!HU000004967T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 967
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A23L 1/29
(21) Magyar ügyszám: E 06 113191 (22) A bejelentés napja: 2005. 05. 17. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060113191 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1685763 A1 2006. 08. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1685763 B1 2008. 11. 12.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20040076479 2004. 05. 17.
(73) Jogosult: N. V. Nutricia, 2712 HM Zoetermeer (NL)
EP
(72) Feltalálók: Speelmans, Gelske, 6708 LW, Wageningen (NL); Govers, Maria Johanna Adriana Petronella, 6721 AJ, Bennekom (NL); Knol, Jan, 6708 SM, Wageningen (NL); Van Tol, Eric Alexander Franciscus, 6824 MZ, Arnhem (NL) (54)
A23L 1/0528 A23L 1/30 A61K 31/715 A61K 31/702 A61K 31/733 A61K 31/01
(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
GOS és polifruktóz szinergizmusa
(57) Kivonat
HU 004 967 T2
A találmány tárgyát galaktooligoszacharidok (GOS, például TOS) és polifruktóz (például inulin) új szinergista keverékei, valamint az ezeket tartalmazó prebiotikus élelmiszer-készítmények képezik. Ezek az élelmiszerkészítmények kedvezõ hatást gyakorolnak a részben
vagy kizárólag tápszerrel táplált csecsemõkre, de elfogyasztásuk a bélproblémákkal, például gyulladásos bélbetegséggel (IBD-vel) vagy irritábilis bél szindrómával (IBS-sel) küzdõ felnõttek egészségi állapotát is javítja.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 967 T2
A találmány tárgyköre A találmány tárgya humán egészségüggyel és táplálkozással kapcsolatos. A találmány tárgyát prebiotikus szénhidrátok, elsõsorban galaktooligoszacharidok (GOS, például TOS) és polifruktóz (például inulin) új szinergista keverékei, valamint az ezeket tartalmazó élelmiszer-készítmények képezik. Az élelmiszer-készítmények kedvezõ hatást gyakorolnak a részben vagy kizárólag tápszerrel etetett csecsemõkre, de elfogyasztásuk a bélproblémákkal, például gyulladásos bélbetegséggel (IBD-vel) vagy irritábilis bél szindrómával (IBSsel) küzdõ felnõttek egészségi állapotát is javítja. A találmány háttere A vakbélre, colonra és végbélre osztott emberi vastagbél mikroflórája alapvetõ szerepet tölt be a humán táplálkozásban és egészségben. A baktériumflóra összetételét a felvett táplálék befolyásolja, ezen keresztül az módosítható is. A gyomron és a vékonybélen keresztüljutott szénhidrátokat ezek a baktériumok metabolizálják, a metabolizmus fõ végtermékeként rövid szénláncú zsírsavak (SCFA), például acetát, propionát, butirát és valerát keletkeznek, amelyek késõbb a véráramba kerülnek. A bakteriális fermentáció további végtermékei például a laktát és a szukcinát. Ezeknek a termékeknek az összmennyisége és összetétele (relatív mennyisége) ugyanakkor jelentõs hatást gyakorol a baktériumnövekedésre, a pH¹ra, a kórokozó fajok kizárására stb. A mikrobiális flóra és azon keresztül az emberi egészség elõnyös befolyásolásának módja a prebiotikumok alkalmazása. A „prebiotikumok” definíciójuk szerint „nem emészthetõ élelmiszer-összetevõk, amelyek elõnyös hatást gyakorolnak a gazdaszervezetre azáltal, hogy egy vagy korlátozott számú colonbeli baktérium szaporodásának és/vagy aktivitásának szelektív stimulálásán keresztül javítják a gazdaszervezet egészségi állapotát” (Gibson és Roberfroid 1995, J. Nutr. 125, 1401–1412). Prebiotikum olyan vegyület lehet, amely 1. nem hidrolizálódhat vagy szívódhat fel a gyomor-bél rendszer felsõ szakaszában (a gyomorban és a vékonybélben), 2. egy vagy több potenciálisan elõnyös baktérium hatására szelektíven fermentálódnia kell a colonban, 3. a colonbeli mikroflórát egészségesebb összetétel irányába kell módosítania, továbbá 4. a páciens egészségi állapota szempontjából elõnyös hatásokat kell kiváltania. Gyakran alkalmazott prebiotikumok az úgynevezett nem emészthetõ szénhidrátok (vagy „oldható élelmi rostok”), amelyek emésztetlenül haladnak át a gyomor-bél rendszer felsõ szakaszán keresztül a vastagbélbe. Ilyenek például a fruktooligoszacharidok (a FOS¹ok), az oligofruktóz, az inulin és a transzgalaktooligoszacharidok (a TOS¹ok). Megjegyzendõ, hogy a szakirodalomban a különféle elnevezések, például a fruktooligoszacharid, az inulin, az oligofruktóz és az inulooligoszacharidok használata gyakran nem következetes, és ugyanazt a megnevezést elõfordulhat, hogy különbözõ vegyületekre vagy készítményekre alkalmazzák. A felvett prebiotikumok által stimulált, és ezáltal egészségügyi szempontból hasznos jól ismert bakté-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
riumok a tejsavbaktériumok, például a lactobacillusok és a bifidobacteriumok. Beszámoltak például az inulin és az inulinszerû fruktánok, például az oligofruktóz bélmûködésre gyakorolt kedvezõ hatásáról (Jenkins és munkatársai, 1999, J. Nutrition 129, 1431S–1433S), ami feltételezhetõen ezek úgynevezett bifidogén aktivitásának, vagyis a teljes bifidobacteriummennyiség szaporodása szelektív elõsegítésének köszönhetõ, ezen hatás mérésére pedig vagy a székletbeli bifidobacteriumok számának in vivo megállapítása, vagy in vitro meghatározás alkalmazható [lásd például Roberfroid, Am. J. Clin Nutr 2001, 73(suppl), 406S–409S]. Az anyatejet is bifidogén hatásúnak tartják, mivel az anyatejjel nevelt csecsemõkben a bifidobacteriumok válnak dominánssá. Ezzel szemben a tejpótló tápszerrel nevelt csecsemõk bélflóráját nem bifidobacteriumok dominálják, az baktériumfajokban gazdagabb (Harmsen és munkatársai, 2000, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30, 61–67). Feltételezik, hogy az anyatejben található oligoszacharidok felelõsek a bifidogén vagy prebiotikus hatásért, ezért erõfeszítéseket tettek annak érdekében, hogy a tejpótló tápszerek összetételét úgy módosítsák, hogy az a lehetõ legközelebb álljon az anyatejéhez, közelebbrõl, hogy az anyatejjel megegyezõ, vagy ahhoz nagyon hasonló prebiotikus hatással rendelkezzen. Ezt csecsemõ tejpótló tápszerek prebiotikumokkal történt kiegészítésével érték el (Boehm és munkatársai, Acta Paediatr. Suppl. 2003, 441, 64–67 és Moro és munkatársai, 2002, J Pediatr Gastroenterol Nutr 34, 291–295). Például tehéntejalapú tejpótló tápszer transzgalaktooligoszacharidokat (TOSokat) és inulin HP¹t tartalmazó oligoszacharidkeverékkel történt kiegészítése a tápszerrel nevelt csecsemõkben növelte a bifidobacteriumok székletbeli számát (Boehm és munkatársai 2002, Arch Dis Child 86, F178–F181). Csecsemõ tejpótló tápszer TOS-sal és inulinnal történt kiegészítése bifidogén hatásúnak bizonyult, és csökkentette a széklet pH¹ját (Boehm és munkatársai, 2003 lásd fent; Moro és munkatársai 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:77–79; Marini és munkatársai 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:80–81; Boehm és munkatársai, 2002, Arch. Dis. Child Fetal Neonata. Ed. 86:F178–F181; Moro és munkatársai 2002, J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291–295; Schmelzle és munkatársai, 2003, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36:343–51). A prebiotikumok tejsavbaktériumok által végzett fermentálása során szerves savak keletkeznek, és csökken a pH. A lactobacillusok tejsavat vagy tejsavat és acetátot (rövid láncú zsírsavat, SCFA¹t) termelnek. A tejsav L¹ vagy D¹izomer lehet; ezzel szemben a bifidobacteriumok L¹tejsavat és acetátot termelnek, D¹tejsavat viszont nem. A bifidobacteriumok (és más tejsavbaktériumok) aktivitása rendszerint nem idéz elõ például H2¹ vagy CH4-gáz-képzõdést. Nem termelnek továbbá egyéb SCFA-kat, például propionátot, butirátot, izobutirátot, valerátot és izovalerátot. Az SCFA¹k, például izobutirát és izovalerát jelenléte a szénhidrátok más baktériumfajok, például clostridiumok, Bacteroides vagy az Enterobacteriaceae családba tartozó egyéb fa-
1
HU 004 967 T2
jok általi fermentálására utal, vagy proteinek fermentációját jelzi (amire a bifidobacteriumok csak korlátozottan alkalmasak). Egyéb bélbaktériumok is képesek acetát vagy tejsav elõállítására, ilyenek a propionibacteriumok, az enterococcusok és a pediococcusok. Korábban beszámoltak arról, hogy bizonyos prebiotikus szénhidrátok felvétele növeli a bifidobacteriumok és/vagy lactobacillusok (relatív) mennyiségét. Ezzel egyidejûleg fokozott SCFA-képzõdést és pH¹csökkenést figyeltek meg. Emellett azonban a prebiotikumok, például az inulin vagy GOS táplálékhoz adásakor nemkívánatos tünetekhez, flatulenciához és hasi fájdalomhoz vezetõ fokozott gázképzõdés is jelentkezett. Mindezeken túl nemcsak az acetát, hanem például a butirát mennyiségének fokozódásáról is beszámoltak, ami nemkívánatos fejlemény. Mindezek alapján bizonyos prebiotikumokkal kiegészített táplálék elfogyasztása különféle nemkívánatos hatásokhoz vezetett. Az anyatejjel nevelt csecsemõk vastagbelében és székletében a domináns SCFA az acetát, de ezekben a mintákban magas koncentrációban fordul elõ laktát is. Ezek a (relatív) mennyiségek magasabbak, mint felnõttekben (akik esetében a laktátkoncentráció rendszerint elhanyagolhatóan alacsony), vagy a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõkben megfigyeltek. Ennek következtében az anyatejjel nevelt csecsemõk vastagbelében és székletében a propionát és különösen a butirát mennyisége jóval alacsonyabb, mint felnõttekben, és alacsonyabb a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél tapasztalható mennyiségeknél is. Az anyatejjel nevelt csecsemõk székletének pH¹ja a legalacsonyabb. Amint a fentiekben említettük igény mutatkozik tápszerkészítmények, különösen tejpótló tápszerkészítmények iránt, amelyek elfogyasztása az anyatejjel nevelt csecsemõkéhez nagyban hasonló bélbeli mikroflóra kialakulásához vezet. Az SCFA¹k és a laktát, valamint az alacsony vastagbélbeli pH számos egészségügyi hatásáról beszámoltak már. Az alacsony pH és a szerves savak jelenléte a beszámolók szerint patogénellenes hatással bír, valamint elõnyhöz juttatja a savtoleráns baktériumokat, például a tejsavbaktériumokat (ideértve a bifidobacteriumokat). Az SCFA¹k bélfalra gyakorolt hatásáról is beszámoltak korábban. Az SCFA¹k energiaforrást jelentenek a vastagbél-nyálkahártya hámsejtjeinek, így elõsegítik a bélfalbeli védõgát egységét. Az SCFA¹k hatással vannak a perisztaltikus mozgásokra, az epesavak metabolizmusára, a vízabszorpcióra és a sejtdifferenciálódásra (lásd például EP1105002 számú európai szabadalmi bejelentés). Az SCFA¹k ismereteink szerint stimulálják a nyálkaképzõdést, szerepet játszanak az ásványi anyagok felszívásában és a nyálka termelésében is. A korábban nem közölt WO 2005/039319 számú nemzetközi közzétételi irat Bifidobacterium breve¹t, galaktooligoszacharidokat és polifruktózt tartalmazó készítményeket mutat be, amelyek jótékony hatással voltak immunológiai rendellenességekre, például allergiára, ekcémára vagy atópiás megbetegedésre.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
A korábban nem közölt WO 2005/039597 számú nemzetközi közzétételi irat savas oligoszacharidokat és két különbözõ neutrális oligoszacharid, például galaktooligoszacharid- és polifruktóztartalmú készítményeket mutat be, amelyek jótékony hatással voltak immunrendszerrel kapcsolatos rendellenességekre, például allergiára, ekcémára vagy atópiás megbetegedésre. A találmány szerinti megoldás részletes ismertetése Azt a meglepõ felfedezést tettük, hogy GOS (különösen a TOS) és polifruktóz (különösen az inulin) együtt adagolva számos jótékony hatást fejt ki, amelyek nem magyarázhatók a bélbeli bifidobacteriumok számának növekedésével, és amelyek ennélfogva nem a TOS vagy az inulin HP esetében a tudomány jelenlegi állása szerint leírt bifidogén hatásnak köszönhetõk (lásd például Boehm és munkatársai, 2002, fentebb). Közelebbrõl, azt a meglepõ felfedezést tettük, hogy GOS és polifruktóz keverékek beadását követõen csecsemõkben nõtt az SCFA¹k képzõdött összmennyisége, nõtt az acetát és laktát relatív mennyisége, és csökkent a széklet pH¹ja, ugyanakkor ezek a hatások nem álltak arányban a bifidobacteriumok számának (relatív) növekedésével. Az SCFA¹k mennyiségének jótékony hatású emelkedése és kedvezõ összetételük, valamint a laktátkoncentráció emelkedése mellett csökkenõ gázképzõdést tapasztaltunk. Mindemellett a laktátnak a vastagbélre gyakorolt, mind ez idáig ismeretlen jótékony hatásáról is beszámoltunk, ugyanis kimutathatóan fokozta a prosztaglandin E1 és prosztaglandin E2 szekrécióját. Errõl a hatásról korábban csak SCFA¹k, elsõsorban acetát esetében számoltak be (Willemsen és munkatársai, 2003, Gut 52, 1442–1447). A laktátot és a laktáttermelést fokozó prebiotikumokat tartalmazó készítmények mindezek alapján igénybe vehetõk a nyálkatermelés fokozására és a nyálkahártya védõrétege épségének támogatására (nyálkavédelemre). Kimutattuk a laktátról, hogy csökkenti a vastagbélizmok spontán összehúzódásait és feszülését, ami csökkenti a görcskészséget és a fájdalmat. A találmány szerinti prebiotikus készítmények újnak tekinthetõk, abban az értelemben, hogy nem, vagy nem lényeges mértékben fokozzák a bifidobacteriumok számát, ezzel szemben növelik az összes SCFA mennyiségét, elõnyösen módosítják az SCFA-összetételt (növelik az acetát és csökkentik a butirát és propionát mennyiségét), növelik a tejsav mennyiségét (ebbõl eredõen görcs- és feszüléscsökkentõ hatással és nyálkatermelést fokozó hatással bírnak), csökkentik a széklet pH¹ját, csökkentik a gázképzõdés mértékét, fokozatosabb SCFA-képzõdést okoznak (ideértve a vastagbél távolabbi szakaszaiban történõ SCFA-képzõdést), vagyis összességében fermentációs termékek optimális összetételét eredményezik (több L¹laktát, kevesebb butirát stb.). Mindezek a változások a vastagbélbeli környezetet hasonlatosabbá teszik az anyatejjel nevelt csecsemõkéhez. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány tárgyát GOS és polifruktóz keverékek hatékony mennyiségekben az anyatejjel nevelt
1
HU 004 967 T2
csecsemõkéhez alapvetõen hasonló vastagbélbeli környezetet kialakító készítmények elõállítására történõ alkalmazása képezi. Az elõnyös hatások lényegesen kifejezettebbek voltak együttes beadás esetén, ahhoz képest, amikor GOS vagy polifruktóz (például TOS vagy inulin) különálló beadására került sor, mindez a GOS és polifruktóz közötti szinergizmusra utal. Ez idáig nem végeztek olyan vizsgálatokat, ahol a TOS és inulin önálló adagolásának hatását közvetlenül e két vegyülettípus együttes adagolásának hatásával hasonlították volna össze, az ilyen különálló vizsgálatok értelemszerûen nem hasonlíthatók össze egymással, és alkalmatlanok szinergista hatások kimutatására. A GOS és polifruktóz (például TOS és inulin) újonnan kimutatott szinergista kölcsönhatása, és együttes beadásuk in vivo hatásai a GOS¹t és polifruktózt megfelelõ (szinergista) mennyiségben tartalmazó készítmények új alkalmazásai elõtt nyitják meg az utat, ilyenek például a kólika és/vagy hasi görcsök, haspuffadás, flatulencia, hasi fájdalom, székrekedés, IBS, IBD, allergia gyógykezelése és/vagy megelõzése, valamint a bélnyálkahártya fokozott védelme. Mindezek mellett laktátot (D¹laktátot és/vagy L¹laktátot, elõnyösen L¹laktátot) tartalmazó készítmény is alkalmazható az említett tünetek vagy rendellenességek kezelésére vagy megelõzésére. Mindezek alapján a prebiotikumok (GOS és polifruktóz) specifikus keverékeinek bélflóra általi fermentációja nem várt módon fokozott és kinetikailag elõnyös SCFAés laktátképzõdéshez, valamint kedvezõbb összetételû végtermékhez vezet. Ez számos kedvezõ hatást eredményez, ilyenek például a nyálkatermelésre gyakorolt hatás, a gyulladáscsökkentõ hatások, a fájdalomérzetre és a hasi görcsökre/kólikára gyakorolt hatások (utóbbiak a vastagbél relaxációján és a spontán összehúzódásainak csökkentésén keresztül alakulnak ki). Az ezeket a prebiotikus keverékeket tartalmazó táplálékkészítmények alkalmazhatók továbbá bélproblémákban, például IBD-ben vagy IBS-ben szenvedõ, vagy hiányos táplálkozás miatt gyengébb integritású bélbeli védõréteggel rendelkezõ felnõttek kezelésére is. Meghatározások „Poliszacharidok” alatt monoszacharidegységekbõl felépülõ, legalább 10 egység hosszúságú szénhidrátláncokat értünk. Ezzel szemben az „oligoszacharidok” lánchosszúsága tíz egységnél kisebb. A „polimerizáció foka” vagy „DP” meghatározás egy oligo- vagy poliszacharidlánc szacharidegységeinek összmennyiségét jelöli. Az „átlagos DP” egy készítmény oligoszacharid vagy poliszacharid láncainak átlagos DP¹jét jelöli, az esetleg jelen lévõ (ebben az esetben elõnyösen eltávolításra kerülõ) mono- és diszacharidok figyelembevétele nélkül. A készítmények átlagos DP¹értéke a készítmények megkülönböztetésére használható. Emellett az elkülönítést segíti a szacharidegységek százalékos mennyisége, például a glükózvagy fruktózegységek egy készítményen belüli százalékos aránya is.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
A „polifruktóz” vagy „polifruktán” vagy „fruktopoliszacharid” megnevezés b¹kapcsolt fruktózegységekbõl álló láncot tartalmazó, 10 vagy nagyobb értékû polimerizációval rendelkezõ poliszacharid szénhidrátot jelöl, ilyenek például az inulin (például az inulin HP), a leván és/vagy a „vegyes típusú polifruktán” (lásd lentebb). Az „inulin” vagy „nem hidrolizált inulin” vagy „inulin HP” megnevezés glükózvégû fruktózláncokat jelöl, ahol a láncok többsége (legalább 90%¹a, elõnyösen legalább 95%¹a) esetében a polimerizáció foka (DP) 10 vagy magasabb. Az inulin ennek megfelelõen a GFn képlettel írható le, ahol a G glikozilegységet, az F fruktozilegységet jelöl, az n pedig az egymáshoz kapcsolódó fruktozilegységek számát jelenti, amelynek értéke 9 vagy több. A G/F arány körülbelül 0,1 és 0 közötti. Az inulinmolekulák kis hányada ugyanakkor nem rendelkezik terminális glükózegységekkel. Az átlagos DP elõnyösen legalább 15, elõnyösebben 20 vagy több, például 20, 21, 22, 23, 25, 30, 40, 60, 70, 100, 150 vagy több. Az inulinban a fruktózegységek b(2®1) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. Megfelelõ inulin például a kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ Raftiline®HP (Orafti), amelynél az átlagos DP >23. A „hidrolizált inulin” vagy „oligofruktóz” megnevezés glükóz- és fruktózvégû fruktózláncokat jelöl, amelyek DP¹je 10 alatti. Ennek megfelelõen a hidrolizált inulin GFn láncok és Fn láncok keveréke (ahol a G glikozilegység, az F fruktozilegység és az n=1–8). A hidrolizált inulin az inulin (enzimes vagy savas) hidrolízisének vagy részleges hidrolízisének terméke, a b(1–2) fruktozil-fruktóz-kötések hasításának eredménye. A hidrolizált inulin megnevezés magában foglalja az azonos szerkezeti felépítéssel rendelkezõ, szintetikus vagy rekombináns úton elõállított inulint is. A „leván”, vagy „levulán”, vagy „levulin”, vagy „levulozán” megnevezések b(2®6) kötésekkel összekapcsolt fruktózegységekbõl felépülõ polifruktózt tartalmazó poliszacharidot jelölnek. A molekula tartalmazhat egy kezdõ glükózgyököt is, de ez nem szükségszerû. A polimerizáció foka 10 feletti. A „vegyes típusú polifruktánokban” a fruktózegységeket b(2®1) és b(2®6) kötések kapcsolják össze. A vegyes típusú polifruktánok elágazó láncú molekulák, esetükben a DP >10. A „GOS”, vagy „galaktooligoszacharidok”, vagy „transzgalaktooligoszacharidok”, vagy „TOS” megnevezés galaktózegységekbõl felépülõ oligoszacharidokra utal, amelyek esetében a DP 10 vagy kevesebb, az átlagos DP pedig 2, 3, 4, 5 vagy 6. A lánc redukáló végén glükózegység is jelen lehet. A GOS elõnyösen legalább 2/3 arányban galaktózegységeket tartalmaz. Legelõnyösebbek a b¹(1–4) glikozidkötésekkel rendelkezõ transzgalaktooligoszacharidok (TOS¹ok). Ilyen például a Vivinal®GOS-ban (kereskedelmi forrása a Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia) található, b¹(1–4) glikozidkötéseket és b¹(1–6) glikozidkötéseket tartalmazó transzgalaktooligoszacharidokból álló GOS. Az „SCFA” vagy „rövid láncú zsírsavak” megnevezés legfeljebb C6 hosszúságú szénlánccal rendelkezõ, bélbeli bakteriális fermentáció végtermékeként keletke-
1
HU 004 967 T2
zõ zsírsavakat jelöl, ilyenek az acetát (C2), a propionát (C3), a butirát és izobutirát (C4), a valerát és izovalerát (C5) stb. Az „iC4–5” kifejezés összefoglalóan izobutirátot, valerátot és izovalerátot jelöl. A „szinergizmus szempontjából hatékony mennyiség” GOS és polifruktóz (például TOS és inulin) olyan mennyiségeire utal, amelyek együttesen beadva egy (vagy több) specifikus (e leírásban máshol részletezett) élettani hatást váltanak ki, ahol az együttes beadás teljes hatása szignifikánsan nagyobb mértékû, mint a GOS és polifruktóz külön-külön történõ alkalmazásának eredményeként létrejövõ hatások összege. Így például ha a GOS önálló alkalmazásának hatása X értékû, a polifruktózé pedig Y, akkor a GOS és a polifruktóz együttes alkalmazásának hatása nagyobb, mint X+Y, és például a GOS 1/2 mennyisége és a polifruktóz 1/2 mennyisége együttes alkalmazásának hatása nagyobb, mint 1/2X+1/2Y stb. Két vagy több anyag együttes beadása alatt ezen anyagok egyazon egyednek, vagy egy készítményben, vagy különálló készítményekben (részekbõl álló kittel, kombinált készítményként), egyazon idõpontban (szimultán) vagy rövid idõn belül (elkülönített vagy szekvenciális alkalmazás, például perceken vagy órákon belül) történõ beadását értjük. „Enterális” beadás alatt közvetlenül egy páciens gyomor-bél rendszerébe (például orálisan, szondán, katéteren vagy sztómán keresztül) történõ beadást értünk. A „magában foglalja” kifejezés adott részek, lépések vagy összetevõk jelenlétét határozza meg, de nem zárja ki egy vagy több további rész, lépés vagy összetevõ jelenlétét. „Csecsemõ” alatt 0–36 hónapos életkorú, elõnyösen 0–18 hónapos életkorú, vagy még elõnyösebben 0–12 hónapos életkorú embert értünk. Az „anyatejjel táplált csecsemõk” meghatározás kizárólag emberi anyatejjel táplált csecsemõkre vonatkozik. A „nem vagy részben anyatejjel táplált csecsemõk” meghatározás nem kizárólag emberi anyatejjel táplált csecsemõket jelöl. Idetartoznak a legalább napi egy üveg (körülbelül 80 ml) tejpótló tápszert fogyasztó csecsemõk is. A „százalék” vagy „átlag” kifejezések ellenkezõ értelmû meghatározás, vagy nyilvánvalóan más számítási alap hiányában általában tömegszázalékra vagy ¹átlagra vonatkoznak. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány tárgyát GOS¹t és polifruktózt megfelelõ (szinergizmus szempontjából hatékony) mennyiségben tartalmazó készítmények új felhasználásai képezik. A találmány szerinti alkalmazások és eljárások A találmány szerinti különbözõ alkalmazásokban a páciens elõnyösen emberi páciens, még elõnyösebben csecsemõ, például újszülött vagy legfeljebb 12 hónapos életkorú csecsemõ. A páciensek elsõsorban részben vagy egészen tejpótló tápszerrel táplált csecsemõk. Alternatív módon a páciens kisgyermek, tizenéves vagy felnõtt is lehet. A találmány szerinti készít-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
mények alkalmazása bélpanaszok kezelésére és/vagy megelõzésére vehetõ igénybe, ilyenek például, de nem kizárólag a gyulladásos bélbetegség (IBD), az irritábilis bél szindróma (IBS), a flatulencia, a hasi görcsök, a kólika, a haspuffadás, a hasi fájdalom stb., amelyek kimerültséget, depressziót vagy levertséget is okozhatnak. Mindemellett a nyálkatermelés is fokozható, illetve a bél optimálistól elmaradó mûködésébõl eredõ allergiás panaszok is megelõzhetõk vagy kezelhetõk a segítségükkel. Alkalmazásukkal például a hiányos táplálás, mûtéti beavatkozás, kemoterápia miatt gyengült bélvédekezõképességû betegekben a bél gát funkciója is javítható. A GOS¹t és polifruktózt, például TOS¹t és inulint tartalmazó készítmények a találmány egy megvalósítási módjában egy páciens vastagbelében történõ SCFAtermelés indukálására és a beadás eredményeként az SCFA¹k (bélbeli és/vagy székletbeli) összmennyiségének lényeges mértékû emelésére, és/vagy a termelt (bélbeli és/vagy székletbeli) SCFA¹k relatív mennyiségének lényeges mértékû módosítására, közelebbrõl az összes SCFA¹n belül a (bélbeli és/vagy székletbeli) acetát relatív mennyiségének növelésére, és/vagy a bélben termelt laktát (abszolút és relatív) mennyiségének lényeges mértékû emelésére, és/vagy a bélbeli gáztermelés lényeges mértékû csökkentésére vagy megelõzésére, és/vagy az SCFA-termelésnek a vastagbél távoli szakaszaira történõ kiterjesztésére, és/vagy a vastagbélbeli pH és a széklet pH lényeges mértékû csökkentésére alkalmazhatók. Mindemellett a bélbeli és/vagy székletbeli butirát, izobutirát, valerát és/vagy izovalerát összes SCFA-hoz viszonyított összmennyisége is csökkenthetõ. Mindezek a hatások a készítmény beadását követõen, a bélbeli bifidobacteriumok összmennyiségére és/vagy relatív mennyiségére gyakorolt lényeges mértékû hatás nélkül érhetõk el. A találmány tárgyát képezik az említett, egy vagy több bélbeli hatás által elõidézett vagy azzal kapcsolatos bármely megbetegedés, rendellenesség vagy kellemetlenség kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmények. A találmány tárgyát galaktooligoszacharidok és polifruktóz hasi puffadás, gázképzõdés, hasi fájdalom és/vagy flatulencia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egy további megvalósítási módban a találmány tárgyát galaktooligoszacharidok és polifruktóz allergia, ekcéma vagy atópiás megbetegedések kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egy további megvalósítási módban a találmány tárgyát galaktooligoszacharidok és polifruktóz kólika kezelésére és/vagy megelõzésére, és/vagy a vastagbél összehúzódásainak, elõnyösen tonikus és/vagy fázikus összehúzódásainak elernyesztésére szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egy további megvalósítási módban a találmány tárgyát galaktooligoszacharidok és polifruktóz irritábilis bél szindróma vagy gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egy még to-
1
HU 004 967 T2
vábbi megvalósítási módban a találmány tárgyát galaktooligoszacharidok és polifruktóz a bél gát funkciójának fokozására és/vagy a vastagbélbeli nyálkatermelés fokozására szolgáló készítmény elõállítására történõ alkalmazása képezi. Egyéb meghatározás hiányában a (például SCFA, acetát vagy laktát mennyiségének) „lényeges mértékû növelése” jelen leírásban a GOS vagy polifruktóz (például inulin) külön-külön történt beadásának hatására képzõdõ mennyiséghez képest legalább 5%¹os, elõnyösen legalább 10%¹os, még elõnyösebben legalább 20%¹os vagy nagyobb mértékû növelést jelent. Hasonlóképpen, egyéb meghatározás hiányában a (például képzõdött gáz mennyiségének) „lényeges mértékû csökkenése” jelen leírásban a polifruktóz (például inulin) külön történt beadásának hatására képzõdõ mennyiséghez képest legalább 5%¹os, elõnyösen legalább 10%¹os, még elõnyösebben legalább 20%¹os, 25%¹os, 50%¹os vagy nagyobb mértékû (például 70%¹os, 80%¹os, 90%¹os vagy 100%¹os) csökkenést jelent. A GOS- és polifruktózkészítmények fermentációs termékeként keletkezõ SCFA-összmennyiség növekedése a páciensek széklet pH¹értékeinek lényeges mértékû csökkenése alapján is meghatározható, utóbbi a vastagbélbeli pH in vivo csökkenésére utal. Csecsemõkben megállapítottuk, hogy a széklet pH¹értéke körülbelül pH=5,8¹re vagy az alá csökkent, így pH=5,6, 5,5, vagy 5,4, vagy 5,2 értéket ért el TOS és polifruktóz (például inulin) együttes adagolását követõen, míg a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél a pH 6 környékén vagy a felett volt, így például 5,9, 6,8 vagy akár 7,0 is volt. A pH¹érték lényeges mértékû csökkenése ennélfogva a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõknél mért értékekhez képest legalább 15%¹os, vagy 0,9 egységet kitevõ csökkenést jelent. A GOS és polifruktóz megfelelõ mennyiségekben együttesen történõ beadásának további elõnyös következménye az, hogy az SCFA¹k összetétele lényeges mértékben különbözik attól, ami a GOS vagy polifruktóz külön-külön történt beadásakor tapasztalható. Különösen a butirát relatív mennyisége csökken lényeges mértékben, míg az acetát relatív mennyisége lényeges mértékben nõ. A készítmények ennek megfelelõen nemcsak az SCFA¹k teljes mennyiségének, hanem azok relatív arányának megváltoztatására is alkalmazhatók. A TOS-sal és polifruktózzal (például inulinnal) együttesen kezelt csecsemõkben a relatív SCFAmennyiségek az anyatejjel táplált csecsemõknél tapasztalt értékekhez hasonlítottak, így náluk az acetát:propionát:butirát arányok általában körülbelül 80–85%:10–15%:1–5% körül alakultak, míg a standard tejpótló tápszerrel táplált csecsemõk esetében az említett arányok általában 69–74%:16–19%:5–6% voltak (lásd a példákat). Ennek megfelelõen a találmány szerinti készítmények elsõsorban az acetát relatív mennyiségét fokozták és a propionát, valamint a butirát relatív mennyiségét csökkentették. A GOS és polifruktóz együttes beadása olyan acetát:propionát:butirát arányokat eredményez, amelyek sokkal jobban hasonlíta-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
nak az anyatejjel táplált csecsemõkben, mint a tejpótló tápszerrel táplált csecsemõkben tapasztaltakra (utóbbiakban nagy mennyiségû butirát és propionát mellett viszonylag alacsonyabb mennyiségû acetát termelõdik). Az SCFA¹k relatív arányára gyakorolt hatás szakember számára ismert eljárásokkal mérhetõ, így például a beadás után különbözõ idõpontokban nyert székletminták gázkromatográfiás vizsgálatával in vivo kísérletekben, vagy in vitro fermentációs rendszerek alkalmazásával, például a példákban leírt módon. A „lényeges mértékben módosított SCFA-összetétel”, vagy a „lényeges mértékben megnövelt acetátmennyiség” az acetát (az összes SCFA %¹ában) legalább 4%, 5%, 10%, 15% vagy nagyobb mennyiségére utal, ami több annál, amikor nem kerül sor GOS vagy polifruktóz beadására, vagy amikor a GOS és a polifruktóz beadása külön-külön történik. Elõnyösen a propionát és/vagy butirát relatív mennyiségei alacsonyabbak annál, amikor nem kerül sor GOS vagy polifruktóz beadására, vagy amikor a GOS és a polifruktóz beadása külön-külön történik. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány szerinti készítmény alkalmas arra, hogy a bélbeli és/vagy székletbeli acetát mennyiségét az összes SCFA több mint körülbelül 85%-ára, így például 86%-ára, 87%-ára, 88%-ára, 90%-ára vagy még magasabb hányadra emelje. A GOS és polifruktóz együttes beadásának egy további megfigyelt elõnyös hatása az elágazódó SCFA¹k mennyiségének lényeges mértékû csökkenése a csak GOS vagy csak polifruktóz beadását követõen tapasztalható arányukhoz képest. Az „elágazódó SCFA¹k mennyiségének lényeges mértékû csökkenése” alatt a prebiotikumokkal nem kezelt csecsemõkben megállapított koncentrációhoz képest legalább 70%¹os csökkenést, vagy az összes SCFA kevesebb mint 1,5%¹át kitevõ székletbeli arányt eredményezõ csökkenést értünk. Az elágazódó SCFA¹k összes SCFA-hoz viszonyított arányát megkaphatjuk, ha az elágazódó SCFA¹k, vagyis az izobutirát plusz az izovalerát plusz a valerát mennyiségét elosztjuk az összes SCFA, vagyis az acetát plusz propionát plusz butirát plusz izobutirát plusz izovalerát plusz valerát stb. mennyiségével. Az elágazódó SCFA¹k arányának csökkentése elõnyös a páciens egészsége szempontjából, mivel az elágazódó SCFA¹k káros hatásúak. Ez csökkent mértékû proteindegradációt jelent, ami nemkívánatos jelenség, mivel a proteinfermentáció növeli a pH¹t, és káros anyagok, például H2S kialakulásához vezet. A butirát mennyiségének lényeges mértékû csökkenése alatt a prebiotikumokkal nem kezelt csecsemõkben megállapított koncentrációhoz képest legalább 50%¹os csökkenést, vagy az összes SCFA kevesebb mint 4%¹át kitevõ székletbeli arányt eredményezõ csökkenést értünk. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány szerinti készítmény alkalmas arra, hogy a bélbeli (és/vagy székletbeli) butirát, izobutirát, valerát és izovalerát összmennyiségét az összes SCFA kevesebb mint körülbelül 7%¹ára, így például 6,5%-ára, 6%¹ára, 5%¹ára, 4%¹ára vagy még alacsonyabb hányadára csökkentse.
1
HU 004 967 T2
A találmány egy további megvalósítási módjában a GOS- és polifruktóztartalmú készítmények alkalmasak a fermentáció vastagbélbeli hosszának megnövelésére. Közelebbrõl, az együttes beadást követõen a bakteriális fermentáció a vastagbél legtávolabbi szakaszaiban is aktív marad, amit a vastagbél disztális szakaszaiban kimutatható SCFA-termelés igazol. A csak GOS¹t vagy csak polifruktózt tartalmazó készítmények beadását követõen SCFA nem, vagy csak nagyon kis mennyiségben termelõdik a vastagbél disztális részében. Együttes beadásukat követõen mindemellett a vastagbél elején gyors fermentáció következik be, ez az anyatejjel táplált csecsemõkben is megfigyelhetõ jelenség különösen fontos a kórokozó-ellenes hatás szempontjából. Mindezek arra utalnak, hogy a találmány szerinti készítmények alkalmasak viszonylag egyenletes fermentációs mintázat kialakítására és/vagy fenntartására egy páciens vastagbelében, illetve a fermentációnak és az SCFA-termelésnek a vastagbél disztális szakaszára történõ kiterjesztésére. Ennek köszönhetõen az SCFA és minden valószínûség szerint egyéb fermentációs termékek, különösen a laktát termelése a vastagbél egész területén, annak kezdeti, középsõ és végsõ szakaszában egyaránt végbemegy. A találmány egy további megvalósítási módjában szinergista mennyiségû GOS és polifruktóz együttes beadása a laktáttermelés lényeges mértékû megnövelésére is alkalmas, ami a kísérleti alanyok és a csak GOS-sal, vagy csak polifruktózzal, vagy egyenértékû, prebiotikum nélküli vivõanyagokkal kezelt kontrollalanyok székletmintáinak elemzésével igazolható. A „lényeges mértékben megnövelt laktáttermelés” kifejezés arra utal, hogy GOS- és polifruktóztartalmú készítményekkel egy idõben kezelt páciensekben a GOS- vagy polifruktózkezelésben nem részesült páciensekhez képest legalább 5%¹kal, 10%-kal, 20%-kal, vagy akár 50% vagy több százalékkal nagyobb mennyiségû laktát termelõdik. Például 6 g/l TOS/inulin keverékkel (90%:10%) kiegészített standard tejpótló tápszerrel táplált csecsemõk 16 hetes életkorukban (az összes sav százalékában kifejezve) körülbelül 16% laktátot termeltek, míg a standard tejpótló tápszerrel etetett csecsemõk körülbelül 0,6%¹ot, az anyatejjel táplált csecsemõk pedig körülbelül 35%¹ot. Bár nem érte el az anyatejjel táplált csecsemõk által termelt laktát mennyiségét, de a standard tejpótló tápszer TOS és inulin keverékekkel történt kiegészítése lényeges mértékben megnövelt laktáttermelést eredményezett. Amint a példákban bemutatjuk, a laktát nem várt jótékony hatásokkal rendelkezik. Az acetáthoz hasonlóan fokozta a prosztaglandin E1¹ és prosztaglandin E2¹termelést, ami megnövelt hámbeli nyálkaképzõdést eredményezett. A bélnyálkahártya jelentõs szerepet játszik a humán egészségben, mivel gátat jelent fertõzõ kórokozók, allergének és rákkeltõ anyagok számára. A nyálkahártya fejlõdését és/vagy integritását pozitívan befolyásoló készítmények ez alapján igénybe vehetõk újszülött csecsemõk egészséges nyálkahártyája kialakulásának elõsegítésére, tejpótló tápszerrel nevelt vagy részben tejpótló
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
tápszerrel nevelt csecsemõk, valamint nem megfelelõen funkcionáló bélnyálkahártya miatt vagy azzal kapcsolatban kialakuló tünetektõl vagy megbetegedésekben szenvedõ páciensekben az egészséges nyálkahártyája kialakításának elõsegítésére. Így kezelhetõk vagy megelõzhetõk bizonyos bélproblémák, például a gyulladásos bélbetegség (IBD, például a colitis vagy a Crohnbetegség), vagy az irritábilis bél szindróma (IBS), vagy csökkenthetõ a kórokozók nyálkahártyához tapadása és/vagy azon történõ átjutása, vagy megelõzhetõk, vagy csökkenthetõk egyéb immunológiai problémák, például az asztma kialakulása. Mindemellett a bél gát integritás hiányos táplálás, mûtéti beavatkozás vagy kemoterápia stb. eredményeként kialakuló elvesztése is megelõzhetõ vagy csökkenthetõ. Mindezeken túl D¹ vagy L¹laktát beadását követõen dózisfüggõ módon lényeges mértékben csökkentek a spontán kontrakciók és a hasi feszülés. A találmány szerinti készítmények ennek megfelelõen igénybe vehetõk a bélbeli laktátmennyiség fokozására, ezáltal olyan tünetek kezelésére vagy megelõzésére, mint a hasi fájdalom, a kólika, a hasi kontrakciók és a hasi feszülés stb. Mivel a laktátnak korábban ismeretlen hatásait tártuk fel, a találmány tárgyát képezik megfelelõ mennyiségben laktátot tartalmazó készítmények, amelyek alkalmasak lehetnek a fentiekben említett tünetek és rendellenességek kezelésére vagy megelõzésére. A találmány egyik megvalósítási módját csak megfelelõ mennyiségû laktátot tartalmazó készítmények képezik, míg egy további megvalósítási módjában a találmány szerinti GOS- és polifruktózkészítmények a bélbeli laktátmennyiség további növelésének céljával laktátot is tartalmaznak. Egy ilyen találmány szerinti készítmény szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségû TOS és inulin mellett megfelelõ mennyiségû laktátot is tartalmaz. A találmány egy megvalósítási módját olyan készítmények képezik, amelyek alkalmasak a bélbeli és/vagy székletbeli laktát mennyiségének körülbelül 10 mmol/kg széklet fölé emelésére. A székletminták elemzésével kapcsolatban figyelembe kell venni, hogy az csak az aktuális in vivo hatás indirekt mérésére alkalmas. Ehhez hasonlóan in vitro vizsgálati eljárások is végezhetõk, ahol baktériumpopulációkat in vitro szaporítunk, és a tenyészetekhez a készítmények megfelelõ mennyiségét adagoljuk. Közelebbrõl, a példákban bemutatott in vitro fermentációs rendszer is igénybe vehetõ erre a célra. A GOS- és polifruktóztartalmú készítmények együttes beadása mindezek alapján a következõ élettani hatások közül egy vagy több elérésére vehetõ igénybe: – az összes SCFA-mennyiség lényeges mértékû emelése, – lényeges mértékû pH¹csökkentés, – lényeges mértékben módosított SCFA-összetétel, – az elágazódó SCFA¹k mennyiségének lényeges mértékû csökkentése, – az egy mol elõállított SCFA¹ra jutó gázképzõdés lényeges mértékû csökkentése,
1
HU 004 967 T2
– tovább tartó és egyenletesebb fermentáció, ideértve a vastagbél legtávolabbi pontjain bekövetkezõ fermentációt, és/vagy – nagymértékû kezdeti SCFA-termelés és/vagy tejsavtermelés a vastagbél kezdetén, – SCFA-termelés elõsegítése a vastagbél kezdeti, középsõ és végsõ szakaszában, – tejsavmennyiség (abszolút és/vagy relatív) lényeges mértékû növelése és/vagy – a teljes képzõdött tejsavmennyiségen belül az L¹laktát relatív mennyiségének fokozása. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában GOS¹t és polifruktózt egyaránt tartalmazó készítmények alkalmazásakor a felsoroltak közül legalább 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy az összes hatás lényeges mértékben módosul ahhoz képest, amikor csak GOS¹t vagy polifruktózt tartalmazó, vagy sem GOS¹t, sem polifruktózt nem tartalmazó készítmények beadására kerül sor. Közelebbrõl, GOS¹t és polifruktózt (szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben) tartalmazó készítmények alkalmazásakor a felsoroltak közül legalább 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy az összes hatás lényegesen nagyobb mértékû, mint a csak GOS¹t vagy polifruktózt tartalmazó készítmények beadásával kiváltott hatások összessége. A találmány szerinti szinergista hatású készítmények szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben beadva mindezek alapján különösen alkalmasak csecsemõ vastagbelében egészséges mikroflóra kialakítására és/vagy fenntartására. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a csecsemõ táplálása kizárólag egy alapkészítménnyel, például tejpótló tápszerrel történik, amelyet a születés utáni elsõ hetekben GOS és polifruktóz szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségével egészítenek ki. A találmány szerinti megoldás szempontjából elõnyös készítmény ennek megfelelõen csecsemõknek szánt élelmiszer-készítmény. A találmány egy további megvalósítási módjában a csecsemõ táplálása csak részben történik találmány szerinti készítménnyel. A találmány egy megvalósítási módjában a készítményt a következõ tünetek közül egy vagy több kezelésére vagy megelõzésére vesszük igénybe: gázképzõdés, flatulencia, vastagbélgyulladás, haspuffadás, hasi görcsök, hasi fájdalom, IBS, IBD, allergia és/vagy nyálkahártyavédõ szerepben alkalmazzuk. GOS és polifruktóz tehát igénybe vehetõ flatulencia, fokozott gázképzõdés, vastagbélgyulladás, haspuffadás, hasi görcsök, hasi fájdalom, IBS, IBD, allergia, csökkent mûködésû bél gát funkció kezelésére és/vagy nyálkahártya-védelemre szolgáló, egyidejû, elkülönülõ vagy egymást követõ alkalmazásra szánt készítmény vagy kombinált készítmény elõállítására. A páciens ebben az esetben tetszõlegesen lehet csecsemõ, gyermek, tizenéves vagy felnõtt. Egyértelmû, hogy a GOS és polifruktóz szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségével kiegészített alapkészítmények a páciens életkorának, a beadás módjának és a kezelni vagy megelõzni kívánt fõ tüneteknek megfelelõen változnak. Csecsemõk esetében például az alapkészítmény elõnyösen folyékony vagy por alakú
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
csecsemõ- vagy nevelõ tápszer („follow¹on formula”), míg felnõttek esetében alkalmasabb lehet a (folyékony, félfolyékony vagy szilárd) táplálékkiegészítõ készítményben vagy szondán keresztül történõ beadás. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában GOS és polifruktóz szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben, egyidejûleg történõ beadására kerül sor, amely alkalmas a bélbeli SCFA¹k képzõdõ összmennyiségének lényeges mértékû emelésére, és/vagy a bélbeli SCFA-összetétel lényeges mértékû javítására (különösen az acetát összes SCFA-mennyiséghez viszonyított százalékos arányának fokozására), és/vagy a laktáttermelés lényeges mértékû fokozására, és/vagy a bél pH¹csökkentésére, és/vagy a bélbeli gázképzõdés lényeges mértékû csökkentésére. A találmány tárgyát képezi szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségben GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmények alkalmazása kólika, és/vagy hasi görcsök, haspuffadás és/vagy flatulencia, hasi fájdalom, IBS, IBD és/vagy allergia kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány tárgyát képezi továbbá e készítményeknek a nyálkahártya védelmének fokozására és a bél gát funkciójának erõsítésére történõ alkalmazása. Figyelembe kell venni, hogy nem szükségszerûen egy készítményrõl van szó, hanem a GOS¹t és a polifruktózt különálló készítmények is tartalmazhatják, amelyek együttes beadása szinergizmus szempontjából hatékony mennyiséget biztosít. Az SCFA¹k mennyiségében, összetételében és a bél-pH-ban bekövetkezõ változások miatt a találmány szerinti készítmények a következõ elõnyös hatások közül egy vagy több elõidézésére képesek: a) Az SCFA-termelés helyén csökken a bélfal áteresztõképessége. Ez fontos a betegségek megelõzése és az egészség megõrzése szempontjából, különösen az allergiás megbetegedések kialakulásának megelõzése tekintetében. Az a felismerés, hogy a GOS és polifruktóz együttes beadása egyenletesebb fermentációt idéz elõ, és kiterjeszti a fermentáció színterét a vastagbél disztális részére, nagyon fontos ebbõl a szempontból, mivel így a bélfal áteresztõképessége, ideértve a vastagbél disztális részeit, egyenletesen csökkenthetõ, tehát a bél egyenletesen egészséges állapotban tartható. b) A bél motilitása vagy perisztaltikus mozgása fokozódik, ami csökkenti vagy megszünteti a tejpótló tápszerrel táplált csecsemõkben gyakori problémának számító székrekedést. c) A spontán összehúzódások számának és a vastagbélizomzat feszülésének csökkentése kevesebb görcsöt és hasi fájdalmat eredményez. d) Nõ a kalciumionok abszorpciója, ami fontos a páciens csontjainak mineralizációja és kifejlõdése szempontjából, különösen, ha csecsemõ páciensrõl van szó. e) A romló egészségi állapothoz társuló másodlagos tünetek, mint például a kimerültség, a depresszió és a hangulatváltozások is enyhíthetõk. f) A bélnyálkahártya nyálkatermelése lényeges mértékben fokozódik, ami védelmet biztosít a kóroko-
1
HU 004 967 T2
zók megtapadása és kolonizációja ellen. Közelebbrõl, kimutattuk, hogy a laktátmennyiségek pozitív korrelációt mutattak a nyálkatermeléssel. A találmány szerinti készítmények ennek megfelelõen a nyálkatermelés stimulálására is igénybe vehetõk. g) Az epe metabolizmus módosítása az anyatejjel táplált csecsemõkben megfigyelt mennyiséget/mintázatot eredményezhet. h) A bélbeli kórokozó mikroorganizmusok szaporodásának gátlása a vastagbél teljes területén. Egy szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségû GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmény mindezek alapján felhasználható (például újszülött, koraszülött vagy idõre született csecsemõben, vagy részben vagy teljesen tejpótló tápszerrel táplált csecsemõben, vagy más páciensekben, például felnõttekben) a fenti élettani hatások közül egy vagy több fenntartására vagy kialakítására, és egészséges vastagbélbeli környezet és a vastagbél optimális aktivitásának biztosításán vagy kialakításán keresztül a páciens egészségi állapotának fenntartására vagy javítására. Közelebbrõl, egy találmány szerinti készítmény alkalmazásával csökkenthetõk, megszüntethetõk vagy megelõzhetõk különféle megbetegedések, rendellenességek vagy tünetek, így például a kólika és/vagy a hasi görcsök, a haspuffadás és/vagy a flatulencia, a hasi fájdalom, az IBS, az IBD és/vagy az allergia, a bélbeli patogének (például baktériumok, vírusok, gombák) okozta fertõzés, a hasmenés, az ekcéma, az allergiás eredetû asztma vagy egyéb atopiás megbetegedés, és/vagy a székrekedés elõfordulási gyakorisága, idõtartama és/vagy súlyossága. A találmány szerinti készítmények alkalmasak továbbá a vastagbél-kontrakciók, elõnyösen a fázikus és/vagy tonikus összehúzódások elernyesztésére. A találmány szerinti készítmények A fentiekben bemutatott alkalmazásokra megfelelõ készítmények szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségekben tartalmaznak GOS¹t és polifruktózt. A készítmények GOS/polifruktóz aránya 3/97–97/3 közötti, elõnyösen 5/95–95/5 közötti, elõnyösebben 90/10–45/55 közötti. A találmány tárgyát képezi az elõbbiekben említett végpontok közötti összes további lehetséges arány is, így például a 10/90, a 20/80, a 30/70, a 40/60, az 50/50, az 55/45, a 60/40, a 70/30, a 80/20, a 85/15 és a 90/10 stb. Az (optimális) szinergista hatás eléréséhez szükséges adag és GOS/polifruktóz arány a készítmény típusának, a beadás módjának és gyakoriságának függvényében változhat. Az alábbiakban ennek ellenére néhány példát mutatunk be erre vonatkozóan. Szakember könnyen megállapíthatja, hogy az egyes összetevõk milyen dózisára van szükség a legjobb élettani hatás eléréshez, és melyik a legmegfelelõbb GOS/polifruktóz arány. Például ha a fõ cél az SCFA összmennyiségének növelése egy GOS¹t és polifruktózt tartalmazó készítmény szájon át történõ beadását követõen, szakember különféle (GOS¹t és polifruktózt, csak GOS¹t vagy csak polifruktózt tartalmazó) készít-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
ményeket fog elõállítani, majd szakember számára ismert in vivo vagy in vitro vizsgálati eljárásokkal összehasonlítja magas SCFA-mennyiségeket indukáló hatékonyságukat. Megjegyzendõ, hogy a „napi adag”, vagy „adag per nap” kifejezések nem arra utalnak, hogy az adagot egy alkalommal kell a páciensnek beadni. Egy szinergizmus szempontjából hatékony csecsemõtápszer például egy alapkészítménybõl (például standard csecsemõtápszerbõl), és benne körülbelül 4 g/l, 5 g/l vagy nagyobb mennyiségû GOS és polifruktóz keverékbõl áll, ahol a GOS polifruktózhoz viszonyított aránya az itt korában leírtak szerint változhat (például 90% GOS:10% polifruktóz). A polifruktóz például leván és/vagy inulin lehet. A készítményekben felhasznált polifruktóz, így a leván vagy inulin kivonható természetes forrásokból (növényekbõl vagy baktériumokból), vagy elõállítható szakember számára ismert de novo szintézissel, vagy rekombináns DNS-technológiákkal. Az inulin extrakciójára, méretalapú szeparálására és tisztítására szolgáló eljárások leírása megtalálható például a következõ forrásokban: De Leenheer (1996), US 6569488 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, US5968365 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, a rekombináns-elõállításra szolgáló eljárások leírása megtalálható például az US 6559356 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. A szintézishez általában szacharózmolekulák és fruktozil-transzferáz-aktivitással rendelkezõ enzimek szükségesek. A találmány szerinti készítményekben való felhasználásra alkalmas inulin már kereskedelmi forgalomban is beszerezhetõ, ilyen például a Raftiline®HP, Orafti. A növényi eredetû inulinok általában sokkal kisebb fokú polimerizációt mutatnak, mint a bakteriális inulinok (legfeljebb 150, a baktériumokban tapasztalható akár 100 000-rel szemben). Növényi inulinforrások például kétszikû fajok lehetnek, ilyenek például a Compositae (fészkesvirágúak). Fõként gyökerükben, hagymájukban vagy gumójukban viszonylag nagy mennyiségû inulint termelõ fajok például a cikória, a spárga, a dália, a csicsóka, a fokhagyma stb. (lásd Kaur és Gupta, J. Biosci. 2002, 27, 703–714). Mivel az inulin elõnyösen nem tartalmazhat oligofruktózt, hidrolízise kerülendõ, vagy a jelen lévõ oligofruktózt és/vagy mono- vagy diszacharidokat a felhasználás elõtt el kell távolítani. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen elõnyös a legalább 10, 15, 20, 50, 70, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 500 vagy magasabb PD¹értékkel rendelkezõ polifruktóz alkalmazása. Egyes polifruktózok, mint például a levánok a túlságosan hosszú láncokból eredõ viszkozitásproblémák elkerülése érdekében hidrolizálhatók, amennyiben PD¹értékük 10 vagy a feletti marad. Levánok természetes forrásokból, például növényekbõl (például egyszikûekbõl), élesztõgombákból, gombákból, baktériumokból is kinyerhetõk, vagy kémiai úton, vagy rekombináns DNS-technológia alkalmazásával is elõállíthatók. A GOS természetes forrásokból, például növényekbõl (például csicsókából, szójából) vagy baktériumok-
1
HU 004 967 T2
ból nyerhetõk ki, vagy szakember számára ismert szintetikus úton vagy rekombináns DNS-technológiával állíthatók elõ. A GOS b¹galaktooligoszacharid vagy a¹galaktooligoszacharid vagy e kettõ keveréke lehet. Közelebbrõl, a galaktózegységeket b(1–4) és b(1–6) glikozidkötések kapcsolják össze (transz GOS vagy TOS). A találmány szerinti készítményekben történõ felhasználásra alkalmas GOS már kereskedelmi forgalomban is beszerezhetõ, ilyen például a Vivinal®GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia. GOS-laktóz b¹galaktozidázzal végzett enzimatikus emésztésével, vagy poliglukán hidrolízisével is elõállítható. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában TOS alkalmazására kerül sor. A találmány egy megvalósítási módjában a polifruktóz elõnyösen inulin HP, így a TOS és az inulin HP kombinációja is a találmány elõnyös megvalósítási módját jelenti. A találmány szerinti további készítmények megfelelõ mennyiségû laktátot tartalmaznak, különösen a fentiekben leírt alkalmazások céljára. A laktát megfelelõ mennyisége például napi 1–30 g között változhat. A találmány szerinti készítmények lehetnek élelmiszer-készítmények, táplálékkiegészítõ készítmények vagy gyógyászati készítmények. A polifruktóz és GOS (és/vagy laktát) mellett további összetevõket is tartalmazhatnak. Élelmiszer-készítmények és táplálékkiegészítõ készítmények esetében ezeknek élelmiszer minõségûnek és élettani szempontból elfogadhatónak kell lenniük. Az „élelmiszer” kifejezés folyékony, szilárd vagy félig szilárd dietetikus készítményekre utal, elsõsorban teljes értékû élelmiszer-készítményekre (élelmiszer-helyettesítõkre), amelyek mellett nincs szükség további tápanyagfelvételre vagy táplálékkiegészítõ készítményekre. A táplálékkiegészítõ készítmények nem helyettesítik teljes mértékben a más forrásból származó tápanyagfelvételt. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az élelmiszer- és a táplálékkiegészítõ készítmény csecsemõtápszer vagy táplálékkiegészítõ, koraszülött csecsemõk számára készült tápszer vagy táplálékkiegészítõ, csecsemõtápszer vagy kisgyermektápszer, amelyek beadására elõnyösen enterálisan, elõnyösen naponta több alkalommal kerül sor. A tápszerek vagy táplálékkiegészítõk különösen alkalmasak nem, vagy csak részben anyatejjel táplált csecsemõk etetésére. A készítmények elõnyösen adagolhatók csecsemõknek a szilárd táplálékra történõ átállás vagy az anyatejes táplálásról a tápszeres etetésre való átállás idõszakában. A találmány szerinti készítmény anyatej beltartalmát növelõ kiegészítõ összetevõje is lehet. A találmány egy megvalósítási módjában a készítmény például szakember számára ismert csecsemõtápszer vagy nevelõ tápszer, közelebbrõl az Európai Bizottság a 91/321/EEC számú direktívájában és annak kiegészítéseiben olvasható, de hatékony mennyiségû polifruktóz és GOS hozzáadásával kiegészíthetõ. A csecsemõtápszer vagy nevelõ tápszer alapja lehet tej (tehéntej, kecsketej stb.), csecsemõ tejpótló tápszer (IMF), laktózintoleráns csecsemõk esetében szója, valamint allergiával vagy felszívási problémákkal küzdõ
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
csecsemõk esetében nitrogénforrásként aminosavakat tartalmazhat. A kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ csecsemõ- vagy nevelõ tápszerek ennek megfelelõen tejprotein vagy szójaprotein alapot, ajánlott napi mennyiségeknek megfelelõ adagokban zsírt, vitaminokat, emészthetõ szénhidrátokat és ásványi anyagokat tartalmazhatnak, kiszerelésük pedig por, folyékony koncentrátum vagy etetésre kész készítmény lehet. A módosított csecsemõ- vagy nevelõ tápszer beadása olyan vastagbélbeli környezetet eredményez, ami hasonlít az anyatejjel nevelt csecsemõkére, amint az a széklet pH¹jából, baktérium-összetételébõl, az SCFA-termelésbõl és ¹összetételbõl, gáztermelésbõl megállapítható. Ital formájú készítmény esetében (a napi hatékony adagot tartalmazó) naponta felvett vagy beadott mennyiség elõnyösen 100 és 1500 ml közötti, elõnyösen 450 és 1000 közötti. Szilárd formájú készítmény esetében (a napi hatékony adagot tartalmazó) naponta felvett vagy beadott por alakú tápszer mennyisége elõnyösen 15 és 220 g/nap közötti, elõnyösen 70 és 150 g/nap közötti. A GOS és polifruktóz napi hatékony adagja körülbelül 1 és 30 g/nap közötti, csecsemõk számára elõnyösen körülbelül 2 és 10 g/nap közötti, felnõtteknek elõnyösen körülbelül 5 és 20 g közötti. A találmány szerinti élelmiszer-készítmények vagy táplálékkiegészítõ készítmények tartalmazhatnak további aktív összetevõket, például (A, B1, B2, B3, B5, B12, C, D, E, K stb.) vitaminokat, probiotikumokat (például bifidobacteriumokat, lactobacillusokat stb.), egyéb prebiotikumokat, rostokat, laktoferrint, immunglobulinokat, nukleotidokat stb. Változó mennyiségben tápanyagok, például proteinek, lipidek és egyéb szénhidrátok (például emészthetõ szénhidrátok, nem emészthetõ szénhidrátok, oldható vagy oldhatatlan szénhidrátok) is jelen lehetnek a készítményekben. A csecsemõtáplálásban jellemzõen alkalmazott oldhatatlan, nem emészthetõ szénhidrátok a szójaeredetû poliszacharidok, a rezisztens keményítõ, a cellulóz és a hemicellulóz. A csecsemõtáplálásban jellemzõen alkalmazott oldható és emészthetõ szénhidrátok például a maltodextrin, a laktóz, a maltóz, a glükóz, a fruktóz, a szacharóz, valamint egyéb mono- és diszacharidok vagy mindezek keverékei. A készítmények tartalmazhatnak továbbá egyéb inaktív összetevõket és vivõanyagokat, így például glükózt, laktózt, szacharózt, mannitolt, keményítõt, cellulózt vagy cellulózszármazékokat, magnézium-sztearátot, sztearinsavat, nátrium-szacharint, talkumot, magnézium-karbonátot stb. A készítmények tartalmazhatnak továbbá vizet, elektrolitokat, esszenciális és nem esszenciális aminosavakat, nyomelemeket, ásványi anyagokat, rostokat, édesítõszereket, ízesítõszereket, színezõanyagokat, emulgeálószereket és stabilizálószereket (például szójalecitint, citromsavat, mono- vagy diglicerid-észtereket), tartósítószereket, kötõanyagokat, illatanyagokat stb. A találmány szerinti készítményekben, különösen a csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazható lipidek a tejzsírok, a növényi lipidek, amilyen például a kanolaolaj, a pórsáfrányolaj, a napraforgóolaj, az olívaolaj,
1
HU 004 967 T2
továbbá a tengeri állatok olaja stb., vagy mindezek megfelelõ (többszörösen telítetlen és/vagy telített) zsírsavakat tartalmazó frakciói vagy keverékei. A találmány szerinti készítményekben, különösen a csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazható proteinek például a kazein, a savó, a sûrített sovány tej, a szója, a marhahús, a kollagén, a kukorica vagy egyéb növényi proteinek vagy hidrolizált proteinek, a szabad aminosavak stb. A csecsemõtápszerekben vagy táplálékkiegészítõkben alkalmazott proteinek az allergizálódás veszélyének csökkentése érdekében elõnyösen erõteljesen és/vagy részben hidrolizáltak. A találmány szerinti a csecsemõtápszerek vagy táplálékkiegészítõk táplálkozási szempontból lényeges mennyiségben, például minimálisan ajánlott napi adagban tartalmazzák a napi vagy heti táplálkozáshoz szükséges összes vitamint és ásványi anyagot. A találmány egy megvalósítási módjában az élelmiszer-készítmény vagy táplálékkiegészítõ készítmény élelmiszeralapon (élelmiszerbõl vagy élelmiszert tartalmazva) is készülhet. Alapulhat vagy tartalmazhat például tejterméket, például fermentált tejterméket, ideértve többek között, de nem kizárólag tejet, joghurtot, joghurtalapú italt vagy „buttermilket”. Ilyen készítmények elõállíthatók például magától értetõdõ módszerrel, például megfelelõ élelmiszer vagy élelmiszeralap polifruktóz és GOS vagy TOS hatékony mennyiségével történõ kiegészítésével. Egyéb megfelelõ élelmiszeralapok lehetnek például a növényi és a húseredetû élelmiszeralapok. A találmány szerinti élelmiszer- vagy táplálékkiegészítõ készítmények kezelésként és/vagy megelõzõ céllal egyaránt alkalmazhatók. Ez úgy értendõ, hogy beadásuk történhet azután, hogy egy páciensben gyomor-bél rendszeri problémákat vagy betegségeket diagnosztizáltak, vagy alternatív módon a tünetek jelentkezését megelõzõen (például nagy veszélynek kitett, gyomor-bél rendszeri panaszokban nagy valószínûséggel megbetegedõ páciensekben). Például ha a vastagbél megbetegedésével vagy optimálisnál rosszabb mûködésével kapcsolatos tünetek, például székrekedés, flatulencia, allergiás megbetegedések, kólika, hasi fájdalom, hasgörcsök, IBD, IBS jelentkeztek, a készítmény beadása elõsegíti az egészséges vastagbélbeli környezet újrakialakulását vagy a további tünetek megelõzését. A találmány egy megvalósítási módjában a készítmények beadására profilaktikus céllal, egészséges mikroflóra és/vagy egészséges vastagbélbeli környezet kialakulásának elõsegítése céljából kerül sor. Az „egészséges vastagbélbeli környezet” a bél normál, élettani mûködésére és aktivitására, elsõsorban a tápanyagok és a víz normál abszorpciójára, a nyálkahártya kórokozók megtapadásával, kolonizációjával és fertõzéssel szembeni ellenállására stb. utal, amirõl székletvizsgálattal és a gázképzõdés vizsgálatával lehet megbizonyosodni. A fenti meghatározás elsõsorban optimális élettani mûködésre és aktivitásra utal. A vastagbél bármely, optimálistól elmaradó mûködése a fentiekben leírt tünetek kialakulásához vezet, amirõl
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
székletvizsgálattal és/vagy a gázképzõdés vizsgálatával lehet megbizonyosodni. A találmány hatóköre kiterjed az optimálistól elmaradó mûködésbõl eredõ bélmegbetegedésekre vagy ¹rendellenességekre. Az optimálistól elmaradó bélmûködésbõl eredõ bélrendellenességek vagy tünetek, így az IBD, a vastagbélgyulladás, az IBS és/vagy a megnõtt bél gát integritás kezelésére vagy profilaxisára szolgáló gyógyászati készítmények tartalmazhatnak további biológiailag aktív összetevõket, így drogokat, biológiailag aktív proteineket vagy peptideket, probiotikumokat stb. Az élelmiszer- vagy táplálékkiegészítõ készítményekkel kapcsolatos megvalósítási módok a gyógyászati készítményeket is magukban foglalják. A találmány szerinti készítmények dózisalakja tetszõleges lehet, így a beadás módjától függõen lehet például folyékony, szilárd, félig szilárd, tabletta, ital, por stb. alakú. A páciensnek történõ beadás módja elõnyösen orális, bár egyes alkalmazásokban a rektális vagy szondán keresztül történõ táplálás (a szondának közvetlenül a gyomorba, duodenumba, a vékonybélbe vagy vastagbélbe juttatásával) is megfelelõ lehet. A találmány további megvalósítási módját képezi egy találmány szerinti készítmény elõállítására szolgáló eljárás, amelyben szinergizmus szempontjából hatékony mennyiségû GOS-nak (vagy TOS-nak) és polifruktóznak a fentiekben leírtak szerint megfelelõ készítményalaphoz adására kerül sor. Az alábbi, nem korlátozó hatókörû példák a GOS és polifruktóz szinergista hatását szemléltetik. Egyéb értelmû közlés hiányában a találmány megvalósítása standard hagyományos molekuláris biológiai, gyógyszerészeti, immunológiai, virológiai, mikrobiológiai és biokémiai eljárásokkal történik. Ezeknek az eljárásoknak a leírása megtalálható a következõ forrásokban: Sambrook és Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Ausubel és munkatársai (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA, 1. és 2. kötet; Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17. kiadás (1985); Microbiology: A Laboratory Manual (6. kiadás), James Cappuccino: Laboratory Methods in Food Microbiology (3. kiadás), W. Harrigan (szerzõ) Academic Press. Az ábrák rövid ismertetése
50
1. ábra Acetát, propionát és butirát képzõdése TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermentációja után.
2. ábra A képzõdött acetát, propionát és butirát relatív mennyiségei TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermen60 tációja után. A képzõdött acetát plusz propionát plusz 55
11
1
HU 004 967 T2
butirát összmennyiségét a vizsgált rostok mindegyike esetében 100%-nak vettük. 3. ábra Gázképzõdés TOS, inulin, TOS/inulin 9/1 keverékének, valamint oligofruktóz és inulin 1/1 keverékének csecsemõktõl nyert friss széklet általi 48 órás in vitro fermentációja után. A képzõdött gáz mennyiségét (ml) az összes képzõdött SCFA mennyiségéhez (mmol/g rost) viszonyítottuk. 4. ábra SCFA-keverék (moláris bázison 90/5/5 arányú acetát/propionát/butirát) és L¹laktát hatásai. 4A. ábra: 0, 0,1, 0,5, 1 és 4 mM SCFA-keverék vagy L¹laktát muc¹2 expresszióra gyakorolt hatása CCD18/T84 vegyes tenyészetben (n=6). A hibasávok a SEM¹et jelzik. Az 1 és 4 mM SCFA-keverék és a 0,5, 1 és 4 mM L¹laktát esetében tapasztalt emelkedés statisztikailag lényeges mértékû. 4B. ábra: 0, 50, 100, 250 és 500 mM SCFA-keverék vagy L¹laktát spontán PGE1 és PGE2 válaszra gyakorolt hatása CCD18 sejtekben (n=7). A hibasávok a SEM¹et jelzik. A 100, 250 és 500 mM SCFA-keverék és a 100 mM L¹laktát esetében tapasztalt PGE1-növekedés statisztikailag lényeges mértékû. A 100, 250 és 500 mM SCFA-keverék és a 250 mM L¹laktát esetében tapasztalt PGE2-növekedés statisztikailag lényeges mértékû (p<0,05).
5
10
15
20
25
2
0,8 g/l, tripton 3,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,4 g/l, epesavas sók 0,05 g/l, K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4.7H2O 0,005 g/l. A tápközeggel 500 ml¹es Scottüvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 °C¹on 15 percig sterilizáltuk. Pufferelt tápközeg: K2HPO4.3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4.7H2O 0,005 g/l. A pH¹t K2HPO4 vagy NaHCO3 segítségével pH=6,3±0,1 értékre állítottuk be. A tápközeggel 500 ml¹es Scott-üvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 °C¹on 15 percig sterilizáltuk. Tartósító tápközeg: pufferelt pepton 20,0 g/l, L¹cisztein-HCl 0,5 g/l, nátrium-tioglikolát 0,5 g/l, 1 rezazurintabletta per liter. A pH¹t 1 M NaOH vagy HCl segítségével pH=6,7±0,1 értékre állítottuk be. A tápközeget mikrohullámú sütõben felforraltuk. A tápközeg 25 ml¹ével 30 ml¹es szérumüvegeket töltöttünk meg, majd azokat 121 °C¹on 15 percig sterilizáltuk. A friss székletmintákat a tartósító tápközeggel elkevertük. A friss széklet ebben a formában 4 °C¹on több óráig eltartható. Székletszuszpenzió: a tartósított székletoldatot 13 000 rpm mellett 15 percig centrifugáltuk. Eltávolítottuk a felülúszót, majd a székletet a McBain & MacFarlane tápközeggel 1:5 tömegarányban elkevertük.
Készítmények/szubsztrát Szubsztrátként 9/1 (w/w) arányú prebiotikum [TOS; TOS (VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Hollandia)] és inulin (raftilinHP, Orafti, Belgium) keveréket; inulint; 1/1 arányú oligofruktóz és inulin keveréket alkalmaztunk, negatív kontrollként nem használtunk szubsztrátot.
Fermentáció Egy üvegben a székletszuszpenzió 3,0 ml¹ét 30 85 mg glükózzal vagy prebiotikummal vagy negatív kontrolloldattal kombináltuk, majd gondosan összekevertük. A t=0 idõpontban mintát vettünk. A kapott szuszpenzió 2,5 ml¹ét dialíziscsõben 60 ml pufferelt tápközeggel töltött 60 ml¹es üvegbe juttattuk. Az üve35 get gondosan lezártuk, majd 37 °C¹on inkubáltuk. A mintákat 3, 24 és 48 óra elteltével injekciós fecskendõvel a dialíziscsõbõl (0,2 ml) vagy a dialízispufferbõl (1,0 ml) vettük, majd a fermentáció leállítása érdekében azonnal jégre helyeztük. 40 A rövid láncú zsírsavak és a laktát mennyiségi meghatározása Lásd a 2. példát. Az értékeket a negatív kontrollra korrigáltuk. 45 A gázmennyiség megállapítása A t=3, t=24 és t=48 idõpontokban a 60 ml¹es üveg felsõ részében tapasztalható gáznyomást gáznyomásmérõ berendezés (Druckmessumformer, Ecotronic, 50 Németország) segítségével állapítottuk meg úgy, hogy 6 ml¹es injekciós fecskendõt szúrtunk keresztül az üveg gumikupakján, majd azzal eltávolítottuk a gázt az üveg felsõ részébõl, amíg a gáznyomás 0 bar értékre nem csökkent. A fecskendõbeli térfogat a termelt gáz 55 mennyiségével egyezett meg. Az értékeket a negatív kontrollra korrigáltuk.
Tápközegek McBain & Mac Farlane tápközeg: pufferelt peptonvíz 3,0 g/l, élesztõkivonat 2,5 g/l, mucin (kefeszegély)
1.2. Eredmények Az in vitro fermentációt a következõ minták alkal60 mazásával végeztük:
5. ábra Nátrium-acetát és nátrium-L-laktát hatása a vastagbél disztális és proximális részén tapasztalható spontán összehúzódásokra. Az (1 g húzóerõre állított) negatív kontroll 0%. A 40 mM KCl hozzáadása után tapasztalt húzóerõt 100%-nak vettük. Példák 1. példa In vitro fermentációs vizsgálatok szinergista hatást mutattak ki a fermentációs mintázatokban 1.1. Anyag és módszer Mikroorganizmusok A mikroorganizmusokat tápszerrel nevelt csecsemõk friss székletébõl nyertük. Az 1–4 hónapos korú csecsemõktõl származó friss székletmintákat összevontuk, majd 2 órán belül tartósítóközegbe helyeztük.
12
1
HU 004 967 T2
1. 85 mg TOS (VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Hollandia) 2. 85 mg inulin (RaftilinHP, Orafti, Belgium) 3. 85 mg TOS/inulin, 9/1 (w/w) TOS/inulin aránynál 4. 85 mg OF (raftiloseP95, Orafti, Belgium)/inulin (RaftilinHP), 1/1 (w/w) OF/inulin aránynál. Termelt összes SCFA-mennyiség Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábráról leolvasható, hogy a TOS/inulin keverék gramm rostonként lényegesen nagyobb mennyiségû SCFA-termelést eredményezett, mint különálló összetevõi, és magasabbat, mint az oligofruktóz (OF) és inulin keveréke. Így vizsgáltuk továbbá a TOS/inulin 1/1 arányú keverékét is (nem közölt adatok), amely szintén szinergista hatásúnak bizonyult. L- és D¹laktát-termelés Az L¹ és D¹laktát jelenlétét csak a t=3 idõpontban lehetett kimutatni. Az 1. táblázat az ebben az idõpontban kialakult metabolikus végtermékeket mutatja be. 1. táblázat 3 órás in vitro fermentációt követõen képzõdött metabolikus végtermékek (mmol/g rost) Acetát
Propionát
Butirát
Llaktát
Dlaktát
TOS
0,23
0
0
0,14
0,03
Inulin
0
0
0
0,00
0,00
TOS/inulin
0,40
0
0
0,17
0,04
OF/inulin
0,30
0
0
0,04
0,02
A TOS/inulin keveréknél szinergizmusra utaló módon ismételten nagyobb mennyiségû laktát képzõdését figyeltük meg, mint komponensei, a TOS és az inulin esetében. Az OF és inulin keverékével összehasonlítva a laktát (összes savmennyiségen alapuló) százalékos aránya és az L¹/D¹laktát arány magasabbnak mutatkozott a TOS/inulin keverék esetében. SCFA¹k relatív mennyiségei A 2. ábrán a fermentációs termékek összetétele látható 48 óra elteltével. A TOS/inulin keveréknél az acetát lényegesen nagyobb százalékos arányban figyelhetõ meg, mint a keverék összetevõinél, valamint az oligofruktóz (OF) és inulin keverékénél. Az anyatejjel táplált csecsemõk székletében az acetát magas százalékos arányban mutatható ki, ezért a TOS/inulin keverék esetében kialakuló fermentációstermék-összetétel hasonlít leginkább az anyatejjel táplált csecsemõkéhez.
2
Az egy mmol képzõdött SCFA¹ra esõ gázmennyiség a TOS/inulin keverék esetében volt a legalacsonyabb. Az SCFA-képzõdés kinetikája A 2. táblázat az SCFA-képzõdés kinetikáját mutatja be. A TOS/inulin kombináció hatására 24 és 48 óra között nagy mennyiségû SCFA keletkezett, ami arra utal, hogy még a vastagbél disztális részében is képzõdött SCFA, ami jótékony hatással van a vastagbél-nyálka10 hártya áteresztõképességére, a nyálkaképzésre, a kórokozó-ellenes hatásokra stb. Az elsõ 3 órában képzõdött a legnagyobb mennyiségû SCFA, mint az emberi tejben található oligoszacharidok esetében (nem közölt adat). A vastagbél kezdeti szakaszán bekövetkezõ 15 gyors fermentáció jelentõsége kórokozó-ellenes hatásából következik. 5
20
2. táblázat Az SCFA-képzõdés (mmol) kinetikája (negatív kontrollra korrigált adatok) Idõintervallum (óra) Prebiotikum
25
30
TOS
0–3 óra
3–24 óra
24–48 óra
0,23
3,85
0,13
TOS/inulin HP
0,40
4,49
0,24
Inulin HP
0,00
3,05
0,05
OF/inulin HP
0,11
4,26
0,00
OF=oligofruktóz
35
40
45
50
Gázképzõdés 55 Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A gázképzõdés tekintetében a TOS és a TOS/inulin keverék eredményezte az egy mmol képzõdött SCFA¹ra esõ legkisebb gázmennyiséget. Az inulin és az OF/inulin keverék sokkal nagyobb mértékû gázképzõdést eredményezett. 60 13
2. példa TOS/inulin klinikai hatásvizsgálata: az acetát mennyiségének relatív növekedése és a butirát mennyiségének relatív csökkenése nem korrelál a bifidobacteriumok számának növekedésével. A TOS és az inulin szinergista hatásúak. 2.1. Anyag és módszer Terhességük utolsó trimeszterében lévõ 63 szoptatást választó és 57 tápszeres etetést választó terhes anyát soroltunk be a vizsgálatban való részvételre. Normál testtömeggel, fejlõdési rendellenesség, veleszületett betegség vagy gyomor-bél betegség nélkül született csecsemõket vettünk fel születésük után három napon belül. A vizsgálatot az illetékes etikai bizottság jóváhagyásával végeztük (Medical Center, St. Radboud, Nijmegen, Hollandia). Besorolásukat megelõzõen a szülõk megfelelõ tájékoztatás után írásos beleegyezésüket adták a vizsgálatban történõ részvételhez. A tápszeres etetést választó anyák csecsemõit véletlenszerûen, kettõs vak elrendezésben, két tápszeres csoport valamelyikébe soroltuk be (OSF, SF). A standard tápszeres csoport (SF; n=19) hagyományos, kiegészítés nélküli csecsemõtápszert kapott (Nutrilon I, Nutricia, Hollandia). A standard tápszer fõbb összetevõit 131 g/l¹es standard hígítása esetén a 3. táblázat tartalmazza. A prebiotikus tápszeres csoport (OSF; n=19) ugyanezen standard csecsemõtápszert kapta, kiegészítve 6 g/l transzgalaktooligoszacharid (TOS; Vivi-
1
HU 004 967 T2
nal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Hollandia) és inulin (PF; RaftilineHP, Orafti active food ingredient, Tienen, Belgium) keverékével. A keverék 90% TOS¹t és 10% inulint tartalmazott. A kísérleti tápszereket ad libitum etették a vizsgálati periódus alatt. A szoptatást választó anyákat a vizsgálat idõtartama alatt szükség esetén szoptatási tanácsadó segítségének igénybevételével támogatták abban, hogy folytassák a szoptatást. A szoptatás befejezését követõen csecsemõik a két tápszer egyikét kapták. Az anyák együttmûködését a látogatások során az el nem használt tápszeres dobozok száma, valamint a felhasznált tápszer és a lejegyzett táplálékfelvétel alapján ellenõrizték. 3. táblázat A standard tápszer összetétele literenként Energia
Kcal
Protein
g
Kazein/savó arány
ben kiolvasztottuk és stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Spanyolország) alkalmazásával 10 perc alatt homogenizáltuk. A homogenizált székletmintából 350 ml¹t 200 ml 5%¹os (v/v) hangyasavval, 100 ml 5 1,25 g/l¹es 2¹etil-vajsavval (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Hollandia) és 350 ml MilliQ-val kevertünk össze. A nagyméretû részecskék eltávolítása érdekében a mintákat 5 percig 14 000 rpm-nél centrifugáltuk, majd a felülúszót –20 °C¹on tároltuk. A FISH-elemzés és a 10 tejsav mennyiségi meghatározása érdekében a mintákat jeges vízben kiolvasztottuk, foszfátpufferelt sóoldatban (PBS-ben; pH=7,4) tízszeresére hígítottuk, majd stomacher alkalmazásával 10 percen át homogenizáltuk. A homogenizált székletmintákat –20 °C¹on 15 tároltuk.
670 14 40/60
Zsír
g
35
Összes szénhidrát
g
75
Laktóz
g
75
Kalcium
mg
540
Foszfor
mg
270
Magnézium
mg
50
Ásványi anyagok
20
25
Nátrium
mg
190
Kálium
mg
680
Klorid
mg
430
Vas
mg
5
Cink
mg
5
Kérdõívek A szülés elõtt demográfiai, klinikai és antropometriai adatokat gyûjtöttek az anyákról. A szüléssel kapcsolatos információt öt nappal a szülést követõen az anyáktól szerezték be. A csecsemõ táplálékfelvételét, tápszer-toleranciáját, székletének jellemzõit, egészségügyi és antropometriai adatait a születés utáni 5., 10., 28. napon és a kísérlet végéig négyhetente egyszer, kérdõíves felméréssel gyûjtötték be. Székletminták A szülõket megkérték, hogy gyûjtsenek székletmintát csecsemõjüktõl a születést követõ 5., 10., 28. napon, illetve késõbb négyhetente egy alkalommal. A mintákat a szülõk a pelenkából, a székletürítés után a lehetõ legrövidebb idõn belül székletgyûjtõ edényekbe (Greiner Labortechnik, Hollandia) vették, és azonnal –20 °C¹ra hûtötték, majd azokat késõbb a kísérletben részt vevõ munkatársak hordozható fagyasztóládában a laboratóriumba juttatták. Székletminták elkészítése Az SCFA-meghatározás érdekében a minták 1 grammját MilliQ-val tízszeresére hígított jeges víz-
2
30
35
40
45
50
55
Fluoreszcens in situ hibridizáció A FISH-elemzést a szakirodalomban leírtak szerint, kis módosításokkal végeztük (Lagendijk és munkatársai, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069–3075). A paraformaldehidben fixált mintákat zselatinnal bevont üveglemezekre vittük (PTFE bevonatú 8 üregû [1 cm2/üreg] tárgylemezek, CBN labsuppliers, Drachten, Hollandia), majd levegõn megszárítottuk. A megszárított mintákat 10 percig 96%¹os etanolban dehidráltuk. A Bif164 mod jelû, 10 ng/l Cy3-mal jelölt Bifidobacterium-specifikus próbát (5’-CAT CCG GYA TTA CCA CCC) tartalmazó hibridizációs puffert (20 mm Tris-HCl, 0,9 M NaCl, 0,1% SDS [pH=7,1]) elõmelegítettük, majd a megszárított mintákra vittük. A Bif 164 mod az S¹G-Bif-a-0164-a-A¹18 jelû próba módosított változata (Lagendijk és munkatársai, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069–3075). A lemezeket egy éjszakán át sötétített nedveskamrában 50 °C¹on inkubáltuk. A hibridizációt követõen a lemezeket 30 percig 50 ml elõmelegített mosópufferrel (20 mM Tris-HCl, 0,9 M NaCl [pH=7,2]) mostuk, majd rövid ideig MilliQval öblítettük. Az összes baktérium megfestése érdekében a mintákat PBS-ben lévõ 0,25 ng/l 4’,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) szobahõmérsékleten 5 percig mostuk. A DAPI-festés után a lemezeket rövid ideig MilliQ-val öblítettük, megszárítottuk, Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) segítségével, tárgylemezzel fedtük. A lemezeket Olympus AX70 epifluoreszcens mikroszkóppal, automatizált képelemzõ szoftver (Analysis 3.2, Soft Imagimg Systems GmbH, Münster, Németország) alkalmazásával automatikusan bíráltuk. A mintánként jelen lévõ bifidobacteriumok számát 25 véletlenszerûen kiválasztott látótér elemzésével állapítottuk meg. Mindegyik látótérben a bifidobacteriumok százalékos arányát az összes sejt DAPI szûrõkészlet (SP100, Chroma Technology Corp., Brattleboro, USA) segítségével, illetve az összes Bifidobacterium Cy3 szûrõkészlet (41007, Chroma Technology, Brattleboro, USA) alkalmazásával történt megszámlálásával állapítottuk meg.
Rövid láncú zsírsavak elemzése A rövid láncú zsírsavak (SCFA): ecetsav, propion60 sav, n¹vajsav, izovajsav és n¹valeriánsav mennyiségi 14
1
HU 004 967 T2
meghatározását lángionizációs detektorral felszerelt Varian 3800 gázkromatográffal (GC) (Varian Inc., Walnut Creek, USA) végeztük el. A minta 0,5 ml¹ét hélium vivõgáz (3,0 psi) segítségével 80 °C¹on az oszlopra injektáltuk (Stabilwax, 15×0,53 mm, filmvastagság 1,00 mm, Restek Co., USA). A minta befecskendezését követõen a kemencét 16 °C/perc sebességgel 160 °C¹ra melegítettük, majd 20 °C/perc sebességgel 220 °C¹ra melegítettük, végül 1,5 percig a hõmérsékletet 220 °C¹on tartottuk. Az injektor és a detektor hõmérséklete egyaránt 200 °C volt. Belsõ standardként 2¹etil etil-vajsavat alkalmaztunk. Laktátanalízis Homogenizált székletmintákat jégen felolvasztottunk és 5 percig 14 000 rpm mellett centrifugáltunk. A felülúszó 100 ml¹ét az összes enzim inaktiválása érdekében 10 percig 100 °C¹ra melegítettük. A laktátmennyiséget enzimatikus úton, D¹ és L¹tejsav dehidrogenázt tartalmazó L¹tejsav detekciós reagenskészlet (Boehringer Mannheim, Mannheim, Németország) alkalmazásával állapítottuk meg. A laktátmennyiséget csak a megfelelõen nagy méretû székletmintákból határoztuk meg. pH-elemzés A –20 °C¹on történt tárolás után a székletmintákat felolvasztottuk, majd a széklet pH¹ját közvetlen módon, szobahõmérsékleten, Inlab 423 pH elektródával (Mettler-Toledo, Columbo, USA) felszerelt Handylab pH¹mérõ (Scott Glas, Mainz, Németország) segítségével állapítottuk meg. Adatelemzés A vizsgálatot megelõzõ statisztikai („power”) számítások arra vezettek, hogy a vizsgált és a standard táp-
2
szert kapott csoportok között a bifidobacteriumok számában tapasztalható 30% különbség (25% SD mellett) kimutatásához csoportonként 13 csecsemõre van szükség. A tápszeres csoportokban várt 30%¹os ki5 esés miatt a vizsgálatot a számítottnál több csecsemõn végeztük el. Az eredmények statisztikai elemzésére az SPSS (11.0 verzió) statisztikai programcsomagot alkalmaztuk. Az összes adat normalitását a normál valószínûségi grafikonok megtekintésével ellenõriztük. A bifi10 dobacteriumok, a pH, az SCFA¹k és a laktát relatív mennyisége közti százalékos különbségek szignifikanciáját varianciaanalízissel vizsgáltuk. Szignifikáns különbség (p<0,05) esetén a csoportokat Bonferroni post hoc teszt segítségével hasonlítottuk össze. Mivel a 15 szoptatás és a tápszeres etetés esetében kettõs vak módszerû csoportba osztás nem lehetséges, és a megfelelõ randomizálás sem biztosítható, az anyatejjel és a tápszerrel táplált csoportok statisztikai összehasonlítását nem végeztük el. Az anyatejes csoport ada20 tait csak abban az esetben közöltük, ha az adott idõpillanatban a csecsemõ kizárólag anyatejet fogyasztott. 2.2. Eredmények Összesen 120 csecsemõt válogattunk be a vizsgá25 latba. 57 csecsemõt születését követõen tápszerrel kezdtek etetni, õket egyenlõen osztottuk el a csoportok között. A születésük után kezdetben anyatejjel táplált 63 csecsemõ közül 24 esetében tápszeres etetésre tértek át 16 hetes életkor elõtt, 5 pedig kiesett a kí30 sérletbõl. A kísérleti alanyok jellemzõit a 4. táblázat tartalmazza. A tápszeres csoportból 9 csecsemõ esett ki életük elsõ 16 hetén belül (4 az SF¹, 5 az OSF-csoportból). A kiesés okai a következõk voltak: kólika, tehéntej-allergia gyanúja, székrekedés és technikai 35 problémák.
4. táblázat A kísérleti alanyok jellemzõi
Nem
Standard tápszer (SF) N=19
Prebiotikus tápszer (OSF) N=19
Anyatej, BF N=63
5
12
33
14
7
30
fiú lány
Születés helye Születés módja
7
8
40
kórházban
otthon
12
11
23
hüvelyi szülés
14
16
59
császármetszés Születési testtömeg
5
3
4
3600±501
3318±602
3651±601
Székletbeli bifidobacteriumok A bifidobacteriumok székletbeli százalékos arányát az egyes táplálási csoportokban 5 napos, 10 napos, 4, 8, 12 és 16 hetes életkorban az 5. táblázat tartalmazza, mennyiségüket a 6. táblázatban ismertetjük. Az OSFcsoportban az SF¹csoporthoz képest mindegyik életkornál az összes baktérium nagyobb százalékos arányában találtunk bifidobacteriumokat, de ezek a különbségek nem bizonyultak statisztikailag lényeges
mértékûnek. Nem várt módon a bifidobacteriumok száma az anyatejjel táplált csecsemõkben is viszonylag alacsony volt, hasonló volt a tápszerrel nevelt csopor55 tokban kapott értékekhez. Az elõzetes adatok a lactobacillusok számának emelkedését mutatták a BF¹ és OSF-csoportokban, de a lactobacillusok a székletflórából legalább egy nagyságrenddel kisebb részt képviselnek, mint a bifidobacteriumok, így a teljes mintázat60 ra gyakorolt hatásuk csekély. 15
1
HU 004 967 T2
pH-eredmények A tápszerrel etetett csecsemõk székletmintáinak pH¹értékeit a 6. táblázat tartalmazza. A legalacsonyabb pH¹értéket az anyatejjel táplált csecsemõk esetében tapasztaltuk. Az OSF tápszerrel etetett csecsemõk székletének pH¹értéke alacsonyabb volt, mint az SF¹csoportban (p<0,045 mindegyik korcsoportban, kivéve az 5. napon). SCFA-eredmények A székletbeli összes SCFA mennyiségét az 5. táblázat tartalmazza. Az összes SCFA¹n belül az egyes SCFA¹k százalékos arányát a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az egyes tápszeres csoportok között az összes SCFA-koncentráció tekintetében nem lehetett statisztikailag lényeges mértékû különbözõséget megállapítani. Az SCFA mennyisége is összehasonlítható volt az egyes táplálási csoportok között. Ugyanakkor már 10 nap elteltével eltéréseket tapasztaltunk az SCFA-profil tekintetében az anyatejjel vagy OSF tápszerrel és a standard tápszerrel etetett csecsemõk csoportjai között. A GOS- és polifruktóztartalmú tápszerrel vagy anyatejjel etetett csecsemõknél
2
magasabb acetátarányt és alacsonyabb propionát, butirát és iC4–6 SCFA-arányt lehetett megállapítani, mint a standard tápszerrel etetett csecsemõk esetében. 5 Laktáteredmények Az összes csoportra vonatkozó laktátkoncentrációt (mmol/kg széklet) az 5. táblázat tartalmazza. Már 5 napos kortól kezdõdõen az OS tápszerrel (nem lé10 nyeges mértékben) és az anyatejjel táplált csoportok esetében a standard tápszerrel etetett csoporthoz képest nagyobb laktátmennyiséget állapítottunk meg. A laktát relatív mennyisége (az összes SCFA és laktát összegének százalékában kifejezve) az anyatejjel táp15 lált csoport esetében volt a legmagasabb, és a standard tápszerrel táplált csoport esetében volt a legalacsonyabb. A TOS/inulin tartalmú tápszerrel etetett csecsemõk csoportjában közepes relatív mennyiségû acetátot lehetett kimutatni. Az OSF tápszerrel etetett 20 csecsemõk esetében 16 hetes életkorban a laktát (összes savhoz viszonyított) százalékos aránya lényeges mértékben különbözött az SF¹csoportba tartozó csecsemõkétõl.
5. táblázat A laktát, az összes SCFA (mmol/kg széklet), a bifidobacteriumok számának (*1,1013/kg széklet) és a pH alakulása születéstõl 16 hetes életkorig. Átlag±SEM-értékek. A pH¹t kivéve nem lehetett statisztikailag lényeges mértékû különbségeket megállapítani
5 nap
10 nap
4 hét
8 hét
12 hét
16 hét
Laktát
SCFA
pH
Bifidobacteriumok
SF
13,5±7,7
54,7±12,6
5,93±0,15
0,58±0,49
OSF
10,7±4,3
56,5±7,7
5,49±0,15
1,20±2,24
BF
13,3±2,8
48,7±4,4
5,27±0,07
0,47±0,39
SF
4,6±3,0
62,0±7,9
6,88±0,15
0,96±0,83
OSF
9,7±3,6
62,3±+7,2
5,95±0,20
1,10±0,99
BF
15,1±3,2
54,7±4,9
5,35±0,07
0,48±0,61
SF
2,6±1,4
68,3±10,3
6,77±0,21
0,97±0,96
OSF
9,9±3,4
83,1±8,8
5,88±0,18*
1,20±0,55
BF
22,8±4,4
59,8±4,8
5,45±0,12
0,56±0,64
SF
7,6±6,8
76,5±13,2
6,80±0,20
0,89±0,56
OSF
24,4±5,3
76,0±8,4
5,68±0,18*
1,00±0,52
BF
30,9±5,3
62,8±5,4
5,27±0,15
0,58±0,59
SF
14,1±9,4
73,9±11,9
6,88±0,20
0,91±0,80
OSF
18,4±7,0
76,1±12,1
5,60±0,18*
1,30±0,99
BF
42,1±7,1
60,4±4,9
5,29±0,17
1,40±1,38
SF
1,7±1,2
68,6±14,0
7,09±0,15
1,00±0,80
OSF
18,5±5,7
67,7±11,7
5,60±0,20*
1,30±0,76
BF
45,1±9,0
59,2±6,9
5,68±0,24
0,89±0,78
16
1
HU 004 967 T2
2
6. táblázat Az SCFA¹k relatív mennyisége (az összes SCFA %¹ában), a laktát relatív mennyisége (az összes sav %¹ában), a bifidobacteriumok százalékos aránya születés és 16 hetes életkor között Nap/hét
5 nap
10 nap
4 hét
8 hét
12 hét
16 hét
Acetát
Propionát
Butirát
Szum iC4–C5
% Bifidobacterium
Laktát
SF
84,3±3,4
12,9±3,2
1,7±0,5
1,1±0,4
45±3,6
13,8±18,5
OSF
85,8±5,1
12,0±4,7
0,5±0,5
1,7±0,7
50±8,6
8,7±13,3
BF
89,5±1,8
7,0±1,5
1,6±0,4
2,0±0,4
54±4,1
12,5±14,0
SF
70,9±2,0
21,3±2,6
4,6±1,1
3,2±0,5
65±6,0
4,3±10,8
OSF
84±2,4*
13,5±2,3
1,4±0,4*
1,1±0,4
61±6,3
8,2±9,8
BF
89,3±1,9
5,8±1,3
2,3±0,3
2,6±0,4
42±4,1
13,4±13,8
SF
71,8±2,8
17,8±3,3
5,0±1,1
5,5±2,6
52±5,4
6,9±16,4
OSF
77,7±2,2
15,4±2,0
5,8±2,2
1,1±0,3
71±4,5
8,4±10,7
BF
91,0±1,8
4,3±1,2
2,6±0,6
2,1±0,4
47±5,4
19,6±17,0
SF
74,6±2,9
16,4±2,0
6,1±1,2
2,9±0,7
50±6,3
3,5±9,9
OSF
83,5±2,7
11,4±2,1
3,7±1,2
1,4±0,4
64±4,1
17,7±15,2
BF
91,2±1,6
5,4±1,4
1,9±0,5
1,6±0,3
41±4,5
21,7±13,4
SF
73,9±2,9
17,8±3,3
5,0±1,1
3,2±0,5
56±5,4
5,4±11,9
OSF
86,5±2,1
11,2±1,8
1,2±0,3*
1,0±0,4
60±5,0
13,6±13,2
BF
86,1±3,3
7,5±2,2
3,0±0,7
3,5±0,8
59±4,5
30,2±16,3
SF
69,9±3,9
19,6±2,7
5,6±0,9
4,9±0,8
52±6,3
0,6±0,9
OSF
82,2±5,3
14,3±4,9
2,1±0,5*
1,5±0,4*
69±7,7
16,4±12,0*
BF
89,7±2,7
6,4±2,1
1,6±0,4
2,2±0,5
47±6,3
35,6±20,4
Az SF¹fel összehasonlítva p<0,05; SF=standard tápszer, OSF GOS+inulin kiegészített SF; BF=anyatejjel táplált
A fentiek alapján az ezzel a GOS és polifruktóz kombinációval táplált csecsemõk székletében csökkent a pH, több laktát termelõdött, savas (acetát és laktát) mintázat alakult ki, amely jobban hasonlít az anyatejjel táplált csecsemõknél tapasztalhatókhoz, és ez a hatás nem köthetõ a bifidobacteriumok számának növekedéséhez. 3. példa – A laktát és SCFA keverék jótékony hatása a Muc-2, PGE1 és PGE2 expresszióra 3.1. Anyag és módszer A laktát és SCFA keverék hatását a Willemsen, LEM, Koetsier MA, van Deventer SJH, van Tol EAF (2003), Gut 52:1442–1447 által leírtak szerint, a következõ módosításokkal végeztük: laktát és acetát/propionát/butirát 90/5/5 arányú keverékét vizsgáltuk. A nyálkatermelésre vonatkozó kísérletekben CCD18 és T84 sejtek együttes tenyészetét alkalmaztuk, míg a PGE1- és PGE2-termelésre vonatkozó kísérletekben CCD18 sejtek önálló tenyészetét használtuk fel. 3.2. Eredmények Az acetát/propionát/butirát 90/5/5 arányú keverékébõl álló SCFA és az L¹laktát dózisfüggõ módon indukálja az MUC¹2 expressziót CCD18 és T84 sejtek együttes tenyészetében, amint az a 4A. ábrán látható. Hasonló módon, amint az a 4B. ábrán látható, hatásuk-
ra a PGE1- és PGE2-koncentráció emelkedik a 35 CCD18 sejtekben.
40
45
50
55
60
17
4. példa: Laktát hatása a vastagbél összehúzódására 4.1. Anyag és módszer Hím Wistar-patkányokat (CKP/Harlan, Wageningen/Horst, Hollandia) szabályozott hõmérsékleti viszonyok és megvilágítási ciklus mellett tartottunk, pelletált takarmányt és vizet ad libitum biztosítottunk számukra. Az állatokat N2O, O2 és izoflurán gázkeverékkel elaltattuk, kinyitottuk a hasüreget, majd a vastagbelet azonnal eltávolítottuk. A szövetet pH=7,4 értékû Krebs–Henseleit-pufferbe helyeztük (a puffer összetétele/mM: 118,0 NaCl, 4,75 KCl, 1,18 MgSO4, 2,5 CaCl2, 10 glükóz, 1,17 KH2PO4 és 24,9 NaHCO3). A vastagbelet egy disztális és egy proximális részre vágtuk, majd miközben óvatosan kipréseltük belõle a béltartalmat, Krebs–Henseleit-pufferrel mostuk. Az in vivo feltételek lehetõ legjobb megközelítése érdekében 1 cm¹es teljesen ép szegmenseket 20 ml¹es, 95% CO2 – 5% O2 tartalmú gázkeverékkel folyamatosan átáramoltatott Krebs–Henseleit-puffert tartalmazó vízköpenyes (37 °C) szervfürdõkben (Schuler, HSE, Németország) hosszirányban izometrikus erõátvivõ berendezéshez (F30 type 372, HSE, Németország) kapcsoltunk. A szegmenseket fokozatosan 1 g nyugalmi feszü-
1
HU 004 967 T2
lésig nyújtottuk, majd idõszakos mosás mellett 45 percig ekvilibrálni hagytuk. A szegmensek nyugalmi állapotban és különbözõ stimulusok hatására mutatott feszülését transzducer erõsítõ modul (HSE, Németország) segítségével felerõsítettük, majd többcsatornás íróberendezéssel lejegyeztük (Rikadenki, HSE, Németország). A szegmenseket 5 percig 40 mM KCl-oldatban inkubáltuk, majd lejegyeztük az összehúzódásos válaszreakciókat. A KCl¹ot ötperces idõközökkel végzett három egymást követõ mosással távolítottuk el. A szegmenseket ezek után fokozatosan növekvõ, de legfeljebb 100 mM koncentrációjú acetáttal vagy nátrium-acetáttal inkubáltuk. A savoldatokat frissen, desztillált vízzel készítettük. A semleges pH eléréséhez NaOH¹ot adtunk az acetáthoz. A zsírsavval végzett inkubálás végén 40 mM KCl¹ot adtunk a rendszerhez, annak megállapítása érdekében, hogy a zsírsav befolyásolta¹e a KCl¹ra adott összehúzódásos válaszreakciót. Az újabb inkubálásokat megelõzõen a szegmenseket szakaszos mosás mellett 45 percig friss Krebs–Henseleit-pufferben ekvilibráltattuk. A kísérletes protokollban a vastagbél két proximális és két disztális részlete szerepelt. Az adatelemzéshez (n=3) a stimulusok által kiváltott kontrakció mértékét 5 perces inkubációt követõen mért, grammban kifejezett feszülésben adtuk meg. Az azonos (proximális vagy disztális) szegmensekkel nyert adatokból átlagértéket számítottunk, mindegyik szegmens saját kontrolljaként szolgált. 4.2. Eredmények Amint az 5. ábrán látható, a nátrium-acetát és különösen a nátrium-L-acetát csökkenti a tonikus összehúzódások erejét. A relaxációs hatás nagyobb mértékû a disztális, mint a proximális vastagbélszakaszban. Hasonlóképpen, a spontán, fázikus kontrakciók száma is csökken a vastagbél proximális szakaszában a nátrium-acetát és a nátrium-L-acetát hatására, a vastagbél disztális szakaszában ugyanakkor ilyen hatást nem lehetett megfigyelni. A vastagbél proximális szakaszában a KCl¹ra adott válaszreakcióként kialakuló tonikus kontrakciók hasonló mértékûek voltak 25 mM nátriumacetát vagy nátrium-L-acetát jelenlétében vagy hiányában. Magasabb koncentrációknál ugyanakkor még KCl hozzáadását követõen is szignifikáns mértékû relaxációt tapasztaltunk.
2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
5
10
15
20
25
30
35
40
45
18
1. Galaktooligoszacharidok és polifruktóz alkalmazása allergia, ekcéma vagy atópiás betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására, ahol a készítmény naponta beadott térfogata a 100-tól 1500 ml¹ig terjedõ tartományban van. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ekcéma vagy atópiás betegségek kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, allergia kezelésére vagy megelõzésére szolgáló készítmény elõállítására. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galaktooligoszacharid:polifruktóz mennyiségi aránya 3:97 és 97:3 közötti. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galaktooligoszacharid transzgalaktooligoszacharid és/vagy a polifruktóz inulin. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a polifruktóz 20 vagy a feletti átlagos polimerizációs fokkal rendelkezõ inulin. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a galaktooligoszacharidok és a polifruktóz napi adagja a körülbelül 1 és 30 g/nap közötti, elõnyösen pedig a körülbelül 2 és 10 g/nap közötti tartományban van. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény proteint, lipideket és a galaktooligoszacharidoktól és polifruktóztól eltérõ szénhidrátokat is tartalmaz. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény élelmiszer-készítmény vagy táplálékkiegészítõ készítmény. 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény csecsemõ táplálására szolgál. 11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a készítmény csecsemõtápszer vagy nevelõ tápszer. 12. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény legalább 4 g/l galaktooligoszacharid és polifruktóz keveréket tartalmaz. 13. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény naponta beadott térfogata a körülbelül 450 és 1000 ml közötti tartományban van. 14. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a proteinek nagymértékben hidrolizáltak és/vagy részlegesen hidrolizáltak.
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
19
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
20
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
21
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
22
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
23
HU 004 967 T2 Int. Cl.: A23L 1/29
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
