gcg gcg cgc gtc ttt gca gcg Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe Ala Ala 345 350 355

1350

atg tca cgc gcc cgt att tcc gtg gtg ctg att acg caa tca tct tcc Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser Ser Ser 360 365 370 375

1398

gaa tac agc atc agt ttc tgc gtt cca caa agc gac tgt gtg cga gct Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val Arg Ala 380 385 390

1446

gaa cgg gca atg cag gaa gag ttc tac ctg gaa ctg aaa gaa ggc tta Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu Gly Leu 395 400 405

1494

ctg gag ccg ctg gca gtg acg gaa cgg ctg gcc att atc tcg gtg gta Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser Val Val 410 415 420

1542

ggt gat ggt atg cgc acc ttg cgt ggg atc tcg gcg aaa ttc ttt gcc Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ala 425 430 435

1590

gca ctg gcc cgc gcc aat atc aac att gtc gcc att gct cag gga tct Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln Gly Ser 440 445 450 455

1638

tct gaa cgc tca atc tct gtc gtg gta aat aac gat gat gcg acc act Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala Thr Thr 460 465 470

1686

ggc gtg cgc gtt act cat cag atg ctg ttc aat acc gat cag gtt atc Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln Val Ile 475 480 485

1734

gaa gtg ttt gtg att ggc gtc ggt ggc gtt ggc ggt gcg ctg ctg gag Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu Leu Glu 490 495 500

1782

caa ctg aag cgt cag caa agc tgg ctg aag aat aaa cat atc gac tta Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile Asp Leu 505 510 515

1830

cgt gtc tgc ggt gtt gcc aac tcg aag gct ctg ctc acc aat gta cat Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn Val His 520 525 530 535

1878

ggc ctt aat ctg gaa aac tgg cag gaa gaa ctg gcg caa gcc aaa gag Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala Lys Glu 540 545 550

1926

ccg ttt aat ctc ggg cgc tta att cgc ctc gtg aaa gaa tat cat ctg Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr His Leu 555 560 565

1974

ctg aac ccg gtc att gtt gac tgc act tcc agc cag gca gtg gcg gat Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val Ala Asp 570 575 580

2022

16

HU 006 467 T2

caa tat gcc gac ttc ctg cgc gaa ggt ttc cac gtt gtc acg ccg aac Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr Pro Asn 585 590 595

2070

aaa aag gcc aac acc tcg tcg atg gat tac tac cat cag ttg cgt tat Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu Arg Tyr 600 605 610 615

2118

gcg gcg gaa aaa tcg cgg cgt aaa ttc ctc tat gac acc aac gtt ggg Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn Val Gly 620 625 630

2166

gct gga tta ccg gtt att gag aac ctg caa aat ctg ctc aat gca ggt Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn Ala Gly 635 640 645

2214

gat gaa ttg atg aag ttc tcc ggc att ctt tct ggt tcg ctt tct tat Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu Ser Tyr 650 655 660

2262

atc ttc ggc aag tta gac gaa ggc atg agt ttc tcc gag gcg acc acg Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala Thr Thr 665 670 675

2310

ctg gcg cgg gaa atg ggt tat acc gaa ccg gac ccg cga gat gat ctt Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu 680 685 690 695

2358

tct ggt atg gat gtg gcg cgt aaa cta ttg att ctc gct cgt gaa acg Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg Glu Thr 700 705 710

2406

gga cgt gaa ctg gag ctg gcg gat att gaa att gaa cct gtg ctg ccc Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val Leu Pro 715 720 725

2454

gca gag ttt aac gcc gag ggt gat gtt gcc gct ttt atg gcg aat ctg Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala Asn Leu 730 735 740

2502

tca caa ctc gac gat ctc ttt gcc gcg cgc gtg gcg aag gcc cgt gat Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala Arg Asp 745 750 755

2550

gaa gga aaa gtt ttg cgc tat gtt ggc aat att gat gaa gat ggc gtc Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp Gly Val 760 765 770 775

2598

tgc cgc gtg aag att gcc gaa gtg gat ggt aat gat ccg ctg ttc aaa Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu Phe Lys 780 785 790

2646

gtg aaa aat ggc gaa aac gcc ctg gcc ttc tat agc cac tat tat cag Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr Tyr Gln 795 800 805

2694

ccg ctg ccg ttg gta ctg cgc gga tat ggt gcg ggc aat gac gtt aca Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp Val Thr 810 815 820

2742

17

HU 006 467 T2

gct gcc ggt gtc ttt gct gat ctg cta cgt acc ctc tca tgg aag tta Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp Lys Leu 825 830 835

2790

gga gtc tga c atg gtt aaa gtt tat gcc ccg gct tcc agt gcc aat atg Gly Val Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met 840 845 850

2839

agc gtc ggg ttt gat gtg ctc ggg gcg gcg gtg aca cct gtt gat ggt Ser Val Gly Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly 855 860 865 870

2887

gca ttg ctc gga gat gta gtc acg gtt gag gcg gca gag aca ttc agt Ala Leu Leu Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser 875 880 885

2935

ctc aac aac ctc gga cgc ttt gcc gat aag ctg ccg tca gaa cca cgg Leu Asn Asn Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg 890 895 900

2983

gaa aat atc gtt tat cag tgc tgg gag cgt ttt tgc cag gaa ctg ggt Glu Asn Ile Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly 905 910 915

3031

aag caa att cca gtg gcg atg acc ctg gaa aag aat atg ccg atc ggt Lys Gln Ile Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly 920 925 930

3079

tcg ggc tta ggc tcc agt gcc tgt tcg gtg gtc gcg gcg ctg atg gcg Ser Gly Leu Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala 935 940 945 950

3127

atg aat gaa cac tgc ggc aag ccg ctt aat gac act cgt ttg ctg gct Met Asn Glu His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala 955 960 965

3175

ttg atg ggc gag ctg gaa ggc cgt atc tcc ggc agc att cat tac gac Leu Met Gly Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp 970 975 980

3223

aac gtg gca ccg tgt ttt ctc ggt ggt atg cag ttg atg atc gaa gaa Asn Val Ala Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu 985 990 995

3271

aac gac atc atc agc cag caa gtg cca ggg ttt gat gag tgg ctg Asn Asp Ile Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu 1000 1005 1010

3316

tgg gtg ctg gcg tat ccg ggg att aaa gtc tcg acg gca gaa gcc Trp Val Leu Ala Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala 1015 1020 1025

3361

agg gct att tta ccg gcg cag tat cgc cgc cag gat tgc att gcg Arg Ala Ile Leu Pro Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala 1030 1035 1040

3406

cac ggg cga cat ctg gca ggc ttc att cac gcc tgc tat tcc cgt His Gly Arg His Leu Ala Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg 1045 1050 1055

3451

18

HU 006 467 T2

cag cct gag ctt gcc gcg aag ctg atg aaa gat gtt atc gct gaa Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu 1060 1065 1070

3496

ccc tac cgt gaa cgg tta ctg cca ggc ttc cgg cag gcg cgg cag Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln 1075 1080 1085

3541

gcg gtc gcg gaa atc ggc gcg gta gcg agc ggt atc tcc ggc tcc Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala Ser Gly Ile Ser Gly Ser 1090 1095 1100

3586

ggc ccg acc ttg ttc gct ctg tgt gac aag ccg gaa acc gcc cag Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys Pro Glu Thr Ala Gln 1105 1110 1115

3631

cgc gtt gcc gac tgg ttg ggt aag aac tac ctg caa aat cag gaa Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu Gln Asn Gln Glu 1120 1125 1130

3676

ggt ttt gtt cat att tgc cgg ctg gat acg gcg ggc gca cga gta Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly Ala Arg Val 1135 1140 1145

3721

ctg gaa aac taa atg aaa ctc tac aat ctg aaa gat cac aac gag Leu Glu Asn Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu 1150 1155 1160

3766

cag gtc agc ttt gcg caa gcc gta acc cag ggg ttg ggc aaa aat Gln Val Ser Phe Ala Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn 1165 1170 1175

3811

cag ggg ctg ttt ttt ccg cac gac ctg ccg gaa ttc agc ctg act Gln Gly Leu Phe Phe Pro His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr 1180 1185 1190

3856

gaa att gat gag atg ctg aag ctg gat ttt gtc acc cgc agt gcg Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala 1195 1200 1205

3901

aag atc ctc tcg gcg ttt att ggt gat gaa atc cca cag gaa atc Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile 1210 1215 1220

3946

ctg gaa gag cgc gtg cgc gcg gcg ttt gcc ttc ccg gct ccg gtc Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe Ala Phe Pro Ala Pro Val 1225 1230 1235

3991

gcc aat gtt gaa agc gat gtc ggt tgt ctg gaa ttg ttc cac ggg Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu Glu Leu Phe His Gly 1240 1245 1250

4036

cca acg ctg gca ttt aaa gat ttc ggc ggt cgc ttt atg gca caa Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg Phe Met Ala Gln 1255 1260 1265

4081

atg ctg acc cat att gcg ggt gat aag cca gtg acc att ctg acc Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr Ile Leu Thr 1270 1275 1280

4126

19

HU 006 467 T2

gcg acc tcc ggt gat acc gga gcg gca gtg gct cat gct ttc tac Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala Phe Tyr 1285 1290 1295

4171

ggt tta ccg aat gtg aaa gtg gtt atc ctc tat cca cga ggc aaa Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly Lys 1300 1305 1310

4216

atc agt cca ctg caa gaa aaa ctg ttc tgt aca ttg ggc ggc aat Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn 1315 1320 1325

4261

atc gaa act gtt gcc atc gac ggc gat ttc gat gcc tgt cag gcg Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala 1330 1335 1340

4306

ctg gtg aag cag gcg ttt gat gat gaa gaa ctg aaa gtg gcg cta Leu Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu 1345 1350 1355

4351

ggg tta aac tcg gct aac tcg att aac atc agc cgt ttg ctg gcg Gly Leu Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala 1360 1365 1370

4396

cag att tgc tac tac ttt gaa gct gtt gcg cag ctg ccg cag gag Gln Ile Cys Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu 1375 1380 1385

4441

acg cgc aac cag ctg gtt gtc tcg gtg cca agc gga aac ttc ggc Thr Arg Asn Gln Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly 1390 1395 1400

4486

gat ttg acg gcg ggt ctg ctg gcg aag tca ctc ggt ctg ccg gtg Asp Leu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val 1405 1410 1415

4531

aaa cgt ttt att gct gcg acc aac gtg aac gat acc gtg cca cgt Lys Arg Phe Ile Ala Ala Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg 1420 1425 1430

4576

ttc ctg cac gac ggt cag tgg tca ccc aaa gcg act cag gcg acg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr 1435 1440 1445

4621

tta tcc aac gcg atg gac gtg agt cag ccg aac aac tgg ccg cgt Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg 1450 1455 1460

4666

gtg gaa gag ttg ttc cgc cgc aaa atc tgg caa ctg aaa gag ctg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile Trp Gln Leu Lys Glu Leu 1465 1470 1475

4711

ggt tat gca gcc gtg gat gat gaa acc acg caa cag aca atg cgt Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr Gln Gln Thr Met Arg 1480 1485 1490

4756

gag tta aaa gaa ctg ggc tac act tcg gag ccg cac gct gcc gta Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro His Ala Ala Val 1495 1500 1505

4801

20

HU 006 467 T2

gct tat cgt gcg ctg cgt gat cag ttg aat cca ggc gaa tat ggc Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly Glu Tyr Gly 1510 1515 1520

4846

ttg ttc ctc ggc acc gcg cat ccg gcg aaa ttt aaa gag agc gtg Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu Ser Val 1525 1530 1535

4891

gaa gcg att ctc ggt gaa acg ttg gat ctg cca aaa gag ctg gca Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu Ala 1540 1545 1550

4936

gaa cgt gct gat tta ccc ttg ctt tca cat aat ctg ccc gcc gat Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 1555 1560 1565

4981

ttt gct gcg ttg cgt aaa ttg atg atg aat cat cag taa aatctattca Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 1570 1575

5030

ttatctcaat

5040

<210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2

Met Lys Arg Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile Thr Thr 1 5 10 15 Gly Asn Gly Ala Gly 20 <210> 3 <211> 820 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3

Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg 1 5 10 15 Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln 20 25 30 Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val 35 45 Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile 50 55 60 Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln 85 90 95

21

HU 006 467 T2

Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly 100 105 110 Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys 115 120 125 Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn 130 135 140 Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala 165 170 175 Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala 180 185 190 Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp 195 200 205 Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu 210 215 220 Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val 225 230 235 240 Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu 245 250 255 Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro 260 265 270 Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu 290 295 300 Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val 305 310 315 320 Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe 325 330 335 Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser 340 345 350 Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val 355 360 365 Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu 370 375 380 Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser 385 390 395 400 Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe 405 410 415

22

HU 006 467 T2

Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln 420 425 430 Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala 435 440 445 Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln 450 455 460 Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu 465 470 475 480 Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile 485 490 495 Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn 500 505 510 Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala 515 520 525 Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr 530 535 540 His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val 545 550 555 560 Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr 565 570 575 Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu 580 585 590 Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn 595 600 605 Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn 610 615 620 Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu 625 630 635 640 Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala 645 650 655 Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp 660 665 670 Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg 675 680 685 Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val 690 695 700 Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala 705 710 715 720 Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala 725 730 735

23

HU 006 467 T2

Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp 740 745 750 Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu 755 760 765 Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr 770 775 780 Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp 785 790 795 800 Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp 805 810 815 Lys Leu Gly Val 820 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4

Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn 35 40 45 Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile 50 55 60 Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu 100 105 110 His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly 115 120 125 Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala 130 135 140 Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile 145 150 155 160 Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala 165 170 175 Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro 180 185 190 24

HU 006 467 T2

Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala 195 200 205 Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys 210 215 220 Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro 225 230 235 240 Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala 245 250 255 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys 260 265 270 Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu 275 280 285 Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly 290 295 300 Ala Arg Val Leu Glu Asn 305 310 <210> 5 <211> 428 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5

Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu Gln Val Ser Phe Ala 1 5 10 15 Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn Gln Gly Leu Phe Phe Pro 20 25 30 His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys 35 40 45 Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly 50 55 60 Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Pro Ala Pro Val Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu 85 90 95 Glu Leu Phe His Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg 100 105 110 Phe Met Ala Gln Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr 115 120 125 Ile Leu Thr Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala 130 135 140 Phe Tyr Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly 145 150 155 160 25

HU 006 467 T2

Lys Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn 165 170 175 Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala Leu 180 185 190 Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu Gly Leu 195 200 205 Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala Gln Ile Cys 210 215 220 Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu Thr Arg Asn Gln 225 230 235 240 Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Leu Thr Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val Lys Arg Phe Ile Ala Ala 260 265 270 Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp 275 280 285 Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser 290 295 300 Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile 305 310 315 320 Trp Gln Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr 325 330 335 Gln Gln Thr Met Arg Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro 340 345 350 His Ala Ala Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly 355 360 365 Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu 370 375 380 Ser Val Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu 385 390 395 400 Ala Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 405 410 415 Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 420 425 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> <222> (1)..(66) <223> leader sequence

26

1

HU 006 467 T2

2

<400> 6

atgaaacgca ttagcaccac cattaccacc accatcacca ttaccacagg taacggtgcg ggctga

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás L¹treonin termelésére, mely tartalmazza a következõ lépéseket: A) L-treonin termelésére képes, az Escherichia nembe tartozó mikroorganizmus szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó fermentációs tápközegben történõ tenyésztése, B) az L¹treonin kigyûjtése a tenyészetbõl, ahol a kénkoncentráció a tápközegben oly módon kerül szabályozásra, hogy 0,35 g/l értéken vagy az alatt marad. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a mikroorganizmus Escherichia coli. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mikroorganizmus valamely, az L¹treonin bioszintézisében részt vevõ enzimje oly módon van módosítva, hogy az enzim nem alanya az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az L¹treonin bioszintézisében részt vevõ enzim a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: aszpartokináz, homoszerin-kináz és a treonin-szintáz és ezek kombinációi. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kénforrás a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: szulfátok, tioszulfátok, szulfitok, cisztein, cisztin, glutation és ezek kombinációi. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tenyésztési eljárás a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: szakaszos tenyészet, rátöltéses szakaszos tenyészet és folyamatos tenyészet. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a tenyésztési eljárás rátöltéses szakaszos tenyésztés vagy folyamatos tenyésztés, és ahol a fermentorban lévõ tenyészetre kénforrást tartalmazó közeg kerül rátöltésre. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a rátöltött tápközeg szénforrást és növekedésserkentõ tápanyagot is tartalmaz, és ahol a rátöltött tápközeg a fermentorban lévõ tenyészetre folyamatosan vagy szakaszosan kerül rátöltésre úgy, hogy a tenyészetben a szénforrás koncentrációja 30 g/l értéken vagy az alatt marad a mikroorganizmus logaritmikus növekedésének befejezõdése után. 9. Eljárás fermentleven alapuló takarmánykiegészítõ elõállítására, mely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

27

60 66

A) az Escherichia nembe tartozó, L¹treonin termelésére képes mikroorganizmus tenyésztése szénforrást, nitrogénforrást és kénforrást tartalmazó fermentációs közegben, B) a fermentáció lefolytatása oly módon, hogy a közegben a kénkoncentráció 0,35 g/l¹en vagy az alatt maradjon, C) a nyers fermentlé szárítása 10 tömeg% vagy kisebb víztartalomig. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a mikroorganizmus Escherichia coli. 11. A 9–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mikroorganizmusban az L¹treonin bioszintézisében részt vevõ valamely enzim úgy van módosítva, hogy nem alanya az L¹treonin által kifejtett visszacsatolásos gátlásnak. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol az L¹treonin bioszintézisében részt vevõ enzim a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: aszpartokináz, homoszerin-kináz, treonin-szintáz és ezek kombinációi. 13. A 9–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kénforrás a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: szulfátok, tioszulfátok, szulfitok, cisztein, cisztin, glutation és ezek kombinációi. 14. A 9–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tenyésztési eljárás a következõk alkotta csoportból van kiválasztva: szakaszos tenyészet, rátöltéses szakaszos tenyészet és folyamatos tenyészet. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a tenyésztési eljárás rátöltéses szakaszos tenyésztés vagy folyamatos tenyésztés, és ahol a fermentorban lévõ tenyészetre kénforrást tartalmazó közeg kerül rátöltésre. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a rátöltött tápközeg szénforrást és növekedésserkentõ tápanyagot is tartalmaz, és ahol a rátöltött tápközeg a fermentorban lévõ tenyészetre folyamatosan vagy szakaszosan kerül rátöltésre úgy, hogy a tenyészetben a szénforrás koncentrációja 30 g/l értéken vagy az alatt marad a mikroorganizmus logaritmikus növekedésének befejezõdése után. 17. A 9–16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a takarmánykiegészítõ L¹treonin-tartalma több mint 95%.

HU 006 467 T2 Int. Cl.: C12P 13/08

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest