(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000004725T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 004 725

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 16/24

(21) Magyar ügyszám: E 04 737302 (22) A bejelentés napja: 2004. 06. 30. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040737302 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1639011 A2 2004. 09. 23. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1639011 B1 2008. 11. 12.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: PCT/GB03/02804 2003. 06. 30. 509613 P 2003. 10. 08. 535076 P 2004. 01. 08.

(73) Jogosult: Domantis Limited, Brentford, Middlesex TW8 9GS (GB)

WO US US

(72) Feltaláló: BASRAN, Amrik, Domantis Ltd., Cambridge CB4 0WG (GB) (54)

(2006.01) A61K 47/48 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04081026 PCT/GB 04/002829

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Peg-ezett, egydoménes antitestek (dAb)

(57) Kivonat

HU 004 725 T2

A találmány tárgyát egy vagy több antitestdomént tartalmazó, természetesen elõforduló vagy szintetikus, polimerkapcsolt polipeptidek képezik.

A leírás terjedelme 80 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 004 725 T2

A hagyományos antitestek legalább négy polipeptidláncot tartalmazó, több alegységes, nagyméretû fehérjemolekulák. Például, az emberi IgG-nek két nehézlánca és két könnyûlánca van, amelyek diszulfidhíddal összekapcsolódva alkotják a mûködõ antitestet. A hagyományos IgG mérete körülbelül 150 kD. Viszonylag nagy méretük miatt, a teljes antitestek (például, IgG, IgA, IgM stb.) terápiás alkalmazása bizonyos problémák, például, a szövetbe történõ behatolás miatt, korlátozott. Jelentõs törekvések irányultak antigénkötõ funkciójukat és oldékonyságukat megtartó kisebb antitestfragmentumok azonosítására és elõállítására. Az antitestek nehéz és könnyû polipeptidláncai tartalmaznak antigénekkel való kölcsönhatásban részt vevõ variábilis (V) régiókat, és szerkezeti támaszt biztosító konstans (C) régiókat, amelyek immuneffektorokkal történõ nem antigénspecifikus kölcsönhatásokban mûködnek. Egy adott hagyományos antitest antigénkötõ doménja két elkülönült doménbõl áll: nehézlánc-eredetû variábilis doménbõl (VH) és könnyûlánceredetû variábilis doménbõl (VL: amely lehet Vk vagy Vl). Önmagában az antigénkötõ helyet hat polipeptidhurok alkotja: három hurok a VH doménbõl (H1, H2 és H3), és három pedig a VL doménbõl (L1, L2 és L3). In vivo, a VH és VL doméneket kódoló V gének diverz primer repertoárja a génszegmentumok kombinatoriális átrendezésével készül. C régiók közé tartoznak CL régióknak nevezett, könnyûlánc-eredetû C régiók és CH1, CH2 és CH3 régióknak nevezett, nehézlánc-eredetû C régiók. A természetes körülmények között elõforduló antitesteknek számos kisebb antigénkötõ fragmentumát azonosították proteázzal végzett emésztést követõen. Ezek közé tartozik, például, a „Fab-fragmentum” (VL–CL–CH1–VH), „Fab’-fragmentum” (a nehézlánc csuklórégióját tartalmazó Fab) és „F(ab’)2-fragmentum” (nehézlánc-eredetû csuklórégióval összekapcsolt Fab’fragmentumok dimerje). Rekombináns eljárásokat alkalmaztak még az ezeknél kisebb, szintetikus peptidlinkerrel összekapcsolt VL és VH doménekbõl álló „egyláncú Fv”-nek (variábilis fragmentum) vagy „scFv”-nek nevezett antigénkötõ fragmentumok elõállítására. Bár a természetes körülmények között (például emberekben és a legtöbb más emlõsben) elõforduló antitest antigénkötõ-egységrõl általában ismert, hogy egy pár V régióból (VL/VH) áll, a tevefélék (Camelidae) közé tartozó fajok nagyrészt olyan, teljes mértékben funkcionális, nagyon specifikus antitesteket expresszálnak, amelyben nincsenek könnyûlánc-eredetû szekvenciák. A tevefélékbõl származó nehézlánc-eredetû antitestek konstans régióikon át dimerizált, egyegy külön nehézláncból létrejött homodimerek. E tevefélék nehézlánc-eredetû variábilis doménjeit VHH doméneknek nevezik, és a VH lánc fragmentumaiként való izolálás esetén megtartják nagy specificitású antigénkötõ képességüket [Hamers–Casterman és munkatársai, Nature 363, 446–448 (1993); Gahroudi és munkatársai, FEBS Lett. 414, 521–526 (1997)]. Antigént kötõ VH egydoméneket, például immunizált egerek lépébõl származó genomi DNS-bõl amplifikált és E.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

coliban expresszált egéreredetû VH gének könyvtárából is azonosítottak [Ward és munkatársai, Nature 341, 544–546 (1989)]. Az izolált VH egydoméneket Ward és munkatársai „doménantitesteknek” („dAb¹k”) nevezték el. A leírás szerinti értelemben, a „dAb” kifejezés antigént specifikusan kötõ, antitesteredetû egyvariábilisdoménes (VH vagy VL) polipeptidet jelent. Egy adott „dAb” más V doménektõl függetlenül köt antigént, azonban, a leírás szerinti értelemben, egy adott „dAb” más VH vagy VL doménekkel együtt homo- vagy heteromultimerként lehet jelen, ahol a többi domén nem szükséges ahhoz, hogy a dAb antigént kössön, azaz, ahol a dAb a további VH vagy VL doménektõl függetlenül köt antigént. Az antitesteredetû, variábilis egydomének, például VHH, a legkisebb ismert antigénkötõ antitestek. Terápiás alkalmazásra, elõnyösek az emberi antitestek, elsõsorban azért, mert nem annyira valószínû, hogy betegeknek való beadás esetén immunválaszt váltanak ki. Ahogyan a fentiekben megjegyeztük, a nem tevefélékbõl származó, izolált VH domének hajlamosak viszonylag rosszul oldódni és gyakran expresszálódnak gyengén. A tevefélékbõl származó VHH és az emberi antitesteredetû VH domének összehasonlítása számos kulcsfontosságú különbségre világított rá a tevefélék, emberi VH domének VH/VL interfészének megfelelõ VHH doménjének vázrégióiban. Elvégezték az emberi VH3 ezen aminosavainak a VHH-szekvenciára jobban emlékeztetõ mutációját (különösen Gly 44®Glu, Leu 45®Arg és Trp 47®Gly csere), amellyel olyan „tevésített” emberi VH doméneket akartak elõállítani, amelyek antigénkötõ aktivitásuk megtartása mellett [Davies és Riechmann, FEBS Lett. 339, 285–290 (1994)] jól expresszálhatók és oldhatók. (A variábilis domén aminosavainak leírásban alkalmazott számozása összhangban van a Kabat-féle számozási konvencióval [Kabat és munkatársai, Sequences of Immunological Interest, 5. kiad., kiad.: U. S. Dept. Health & Human Services, Washington, D. C. (1991)]. A WO 03/035694 számú nemzetközi közzétételi irat (Muyldermans) ismertette, hogy a Trp 103®Arg mutáció javította a nem tevefélékbõl származó VH domének oldhatóságát. Davies és Riechmann [Davies és Riechmann, Biotechnology N. Y. 13, 475–479 (1995)] is ismertette tevésített, emberi VH domének fágbemutatásos repertoárjának elõállítását és az olyan klónok szelektálását, amelyek a haptént 100–400 nM tartományba esõ affinitással kötötték, azonban a fehérjeantigén kötésére szelektált klónok affinitásai gyengébbek voltak. A WO 00/29004 számú nemzetközi közzétételi irat (Plaskin és munkatársai) és Reiter és munkatársai [Reiter és munkatársai, J. Mol. Biol. 290, 685–698 (1999)] ismertet olyan, egéreredetû antitestbõl származó és E. coliban expresszált, izolált VH doméneket, amelyek igen stabilak voltak és a nanomoláris tartományba esõ affinitással kötöttek fehérjeantigéneket. A WO 90/05144 számú nemzetközi közzétételi iratban (Winter és munkatársai) a kipróbálás célját szolgáló lizozimet 19 nM disszociációs konstanssal kötõ, egéreredetû VH doménbõl származó antitestfragmentumot írtak le.

1

HU 004 725 T2

A WO 02/051870 számú nemzetközi közzétételi irat (Entwistle és munkatársai) kipróbálás célját szolgáló antigéneket kötõ, emberi VH-eredetû egydoménes antitestfragmentumokat, így Brucella antigénre specifikus scFv¹t 117 nM affinitással kötõ VH domént és FALG elleni IgG¹t kötõ VH domént ismertet. Tanha és munkatársai [Tanha és munkatársai, J. Biol. Chem. 276, 24774–24780 (2001)] kipróbálás célját szolgáló antigénként alkalmazott két monoklonális antitestet kötõ, mikromoláris tartományba esõ disszociációs konstansú, tevésített emberi VH domén szelekcióját írják le. Az US 6.090.382 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Safeld és munkatársai) az emberi aTNF¹et 10–8 M vagy annál alacsonyabb affinitással kötõ, az emberi aTNF¹re 10–3 see–1 vagy annál alacsonyabb disszociációs sebességû [off-rate (Koff)] és standard L929-sejtekkel végzett vizsgálatban emberi aTNF¹et semlegesítõ emberi antitesteket ír le. Bár sok antitest és azok származéka alkalmas diagnosztikára és terápiára, az antitestek ideális farmakokinetikáját konkrét alkalmazás során gyakran nem sikerül elérni. Az antitestmolekulák farmakokinetikájának javítása céljából, a találmány tárgyát variábilis egydoménes régiójú, fokozott stabilitást és féléletidõt biztosító polimerekhez kapcsolt polipeptidek képezik. A polimermolekulák (például, polietilénglikol, PEG) fehérjékhez való kapcsolása jól ismert, és ezekrõl kimutatták, hogy modulálják a módosított fehérjék farmakokinetikai tulajdonságait. Például, fehérjék PEG-gel való módosításáról kimutatták, hogy megváltoztatja az in vivo keringési féléletidõt, antigenicitást, oldhatóságot, és a fehérje proteolízissel szembeni ellenállását [Abuchowski és munkatársai, J. Biol. Chem., 252, 3578 (1977); Nucci és munkatársai, Adv. Drug Delivery Reviews, 6, 133 (1991); Francis és munkatársai, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3, szerk: Borchardt; és Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, 235–263, kiad.: Plenum, NY (1991)]. Fehérjemolekulák irányított és random PEG-ezése a technikában ismert [lásd például: Zalipsky és Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, 347–370, kiad.: Plenum, NY (1992); Goodson és Katre, Bio/Technology, 8, 343 (1990); Hershfield és munkatársai, PNAS 88: 7185 (1991)]. Konkrétabban, antitestmolekulák random PEG-ezését már leírták lizin aminosavak és tiolált származékok esetében [Ling és Mattiasson, Immunol. Methods 59, 327 (1983); Wilkinson és munkatársai, Immunol. Letters, 15, 17 (1987); Kitamura és munkatársai, Cancer Res. 51: 4310 (1991); Delgado és munkatársai, Br. J. Cancer, 73, 175 (1996); Pedley és munkatársai, Br. J. Cancer, 70, 1126 (1994)]. A találmány összefoglalása A találmány azon a felismerésen alapul, hogy polimercsoportok, például PEG, kötése antitesteredetû, variábilis egydoménes polipeptidekhez (domén antitestek, dAb) hosszabb in vivo féléletidõt és proteolízissel szembeni fokozott ellenállást biztosít a dAb aktivitásá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

nak vagy a célhoz való kötési affinitásának elvesztése nélkül. A találmány tárgyát képezik olyan, különbözõ formátumú dAb molekulák, így dimerek, trimerek és tetramerek, amelyek egy vagy több polimermolekulához, például PEG-hez, vannak kapcsolva. A találmányt a mellékelt szabadalmi igénypontok 1. igénypontja szerinti legtágabb értelemben kell értelmezni. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptid féléletideje 1,3 és 70 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel nem kapcsolt polipeptidhez képest az ugyanolyan, de PEG-gel kapcsolt polipeptid aktivitásának legalább 90%¹át megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt polipeptid egy adott ligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis domén univerzális vázat tartalmaz. A találmány egy további megvalósítási módjában, az univerzális váz a DP47¹et, DP45¹öt és DP38¹at tartalmazó csoportból választott VH vázat tartalmaz; és/vagy a VL váz DPK9. A találmány tárgya továbbá az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely aTNF¹re specifikus antigénkötõ helyet tartalmaz, a polipeptid tartalmaz egy vagy két, antitesteredetû variábilis domént, amely variábilis domén(ek) mindegyikének van aTNF¹et kötõ helye. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint a polipeptid 50 nM–20 pM disszociációs konstanssal és 5×10–7–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a polipeptid 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány egy további megvalósítási módjában, a PEG-gel kapcsolt polipeptid univerzális vázat tartalmaz, ahol az univerzális váz a DP47¹et, DP45¹öt és DP38¹at tartalmazó csoportból választott VH vázat tartalmaz; és/vagy a VL váz DPK9. Továbbá, a találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amelynek féléletideje legalább 1,3 óra, és ahol a PEG közvetlenül vagy közvetetten az antitesteredetû, variábilis egydoménhez az antitesteredetû, variábilis egydomén cisztein vagy lizin aminosavához van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén egy elõre meghatározott helyén található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a PEG a variábilisrégió-eredetû vázban, az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ régióban lévõ cisztein vagy lizin aminosavnál van kapcsolva.

1

HU 004 725 T2

A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a PEG a C¹ és/vagy N¹terminálistól legalább két aminosavtávolságra elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavhoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG a Gln13, Pro41, vagy Leu115 csoportból választott pozíciónál szubsztituált cisztein vagy lizin aminosavat tartalmazó, nehézlánc-eredetû variábilis doménhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminális csuklórégiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén nehézlánc-eredetû variábilis domén. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén könnyûlánc-eredetû variábilis domén (VL). A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid féléletideje 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén Xa1/2 ideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén tb1/2, ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely legalább 1,3 óra féléletidejû, antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt multimere és ahol a PEG a multimerhez a multimer cisztein vagy lizin aminosaván át kapcsolódik, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõhelye, és minden variábilis dolmén, mint a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén, köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta dimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta trimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének legalább egyikének egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu115 alkotta csoportból választott. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménekhez a C¹ és/vagy N¹terminálistól legalább két aminosavval távolabb elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavhoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén ta1/2 ideje 0,25 és 5,8 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén tb1/2 ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt multimer formájában lévõ polipeptid, amely két vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A multimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimernek 3, 4, 5, 6, 7, vagy 8 antitesteredetû, variábilis egydoménje van. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt multimer féléletideje legalább 1,3 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén ta1/2, ideje 0,55 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén tb1/2, ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydomén alkotta trimerhez vagy tetramerhez, a multimer egyik variábilis doménjének vázrégiója által biztosított, elõre meghatározott cisztein vagy lizin aminosavnál kapcsolódik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer egyik, antitesteredetû, variábilis egydoménjének C¹terminálisán vagy N¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, va-

1

HU 004 725 T2

riábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu115 alkotta csoportból van kiválasztva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménekhez a C¹ vagy N¹terminálistól legalább két aminosav távolságra elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavnál van kapcsolva. Továbbá, a találmány tárgyát az 1. igénypontban meghatározott, aTNF¹re specifikus kötõhelyet tartalmazó polipeptid képezi, amely polipeptid egy vagy több, antitesteredetû, variábilis domént tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A polipeptid 20 és 60 kDa közötti méretû PEG-polimerhez van kapcsolva. A polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid ta1/2 féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2 féléletideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid variábilis domént tartalmaz, amely a variábilis domén cisztein vagy lizin aminosavánál lévõ PEG-csoporthoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu115 alkotta csoportból van kiválasztva. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely homomultimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletideje legalább 1,3 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

variábilis domén a homomultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A homomultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer ta1/2, féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2 féléletideje 1 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a homodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer specificitást mutat aTNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménje aTNF¹et köt. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10 –1 –1×10 –7 s –1 K off -sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménje 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének

1

HU 004 725 T2

alkotta heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely heteromultimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletideje legalább 1,3 óra, és minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden antitesteredetû, variábilis egydomén a heteromultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A heteromultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer féléletideje 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer ta1/2 féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2 féléletideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heterodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a heterodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer specificitást mutat aTNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározva, a heteromultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer 500 nM és 50 pM közötti ND 50 -értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje specificitást mutat a aTNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározva, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis egydomén formájában lévõ polipeptid, amely – a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEGgel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva – aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis doménnek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén, a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásának legalább 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF-hez való kötõdésének felszíni plazmonrezonanciával végzett mérésével határozzuk meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50¹ vagy ND50-értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén IC50¹ vagy ND50-értékét maximum 10%-kal haladja meg. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, egy adott célantigénre specifikus, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely domén a célantigént 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köti. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely a célantigént 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köti. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely a célantigént 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köti. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval köt emberi aTNF¹et.

1

HU 004 725 T2

A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban – 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimerrel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménes homomultimernek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer aTNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimernek az aTNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50értéke a PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer IC50-értékét maximum 10%-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden tagja vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer olyan, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, amelyet úgy változtattunk meg, hogy az további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimerhez képest aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer aTNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitását a heteromultimernek az aTNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer IC50-értékét maximum 10%-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden tagja vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden antitesteredetû, variábilis egydomént úgy változtatunk meg, hogy az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második tagot tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a fenti homo- vagy heteromultimer dimer, trimer vagy tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a fenti homo- vagy heteromultimer PEG-csoportja elágazó PEG. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt homomultimerének formájában lévõ polipeptid, amely 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel köt egy adott cél antigént.

1

HU 004 725 T2

A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt homomultimerek 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (K d ) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval kötnek emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést a PEG-gel kapcsolt homomultimer aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt homomultimer – standard sejtes vizsgálatban – 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány tárgyát az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid képezi, amely antitesteredetû, variábilis egydomén egy elõre meghatározott helyén lévõ, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt lizin aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG, PEG-gel kapcsolt aktív N¹hidroxil-szukcimid-észter formájában kapcsolódik az oldószer által elérhetõ lizinhez. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktív N¹hidroxil-szukcimid-észtert az alábbi csoportból választjuk: PEG–O–CH2CH2CH2–CO2–NHS; PEG–O–CH2–NHS; PEG–O–CH2CH2–CO2–NHS; PEG–S–CH2CH2CO–NHS; PEG–O2CNH–CH (R)–CO2–NHS; PEG–NHCO–CH2CH2–CO–NHS; és PEG–O–CH2–CO2–NHS; ahol R jelentése ((CH2)4)NHCO2(mPEG). A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG elágazó PEG. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely antitesteredetû, variábilis egydomén multimere, a multimer minden tagja legalább egy, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt lizin aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, az oldószer által elérhetõ lizin aminosav a Gln13,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

Pro41 vagy Leu115 csoportból választott egy vagy több aminosav mutációjának eredménye. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer homomultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer heteromultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer hetero- vagy homomultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer hetero- vagy homotatramer. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomén homovagy heterotrimer vagy tetramer polipeptid, amely legalább egy, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt cisztein aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az oldószer által elérhetõ ciszteinhez az alábbi csoportból választott, szulfhidrilre szelektív reagenssel van kapcsolva: maleimid, vinil-szulfon és tiol. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és az oldószer által elérhetõ cisztein aminosav az alábbi csoportból választott egy vagy több aminosav mutációjának eredménye: Gln13, Pro41 vagy Leu115. A találmány tárgya továbbá az 1. igénypontban meghatározott polipeptid, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû egy variábilis régiójú polipeptid formájában, amelynek féléletideje legalább hétszer hosszabb, mint az ugyanolyan, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis régiójú polipeptidé. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, egyetlen variábilis régió hidrodinamikai mérete 24 kDa és 500 kDa közé esik. A találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptidet és valamilyen hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, legalább 1,3 óra féléletidejû és legalább 200 kDa hidrodinamikai méretû, PEG-gel kapcsolt polipeptidet és valamilyen hordozót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis egydomén heterotrimer vagy homotrimer vagy heterotetramer formájú polipeptidet tartalmaz, ahol minden variábilis domének van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén egyetlen variábilis doménként köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, PEG-gel kapcsolt polipeptidet tartalmaz, ahol a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a gyógyászati készítmény egy adott állat gyomrába történt beadása után 10%-nál alacsonyabb mértékben bomlik le. Elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból választott proteázzal való in vitro érintkeztetés esetén 10%-nál ki-

1

HU 004 725 T2

sebb mértékben bomlik le: pepszin, tripszin, elasztáz, kimotripszin, és karboxipeptidáz, ahol, amennyiben a proteáz pepszin, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 10%-nál alacsonyabb mértékben bomlik le pepszin jelenlétében, pH=2,0-nál 30 percig végzett inkubálás során, és ahol, amennyiben a proteáz tripszin, elasztáz, kimotripszin, vagy karboxipeptidáz a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 10%-nál alacsonyabb mértékben bomlik le tripszin, elasztáz, kimotripszin, vagy karboxipeptidáz jelenlétében, pH=8,0-nál 30 percig végzett inkubálás során. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény alkalmas orális beadásra vagy alkalmas az alábbi csoportból választott módon történõ parenterális beadásra: intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális injekció, implantáció, rektális és transzdermális beadás. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény hosszan tartó felszabadulást biztosító parenterális vagy orális dozírozású készítmény. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén nehézlánc-eredetû variábilis domén (VH). A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén könnyûlánc-eredetû variábilis domén (VL). A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polimerrel kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén ta1/2, ideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polimerrel kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén tb1/2 ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely legalább 0,25 óra féléletidejû, antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt multimere, és ahol a PEG a multimerhez a multimer cisztein vagy lizin aminosaván át kapcsolódik, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõhelye, és minden variábilis domén, mint a multimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén, köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta dimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta trimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, egyetlen domének legalább egyikének egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén ta1/2 ideje 0,25 és 5,8 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén tb1/2 ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt mutlimere formájában lévõ polipeptid, amely két vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A PEG-gel kapcsolt multimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimernek 3, 4, 5, 6, 7, vagy 8 antitesteredetû, variábilis egydoménje van. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt multimer féléletideje legalább 0,25 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aVA ideje 0,55 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t1/2 ideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis-egydoménes trimerhez vagy tetramerhez, a multimer variábilis doménje által biztosított, elõre meghatározott cisztein vagy lizin aminosavnál kapcsolódik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antigénkötõ helyet tartalmazó polipeptid, amely polipeptid egy vagy több antitesteredetû, variábilis domént tartalmaz, ahol a polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletidje legalább 0,25 óra, ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tartalmaz aTNF¹re specifikus kötõhelyet, a poli-

1

HU 004 725 T2

peptid tartalmaz egy vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént, ahol polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletidje legalább 0,25 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A polipeptid 20 és 60 kDa közötti méretû PEG-polimerhez van kapcsolva. A polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid ta1/2 féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2 féléletideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid variábilis domént tartalmaz, amely a variábilis domén cisztein vagy lizin aminosavánál lévõ PEG-csoporthoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely homomultimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletideje legalább 0,25 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén a homomultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén ként köt antigént. A homomultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer ta1/2, féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2 féléletideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy VH¹t vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

mer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a homodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer specificitást mutat aTNF¹ra. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje aTNF¹et köt. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta heteromultimer formájában lévõ polipeptid, ahol a heteromultimer hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és féléletideje legalább 0,25 óra, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden antitesteredetû, variábilis egydomén a heteromultimerben lévõ, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A heteromultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,25 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer ta1/2 féléletideje 0,25 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tb1/2, féléletideje 2 és 40 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy VH¹t vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva.

1

HU 004 725 T2

A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a heteromultimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer specificitást mutat aTNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a heteromultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer 500 nM és 50 pM közötti ND 50 -értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje aTNF¹re specificitást mutat. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatárva, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis egydomén formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEGgel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis doménnek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásának legalább 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF-hez való kötõdésének felszíni plazmonrezonanciával végzett mérésével határozzuk meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le az emberi aTNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban – 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50 vagy ND50-értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén IC50¹ vagy ND50-értékét maximum 10%-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, egy adott célantigénre specifikus, antitesteredetû, variábilis egydomén a célantigént 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köti. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval köt emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban – 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely – a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva – aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimernek egy adott célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer aTNF-hez való kötõdésével mérjük.

1

HU 004 725 T2

A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimernek, az aTNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50értéke a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer IC50-értékét maximum 10%-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden tagja vagy VH¹t vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer olyan, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, amelyet úgy változtattunk meg, hogy az további cisztein aminosavat tartalmazzon antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimerhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimernek egy adott célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer aTNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitását a heteromultimernek az aTNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC50értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer IC50-értékét maximum 10%-kal haladja meg.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

2

A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden tagja vagy VH¹t vagy pedig VL¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánceredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt homomultimerének formájában lévõ polipeptid, amely 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott cél antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt homomultimer 50 nM és 20 pM közötti disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–1–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval köt emberi aTNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt homomultimer aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt homomultimer 500 nM és 50 pM közötti ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 80 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 3 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 100 nM és 30 pM közötti Kd-értékkel specifikusan köt egy adott célantigént.

Meghatározások A leírás szerinti értelemben, a „domén” kifejezés 60 olyan feltekert fehérjeszerkezetet jelent, amely tercier 12

1

HU 004 725 T2

szerkezetét a fehérje többi részétõl függetlenül megtartja. Általában, domének felelõsek a fehérjék különálló funkcionális tulajdonságaiért, és sok esetben hozzáadhatók, eltávolíthatók vagy egy másik fehérjébe átvihetõk a fehérje maradéka és/vagy a domén mûködésének elvesztése nélkül. Az „antitesteredetû, variábilis egydomén” kifejezés olyan feltekert polipeptiddomént jelent, amely immunglobulin-eredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvenciákat tartalmaz és amely specifikusan (azaz, a 1 mM vagy annál kevesebb disszociációs konstanssal) köt egy adott antigént, amely variábilis egydoménként, azaz bármilyen komplementer variábilis domén nélkül, köt antigént. Ennélfogva, az „antitesteredetû, variábilis egydomén” kifejezés magában foglal teljesen antitesteredetû variábilis doméneket és módosított variábilis doméneket – például olyanokat, amelyekben egy vagy több hurok antitesteredetû variábilis doménekre nem jellemzõ szekvenciákra lett cserélve – vagy csonkolt vagy N¹, illetve C¹terminális kiterjesztést tartalmazó, antitesteredetû variábilis doméneket, továbbá variábilis doménekbõl származó, olyan feltekert fragmentumokat, amelyek megtartják 500 nM vagy kevesebb (például, 450 nM vagy kevesebb, 400 nM vagy kevesebb, 350 nM vagy kevesebb, 300 nM vagy kevesebb, 250 nM vagy kevesebb, 200 nM vagy kevesebb, 150 nM vagy kevesebb, 100 nM vagy kevesebb) disszociációs konstansukat és a teljes hosszúságú domén, célantigénnel szembeni specificitását. Elõnyös, ha a találmány szerinti megoldásban alkalmazható antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból választott: VH és VL, így Vk és Vl. A találmány szerint, a megoldásban leírt, VH-doméneket hasznosító eljárások és készítmények képesek hasznosítani tevefélékbõl származó VHH-doméneket. Antitesteredetû, variábilis egydoméneket leírtak már a technika állása szerint, így azok ismertek [például Ward és munkatársai, Nature 341, 544–6 (1989), amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi]. Az „antitesteredetû, variábilis egydomén” kifejezésbe nem csak izolált, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid, hanem egy adott antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidszekvencia egy vagy több monomerjét tartalmazó, nagyobb polipeptidek is tartoznak. A leírás szerinti értelemben, egy „doménantitest” vagy „dAb” egyenértékû egy „antitesteredetû, variábilis egydomén” polipeptiddel. A leírás szerinti értelemben, az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid emlõseredetû, elõnyösen emberi – de magában foglalja a rágcsálókból származó (például, a WO 00/29004 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint, amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi) – egyetlen immunglobulin-eredetû variábilis-doménes polipeptidet vagy a tevefélékbõl származó VHH dAb-okat. A tevefélékbõl származó dAB¹ok olyan antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek, amelyek a teve, láma, alpakka, dromedár és guanakó alkotta csoportból származó fajokból származnak és nehézlánc-eredetû, könnyûlánc nélküli anti-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

testeket tartalmaznak: VHH. A VHH-molekulák az IgGmolekuláknál körülbelül tízszer kisebbek, és egyedülálló polipeptidekként rendkívül stabilak, extrém pH¹nak és hõmérsékleti körülményeknek is ellenállnak. Továbbá, a tevefélék antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidjei a proteázok hatásának ellenállnak. Tevefélékbõl származó antitestek vannak leírva, például, az US 5 759 808; 5 800 988; 5 840 526; 5 874 541; 6 005 079; és 6 015 695 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, amely publikációk teljes egészében a kitanítás részét képezik. A találmány szerint alkalmas, tevefélékbõl származó, VHH antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek közé tartozik a tevefélékbõl származó antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek azon osztálya, amelyben az emberéhez hasonló szekvenciák vannak, ahol az osztályt az jellemzi, hogy a VHH-domén a Kabat-féle számozás szerinti 45. pozícióban a glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, metionin, szerin, treonin, aszparagin, és glutamin alkotta csoport bármelyik aminosavat, mint például L45, és a 103. pozícióban pedig triptofánt tartalmaz. Humanizált, tevékbõl származó VHH polipeptidek ismertek, például a WO 04/041862 számú nemzetközi közzétételi iratból (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). A szakember számára egyértelmû, hogy a természetes körülmények között elõforduló, tevefélékbõl származó antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek a WO 04/041862 számú nemzetközi közzétételi irat (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi) kitanításai szerint módosíthatók humanizált, tevékbõl származó VHH polipeptidek elõállítása céljából. A leírás szerinti értelemben, az „antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid”, „antitesteredetû, variábilis egydomén”, „egyetlen, antitesteredetû variábilis domén” és „immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén” kifejezéseket egymással egyenértékûnek tekintjük. A leírás szerinti értelemben, az „immunglobulin-eredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvencia” kifejezés 20 feletti vagy több, 25 vagy több, 30 vagy több, 35 vagy több, 40 vagy több, 45 vagy több, vagy akár 50 vagy több, egymással érintkezõ aminosavból álló, immunglobulin-eredetû variábilis domén szekvenciával homológ aminosavszekvenciát jelent. A leírás szerinti értelemben, a „kapcsolt” kifejezés a PEG-polimercsoportnak a találmány szerinti, antitesteredetû variábilis egydomén vagy variábilis-egydoménes polipeptid egyik aminosavához való kapcsolását jelenti. Egy adott PEG-polimer egy adott dAb vagy polipeptid aminosavához való kapcsolását „PEG-ezésnek” nevezzük, és ez elérhetõ a PEG kapcsolására szolgáló különféle csoportok, így például – minden korlátozás nélkül – N¹hidroxil-szukcinimid (NHS) aktív észter, szukcinimidil-propionate (SPA), maleimid (MAL), vinilszulfon (VSZ), vagy tiol, révén. PEG-polimer egy elõre meghatározott pozíciónál kapcsolható egy dAb-polipeptidhez vagy véletlenszerûen kapcsolható a dAbmolekulához. Elõnyös, azonban, ha a PEG-polimert

1

HU 004 725 T2

elõre meghatározott pozíciónál kapcsoljuk egy dAbhez vagy polipeptidhez. PEG-polimert kapcsolhatunk a dAb-ban vagy polipeptidben lévõ bármelyik aminosavhoz, azonban elõnyös, ha a polimer kapcsolása a dAbban vagy polipeptidben természetesen elõforduló lizinhez vagy ciszteinhez, vagy a dAb¹ba vagy polipeptidbe génsebészeti úton, például, a dAb-ban természetes körülmények között elõforduló aminosav vagy ciszteinre vagy pedig lizinre történõ mutagenezisével, beépített lizinhez vagy ciszteinhez történik. A leírás szerinti értelemben, a „kapcsolt” kifejezés két vagy több, antitesteredetû, variábilis-doménes polipeptidbõl származó monomer összekapcsolódását jelenti dimer, trimer, tetramer vagy más multimer formává. dAb monomerek a technikában ismert több eljárással – így, minden korlátozás nélkül, a dAb monomerek fúziós fehérjeként történõ expressziója, két vagy több monomer összekapcsolása monomerek közötti peptidlinker révén, vagy a transzláció után, a monomerek közvetlenül vagy linker révén diszulfidkötésekkel egymáshoz való kémiai kapcsolásával, vagy di¹, tri- vagy multivalens csoportok (például, többágú PEG) kapcsolásával – kapcsolhatók össze multimerré. A leírás szerinti értelemben, egy adott antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidhez „közvetlenül kapcsolt” polimer vonatkozásában alkalmazott „közvetlenül kapcsolt” kifejezés olyan helyzetet jelent, amelyben a polimer egy adott (természetes eredetû, vagy génsebészettel megváltoztatott) a variábilis domén részét képzõ például, nem a konstans régióban, csuklórégióban vagy linkerpeptidben lévõ – aminosavhoz van csatlakoztatva. Viszont, a leírás szerinti értelemben, egy adott antitesteredetû, variábilis egydoménhez való „közvetetten kapcsolás” kifejezés egy adott polimermolekula valamely antitesteredetû, variábilis egydoménhez való kapcsolását jelenti, ahol a polimermolekula nincs olyan aminosavhoz kapcsolva, amely a variábilis régió részét képezné (például, a csuklórégióhoz köthetõ). Egy adott polimer akkor van „közvetetten kapcsolva”, ha az likerpeptiden át van a variábilis egydoménhez kapcsolva, vagyis a polimer nincs olyan aminosavhoz csatlakoztatva, amely önmagában az antitesteredetû, variábilis egydomén részét képezi. Esetleg, egy adott polimer „közvetetten kapcsolódik” valamely antitesteredetû, variábilis egydoménhez, ha a polimer a variábilis egydomén C¹terminális csuklórégiójához, vagy az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid részeként jelen levõ konstans régió bármelyik aminosavához van kapcsolva. A leírás szerinti értelemben, a „homológia” vagy „hasonlóság” vagy „azonosság” kifejezések arra utalnak, hogy két nukleotid- vagy aminosavszekvencia szerkezetileg milyen mértékben hasonlítanak egymásra. A találmány szerinti homológ szekvencia lehet az aminosavak addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával módosított polipeptid, ahol a módosítás lényegében nem változtatta meg a mûködési jellemzõket a nem módosított polipeptidével összehasonlítva. Ahol a találmány szerinti antitesteredetû, variábilis-

2

egydoménes polipeptid tevefélékbõl származó polipeptid, a találmány szerinti homológ szekvencia lehet más Camelidae fajban, például, tevében, dromedárban, lámában, alpakkában vagy guanakóban létezõ 5 szekvencia. A leírás szerinti értelemben, a szekvencia „hasonlóság” kifejezés arra utal, hogy a rendezett szekvenciák esetén az aminosavszekvenciák milyen mértékben tartalmaznak hasonló aminosavakat a megfelelõ pozíciókban. Aminosavak akkor hasonlíta10 nak egymásra, ha oldalláncaik hasonlóak. A „hasonlóság” elsõsorban olyan aminosavakra vonatkozik, amelyek egymásra való cseréje konzervatív szubsztitúciónak számít. „Konzervatív” szubtitúciónak számít minden olyan szubsztitíció, amely a blosum62 substitution 15 mátrixban pozitív pontszámú [Hentikoff és Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915–10919 (1992)]. A leírás szerinti értelemben, az „A szekvencia n%¹ban hasonlít a B szekvenciához” kijelentés azt jelenti, hogy az A és B szekvenciák optimális globális egyez20 tetése esetén a pozíciók n%¹ában azonos aminosavak vagy konzervatív szubsztitúciók vannak. Optimális egyeztetés elvégezhetõ a Needleman–Wunsch egyeztetési algoritmusban az alábbi paraméterek alkalmazásával: 25 Polipeptidekre Szubsztitúciós mátrix: blosum62. Réspontozási funkció (Gap scoring function): –A –B*LG, ahol A=11 [a rés büntetõpontja (the gap pe30 nalty)], B=1 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty) és LG a réshossz (the length of the gap)].

35

40

45

50

55

60 14

Nukleotidszekvenciákra Szubsztitúciós mátrix: 10 az egyezésekre, 0 a nem egyezésekre. Réspontozási funkció (Gap scoring fiinction): –A –B*LG, ahol A=50 [a rés büntetõpontja (the gap penalty)], B=3 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty)] és LG a réshossz (the length of the gap). Jellemzõ konzervatív szubsztitúciók a Met, Val, Leu és Ile; a Ser és Thr; az Asp, Glu és Asn; a Gln, Lys és Arg; vagy az aromás Phe és Tyr aminosavak közötti szubsztitúciók. A leírás szerinti értelemben, két szekvencia akkor „homológ” egymással vagy „hasonlít” egymáshoz, ha a Needleman-Wunsch algoritmus vagy a Tatusova és Madden által leírt „BLAST 2 sequences” algoritmus [Tatusova és Madden, FEMS Microbiol Lett. 174, 247–250 (1999)] alkalmazásával végzett egyeztetéskor a szekvenciák vonatkozásában legalább 85%ban hasonlítanak egymásra. Aminosavszekvenciák „BLAST 2 sequences algorithm” alkalmazásával végzett egyeztetésekor a Blosum 62 mátrix az alapértelmezett mátrix. A leírás szerinti értelemben, az „alacsony sztringenciájú”, „közepes sztringenciájú”, „magas sztringenciájú” vagy „nagyon magas sztringenciájú körülmények” kifejezések nukleinsavhibridizációs és ¹mosási körülményeket írnak le. Hibridizációs reakciók elvégzésére szolgáló útmutatások a Current Protocols in

1

HU 004 725 T2

Molecular Biology [Current Protocols in Molecular Biology, kiad.: John Wiley & Sons, N. Y. (1989)] címû könyvben találhatók (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). A hivatkozott publikációban leírt vizes és nem vizes eljárások egyaránt alkalmazhatók. A leírásban megadott specifikus hibridizációs körülmények az alábbiak: (1) alacsony sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6× nátrium-klorid/nátrium-citrát (SSC) oldatban körülbelül 45 °C¹on, majd két mosás 0,2× SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban legalább 50 °C¹on (alacsony sztringenciájú körülmények esetén, a mosások hõmérséklete 55 °C¹ra növelhetõ); (2) közepes sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6× SSC-ben körülbelül 45 °C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2× SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban 60 °C¹on; (3) magas sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6× SSC-ben körülbelül 45 °C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2× SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban 65 °C¹on; és elõnyösen (4) nagyon magas sztringenciájú körülmények: hibridizálás 0,5 M nátrium-foszfát/7% SDS-tartalmú oldatban 65 °C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2× SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban 65 °C¹on. A leírás szerinti értelemben, a „specifikusan köti” kifejezés egy antigénnek egy antigéneredetû, variábilis egydoménhez, 1 mM vagy annál alacsonyabb disszociációs konstanssal (Kd) való kötõdését jelenti, ahol a kötõdést felszíni plazmonrezonanciával mérjük, például, BiaCore™ felszíni plazmonrezonanciás rendszer és BiaCore™ kinetikai értékelõ szoftverrel (például, 2.1 verzió) alkalmazásával. Specifikus kölcsönhatás esetén az affinitás vagy K d elõnyösen körülbelül 500 nM vagy alacsonyabb, elõnyösen körülbelül 300 nM, elõnyösen körülbelül 100 nM vagy alacsonyabb, még elõnyösebben körülbelül 80 nM vagy alacsonyabb, és elõnyösen akár 10 pM. A leírás szerinti értelemben, a „magas affinitású kötõdés” kifejezés olyan kötõdést jelent, amelynek Kd¹je 100 nM¹al egyenlõ vagy annál alacsonyabb. A leírás szerinti értelemben, a „koncentrációnál” kifejezés egy adott oldatban (elõnyösen vizes oldatban) a megadott tömegben vagy térfogategységre megadott moláris mennyiségben oldott polipeptidet jelent, és így a kifejezés magában foglalja a moláris koncentrációt és a tömeg/térfogat százalékot. Egy „adott X koncentrációban” vagy „legalább X koncentrációban” jelen lévõ polipeptid kifejezés nem a polipeptid szárított vagy kristályos készítményeire nem vonatkozik. A leírás szerinti értelemben, a „repertoár” kifejezés sokféle változat – például nukleotidszekvencia tekintetében különbözõ nukleinsavváltozatok vagy aminosavszekvencia tekintetében különbözõ polipeptidváltozatok – gyûjteményét jelenti. A találmány szerinti könyvtár polipeptidek vagy nukleinsavak repertoárját tartalmazza. A találmány szerint, egy adott generikus ligandum számára kötõhelyet és egy adott célligandum számára kötõhelyet tartalmazó polipeptidrepertoárt terveztünk. A kötõhelyek egymást átfedhetik, vagy lehetnek a molekula ugyanazon régiójában, de specifikusságuk eltérõ. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

könyvtár legalább 1000 tagot tartalmazó polipeptidrepertoár. A leírás szerinti értelemben, a „könyvtár” kifejezés heterogén polipeptidek vagy nukleinsavak keverékét jelenti. A könyvtár olyan tagokból áll, amelyek mindegyikének egyetlen polipeptid- vagy nukleinsavszekvenciája van. Ebben az értelemben, a könyvtár és a repertoár jelentése azonos. A könyvtár tagjai közötti szekvenciakülönbségek felelõsek a könyvtárban fennálló változatosságért. A könyvtár lehet polipeptidek vagy nukleinsavak egyszerû keverékének formájában, vagy lehet nukleinsavkönyvtárral transzformált szervezetek vagy sejtek – például, baktériumok, vírusok, állati vagy növényi sejtek és hasonlók – formájában. Elõnyös, ha minden egyedi organizmus vagy sejt csak egyetlen vagy korlátozott számú könyvtártagot tartalmaz. A nukleinsavak által kódolt polipeptidek expressziójának biztosítása céljából elõnyös, ha a nukleinsavak expressziós vektorokba vannak beépítve. A találmány egy elõnyös szempontja szerint, egy adott könyvtár lehet gazdaszervezetek populációjának formájában, ahol minden organizmus a könyvtár egyetlen tagját tartalmazó expressziós vektor egy vagy több kópiáját tartalmazza olyan nukleinsav formájában, amely a megfelelõ polipeptidtag elõállítása végett expresszálható. Eszerint, a gazdaszervezetek populációja potenciálisan képes arra, hogy genetikailag sokféle polipeptidváltozat hatalmas repertoárját kódolja. A leírás szerinti értelemben, a „polimer” ismétlõdõ monomeregységekbõl készült makromolekula, és a kifejezés jelenthet szintetikus vagy természetes körülmények között elõforduló polimert, mint például – adott esetben – szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú polialkilént, polialkenilént, vagy polioxi-alkilén-polimert vagy elágazó vagy el nem ágazó poliszacharidot. A leírás szerinti értelemben, a „polimer” kifejezés jelentése elõnyösen poli(etilénglikol), polipropilénglikol vagy poli(vinil-alkohol) vagy ezek származéka, amelyek adott esetben szubsztituáltak. A leírás szerinti értelemben, a „PEG” vagy „PEGpolimer” polietilénglikolt jelent, illetve konkrétabban jelenthet derivatizált PEG¹et, ideértve – minden korlátozás nélkül – a PEG N¹hidroxiszukcinimid (NHS) aktív észtereit, mint amilyenek például az alábbiak: szukcinimidil-propionát, benzo-triazol aktív észterek, maleimiddel, vinil-szulfonokkal vagy tiolcsoportokkal derivatizált PEG. Konkrét PEG-készítmények közé tartozhatnak az alábbiak: PEG–O–CH2CH2CH2–CO2–NHS; PEG–O–CH 2 –NHS; PEG–O–CH 2 CH 2 –CO 2 –NHS; PEG–S–CH 2 CH 2 –CO–NHS; PEG–O 2 CNH–CH (R)–CO2–NHS; PEG–NHCO–CH2CH2–CO–NHS; és PEG–O–CH 2 –CO 2 –NHS; ahol R jelentése ((CH2)4)NHCO2(mPEG). A találmány szerinti megoldásban alkalmazható PEG-molekulák lehetnek olyan lineáris molekulák vagy lehetnek elágazók, ahol egyetlen polimerben több PEG-csoport van jelen. A találmány szerinti megoldásban különösen elõnyös PEGkonformációk közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – az alábbiak:

1

HU 004 725 T2

2

; ; mPEG-MAL m PEG2-MAL

;

; mPEG-(MAL)2

multi-arm PEG

;

mPEG2-(MAL)2

; és

mPEG2-NHS

mPEG-SPA

A leírás szerinti értelemben, a „szulfhidrilszelektív reagens” olyan reagens, amely alkalmas a PEG-polimer tioltartalmú aminosavhoz való kapcsolására.

A cisztein aminosavon lévõ tiolcsoportok szulfidrilszelektív reagenssel való kölcsönhatásra különösen alkal60 masak. A találmány szerinti megoldásban alkalmazha16

1

HU 004 725 T2

tó szulfhidrilszelektív reagensek közé tartozik – minden korlátozás nélkül – a maleimid, vinil-szulfon és tiol. A szulfhidrilszelektív regensek cisztein aminosavakhoz való kapcsolásra történõ alkalmazása a technikában ismert, és a találmány szerinti megoldásban szükség szerint adaptálható [lásd például Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6, 150 (1995); Greenwald és munkatársai, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17, 101 (2000); Herman és munkatársai, Macromol. Chem. Phys. 195, 203 (1994)]. A leírás szerinti értelemben, egy adott „antigén” valamilyen antitest antitest- vagy kötõrégiójához (például, variábilis doménhez) kötõdik. Jellemzõ, hogy az antigének képesek antitestválaszt kiváltani in vivo. Az antigén lehet peptid, polipeptid, fehérje, nukleinsav, lipid, szénhidrát vagy más molekula, és több alegységes molekulák is lehetnek antigének. Általában, immunglobulin-eredetû variábilis doméneket egy adott antigén ellen mutatott célspecificitás alapján válogatunk ki. A leírás szerinti értelemben, az „epitóp” kifejezés egy adott antitesteredetû szerkezeti egységet jelent, amelyet hagyományosan egy pár variábilis egydomén, a VH/VL pár köt. Epitópok határozzák meg a minimális kötõhelyet is egy adott antitest számára, és így célt képeznek a kérdéses antitest specifitása tekintetében. Antitesteredetû variábilis egydomének esetében egy adott epitóp felel meg izolált variábilis domén által kötött szerkezeti egységnek. A leírás szerinti értelemben, a leírtak szerint az antitesteredetû, variábilis egydoménnel kapcsolatban alkalmazott „semlegesítõ” kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptid megzavarja (például, teljesen vagy részlegesen elnyomja vagy eltörli) a célantigén valamely mérhetõ aktivitását vagy funkcióját. Egy adott polipeptidet akkor tekintünk „semlegesítõ” polipeptidnek, ha a célantigén mérhetõ aktivitását vagy funkcióját legalább 50%-ban és elõnyösen legalább 60%, 70%, 80%, 90%, 95%-ban vagy annál nagyobb arányban csökkenti, és akár egészen 100%¹os mértékben gátolja (azaz, a célantigénnek nincs kimutatható hatása vagy funkciója). A célantigén ezen mérhetõ aktivitásának vagy funkciójának csökkenését a szakember, az ilyen aktivitás vagy funkció egy vagy több indikátorának mérésére szolgáló standard eljárások alkalmazásával meg tudja határozni. Például, amennyiben a cél aTNF, a semlegesítõ aktivitás meghatározható a standard L929 sejtölési vizsgálattal vagy annak mérésével, hogy antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid képes¹e gátolni az ELAM–1 aTNF által indukált expresszióját a HUVEC¹en (amely vizsgálat az aTNF által indukált sejtaktiválást méri). A leírás szerinti értelemben, a „semlegesítõ” kifejezéssel analóg módon alkalmazott „gátolja a sejtcitotoxicitást” kifejezés a sejthalálban bekövetkezõ – például – standard L929 sejtölési vizsgálat alkalmazásával mért csökkenésre utal, ahol a sejtcitotoxicitás gátlására akkor kerül sor, ha a sejthalált legalább 10%-ban vagy annál nagyobb mértékben sikerül csökkenteni. A leírás szerinti értelemben, egy adott „célantigén mérhetõ aktivitása vagy funkciója” kifejezés – minden korlátozás nélkül – például sejt-jelátvitelt, enzimaktivi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

tást, kötõaktivitást, ligandumtól függõ internalizációt, sejtölést, sejtaktiválást, sejttúlélés elõsegítését és génexpressziót foglal magában. A szakember képes olyan vizsgálatokat végezni, amely méri az ilyen aktivitásokat egy adott célantigénre nézve. Elõnyös, ha a leírás szerinti értelemben az „aktivitás”¹t (1) sejteken alpuló vizsgálatban végzett ND50-érték; (2) egy adott célligandummal szembeni affinitás, (3) ELISA-kötõdés, vagy (4) receptorkötési vizsgálat határozza meg. Az ilyen tesztek elvégzésére szolgáló eljárásokat a szakember ismeri és azok az alábbiakban részletes leírásra kerülnek. A leírás szerinti értelemben, a „dAb aktivitás” vagy „antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitás” kifejezés az antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid antigénkötõ képességét jelenti. A leírás szerinti értelemben, az „aktivitását megtartja” kifejezés a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitási szintjére utal, amely a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitási szintjének legalább 10%¹a, elõnyösen legalább 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%¹a és akár 90%¹a, elõnyösen akár 95%, 98%¹a, és a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménben vagy polipeptidben lévõvel megegyezõ variábilis domént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitásának akár 100%¹a, ahol az aktivitás mérése a fentiekben leírtak szerint történik. Elõnyösebben, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnek vagy polipeptidnek a PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménhez vagy polipeptidhez viszonyított aktivitását antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid olyan moláris mennyiségével kell meghatározni, ahol minden vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt és PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomének mólszámának meg kell egyeznie, és ahol az egyes vizsgálatokban minden más körülménynek azonosnak kell lenniük. Annak meghatározására, hogy egy konkrét, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén „megtartja aktivitását” vagy sem, elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitását ugyanazon antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásával határozzuk meg, PEG hiányában. A leírás szerinti értelemben, a „specifikusan köti” kifejezés egy antigénnek egy immunglobulin-eredetû, variábilis doménhez vagy polipeptidhez, 1 mM vagy annál alacsonyabb disszociációs konstanssal (Kd) való kötõdését jelenti, ahol a kötõdést felszíni plazmonrezonanciával mérjük, például, BiaCore™ felszíni plazmonrezonanciás rendszer és BiaCore™ kinetikai értékelõ szoftverrel (például, 2.1 verzió) alkalmazásával. Specifikus kötési kölcsönhatás esetén az affinitás vagy Kd elõnyösen körülbelül 1 mM vagy alacsonyabb, elõnyösen 500 nM vagy alacsonyabb, elõnyösen körülbelül 100 nM, még elõnyösebben körülbelül 80 nM vagy alacsonyabb, és elõnyösen akár 10 pM. A leírás szerinti értelemben, a „heterodimer”, „heterotrimer”, „heterotetramer”, és „heteromultimer” kifeje-

1

HU 004 725 T2

zések két vagy több, különbözõ immunglobulin-eredetû variábilis-egydoménes polipeptidszekvencia két, három vagy több (például, négy, öt, hat, hét vagy akár nyolc, sõt annál több) monomerjeit tartalmazó molekulákat (megfelelõen) jelentik. Például egy adott heterodimerben lehet két VH-szekvencia, például VH1 és VH2, vagy VHH1 és VHH2, vagy esetleg tartalmazhat VH és VL kombinációt. A homodimerhez, ¹trimerhez vagy tetramerhez hasonlóan, egy adott heterodimer, heterotrimer, heterotetramer, vagy heteromultimer monomerjei összekapcsolhatók fúziós fehérjeként történõ expresszálással, például monomerek közötti peptidlinkerrel, vagy transzláció után a monomerek kémiai úton közvetlenül vagy közvetetten vagy linker – például, diszulfidkötéssel – vagy di¹, tri- vagy multivalens kapcsolócsoporthoz való kötéssel kapcsolhatók egymáshoz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heterodimer, ¹trimer, ¹tetramer, vagy ¹multimer monomerjei többkaros PEG-polimerrel kapcsolhatók egymáshoz, ahol a dimer, trimer, tetramer, vagy multimer minden monomere a fentiekben leírtak szerint vannak a többkaros PEG PEG-csoportjához kapcsolva. A leírás szerinti értelemben, a „féléletidõ” kifejezés azt az idõt jelenti, amely a ligandum (például, immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén) szérumban mért koncentrációjának – például, a ligandum lebomlása és/vagy kiválasztása (clearance) vagy a ligandum természetes mechanizmusok általi kizárása (sequestration) miatt bekövetkezõ – 50%¹os csökkenéséig eltel. A találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis egydoméneket in vivo stabilizáltuk és féléletidejüket megnöveltük a lebontásnak és/vagy kiválasztásnak vagy kizárásnak feltehetõen ellenálló molekulákhoz, például PEG-hez, való kötés révén. Egy adott dAb vagy polipeptid féléletidejét akkor tekintjük megnöveltnek, ha annak funkcionális aktivitása hosszabb ideig marad fenn, in vivo, mint a hasonló, de PEG-polimerhez nem kapcsolt dAb¹jé. Jellemzõ, hogy a PEG-ezett dAb vagy polipeptid féléletideje a nem PEG-ezett dAb-jéhez vagy polipeptidéhez viszonyítva 10%-kal, 20%-kal, 30%-kal, 40%-kal, 50%-kal vagy annál nagyobb arányban megnõtt. A féléletidõ növekedése a 2×, 3×, 4×, 5×, 10×, 20×, 30×, 50× tartományba esik sõt még annál nagyobb mértékû is lehet. Esetleg, vagy ráadásul, a féléletidõt illetõen akár 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 100×, 150× növekedés is lehetséges. A találmány szerint, egy adott, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid féléletideje 0,25 és 170 óra, elõnyösen 1 és 100 óra, elõnyösebben 30 és 100 óra, és ennél is elõnyösebben 50 és 100 óra közé esik, és akár 170, 180, 190 és 200 óra vagy annál hosszabb. A leírás szerinti értelemben, dAb-monomerhez vagy – multimerhez kapcsolt PEG vagy más polimer vonatkozásában alkalmazott „degradálásnak ellenálló” vagy „degradálásnak ellenáll” kifejezés azt jelenti, hogy amennyiben PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt dAb-monomert vagy multimert – pH=2,0-nál, 30 percig – pepszinnel érintkeztetjük, akkor a kérdéses monomer vagy multimer 10%-nál nagyobb mértékben nem deg-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 18

2

radálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A találmány szerinti, PEG-hez vagy más polimerhez kötött dAb-multimerre (például, hetero- vagy homodimer, trimer, tetramer stb.) vonatkozóan, amennyiben ilyen multimert – pH=2,0-nál, 30 percig – pepszinnel érintkeztetünk, akkor az 5%¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A leírás szerinti értelemben, a „hidrodinamikai méret” kifejezés a molekula (például, fehérjemolekula) vizes oldaton át történõ diffúzióján alapuló, nyilvánvaló méretét jelenti. A fehérje oldaton át történõ diffúziója vagy mozgása felhasználható a fehérje nyilvánvaló méretének származtatására, ahol a méretet a fehérjepartikulum „Stokes rádiuszaként” vagy „hidrodinamikai rádiuszaként” adjuk meg. A fehérje „hidrodinamikai mérete” függ a tömegtõl és az alaktól (konformáció), oly módon, hogy két, ugyanazon molekulatömegû fehérjének eltérhet a fehérjék általános konformációján alapuló hidrodinamikai mérete A PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén (ideértve a leírás szerinti, antitesteredetû, variábilis-doménes multimereket) hidrodinamikai mérete a 200–500 kDa; 250–500 kDa; 300–500 kDa; 350–500 kDa; 400–500 kDa és 450–500 kDa tartományba eshet. A találmány szerinti, PEG-ezett dAb hidrodinamikai mérete elõnyösen 200–300 kDa. A leírás szerinti értelemben, a „TAR1” kifejezés olyan dAb¹t jelent, amelynek célantigénje aTNF. A leírás szerinti értelemben, a „TAR2” kifejezés olyan dAb¹t jelent, amelynek célantigénje az emberi p55-aTNF receptor. Az ábrák rövid leírása 1. ábra: Egy sorozat PEG-ezett TAR1–5–19 formátum affinitását bemutató receptorkötési vizsgálat eredménye. 2. ábra: Egy sorozat PEG-ezett TAR1–5–19 formátum affinitását bemutató sejtcitotoxicitási vizsgálat eredménye. 3. ábra: Különféle PEG-ezett HEL4 dAb formátum lizozimhez való affinitási kötõdésének eredményeit bemutató SDS-PAGE gélek. A sávok leírása a példákban található. 4. ábra: A TAR2–10–27 és a 40 K PEG-ezett monomer affinitását bemutató receptorkötési vizsgálat eredményei. 5. ábra: A TAR1–5–19 és PEG-ezett változatok pH=2,0-nál végzett pepszinkezelés elleni proteázstabilitása. 6. ábra: dAb¹k monomer PEG-ezésének vázlatos bemutatása. 6–1. ábra: módosítatlan VH vagy VL dAb. 6–2. ábra: Felszínen PEGezett VH vagy VL. 6–3. ábra: PEG-hez kapcsolt C¹terminális ciszteint tartalmazó VH vagy VL dAb. 7. ábra: PEG-ezett VH vagy VL hetero- or homodimer dAb¹k vázlatos bemutatása. 7–4. ábra: C¹terminális diszulfidkötéssel

1

HU 004 725 T2

képzett V H vagy V L diszulfid dimer. 7–5. ábra: Egyetlen alegységen PEGezett V H vagy V L diszulfid dimer. 7–6. ábra: Mindkét alegységen PEGezett V H vagy V L diszulfid dimer. 7–7. ábra: Elágazó/villás/többkarú PEGgel a C¹terminális ciszteinen át kialakított VH vagy VL dimer. 7–8. ábra: Felszíni diszulfidkötéssel képzett VH vagy VL diszulfid dimer. 7–9. ábra: Egyetlen alegységen PEG-ezett VH vagy VL diszulfid dimer. 7–10. ábra: Mindkét alegységen PEG-ezett VH vagy VL diszulfid dimer. 7–11. ábra: Elágazó/villás/többkarú PEG-gel a felszíni ciszteineken át kialakított VH vagy VL dimer. 8. ábra: A találmány szerinti, PEG-ezett VH vagy VL hetero- vagy homodimerek további vázlatos bemutatása. 8–12. ábra: (Gly4Ser)n linkerrel (n=0–10) kialakított VH vagy VL linker dimer. 8–13. ábra: Egyetlen alegységen PEG-ezett VH vagy VL linker dimer. 8–14. ábra: Mindkét alegységen PEG-ezett VH vagy VL linker dimer. 8–15. ábra: A linker révén PEGezett V H vagy V L linker dimer. 8–16. ábra: C¹terminális cisztein aminosavat tartalmazó VH vagy VL linker dimer. 8–17. ábra: Két, diszulfidkötésekkel dimerizált VH vagy VL linker dimer. 9. ábra: PEG-ezett linker dAb dimerek vázlatos bemutatása. 9–18. és 9–19. ábrák: Egyetlen alegységen lévõ C¹terminális cisztein aminosav révén PEG-ezett VH vagy VL linker dimerek. 9–20. ábra: A linkerben lévõ cisztein révén PEG-ezett VH vagy VL linker dimer. 9–21. ábra: Egyetlen alegységen lévõ cisztein révén PEG-ezett VH vagy VL linker dimer. 9–22. ábra: Mindkét alegységen lévõ ciszteinek révén PEGezett VH vagy VL linker dimer. 10. ábra: VH vagy VL hetero- vagy homodimer dAb¹k PEG-ezésének vázlatos bemutatása. 10–23. és 10–24. ábrák: dAb tirmerek PEG-ezése és kialakítása C¹terminális aminosavak révén történõ kovalens trimerizálással 3 ágú PEG alkalmazásával. 10–25. ábra: Egy vagy több dAb monomer felszíni PEG-ezése, ahol a dAb trimer kialakítása linkerpeptidekkel történt. 10–26. ábra: A dAb-trimer monomerjei egyikének C¹terminális PEG-ezése. 10–27. ábra: Két specifikus dAb-trimer, amelyben a dAb-monomerek közül kettõnek kötési affinitása van az aTNF¹re, a harmadik monomernek pedig szérumalbuminra van kötési specificitása. Ez a formátum is PEG-ezhetõ a 10–25. vagy 10–26. ábrákon bemutatottak szerint. 11. ábra: VH vagy VL hetero-

5

10

15

20 12. ábra:

25

30

35 13. ábra:

40 14. ábra:

45 15. ábra:

50 16. ábra:

55

60 19

2

vagy homotetramer dAb¹k vázlatos bemutatása. 11–28. ábra: 4 ágú PEG-nek az egyes dAb-monomerek C¹terminális ciszteinjéhez való kötésével kialakított dAb-tetramer. 11–29. és 11–31. ábrák: dAb-tetramer kialakítása két dAb-linkerdimer, elágazó/többkarú PEG révén történt kapcsolásával, ahol a PEG vagy C¹terminális ciszteinhez (11–29) vagy pedig a kapcsoló peptidhez (11–31) van kapcsolva. 11–30. ábra: dAb-tetramer, amelyben a tetramer minden monomerje a monomerek C¹terminális cisztein aminosavához kapcsolódó, egyetlen elágazó PEG-gen keresztül van összekapcsolva. 11–32. ábra: dAb-tetramer, amelyben az egyes monomerek linker peptiddel vannak egymáshoz kapcsolva. Ez a konfiguráció a 10–25. vagy 10–26. ábrákon bemutatott bármely stratégia alkalmazásával PEG-ezhetõ. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható, PEG-gel kapcsolt, más multimer dAb-formátumok. 12–31. ábra: dAB linkerdimerek tetramerje, amelyek a tetramer kialakítása végett, többkaros PEG-gel önmagukban vannak összekapcsolva, ahol a PEG az egyes dimereket alkotó monomerek egyikének C¹terminális ciszteinjéhez kapcsolódik. 32. ábra: dAB linkerdimerek tetramerje, amelyek a tetramer kialakítása végett, többkaros PEG-gel önmagukban vannak összekapcsolva, ahol a PEG az egyes dimerpárok linkerjében lévõ cisztein aminosavhoz kapcsolódik. A VH váz, DP47–H4b csíravonal-szekvencián alapuló szekvenciája (a szekvencialistában 1–3. azonosító számokon megadott szekvencia), ahol az 1–3 HCDR-eket aláhúzással jelöltük. A Vk váz, DPk9 – J kl csíravonal-szekvencián alapuló szekvenciája (a szekvencialistában 3., 4. azonosító számokon megadott szekvencia), ahol az 1–3 LCDR-eket aláhúzással jelöltük. A dAb¹k natív hidradinamikus mérete és az egérben mért in vivo féléletidõ közötti összefüggést bemutató diagram. A 8. táblázatban bemutatott adatokat alkalmaztuk a grafikon elkészítéséhez. Monomer és 40 K PEG-ezett TAR1–5–19 proteázstabilitási profilja. A relatív aktivitás a proteázt nem tartalmazó kontroll százalékában van megadva. Az alkalmazott proteázok az alábbiak voltak: pepszin, sertéseredetû bélnyálkahártyából származó peptidáz, elasztáz, borjúhasnyálmirigybõl származó nyers proteáz (CBP), és patkánybélbõl készült por (Rat In).

1

HU 004 725 T2

Részletes leírás A találmány tágyát megnövelt féléletidejû és proteolitikus lebontásnak a PEG-gel kapcsolt dAb-khez képest ellenálló, PEG-gel kapcsolt dAb¹k és dAb-homo- és heteromultimerek képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt dAb-monomerek, ¹dimerek, ¹trimerek és tetramerek képezik, amelyek féléletideje legalább 0,25 óra, és hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. Elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitását a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis doménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis domént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménhez képest megtartja. Ez fokozott terápiás hatékonyságot biztosít a dAbmolekuláknak, mivel így megnõ azok keringési ideje és potens és hatékony aktivitásuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát olyan, PEG-gel kapcsolt dAb-multimerek képezik, amelyek legalább két, nem komplementer variábilis domént tartalmaznak. Például, a dAb¹k tartalmazhatnak egy pár VH domént vagy egy pár VL domént. Elõnyös, ha a domének nem tevefélékbõl származnak; elõnyösen emberi domének vagy emberi vázrégiókat (FW¹k) és egy vagy több heterológ CDR¹t tartalmaznak. A CDR¹ek és vázrégiók az immunglobulinok variábilis doménjeinek azon régiói, amelyeket a Kabat-féle „Sequences of Proteins of Immunological Interest” adatbázisban meghatároztak. A találmány egyik megvalósítási módjában, a dAb domének tevefélékbõl származnak. Elõnyösek azok az emberi vázrégiók, amelyeket a DP47 és DPK9 csíravonal-génszegmensek kódolnak. Elõnyös, ha egy adott VH vagy VL domén FW1, FW2 és FW3 vázrégióinak szekvenciája megegyezik a DP47bõl vagy DPK9-bõl származó FW1, FW2 és FW3 vázrégiók szekvenciájával. Az emberi vázrégiók (frameworks) – adott esetben – tartalmazhatnak mutációkat, például a találmány szerinti dAb-kben alkalmazott emberi vázrégiók esetében összesen akár 5 aminosavváltoztatást vagy akár 10 aminosavváltoztatást. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén elõállítása: A találmány szerinti alkalmazásra szolgáló, antitesteredetû, variábilis egydomének (vagy dAb¹k) olyan feltekert polipeptiddomének, amelyek immunglobulineredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvenciákat tartalmaznak és amelyek specifikusan (azaz, a 500 mM vagy annál kevesebb disszociációs konstanssal) kötnek egy adott antigént, és amelyek variábilis egydoménként, azaz bármilyen komplementer variábilis domén nélkül, kötnek antigént. Ennélfogva, egy adott antitesteredetû, variábilis egydomén magában foglal teljesen antitesteredetû variábilis doméneket és módosított variábilis doméneket – például olyanokat, amelyekben egy vagy több hurok, antitesteredetû variábilis doménekre nem jellemzõ szekvenciákra lett cserélve – vagy csonkolt vagy N¹ illetve C¹terminális kiterjesztést tartalmazó, antitesteredetû variábilis domé-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

2

neket, továbbá variábilis doménekbõl származó, olyan feltekert fragmentumokat, amelyek megtartják 500 nM vagy kevesebb (például, 450 nM vagy kevesebb, 400 nM vagy kevesebb, 350 nM vagy kevesebb, 300 nM vagy kevesebb, 250 nM vagy kevesebb, 200 nM vagy kevesebb, 150 nM vagy kevesebb, 100 nM vagy kevesebb) disszociációs konstansukat és a teljes hosszúságú domén, célantigénnel szembeni specificitását. Elõnyös, ha a találmány szerinti megoldásban alkalmazható antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból van kiválasztva: VHH, VH és VL, így Vk és Vl. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének különféle módon elõállíthatók. Mindezen megközelítéshez alkalmasak a nukleinsavszekvenciák elõállítására (például amplifikálás, mutáció stb.) és manipulálására szolgáló jól ismert eljárások. Az egyik mód a kívánt antigént ismerten kötõ klónozott antitest nehézláncának vagy könnyûláncának VH vagy VL régióját kódoló gén amplifikálása és expresszálása. A VH és VL domének határai a Kabat és munkatársai publikációjában találhatók [Kabat és munkatársai, mint fenn (1991)]. A nehézlánc- és könnyûlánc-gének VH és VL doménjeinek határaival kapcsolatos információt alkalmazzuk a kívánt antigént ismerten kötõ antitesteredetû klónozott nehézlánc vagy könnyûlánc V domént amplifikáló PCR-láncindítók tervezésére. Az amplifikált V domént alkalmas expressziós vektorba, például, pHEN–1¹be [Hoogenboom és munkatársai, Nucleic Acids Res. 19, 4133–4137 (1991)] illesztjük és egyedül vagy más polipeptidszekvenciával képzett fúzióként expresszáljuk. Az expresszált VH vagy VL domént a kívánt antigénnel szembeni nagy affinitású kötésre szûrjük a nehéz- vagy könnyûlánc-polipeptid maradékától való eltávolítás céljából. A találmány minden szempontja szerint, a kötésre való szûrést a technikában ismertek vagy az itt leírtak szerint végezzük. VH vagy VL domének repertoárját, például, a kívánt antigén elleni fágbemutatással szûrjük. Bakteriofágkönyvtárak és lambda fág expressziós könyvtárak elõállítására szolgáló eljárások a technikában jól ismertek, és az irodalomban le vannak írva [például, McCafferty és munkatársai, Nature 348, 552 (1990); Kang és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 4363 (1991); Clackson és munkatársai, Nature 352, 624 (1991); Lowman és munkatársai, Biochemistry 30, 10832 (1991); Burton és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88, 10134 (1991); Hoogenboom és munkatársai, Nucleic Acids Res. 19, 4133 (1991); Chang és munkatársai, J. Immunol. 147, 3610 (1991); Breitling és munkatársai, Gene 104, 147 (1991); Marks és munkatársai, J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); Barbas és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4457 (1992); Hawkins és Winter, J. Immunol., 22, 867 (1992); Marks és munkatársai, J. Biol. Chem., 267, 16007 (1992); és Lerner és munkatársai, Science, 258, 1313 (1992)]. scFv fágkönyvtárak is le vannak írva az irodalomban [például Huston és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85, 5879–5883 (1988); Chaudhary és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87,

1

HU 004 725 T2

1066–1070 (1990); McCafferty és munkatársai, mint fenn (1990); Clackson és munkatársai, mint fenn (1991); Marks és munkatársai, mint fenn (1991); Chiswell és munkatársai, Trends Biotech. 10, 80 (1992); és Marks és munkatársai, mint fenn (1992)]. ScFv-könyvtárak bakteriofág-eredetû bevonó (coat) fehérjéken való bemutatására különféle megoldási módokat írtak le. Fágbemutatási megközelítés tökéletesítése is ismert, például a WO 96/06213 számú és a WO 92/01047 számú (Medical Research Council és munkatársai), illetve a WO 97/08320 számú (Morphosys, mint fenn) nemzetközi közzétételi iratokban leírtakból. A VH vagy VL domének repertoárja lehet természetes körülmények között elõforduló immunglobulinszekvenciák repertoárja vagy lehet szintetikus repertoár. Természetes eredetû repertoár az, amelyet – például – egy vagy több állatból, ideértve az embert is, gyûjtött, immunglobulint expresszáló sejtekbõl lett elõállítva. Ilyen repertoár lehet „természetes” (naïve), amelyet – például – emberi foetusból vagy újszülöttbõl származó, immunglobulint expresszáló sejtekbõl állítottak elõ, vagy átrendezett, azaz, például felnõtt emberi B¹sejtekbõl állítottak elõ. Természetes repertoárok az irodalomban ismertek [például Marks és munkatársai, J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); és Vaughan és munkatársai, Nature Biotech. 14, 309 (1996)]. Amennyiben szükséges, természetes repertoárból, vagy bármilyen repertoárból azonosított, egyébként a célantigént kötõ klónokat azután mutagenezisnek és további szûrésnek vetjük alá fokozott kötési jellemzõket mutató változatok elõállítása és szelektálása céljából. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének szintetikus repertoárját egy adott klónozott V doménbe mesterségesen bevitt sokféleséggel állítunk elõ. Természetes repertoárok az irodalomban ismertek [például Hoogenboom és Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1992); Barbas és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4457 (1992); Nissim és munkatársai, EMBO J. 13, 692 (1994); Griffiths és munkatársai, EMBO J. 13, 3245 (1994); DeKriuf és munkatársai, J. Mol. Biol. 248, 97 (1995); és WO 99/20749 számú nemzetközi közzétételi irat]. Egy adott hagyományos antitest antigénkötõ-doménje két különálló régiót tartalmaz: nehézlánc-eredetû variábilis domént (VH) és könnyûlánc-eredetû variábilis domént (VL: amely lehet Vk vagy Vl). Az ilyen antitest antigénkötõ helyét hat polipeptidhurok alkotja: három hurok a VH doménbõl (H1, H2 és H3), és három pedig a VL doménbõl (L1, L2 és L3). E hurkok határai például Kabat és munkatársai publikációjában [Kabat és munkatársai, mint fenn (1991)] vannak leírva. A VH és VL doménokat kódoló V gének diverz primer repertoárja a génszegmentumok kombinatoriális átrendezésével készül in vivo. A VH gén három génszegmentum, a VH, D and JH, rekombinációjával jön létre. Emberekben, körülbelül 51 funkcionális VH szegmens [Cook és Tomlinson, Immunol Today 16, 237 (1995)], 25 funkcionális D szegmens [Corbett és munkatársai, J. Mol. Biol. 268, 69 (1997)] és 6 funkcionális JH szegmens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

[Ravetch et al., Cell, 27, 583 (1981)] létezik a haplotípustól fûggõen. A VH szegmens kódolja a polipeptidlánc azon régióját, amely a VH domén elsõ és második antigénkötõ hurkát (H1 és H2) képezi, míg a VH, D és JH szegmensek kombinációja alakítja ki a VH domén harmadik antigénkötõ hurkát (H3). A VL gén csak két génszegmens, a VL és JL, rekombinációjával jön létre. Emberekben, körülbelül 40 funkcionális Vk szegmens [Schäble és Zachau, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 1001 (1993)], 31 funkcionális Vl szegmens [Williams és munkatársai, J. Mol. Biol. 264, 220 (1996); Kawasaki és munkatársai, Genome Res. 7, 250 (1997)], 5 funkcionális Jk szegmens [Hieter és munkatársai, J. Biol. Chem. 257, 1516 (1982)] és 4 funkcionális Jl szegmens [Vasicek és Leder, J. Exp. Med. 172, 609 (1990)] létezik, a haplotípustól függõen. A VL szegmens kódolja a polipeptidlánc azon régióját, amely a VL domén elsõ és második antigénkötõ hurkát (L1 és L2) képezi, míg a VL és JL szegmensek kombinációja alakítja ki a VL domén harmadik antigénkötõ hurkát (L3). E primer repertoárból szelektált antitestekrõl úgy gondolják, hogy eléggé változatosak ahhoz, hogy csaknem minden antigént, legalább mérsékelt affinitással, megkössenek. Magas affinitású antitestek az átrendezett gének „affinitás-érésével” képzõdnek in vivo. Az affinitás-érés során pontmutációk jönnek létre és azokat az immunrendszer szelektálja a fokozott kötés alapján. Az antitestek szerkezetinek és szekvenciáinak analízise kimutatta, hogy a hat antigénkötõ hurok közül öt (H1, H2, L1, L2, L3) fõláncának konformációi vagy kanonikus szerkezetei száma korlátozott [Chothia és Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987); Chothia és munkatársai, Nature 342, 877 (1989)]. A fõlánc konformációit (i) az antigénkötõ hurok hossza, és (ii) az antigénkötõ hurokban vagy az antitest vázában bizonyos kulcs pozíciókban lévõ konkrét aminosavak, vagy aminosavtípusok határozzák meg. A hurkok hosszának és a kulcsaminosavak analízise lehetõvé tette az emberi antitestszekvenciák többsége által kódolt H1, H2, L1, L2 és L3 fõlánc-konformációinak elõrejelzését [Chothia és munkatársai, J. Mol. Biol. 227, 799 (1992); Tomlinson és munkatársai, EMBO J. 14, 4628 (1995); Williams és munkatársai, J. Mol. Biol. 264, 220 (1996)]. Bár a H3 régió szekvencia, hosszúság és szerkezet tekintetében (a D szegmensek alkalmazása miatt) sokkal változatosabb, ez is csak korlátozott számú, az antitest vázában kulcs pozícióiban lévõ konkrét aminosavaktól, vagy aminosavtípusoktól függõ, rövid hurokhosszúságú fõlánc-konformációt képez [Martin és munkatársai, J. Mol. Biol. 263, 800 (1996); Shirai és munkatársai, FEBS Letters 399, 1 (1996)]. Bár a találmány egyik megvalósítási módja szerint, szintetikus repertoárok esetén a változatosságot a különbözõ antigénkötõ hurkok CDR-jeinek bármely helyén biztosíthatjuk, ez a megközelítés nem megfelelõen feltekeredett V domének nagyobb arányát eredményezi és ezáltal a molekulák alacsonyabb hányadának lesz antigénkötõ képessége. Egy adott szintetikus VH vagy VL doménrepertoárt változatossá tétele céljá-

1

HU 004 725 T2

ból az antigénkötõ hurkok fõláncának konformációjában részt vevõ aminosavak értelmezése lehetõvé teszi a specifikus aminosavak azonosítását. Vagyis, a változatosságot a legjobb azon aminosavakat érintve bevezetni, amelyeknek a fõlánc konformációjának fenntartásában nincs lényeges szerepük. Például, az L2 hurok változatossá tételéhez, a hagyományos megközelítés az volna, ha a Kabat és munkatársai szerint megfelelõ CDR-ben (CDR2) [Kabat és munkatársai, mint fenn (1991)] minden aminosavat, nagyjából hét aminosavat, variálnánk. Azonban, az L2¹nél ismert, hogy a természetes körülmények között elõforduló antitestekben az 50. és 53. pozíciók változatosak, és ismereteink szerint ezek lépnek érintkezésbe az antigénnel. Az elõnyös megközelítés az volna, ha ebben a hurokban csak e két aminosavat variálnánk. Ez jelentõs javulást jelent az antigénkötõ specificitási tartomány létrehozásához szükséges funkcionális változatosság terén. A találmány egyik szempontja szerint, mesterségesen variált, csíravonal-eredetû VH vagy Vk szekvenciákon alapuló, szintetikus variábilis doméneket tartalmazó repertoárt készítünk VH or Vk háttérben. Például a VH doménrepertoár csíravonal-eredetû VH gén, klónozott V3–23/DP47 [Tomlinson és munkatársai, J. Mol. Biol. 227, 7768 (1992)] és JH4b szegmensein alapul. A Vk doménrepertoár, például csíravonal-eredetû Vk gén O2/O12/DPK9 [Cox és munkatársai, Eur. J. Immunol. 24, 827 (1994)] és Jk1 szegmensein alapul. Ezekbe vagy más génszegmensekbe variabilitást viszünk be, például PCR-mutagenezissel. Variabilitás beilleszthetõ véletlenszerûen, például mutagén (error prone) PCR-rel [Hawkins, et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)] vagy kémiai mutagenezissel. A fentiekben tárgyaltak szerint azonban elõnyös, ha a variabilitás bevitele konkrét aminosavakra irányul. Elõnyös továbbá az is, ha a kívánt aminosavakat az NNK kodon bevitelével vesszük célba az összes aminosavat és a TAG stopkodont kódoló mutagén láncindítókat alkalmazva (az IUPAC nevezéktan szerint, N=G, A, T vagy C, és K=G vagy T). Más, hasonló véget eredményezõ kodonok is alkalmazhatók, ideértve az NNN kodont (amely a további TGA és TAA stopkodonok elõállításához vezet), DVT kodont [(A/G/T) (A/G/C)T], DVC kodont [(A/G/T)(A/G/C)C], és DVY kodont [(A/G/T)(A/G/C)(C/T)]. A DVT kodon 22% szerint és 11% tiroszint, aszpargint, glicint, alanint, aszpartátot, treonint és ciszteint kódol, amely leginkább utánozza a természetes emberi antitestek antigénkötõ helyének aminosaveloszlását. Repertoárokat olyan PCR-láncindítók alkalmazásával készítünk, amelyek tartalmazzák a kiválasztott degenerált kodont vagy kodonokat minden variálni kívánt hely esetében. A PCR-mutagenezis a technikában jól ismert, azonban, a találmány szerinti eljárásokban a láncindítók tervezésének és a PCR-mutagenezis szempontjait az alábbiakban a „PCR-mutagenezis” címû részben tárgyaljuk. A variált repertoárokat fág-bemutató vektorokba klónoztuk a technikában ismert módon és, például, a WO 99/20749 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint. Általánosságban, a találmány megvalósításához szükséges nukleinsavak és vektorkonstruk-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 22

2

ciók a technikában elérhetõk, és standard laboratóriumi kézikönyvekben [például, Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor, USA (1989)] leírtak szerint elkészíthetõk és manipulálhatók. A találmány szerinti nukleinsavak manipulálása, jellemzõen, rekombináns vektorokban történik. A leírás szerinti értelemben, a „vektor” olyan különálló elem, amelyet heterológ DNS-sejtekbe történõ bevitelére alkalmazunk, a heterológ DNS expresszálása és/vagy replikálása céljából. Az ilyen vektorok szelektálására, elõállítására és azt követõ alkalmazására szolgáló eljárásokat a szakember jól ismeri. Számos vektor – így, bakteriális plazmidok, bakteriofágok, mesterséges kromoszómák és episzómális vektorok – nyilvánosan beszerezhetõ. Ilyen vektorok alkalmazhatók egyszerû klónozásra és mutagenezisre. Egy további változat szerint, amint az jellemzõ a találmány szerinti repertoár (vagy pre-repertoár) tagjait hordozó vektorokra, génexpressziós vektort alkalmazunk. A találmány szerint alkalmazásra szolgáló vektort úgy választjuk meg, hogy befogadjon egy kívánt méretû – jellemzõen 0,25 kilobázis (kb) és 40 kb közötti hosszúságú – polipeptidkódoló szekvenciát. In vitro klónozási manipulációkat követõen, alkalmas gazdasejtet transzformálunk a vektorral. Minden vektor tartalmaz különféle funkcionális komponenseket, amelyek közé általában az alábbiak tartoznak: klónozó (vagy „polilinker”) hely, replikációs origó, és legalább egy szelektálható markergén. Amennyiben egy adott vektor expressziós vektor, egy vagy többet tartalmaz az alábbiak közül: enhancer (erõsítõ) elem, promoter, transzkripciót termináló- és szignálszekvenciák, amelyek mindegyike a klónozóhely közvetlen közelében van elhelyezve oly módon, hogy mûködõképesen vannak csatlakoztatva a találmány szerinti polipeptidrepertoár valamely tagját kódoló génhez. Klónozó- és expressziós vektorok általában tartalmaznak olyan nukleinsavszekvenciákat, amelyek lehetõvé teszik, hogy a vektor egy vagy több kiválasztott gazdasejtben replikálódjon. Jellemzõen, a klónozóvektorokban ez a szekvencia az, amely lehetõvé teszi, hogy a vektor a gazda kromoszomális DNS-étõl függetlenül replikálódjon, és ez tartalmaz replikációs origót vagy autonóm replikálódó szekvenciákat. Ilyen szekvenciák különféle baktériumoknál, élesztõknél és vírusoknál jól ismertek. A pBR322 plazmidból származó replikációs origó alkalmazható a legtöbb Gram-negatív baktérium esetében, a 3 mikronos plazmideredetû origó alkalmas élesztõre, míg különféle víruseredetû (például, SV40-bõl, adenovírusból származó) origók emlõssejtek klónozóvektoraiban alkalmazhatók. Általában, a replikációs origó nem szükséges az emlõsöknél alkalmazható expressziós vektorokhoz, hacsak nem nagy mennyiségû DNS replikálására képes emlõssejtekben, például COS-sejtekben, alkalmazzuk ezeket. Elõnyös, ha a klónozó- vagy expressziós vektor szelekciós gént, vagy más néven szelektálható markert, is tartalmaz. E gének a transzformált gazdasejt, szelektív tápközegben való túléléséhez vagy szaporodásához szükséges fehérjét kódolnak. Ennélfogva, a

1

HU 004 725 T2

szelekciós gént tartalmazó vektorral nem transzformált gazdasejtek a tápközegben túlélésre nem képesek. Jellemzõ szelekciós gének antibiotikumok és más toxinok – például, ampicillin, neomicin, metotrexát vagy tetraciklin – ellen rezisztenciát biztosító, komplement auxotróf hibákat kódoló, vagy a tápközegben nem elérhetõ kritikus fontosságú tápanyagokat szolgáltató fehérjéket kódolnak. Mivel a találmány szerinti vektorok replikálását legkényelmesebben E. coliban lehet végezni, E. colira szelektálható markert, például az ampicillin antibiotikum ellen rezisztenciát szolgáltató b¹laktamázt kódoló gént szokás alkalmazni. Ez kinyerhetõ E. coli-eredetû plazmidokból, például pBR322-bõl, vagy pUC plazmidból, például pUC18-ból vagy pUC19-bõl. Expressziós vektorok rendszerint tartalmaznak a gazdaszervezet által felismerhetõ, az érdeklõdésre számottartó kódolószekvenciához mûködõképesen kapcsolt promotert. Egy ilyen promoter lehet indukálható vagy konstitutív. A leírás szerinti értelemben, a „mûködõképesen kapcsolt” kifejezés egymás mellé helyezést jelent, ahol a leírt komponensek olyan viszonyban állnak egymással, amely lehetõvé teszi, hogy az eltervezett módon mûködjenek. Kódolószekvenciához „mûködõképesen kapcsolt” szabályozószekvencia oly módon kerül ligálásra, hogy a kódolószekvencia a szabályozószekvenciákkal összeegyeztethetõ feltételek mellett expresszálódjon. Prokarióta gazdákkal való alkalmazásra megfelelõ promoterek közé tartoznak például az alábbiak: a b¹laktamáz és laktóz promoterrendszer, alkalikus foszfatáz, a triptofán (trp) promoterrendszer, és hibrid promoterek, mint például a tac promoter. Bakteriális rendszerekben való alkalmazásra szolgáló promoterek általában tartalmaznak a kódolószekvenciához mûködõképesen kapcsolt Shine–Dalgarno-szekvenciát. A leírás szerinti könyvtárakban vagy repertoárokban elõnyös vektorok az olyan expressziós vektorok, amelyek lehetõvé teszik egy adott polipeptidkönyvtártagnak megfelelõ nukleotidszekvencia expresszióját. Ennélfogva, szaporítással szelekciót végzünk és a polipeptidkönyvtár-tagot expresszáló egyetlen klónt külön expresszáljuk vagy bármilyen bemutatási rendszerrel alkalmazzuk. A fentiekben leírtaknak megfelelõen, elõnyös szelekciós bemutatási rendszer bakteriofág-bemutatást alkalmaz. Így, fág- vagy fagemidvektorok alkalmazhatók. Elõnyös vektorok az olyan fagemidvektorok, amelyekben E. coli-eredetû replikációs origó mellett (a kettõs szálú replikációhoz) fágeredetû replikációs origó is van (egyszálú DNS elõállítása céljából). Az ilyen vektorok manipulálása és expresszálása a technikában jól ismert [Hoogenboom és Winter, mint fenn (1992); Nissim és munkatársai, mint fenn (1994)]. Röviden, a vektor a fagemid szelektivitásának biztosítása végett b¹laktamáz vagy más szelektálható markergént, és lac-promotert tartalmaz egy expressziós kazettától 5’¹irányban. Az expressziós kazetta (az N¹terminálistól a C¹terminális felé haladva) áll egy leaderszekvenciából (amely az expresszált polipeptidet a periplazmás térbe irányítja), egy többszörös klónozóhely-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2

bõl (a könyvtártag nukleotidváltozatának klónozásához), adott esetben, egy vagy több peptidtoldalékból (a kimutatáshoz), adott esetben, egy vagy több TAG stopkodonból és a pIII fágproteinbõl. Bakteriális expresszióban és/vagy fág- vagy fagemid-bemutatásban alkalmazható leaderszekvenciák közé tartozik a pelB, stII, ompA, phoA, bla, és pelA. Az E. coli különféle szuppresszor és nem szuppresszor törzseinek alkalmazásával és glükóz, izopropil-tio-b-D-galaktozid (IPTG) vagy helper-fág, például VCS M13, hozzáadásával a vektor képes expresszálást nem végzõ plazmidként replikálódni, nagy mennyiségben elõállítani a polipeptidkönyvtár tagjait, vagy olyan fágot termelni, amelyek némelyike felszínén tartalmazza a polipeptidpIII fúzió legalább egy kópiáját. Például, elõnyös vektor a pHENI fagemidvektor [Hoogenboom és munkatársai, Nucl. Acids Res. 19, 4133–4137 (1991); szekvenicia elérhetõ, például a WO 03/031611 számú nemzetközi közzétételi irat szekvencialistájában 7. azonosító számon megadott szekvenciaként], amelyben a pIII fúziós fehérje termelõdése – a glükóz jelenlétében gátlódó és IPTG-vel indukálható – LacZ promoter szabályozása alatt áll. Szuppresszor E. coli törzsekben, például TG1-ben való szaporítás esetén, a gén III fúziósfehérje termelõdik és a fágba csomagolódik, míg nem szuppresszor törzsekben, például HB2151-ban, történõ szaporítás lehetõvé teszi, hogy az oldható fúziósfehérje a bakteriális periplazmába és a tápoldatba szekretálódjon. Mivel a gén III expressziója megakadályozza a helper-fággal való késõbbi fertõzést, a fágmentés miatti a VCSM13 helper-fággal történõ fertõzés elõtt a fagemidvektorokat tartalmazó baktériumokat glükóz jelenlétében szaporítjuk. A találmány szerinti vektorok elõállítása hagyományos ligációs eljárásokkal történik. Izolált vektorokat vagy DNS-fragmentumokat hasítunk, igazítunk és a szükséges vektor elõállításához kívánt formában ligáljuk vissza. Ha szükséges, standard eljárások alkalmazásával szekvenciaanalízist végzünk annak ellenõrzésére, hogy a korrekt szekvenciák jelen vannak¹e a kész vektorban. Expressziós vektorok konstruálására, in vitro transzkriptumok elõállítására, DNS gazdasejtekbe történõ bevitelésre, és az expresszió és mûködés értékelésére irányuló analízisek elvégzésére alkalmas eljárásokat a szakember ismeri. Egy adott mintában hagyományos eljárásokkal – például Southern- vagy Northernanalízissel, Western-blottolással, DNS, RNS vagy fehérje dot-blottjával, in situ hibridizációval, immunkémiával vagy nukleinsavak vagy fehérjemolekulák szekvenciaanalízisével – kimutatjuk a génszekvencia jelenlétét, vagy kvantifikáljuk annak amplifikációját és/vagy expresszióját. A szakember könnyen felismeri, hogy igény szerint hogyan lehet ezeket az eljárásokat módosítani.

Antitesteredetû, variábilis egydomének konstruálására szolgáló állványszerkezetek („scaffolds”) i. A fõlánc konformációjának kiválasztása Az immunglobulin-szupercsalád minden tagjának 60 polipeptidlánca hasonlóan van feltekeredve. Például 55

23

1

HU 004 725 T2

bár az antitestek primer szekvenciájukat tekintve igen változatosak, a szekvenciák összehasonlítása és krisztallográfiás vizsgálatok rávilágítottak arra, hogy a vártakkal ellentétben, az antitestek hat antigénkötõ hurka közül ötben (H1, H2, L1, L2, L3) a fõlánc-konformációk vagy kanonikus szerkezetek száma korlátozott [Chothia és Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901 (1987); Chothia és munkatársai, Nature, 342, 877 (1989)]. A hurkok hosszának és a kulcsaminosavak analízise lehetõvé tette az emberi antitestszekvenciák többsége által kódolt H1, H2, L1, L2 és L3 fõlánc-konformációinak elõrejelzését [Chothia és munkatársai, J. Mol. Biol. 227, 799 (1992); Tomlinson és munkatársai, EMBO J. 14, 4628 (1995); Williams és munkatársai, J. Mol. Biol. 264, 220 (1996)]. Bár a H3 régiószekvencia, hosszúság és szerkezet tekintetében (a D szegmensek alkalmazása miatt) sokkal változatosabb, ez is csak korlátozott számú, az antitest vázában kulcs pozícióiban lévõ konkrét aminosavaktól, vagy aminosavtípusoktól függõ, rövid hurokhosszúságú fõlánc-konformációt képez [Martin és munkatársai, J. Mol. Biol. 263, 800 (1996); Shirai és munkatársai, FEBS Letters 399, 1 (1996)]. A találmány szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén monomerek és multimerek doménkönyvtárakból – például, VH domének könyvtáraiból vagy VL domének könyvtáraiból – elõnyösen összeállíthatók. Továbbá, a találmány szerinti, PEGgel kapcsolt dAb¹k könyvtárak formájában önmagukban is elõállíthatók. A találmány egyik szempontja szerint, antitesteredetû, variábilis egydoméneket tartalmazó könyvtárakat tervezünk, amelyekben olyan hosszúságú hurkokat és olyan kulcsaminosavakat választunk, amelyek biztosítják hogy a könyvtártagok fõláncának konformációja ismert legyen. Elõnyös, ha e konformációk valóban azonosak az immunglobulin szupercsalád molekuláinak természetes körülmények közötti konformációival, mivel így minimalizálható annak esélye, hogy ezek mûködésképtelenek legyenek a fentiekben leírtak szerint. Csíravonal-eredetû V gén szegmensei szolgáltatnak egy alkalmas vázat az antitest- vagy T¹sejt-receptor könyvtárak készítésére; azonban más szekvenciák is alkalmasak. Alacsony gyakorisággal elõfordulhatnak variációk, vagyis kis számú mûködõképes tagnak lehet olyan eltérõ fõlánc-konformációja, amely nem befolyásolja a kérdéses tag mûködését. A kanonikus szerkezet elmélete is alkalmas a ligandumok által kódolt különféle fõlánc-konformációk számának becslésére, ligandumszekvenciákon alapuló fõlánc-konformáció jóslására és változatossá tétel céljából olyan aminosavak kiválasztására, amelyek a kanonikus szerkezetet nem befolyásolják. Ismert, hogy az emberi Vk doménben az L1 hurok a négy kanonikus szerkezet egyikét képes adoptálni, az L2 huroknak egyetlen kanonikus szerkezete van és az emberi Vk domének az L3 hurokhoz a négy vagy öt kanonikus szerkezet egyikét adoptálják [Tomlinson éa munkatársai, mint fenn (1995)]; így, egyedül a Vk doménben, különféle kanonikus szerkezetek képesek kombinálódni egy egész sorozat különféle fõlánc-konformáció kialakítása céljából. Adott, hogy a Vl domén külön sorozat

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 24

2

kanonikus szerkezetet kódol az L1, L2 és L3 hurkokra, és hogy a Vk és Vl domének képesek bármely olyan VH doménnel párosodni, amely számos kanonikus szerkezetet kódolhat a H1 és H2 hurkokra. A kanonikus szerkezetek kombinációinak ezen öt hurokra megfigyelt száma igen hatalmas. Ez arra utal, hogy a fõlánc-konformációban a változatosság generálása a kötési specificitások széles tartományának elõállítása céljából lényeges lehet. Azonban, egyetlen ismert fõlánckonformáción alapuló antitestkönyvtár készítésével úgy találtuk, hogy a várakozásokkal szemben, lényegében az összes antigént célbavevõ elégséges változatosság generálásához a fõlánc-konformációnak nem szükséges változatosnak lennie. Még ennél is meglepõbb, hogy az egyetlen fõlánc-konformációnak nem kell konszenzus szerkezetûnek lennie – egyetlen, természetes körülmények között elõforduló konformáció használható alapul a teljes könyvtárhoz. Így, a találmány egyik szempontja szerint, a találmány szerinti, polimerrel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoméneknek egyetlen ismert fõlánc-konformációjuk van. Elõnyös, ha a kiválasztott egyetlen fõlánc-konformáció a kérdéses immunglobulinszupercsalád-típus molekulái között mindenütt elõfordul. Egy adott konformáció közönségesnek számít, ha a megfigyelések szerint, jelentõs számú, természetes körülmények között elõforduló molekula adoptálja. Eszerint, a találmány egyik elõnyös szempontjában, egy adott immunglobulin-eredetû domén minden kötõhurka esetében a természetes körülmények között elõforduló különbözõ fõlánc-konformációkat elkülönülten vizsgáljuk, majd olyan, természetes körülmények között elõforduló variábilis domént választunk, amely a különbözõ hurkokra a kívánt fõlánc-konformációk kombinációját birtokolja. Ha nincs ilyen, akkor választhatjuk a lehetõ legközelebbi ekvivalenst. Elõnyös, ha a kívánt, különbözõ hurkokra vonatkozó fõlánc-konformációk kombinációját úgy hozzuk létre, hogy a kívánt fõlánc-konformációkat kódoló, csíravonal-eredetû génszegmenseket szelektáljuk. Elõnyösebb, ha a szelektált csíravonal-eredetû génszegmensek a természetben gyakran expresszálódnak, és legelõnyösebb, ha azokat leggyakrabban minden, természetes körülmények között elõforduló, csíravonal-eredetû génszegmens expresszálja. Antitesteredetû, variábilis egydomének vagy azok könyvtárainak tervezésekor mind a hat antigénkötõ hurokra vonatkozó különféle fõlánc-konformációk elõfordulási gyakoriságát elkülönülten kell vizsgálni. H1, H2, L1, L2 és L3 esetében, olyan adott konformációt választunk, amely a természetes körülmények között elõforduló molekulák antigénkötõ hurkainak 20–100%-ban megtalálható. Jellemzõ, hogy a megfigyelt elõfordulási gyakoriság 35% felett van (azaz 35% és 100% közötti), és – ideális esetben – 50% feletti vagy akár 65% feletti. Mivel a H3 hurkok többségének nincs kanonikus szerkezete, elõnyös, ha olyan fõlánc-konformációt választunk, amely a kanonikus szerkezeteket mutató hurkok között megszokott. Minden hurokra a természetes repertoárban leggyakrabban megfigyelhetõ konformációt választunk. Emberi antitestekben, minden hurkok ese-

1

HU 004 725 T2

tében a legnépszerûbb kanonikus szerkezetek (CS) az alábbiak: H1–CS1 (az expresszált repertoár 79%¹a), H2–CS3 (46%), L1–a Vk CS2¹je (39%), L2–CS1 (100%), L3–a Vk CS1e (36%) (a számítások 70:30 k:l arányon alapulnak) [Hood és munkatársai, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48, 133 (1967)]. Kanonikus szerkezettel rendelkezõ H3 huroknál, úgy tûnik, hogy egy hét aminosavból álló, a 94. és 101. aminosav között sóhidat tartalmazó CDR3 hossz [Kabat és munkatársai, Sequences of proteins of immunological interest, kiad.: U.S. Department of Health and Human Services (1991)] legáltalánosabb. Az EMBL adatbázisban legalább 16, e konformáció kialakításához szükséges elõírt H3 hosszúsággal bíró és kulcsfontosságú aminosavakat tartalmazó, emberi antitestszekvencia található, és a fehérje-adatbázisban van legalább két olyan krisztallográfiás szerkezet (2 cgr és 1 tet), amely antitestmodellezés alapjául szolgálhat. E kanonikus szerkezetek kombinációjával bíró, leggyakrabban expresszált csíravonal-eredetû génszegmens a 3–23¹as VH szegmens (DP–47), a JH4b JH szegmens, az O2/O12 (DPK9) Vk szegmens és a Jk1 JK szegmens. A DP45 és DP38 VH-szegmensek szintén alkalmasak. Ennélfogva, a kívánt egyetlen fõlánc-konformációval rendelkezõ könyvtár létrehozásakor e szegmensek kombinációjából indulhatunk ki. Esetleg, ahelyett, hogy az egyetlen fõlánc-konformációt a kérdéses kötõhurkok mindegyikével kapcsolatos különbözõ fõlánc-konformációk természetes körülmények közötti elõfordulása alapján választanánk meg, az egyetlen fõlánc-konformáció kiválasztásában alapul a fõlánc-konformációk kombinációinak természetes elõfordulását alkalmazzuk. Antitestek esetében, például bármely két, három, négy, öt vagy mind a hat antigénkötõ hurokra meghatározható a kanonikus szerkezetek kombinációinak természetes elõfordulása. A találmány szerinti megoldásban elõnyös, ha a választott konformáció a természetes körülmények között elõforduló antitestekben megszokott, és legelõnyösebb, ha az a természetes repertoárban a leggyakoribb. Eszerint, az egyetlen fõlánc-konformáció kiválasztásának alapjául szolgál, például, az, ha emberi antitestekben, a H1, H2, Ll1, L2 és L3, öt, antitesteredetû kötõhurok kombinációjára meghatározzuk a kanonikus szerkezetek leggyakoribb kombinációját és azt kombináljuk a H3 hurok legnépszerûbb konformációjával. A kanonikus szekvencia változatossá tétele Számos ismert fõlánc-konformáció vagy, elõnyösen, egyetlen ismert fõlánc-konformáció kiválasztása után, szerkezeti és/vagy funkcionális sokféleség generálása céljából a molekula kötõhelyének variálásával elõállíthatók a találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének vagy a találmány szerinti megoldásban alkalmazandó könyvtárak. Ez azt jelenti, hogy olyan változatokat generálunk, amelyek szerkezetüket és/vagy funkciójukat tekintve megfelelõen változatosak, így egy egész sor aktivitás kifejtésére képesek. A kívánt sokféleséget a kiválasztott molekula egy vagy több pozíciójának változtatásával generáljuk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 25

2

A megváltoztatni kívánt pozíció kiválasztható véletlenszerûen, vagy elõnyös, ha szelektáljuk. A változat elérhetõ randomizálással, amely során a rezidens aminosavat agy másik aminosavval vagy annak természetes vagy szintetikus analógjával helyettesítve nagyszámú változatot állítunk elõ, vagy a rezidens aminosavat az aminosavak egy vagy több, meghatározott részhalmazával helyettesítve, sokkal korlátozottabb számú változathoz jutunk. Az ilyen sokféleség bevitelére különféle eljárások ismertek: Mutagén (Error-prone) PCR [Hawkins és munkatársai, J. Mol. Biol., 226, 889 (1992)], kémiai mutagenezis [Deng és munkatársai, J. Biol. Chem., 269, 9533 (1994)], vagy bakteriális mutációs (mutator) törzsek [Low és munkatársai, J. Mol. Biol., 260, 359 (1996)] alkalmazhatók véletlenszerû mutációk bevitelére a molekulát kódoló génekbe. Kiválasztott pozíciók mutáltatására szolgáló eljárások a technikában jól ismertek, és idetartozik a hibásan párosított oligonukleotidok vagy degenerált oligonukleotidok alkalmazása PCR alkalmazásával vagy anélkül. Például számos szintetikus antitestkönyvtárat állítottak már elõ az antigénkötõ hurkokra irányított mutációkkal. Az emberi tetanusztoxoidot kötõ Fab H3¹régióját randomizálva egy egész sor új kötõspecificitást állítottak elõ [Barbas és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4457 (1992)]. Nem mutált vázrégiókat tartalmazó nagy könyvtárak elõállítása céljából, véletlenszerûen vagy félig véletlenszerûen elõállított H3 és L3 régiókat csatoltak csíravonal-eredetû V gén szegmenseihez [Hoogenboom és Winter, J. Mol. Biol., 227, 381 (1992); Barbas és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4457 (1992); Nissim és munkatársai, EMBO J., 13, 692 (1994); Griffiths és munkatársai, EMBO J., 13, 3245 (1994); De Kruif és munkatársai, J. Mol. Biol., 248, 97 (1995)]. Ilyen változatossá tételt már néhány vagy az összes többi antigénkötõ hurokra kiterjesztettek [Crameri és munkatársai, Nature Med., 2, 100 (1996); Riechmann és munkatársai, BiolTechnology, 13, 475 (1995); Morphosys, WO 97/08320 számú nemzetközi közzétételi irat, mint fenn]. Mivel a hurokrandomizálás csak a H3¹ra akár körülbelül több mint 1015 szerkezetet képes készíteni és hasonlóan nagyszámú változatot a másik öt hurokra, a jelen transzformációs technológia vagy akár a sejtmentes rendszerek alkalmazása ésszerûtlen egy minden lehetséges kombinációt reprezentáló könyvtár elõállítására. Például a mai napig készített egyik legnagyobb könyvtár 6×1010 különféle antitestet tartalmaz [Griffiths és munkatársai, mint fenn (1994)], és ez egy ilyen tervezésû könyvtár potenciális sokféleségének csak egy részét képezi. A találmány elõnyös megvalósítási módjában, csak a molekula kívánt funkciójának elõállításában vagy módosításában közvetlenül részt vevõ aminosavak kerülnek variálásra. Számos molekula esetén, a funkció egy adott cél kötése, ennélfogva a sokféleségnek a célt kötõ helyre kell irányulnia, miközben el kell kerülni a molekula általános becsomagolásának szempontjából

1

HU 004 725 T2

vagy a kiválasztott fõlánc-konformáció fenntartásában lényeges fontosságú aminosavak cseréjét. A kanonikus szerkezetek változatossá tétele az antitesteredetû doménekre alkalmazva Az antitesteredetû, variábilis egydomének esetében, a cél kötõhelye leggyakrabban az antigénkötõ hely, így, a találmány egy igen elõnyös szempontja szerint, a találmány tárgyát antitesteredetû, variábilis egydomének könyvtárai vagy az antitesteredetû, variábilis egydomének összeállítására szolgáló könyvtárak képezik, amelyekben csak az antitestkötõ-helyet alkotó aminosavakat variáljuk. Az emberi repertoárban ezek az aminosavak rendkívül változatosak és ismereteink szerint, a nagyfelbontású antitest/antigén komplexekben ezek lépnek érintkezésbe. Például az L2¹nél ismert, hogy a természetes körülmények között elõforduló antitestekben az 50. és 53. pozíciók változatosak, és ismereteink szerint ezek lépnek érintkezésbe az antigénnel. Ezzel szemben, a hagyományos megközelítés szerint, a Kabat és munkatársai szerinti [Kabat és munkatársai, mint fenn (1991)] megfelelõ, Komplementaritás Meghatározó Régióban [Complementarity Determining Region (CDR1)] lévõ összes aminosavat variálni kellene, ami nagyjából hét aminosavat jelent a találmány szerinti alkalmazásra szolgáló könyvtárban variálandó kettõhöz képest. Ez jelentõs javulást jelent az antigénkötõ-specificitási tartomány létrehozásához szükséges funkcionális változatosság terén. A természetben, az antitestek változatossága két folyamat eredménye: csíravonal-eredetû V, D és J génszegmensek szomatikus rekombinációja természetes primer repertoár létrehozása céljából (úgynevezett csíravonal- vagy kapcsolási (ijunctional) sokféleség, és az eredményül kapott, átrendezõdött V gének szomatikus hipermutációja. Emberi antitestszekvenciák analízise rámutatott arra, hogy az elsõdleges repertoárban fennálló változatosság („diverzitás”) az antigénkötõ hely központjára irányul, míg a szomatikus hipermutáció az antigénkötõ helynek az elsõdleges repertoárban igen konzervált periferiális régióira terjeszti ki a változatosságot [lásd Tomlinson és munkatársai, J. Mol. Biol., 256, 813 (I996)]. E komplementaritás feltehetõen a szekvenciaterek keresésének hatékony stratégiájaként alakult ki és – bár nyilvánvalóan kizárólag az antitestekre korlátozódik – ez más polipeptidrepertoárokra is könnyen alkalmazható. A variálandó aminosavak a célra irányuló kötõhelyet alkotó aminosavak egy részhalmazát képezik. Ha szükséges, a célt kötõ helyen lévõ aminosavak különbözõ (ideértve az átfedõket is) részhalmazait variáljuk a szelekció különbözõ lépései alatt. Egy adott antitestrepertoár esetén, egy kiindulási „természetes” repertoárt készítünk, ahol az antigénkötõ helyen lévõ néhány, de nem az összes, aminosavat variáljuk. A leírás szerinti értelemben, a „természetes” kifejezés az elõre meghatározott célponttal nem rendelkezõ antitestmolekulákra utal. E molekulák az immundiverzifikáción át nem esett egyed immunglobulingénjei által kódoltakra hasonlítanak. Ilyen egyedek, például, a foetális és újszülött egyedek, akiknek im-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 26

2

munrendszere még nem szembesült a legkülönfélébb antigének serkentõ hatásával. Ezt követõen, a repertoárt egy sorozat antigénnel vagy epitóppal szemben szelektáljuk. Ha szükséges, a kiindulási repertoárban változatossá tett régión kívülre további változatosságot lehet bevinni. Ezen érett repertoárt módosított funkcióra, specificitásra vagy affinitásra szelektálni lehet. A találmányban való alkalmazásra szolgáló könyvtárak készítésében, a kiválasztott pozíciók változatossá tételét jellemzõen a nukleinsavszinten érjük el, a polipeptid szekvenciáját meghatározó kódolószekvencia oly módon történõ megváltoztatásával, hogy a lehetséges aminosavak közül számos aminosavat (mind a húszat, vagy azok alhalmazát) be lehessen építeni abba a pozícióba. Az IUPAC nevezéktan alkalmazásával, a leginkább verzatilis kodon az összes aminosavat kódoló NNK és a TAG stopkodon. Az NNK kodont elõnyösen alkalmazzuk az igényelt változatosság bevezetésére. Más, ugyanazt a végtermékeket eredményezõ kodonok is alkalmazhatók, ideértve az NNN kodont, amely a további, TGA és TAA, stopkodonok elõállításához vezet. Az emberi antitestek antigénkötõ helyében fennálló oldallánc-változatosság olyan, határozott „eltolódást” mutat, amely bizonyos aminosavakat elõnyben részesít. Amennyiben, a VH, Vk és Vl régiókban fennálló tíz legváltozatosabb pozícióban lévõ aminosavak összetételét összegezzük, az oldalláncok változatosságának több mint 76%¹a mindössze hét különbözõ aminosavtól származik: szerin (24%), tirozin (14%), aszparagin (11%), glicin (9%), alanin (7%), aszpartát (6%) és treonin (6%). Ez a fõláncnak flexibilitást biztosító hidrofil aminosavak és kis aminosavak irányba mutató eltolódás feltehetõen a legkülönfélébb antigének vagy epitópok kötésére hajlamos felszínek evolúcióját tükrözi, és segíthet megmagyarázni az antitestek szükséges keveredését a primer repertoárban. Mivel elõnyös az aminosavak ezen megoszlását utánozni, elõnyös, ha az utánzás a változtatni kívánt pozíciókban lévõ aminosavmegoszlás az antitestek antigénkötõ helyében látottaknak megfelelõen történik. Az aminosavak szubsztitúciójában fennálló, egy sorozat célantigén elleni bizonyos polipeptidek (nem csak antitesteredetû polipeptidek) szelektálását lehetõvé tevõ eltolódás könnyen alkalmazható bármely polipeptidrepertoárra. A variálni kívánt pozícióban lévõ aminosaveloszlás eltolására különféle eljárások léteznek (ideértve a trinukleotidok mutagenezisének alkalmazását, lásd WO 97/08320 számú nemzetközi közzétételi irat), amelyek közül – a szintézis egyszerûsége miatt – elõnyös eljárás a hagyományos degenerált kodonok alkalmazása. A degenerált kodonok összes kombinációja (minden pozícióban azonos arányokban létezõ egyszeres, kétszeres, háromszoros és négyszeres degeneráltság) által kódolt aminosavprofil és a természetben található aminosavhasználat összehasonlításával ki lehet számítani a leginkább reprezentatív kodont. Az (AGT) (AGC)T, (AGT)(AGC)C és (AGT)(AGC)(CT) – vagyis az IUPAC nevezéktan szerint DVT, DVC és DVY (megfelelõen) – kodonok állnak a legközelebb a

1

HU 004 725 T2

kívánt aminosavprofilhoz: ezek 22% szerint és 11% tirozint, aszparagint, glicint, alanint, aszpartátot, treonint és ciszteint kódolnak. Ennélfogva, elõnyös, ha úgy készítünk könyvtárakat, hogy a változatossá teendõ pozíciók mindegyikénél a DVT, DVC vagy DVY kodont alkalmazunk. PCR-mutagenezis A láncindító a polipeptidrepertoár tagjait kódoló nukleinsavrepertoár tagjainak elõállítására alkalmazott nukleinsavgyûjteményben lévõ célmolekula egy részével komplementer. A láncindítókat leggyakrabban szintetikus eljárásokkal állítják elõ kémiai úton vagy enzimekkel. Mutagén oligonukleotid-láncindítók általában 15–100 nukleotid, ideális esetben 20–40 nukleotid hosszúak, bár különbözõ hosszúságú oligonukleotidok is alkalmasak. Jellemzõ, hogy két, lényegében komplementer (egy legalább 14–25 nukleotid méretû szakasz mentén legalább körülbelül 65%-ban komplementer, elõnyösen legalább körülbelül 75%-ban komplementer, elõnyösebben legalább körülbelül 85%-ban vagy 90%-ban komplementer) nukleinsavszekvencia között szelektív hibridizáció jön létre. [lásd Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12, 203 (1984); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi]. Ennek eredményeként, várható, hogy az aktiválási helyen bizonyos mértékû hibás egyeztetés tolerálható. Ilyen hibás egyeztetés lehet kicsi, például mono¹, di¹ vagy trinukleotid. Esetleg, tartalmazhat olyan nukleotidhurkokat, amelyeket négy vagy több nukleotidból álló, megszakítatlan sorozatot felölelõ, hibásan egyeztetett régióknak nevezünk. Általában, a láncindítónak a szekunder nukleinsavhoz való hibridizációjának hatékonyságát és szelektivitását öt tényezõ befolyásolja. Ezek a faktorok – (i) a láncindító hossza, (ii) a nukleotidszekvencia és/vagy összetétel, (iii) hibridizációs hõmérséklet, (iv) a puffer kémiája, és (v) a szterikus gátlás lehetõsége abban a régióban, ahová a láncindítónak hibridizálni kellene – fontos tényezõk a nem véletlenszerû aktiválási szekvenciák tervezésében. A láncindító hossza és a láncindító egy adott célszekvenciával való összeolvadásának hatékonysága, illetve pontossága között pozitív összefüggés van; a hosszabb szekvenciáknak magasabb az olvadáspontja (TM) mint a rövidebbeknek, és egy adott célszekvencián belüli ismétlõdés kevésbé valószínû, ezáltal a kevert (promiszkus) hibridizáció elõfordulása minimális. Magas G–C-tartalmú vagy palindromszekvenciákat tartalmazó láncindító szekvenciák, akárcsak a tervezett célhelyeik, hajlamosak az önmagukkal való hibridizációra, mivel oldatban inkább az unimolekuláris hibridizáció kinetika az elõnyös és nem a bimolekuláris; ugyanakkor szükség van olyan láncindító tervezésére, amely a célszekvencia szoros kötéséhez elegendõ számú G–C nukleotidpárt tartalmaz, mivel minden ilyen pár három hidrogénkötéssel kapcsolódik, míg az A és T bázispárok csak kettõvel. A hibridizációs hõmérséklet a láncindító olvasztási hatékonyságával fordítottan arányos, és a hibridizációs keverékhez esetleg hozzá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 27

2

adott szerves oldószerekkel, például formamiddal, is ugyanez a helyzet, míg a sókoncentráció növelése elõsegíti a kötõdést. Sztringens körülmények között, a hosszabb próbák hatékonyabban hibridizálnak, mint az engedékenyebb körülmények között alkalmas rövidebbek. Láncindítók esetében, a sztringens körülmények közé tartozik jellemzõen a körülbelül 1 M¹osnál alacsonyabb, gyakorta körülbelül 500 mM¹osnál alacsonyabb, elõnyösen körülbelül 200 mM¹osnál alacsonyabb sókoncentrációk. A hibridizációs hõmérsékleti tartomány akár 0 °C¹tól 22 °C¹nál magasabb, körülbelül 30 °C¹nál magasabb, és (leggyakrabban) több mint 37 °C lehet. A hosszabb fragmentumok specifikus hibridizációjához magasabb hibridizációs hõmérsékletre lehet szükség. Mivel a hibridizáció sztringenciáját számos tényezõ befolyásolja, a paraméterek kombinálása fontosabb, mint önmagában bármelyikük abszolút mértéke. A láncindítók tervezésénél mindezeket át kell gondolni. Bár a szakember képes a számtalan szekvencia relatív értékeit megbecsülni; már terveztek olyan számítógépes programot, amely segítséget nyújt e számtalan paraméter értékeléséhez és a láncindító szekvenciákat optimalizálásához. Ilyen program például a DNAStar™ szoftvercsomag „PrimerSelect” programja (DNAStar, Inc.; Madison, WI) és az OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.). A tervezést követõen, alkalmas oligunkleotidokat állítunk elõ valamilyen alkalmas módon, például a Beaucage és Carruthers által leírt foszforamidit eljárással [Beaucage és Caruthers, Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981)] vagy a Matteucci and Caruthers szerinti triészter eljárással [Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (19881)] (mindkét publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi), vagy más kémiai eljárással, automata oligonukleotidszintetizátor, vagy például a VLSIPS™ technológia alkalmazásával. PCR-reakciót végzünk templát DNS (legalább 1 fg; alkalmasabban 1–1000 ng) és legalább 25 pM oligonukleotid-láncindító alkalmazásával. Amennyiben a láncindító készlet nagymértékben heterológ elõnyös lehet a láncindítót nagyobb mennyiségben alkalmazni, mivel minden szekvenciát a készletben levõ molekulák csak kis frakciója reprezentálja, és a késõbbi amplifikációs ciklusokban a mennyiség korlátozó tényezõvé válik. Egy jellemzõ reakciókeverék az alábbiakat tartalmazza: 2 ml DNS, 25 pmol oligonukleotid-láncindító, 2,5 ml 10X PCR-puffer 1 (Perkin–Elmer), 0,4 ml 1,25 mM¹os dNTP, 0,15 ml (vagy 2,5 egység) Taq DNS-polimeráz (Perkin–Elmer) és ionmentes víz 25 ml végsõ térfogatig. A keverékre ásványi olajat rétegezünk és programozható hõciklizáló berendezésben végrehajtjuk a PCR-reakciót. A PCR-ciklus minden lépésének hosszát és hõmérsékletét, akárcsak a ciklusok számát, a sztringencia aktuális elõírásai szerint állítjuk be. Az olvasztási hõmérsékletet és idõt egyrészt az a hatékonyság határozza meg, amellyel a láncindító várhatóan a templáthoz fog olvasztódni, másrészt pedig téves egyeztetések tolerálható mértéke. Egyértelmû, hogy amikor nukleinsavmolekulák szimultán amplifikációjára és mutagene-

1

HU 004 725 T2

zisére kerül sor, szükség van hibás egyeztetésre, legalábbis a szintézis elsõ körében. Molekulapopuláció kevert mutagén láncindító készlettel történõ amplifikációjára irányuló próbálkozás során, sztringens (magas hõmérsékletû) olvadási körülmények mellett, a csak az alacsony olvadási hõmérsékleteknél kapott potenciális mutáns termékek elvesztését állítjuk szembe a láncindítóknak a célhelytõl eltérõ szekvenciákkal való válogatás nélküli összeolvadásával. A láncindítók olvasztási körülményeinek sztringenciáját a szakember meg tudja határozni. Olvasztási hõmérsékletként 30 °C és 72 °C közötti hõmérsékletet szoktak alkalmazni. A templátmolekulák kezdeti denaturálása normális esetben 92 °C és 99 °C közötti hõmérsékleten 4 percig történik, majd ezt követi 20–40 ciklus, amely denaturálásból (94–99 °C, 15 másodperc és 1 perc közötti ideig), olvasztás (a hõmérséklet meghatározását a fentiekben már tárgyaltuk; 1¹2 perc), és kiterjesztés (72 °C, az amplifikált termék hosszától függõen 1–5 percig). A végsõ kiterjesztés általában 4 percig tart 72 °C¹on, és ezt követheti egy nem meghatározott idõtartamú (0–24 órás) lépés 4 °C¹on. Immunglobulin-eredetû variábilis egydomének szûrése antigénkötésre Miután egy adott, immunglobulin-eredetû variábilis egydomén-repertoárt expresszáltunk a fág felszínén, szelekciót végzünk a fágrepertoár immobilizált célantigénnel való érintkeztetésével, a nem kötõdött fág eltávolítására végzett mosással és a kötõdött fág szaporításával, a teljes folyamatot gyakran „panning”-nak (szelektálómosásnak) nevezik. Esetleg, valamilyen, csak a feltekeredett tagokat kötõ, immobilizált generikus ligandum (például, protein A vagy protein L) elleni szelektálómosással (panning) elõzetes fágszelekciót végzünk a korrekten feltekeredett tagváltozatok expresszálására nézve. Ennek megvan az az elõnye, hogy csökkenti a nem funkcionáló tagok arányát, ezáltal növeli azon tagok arányát, amelyek feltehetõen kötik az adott antigént. Generikus ligandumokkal végzett elõzetes szelekciót ismertetnek a WO 99/20749 számú nemzetközi közzétételi iratban. A fágeredetû antitestkönyvtárak szûrése általánosságban le van írva, például, Harrison és munkatársai közleményében [Harrison és munkatársai, Meth. Enzymol. 267, 83–109 (1996)]. A szûrést szilárd hordozón, például mûanyagcsövek vagy lyukak, vagy kromatográfiás mátrixon, például Sepharose™ (Pharmacia), immobilizált, tisztított antigén alkalmazásával szokták végezni. Szûrés és szelekció végezhetõ komplex antigénen is, például a sejtek felszínén [Marks és munkatársai, BioTechnology 11, 1145 (1993); de Kruif és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 3938 (1995)]. Egy másik alternatíva szerint, szelekciót végzünk biotinilált antigénoldatban történõ kötésével, majd ezt követi sztreptavidinnel bevont gyöngyökkel végzett befogás. A találmány egy elõnyös szempontja szerint, a szelektálómosást csöveken vagy lemezek lyukaiban, például Nunc MAXISORP™ M immuncsõ 8 lyukas csík, immobilizált (generikus vagy specifikus) antigénnel vé-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 28

2

gezzük. A lyukakat bevonjuk 150 ml antigénnel (100 mg/ml PBS) és 12 órán át inkubáljuk. Ezt követõen, a lyukakat PBS-sel háromszor mossuk és 400 ml, 2% fölözött tejet tartalmazó PBS-sel (2% MPBS) 2 órán át 37 °C¹on blokkoljuk. A lyukakat PBS-sel háromszor mossuk és 2% MPBS-ben hozzáadjuk a fágot. A keveréket szobahõmérsékleten 90 percig inkubáljuk és a nem kötött fágot tartalmazó folyadékot eltávolítjuk. A lyukakat elõször PBS-0,1% tween 20 eleggyel tízszer mossuk, majd a detergens eltávolítására PBS-sel még tízszer mossuk. A felkötött fágot 200 ml frissen készített 100 mM¹os trietil-amin hozzáadásával, elkeverésével és szobahõmérsékleten végzett 10 perces inkubálással eluáljuk. Az eluált fágot 100 ml 1 M¹os TrisHCl¹t (pH=7,4) tartalmazó csõbe visszük át és a trietilamin semlegesítése céljából vortexeljük. Exponenciálisan szaporodó E. coli gazdasejteket (például, TG1) fertõzünk, például, 150 ml eluált fággal (inkubálás 30 percig 37 °C¹on). A fertõzött sejteket lecentrifugáljuk, friss tápoldatban felszuszpendáljuk és agarózra lemezeljük. Fágtelepeket eluálunk vagy szúrunk fel friss gazdasejttenyészetekbe analízishez vagy további szelekciós körökhöz való felszaporítás céljából. Ha szükséges, egy vagy több teleptisztítást végzünk a szelektált fág tiszta populációjának biztosítására. További szûrési megközelítések az irodalomban ismertek [lásd például Harrison és munkatársai, mint fenn (1996)]. Egy kívánt célt kötõ, immunglobulin-eredetû variábilis egydomént expresszáló fág azonosítása után, fagemidvektor, például pHEN1, alkalmazása esetén, a variábilis domén fúziósfehérje könnyen elõállítható oldható formában az oldható gén III fúziósfehérje szekrécióját lehetõvé tevõ, nem szuppresszor baktériumtörzs, például HB2151, fertõzésével. Esetleg, oldható fehérje elõállítása végett a V doménszekvencia megfelelõ expressziós vektorba szubklónozható a technikában ismert eljárásokkal. Immunglobulin-eredetû variábilis egydomének tisztítása és töményítése A periplazmás térbe vagy a baktériumok tápközegébe szekretált, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptideket begyûjtöttük és ismert eljárások szerint [Harrison és munkatársai, mint fenn (1996)] tisztítottuk. Skerra és Pluckthun [Skerra és Pluckthun, Science 240, 1038 (1988)] és Breitling és munkatársai írták le [Breitling és munkatársai, Gene 104, 147 (1991)] az antitesteredetû polipeptidek periplazmából történõ begyûjtését, míg Better és munkatársai a tenyészet felülúszójából való gyûjtést ismertették [Better és munkatársai, Science 240, 1041 (1988)]. A tisztítás, generikus ligandumhoz – mint például protein A¹hoz vagy Protein L¹hez – való kötéssel is elérhetõ. Esetleg, a variábilis doméneket az affinitáskromatográfiás tisztítást elõsegítõ peptidtoldalékkal például, Myc, HA vagy 6X–His toldalékok – lehet expresszálni. Polipeptideket a technikában ismert számos eljárással – például ultraszûréssel, diaszûréssel és tangenciális áramlásos szûréssel – koncentrálunk. Az ultraszûréses folyamatban féligáteresztõ membránokat

1

HU 004 725 T2

és nyomást alkalmazunk a molekulák méret és alak szerinti elkülönítésére. A nyomást gáznyomás vagy centrifugálás biztosítja. A kereskedelmi forgalomban kapható termékek sokfelé beszerezhetõk, például a Millipore-tól (Bedford, MA; ilyenek például a Centricon™ és Microcon™ koncentrátorok) és a Vivascience-tõl (Hannover, Németország; ilyenek például a Vivaspin™ koncentrátorok). A célbavett polipeptid méreténél kisebb molekulatömeg-kizárás kiválasztásával (általában a célbavett polipeptid molekulatömegének 1/3¹a–1/6¹a, bár akár 10 kD¹os különbséget is lehet sikeresen alkalmazni), a polipeptid visszamarad, miközben az oldószer és a kisebb oldott anyagok áthaladnak a membránon. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek koncentrálására körülbelül 5 kD¹os molekulatömeg-kizárás alkalmas. Ultraszûrõ membránokat és „mosási” folyamatot alkalmazó diaszûrést alkalmazunk akkor, ha egy adott polipeptidkészítményben a só vagy puffer eltávolítására van szükség. A polipeptidet az oldószernek és kisméretû oldott anyagoknak a membránon való áthaladásával koncentráljuk, és a visszamaradt sókat és puffert a visszatartott polipeptid új pufferrel vagy sóoldattal vagy vízzel történõ hígításával, a kívánalmak szerint további ultraszûréssel, távolítjuk el. Folyamatos diaszûrés során, a szûrlet membránon való áthaladásával azonos arányban adunk új puffert a rendszerhez. A diaszûrési térfogat a polipeptidoldat térfogata a diaszûrés kezdete elõtt – folyamatos diaszûrés alkalmazásával, a teljesen permeábilis oldatnak több mint 99,5%¹a eltávolítható hat diafiltrációs térfogatnyi új pufferrel végzett átmosással. Esetleg, a folyamat elvégezhetõ szakaszos módban is, ahol a mintát ismételten hígítjuk, majd eredeti térfogatára visszaszûrjük a só vagy puffer eltávolítása vagy cseréje céljából, végül koncentráljuk a polipeptidet. Diafiltrációs berendezések és azok alkalmazásával kapcsolatos részletes módszertan beszerezhetõk, például a Pali Life Sciences (Ann Arbor, MI) és Sartorius AG/Vivascience (Hannover, Németország). A tangenciális áramlási szûrésben (Tangential flow filtration (TFF), más néven „keresztáramlásos szûrés”ben, is ultraszûrõ membránokat alkalmazunk. A célpolipeptidet tartalmazó folyadékot érintõlegesen pumpáljuk a membrán felszíne mentén. A nyomás miatt a folyadék egy része áthalad a membránon, míg a célpolipeptid visszamarad a szûrõ felett. Azonban, a standard ultraszûréssel szemben, a visszatartott molekulák nem gyûlnek össze a membrán felszínén, hanem a tangenciális áramlás mentén haladnak. A szûrõn át nem haladó oldat (amely tartalmazza a célpolipeptidet), a koncentrálás kívánt mértékének eléréséig ismételten cirkuláltatható a membránon át. TFF-hez szükséges berendezések és azok alkalmazásával kapcsolatos részletes módszertan beszerezhetõk, például Millipore-tól (például, a ProFlux M12™ Benchtop TFF rendszer és a Pellicon™ rendszerek), és a Pall Life Sciences-tõl (például, a Minim™ Tangential Flow Filtration rendszer).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 29

2

Fehérjekoncentráció a technikában ismert számtalan jól ismert eljárással mérhetõ. Ezek közé tartozik, például, az aminosavanalízis, a 280 nm¹en mért abszorbancia, a „Bradford” és „Lowry” eljárások, és az SDS-PAGE. A legpontosabb eljárás a teljes hidrolízist követõen HPLC-vel végzett aminosavanalízis, majd azt követõen a koncentrációt az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid ismert szekvenciájával való összehasonlítással állapítjuk meg. Bár ez az eljárás a legpontosabb, de költséges és idõigényes. A 280 nmes UV¹abszorbancia mérésével történõ fehérjemeghatározás gyorsabb és kevésbé költséges, de mégis viszonylag pontos és elõnyös választás az aminosavanalízis helyett. A 280 nm¹en mért abszorbanciát alkalmaztuk a példákban leírt fehérjekoncentrációk meghatározására. A „Bradford” és „Lowry”-féle fehérjevizsgálatok [Bradford, Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976); Lowry és munkatársai, J. Biol. Chem. 193, 265–275 (1951)] a minták fehérjekoncentrációját hasonlítják össze egy legtöbbször borjúeredetû szérumalbuminon (BSA) alapuló – standard görbével. Ezek az eljárások kevésbé pontosak, mivel hajlamosak túlbecsülni az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydomének koncentrációját. Az eljárások pontossága növelhetõ, azonban, ha VH¹ vagy Vk-eredetû egydoménes polipeptideket alkalmazunk standardként. Egy további fehérjevizsgálati eljárás az US 4.839.295 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi) leírt és Pierce Biotechnology (Rockford, IL) által „BCA Protein Assay”-ként forgalmazott (például, Pierce Katalógusszám: 23227) bicinchoninsavas vizsgálat. A SDS-PAGE eljárás gélelektroforézist és Coomassie Blue festést alkalmaz az ismert koncentrációjú standardokkal, például ismert mennyiségû immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptiddel, való összehasonlításban. A mennyiségi meghatározás végezhetõ szemmel vagy denzitometriával. A leírás szerinti, emberi immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes antigénkötõ polipeptidek oldékonyságukat magas koncentrációnál [például legalább 4,8 mg (~400 mM) vizes oldatban (például PBS), és elõnyösen legalább 5 mg/ml (~417 mM), 10 mg/ml (~833 mM), 20 mg/ml (~1,7 mM), 25 mg/ml (~2,1 mM), 30 mg/ml (~2,5 mM), 35 mg/ml (~2,9 mM), 40 mg/ml (~3,3 mM), 45 mg/ml (~3,75 mM), 50 mg/ml (~4,2 mM), 55 mg/ml (~4‚6 mM), 60 mg/ml (~5,0 mM), 65 mg/ml (~5,4 mM), 70 mg/ml (~5,8 mM), 75 mg/ml (~6,3 mM), 100 mg/ml (~8,33 mM), 150 mg/ml (~12,5 mM), 200 mg/ml (~16,7 mM), 240 mg/ml (~20 mM) vagy magasabb] megtartják. A magas oldékonyságot elõsegítõ egyik szerkezeti tulajdonság az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek viszonylag kis mérete. Egy teljes hosszúságú, négy láncból álló antitest, például IgG, körülbelül 150 kD méretû. Ezzel szemben, az immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének – amelyek általános szerkezete 4 vázrégiót (FW) és 3 CDR¹t tartalmaz – mérete körülbelül 12 kD,

1

HU 004 725 T2

vagy a hagyományos antitest méretének 1/10-énél kisebb. Hasonlóképpen, az immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének mérete az scFv molekula méretének (~26 kD) körülbelül a fele és a Fab molekula méretének (~60 kD) körülbelül egyötöde. Elõnyös, ha a leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis egydoméneket tartalmazó szerkezet mérete 100 kD vagy annál kisebb, ideértve a körülbelül 90 kD vagy kisebb, 80 kD vagy kisebb, 70 kD vagy kisebb, 60 kD vagy kisebb, 50 kD vagy kisebb, 40 kD vagy kisebb, 30 kD vagy kisebb, 20 kD vagy kisebb, le egészen és ideértve a körülbelül 12 kD méretû szerkezeteket, vagy egy különálló immunglobulin-eredetû, variábilis egydomént. Egy adott polipeptid oldékonyságát elsõsorban az aminosav-oldalláncok és az azokat körülvevõ oldószer közötti kölcsönhatások határozzák meg. A polipeptid feltekeredésekor a hidrofób oldalláncok hajlamosak a molekula belsejében elhelyezkedni, a polipeptid, oldószerekkel kölcsönhatásba lépõ felszíneitõl távol. Ezzel szemben, a hidrofil aminosavak inkább a polipeptid, oldószerekkel kölcsönhatásba lépõ felszíneinél helyezkednek el. Általában, az olyan elsõdleges szekvenciájú polipeptidek, amelyek lehetõvé teszik, hogy a molekula a vizes környezetnek több hidrofil aminosavat kitevõ módon tekeredjen fel jobban oldhatóak, mint a felszínükre kevesebb hidrofil aminosavat kitevõ módon feltekeredõ polipeptidek. Így, a hidrofób és hidrofil aminosavak elrendezõdése és száma az oldékonyság fontos meghatározója. A polipeptid oldékonyságát meghatározó további paraméterek közé tartozik az oldószer pH¹ja, hõmérséklete és ionerõssége. Az általános gyakorlatban, a polipeptidek oldékonysága megtartható vagy fokozható, ha az oldathoz (például, ~10% v/v) glicerint adunk. A fentiekben tárgyaltak értelmében, olyan, specifikus aminosavakat azonosítottunk az emberi VH-domének konzervált aminosavai között, amelyek a tevefélék, emberi VH-doméneknél általában oldékonyabb VH-doménjeiben változnak. Ezek közé tartozik, például, a Gly 44 (tevefélékben Glu), Leu 45 (tevefélékben Arg) és Trp 47 (tevefélékben Gly). A VH 103. aminosava is érintett az oldékonyság tekintetében, Trp-rõl Arg¹ra történõ mutáció fokozza a VH oldékonyságát. A találmány elõnyös szempontjaiban, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek a DP47 csíravonal-eredetû VH-génszegmensen vagy a DPK9 csíravonal-eredetû Vk-génszegmensen alapulnak, így, e csíravonal-eredetû génszegmensek – különösen a leírás szerinti kiválasztott szerkezeti helyeken történ diverzifikálás esetén – képesek jól oldható, specifikus kötésû, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet elõállítani. Különösen a négy vázrégió – amelyek elõnyösen nincsenek diverzifikálva – vehet részt az eredményül kapott fehérjék magas oldékonyságában. Azt várjuk, hogy egy ismerten magas oldékonyságú, immunglobulin-eredetû, variábilis egydoménnel homológ immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén is igen oldékony lesz. Így, annak elõrejelzése vagy felismerése alapján, hogy egy adott, immunglobulin-erede-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

tû, variábilis egydoménnek az itt említett magas oldékonysága lenne, össze lehet hasonlítani egy adott immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet egy vagy több másik, ismert oldékonyságú, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptiddel. Eszerint, amikor egy adott, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidrõl megállapítjuk, hogy magas kötési aktivitású de oldékonysága nem ismert, a kérdéses polipeptid aminosavszekvenciájának egy vagy több (elõnyösen több), ismerten jól oldódó, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptiddel (például, a leírásban ismertetett egyik dAb-szekvencia) összehasonlítása lehetõvé teszi megjósolni annak oldékonyságát. Bár ez nem agy abszolút elõrejelzés, ahol nagyfokú a hasonlóság egy ismerten jól oldódó szekvenciához (például 90–95%¹os, vagy annál nagyobb hasonlóság), és különösen ott, ahol a hidrofil aminosavakat, vagy az oldószer interfázisnak felehetõen kitett aminosavakat illetõen nagy a hasonlóság, igen valószínû, hogy az újonnan azonosított kötõ-polipeptid oldékonysága hasonlítani fog az ismerten jól oldódó szekvenciáéhoz. Egy adott polipeptidszekvencia, ismert oldékonyságú polipeptidéhez viszonyított oldékonyságának elõrejelzésére molekulamodellezõ szoftvereket is alkalmazhatunk. Például, az oldószernek kitett felszínen egy hidrofób aminosav szubsztitúciója vagy addíciója – a kérdéses pozícióban kitett, kevésbé hidrofób vagy akár hidrofil aminosavat tartalmazó, ismert oldékonyságú molekulához viszonyítva – várhatóan csökkenti a polipeptid relatív oldékonyságát. Hasonlóképpen, az ilyen helyen lévõ hidrofilebb aminosav szubsztitúciója vagy addíciója várhatóan növeli a relatív oldékonyságot. Vagyis, a molekula felszínén található hidrofil vagy hidrofób aminosavak nettó számában (vagy a felszínen kitett aminosavak általános hidrofób vagy hidrofil természetében) egy ismert oldékonyságú, immunglobulineredetû, variábilis-egydoménes polipeptidszerkezethez viszonyítva bekövetkezett változás elõrejelezheti egy adott immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid relatív oldékonyságát. Esetleg vagy egy ilyen elõrejelzéssel kapcsolatban, meg az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid oldékonyságának határait a polipeptid töményítésével egyszerûen meg lehet határozni.

Affinitás/aktivitás meghatározása A találmány szerinti, izolált, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptideknek legalább 50 300 nM¹os vagy annál alacsonyabb és elõnyösen legalább 300 nM–50 pM, 200 nM–50 pM, és elõnyösebben legalább 100 nM–50 pM, 75 nM–50 pM, 50 nM–50 pM, 25 nM–50 pM, 10 nM–50 pM, 5 nM–50 pM, 1 nM–50 pM, 950 pM–50 pM, 55 900 pM–50 pM, 850 pM–50 pM, 800 pM–50 pM, 750 pM–50 pM, 700 pM–50 pM, 650 pM–50 pM, 600 pM–50 pM, 550 pM–50 pM, 500 pM–50 pM, 450 pM–50 pM, 400 pM–50 pM, 350 pM–50 pM, 300 pM–50 pM, 250 pM–50 pM, 200 pM–50 pM, 60 150 pM–50 pM, 100 pM–50 pM, 90 pM–50 pM, 30

1

HU 004 725 T2

80 pM–50 pM, 70 pM–50 pM, 60 pM–50 pM, vagy akár 50 pM¹os affinitásuk van (disszociációs állandó, Kd,=Koff/Kon). Egy adott, variábilis doménbõl származó polipeptid antigénkötõ affinitása felszíni plazmonrezonanciával [surface plasmon resonance (SPR)] kényelmesen mérhetõ [BIAcore rendszer (Pharmacia Biosensor, Piscataway, N. J.)]. Ebben az eljárásban, a BIAcore chiphez ismert koncentrációban antigént kötünk fel, és variábilis-doménes polipeptideket visszünk be. A variábilis domén polipeptidje és az immobilizált antigén közötti specifikus kötõdés a chip anyagán fehérjekoncentráció-növekedést és az SPR-jelben változást eredményez. Az SPR-jelben bekövetkezett változások rezonanciaegységként (RU) tárolódnak és a szenzogram Y tengelye mentén az idõ függvényében kerülnek kijelzésre. Az oldószert (például, PBS¹t) a chip felett áramoltatva alapvonalat is felveszünk. Az alapvonaljel és a variábilisdoménes polipeptid injektálásának befejezése utáni jel közötti nettó különbség felel meg egy adott minta kötési értékének. Az „eltávozási” (off) sebességi konstans (Koff), a „kapcsolódási” (on) sebességi konstans (Kon) és a disszociációs sebességi konstans (Kd) meghatározásához BIAcore kinetikai értékelési szoftvert (például, 2.1 verzió) alkalmazunk. A magas affinitás függ az antigén felszíne és az antitest vagy antitestfragmentum CDR-jei közötti komplementaritástól. A komplementaritást a célantigén részei és a CDR közötti lehetséges molekuláris kölcsönhatások típusa és erõssége határozza meg, például, a lehetséges ionos kölcsönhatások, a van der Waals-féle vonzások, hidrogénkötés és más esetlegesen elõforduló kölcsönhatások. Feltehetõen általában nagyobb mérete miatt, az elõnyös felszíni kölcsönhatásokhoz több lehetõséget biztosító CDR3 inkább hajlamos résztvenni az antigénkötõ kölcsönhatásban, mint a CDR1 vagy CDR2. [lásd például Padlan és munkatársai, Mol. Immunol. 31, 169–217 (1994); Chothia és Lesk, J. Mol. Biol. 196, 904–917 (1987); illetve Chothia és munkatársai, J. Mol. Biol. 186, 651–663 (1985)]. A nagy affinitás olyan, immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén/antigén párképzést jelez, amelynek komplementaritása nagy arányú, amely a variábilis domén és a cél szerkezeteivel közvetlenül kapcsolatos. Immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidnek egy adott antigénre vonatkozó nagy affinitását biztosító szerkezetek kijelölhetõk egy adott antigénnek a polipeptidszerkezettel való dokkolását lehetõvé tevõ, molekuláris modellezési szoftver alkalmazásával. Általában, a kölcsönhatásban részt vevõ felszínek meghatározása céljából, egy adott, ismert aktivitású, immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén szerkezetének számítógépes modellje dokkolható egy adott, ismert szerkezetû polipeptid vagy célantigén számítógépes modelljével. Miután egy ilyen ismert kölcsönhatás esetében a kölcsönhatásban részt vevõ felszínekre fény derült, elõre lehet jelezni azt, hogy a variábilis domén szekvenciájában végzett konzervatív vagy kevésbé konzervatív szubsztitúciók milyen (pozitív vagy negatív) hatást gyakorolnak a kölcsönhatás erõsségére,

2

és így lehetõvé válik a tökéletesített kötõmolekulák racionális tervezése.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 31

Antitesteredetû, variábilis egydomének multimer formái A találmány egyik szempontjában, multimerizáljuk a leírás szerinti immunglobulin-eredetû, variábilis egydomént, például, hetero- vagy homodimerekké, heterovagy homotrimerekké, hetero- vagy homotetramerekké, vagy magasabb rendû hetero- vagy homomultimerekké (például, hetero- vagy homopentamerré és akár octomerekké is). A multimerizáció megnövelheti az antigén megkötésének erõsségét az aviditási hatás révén, ahol a kötés erõssége kapcsolatban áll a többszörös kötõhelyek kötõaffinitásai összességével. Hetero- és homomultimereket állítunk elõ egymással – például dAb-linker-dAb konfigurációt vagy az elõbbi elrendezés magasabb rendû többszöröséhez vezetõ peptidlinkeren át – fuzionált immunglobulin-eredetû, variábilis egydoménekkel. A multimerek is kapcsolhatók további csoportokkal, például szérum féléletidõt növelõ polipeptidszekvenciával vagy más effektor csoporttal, például toxinnal vagy célbajuttató csoporttal; például PEG-gel. Hetero- és homomultimerek elõállítására bármilyen peptidlinker-szekvencia alkalmazható, például a technikában egy scFv elõállítására alkalmazható linkerszekvenciák. Egy szokásos alkalmas linker a (Gly4Ser)n peptidszekvencia ismétlõdéseit tartalmazza, ahol n=1-tõl körülbelül 10¹ig terjed (például, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, vagy 10). Például a linker lehet (Gly4Ser)3, (Gly4Ser)5, (Gly4Ser)7 vagy a (Gly4Ser) szekvencia egy másik többszöröse. A multimerek peptidszekvenciákkal kapcsolt monomerként történõ expressziójának egy alternatívája, ha az immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének monomerjeinek kapcsolása a transzlációt követõen, például diszulfidkötéssel vagy más kémiai kapcsolással történik. Például szabad ciszteint építünk be génsebészeti úton, például a polipeptidmonomer C¹terminálisához, amely cisztein lehetõvé teszi a monomerek közötti diszulfidkötés létrejöttét. A találmány ezen vagy más, szabad ciszteint igénylõ szempontjaiban, a ciszteint beillesztjük a dAb-szekvencia utolsó kodonnal határos PCR-láncindítóba bevett cisztein kodonnal (TGT, TGC) (C¹terminális cisztein esetében, a láncindítóban lévõ szekvencia lesz aktuálisan a fordított komplement, azaz ACA vagy GCA, mivel ez a 3’ PCR-láncindítóba lesz beépítve) az egyetlen vagy több stopkodon elé közvetlenül. Ha szükséges, linkerpeptid-szekvenciát, például (Gly4Ser)n, helyezünk a dAb-szekvencia és a szabad cisztein közé. A szabad cisztein aminosavat tartalmazó monomerek expressziója a monomer és dimer formák körülbelül 1:1 arányú keverékét eredményezi. A dimereket gélkromatográfia alkalmazásával, például sógradienssel végzett ioncserélõ kromatográfiával, különítjük el a monomerektõl. Esetleg, génsebészeti úton bevitt szabad ciszteint alkalmazunk a monomerek multivalens kémiai linkerhez (például, trimeri maleimid molekula (például trisz[2¹maleimido-etil]-amin, TMEA) vagy bimaleimid

1

HU 004 725 T2

PEG molekula [beszerezhetõ például a Nektartól (Shearwater)] tiolkötéseken át történõ kapcsolására. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti homodimer vagy heterodimer immunglobulin-eredetû CH1-domén vagy Ck-domén C¹terminális aminosavához kovalensen kapcsolt VH vagy VL doménokat tartalmaz, megfelelõen. Így, a hetero- vagy homodimer lehet Fab-szerû molekula, ahol az antigénkötõ domén rendre a C¹terminálisuknál CH1- és Ck-doménekkel kovalensen kapcsolt, asszociált VH és/vagy VL doméneket tartalmaz. Ezenfelül, vagy esetleg, a találmány szerinti dAb-multimer modellezhetõ olyan, a tevefélék közé tartozó fajon, amely nagy arányban expresszál teljesen funkcionális, magasan specifikus, de könnyûlánc-eredetû szekvenciákat nem tartalmazó antitesteket. A tevefélékbõl származó nehézlánc-eredetû antitestek egyetlen, konstans régióikon át dimerizált nehézláncból létrejött homodimerek. E tevefélék nehézlánc-eredetû variábilis doménjeit VHH doméneknek nevezik, és a VH lánc fragmentumaiként való izolálás esetén megtartják nagy specificitású antigénkötõ képességüket [Hamers–Casterman és munkatársai, Nature 363, 446–448 (1993); Gahroudi és munkatársai, FEBS Lett. 414, 521–526 (1997)]. Így, olyan a találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes multimert lehet elõállítani – a technikában ismert eljárások alkalmazásával és a fentiekben leírtak szerint – amelyeknek a tevefélék nehézlánc-antitestjeire jellemzõ VHH konformációja van.

5

10

15

20

25

30 Célantigének A találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek célantigénjei betegséggel vagy rendellenességgel kapcsolatos emberi antigének. Vagyis, a leírás szerinti antigének terápiásan releváns célpontok. A leírás szerinti értelemben, „terápiásan releváns célpont” az, amely – a célantigént kötõ és a célpont aktivitása antagonistájaként vagy agonistájaként mûködõ immunglobulin-eredetû, variábilis egydoménhez vagy más antitesteredetû polipeptidhez kötõdve – jótékony hatást gyakorol arra egyedre (elõnyösen emlõsre, elõnyösen emberre), amelyben a célpont kötött állapotban van. „Jótékony hatást” jelent, ha egy adott betegség vagy rendellenesség egy vagy több klinikai elõjel legalább 10%¹os javulást mutat, vagy, esetleg, ahol az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid profilaktikus alkalmazására van szükség, a célbavett betegség vagy elváltozás tüneteinek megjelenése elõtti idõben legalább 10%¹os növekedés figyelhetõ meg az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidkészítménnyel nem kezelt egyedhez képest. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek számára alkalmas célpontnak tekintett antigének közé tartozik, minden korlátozás nélkül, például a citokinek, citokinreceptorok, enzimek, enzimkofaktorok, vagy DNS-kötõ fehérjék. Alkalmas citokinek és növekedési faktorok közé tartoznak, minden korlátozás nélkül, az alábbiak: ApoE, ApoSAA, BDNF, kardiotrofin-1, EGF, EGF-receptor, ENA–78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, savas FGF,

35

40

45

50

55

60 32

2

bázikus FGF, fibroblaszteredetû növekedési faktor 10, FLT3 ligandum, Fraktalkin (CX3C), GDNF, G–CSF, GM–CSF, GF¹b1, inzulin, gIFN, IGF–I, IGF–II, IL–1a, IL–ab, IL–2, IL–3, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–8 (72 a.a.), IL–8 (77 a.a.), IL–9, IL–10, IL–11, IL–12, IL–13, IL–15, IL–16, IL–17, IL–18, Inhibin a, Inhibin a, IP–10, keratinocitaeredetû növekedési faktor¹2 (KGF–2), KGF, Leptin, LIF, Limfotactin, Mülleri inhibitorszubsztancia („Mullerian inhibitory substance”), monocitaeredetû telepgátló-faktor, monocitaeredetû attraktáns fehérje, M–CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP–1 (MCAF), MCP–2, MCP–3, MCP–4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP–1a, bMIP–1, aMIP–3, bMIP–3, MIP–4, mieloideredetû progenitorinhibitor-faktor¹1 (MPIF–1), NAP–2, Neurturin, idegi növekedési faktor, bNGF, NT–3, NT–4, Onkosztatin M, PDGF¹AA, PDGF¹AB, PDGF¹BB, PF–4, RANTES, SDF1a, SDFab, SCF, SCGF, õssejtfaktor (SCF), TARC, TACE felismerési hely, aTGF, bTGF, bTGA 2, bTGF 3, tumornekrózis-faktor (TNF), aTNF, bTNF, TNF receptor I (p55), TNF receptor II, TNIL–1, TPO, VEGF, VEGF-receptor 1, VEGF-receptor 2, VEGF-receptor 3, GCP–2, GRO/MGSA, bGRO, gGRO, HCCl, 1–309, HER 1, HER 2, HER 3 és HER 4. Citokinreceptorok közé tartoznak az alábbi összes citokin receptorai: például, IL–1R, IL–6R, IL–10R, IL–18R stb. Egyértelmû, hogy ez lista nem teljes. A találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek elõnyös célpontjai a WO 04/041867 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak leírva (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi), és – minden korlátozás nélkül – idetartoznak az alábbiak: aTNF, IgE, gIFN, MMP–12, EGFR, CEA, H. pylori, TB, influenza, PDK–1, GSK1, Bad, kaszpáz, Forkhead és Von Willebrand Faktor (vWF). A fenti célpontok fragmentumai is célpontok lehetnek. Eszerint, egy adott célpont lehet akár a centi célpontok immunválasz kiváltására képes fragmentuma is. Egy adott célpont továbbá a fenti célpontoknak a teljes hosszúságú célpont ellen elõállított, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidhez való kötõdésre képes fragmentuma. A találmány egyik szempontjában, immunglobulineredetû, variábilis egydomént kötünk egy másik, immunglobulin-eredetû, variábilis egydoménhez olyan homodimer vagy heterodimer kialakítása végett, amelyben minden egyedi domén képes a hozzá tartozó antigént megkötni. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén homodimerekké történõ fuzionáltatása, például az avidítási hatás révén, képes fokozni a célpont megkötésének hatékonyságát. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének olyan heterodimerekké való fuzionáltatása, amelyekben minden monomer más célantigént köt, kettõs specificitású ligandum elõállítását eredményezheti, amely például a megfelelõ célantigén áthidaló kötésére képes. Ilyen, kettõs specificitású ligandumok alkalmazhatók citokinek és más, egy adott szervezetben a terápiás helyzetekben szinergista módon együttmûködõ molekulák célbavételére. Így, a találmány tárgyát két vagy több citokin aktivitásának szinergizálására szol-

1

HU 004 725 T2

gáló eljárás képezi, amely eljárásban a két vagy több citokinhez való kötõdésre képes, kettõs specificitású, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes heterodimert adunk be. A találmány e szempontjában, a kettõs specificitású ligandum lehet bármilyen kettõs specificitású ligandum, így komplementer és/vagy nem komplementer doménekbõl álló ligandum. Például e

Párosítás

TNF/bTGF TNF/IL–1

5

2

szempont VH-domének és VL-domének kombinációira, csak VH doménekre és csak VL-doménekre vonatkozik. Elõnyös, ha a találmány e szempontja szerinti kettõs specificitású, immunglobulin-eredetû, variábilisegydoménes heterodimer által megkötött citokineket az alábbi listából választjuk ki:

Bizonyíték a terápiás hatásra

Kollagén által indukált arthritis egérmodelljében a bokaízületbe injektált bTGF és TNF jelentõs mértékben javította az ízületi gyulladást. Kollagénnel nem kezelt egerekben nem volt hatás. TNF és IL–1 az uveitis patológiájában szinergizál. TNF és IL–1 a malária patológiájában szinergizál (hipoglikémia, NO). TNF és IL–1, gyulladás során a polinukleáris (PMN) sejtek migrációjának indukálásában szinergizál. IL–1 és TNF szinergizálja az egérperitoneumba irányuló PMN-beszürõdés indukálását. IL–1 és TNF szinergizálja az endotél sejtek IL–1 szekréciójának indukcióját. Fontos a gyulladásban. IL–1 és TNF egyedül bizonyos sejtes beszûrõdést indukált a nyulak térdizületébe. IL–1 PMNeket indukált, a TNF pedig monocitákat. Ezek együtt, a megnövekedett PMN¹ek miatti súlyosabb beszûrõdést indukáltak. Keringõ miokardiális depresszáns szubsztancia (szepszis esetén van jelen) a szinergista módon ható alacsony szintû IL–1 és TNF.

TNF/IL–2

Ölõ T¹sejtek szinergista aktiválásával kapcsolatos hivatkozások

TNF/IL–3

–

TNF/IL–4

IL–4 és TNF, endotél sejteken VCAM-expresszió indukálására szinergizál. Feltehetõen szerepet játszik az asztmában. Ugyanez a helyzet az ízületre – szerepet játszik az RA¹ban. TNF és IL–4, keratinocitákban IL–6 indukálására szinergizál.

TNF/IL–6

–

TNF/IL–8

TNF és IL–8 a vérlemezkék aktiválására PMN-ekkel szinergizál. Részt vesz az akut légzési elégtelenségben.

TNF/IL–10

IL–10 indukálja és TNF¹fel szinergizálja a HIV-expresszió indukcióját krónikusan fertõzött T¹sejtekben.

TNF/IL–12

–

TNF/gIFN

MCH indukciója az agyban. Vírusellenes válaszban/IFN¹b indukcióban szinergizál. Neutrofil aktiválás/légzési robbanás. Endotélsejtek aktiválása Betegek TNF/gIFN¹nel végzett antivirális kezelésekor toxicitást figyeltek meg (további ismeretek szükségesek). Emberi asztrociták fraktalkint expresszálnak. Számos közlemény a gyulladásos válaszokról – azaz LPS, továbbá makrofág-aktiválás. Egerek halálos endotoxémiája elleni védelmére anti-TNF és anti-gIFN szinergizál.

bTGF/IL–1

Oszteoblasztok általi prosztaglandinszintézis Epitél sejtek általi IL–6-termelés (gyulladási modell) IL–11 és IL–6 serkentése tüdõfibroblasztokban (gyulladási modell) IL–6- és IL–8-termelés a retinában

bTGF/IL–6 IL–1/IL–2

Kondrokarcomaproliferáció B-sejtek aktiválása LAK-sejtek aktiválása T-sejtek aktiválása

33

HU 004 725 T2

Táblázat (folytatás) Párosítás

Bizonyíték a terápiás hatásra

IL–1/IL–3

–

IL–1/IL–4

B-sejtek aktiválása Endotél sejtek aktiválásában az IL–4 IL¹1-expressziót indukál.

IL–1/IL–6

B-sejtek aktiválása T-sejtek aktiválása (helyettesítheti a járulékos sejteket) IL–1 indukálja az IL–6 expresszióját C3 és szérumeredetû amiloid expressziója (akut fázisú válasz) HIV-expresszió A porcban lévõ kollagén lebontása.

IL–1/IL–8

–

IL–1/IL–10

–

IL–1/gIFN

–

IL–2/IL–3

T-sejt-proliferáció B-sejt-proliferáció

IL–2/IL–4

B-sejt-proliferáció T-sejt-proliferáció

IL–2/IL–5

B-sejt-proliferáció/Ig-szekréció IL–5 indukálja a B¹sejteken lévõ IL–2 receptorokat

IL–2/IL–6

Citotoxikus T¹sejtek kialakulása

IL–2/IL–7

–

IL–2/IL–10

B-sejtek aktiválása

IL–2/IL–12

–

IL–2/IL–15

–

IL–2/gIFN

B-sejtek általi Ig¹szekréció IL–2 T¹sejtek általi gIFN-expressziót indukál

IL–2/a/bIFN

–

IL–3/IL–4

A hízósejtek szaporodásában szinergizál

IL–3/IL–5

–

IL–3/IL–6

–

IL–3/gIFN

–

IL–4/IL–5

A hízósejtek hisztamintartalma megnõ stb., IgE¹re adott válaszként történõ szekréció

IL–4/IL–6

–

IL–4/IL–10 IL–4/IL–12

–

IL–4/IL–13

–

IL–4/gIFN

–

IL–4/SCF

Hízósejt-proliferáció

IL–5/IL–6

–

IL–5/gIFN

–

IL–6/IL–10

–

IL–6/IL–11

–

IL–6/gIFN

–

IL–10/IL–12

–

IL–10/gIFN

–

IL–12/IL–18

–

34

1

HU 004 725 T2

2

Táblázat (folytatás) Párosítás

Bizonyíték a terápiás hatásra

IL–12/gIFN

Az immunrendszer serkentésének részeként, az IL–12 B¹ és T¹sejtek általi gIFN-expressziót indukál.

IL–18/gIFN

–

Anti-TNF/anti–CD4

Szinergista terápiás hatás arthritises DBA/1 egerekben.

A fentiekben felsorolt és más célantigének aminosav- és nukleotidszekvenciái ismertek és a szakember számára elérhetõk. Ahol szükséges, a szakember, rekombináns fehérjék expressziójára szolgáló standard eljárásokat alkalmaz ezek és más antigének expresszálására és tisztítására – például a célantigént kötõ immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének elõállítására. Funkcionális vizsgálatok A találmány egyik megvalósítási módjában, a leírás szerinti, antitesteredetû, variábilis egydoméneknek (és egydoménekbõl képzett multimereknek) az általuk célbavett antigének felé semlegesítõ aktivitásuk (például, antagonizáló aktivitásuk) vagy agonista aktivitásuk van. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid (akár semlegesítõ, akár pedig agonista) aktivitását a célantigénnek a polipeptid hiányában kifejtett aktivitásához képest mérjük az ilyen aktivitás mérésére elfogadott bármilyen vizsgálatban. Például, amennyiben a célantigén enzim, a kérdéses enzim aktivitását nyomonkövetõ in vivo vagy in vitro funkcionális vizsgálatot alkalmazunk egy adott, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid aktivitásának vagy hatásának nyomon követésére. Ahol például a célantigén receptor, például citokinreceptor, az aktivitást a ligandum receptorhoz való csökkent vagy megnövekedett kötõdéseként mérjük, vagy a receptor csökkent vagy megnövekedett jeltovábbítási aktivitásával mérjük az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid jelenlétében. Receptor jeltovábbítási aktivitást nyomon követéssel, például, receptorkonformáció, kofaktor- vagy partner polipeptidkötõdés, GDP GTP¹re való cseréje, az aktivált receptor általi kináz¹, foszfatáz- vagy más enzimatikus aktivitás monitorozásával vagy az ilyen aktivitás késõbbi, „downstream” eredményének, például egy adott gén expressziója (így riportergén) vagy más hatás, így például, sejthalál, DNSreplikáció, sejtadhézió, vagy receptoraktiválás eredményeként normális esetben elõforduló egy vagy több molekula kiválasztása, monitorozásával mérjük. Amennyiben a célantigén, például, citokin vagy növekedési faktor, az aktivitást a citokinnek a receptorához való kötõdésének vizsgálatával követjük nyomon vagy a receptor aktiválását monitorozzuk, például, a fentiekben leírtak szerint, a receptor jeltovábbítási aktivitását követjük nyomon. Egy adott citokin késõbbi, „downstream” hatását mérõ funkcionális vizsgálat, például, az aTNF aktivitásának vizsgálatára szolgáló, a technikában jól ismert L929 sejtölési vizsgálat (lásd például US 6.090.382 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Az alábbi L929 citotoxicitási vizs-

10 gálatot nevezzük a leírásban „standard” L929 citotoxicitási vizsgálatnak. TNF-elleni, immunglobulin-eredetû, variábilis egydoméneket („anti-TNF dAb-ok”) teszteltünk a TNF, egéreredetû L929-fibroblasztokra gyakorolt citotoxikus hatását semlegesítõ képességükre nézve 15 [Evans, Molecular Biotechnology 15, 243–248 (2000)]. Röviden, mikrotiterlemezekre kilemezelt L929-sejteket anti-TNF dAb-okkal, 100 pg/ml TNF¹el és 1 mg/ml aktinomicin D¹vel (Sigma, Poole, UK) inkubáltunk 12 órán át. A sejtek életképességét 3¹(4,5-dimetil-tiazol-2¹il)-520 (3¹karboxi-metoxi-fenil)-2-(4¹szulfofenil)-2H-tetrazoliummal (Promega, Madison, USA) való inkubálás után 490 nm¹en leolvasott abszorbanciával mértük. Az antiTNF dAb-aktivitás TNF-citotoxicitásban bekövetkezett csökkenéshez és ezért a csak TNF-fel kezelt kontrollal 25 összehasonlítva, az abszorbancia növekedéséhez vezetett. E standard L929 sejtvizsgálatban, a leírás szerinti, aTNF¹re vagy aTNF-receptorra specifikus, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid IC50-értéke 500 nM vagy alacsonyabb, elõnyösen 30 50 nM vagy alacsonyabb, 5 nM vagy alacsonyabb, 500 pM vagy alacsonyabb, 200 pM vagy alacsonyabb, 100 pM vagy alacsonyabb vagy akár 50 pM. Receptor ligandum (például, citokin) kötésének mérésére szolgáló vizsgálatok a technikában ismertek. 35 Például, anti-TNF dAb¹ok tesztelhetõk a TNF rekombináns TNF-receptor 1¹hez (p55) való kötõdését gátló képességükre nézve. Röviden, Maxisorp lemezeket inkubáltunk 30 mg/ml egéreredetû, emberi Fc¹elleni monoklonális antitesttel (Zymed, San Francisco, USA) 40 12 órán át. A lyukakat 0,05% Tween-20¹at tartalmazó, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS) mostuk majd 1% BSA-tartalmazó PBS-sel blokkoltuk a 100 ng/ml TNFreceptor 1–Fc fúziós fehérjével (R&D Systems; Minneapolis, USA) való inkubálás elõtt. A mosott lyukak45 hoz TNF-fel kevert anti-TNF dAb¹ot adtunk 10 ng/ml végkoncentrációban. A TNF kötõdését 0,2 mg/ml, TNF-elleni, biotinilált antitesttel (HyCult biotechnology, Uben, Hollandia), majd 1:500 arányban hígított, sztreptavidinnal jelzett retek-peroxidázzal (Amersham Bios50 ciences, UK) és TMB-szubsztrátummal (KPL, Gaithersburg, MD) való inkubálással mutattuk ki. A reakciót HCl hozzáadásával leállítottuk 450 nm¹en leolvastuk és az abszorbanciát. Az anti-TNF dAb gátló aktivitása a TNFkötõdésben bekövetkezett csökkenéshez és ezért a 55 csak TNF-fel kezelt kontrollal összehasonlítva, az abszorbancia csökkenéséhez vezetett. Receptor ligandum (például, citokin) kötésének mérésére szolgáló vizsgálatok a technikában ismertek. Például TNF-receptor 1 elleni dAb¹ok tesztelhetõk a 60 TNF rekombináns TNF-receptor 1¹hez (p55) való kötõ35

1

HU 004 725 T2

dését gátló képességükre nézve. Röviden, Maxisorp lemezeket inkubáltunk 30 mg/ml egéreredetû, emberi Fc¹elleni monoklonális antitesttel (Zymed, San Francisco, USA) 12 órán át. A lyukakat 0,05% Tween-20¹at tartalmazó, foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS) mostuk majd 1% BSA-tartalmazó PBS-sel blokkoltuk a 100 ng/ml TNF-receptor 1–Fc fúziós fehérjével (R&D Systems; Minneapolis, USA) való inkubálás elõtt. A TNF-receptor 1 elleni dAb¹t 30 percig inkubáltuk a lemezen, majd 3 ng/ml végkoncentrációban TNF¹et adtunk hozzá és további 60 percig inkubáltuk. A fel nem kötött fehérjék eltávolítása végett, a kimutatási lépés elõtt mostuk a lemezeket. A TNF kötõdését 0,2 mg/ml, TNF-elleni, biotinilált antitesttel (HyCult biotechnology, Uben, Hollandia), majd 1:500 arányban hígított, sztreptavidinnal jelzett retek-peroxidázzal (Amersham Biosciences, UK) és TMB-szubsztrátummal (KPL, Gaithersburg, MD) való inkubálással mutattuk ki. A reakciót HCl hozzáadásával állítottuk le és 450 nm¹en leolvastuk az abszorbanciát. Az anti-TNF dAb gátló aktivitása a TNF kötõdésében bekövetkezett csökkenéshez és ezért a csak TNF-fel kezelt kontrollal összehasonlítva, az abszorbancia csökkenéséhez vezetett. Alternatívaként, az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid p55 aTNF-receptorra kifejtett hatásának értékelésére az alábbi, HeLa-sejtekben az IL–8 szekréciójának TNF-általi indukcióján alapuló HeLa-sejt-vizsgálat alkalmazható (az eljárás HUVEC-ben az IL–8 IL–1-gyel történõ indukcióját leíró egyik közleményben [Alceson és munkatársai, Journal of Biological Chemistry 271, 30 517–30 523 (1996)] megadott eljárásból adaptáltuk; itt az emberi aTNF általi indukciót vizsgáltuk és HUVEC-sejtvonal helyett HeLa-sejtekét alkalmaztunk). Röviden, mikrotiterlemezekre kilemezelt HeLa-sejteket dAb-vel és 300 pg/ml TNF-fel inkubáltunk 12 órán át. Az inkubálás után, a sejtekrõl leszívtuk a felülúszót és az IL–8-koncentrációt szendvics ELISA-val (R&D Systems) mértük. TNFR1-elleni dAb-aktivitás az IL–8, felülúszóba való szekretálásának, csökkenéséhez vezetett a csak TNF¹es kontrollhoz képest. Alternatívaként, az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid p55 aTNF-receptorra kifejtett hatásának értékelésére az alábbi, MRC–5-sejtekben az IL–8 szekréciójának TNF-általi indukcióján alapuló MRC–5-sejtvizsgálat alkalmazható (az eljárás HUVEC-ben az IL–8 IL–1-gyel történõ indukcióját leíró egyik közleményben [Alceson és munkatársai, Journal of Biological Chemistry 271, 30 517–30 523 (1996)] megadott eljárásból adaptáltuk; itt az emberi aTNF általi indukciót vizsgáltuk és HUVEC-sejtvonal helyett MRC–5-sejteket alkalmaztunk). Röviden, mikrotiterlemezekre kilemezelt MRC–5-sejteket dAb-vel és 300 pg/ml TNF-fel inkubáltunk 12 órán át. Az inkubálás után, a sejtekrõl leszívtuk a felülúszót és az IL–8-koncentrációt szendvics ELISA-val (R&D Systems) mértük. TNFR1-elleni dAb-aktivitás az IL–8, felülúszóba való szekretálásának, csökkenéséhez vezetett a csak TNF¹es kontrollhoz képest. A szakember ismeri a többi ligandum (citokinek, növekedési faktorok stb.) vagy azok receptorai aktivitásá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 36

2

nak meghatározására hasonló funkcionális vizsgálatokat, és képes azokat alkalmazni az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek antagonista vagy agonista hatását értékelni. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGezett dAb-polipeptidek (monomerek és/vagy multimerek) a nem a PEG-ezett dAb-monomerekéhez és/vagy ¹multimerekéhez viszonyított aktivitásukat megtartják, ahol az aktivitást a fentiekben leírtak szerint mérjük; vagyis, az aktivitást a PEG-ezett dAb célmolekulával szembeni affinitásával mérjük. A találmány szerinti PEG-ezett dAb-monomer vagy multimer megtart egy bizonyos aktivitási szintet (például, egy adott célponttal szembeni affinitás), amely szint legalább 10%¹a a PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménének, elõnyösen legalább 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% és akár 90%¹a vagy annál több százaléka a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásának, ahol az aktivitást a fentiekben leírtak szerint határozzuk meg. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, a PEG-ezett dAb-monomer vagy multimer megtartja a nem PEGezett dAb-monomer vagy multimer aktivitásának legalább 90%¹át és ennél is elõnyösebben, megtartja a nem PEG-ezett dAb-monomer vagy multimer összes (100%) aktivitását. Homológ szekvenciák A találmány oltalmi körébe tartoznak antitesteredetû, variábilis egydomén-klónok és azokkal lényeges szekvenciahasonlóságot vagy ¹homológiát mutató klónok, amelyek szintén nagy affinitással kötnek célantigént és magas koncentrációnál oldékonyak (továbbá ilyen, antitesteredetû, variábilis egydomén-klónok multimerekbe beépítve). A leírás szerinti értelemben, a „lényeges” szekvenciahasonlóság vagy ¹homológia kifejezés legalább 85%¹os hasonlóságot vagy homológiát jelent. Két szekvencia közötti „homológia” vagy „szekvenciaazonosság” (a leírásban a kifejezéseket egymással felcserélhetõen alkalmazzuk) kiszámítása az alábbiak szerint történik: a szekvenciákat optimális összehasonlítási célokból egymás mellé rendezzük [optimális rendezés céljából, például, réseket (gap) illeszthetünk be az elsõ vagy második aminosav- vagy nukleinsavszekvenciába vagy mindkettõbe, és összehasonlítás céljából, a nem homológ szekvenciákat figyelmen kívül hagyhatjuk]. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, az összehasonlítási célokra rendezett referenciaszekvencia hossza a referenciaszekvencia hosszának legalább 30%¹a, elõnyösen legalább 40%¹a, elõnyösebben legalább 50%¹a, még ennél is elõnyösebben legalább 60%¹a, és még elõnyösebben legalább 70%, 80%, 90%, 100%¹a. Ezután összehasonlítjuk a megfelelõ aminosavpozíciókban vagy nukleotidpozíciókban lévõ aminosavakat vagy nukleotidokat. Amennyiben az elsõ szekvenciában egy adott pozíciót ugyanaz az aminosav vagy nukleotid foglal el mint a második szekvenciában, akkor a molekulák arra a pozícióra nézve azonosak (a leírás szerinti értelemben, az aminosav- vagy nukleinsav-„homológia”

1

HU 004 725 T2

egyenértékû az aminosav- vagy nukleinsav-„azonosság” kifejezéssel). A két szekvencia közötti százalékos azonosság a szekvenciákban lévõ azonos pozíciók számának függvénye, figyelembe véve a két szekvencia optimális összerendezése miatt bevitt a réseket, az egyes rések hosszát. A leírás szerinti értelemben, a szekvencia „hasonlóság” kifejezés arra utal, hogy a rendezett szekvenciák esetén az aminosavszekvenciák milyen mértékben tartalmaznak hasonló aminosavakat a megfelelõ pozíciókban. Aminosavak akkor hasonlítanak egymásra, ha oldalláncaik hasonlóak. A „hasonlóság” elsõsorban olyan aminosavakra vonatkozik, amelyek egymásra való cseréje konzervatív szubsztitúciónak számít. „Konzervatív” szubtitúciónak számít minden olyan szubsztitúció, amely a blosum62 substitution mátrixban pozitív pontszámú [Hentikoff és Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 915–10 919 (1992)]. A leírás szerinti értelemben, az „A szekvencia n%¹ban hasonlít a B szekvenciához” kijelentés azt jelenti, hogy az A és B szekvenciák optimális globális egyeztetése esetén a pozíciók n%¹ában azonos aminosavak vagy konzervatív szubsztitúciók vannak. Optimális egyeztetés elvégezhetõ a Needleman–Wunsch egyeztetési algoritmusban az alábbi paraméterek alkalmazásával: Polipeptidekre Szubsztitúciós mátrix: blosum62. Rés pontozási funkció (Gap scoring function): –A –B*LG, ahol A=11 [a rés büntetõpont (the gap penalty)], B=1 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty)] és LG a réshossz (the length of the gap). Nukleotidszekvenciákra: Szubsztitúciós mátrix: 10 az egyezésekre, 0 a nem egyezésekre. Rés pontozási funkció (Gap scoring function): –A –B*LG, ahol A=50 [a rés büntetõpont (the gap penalty)], B=3 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty)] és LG a réshossz (the length of the gap). Jellemzõ konzervatív szubsztitúciók a Met, Val, Leu és Ile; a Ser és Thr; az Asp, Glu és Asn; a Gln, Lys és Arg; vagy az aromás Phe és Tyr aminosavak közötti szubsztitúciók. Az összehasonlítani kívánt két molekula teljes hosszát tekintve, a két polipeptidszekvencia közötti hasonlóság (leggyakrabban százalékos arányban) megadott mértékének kiszámításában figyelembe szokták venni azon pozíciók számát, amelyeknél a két polipeptidszekvenciában lévõ megfelelõ aminosavak között azonosságot vagy hasonlóságot figyeltek meg. Esetleg, szekvencia-összerendezésre a BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algoritmust alkalmazzák alapértékekre beálított pareméterekkel. A BLAST algoritmus „BLAST 2 Sequences” elérhetõ az alábbi módon képezett világháló címen: Világháló: („www”); National Center for Biotechnology Information: („.ncbi”), National Library of Medicine: („.nlm”), National Institutes of Health: („nih”), az U.S.A kormánya: („.gov”), a „/blast/” könyvtárban, alkönyvtárak: „b12seq/b12.html.” Ez az algoritmus összehasonlítás céljából két szekvenciát rendez össze [Tatusova és Madden, FEMS Microbiol Lett. 174, 247–250 (1999)].

2

A homológia vagy hasonlóság egy további mértéke az, ha a kérdéses szekvenciák képesek magasan sztringens hibridizációs körülmények közötti hibridizálni. Eszerint, egy adott, immunglobulin-eredetû, variábi5 lis-egydoménes polipeptidet kódoló elsõ szekvencia lényegében hasonló egy másik kódolószekvenciához, ha magasan sztringens hibridizációs körülmények között (mint például, az, ami a Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor La10 boratory Press, New York, könyvben meg van adva) az elsõ szekvencia hibridizál a második szekvenciához (vagy annak komplementeréhez). A leírás szerinti értelemben, a „magasan sztringens hibridizációs körülmények” kifejezés 6X SSC-ben, körülbelül 45 °C¹on törté15 nõ hibridizációt, majd 0,2X SSC, 0,1% SDS oldatban 65 °C¹on végzett egy vagy több mosást jelent. Az „igen magasan sztringens hibridizációs körülmények” kifejezés 7% SDS¹t tartalmazó 0,5 M¹os nátrium-foszfátban történõ hibridizációt, majd 0,2X SSC, 0,1% SDS oldat20 ban 65 °C¹on végzett egy vagy több mosást jelent.

25

30

35

40

45

50

55

60 37

dAB¹ok PEG-ezése A találmány tárgyát, a nem PEG-ezett dAb-kéhez képest megnövelt féléletidõt és a lebontás ellen, az aktivitás (például kötõeffinitás) elvesztés nélküli rezisztenciát biztosító PEG-ezett dAb-monomerek és ¹multimerek képezik. A találmány szerinti dAb-molekulák, a technikában ismert eljárások alkalmazásával – kapcsolhatók a találmány szerinti megnövelt féléletidõ és degradáció elleni rezisztencia elérésére alkalmas polimermolekulákkal (PEG). A találmányban alkalmazható PEG-polimermolekulák lehetnek szintetikus vagy természetes körülmények között elõforduló molekulák, és egyenes vagy elágazó láncú polimerek. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható különösen elõnyös polimerek közé tartoznak szubsztituált PEG¹ek, így metoxi-(polietilénglikol). A találmány szerinti megoldásban alkalmazandó polimermolekulák derivatizált formái közé tartoznak például olyan származékok, amelyek a találmány szerinti dAb-polipeptidek aminosavaival való kölcsönhatást lehetõvé tevõ további csoportokat vagy reaktív csoportokat tartalmaznak. Ilyen származékok közé tartoznak N¹hidroxil-szukcinimid-eredetû (NHS) aktív észterek, szukcinimidil-propionát polimerek, és szulfhidrilre szelektív ágensek, például maleimid, vinil-szulfon, és tiol. Különösen elõnyös derivatizált polimerek közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – az alábbi képletû PEG-polimerek: PEG–O–CH2CH2CH2–CO2–NHS; PEG–O–CH 2 –NHS; PEG–O–CH 2 CH 2 –CO 2 –NHS; PEG–S–CH 2 CH 2 –CO–NHS; PEG–O 2 CNH–CH (R)–CO2–NHS; PEG–NHCO–CH2CH2–CO–NHS; és PEG–O–CH 2 –CO 2 –NHS; ahol R jelentése ((CH2)4)NHCO2(mPEG). A találmány szerinti megoldásban alkalmazható PEG-molekulák lehetnek olyan lineáris molekulák vagy lehetnek elágazók, ahol egyetlen polimerben több PEG-csoport van jelen. A találmány szerinti megoldásban különösen elõnyös PEGszármazékok közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – az alábbiak:

1

HU 004 725 T2

mPEG-MAL

2

mPEG2-MAL

mPEG-(MAL)2

multi-arm PRG

mPEG2-(MAL)2

mPEG-MAL

mPEG2-MAL mPEG2-NHS

mPEG-SPA

A PEG-polimerhez a reaktív csoport (például, MAL, NHS, SPA, VS, vagy Tiol) csatlakoztatható közvetlenül vagy linkermolekulán át.

A találmány szerinti megoldásra alkalmas polimerek mérete a kDa és 60 kDa, 20 kDa és 60 kDa, 30 kDa 60 és 60 kDa, 40 kDa és 60 kDa, and akár 50 kDa és 38

1

HU 004 725 T2

60 kDa közötti tartományba eshet. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott polimerek, különösen a PEG, lehet egyenes láncú polimer vagy lehet elágazó konformációja. A molekulatömeg és konformáció függvényében, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható polimermolekulák – dAb-monomerhez vagy ¹multimerhez való kapcsolás esetén – olyan molekulát eredményeznek, amelynek átlagos hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa. A leírás szerinti értelemben, egy adott polimermolekula hidrodinamikai mérete a kérdéses molekula (például fehérjemolekula) vizes oldaton át történõ diffúzióján alapuló, nyilvánvaló méretét jelenti. A fehérje oldaton át történõ diffúziója vagy mozgása felhasználható a fehérje nyilvánvaló méretének származtatására, ahol a méretet a fehérjepartikulum Stokes rádiuszaként vagy hidrodinamikai rádiuszaként adjuk meg. A fehérje „hidrodinamikai mérete” függ a tömegtõl és az alaktól (konformáció), oly módon, hogy két, ugyanazon molekulatömegû fehérjének eltérhet a fehérjék általános konformációján alapuló hidrodinamikai mérete. A PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén (ideértve a leírás szerinti, antitesteredetû, variábilis-doménes multimereket) hidrodinamikai mérete a 200–500 kDa; 250–500 kDa; 300–500 kDa; 350–500 kDa; 400–500 kDa és 450–500 kDa tartományba eshet. A találmány szerinti, PEG-ezett dAb hidrodinamikai mérete elõnyösen 200–300 kDa. A találmány szerinti, PEG-gel kapcsolt dAb-monomerek és ¹multimerek hidrodinamikai mérete a technikában ismert eljárások alkalmazásával meghatározható. Például gélszûrés alkalmazható a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt dAb-monomerek és ¹multimerek hidrodinamikai méretének meghatározására, ahol a gélen a dAb-sáv méretét molekulatömeg-standardokkal hasonlítjuk össze. A hidrodinamikai méret meghatározására szolgáló egyéb eljárások közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – az SDS-PAGE méretkizárásos kromatográfiás oszlopok, például Superose 12HR (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) alkalmazása. A találmány szerinti, PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt dAb-monomerek vagy ¹multimerek hidrodinamikai méretének meghatározására szolgáló más eljárásokat a szakember ismeri. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti, PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek hidrodinamikai méretét gélszûrõ mátrixok alkalmazásával határozhatjuk meg. A különféle, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek hidrodinamikai méretének meghatározására alkalmazott gélszûrõ mátrixok alapulhatnak magasan keresztkötött agarózon. Például a globuláris fehérjékre alkalmazott két oszlop frakcionálási tartománya lehet: Superose 12 HR 1000–3×105 Mr és Superose 6 HR 5000–5×106 Mr. Globuláris fehérjére a méretkizárási határok az alábbiak: ~2×06 a Superose 12 HR¹re és ~4×107 a Superose 6HR¹re. A találmány szerinti dAB-hez vagy dAb-multimerhez kapcsolt polimermolekula mérete így a kívánt alkalmazástól függõen változtatható. Például ahol a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 39

2

PEG-ezett dAb¹t arra szánták, hogy a keringést elhagyja és belépjen a periferiális szövetekbe, kívánatos a kapcsolt polimer méretének alacsonyan tartása a véráramból való kiszivárgás elõsegítése céljából. Esetleg, ahol arra van szükség, hogy a PEG-ezett dAb hosszabb ideig bennmaradjon a keringésben, magasabb (például, 30–60 kDa) molekulatömegû polimert lehet alkalmazni. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható polimer (PEG) molekulák a technikában jól ismert eljárások alkalmazásával kapcsolhatók dAb-polipeptidekhez (és ¹polipeptid-multimerekhez). A PEG-nek vagy más polimercsoportnak a találmány szerinti dAb-monomerhez vagy ¹multimerhez való csatlakoztatásában az elsõ lépés a PEG-polimer hidroxil-végcsoportjainak szubsztitúciója elektrofilt tartalmazó funkcionális csoportokkal. PEG-polimerek különösen a találmány szerinti dAbmonomerekben vagy ¹multimerekben lévõ ciszteinvagy lizincsoportokhoz kapcsolhatók. A cisztein- vagy lizincsoportok lehetnek természetes körülmények között elõfordulók, vagy génsebészeti úton be lehet ilyeneket vinni a dAb-molekulába. Például ciszteincsoportokat rekombináns eljárásokkal be lehet vinni a dAbpolipeptidek C¹terminálisához, vagy a dAb, oldószerekkel elérhetõ, specifikus helyein lévõ aminosavakat ciszteinnel vagy lizinnel lehet szubsztituálni. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, PEG-csoportot kapcsolunk a találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid N¹terminálisán természetes körülmények között elõforduló, vagy oda génsebészettel bevitt cisztein vagy lizin aminosavhoz. A találmány egy további megvalósítási módjában, PEG-csoportot kapcsolunk a találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid C¹terminálisától és/vagy N¹terminálisától (például „befelé”) legalább 2 hely távolságra lévõ (természetes körülmények között elõforduló, vagy oda génsebészettel bevitt) cisztein vagy lizin aminosavhoz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGpolimer(eke)t valamelyik vázrégióban (FW¹k) és antitesteredetû, variábilis egydomén egy vagy több heterológ CDR-jében lévõ egy vagy több cisztein vagy lizin aminosavhoz kapcsoljuk. A CDR¹ek és vázrégiók egy adott immunglobulin-eredetû, variábilis domén azon régiói, amelyek a Kabat „Sequences of Proteins of Immunological Interest” elnevezésû adatbázisában [Kabat és munkatársai, Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991)] ekként vannak meghatározva. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, PEG-polimer kapcsolódik a VH, DP47¹es vázszegmensében, vagy a Vk, DPK9¹es vázszegmensében lévõ ciszteinhez vagy lizinhez. A találmány szerint, a DP47, PEGgel kapcsolható cisztein és/vagy lizin aminosavai közé tartozik a szekvencialistában 2. azonosító számon megadott szekvenciában a 22. vagy 96. számú pozícióban lévõ cisztein, és a 43., 65., 76., vagy 98. pozícióban lévõ lizin (13. ábra). A találmány szerint, a DPK9, PEG-gel kapcsolható cisztein és/vagy lizin aminosavai közé tartozik a szekvencialistában 4. azonosí-

1

HU 004 725 T2

tó számon megadott szekvenciában a 23. és 88. számú pozícióban lévõ cisztein, és a 39., 42., 45., 103. vagy 107. pozícióban lévõ lizin (13. ábra). Továbbá, a VH, DP38 vagy DP45 kanonikus vázrégióiban levõ specifikus cisztein vagy lizin aminosavak is kapcsolhatók PEG-hez. Ezenfelül, a dAb-molekulában specifikus, oldószer által elérhetõ helyek, ahol természetes körülmények között nem fordul elõ cisztein vagy lizin, PEG-polimer kapcsolása céljából ciszteinre vagy lizinre mutáltathatók. Bármely adott dAB-monomer vagy ¹multimer, oldószer által elérhetõ aminosavai meghatározhatók a technikában ismert eljárások alkalmazásával, így például egy adott dAb kristályszerkezetének analízisével. Például, a VH dAb HEL4 (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia) megoldott kristályszerkezetének alkalmazásával, a Gln¹13, Pro¹14, Gly¹15, Pro¹41, Gly¹42, Lys¹43, Asp¹62, Lys¹65, Arg¹87, Ala¹88, Glu¹89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119, és Ser-120 aminosavakat oldószer által elérhetõnek azonosították, és a találmány szerint, vonzó jelöltek lennének a PEG-polimer kapcsolására szolgáló cisztein vagy lizin aminosavakra történõ mutációhoz. Például a Vk mesterséges dAb (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia) megoldott kristályszerkezetének alkalmazásával, a Val¹15, Pro¹40, Gly¹41, Ser¹56, Gly¹57, Ser¹60, Pro¹80, Glu¹81, Gln-100, Lys-107, és Arg-108 aminosavakat oldószer által elérhetõnek azonosították, és a találmány szerint, vonzó jelöltek lennének a PEG-polimer kapcsolására szolgáló cisztein vagy lizin aminosavakra történõ mutációhoz. Elõnyös, ha PEG-csoportot olyan cisztein vagy lizin aminosavhoz kapcsolunk, amelyet a Gln13, Pro41 vagy Leu115 pozíciók egyikébe vagy többe, illetve a találmány szerinti más, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidekben lévõ, oldószer számára hasonlóan elérhetõ helyekbe szubsztituáltunk. A találmány egyik megvalósítási módjában, PEG-polimert kapcsolunk több, oldószer által elérhetõ ciszteinhez vagy lizinhez, vagy olyan, oldószer által elérhetõ aminosavakhoz, amelyeket mutációval ciszteinre vagy lizinre változtattunk. Esetleg, csak egyetlen, oldószer által elérhetõ aminosavhoz kapcsolunk PEG¹et, akár azért, mert az adott dAb csak egyetlen, oldószer által elérhetõ ciszteint vagy lizint (vagy ciszteinre vagy lizinre módosított aminosavat) tartalmaz vagy azért, mert a PEG-ezésre a számos ilyen aminosav közül egy adott, oldószer által elérhetõ aminosavat választunk ki. A HEL4 primer aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 3. azonosító számon megadott szekvencia). 1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS 51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL 101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS A mesterséges Vk primer aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 4. azonosító számon megadott szekvencia).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 40

2

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA 51 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ 101 GTKVEIKR Számtalan olyan kapcsolási tervet biztosít a Nektar (San Carlos, CA) társaság, amelyek a találmányban alkalmazhatók. Például olyan esetekben, amikor PEG vagy más polimerek lizinhez való kapcsolására van szükség, PEG-polimerek N¹hidroxil-szukcinimiddel, mint például szukcinimidil-propionáttal, derivatizált aktív észterei alkalmazhatók. Ciszteinhez való kapcsoláskor, szulfhidrilre szelektív reagensekkel, például maleimiddel, vinil-szulfonnal vagy tiolokkal, derivatizált PEG-polimerek alkalmazhatók. A találmány szerinti megoldásban, PEG-ezett dAb¹ok kialakítására alkalmazható PEG-származékokra további példákat a Nektar cég katalógusában (elérhetõ a www.nektar.com honlapon) találhatunk. Ezenfelül, a találmány szerinti megoldásban számos derivatizált PEG alkalmazható a PEG-polimernek a találmány szerinti dAb-monomerhez vagy multimerhez való kapcsolásának elõsegítésére. A találmányban alkalmazható PEG-származékok, minden korlátozás nélkül, az alábbiak: PEG-sukcinimidil sukcinát, uretánnal kapcsolt PEG, PEG-fenil-karbonát, PEGsukcinimidil-karbonát, PEG-karboxi-metil-azid, dimetilmaleinsavanhidrid PEG, PEG ditiocarbonát származékok, PEG-trezilátok (2,2,2-trifluoro-etánszulfonátok), mPEG imido-észterek, és más, Zalipsky és Lee által leírt származékok [Zalipsky és Lee, „Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides”, Poly (Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, szerk.: J. Milton Harris, kiad.: Plenum Press, NY(1992)]. A 6–11. ábrák számos megvalósítást mutatnak be a találmány szerinti PEG-ezett dAb¹re és dAb-multimerre. Minden ábrán „X”-szel jelöltük a dAb, kémiailag aktivált PEG-gel – például, PEG-NHS-sel, SPA-val, MAL-lal, VS¹sel, tiollal stb. – k kémiailag módosított aminosavait. A módosított aminosav lehet bármilyen aminosav – de elõnyösen cisztein vagy lizin, és elõnyösebben, oldószer által elérhetõ aminosav – a dAb-ben. Az ábrákon feltüntetett „PEG” lineáris, elágazó, villás, és/vagy többkarú PEG¹et jelent. „S”-sel jeleztük a cisztein aminosavat. A 7. ábra különbözõ dimerizált dAb-formátumokat mutat be, ahol a dimerek a dAb-szerkezeten belüli, vagy a dAb C¹terminálisán lévõ cisztein aminosavak közötti diszulfidkötések révén alakultak ki. A találmány egyik megvalósítási módjában, a C¹terminális cisztein aminosav a csuklórégióban található. A dAb-dimerek, az egyik vagy mindkét dAb-monomeren lévõ belsõ helyeken (lásd, 7–5. ábra) PEG-ezhetõk. Esetleg, a dAbdimerek kialakíthatók az egyes dAb-monomerek C¹terminális ciszteinjéhez (7–7. ábra), vagy mindkét monomeren belül található aminosavakhoz (7–11. ábra) kapcsolt elágazó, villás vagy többkarú PEG-polimer csatlakoztatásával. A 8. ábra a dAb-homo- és heterodimerek kialakításának különbözõ megvalósítási módjait mutatja be,

1

HU 004 725 T2

amelyekben a dAb-monomerek linkerpeptid – például, (Gly4Ser)n linker, ahol n=1 és körülbelül 10 közötti – révén vannak dimerré kapcsolva. Miután a dAb-monomerek dimerré lettek összekapcsolva, a dimerekhez, a cisztein vagy lizin aminosavaknál, derivatizált PEG-polimer(ek) csatlakoztatható(k) véletlenszerûen, vagy a derivatizált PEG-polimer(ek) – a PEG, leírásban említett kapcsolócsoportjai (például, MAL, NHS, SPA, VS, vagy Tiol) bármelyikének alkalmazásával – specifikusan irányíthatók az egyik vagy mindkét dAb-monomer C¹terminálisán lévõ vagy a molekulán belüli cisztein aminosavra. Esetleg, a PEG-polimer hozzákapcsolható a dAb-monomerek összekapcsolására alkalmazott linkerpeptidben jelen lévõ reaktív tiolcsoportokhoz (8–15. ábra). Továbbá, ahogyan a 8–17. ábrán látszik, linkerpeptidek alkalmazásával kialakított két vagy több dAb-dimer C¹terminális diszulfidhidak révén összekapcsolható. A 9. ábra specifikusan mutatja be a PEG, belsõ helyeken, a linkerpeptidben, vagy a dAb-monomerek egyikének vagy mindkettõnek C¹terminálisán lévõ cisztein aminosavakhoz való csatlakoztatásának különféle megvalósítási módjait. Ahogyan az a 10. ábrán látható, homo- vagy heterotrimer dAb¹k képezhetõk három dAb-monomer, egy sorozat linkerpeptid (például, Gly Ser linker; 10–25., 26., vagy 27. ábra) révén, vagy többkaros PEG-polimer alkalmazásával (10–23., 24. ábra) oly módon történõ összekapcsolásával, hogy a többkaros polimer egyes PEG-polimerjei az egyez dAb-monomerek C¹terminálisához van kapcsolva (a cisztein, lizin, vagy más, oldószer által elérhetõ aminosavak révén). Ahol a dAb-monomerek linkerpeptiddel vannak egymáshoz kapcsolva, a PEG-polimer a trimer dAb C¹terminális ciszteinjéhez csatlakoztatható, vagy ahogyan a fentiekben leírtuk, MAL, NETS, SPA, VS, vagy Tiol csoportokon keresztül csatlakoztatható a dAb-monomerek egyikében, kettõben vagy mind a háromban jelen lévõ, oldószer által elérhetõ bármely más aminosavhoz. A 10–27. ábra bemutatja a találmány egyik, kettõs specificitású dAbtrimert tartalmazó megvalósítási módját. Ebben a megvalósítási módban, a dAb-monomerek egyikének vagy többnek (de nem az összesnek) a maradék dAb-monomertõl eltérõ antigénre van kötési specificitása. E kettõs specificitású megvalósítási módban a dAb-monomerek linkerpeptiden át csatlakoztathatók (lásd 10–27. ábra), vagy esetleg egy elágazó vagy több karos PEG révén, ahol a trimer minden monomerje PEGcsoporthoz kapcsolódik. Ahol a 10–27. ábrán bemutatott, kettõs specificitású trimer monomerjei linkerpeptiddel vannak összekapcsolva, a trimerhez, a fentiekben leírt mechanizmusok bármelyikével csatlakoztatható egy vagy több PEG-polimer. Vagyis, PEG csatlakoztatható a dAb-monomerek egyikében vagy többen, vagy a dAb-monomerek egyikének vagy többnek C¹terminálisán jelen lévõ, illetve, a trimert alkotó dAb-monomerek egyikébe vagy többe génsebészeti úton bevitt ciszteinhez vagy lizinhez. A fentiekben leírt és a 6–11. ábrán bemutatott monomer, dimer vagy trimer dAb-kben, PEG-polimer kapcsolható egy már meglévõ ciszteinhez vagy lizinhez, vagy csatlakoztatható a dAb-mono-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 41

2

merek egyikébe vagy többe génsebészeti úton bevitt ciszteinhez vagy lizinhez. A 11. ábra hetero- vagy homotetramer dAb¹k PEGezésének különbözõ megvalósítási módjait mutatja be. dAb-monomerek egy vagy több linkerpeptiddel csatlakoztathatók egymáshoz (11–29. ábra), vagy esetleg, többkaros vagy elágazó PEG-polimer alkalmazásával tetramerré kapcsolhatók össze (11–28., 30. ábra). Esetleg két vagy több – két monomer, linkerpeptiden át történt összekapcsolásával – elõállított dimer, elágazó vagy többkaros PEG-polimerrel tetramerré kapcsolható össze (11–29., 31. ábra), ahol a PEG-polimer a dAbmonomerben, a dAb-monemer C¹terminálisán lévõ lizinhez vagy ciszteinhez van csatlakoztatva. Ahogy azt a fentiekben a dAb-monomerekre, ¹dimerekre és trimerekre leírtuk, a találmány szerinti dAb-tetramer vázának bármely kívánt pozíciójához egy vagy több PEGpolimer csatlakoztatható. Például PEG-polimer csatlakoztatható C¹terminális ciszteinhez, vagy más aminosavhoz, illetve csatlakoztatható a tetramert alkotó dAbmonomerekben jelen lévõ vagy azokba génsebészeti úton bevitt bármely ciszteinhez vagy lizinhez. A 12. ábra példákat mutat be a találmány szerint elõállítható, magasabb rendû PEG-gel kapcsolt dAbmultimerekre. Például linkerpeptiddel kapcsolt (lásd 12–31. ábra) vagy esetleg, az egyes diemerek monomerjei között diszulfidkötésekkel összekapcsolt dAb-dimerek sokaságát dimerekbõl képzett tetramerré kapcsoljuk össze töbkaros PEG-polimer segítségével, ahol a többkaros PEG-polimer minden PEG¹e az egyes dimerpárok monomerjeinek egyikében jelen lévõ C¹terminális cisztein aminosavhoz van kapcsolva. Nagyméretû, PEG-gel kapcsolt dAb-multimerek, például oktamerek, dekamerek stb. kialakítása céljából a dimer, trimer és tetramer kialakításának módja (például linker peptidekkel vagy diszulfidkötésekkel), és a PEG csatlakoztatásának fentiekben leírt helye és módjai a találmány szerint változtathatók. Például a 12. ábrán bemutatott, nagyméretû, PEG-gel kapcsolt dAb-multimerek elõállítására irányuló stratégiához hasonlóan, dAb-trimerek vagy ¹tetramerek kapcsolhatók önmagukban egymáshoz – például, többkaros PEG-gel, linkerpeptiddel, vagy diszulfidkötéssel nagyméretû, PEG-gel kapcsolt dAb-multimer generálása céljából. Ahol dAb-dimerek, ¹trimerek, ¹tetramerek sokaságát linkerpeptidekkel, vagy diszulfidkötésekkel kapcsoljuk össze (például a 12. ábrán bemutatott, többkaros PEG alkalmazása helyett), az eredményül kapott multimerhez PEGpolimerek kapcsolhatók az itt leírtak bármelyike szerinti módon. Például a PEG-polimer a multimert alkotó dAbmonomerek egyikének vagy többnek a felszínén lévõ ciszteinhez vagy lizinhez kapcsolható, a PEG-polimer kapcsolható a multimert alkotó dAb-monomerek egyikének vagy többnek C¹terminálisán lévõ ciszteinhez. A fenti megvalósítási módok mindegyikében, a PEG-polimer csatlakoztatható a dAb-peptidek vázában jelen lévõ bármelyik elérhetõ aminosavhoz, vagy elõnyösen, a dAb egy vagy több aminosava módosítható vagy mutáltatható ciszteinre vagy lizinre, amelyeket majd a PEG-polimer kapcsolására csatlakoztatási

1

HU 004 725 T2

pontként alkalmazhatunk. Elõnyös, ha az így módosítandó aminosav, oldószer által elérhetõ aminosav, vagyis, olyan aminosav, amely a természetes módon feltekeredett konfigurációjú dAb-ban egy adott vizes környezet és derivatizált PEG-polimer számára elérhetõ. Miután, ezen aminosavak közül egyet vagy többet mutációval a találmány szerinti cisztein aminosavra alakítottunk, e cisztein, lineáris vagy elágazó, MAL-lal derivatizált PEG (MAL-PEG) alkalmazásával történõ PEG-kapcsolásra elérhetõ. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát az 1. igénypont szerinti, PEG-polimerhez kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén formájában lévõ polipeptid képezi, ahol a PEG-polimer és az antitesteredetû, variábilis egydomén aránya legalább 0,25:1 moláris arány. A találmány további megvalósítási módjában, a PEG-polimer és az antitesteredetû, variábilis egydomén moláris aránya 0,33:1 vagy nagyobb. A találmány még további megvalósítási módjában, a PEG-polimer és az antitesteredetû, variábilis egydomén moláris aránya 0,5:1 vagy nagyobb. Megnövekedett féléletidõ A találmány szerinti PEG-ezett dAb-monomerek és ¹multimerek sajátságos elõnyt biztosítanak a technikában ismertetett dAb-molekulákkal szemben: a találmány szerinti PEG-ezett dAb-molekulák féléletideje lényegesen hosszabb. Anélkül, hogy bármilyen konkrét elmélethez kötõdnék úgy gondoljuk, hogy a találmány szerinti dAb-molekulák megnövekedett féléletideje a dAb-molekulák, PEG-polimer(ek) kapcsolásának eredményeként megnövekedett hidrodinamikai méretének köszönhetõ. Konkrétabban, úgy gondoljuk, hogy a PEG-ezett dAb¹k és ¹dAb-multimerek szérum-féléletidejének meghatározásában két tényezõnek van fontos szerepe. Az elsõ kritérium a csatlakoztatott PEG természete és mérete, azaz, ha a polimer lánca csak egyszerû lineáris lánc vagy elágazó/villás lánc, az elágazó/villás lánc hosszabb féléletidõt biztosít. A második, a dAb elhelyezkedése a végsõ formátumon, és hogy a molekulának hány „szabad” módosítatlan PEGkarja van. A kapott PEG-ezett dAb, például, méretkizárásos kromatográfiával becsült hidrodinamikai mérete és a molekula féléletideje között összefüggés van. Eszerint, minél nagyobb a PEG-ezett molekula hidrodinamikai mérete, annál nagyobb a szérum-féléletideje. A megnövekedett féléletidõ az immunglobulinok, elõnyösen antitestek, és legelõnyösebben a kisméretû antitestfragmentumok, in vivo alkalmazása szempontjából hasznos. Az ilyen fragmentumok (Fv¹k, Fab¹ok, scFv¹k, dAb¹ok) gyorsan kiürülnek a testbõl; így, bár gyorsan el tudnak jutni a test legtöbb részébe, és ezeket gyorsan elõ lehet állítani és könnyebb kezelni, rövid in vivo megmaradásuk korlátozza in vivo alkalmazásukat. A találmány egyik szempontjában, a leírás szerinti, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet, a dAb-polipeptid hidrodinamikai méretét növelõ csoporttal, például PEG-gel, stabilizáljuk in vivo. Farmakokinetikai analízisére és a dAb féléletidejének meghatározá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 42

2

sára szolgáló eljárásokat a szakember ismeri. Részletek a Kenneth és munkatársai publikációjában [Kenneth és munkatársai, Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, és Peters és munkatársai, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)] találhatók. Hivatkozunk a különféle farmakokinetikai paramétereket, például a ta1/2 és tb1/2 féléletidõket, illetve a görbe alatti területet (AUC) leíró publikációra is [Gibaldi és Perron, „Pharmacokinetics”, kiad.: by Marcel Dekker, 2. átdolgozott kiadás (1982)]. Jellemzõ, hogy a találmány szerinti PEG-ezett dAbmonomer vagy ¹multimer féléletidejét a nem PEG-ezett dAb-jéhez képest 10%, 20%, 30%, 40%, 50%-kal vagy annál nagyobb mértékben megnöveltük (ahol, a PEGezett dAb-ben lévõ dAb megegyezik a nem PEG-ezett dAb-ben lévõvel). A féléletidõ növekedése a 2×, 3×, 4×, 5×, 7×, 10×, 20×, 30×, 40×, vagy akár 50× tartományba esik sõt még annál nagyobb mértékû is lehet. Esetleg, vagy ráadásul, a féléletidõt illetõen akár 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 100×, 150× növekedés is lehetséges. Féléletidõk (ta1/2 és tb1/2) és AUC meghatározható a ligandum szérumkoncentrációjának az idõ függvényében való ábrázolásakor kapott görbe alapján. A WinNonlin analíziscsomag (beszerezhetõ a Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USA, cégtõl) alkalmazható, például, a görbe modellezésére. Az elsõ fázisban (az alfa-fázisban) a ligandum, bizonyos mértékû elimináció mellett, fõként a betegben oszlik el. A második fázis (béta-fázis) a terminális fázis, amikor a ligandum már eloszlott és a szérumkoncentrácíó csökken, ahogyan a ligandum kiürül a betegbõl. A ta1/2, az elsõ fázis féléletideje, a tb1/2 pedig a második fázis féléletideje. A leírás szerinti értelemben, a „féléletidõ” kifejezés, hacsak másként nincs jelezve, a találmány szerinti antitesteredetû, variábilis egydomén, nem kompartmentumos modellezéssel (szemben, például, a bifázisos modellezéssel) meghatározott általános féléletidejét jelenti. A béta-féléletidõ az az idõtartam, ami egy adott mennyiségû dAb-monomer vagy ¹multimer, az azzal kezelt emlõsbõl való kiürüléséig eltelik. Eszerint, elõnyösen, a találmány tárgyát olyan dAb-készítmény – például dAb-effektor csoportot tartalmazó készítmény – képezi, amelynek féléletideje 0,25 óra és 6, vagy annál több óra közötti tartományba esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány alsó határa 30 perc, 45 perc, 1 óra, 1,3 óra, 2 óra, 3 óra, 4 óra, 5 óra, 6 óra, 7 óra, 10 óra, 11 óra or 12 óra. Ezenfelül vagy esetleg, egy adott dAb-tartalmú készítmény ta féléletideje akár 12 óra is lehet. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány felsõ határa 11, 10, 9, 8, 7, 6, vagy 5 óra. Alkalmas tartomány, például az 1‚3–6 óra, 2–5 óra, vagy 3¹4 óra. Elõnyösen, a találmány tárgyát a találmány szerinti ligandumot tartalmazó dAb-tartalmú készítmény képezi, amelynek tb féléletideje az 1 és 170, vagy annál több óra tartományba esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány alsó határa 2,5 óra, 3 óra, 4 óra, 5 óra, 6 óra, 7 óra, 8 óra, 9 óra, 10 óra, 11 óra, vagy 12 óra. Ezenfelül vagy esetleg, egy adott dAb-tar-

1

HU 004 725 T2

talmú készítmény, például tb féléletideje akár 21 nap is lehet. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány felsõ határa 12 óra, 24 óra, 2 days, 3 nap, 5 nap, 10 nap, 15 nap, vagy 20 nap. Elõnyös, ha a találmány szerinti dAb-tartalmú készítmény tb féléletideje a 2–100 óra, 4–80 óra, és 10–40 óra tartományba esik. A találmány egy további megvalósítási módjában, a tb féléletidõ a 12–48 óra közötti tartományba esik. A találmány egy további megvalósítási módjában, a tb féléletidõ a 12–26 óra közötti tartományba esik. A találmány tárgyát a találmány szerinti ligandumot tartalmazó dAbtartalmú készítmény képezi, amelynek féléletideje az 1 és 170, vagy annál több óra tartomnyba esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány alsó határa 1,3 óra, 2,5 óra, 3 óra, 4 óra, 5 óra, 6 óra, 7 óra, 8 óra, 9 óra, 10 óra, 11 óra, vagy 12 óra. Ezenfelül vagy esetleg, egy adott dAb-tartalmú készítmény, például tb féléletideje akár 21 nap is lehet. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány felsõ határa 12 óra, 24 óra, 2 days, 3 nap, 5 nap, 10 nap, 15 nap, vagy 20 nap. A fenti kritériumok mellett vagy esetleg, a találmány tárgyát az 1. igénypont szerint ligandumot tartalmazó, dAb-tartalmú készítmény képezi, amelynek AUC-értéke (görbe alatti terület) az 1 mg*min/ml vagy több tartományba esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány alsó határa 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 vagy 300 mg*min/ml. Továbbá, vagy esetleg, a találmány szerinti ligandum vagy készítmény AUC-értéke a 600 mg*min/ml¹ig terjedõ tartományba esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a tartomány felsõ határa 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 vagy 50 mg*min/ml. Elõnyös, ha a találmány szerinti ligandum AUC-értékének tartománya az alábbiakat tartalmazó tartományba esik: 15–150 mg*min/ml, 15–100 mg*min/ml, 15–75 mg*min/ml, és 15–50 mg*min/ml. Proteázok elleni fokozott stabilitás A találmány szerinti megoldás egy további elõnye az, hogy a leírás szerinti PEG-ezett dAb¹ok és dAbmultimerek fokozott stabilitást mutatnak a proteázok hatásával szemben. A vizsgálat körülményeitõl függõen, a dAb¹ok a proteázok hatásával szemben valójában stabilak. Azonban, pepszin jelenlétében sok dAb pH=2-nél teljes mértékben lebomlik, mivel savas körülmények között a fehérje letekeredik, ezáltal a fehérje jobban elérhetõ a proteázenzim számára. A találmány tárgyát PEG-ezett dAb-molekulák, így dAb-multimerek, képezik, amelyekrõl azt gondoljuk, hogy a polipeptid PEG-általi fizikai letakarásával a PEG-polimer védelmet nyújt a polipeptid vázának, így akadályozva meg, hogy a proteáz hozzáférjen a polipeptid vázához és azt hasítsa. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, nagyobb (például 200–500 kDa) hidrodinamikai méretû PEG-ezett dAB¹t állítunk elõ a találmány szerint, mivel a nagyobb hidrodinamikai méret nagyobb szintû védelmet nyújt a proteázok általi lebontás ellen, mint ami kisebb hidrodinamikai méretû PEG-ezett dAb esetében fennáll. A találmány egyik megvalósítási

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 43

2

módjában, PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes monomer vagy multimer 10%-nál alacsonyabb mértékben bomlik le, ha pepszin, tripszin, elasztáz, kimotripszin, és karboxipeptidáz enzimek közül eggyel vagy többel érintkeztetjük ahol, amennyiben a proteáz pepszin, akkor az érintekeztetést, pH=2,0-nál 30 percig végezzük, és ahol, amennyiben a proteáz tripszin, elasztáz, kimotripszin, vagy karboxipeptidáz, az érintkeztetést pH=8,0-nál 30 percig végezzük. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt dAb-monomer vagy multimer pepszinnel való érintkeztetés esetén (pH=2,0, 30 perc), 10%-nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen 5%¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A találmány egy további megvalósítási módjában, a találmány szerinti, PEG-hez vagy más polimerhez kötött dAb-multimer (például, hetero- vagy homodimer, trimer, tetramer stb.), pepszinnel való érintkeztetés esetén (pH=2,0, 30 perc) 5%¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt dAb-monomer vagy multimer, tripszin, elasztáz, kimotripszin, és karboxipeptidáz enzimmel való érintkeztetés esetén (pH=8,0, 30 perc), elõnyösen 5%¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában, a találmány szerinti, PEG-hez vagy más polimerhez kötött dAb-multimer (például, hetero- vagy homodimer, trimer, tetramer stb.), tripszin, elasztáz, kimotripszin, és karboxipeptidáz enzimmel való érintkeztetés esetén (pH=8,0, 30 perc) 5%¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A proteáz: antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid relatív arány a találmány szerint megváltoztatható a fentiekben leírt, kívánt mértékû lebontási szint elérése céljából. Például, a proteáz: antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid relatív arány az alábbi lehet: körülbelül 1:30-tól körülbelül 1:40¹ig, körülbelül 20:50¹ig, körülbelül 30:50¹ig, körülbelül 40:50, körülbelül 50:50, körülbelül 50:40, körülbelül 50:30, körülbelül 50:20, körülbelül 50:10, körülbelül 40:1, és körülbelül 30:1. A találmány szerinti, PEG-gel kapcsolt dAb-monomerek és ¹multimerek degradációsa mérhetõ e szakember által jól ismert eljárások alkalmazásával. Például PEG-gel kapcsolt dAb pepszinnel történõ inkubálása (pH=2,0, 30 perc) után, vagy tripszin, elasztáz, kimotripszin vagy karboxipeptidázzal végzett inkubálás (pH=8,0, 30 perc) után, a dAb minták gélszûréssel analizálhatók, ahol a dAb-monomer vagy ¹multimer degradációját a gélben a nem degradált dAb-hez (azaz, pepszinnel, tripszinnel, elasztázzal, kimotripszinnel vagy karboxipeptidázzal nem kezelt kontrol dAb-hez) képest kisebb molekulatömegû sáv megjelenésével igazoljuk. A gélen a dAb-sávok molekulatömegét a sáv migrációjának és a molekulatömeg-létra migrációjának össze-

1

HU 004 725 T2

hasonlításával határozhatjuk meg (lásd 5. ábra). A találmány szerinti, PEG-gel kapcsolt dAb-monomerek és ¹multimerek értékelésére, a szakember további, fehérjedegradáció mérésére szolgáló eljárásokat is ismer. 5 Immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek alkalmazásai: A leírtak szerinti PEG-ezett, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek különféle in vivo és in vitro diagnosztikai, és terápiás és megelõzõ célokra alkalmazhatók. Például a polipeptidek beépíthetõk immunvizsgálatokba (például ELISA, RIA stb.) az azok által célbavett antigének biológiai mintában történõ kimutatására, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek alkalmazhatók, például Western-blottolásra és affinitáskromatográfiás eljárásokhoz. A szakember jól ismeri az ilyen eljárásokat. Az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek igen fontos alkalmazási területe a célantigénnel kapcsolatos betegségek vagy rendellenességek kezelése vagy megelõzése. Lényegében bármilyen betegség vagy rendellenesség, amely antitestkészítménnyel feltehetõen kezelhetõ vagy megelõzhetõ, a leírás szerinti, immunglobulineredetû, variábilis-egydoménes polipeptiddel való kezelés vagy megelõzés potenciális jelöltje. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek nagy kötõaffinitása, emberi szekvenciából való eredete, kis mérete és nagy oldékonysága miatt, például a teljes hosszúságú antitesteknél, sõt például az scFv-nél sokkal alkalmasabbak az emberi betegség kezelésére vagy megelõzésére. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilisegydoménes polipeptidekkel kezelhetõ vagy megelõzhetõ betegségek vagy rendellenességek közé például az alábbiak tartoznak: gyulladás, sepsis (így például, szeptikus sokk, endotoxin által kiváltott sokk, Gram-negatív sepsis, toxikus sokk szindróma), allergiás túlérzékenység, rák vagy más hiperproliferációs rendellenességek, autoimmun rendellenességek (így például diabétesz, ízületi csúz, sclerosis multiplex, lupus erythematosis, myasthenia gravis, scleroderma, Crohn-betegség, ulcerative colitis, Hashimoto-féle betegség, Graves-betegség, Sjögren-szindróma, poliendokrin szindróma, vitiligo, periferiális neuropátia, graft-versushost betegség, 1¹es típusú autoimmun poliglanduláris szindróma, akut glomerulonephritis, Addison-féle betegség, felnõttkori idiopátiás hypoparathyroidismus (AOIH), alopecia totális, amiotrof laterális sclerosis, Bechterew-kór, autoimmun anemia aplastica, autoimmun hemolyticus anemia, Behcet-kór, Celiac-betegség, krónikus aktív hepatitis, CREST-szindróma, dermatomyositis, dilatatív cardiomyopatia, eosinophiliamyalgia szindróma, epidermolisis bullosa acquisita (EBA), óriássejtes arteritis, Goodpasture-szindróma, Guillain-Barré szindróma, hemochromatosis, Henoch–Schönlein purpura, idiopátiás IgA neuropátia, inzulinfüggõ diabetes mellitus (IDDM), fiatalkori ízületi csúz, Lambert–Eaton szindróma, lineáris IgA dermatosis, myocarditis, nakrolepszia, nekrotizáló vasculitis, új-

10

15

20

25

30

2

szülöttek lupus szindrómája (NLE), nefrotikus szindróma, pemphigoid, pemphigus, polymyositis, primer sclerosing cholangitis, psoriasis, gyorsan fejlõdõ glomerulonephritis (RPGN), Reiter-szindróma, merev ember szindróma és thyroiditis), ferõzõ betegség hatása (például korlátozott gyulladással, cachexiával járó vagy citokin által közvetített szövetkárosodás), transzplantátumkilökõdés és graft versus host betegség, tüdõrendellenességek (például respirációs distress szindróma, „shock tüdõ”, krónikus tüdõgyulladás, tüdõ sarcoidosis, tüdõ fibrosis és silicosis), szívrendellenességek (például, szívischemia, szívelégtelenség), gyulladásos csontelváltozások és csontfelszívódással járó betegség, hepatitis (így, alkohol okozta hepatitis és vírusos hepatitis), véralvadási zavarok, reperfúziós sérülés, keloid képzõdése, hegszövetképzõdés és pyrexia. Rákos megbetegedések kezelhetõk, például, a daganat növekedéséhez és/vagy metabolikus aktivitásához szükséges egy vagy több molekula, például citokinek vagy növekedési faktorok, sejtfelszíni receptorok vagy antigének, vagy enzimek célbavételével, vagy például, daganatspecifikus vagy daganatra nézve dúsított antigénre specifikus, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid alkalmazásával valamilyen feltehetõen citotoxikus vagy apoptózist indukáló ágenst a daganatsejtekhez célba juttatni. Más betegségek vagy rendellenességek, például gyulladásos vagy autoimmun rendellenességek hasonló módon kezelhetõk úgy, hogy a leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes, semlegesítõ polipeptiddel célbavesszük a kórtan egy vagy több mediátorát. Az ilyen mediátorok legtöbbször, például, endogén citokinek (például aTNF) vagy azok, gyulladást vagy más szövetkárosodást közvetítõ receptorai lesznek.

35

40

45

50

55

60 44

Gyógyászati készítmények, dozírozás és beadás A találmány szerinti immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek beépíthetõk egy adott alanynak beadható gyógyászati készítménybe. Jellemzõ, hogy a gyógyászati készítmény immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászatilag elfogadható hordozó” vagy „hordozó” kifejezésbe tartozik bármilyen és minden olyan oldószer, diszperziós közeg, bevonat, antibakteriális és gombaellenes ágensek, izotonikusságot biztosító vagy abszorpciót késleltetõ ágensek és hasonlók, amelyek gyógyászatilag elfogadhatók. A „gyógyászatilag elfogadható hordozó” kifejezésbe nem tartozik borjú- vagy lóeredetû szérumot tartalmazó szövettenyésztõ közeg. Gyógyászatilag elfogadható hordozók közé tartozik például az alábbiak közül egy vagy több: víz, sóoldat, foszfáttal pufferelt sóoldat, dextróz, glicerin, etanol és hasonlók, illetve ezek kombinációi. Sok esetben elõnyös, ha a készítmény izotonikusságot biztosító ágenseket, például, cukrokat, polialkoholokat – például mannitolt, szorbitolt –, vagy nátrium-kloridot tartalmaz. Gyógyászatilag elfogadható anyagok közé tartoznak kis mennyiségû járulékos anyagok, például az immunglobulin-eredetû, variábilis-

1

HU 004 725 T2

egydoménes polipeptid féléletidejét vagy hatékonyságát javító nedvesítõ- vagy emulgeálóágensek, tartósítók vagy pufferek. A találmány szerinti készítmények különbözõ formákban lehetnek. Ezek közé tartoznak, például, folyékony, félszilárd és szilárd dozírozási formák, mint például, folyékony oldatok (például injektálható és infúzióval beadható oldatok), diszperziók vagy szuszpenziók, tabletták, pirulák, liposzómák és kúpok. Az elõnyös forma a beadásra és terápiás alkalmazásra szánt eljárástól függ. Jellemzõ elõnyös készítmény injektálható vagy infúzióval beadható oldatok, mint például emberek más antitestekkel végzett immunizálására alkalmazottakhoz hasonló készítmények, formájában van. A beadás elõnyös módja a parenterális (például intravénás, szubkután, intraperitoneális, intramuszkuláris) beadás. A terápiás készítményeknek jellemzõen sterilnek és a gyártási és tárolási körülmények között stabilnak kell lenniük. A készítmény kiszerelhetõ oldatként, mikroemulzióként, diszperzióként, a magas gyógyszer-koncentrációhoz alkalmas liposzómaként vagy más rendezett szerkezetként. Steril injektálható oldatok elõállíthatók az aktív vegyület elõírt mennyiségének és a fentiekben felsorolt összetevõk megfelelõ oldószerbe való beépítésével (az elõírás szerint), majd szûréssel történõ sterilizálással. Általában, diszperziókat úgy állítunk elõ, hogy az aktív vegyületet, diszperziós alapközeget és a fentiekbõl elõírt más összetevõket tartalmazó steril hordozóba építjük be. Steril injektálható oldatok elõállítására szolgáló steril porok esetében, az elkészítés elõnyös módja, az elõzõleg sterilre szûrt oldatból az aktív összetevõt és minden további szükséges összetevõt por alakban biztosító vákuumszárítás és fagyasztva szárítás. Az oldat helyes fluiditása fenntartható, például bevonat, például lecitin alkalmazásával, diszperzió esetében a szükséges részecskeméret fenntartásával és a felületaktív anyagok alkalmazásával. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilisegydoménes polipeptidek beadhatók a technikában ismert különféle módokon, bár sok terápiás alkalmazásra az elõnyös beadási mód az intravénás injekció vagy infúzió. A polipeptid intramuszkuláris és szubkután injekcióként is beadható. A találmány szerinti PEG-ezett, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek a fentiek helyetti vagy melletti beadása történhet késleltetett felszabadulást biztosító mechanizmussal. A késleltetett felszabadulást biztosító mechanizmusba tartozhatnak a szakember által ismert, cellulózalapú polimerek, és ide tartozhatnak továbbá, egy emlõsegyedbe implantálható és a PEG-ezett, variábilis régiójú polipeptidet idõben lassan felszabadító ozmotikus pumpák. A találmány szerinti ozmotikus pumpák felszabadítást arányai közé tartoznak a 6 hetes idõtartam alatt körülbelül 0,5 ml és a 2 hetes idõtartam alatt 0,1 ml közötti felszabadulási arányok. Elõnyösek a 4 hetes idõtartam alatt körülbelül 0,2 ml¹t biztosító felszabadítási arányok. A szakember elfogadja, hogy a specifikus felszabadítási arányok a konkrétan szükséges kimenet, vagy az alkalmazott, PEG-ezett, variábilis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 45

2

régiójú polipeptid függvényében változhatnak. A találmány szerinti készítmények közé tartoznak a PEGezett, antitesteredetû, variábilis egydomén (vagy PEGezett multimer) koncentrált oldatai, például, legalább 5 mg/ml¹es (~417 mM), és elõnyösen legalább 10 mg/ml¹es (~833 mM), 20 mg/ml¹es (~1,7 mM), 25 mg/ml¹es (~2,1 mM), 30 mg/ml¹es (~2,5 mM), 35 mg/ml¹es (~2,9 mM), 40 mg/ml¹es (~3,3 mM), 45 mg/ml¹es (~3,75 mM), 50 mg/ml¹es (~4,2 mM), 55 mg/ml¹es (~4,6 mM) 60 mg/ml¹es (~5,0 mM), 65 mg/ml¹es (~5,4 mM), 70 mg/ml¹es (~5,8 mM), 75 mg/ml¹es (~6,3 mM), 100 mg/m (~8,33 mM), 150 mg/ml¹es (~12,5 mM), 200 mg/ml¹es (~16,7 mM) vagy magasabb koncentrációjú vizes (például, PBS-sel készült) oldatok. A találmány néhány megvalósítási módjában, a készítmények lehetnek, például 250 mg/ml (~20,8 mM), 300 mg/ml (~25 mM), 350 mg/ml (29,2 mM) vagy annál magasabb koncentrációjúak, de alkalmazás elõtt 200 mg/ml koncentrációra vagy az alá lehet ezeket hígítani. A szakember számára egyértelmû, hogy beadás útja/módja a kívánt eredménytõl függõen változik. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, az aktív vegyület, a vegyületet a gyors felszabadulástól megvédõ hordozóval állítható elõ, például szabályozott felszabadulást biztosító kiszerelésben, ideértve az implantátumokat, transzdermális tapaszokat, és mikrokapszulázott adagolórendszereket. Részben kis méretüknél fogva, az immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének kiválóan alkalmasak az olyan formulációk elõállításához, mint amilyenek a hosszan tartó felszabadulást biztosító készítmények – a dózisonként mólok száma lényegesen magasabb lehet, mint például a teljes hosszúságú antitestek dózisaiban. Biológiailag lebontható, biológiailag kompatibilis polimerek, például etilénvinil-acetát, polianhidridek, poliglikolsav, kollagén, poliortoészterek és tejsavpolimer is alkalmazható. Injektálható készítmények elhúzódó abszorpciója végrehajtható úgy, hogy a készítménybe abszorpciót késleltetõ ágenst, például monosztearátsókat és zselatint építünk be. Ilyen formulációk készítésére szolgáló számos eljárás szabadalmaztatva van vagy a szakemberek számára általában ismert [lásd például Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, szerk: Robinson, kiad,: Marcel Dekker, Inc., New York, (1978)]. Polipeptidágensek, mint például a leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek, szabályozott vagy megnövelt idõtartamú felszabadítására szolgáló további eljárások az irodalomban ismertek (lásd például US 6.306.406 számú és 6.346.274 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, és például US 20020182254 számú és US 20020051808 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, amelyek mindegyike a kitanítás részét képezi). A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet adhatunk be orálisan, például inert diluenssel vagy emészthetõ ehetõ hordozóval. A vegyületet (és ha szükséges, a többi összetevõt) kemény- vagy lágyhéjú

1

HU 004 725 T2

zselatinkapszulába zárhatjuk, tablettákká préselhetjük, vagy beépíthetjük közvetlenül az egyed táplálékába. Orális terápiás beadáshoz a vegyületeket kötõanyaggal egybeépíthetjük és emészthetõ tabletták, rágótabletták, pasztillák, kapszulák, elixírek, szuszpenziók, szirupok, gyógyszergyártó ostyák, és hasonlók formájában alkalmazhatjuk. A találmány szerinti vegyület, parenterális beadástól eltérõ alkalmazásához, szükség lehet arra, hogy a vegyületet annak inaktivációja gátlására szolgáló anyaggal bevonjuk vagy azzal együtt alkalmazzuk. A találmány, terápiás polipeptidek, ágensek vagy antigének, természetes gáton (barrier) át történõ bevitelére szolgáló eljárásban alkalmazható, amely eljárásban a terápiás polipeptidekhez, ágensekhez vagy antigénekhez legalább egy, internalizáló sejtreceptor elleni, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó polipeptidkonstrukciót kapcsolunk, ahol a konstrukció a receptorhoz való kötõdéskor internalizálódik. Természetes gátak közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – a vér-agy, tüdõ-vér, bél-vér gát, vagina-vér, végbélvér és orr-vér gátak. Például a felsõ légúton és tüdõn át bejutó peptidkonstrukció alkalmazható terápiás polipeptideknek vagy ágenseknek a tüdõ lumenébõl a vérbe irányuló transzportjára. A konstrukció specifikusan kötõdik a nyálkahártya felszínén (a bronchiális epitélsejteken) lévõ receptorhoz, ami a véráramban lévõ célokra specifikus terápiás polipeptidek vagy ágensek sejtes internalizációja révén a tüdõ lumenjébõl a vérbe irányuló transzportot eredményez. Egy másik példában, terápiás polipeptidet vagy ágenst kapcsolunk legalább egy, a bélfalon át a vérbe irányuló internalizáló sejtes receptor elleni antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó polipeptid-konstrukcióhoz. A konstrukció bélfalon át történõ transzfert indukál a terápiás polipeptid vagy ágens sejtes internalizációja révén. A vegyületek, például a találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének bevitelére és beadására szolgáló eljárások a technikában ismertek és le vannak írva, például a WO 04/041867 számú nemzetközi közzétételi irat kitanításaiban, amelynek tartalma teljes egészében a kitanítás részét képezi. A találmány szerinti megoldás alkalmazható még olyan eljárásokban is, amelyek azt határozzák meg, hogy beadás – például orális, nazális, tüdõn vagy bõrön át – melyik antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek (például, dAb¹ok, VHH) hatolnak egy adott természetes gáton át a véráramba. Az egyik példában, az eljárásban természetes¹, szintetikus- vagy immuneredetû antitesteredetû, variábilis egydomén fágkönyvtárat adunk be valamilyen kisméretû állatnak, például egérnek. A beadás után, különbözõ idõpontokban vért veszünk a véráramba aktív transzferrel bejutott fágok megmentésére. Továbbá, a beadás után, szerveket lehet izolálni és felkötõdött fágokat lehet azokról leszedni. A tüdõ lumenjébõl a véráramba irányuló aktív transzport egyik receptora, például, az „N” Fc¹receptor (FcRn). Az eljárás így azonosítja azokat az egydoménes antitesteket, amelyek bár nem aktív transzporttal jutnak el a véráramba, de ettõl még képesek célbaven-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 46

2

ni specifikus szerveket. Az eljárással azonosítható az is, hogy milyen antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek transzportálódnak a bélen át a vérbe; a nyelven (vagy az alatt) keresztül a vérbe; a bõrön keresztül a vérbe stb. A találmány szerinti gyógyászati készítményben való beadásra leginkább alkalmas antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek meghatározására szolgáló eljárások a WO 04/041867 számú nemzetközi közzétételi iratban vannak ismertetve (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). A készítményekbe további aktív vegyületek is beépíthetõk. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet egy vagy több további terápiás ágenssel együtt formulázunk és/vagy adunk be. Például immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid együtt formulázható és/vagy együtt adatható be egy vagy több további antitesttel, amely(ek) más célponthoz (például, más citokineket kötõ, vagy sejtfelszíni molekulákat kötõ antitestek), vagy például egy vagy több citokinhez kötõdik(nek). Az ilyen kombinációs terápia esetén a beadandó terápiás ágens dózisa csökkenthetõ, ezáltal el lehet kerülni a különbözõ monoterápiákkal járó lehetséges toxicitásokat vagy komplikációkat. A találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak „terápiásan hatékony mennyiségû” vagy „profilaktikusan hatékony mennyiségû” immunglobulineredetû, variábilis-egydoménes polipeptidet. A „terápiásan hatékony mennyiség” a kívánt terápiás eredmény eléréséhez, dozírozásban és szükséges ideig, hatékony mennyiséget jelent. Az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid terápiásan hatékony mennyisége különféle tényezõktõl – például a betegség státusa, életkor, nem és az egyed súlya, és az immunglobulineredetû, variábilis-egydoménes polipeptid azon képessége, hogy az adott egyedben milyen mértékben képes a várt válasz kiváltani – függõen változhat. Terápiásán hatékony mennyiségnek tekintjük továbbá azt a mennyiséget, amelynél az antitest vagy antitestrész bármilyen toxikus vagy káros hatásánál többet nyom a latban a terápiásan elõnyös hatás. A „terápiásan hatékony mennyiség” a kívánt profilaktikus eredmény eléréséhez, dozírozásban és szükséges ideig, hatékony mennyiséget jelent. Jellemzõ, hogy mivel egy adott alany esetében a profilaktikus dózist a betegséget megelõzõen vagy a betegség korai stádiumában alkalmazzuk, a profilaktikusan hatékony mennyiség a terápiásan hatékony mennyiségnél kevesebb. Dozírozási rendek beállíthatók az optimális kívánt válasz (például, terápiás vagy profilaktikus válasz) biztosítására. Például beadható egyetlen bolus, számos megosztott dózis adható be egy adott idõtartam alatt, vagy a terápiás helyzet szükségleteinek megfelelõen a dózis arányosan csökkenthetõ vagy növelhetõ. Elõnyös, ha a beadás megkönnyítése és a dózisok azonossága céljából a parenterális készítményeket dózisegységekként formulázzuk. A leírás szerinti értelemben, a dózisegység forma olyan fizikailag elkülönült egységeket jelent, amelyek a kezelni kívánt, emlõsere-

1

HU 004 725 T2

detû alany egységes dozírozására megfelelõek; minden egység a kívánt terápiás hatás eléréséhez kiszámított, elõre meghatározott mennyiségû aktív vegyületet és az elõírt gyógyászati hordozót tartalmazzák. Az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid terápiásan vagy profilaktikusan hatékony mennyisége, minden korlátozás nélkül, a 0,1–20 mg/kg, elõnyösebben az 1–10 mg/kg tartományba esik. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a dózisértékek az enyhíteni kívánt állapot típusától és súlyosságától függõen változhatnak. Egyértelmû, hogy bármely konkrét alany esetében, a specifikus dozírozási rendet, az egyed szükségleteinek és a beadó orvos szakmai megítélésének megfelelõen, idõrõl idõre be kell állítani. A leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilisegydoménes polipeptiddel végzett kezelés hatékonyságát a szakorvos a betegségi állapot vagy a kezelni kívánt rendellenesség egy vagy több szimptómájában vagy indikátorában bekövetkezett javulás alapján bírálja meg. „Hatékony kezelésnek” tekintjük az egy vagy több klinikai indikátorban bekövetkezõ legalább 10%¹os javulást (növekedés vagy csökkenés, a mérni kívánt indikátortó függõen), bár elõnyös a nagyobb – például 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, vagy akár 100%, vagy, a mérendõ indikátortól függõen, 100%-osnál nagyobb (például kétszeres, háromszoros, tízszeres stb. akár vagy egészen a betegségtõl mentes állapot eléréséig) – mértékû javulás. Az indikátorok lehetnek fizikai mérések, például enzim, citokin, növekedési faktor vagy metabolitszint, sejtszaporodás vagy sejthalál mértéke, vagy az abnormális sejtek jelenléte vagy mennyisége. Meg lehet mérni, például a betegség vagy rendellenesség (például, enyhüléses/rosszabbodásos betegségek, mint például sclerosis multiplex) fellángolási szimptómái közötti idõbeli különbségeket. Esetleg, nem fizikai mérések, mint például a fájdalomban vagy kényelmetlenségben vagy a betegség státusának más jeleiben bekövetkezõ csökkenés alapján is felmérhetõ a kezelés hatékonysága. Nem fizikai mérések esetén, különféle, klinikailag elfogadható skálák vagy indexek alkalmazhatók, mint amilyen például a Crohn-betegség aktivitási indexe (Crohn’s Disease Activity Index (CDAI)) [Best és munkatársai, Gastroenterology 70, 439 (1976)], amely a betegségi pontszámok megadásához fizikai indikátorokat – például hematokrit – és a folyékony vagy igen puha székletek számát kombinál, többek között, a beteg által jelentett tényezõkkel, mint például a hasi fájdalom vagy görcsölés súlyossága, általános jólét. A leírás szerinti értelemben, a leírás szerinti készítménnyel végzett „profilaxis” akkor tekinthetõ „hatékonynak”, ha egy vagy több szimptóma jelentkezése vagy súlyossága a készítménnyel nem kezelt hasonló alanynál tapasztaltakhoz (emberi vagy állatmodell) képest legalább 10%-kal késik vagy csökken, vagy megszûnik. Egy adott betegség vagy rendellenesség kezelésében vagy megelõzésében, a leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid hatékonyságának becslésére az emberi betegségek elfogadott állatmodellje alkalmazható. Ilyen betegségi modellek közé tartoznak például az alábbiak: az asztma ten-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 47

2

gerimalac-modellje [Savoie és munkatársai, Am. J. Respir. Cell Biol. 13, 133–143 (1995); sclerosis multiplex és kísérletes autoimmun encephalomyelitis (EAE) indukálható állatmodelljei, amelyek számos fajban, például, tengerimalacban [Suckling és munkatársai, Lab. Anim. 18, 36–39 (1984)], Lewis patkányban [Feurer és munkatársai, J. Neuroimmunol. 10, 159–166 (1985)], nyulakban [Brenner és munkatársai, Isr. J. Med. Sci. 21, 945–949 (1985)], és egerekben [Zamvil és munkatársai, Nature 317, 355–358 (1985)] indukálhatók; a diabétesz, technikában ismert állatmodelljei, így, az inzulintól függõ diabetes mellitus [insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM)] és inzulintól függõ diabetes mellitus [non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM)] állatmodelljei, például a nem elhízott diabetikus [nonobese diabetic (NOD)] egér [például Li és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11 128–11 132 (1994)], a BB/DP patkány [Okwueze és munkatársai, Am. J. Physiol. 266, R572-R577 (1994)], a Wistar zsíros patkány [Jiao és munkatársai, Int. J. Obesity 15, 487–495 (1991)], és a Zucker-féle diabetikus zsíros patkány [Lee és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10 878–10 882 (1994)]; prosztatabetegség állatmodellje [Lowethetal, Vet. Pathol. 27, 347–353 (1990)], atherosclerosis modellek [számos modell, lásd például Chao és munkatársai, J. Lipid Res. 35, 71–83 (1994); Yoshida és munkatársai, Lab. Anim. Sci. 40, 486–489 (1990); és Hara és munkatársai, Jpn. J. Exp. Med. 60, 315–318 (1990)]; nefrotikus szindróma [Ogura és munkatársai, Lab. Anim. 23, 169–174 (1989)]; autoimmun thyroiditis [Dietrich és munkatársai, Lab. Anim. 23, 345–352 (1989)]; hyperuricaemia/köszvény [Wu és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 742–746 (1994)], gastritis [Engstrand és munkatársai, Infect. Immunity 58, 1763–1768 (1990)]; proteinuria/veseglomerulusok nem megfelelõ mûködése [Hyun és munkatársai, Lab. Anim. Sci. 41, 442–446 (1991)]; ételallergia [például Ermel és munkatársai, Lab. Anim. Sci. 47, 40–49 (1997); Knippels és munkatársai, Clin. Exp. Allergy 28, 368–375 (1998); Adel-Patient és munkatársai, J. Immunol. Meth. 235, 21–32 (2000); Kitagawa és munkatársai, Am. J. Med. Sci. 310, 183–187 (1995); Panush és munkatársai, J. Rheumatol. 17, 285–290 (1990)]; reumás betegség [Mauri és munkatársai, J. Immunol. 159, 5032–5041 (1997); Saegusa és munkatársai, J. Vet. Med. Sci. 59, 897–903 (1997); Takeshita és munkatársai, Exp. Anim. 46, 165–169 (1997)]; osteoarthritis [Rothschild és munkatársai, Clin. Exp. Rheumatol. 15, 45–51 (1997); Matyas és munkatársai, Arthritis Rheum. 38, 420–425 (1995)]; lupus [Walker és munkatársai, Vet. Immunol. Immunopathol. 15, 97–104 (1983); Walker és munkatársai, J. Lab. Clin. Med. 92, 932–943 (1978)]; és Crohn-betegség [Dieleman és munkatársai, Scand. J. Gastroenterol. Supp. 223, 99–104 (1997); Anthony és munkatársai, Int. J. Exp. Pathol. 76, 215–224 (1995); Osborne és munkatársai, Br. J. Surg. 80, 226–229 (1993)]. A szakember további állatmodelleket is ismer. Bár a leírás szerinti, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptideknek nagy affinitással kell

1

HU 004 725 T2

emberi antigént kötniük, állatmodellben való hatáselemzés esetén, az állatmodellben a polipeptideknek egy vagy több antigénnel keresztreakciót kell adnia, elõnyösen magas affinitással. A szakember könnyen meg tudja határozni, hogy ezek a körülmények kielégítõek¹e egy adott állatmodell-rendszerre és egy adott, immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptidre. Amennyiben e körülmény kielégítõ, az immunglobulin-eredetû, variábilis-egydoménes polipeptid vizsgálható egy adott állatmodellnek való beadással, adott betegségi statust utánzó körülmények között, és az adott betegségi státus egy vagy több indikátorának legalább 10%¹os javulásra történõ monitorozásával. Példák A leírásban említett minden szabadalmi beadvány és publikált hivatkozás teljes egészében a kitanítás részét képezi. Bár a találmány már konkrét bemutatásra és leírásra került, annak elõnyös megvalósítási módjaira való hivatkozásokkal, a szakember számára egyértelmû, hogy a formákban és részletekben különféle változtatások eszközölhetõk a mellékelt igénypontokban megadott oltalmi körtõl való eltérés nélkül. Összefoglalás A VH és Vk dAb¹ok irányított maleimid-PEG-ezéséhez a molekula felszínén – ebben a példában a C¹terminálison – biztosított, oldószer által elérhetõ ciszteinre van szükség. A cisztein aminosav, szabad tiollá való

2

redukciót követõen, alkalmazható a fehérje maelimidvagy tiol-PEG Dab-hez való specifikus kapcsolására. Egy egész sor, kémiailag módosított, különféle méretû és elágazó formátumú PEG szerezhetõ be a Nektar 5 (ismertebben Shearwater Corp) cégtõl. Ez lehetõvé teszi, hogy az alap dAb-cys monomert különféle módokon, például PEG-ezett monomerré, ¹dimerré, ¹trimerré, ¹tetramerré stb., formatáljuk. A PEG¹ek mérete kDaban van megadva, de elõfordulhat, hogy „K” ¹ként hi10 vatkozunk rá (azaz „40 K PEG”=40 kDa PEG). 1.0 1. példa: Vk dAb TAR1–5–19 PEG-ezése 1.1. TAR1–5–19 cys elõállítása PCR-rel C-terminális cisztein Vk dAb¹ra való génsebészeti 15 bejuttatásához példaként TAR1–5–19¹et alkalmaztunk (6–3. ábrák). A PEG kapcsolási helye máshová is helyezhetõ dAb felszínén, amennyiben a célbavett aminosav, oldószer által elérhetõ és a kapott PEG-ezett fehérje megtartja antigént kötõ képességét. Ennek meg20 felelõen, PEG-ezés céljából a dAb 1–4 vázának bármelyikébe be lehet építeni ciszteint génsebészeti úton, és a dAb antigénkötõ kapacitását egy bizonyos mértékig még továbbra is megtartja. Az alábbi oligonukleotidokat alkalmaztuk a TAR1–5–19 specifikus PCR-ezé25 sére. Az oligonukleotidok SalI és BamHI helyet tartalmaznak a klónozáshoz és C¹terminális ciszteint is bevisznek. Az alábbi szekvencia a TAR1–5–19 cys és a génsebészeti úton elõállított dAb amplifikálására alkalmazott PCR-láncindítók DNS-szekvenciája. SalI

Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp 61 GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln 121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro 241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA BamHI

Phe Thr 301 TTT ACG AAA TGC (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Phe TTC AAG NO: NO: NO:

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser Gly GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGC CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG 9) 8) 7) 48

1

HU 004 725 T2

Elõre láncindító (a szekvencialistában 10. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA¹3’ Vissza láncindító (a szekvencialistában 11. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC¹3’ A PCR-reakciókeveréket (50 ml) az alábbiak szerint állítottuk össze: 200 mM dNTP, 0,4 mM mindegyik láncindítóból, 5 mL 10× PfuTurbo puffer (Stratagene), 100 ng templátplazmid (TAR1–5–19), 1 mL PfuTurbo enzim (Stratagene) és a térfogatot steril vízzel 50 mL¹re egészítettük ki. Az alábbi PCR-körülményeket alkalmaztuk: kezdeti denaturációs lépés: 94 °C 2 percig, majd 25 ciklus: 94 °C 30 mp, 64 °C 30 mp és 72 °C 30 mp; majd végsõ extenziós lépés: 72 °C 5 percig. A PCR-terméket tisztítottuk, majd SalI és BamHI enzimekkel végzett emésztés után ugyanazokkal az enzimekkel hasított vektorba ligáltuk. A klónok megfelelõségét DNS-szekvenciával ellenõriztük. 1.2. TAR1–5–19 cys expresszálása és tisztítása TAR1–5–19 cys vektort BL21 (DE3) pLysS kémiailag kompetens sejtekbe (Novagen) transzformáltuk a gyártó útmutatása szerint. A dAb-plazmidot hordozó sejteket 100 mg/ml karbenicillin és 27 mg/ml kloramfenikol alkalmazásával szelektáltuk. Tenyészeteket állítottunk össze 500 ml „terrific” (fantasztikus) tápoldatot, 100 mg/ml karbenicillint és 27 mg/ml kloramfenikolt tartalmazó 2 literes flaskákban. A tenyészeteket

30 °C¹on, 200 rpm rázatás mellett, OD600=1–1,5¹ig növesztettük, majd 1 mM IPTG-vel (izopropil-b-D-tiogalaktopiranozid, Melford Laboratories) indukáltuk. A dAb expresszióját 12–15 órán át, 30 °C¹on hagytuk 5 folytatódni. Úgy találtuk, hogy a dAb többsége a tápoldatban volt jelen. Emiatt, a sejteket centrifugálással (8000×g, 30 perc) elkülönítettük a tápoldattól, és a dAb tisztítására a felülúszót alkalmaztuk. A felülúszóhoz literenként 30 mL Protein L agarózt (Affitech) ad10 tunk és keverés mellett, 2 órán át hagytuk, hogy a dAb felkötõdjön a Protein L agarózra. A felülúszó leeresztése elõtt a gyantát további egy órán át hagytuk leülepedni. Az agarózt XK 50 oszlopba (Amersham Pharmacia) töltöttük és 10 térfogatnyi 2×PBS-sel 15 mostuk. A kötött dAb¹t 100 mM glicinnel (pK 2,0) eluáltuk, és a fehérjetartalmú frakciókat 1/5 térfogat 1 M¹os Tris (pH=8,0) hozzáadásával semlegesítettük. A tenyészet felülúszójából literenként 20–30 mg tiszta fehérjét izoláltunk, amely 50:50 százalékban mono20 mert és TAR1–5–19 diszulfid dimert tartalmazott (7–4. ábra). 1.3. TAR1–5–19 cys PEG-ezése MAL-aktivált PEG alkalmazásával 25 1.3.1. Monomer PEG-ezése A VH vagy Vk felszínére génsebészeti úton bevitt cisztein aminosav egyetlen lineáris vagy elágazó PEGMAL-lal specifikusan módosítható monomeres módosított fehérje elõállítása céljából. Az alábbiakban bemu30 tatjuk azt a két PEG-MAL formátumot, amelyek monomer VH vagy Vk dAb PEG-ezésére alkalmazhatók. A PEG¹ek molekulatömege lehet 500 és 60 000 közötti (például, 2000–40 000).

mPEG-MAL

2,5 mL 500 mM¹os TAR1–5–19 cys¹t 5 mM ditiotreitollal redukáltunk és szobahõmérsékleten 20 percig inkubáltuk. A mintán, PD¹10 oszlop (Amersham Pharmacia) alkalmazásával puffercserét végeztünk. Az oszlopot 5 mM EDTA¹t, 20 mM nátrium-foszfátot (pH=6,5) és 10% glicerint tartalmazó pufferrel ekvilibráltuk, majd felvittük a mintát és elúciót végeztünk a gyártó útmutatásai szerint. A mintát (3,5 mL, ~360 mM dAb) a további feldolgozásig jégre helyeztük. Kimértünk négyszeres moláris feleslegû 40 KPEG-MAL¹t (~200 mg) és 100%¹os metanolban feloldottuk a redukált dAb¹ot tartalmazó oldattal való összekeverés elõtt. A reakció szobahõmérsékleten 3 órán át zajlott.

2

mPEG2-MAL

1.3.2. PEG-ezett TAR1–5–19 cys monomer tisztítása Ebben a példában, a Vk dAb¹t kationcserélõ kromatográfia alkalmazásával tisztítottuk (mivel a fehérje izo50 elektromos pontja, pI~8,8). Ha a protein pI¹je alacsony lenne, például 4,0, anioncserélõ kromatográfiát alkalmaznánk. A pH ~4¹re való csökkentése céljából, a 40K PEG TAR1–5–19 cys reakcióhoz milliliterenként 40 mL 40%¹os jégecetet adtunk. A mintát elõzõleg 50 mM¹os 55 nátrium-acetáttal (pH=4,0) ekvilibrált, 1 mL¹es Resource 5 kationcserélõ oszlopra (Amersham Pharmacia) vittük fel. 20 oszloptérfogatnyi, 0–500 mM¹os, lineáris nátriumklorid-gradienssel különítettük el a PEG-ezett anyagot a módosítatlan dAb-tõl. A csak PEG-ezett dAb¹t tartalma60 zó frakciókat SDS-PAGE alkalmazásával azonosítottuk, 49

1

HU 004 725 T2

majd összeöntöttük és 1/5 térfogat 1 M¹os Tris (pH=8,0) hozzáadásával a pH¹t 8¹ra növeltük. 1.3.3. A TAR1–5–19 cys multimerizálása mPEGMAL¹ok alkalmazásával A dAb¹ok multimerizációja különféle, olyan többszörös reaktív csoportokkal módosított, villás/elágazó

5

2

PEG-ekkel érhetõ el, amely reaktív csoportokhoz a dAb kovalensen kapcsolható (lásd 7. és 10. ábra). Kimutatták, hogy az olyan, több alegységes célok, mint például TNF, esetében, a dAb (dimerré, trimerré és tetramerré való) multimerizációja szignifikánsan növeli a dAb, antigénjével szembeni aviditását (lásd 1. táblázat).

mPEG-(MAL)2

multi-arm PEG

mPEG2-(MAL)2 A fenti szerkezetek a VH és Vk dAb¹ok multimerizációjához alkalmazható mPEG-MAL formátumokat mutatnak be. Az mPEG MW¹tarománya 500 és 60 000 közötti (például, 2000–40 000). dAb-dimereket mPEG(MAL)2 vagy mPEG2(MAL)2 alkalmazásával állítottuk elõ; trimereket és tetramereket pedig 3 vagy 4 karú PEG-ekkel, megfelelõen. A dAb¹ok kapcsolásához a bemutatott többkaros PEG¹et MAL¹al módosítani kell. A multimerizált dAb-formátumok elõállításakor, a kísérletes metodológia megegyezett a monomer elõállítására alkalmazottal, kivéve azt, hogy a PEG-MAL:dAb moláris arány az alkalmazott PEG-MAL formátumától függõen változott. Például TAR1–5–19 dimer (lásd 7–7. ábra) mPEG2-(MAL)2-vel való elõállításához az alkalmazott PEG-MAL:dAb moláris arány 0,5:1 volt. A PEG-ezett dimer tisztításához is a PEG-ezett monomerre leírt kationcserélõ kromatográfiát alkalmaztuk, az alábbi változtatások mellett. Az alkalmazott nátriumklorid-gradiens 0¹tól 250 mM¹ig terjedt, és 30 oszloptérfogatnyi volt. TAR1–5–19 trimer (lásd 10–23. ábrák) 3¹karosPEG-MAL alkalmazásával történõ elõállításához az alkalmazott PEG-MAL:dAb moláris arány 0,33:1 volt. A PEG-ezett trimer tisztításához is a PEGezett monomerre leírt kationcserélõ kromatográfiát alkalmaztuk, az alábbi változtatások mellett. Az alkalmazott nátrium-klorid-gradiens 0¹tól 250 mM¹ig terjedt, és 30 oszloptérfogatnyi volt. TAR1–5–19 tetramer (lásd

11–28. ábrák) 4¹karosPEG-MAL alkalmazásával törté35 nõ elõállításához az alkalmazott PEG-MAL:dAb moláris arány 0,25:1 volt. A PEG-ezett trimer tisztításához is a PEG-ezett monomerre leírt kationcserélõ kromatográfiát alkalmaztuk, az alábbi változtatások mellett. Az alkalmazott nátrium-klorid-gradiens 0¹tól 250 mM¹ig ter40 jedt, és 30 oszloptérfogatnyi volt. A TAR1–5–19 PEGtrimer és tetramer esetében, ha szükséges, a mintákat méretkizárásos kromatográfiával tovább lehet tisztítani. Superose 6 HR oszlopot (Amersham Pharmacia) foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS) ekvilibráltunk a minta 45 felvitele elõtt. Az oszlop átfolyási sebessége 0,5 ml/perc volt és a fehérjeelúciót az abszorpció 280 nm¹en történõ követésével monitoroztuk. A csak PEG-ezett dAB¹t tartalmazó frakciókat SDS-PAGE alkalmazásával azonosítottuk, majd összeöntöttük. 50 2.0. 2. példa: VH dAb TAR2–10–27 MAL-PEG-ezése 2.1. TAR1–10–27 cys elõállítása PCR-rel C-terminális cisztein VH dAb¹ra való génsebészeti bejuttatásához példaként TAR2–10–27¹et alkalmaz55 tunk. Ahogyan a Vk dAB¹ok esetében, a PEG kapcsolási helye máshová is helyezhetõ dAb felszínén, amennyiben a célbavett aminosav, oldószer által elérhetõ és a kapott PEG-ezett fehérje megtartja antigént kötõ képességét. Az alábbi oligonukleotidokat alkal60 maztuk a TAR1–5–19 specifikus PCR-ezésére. Az oli50

1

HU 004 725 T2

gonukleotidok SalI és BamHI helyet tartalmaznak a klónozáshoz és C¹terminális ciszteint is bevisznek. A PCR-reakció körülményei és a klónozás az 1.1. rész-

2

ben körvonalazottak szerint történt, azzal az egyetlen kivétellel, hogy az alkalmazott templát TAR2–10–27¹et tartalmazó plazmid-DNS volt. SalI

Ala Ser Thr GIu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 1 GCG TCG ACG GAG GTC CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 46 CAG CCT GGG GGG TCC CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTC GTC GGA CCC CCC AGG GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAG Thr Phe Glu Trp Tyr Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 91 ACC TTT GAG TGG TAT TGG ATG GGT TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG TGG AAA CTC ACC ATA ACC TAC CCA ACC CAG GCG GTC CGA GGT CCC Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser 136 AAG GGT CTA GAG TGG GTC TCA GCT ATC AGT GGT AGT GGT GGT AGC TTC CCA GAT CTC ACC CAG AGT CGA TAG TCA CCA TCA CCA CCA TCG Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 181 ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGC TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCG Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 226 GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT CTG TTA AGG TTC TTG TGC GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA SalI

Ala 271 GCC CGG Gly 316 GGG CCC

Glu GAG CTC Gly GGG CCC

Asp GAC CTG Pro CCT GGA

Ala GCC CGG Asn AAT TTA

Ala GCG CGC Phe TTT AAA

Val GTA CAT Gly GGC CCG

Tyr TAT ATA Tyr TAC ATG

Tyr TAC ATG Arg CGG GCC

Cys TGT ACA Gly GGC CCG

Ala GCG CGC Gln CAG GTC

Lys AAA TTT Gly GGA CCT

Val GTT CAA Thr ACC TGG

Lys AAG TTC Leu CTG GAC

Leu TTG AAC Val GTC CAG

Gly GGG CCC Thr ACC TGG

BamHI

Val Ser Cys *** *** Gly Ser (SEQ ID NO: 14) 361 GTC TCG TGC TAA TAA GGA TCC (SEQ ID NO: 12) CAG AGC ACG ATT ATT CCT AGG (SEQ ID NO: 13) Elõre láncindító (a szekvencialistában 15. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT¹3’ Vissza láncindító (a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG¹3’ 2.1. ábra: A TAR2–10–27 cys és a génsebészeti úton készített dAb amplifikálására alkalmazott PCR-láncindítók DNS-szekvenciája 2.2. TAR1–10–27 cys expresszálása és tisztítása A DOM1h–10–27 cys expressziója és tisztítása az 1.2. részben leírtak szerint történt az alábbi módosítá-

sok mellett: mivel a dAb VH volt, ezért Streamline Protein A¹t alkalmaztunk a fehérje, sejttenyészet-felülúszóból való tisztítására. Továbbá, a gyantáról pH=2,0 puffer helyett 100 mM¹os glicinnel (pH=3,0) alkalmazásá50 val eluáltuk a fehérjét. 2.3. TAR2–10–27 cys PEG-ezése A monomer TAR2–10–27cys PEG-ezése az 55 1.3.1 részben körvonalazottak szerint történt. Továbbá, VH dAB-okat az 1.3.3. részben körvonalazottak szerint multimerizáltunk PEG alkalmazásával. A PEG-ezett TAR2–10–27 cys tisztítása kationcserélõ kromatográfiával, pH=4,0¹án történt (lásd 1.3.2. rész), mivel a fe60 hérje pI¹értéke ~8,5. 51

1

HU 004 725 T2

3.0. VH és Vk dAB¹ok PEG-ezése NSH-val és SPA-val módosított PEG alkalmazásával Az irányított PEG-ezés mellett, sokkal véletlenszerûbb PEG-ezés is alkalmazható a fehérje kovalens módosítására. Ebben a megközelítésben, NHS-sel vagy SPA-val módosított PEG¹et alkalamzunk, amely a dAb, oldószernek kitett felszíni lizin aminosavaival reagál. Ennek megvan az az elõnye, hogy a dAb¹t nem kell génse-

5

bészeti úton módosítani, mivel a VH és Kk dAb¹ok felszínén számos felszíni lizin van. Továbbá, mindenféle megelõzõ módosítás nélkül bármilyen formátum PEG-ezhetõ, például a TAR 1–5–19 diszufid-dimer (7–5,6. ábra) vagy ultraaffinitású dimerek (8–13., 8–14., és 8–15. ábra) (lásd, 3.3 és 5.0 részeket). A MAL-PEG-khez hasonlóan, az alábbiakban bemutatunk néhány lineáris/villás és elágazó SPA és NHS-PEG formátumot.

mPEG2-NHS

mPEG-SPA 3. példa: A Vk dAb TAR1–5–19 NHS- és SPAPEG-ezése 3.1. TAR1–5–19 elõállítása PCR-rel A TAR1–5–19¹et példaként alkalmazzuk az NHSés SPA-PEG-ekkel már PEG-ezett Vk dAb¹ra.

2

TAR1–5–19¹et amplifikáltunk PCR-rel és klónoztunk az alábbi láncindítókkal az 1.1. részben körvonalazottak szerint. 25

SalI

Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 TGG AGG GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp 61 GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT GAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln 121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro 241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA BamHI

Phe Thr 301 TTT ACG AAA TGC (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Phe TTC AAG NO: NO: NO:

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg *** *** Gly Ser Gly GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TAA TAA GGA TCC GGC CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ATT ATT CCT AGG CCG 19) 17) 18)

Elõre láncindító (a szekvencialistában 20. azonosító számon megadott szekvencia)

5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGAT60 GACCCAGTCTCCA¹3’ 52

1

HU 004 725 T2

Vissza láncindító (a szekvencialistában 21. azonosító számon megadott szekvencia) 5 ’ - A A A G G A T C C T T A T T A C C G T T T G A T T T CCACCTTGGTCCC¹3’ 5 3.2. TAR1–5–19 expresszálása és tisztítása A TAR1–5–19 expresszióját és tisztítását az 1.2. részben körvonalaztuk. Az egyetlen módosítás az volt, hogy a már tisztított fehérjét a jelen lévõ tris/glicin puffer eltávolítása végett PBS ellen dializáltuk vagy puffercserét (PD10) végeztünk. 3.3. Monomer és TAR1–5–19 dimer PEG-ezése NHS- vagy SPA-PEG-gel PEG-ezési reakciókat vagy PBS-pufferben vagy 50 mM nátrium-foszfátban (pH=7,0) végeztünk. 400 mM TAR1–5–19 monomert összekevertünk 5–10-szeres moláris feleslegben lévõ aktivált PEGgel (NHS vagy SPA, 100%¹os metanolban oldva). A reakciót szobahõmérsékleten 2–4 óráig folytattuk, majd 1 M glicin (pH=3,0) hozzáadásával (20 mM végkoncentrációban) leállítottuk. Úgy találtuk, hogy az expresszió során elõállított TAR1–5–19 diszulfid di-

10

2

mer (1.2. rész) is PEG-ezhetõ a fenti metodológia alkalmazásával. Ez lehetõvé teszi, hogy a diszulfid dimer formátumot DTT-vel végzett redukció, majd PEG2-(MAL)2-vel történõ módosítás nélkül PEG-ezni lehessen. A protokolban egyetlen módosítás történt: a koncentrálási lépések során a dAb-dimer kicsapódásának megakadályozására 10%¹os glicerint alkalmaztunk. 3.4. A PEG-ezett Vk dAb¹ok tisztítása A PEG-ezett monomer és diszulfid dimer dAb¹t kationcserélõ kromatográfiával tisztítottuk az 1.3.3. részben leírtak szerint.

15 4. példa: VH dAb HEL4 NHS- és SPA-PEG-ezése 4.1. HEL4 elõállítása PCR-rel A HEL4¹et példaként alkalmazzuk az NHS- és SPA-PEG-ekkel már PEG-ezett VH dAb¹ra. PCR-rel 20 HEL4¹et amplifikáltunk és klónoztunk az alábbi láncindítók alkalmazásával és az 1.1 részben megadott körülmények között, azzal az egyetlen módosítással, hogy a templát DNS a HEL4 DNS-szekvenciát tartalmazó plazmidvektor volt. salI

Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 GCG TCG ACG GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT GTC GGA CCC CCC AGG Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu Asp Met Gly Trp Val 61 CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTT AGG ATT AGC GAT GAG GAT ATG GGC TGG GTC GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAA TCC TAA TCG CTA CTC CTA TAC CCG ACC GAG Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser 121 CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGT CTA GAG TGG GTA TCA AGC ATT TAT GGC CCT AGC GGT AGC GCG GTC CGA GGT CCC TTC CCA GAT CTC ACC CAT AGT TCG TAA ATA CCG GGA TCG CCA TCG Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 181 ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGT GAC AAT TCC AAG AAC TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCA CTG TTA AGG TTC TTG Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 241 ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT GCC GAG GAC ACC GCG GTA TAT TAT TGC GCG TGC GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA CGG CTC CTG TGG CGC CAT ATA ATA ACG CGC Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 301 AGT GCT TTG GAG CCG CTT TCG GAG CCC CTG GGC TTT TGG GGT CAG GGA ACC CTG GTC ACC TCA CGA AAC CTC GGC GAA AGC CTC GGG GAC CCG AAA ACC CCA GTC CCT TGG GAC CAG TGG BamHI

Val Ser 361 GTC TCG CAG AGC (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Ser AGC TCG NO: NO: NO:

*** *** Gly Ser TAA TAA GGA TCC ATT ATT CCT AGG 24) 22) 23)

53

1

HU 004 725 T2

Elõre láncindító (a szekvencialistában 25. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT¹3’ Vissza láncindító (a szekvencialistában 26. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-AAAGGATCCTTATTAGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG¹3’ 4.2. HEL4 expresszálása és tisztítása A VH dAb¹t a 2.2. részben körvonalazottak szerint expresszáltuk és tisztítottuk. 4.3. HEL4 NHS- és SPA-PEG-ezése A felszíni lizin aminosavak NHS-sel és SPA-val aktivált PEG¹ek alkalmazásával történõ módosításának metodológiája a 3.3. részben körvonalazott volt. A protokolban mindössze egyetlen változás volt: a reakciót 1 M¹os Tris-puffer (pH=8,0) hozzáadásával (20 mM végkoncentrációban) állítottuk le. 4.4. NHS- vagy SPA-PEG-ezett HEL4 tisztítása Mivel a HEL4 pJ¹je ~4, ezért a PEG-ezett fehérjét anioncserélõ kromatográfiával tisztítottuk. Az alkalmazott oszlop 50 mM Tris-szel (pH=8,0) ekvilibrált, 1 ml¹es Resource Q oszlop volt (Amersham Pharmacia). Az oszlopra való felvitel elõtt a minta pH¹ját 8¹ra állítottuk be. A PEG-ezett fehérjét 50 mM Trist (pH=8,0) tartalmazó 0–500 mM, lineáris nátrium-kloridgradienssel különítettük el a módosítatlan dAb-tõl. 4.5. PEG-ezett HEL4 affinitási kötése HEL4 affinitáson alapuló (az antigénen, tyúktojáseredetû lízozimen alapuló) gyantát állítottunk elõ a PEG-ezett dAb funkcionalitásának tesztelésére. Lizozimet kapcsoltunk NETS-sel aktivált Sepharose 4B

5

10

15

20

25

30

35

2

gyantához (Amersham Pharmacia) a gyártó utasításait követve. A PEG-ezett mintákat (5 mg) összekevertük az affinitási gyantával (100 ml) és PBS-ben szobahõmérsékleten 30 percig inkubáltuk. A gyantát PBS-sel (3×1 ml) intenzíven mossuk a fel nem kötött fehérje eltávolítására. Az affinitási gyantát megfuttattuk SDSPAGE¹n annak meghatározására, hogy a PEG-zett HEL4 felkötõdött¹e a mátrixra (lásd 8.3. rész). 5. példa: Ultraaffinitási dimerek PEG-ezése, SPAval és NHS-sel aktivált PEG¹ek alkalmazásával VH és Vk dAb-okat multimerizálhatunk (Gly4Ser)n linker (n=0–7) alkalmazásával egyetlen polipeptidlánc kialakítása céljából (például két dAb¹t ultraaffinitású dimerhez; 8–12. ábra). Ennélfogva, lehetséges kettõs specificitású homodimer (VH1–VH1 és VL1–VL1) vagy heterodimer (VH1–VH2 és VL1–VL2) párok kialakítása. A dimerek kialakításához hasonlóan, nagyobb fehérjék, például trimerek (10–27. ábra) vagy tetramerek (11–32. ábra) készítéséhez további dAb¹ok adhatók. Továbbá, mivel VH és Vk dAb¹ok kombinációja alkalmazható e nagyobb formátumok elõállítására, kettõs specificitású molekulák elkészítése is lehetséges. Például dAb-trimer, amelynek féléletideje megnõhet és aTNF¹et köt le: egy, szérumalbumint megkötni képes dAb hozzá van kapcsolva két, TNF¹et dimerként kötõ TAR1–5–19 dAb. Az ultraaffinitású dimereket NHS- és SPA-PEG-ekkel PEG-eztük (8–13., 8–14. és 8–15. ábra) és génsebészeti úton specifikusan átalakítottunk abból a célból, hogy azok a fehérje C¹terminálisán MAL-PEG-eket befogadjanak (6a. és 6b. példa) (8–16. ábra). Ebben a példában, a TARI–5–19-Dimer 4 ultraaffinitású dimert 20K-SPA-val vagy 40KNHS-sel módosítottuk. A TAR1–5–19 Dimer 4 ultraaffinitású dimer DNS-szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be.

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG KpnI

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 61 ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 121 GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 181 CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TGG TCA GAC GTT GGA HindII Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln 241 GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA AAA TGC AAG CCG GTT

54

1

HU 004 725 T2

2

XhoI

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 301 GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCG AGC TCG CCA CCT CCG CCA AGT CCG CCT CCA CCG TCG Sal HindII

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met 361 GGC GGT GGC GGG TCA GGT GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG CCG CCA CCG CCC AGT CCA CCA CCG CCT TCG CCG CCA CCG CCC AGC TGC CTG TAG GTC TAC Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 421 ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG TGG GTC AGA GGT AGG AGG GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC KpnI

Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 481 GCA AGT CAG AGC GTT AAG GAG TTT TTA TGG TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT CGT TCA GTC TCG CAA TTC CTC AAA AAT ACC ACC ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA Lys Leu Leu Ile Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 541 AAG CTC CTG ATC TAT ATG GCA TCC AAT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC TTC GAG GAC TAG ATA TAC CGT AGG TTA AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 601 AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA HindII

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 661 ACG TAC TAC TGT CAA CAG AAG TTT AAG CTG CCT CGT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG TGC ATG ATG ACA GTT GTC TTC AAA TTC GAC GGA GCA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC NotI

Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu 721 GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC CTT TAG TTT GCC CGC CGG CGT GTA GTA GTA GTG GTA GTG CCC CGG CGT CTT GTT TTT GAG Ile Ser 781 ATC TCA TAG AGT (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Glu GAA CTT NO: NO: NO:

Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA CTC CTA GAC TTA CCC CGG CGT 29) 27) 28)

TAR1–5–19 Dimer 4 ultraaffinitású dimer expresszálása és tisztítása A dimer expressziója megegyezett az 1.2 részben leírtakkal, a protokoll azon módosításaitól eltekintve, hogy a konstrukciót TOP10 F’¹sejtekbe transzformáltuk és a karbenicillint 100 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk.

5.2. A TAR1–5–19 dimer 4 ultraaffinitású dimer 20K SPA és 40K NHS-PEG-ezése és tisztítása A dimert a 3.3. részben körvonalazottak szerint PEG-eztük 20K SPA-PEG-gel vagy 40K NHS-PEGgel. A 20K SPA és a 40K NHS-PEG-ezett dimereket kationcserélõ kromatográfiával tisztítottuk az 1.3.3 rész 60 1a. példájában leírtak szerint. 55

55

1

HU 004 725 T2

6a. példa: Ultraaffinitású dimerek irányított PEGezése MAL-lal aktivált PEG-ekkel Az ultraaffinitású dAb-dimerek a génsebészettel bevitt C¹terminális ciszteinnel módosított dAb-khez hasonlóan módosíthatók (8–16. ábrák). A ciszteines dimert alap építõtéglaként lehet alkalmazni nagyobb, PEG-ezett multi-dAb formátumok elõállítására (8–17., 11–29. és 11–31. ábra). (Gly4Ser)5 linker

5

2

ciszteint tartalmazó TAR1–5–19 homodimer (lásd 8–16. ábra) alkalmazható példaként. Akárcsak a TAR1–5–19 cys monomer esetében, monomeres (azaz dimer; 8–16. ábra) és dimeres (azaz tetramer; 8–17. ábra) egyaránt elõállítható oldatban az expresszió során. A TAR1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású dimer DNS-szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be.

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1 GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG KpnI

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 61 ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 121 GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 181 CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA HindII

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln 241 GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA AAA TGC AAG CCG GTT XhoI

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 301 GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCG AGC TCG CCA CCT CCG CCA AGT CCG CCT CCA CCG TCG SalI HindII

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met 361 GGC GGT GGC GGG TCA GGT GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG CCG CCA CCG CCC AGT CCA CCA CCG CCT TCG CCG CCA CCG CCC AGC TGC CTG TAG GTC TAC Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 421 ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC KpnI

Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 481 GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 541 AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG

56

1

HU 004 725 T2

2

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 601 AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA HindII

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 661 ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GCA AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC Glu Ile 721 GAA ATC CTT TAG (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Lys AAA TTT NO: NO: NO:

Arg Cys CGC TGC GCG ACG 32) 30) 31)

6.1. TAR1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású dimer expresszálása és tisztítása A dimer expressziója megegyezett az 1.2 részben leírtakkal, a protokoll azon módosításaitól eltekintve, hogy a konstrukciót TOP10 F’¹sejtekbe transzformáltuk és a karbenicillint 100 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk. 6.2. TAR1–5–19 homodimer cys dimerizációja és tisztítása 40K PEG2-(MAL)2-vel TAR1–5–19 homodimer cys¹t 40K PEG2-(MAL)2vel PEG-eztünk a dimer kialakítása céljából [azaz, összesen 4 dAb¹ot tartalmazó, 2×linkerdimer (11–29. ábra)]. A reakció és tisztítás körülményei megegyeztek az 1.3.1. részben leírtakkal és az 1a. példában körvonalazott módosításokkal. 6b. példa: TAR1–5–19 homodimer cys tetramerizációja és tisztítása 40K PEG2-(MAL)2-vel TAR1–5–19 homodimer cys¹t 20K PEG-MAL-lal PEG-eztünk a dimer tetramer kialakítása céljából [azaz, összesen 8 dAb¹ot tartalmazó, 4×linkerdimer

(11–31. ábra)]. A reakció és tisztítás körülményei megegyeztek az 1.3.1. részben leírtakkal és az 1c. példá20 ban körvonalazott módosításokkal. 7. példa: Alacsony affinitású dAb (VH vagy Vk) multimerizációja magasabb affinitású formátumok kialakítása céljából 25 Vk dAb¹ra példaként alkalmazott TAR1–5 monomerként viszonylag alacsony kötõaffinitást mutat TNF¹re, ám a dAb affinitása multimerizációval növelhetõ. Ismét C¹terminális ciszteint alkalmaztunk a dAb, 4¹karos 20K PEG MAL révén történõ multimerilázálá30 sára. 7.1. TAR1–5 cys elõállítása PCR-rel Az alábbi oligonukleotidokat alkalmaztuk a TAR1–5 specifikus PCR-ezésére. Az oligonukleotidok 35 SalI és BamHI helyet tartalmaznak a klónozáshoz és C¹terminális ciszteint is bevisznek. A TAR1–5 cys és a génsebészeti úton készített dAb amplifikálására alkalmazott PCR-láncindítók DNS-szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk be. SalI

Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGG GAC AGA CGT AGA CAT KpnI

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn Leu Leu Trp 61 GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT TTT ATG AAT TTA TTG TGG CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA AAA TAC TTA AAT AAC ACC KpnI

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln 121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAT GCA TCC GTG TTG CAA ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TTA CGT AGG CAC AAC GTT

57

1

HU 004 725 T2

2

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TGA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG HindII

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro 241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA BamHI

Phe Thr 301 TTT ACG AAA TGC (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID

Phe TTC AAG NO: NO: NO:

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser Phe GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC TTT CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG AAA 35) 33) 34)

Elõre láncindító (a szekvencialistában 36. azonosító számon megadott szekvencia) 5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA¹3’ Vissza láncindító (a szekvencialistában 16. azonosító számon megadott szekvencia) 37) 5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC¹3’ A reakció körülményei megegyeztek az 1.1. részben leírtakkal. 7.2. TAR1–5 cys expresszálása és tisztítása A dAb expresszálása és tisztítása az 1.2. részben körvonalazottak szerint történt. Ismét 50:50 arányú monomer – TAR1–5 diszulfid dimer keverék alakult ki. 7.3 PEG-ezéssel végzett multimerizáció és a 4¹karos 20K PEG-MAL TAR1–5 tisztítása A PEG-ezési és tisztítási körülmények megegyeztek az 1.3.3. rész, 1c. példájában leírtakkal. A sejt-citoxicitási vizsgálatok eredményeit az 1. táblázat mutatja be. 8. példa: In vitro funkcionális kötési vizsgálat: TNF-receptorvizsgálat és sejtvizsgálat 8.1. PEG-ezett TAR1–5–19 monomer és TAR1–5–19 cys konstrukciók vizsgálati adatai Az emberi aTNF elleni, PEG-ezett dAb affinitását a TNF-receptorkötéssel (receptor binding (RBA)) és a sejtcitotoxicitás vizsgálatával határoztuk meg (összegezve az 1. táblázatban). Az 1. ábra mutatja be azokat az RBA vizsgálati adatokat, amelyeket néhány kiválasztott PEG-ezett Vk dAb¹re kaptunk. A grafikonokból meghatározott IC50-értékeket az 1. táblázatban összegeztük. Látható, hogy az RBA-ban csak kis különbség tapasztalható a monomer és dimer, pEG-ezett és módosítatlan formái között. Az IC50 még a nagyobb 40K

20 PEG–MAL esetén is változatlan. A 40K-NHS-nél enyhe csökkenést figyeltünk meg, de ez feltehetõen annak köszönhetõ, hogy a PEG-ezés helye közel van a CDRekhez, míg a 40K-MAL a dAb C¹terminálisán helyezkedik el. Ez azt mutatja, hogy a PEG-ezés antigénkötés25 re gyakorolt hatása elhanyagolható, ha a PEG a CDRektõl távol helyezkedik el. Továbbá az is látható, hogy az RBA-ban, a monomer dAb 3¹ és 4¹karos PEG-gel képzett formátumai fokozott affinitást mutatnak a TNF¹re. 2. ábra ugyanazon mintákra, a sejtcitotoxicitá30 si vizsgálatban kapott eredményeket mutatja be. Ismét csak kis különbség van a PEG-ezett és módosítatlan minták között, ami azt mutatja, hogy a dAb potenciája megmaradt. A 3¹ és négykarú PEG-mintákkal kapott leglényegesebb különbség az ND50, 100 és 30 pM¹ra 35 való csökkentése (megfelelõen). A TAR1–5-nél látható, hogy ebben a sejtvizsgálatban, az alacsony affinitással kötõ monomer ND50-értéke ~10 mM. Dimerizáció esetén, az affinitás ~3 mM¹ra csökken, és 4¹karos PEG¹el végzett tetramerizáláskor az ND50 200 nM¹ra 40 megy le. Ennélfogva, még egy alacsony affinitású dAb is multimerizálható többkaros PEG-gel olyan formátummá, amely az antigénjével szemben nagyobb aviditást mutat. 45

8.2 TAR1–5–19 Dimer 4 and TAR1–5–19 homodimer cys PEG-ezett ultraaffinitású dimerek vizsgálati adatai A TAR1–5–19 Dimer 4 SPA és NHS-PEG-ezése is50 mét megmutatta, hogy a véletlenszerû felszíni módosítás csak kissé befolyásolta a dimer potenciáját (lásd 1. táblázat). A TAR1–5–19 homodimer cys esetében azt találtuk, hogy a dimer tetramerré dimerizálása fenntatartotta a ~3 nM¹os ND50-értéket. Az ND50-ben akkor 55 láttunk szignifikáns esést, amikor a dieómert a 4¹karos MAL-PEG¹el tovább multimerizáltuk oktamerré (az ND50-érték ~100 pM¹ra tolódott el). Ez tükrözi vissza azt a tényt, hogy az RBA-vizsgálat érzékenysége viszonylag magas, és hogy a magas af60 finitású formátumok ND50-értéke ~200 pM. 58

1

HU 004 725 T2

2

1. táblázat TAR1–5–19¹en alapuló dAb-formátumok receptor- és sejtcitotoxicitási vizsgálatai során kapott eredmények összefoglalása dAb formátum

Receptorvizsgálat IC50 (nM)

Sejtcitotoxicitási vizsgálat ND50 (nM)

Módosítatlan TAR1–5–19 monomer

30

70

20K SPA TAR1–5–19 monomer

45

70

40K SPA TAR1–5–19 monomer

45

90

20K MAL TAR1–5–19 monomer

30

70

40K MAL TAR1–5–19 monomer

30

80

Módosítatlan TAR1–5–19 diszulfid dimer

0,8

3

1×20K SPA TAR1–5–19 diszulfid dimer

1

3

1×40K NHS TAR1–5–19 diszulfid dimer

3

10

40K PEG2-(MAL2) TAR1–5–19 dimer

1

3

TAR1–5–19 D4 ultraaffinitású dimer

–

10

20K SPA PEG TAR1–5–19 D4 ultraaffinitású dimer

–

30

40K NHS PEG TAR1–5–19 D4 ultraaffinitású dimerek

–

25

TAR 1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású dimer

–

3

TAR1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású diszulfid dimer

–

3

40K PEG2-(MAL)2 TAR 1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású

–

3

4-karos PEG-MAL TAR1–5–19 homodimer cys ultraaffinitású dimer tetramer (karonként 5K)

0,1

3-karos PEG-MAL TAR1–5–19 trimer (karonként 5K)

0,2

0,1

4-karos PEG-MAL TAR1–5–19 tetramer (karonként 5K)

0,1

0,03

4-karos PEG-MAL TAR1–5–19 tetramer (karonként 10K)

–

0,02

TAR1–5 monomer

–

10 000

TAR1–5 diszulfid dimer

–

3 000

4-karos PEG-MAL TAR1–5 tetramer (karonként 5K)

–

200

9. példa: PEG-ezett VH és Vk dAb¹k szérum in vivo féléletideje és hidrodinamikai méretük közötti összefüggés Fehérjék PEG-ezését in vivo szérum-féléletidejük megnövelésére alkalmaztuk. A vesében a szûrés küszöbértéke körülbelül 70 kDa, ami azt jelenti, hogy egy, a módosítatlan dAb-vel (VH ~13–14 kDa és Vk ~12 kDa) megegyezõ méretû fehérje szérum-féléletideje viszonylag alacsony (t b1/2 ~10–30 perc). A dAb¹ok PEG-ezésén végzett munka megmutatta, hogy egy adott dAb (akár VH akár pedig Vk) szérumféléletideje módosítható az alkalmazott PEG méretével és elágazásainak természetével. Ez egy jelentõs alkalmazás, például olyan gyógyszeres terápiák esetén, ahol 10 órás idõtartamra növelt (például, >30 órás) féléletidõre van szükség; míg lényeges rövidebb, néhány órás (3–6 órás) fennmaradási idõre van szükség, ha a dAb meg lesz jelölve és in vivo leképezési reagensként diagnosztikai célokra alkalmazzuk. Kimutattuk, hogy a PEG-ezett dAb¹ok szérum-féléletidejének meghatározásában két paraméternek

40 van fontos szerepe. Az elsõ a csatlakoztatott PEG természete és mérete, azaz az, hogy természetét tekintve az alkalmazott polimer egyszerû lineáris lánc vagy elágazó/villás. A második, a dAb elhelyezkedése a végsõ formátumon, és hogy a molekulának 45 hány „szabad” módosítatlan PEG-karja van. A kapott PEG-ezett formátum, méretkizárásos kromatográfiával becsült hidrodinamikai mérete a molekula féléletideje között kapcsolat áll fenn. Eszerint, minél nagyobb a PEG-ezett molekula hidrodinamikai mérete, 50 annál nagyobb a szérum-féléletideje (lásd 2. táblázat). A különféle, PEG-ezett fehérjék hidrodinamikai méretének meghatározására alkalmazott gélszûrõ mátrixok magasan keresztkötött agarózon alapultak. 55 A globuláris fehérjékre alkalmazott két oszlop frakcionálási tartománya lehet: Superose 12 HR 1000–3×105 Mr és Superose 6 HR 5000–5×106 Mr. Globuláris fehérjére a méretkizárási határok az alábbiak: ~2×106 a Superose 12 HR¹re és ~4×107 a Supe60 rose 6HR¹re. 59

1

HU 004 725 T2

2

2. táblázat Formátum

Lineáris/elágazó PEG mérete

Becsült méret (kDa)a

Hidrodinamikai méret (kDa)b

na

12

14

na

24

30

20K lineáris

60

280c

In vivo szérumféléletidõ (tb1/2 óra)

Vk dAb-ok TAR1–5–19 monomer TAR1–5–19 diszulfid dimer TAR1–5–19 diszulfid dimer 20K PEG-SPA TAR1–5–19 Pc fúzió

0,5 2,5 16

na

80

na

>24

TAR1–5–19 monomer 40K PEG–MAL

40K elágazó (2×20K)

95

550c

>36

TAR1–5–19 dimer 40K PEG

40K elágazó (2×20K)

110

580c

–51,6

TAR1–5–19 trimer PEG-MAL

15K 3¹karos elágazó (3×5K)

52

130c

na

TAR1–5–19 tetramer PEG-MAL

20K 4¹karos elágazó (4×5K)

90

150c

–12,7

na

14

16

na

HEL4 5K PEG-MAL

5K lineáris

24

70

na

HEL4 20K PEG-MAL

20K lineáris

55

275

na

HEL4 30K PEG-THIOL

30K lineáris

84

310

na

HEL4 40K PEG-NHS

40K elágazó (2×20K)

95

544

na

HEL4

Megjegyzések: a becsült méretet SDS-PAGE-val határoztuk meg. b Superose 12HR (Amersham Pharmacia) méretkizárásos kromatográfiával meghatározott hidrodinamikai méretek. c Méretbecslések.

Így, a 2. táblázatból látható, hogy bár a TAR1–5–19 4¹karos PEG-formátuma 20K PEG-bõl áll és molekulatömege nagyobb, mint a 20K SPA TAR1–5–19 diszulfid dimeré (95 kDa vs. 60 kDa), féléletidejük hasonló, mivel a vese kizárási határa 70 kDa. Ez feltehetõen amiatt van, hogy a 4¹karos formátumban a dAb¹ok az egyes PEG-molekulák végéhez vannak kapcsolva és így a molekula sokkal kompaktabb (kisebb a hidrodinamikai mérete), azaz ebben a formátumban a molekula magjában igen magas a PEG sûrûsége az egyetlen lineáris 20K láncot hordozóhoz képest. A 4¹karos formátum alkalmazásának elõnye az, hogy a dimermolekulával összehasonlítva a TNF elleni affinitás szignifikánsan megnõtt (30 pM vs. 3 nM, megfelelõen). Eszerint, bizonyos alkalmazásokban – ahol magas affinitású, de rövid szérum-féléletidejû kötõre van szükség – a jelen lévõ dAb¹ok számának és az alkalmazott PEG méretének variálásával a molekula úgy alakítható, hogy mindkét jellemzõnek megfeleljen. 10. példa: PEG-ezett dAb¹ok proteázokkal szembeni stabilitása A PEG-ezett dAb¹ok egy másik kulcsfontosságú sajátsága a proteázok hatásával szembeni fokozott stabilitásuk. A vizsgálati körülményektõl függõen, a dAb¹ok lényegében viszonylag stabilak a proteázok hatásával szemben. Például, a TAR1–5–19¹et a tripszin még 5 M

35

40

45

50

55

60

60

urea jelenlétében sem bontja le. Ez azért van, mert a dAb nem tekeredik le a denaturálóágens jelenlétében, ezzel szemben a pepszin pH=2-nél teljesen lebontja, mivel savas körülmények között a fehérje letekeredik. A PEG-ezésnek meg van az az elõnye, hogy a polimerlánc valószínûleg betakarja a dAb felszínét, ezáltal megakadályozza, hogy a proteáz eljusson a polipeptidvázhoz és azt lebontsa. Mégha a fehérje alacsony pH¹nál részben denaturálódik, a PEG jelenléte a dAb felszínén szignifikánsan növeli annak pepszinnel szembeni ellenálló képességét (5. ábra). Az 5. ábra mutatja be a TAR1–5–19 és más PEGezett változatok pepszinnel végzett lebontásának eredményeit. Reakciókat futtatunk pH=2,0-nál, 37 °C¹on 30 percig, 250 mg pepszin jelenlétében. A csíkok az alábbi mintákkal készültek: 1: molekulatömeg-sorozat; 2: monomer (0 min); 3: monomer (15 min); 4: monomer (30 min); 5: 40K MAL2 dimer (0 min); 6: 40K MAL2 dimer (15 min); 7: 40K MAL2 dimer (30 min); 8: 20K MAL monomer (0 min); 9: 20K MAL monomer (15 min); 10: 20K MAL monomer. A gél bemutatja, hogy a módosítatlan dAb¹t az enzim, alacsony pH¹nál igen gyorsan lebontja. Az 5. ábra is bemutatja, hogy a dAb felszínén lévõ PEG típusa is lényeges hatással van a dAb, proteázokkal szembeni ellenálló képességére. A lineáris 20K PEG ugyan bizonyos fokig megvédi a dAb¹t, de akár 30 perc elteltével is látható bizonyos mértékû degradáció (a 3 kDa-nál lévõ sáv, a gélen láthatók szerint

1

HU 004 725 T2

~15–20% degradáció). Ezzel szemben, 30 perc elteltével a 40K PEG MAL2 dimer esetében igen kismértékû degradáció látható (legfeljebb <5% degradáció, a gélbõl). Legvalószínûbb, hogy ez a 2×20K formátumú PEG-nek köszönhetõ, ami nagyobb védelmet biztosít a pepszin mûködésével szemben. Ez felvetné azt, hogy a PEG-ezett dAb is ellenálló lenne az emberi emésztõcsatornában található különféle proteázok mûködésével szemben és fenntartaná a mûködõképességet a gyomor alacsony pH¹jú környezetén való áthaladáskor. Ennélfogva, PEG-ezett dAb terápiás gyógyszerként szájon át beadható lehetne a lebontást megakadályozó vagy a mûködõképesség elvesztését eredményezõ komplex formulázások szüksége nélkül. PEG-ezett dAb egyértelmû elõnyt biztosít más formátumokkal, például IgG, scFv vagy Fabok, szemben, amelyek fogékonyabbak a proteázok hatására és a denaturációra (így fennáll a funkcionalitás elvesztésének lehetõsége) az emésztés során tapasztalható extrém pH¹kon.

5

10

15

20 11. példa: VH vagy Vk dAb¹ok irányított PEGezése NHS-sel vagy SPA-val aktivált PEG-ekkel A dAb (VH vagy Vk) felszínén lévõ számos lizin aminosav jelenléte miatt, viszonylag kevéssé hatékony megpróbálkozni egyetlen NHS/SPA-PEG felkötésével, mivel a kötéshez csak alacsony PEG:dAb arányokat alkalmazunk. Bár egyetlen PEG-ezett példányt is elõ lehet állítani, általában az összes fehérjének ~10–20%¹a lesz PEG-ezve. Egyértelmû, hogy az aktivált PEG arányának növelése túlságos mértékû PEG-ezést eredményez, ami potenciálisan az antigénkötés elvesztését okozhatja, mivel a CDR-eket elfedi a PEG. E probléma egyik megoldási módja az lenne, ha ezeket a felszíni lizineket, az emberi antitestvázakban is jelen levõ más aminosavakkal szubsztituálnánk. Például a VkI (DPK9) 3 lizin aminosavat tartalmaz a 2. vázban. Ezen aminosavak kicserélhetõk a VkII-ben (DPK18) találhatókkal (arginin és glutamin aminosavak). Ezen aminosavak más, az emberi vázban már megtaláltakkal való cseréje is csökkentheti az immunogenitás potenciális hatásait. A Vk dAb-oknak is van C¹terminális ciszteinjük, amelyet az irányított PEG-ezéshez meg lehet tartani. Specifikus „lizin-génsebészet” is végezhetõ a VH dAb-okra. Ismételten, a felszíni lizinek szubsztituálhatók más, megfelelõ emberi VH vázakban talált aminosavakkal, de ez esetben szükség lehet a C¹terminális szerint lizinre történõ szubsztituálására. Ezzel lehetõvé válhat az, hogy génsebészeti úton egyetlen lizint vigyünk be a dAb¹ba (ezzel megegyezõ módon, a ciszteinnel már megtettük). Az egyetlen követelmény az, hogy a lizinnek oldószer által elérhetõnek kell lennie, így PEG-ezés esetén nem fogja lényegesen csökkenteni az antigénhez való kötõdést. 12. példa: Potenciális PEG-ezési helyek azonosítása VH és Vk dAb-on Ahhoz, hogy VH vagy Vk dAb¹ok vázába specifikus génsebészettel PEG-ezésre szolgáló cisztein aminosavat vigyünk be, számos tényezõt kell figyelembe venni. Ezek közé tartoznak az alábbiak:

25

30

35

40

2

a bevitt aminosav, oldószer általi elérhetõsége, amihez az szükséges, hogy az aminosav a fehérje felszínén helyezkedjen el, a bevitt hely közelsége a CDR-ekhez, és hogy ennek PEG-ezése milyen hatással lesz az antigénkötésre, a natív elõnyös kölcsönhatások (például hidrogénkötés) megbontása, amely a cisztein szubsztitúciója esetén destabilizálhatja a fehérjét vagy befolyásolhatja a feltekeredési útvonalat, minek folytán a kapott dAb¹ot nem lehet hatékonyan expresszálni. Ennélfogva, a felszíni cisztein számára legalkalmasabb hely vizsgálatára közvetlenül összehasonlítottuk a fehérjeexpressziót, PEG-ezést és affinitási kötésvizsgálatokat. Ez meghatározhatja azt, hogy fehérjeexpresszió szempontjából – az antigénnel szembeni affinitás fenntartása mellett – egy, a C¹terminálisra helyezett cisztein aminosav (Ser120cys) valóban jobb¹e, mint egy belsõ kapcsolási hely. A felszíni aminosavak oldószer általi elérhetõségének kiszámítására – így cisztein aminosavban a génsebészeti beavatkozásra potenciális helyek azonosítására – a Swiss PDB Viewer programot alkalmaztuk. Ismételten ezeket az aminosavakat választottuk ki a CDRektõl való távolságuk miatt. Ha egy nagy PEG-molekulát a CDR-ekhez közel viszünk be, akkor az bizonyára hatással lesz az antigénkötésre. A 3. táblázat mutatja be a HEL4 és a mesterséges Vk szerkezeteinek alkalmazásával azonosított legalkalmasabb helyeket (a szekvenciákat lásd alább). Látható, hogy a PEG-ezésre alkalmas helyek együttesen csoportokba vannak rendezve a dAb felszíni területein. Ennélfogva, (a V csoport kivételével) minden csoportban csak egyetlen mutánst választottunk ki expresszálásra (vastag betûvel szedve). Valószínûleg ezekre a helyekre lehet génsebészettel cisztein aminosavat bevinni az antigénkötésben bekövetkezõ lényeges veszteség nélkül. 3. táblázat A helyeket a HEL4 kristályszerkezetének koordinátái és a mesterséges Vk modellezett szerkezete alkalmazásával azonosítottuk. Az aminosavak számozása az egyes dAb¹k primer aminosavszekvenciáinak alapján van megadva (lásd alább)

45 dAb

Génsebészetre alkalmasnak azonosított aminosavak

VH

50

55

I CSOPORT

Gln¹13, Pro¹14, Gly¹15

II CSOPORT

Pro-41, Gly¹42, Lys¹43

III CSOPORT

Asp-62, Lys¹65

IV CSOPORT

Arg¹87, Ala¹88, Glu-89

V CSOPORT

Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119, Ser-120

Vk

60 61

I CSOPORT

Val¹15

II CSOPORT

Pro¹40, Gly¹41

1

HU 004 725 T2

3. táblázat (folytatás) dAb

Génsebészetre alkalmasnak azonosított aminosavak

III CSOPORT

Ser¹56, Gly¹57, Ser¹60

IV CSOPORT

Pro¹80, Glu¹81

V CSOPORT

Gln-100, Lys-107, Arg-108

5

A VH dAb HEL4 primer aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 5. azonosító számon megadott szekvencia. 1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS 51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL 101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS A mesterséges Vk primer aminosavszekvenciája (a szekvencialistában 6. azonosító számon megadott szekvencia).

2

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA 51 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ 101 GTKVEIKR

12.1. A TAR2–10–27 Quick-change mutagenezise irányított PEG-ezéshez szükséges felszíni cisztein beviteléhez 10 Quick-change mutagenezist (Stratagene) alkalmaztunk egy adott felszíni aminosav, irányított PEG-ezéshez szükséges egyetlen ciszteinre való helyettesítésére. A Quick-change mutagenezist a gyártó által megadott protokol szerint végeztük a megfelelõ láncindí15 tókkal (4. táblázat) és templátként vad típusú TAR2–10–27 DNS¹t alkalmazva. DNS-szekvenálással pozitív klónokat azonosítottunk, és minden mutáns dAb¹t a 2.2. részben leírtak szerint expresszáltunk és tisztítottunk. PEG-ezés és a formattált fehérjék tisztítá20 sa a 2.3. részben leírtak szerint történt.

4. táblázat A TAR2–10–27 Quick-change mutagenezisére alkalmazott oligonukleotidpárok Pontmutációk

SEQ ID NO

5’®3’ Oligonukleotidszekveneia

Glnl3cys Elõre láncindító

38

TCTGGGGGAGGCTTGGTATGCCCTGGGGGGTCCCTGCGT

Vissza láncindító

39

ACGCAGGGACCCCCCAGGGCATACCAAGCCTCCCCCAGA

Elõre láncindító

40

ATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTTGCGGGAAGGGTCTAGAGTGG

Vissza láncindító

41

CCACTCTAGACCCTTCCCGCAAGCCTGGCGGACCCAACCCAT

Elõre láncindító

42

GGTAGCACATACTACGCATGCTCCGTGAAGGGCCGGTTC

Vissza láncindító

43

GAACCGGCCCTTCACGGAGCATGCGTAGTATGTGCTACC

Elõre láncindító

44

ATGAACAGCCTGCGTGCCTGCGACGCCGCGGTATATTAC

Vissza láncindító

45

GTAATATACCGCGGCGTCGCAGGCACGCAGGCTGTTCAT

Elõre láncindító

46

CCTAATTTTGGCTACCGGGGCTGCGGAACCCTGGTCACCGTC

Vissza láncindító

47

GACGGTGACCAGGGTTCCGCAGCCCCGGTAGCCAAAATTAGG

Elõre láncindító

48

GGCTACCGGGGCCAGGGAACCTGCGTCACCGTCTCGAGCTAA

Vissza láncindító

49

TTAGCTCGAGACGGTGACGCAGGTTCCCTGGCCCCGGTAGCC

Elõre láncindító

50

CGGGGCCAGGGAACCCTGGTCTGGCGTCTCGAGCTAATAAGGA

Vissza láncindító

51

TCCTTATTAGCTCGAGACGCAGACCAGGGTTCCCTGGCCCCG

Pro41cys

Asp62cys

Glu89cys

Gln112cys

Leu115cys

Thr117cys

A TAR2–10–27 cys minden egyes mutánsát expresszáltuk és tisztítottuk. A fehérjék végsõ kitermelését az 5. táblázat mutatja be.

60

62

1

HU 004 725 T2

2

5. táblázat Receptorvizsgálat IC50 (nM)

MRC–5 sejt vizsgálat ND50 (nM)

Glu89cys 30K MAL PEG

20

100

Gln112cys 30K MAL PEG

15

650

Leu115cys 30K MAL PEG

10

300

Thr117cys 30K MAL PEG

8

700

Ser120cys 30K MAL PEG

10

600

TAR2–10–27 cys mutáns Mutáns

Expresszió végsõ kitermelése (mg/ml tenyészet)

Ser120cys-éhez viszonyított expresszió

Gln13cys

1,10

2,2

Pro41cys

0,86

1,7

Asp62cys

0,24

0,5

Glu89cys

0,93

1,9

Gln112cys

0,87

1,7

Leu115cys

2,65

5,3

Thr117cys

1,00

2,0

Ser120cys

0,50

1,0

10

Az 5. táblázaton látható, hogy a dAb-mutánsok expressziós szintjei a fehérje felszínén lévõ cisztein pozíciójától függõen jelentõs mértékben eltérnek. Például a Leu115cys mutáns expressziós szintje ~5,3szor nagyobb, mint a Ser120cys mutánsé. Ennélfogva, a PEG-ezési hely pozíciója jelentõs hatást gyakorol az expressziós szintre in vivo. Annak vizsgálatára, hogy a PEG-ezési hely befolyásolta¹e a dAb, antigénjével szembeni affinitását, mindegyik mutánst 30KMAL PEG-gel PEG-eztük és ioncserélõ kromatográfiával tisztítottuk. Kontrollként mindegyik mutánsból készítettünk olyan változatot, amelynek felszínén lévõ ciszteint, monomer elõállítása céljából N¹metilmaleimiddel blokkoltuk. Mindegyik fehérjét DOM1 receptorkötési vizsgálatban (RBA) és MRC–5 sejtvizsgálatban vizsgáltuk. A kapott eredményeket a 6. táblázat tartalmazza. 6. táblázat A TAR210–27 cys felszíni mutánsainak RBA és sejtvizsgálati adatai (összefoglalás). Blokkolt fehérjéket N¹etil-maleimid alkalmazásával állítottunk elõ TAR2–10–27 cys mutáns

Receptorvizsgálat IC50 (nM)

5

MRC–5 sejt vizsgálat ND50 (nM)

vad típusú TAR2–10–27

3

30

blokkolt Gln13cys

2

30

blokkolt Pro41cys

1

45

blokkolt Asp62cys

15

430

blokkolt Glu89cys

3

70

blokkolt Gln112cys

2

15

blokkolt Leu115cys

3

30

blokkolt Thr117cys

3

30

blokkolt Ser120cys

3

30

Gln13cys 30K MAL PEG

8

200

Pro41cys 30K MAL PEG

8

200

Asp62cys 30K MAL PEG

>300

1000

Világosan látható, hogy a PEG-ezési hely elhelyezkedése valóban jelentõs hatással van a dAb, antigénjé15 vel szembeni affinitására. PEG-ezésre legjobb helynek a Gln13, Pro41 vagy Leu115 tûnik (~200–300 nM¹os ND50-értékek). Úgy tûnik, hogy e konstrukciók mindegyike fenntart egy viszonylag magas affinitást az antigénre összehasonlítva a Ser120cys közvetlen C¹termi20 nális PEG-ezésével (600 nM¹os ND50). Ennélfogva, egy belsõ PEG-ezési hely kiválasztása inkább elõnyös lehet mint egy C¹terminálisé; (i) a fehérjeexpresszió lényegesen magasabb és (ii) az antigénkötés kevésbé érintett. 25 13. példa: PEG-ezett VH és Vk dAb¹ok szérum in vivo féléletideje és hidrodinamikai méretük közötti összefüggés A különféle PEG-ezett VH és VL dAb¹ok natív mo30 lekulatömegét gélszûréses kromatográfiával határoztuk meg. Superose 6HR oszlopot (Amersham Biosciences) ekvilibráltunk 5 oszloptérfogatnyi PBS-sel AKTA 100 rendszert (Amersham Biosciences) alkalmazva. Az oszlopot magas és alacsony molekulatöme35 gû fehérjekalibrációs készletekkel (Amersham Biosciences) kalibráltuk a gyártó útmutatásai szerint. Az oszlopra 100 ml PEG-ezett fehérjét (1,5 mg/ml) vittünk fel 0,5 ml/min áramlási sebességnél. A fehérje elúciós térfogatát az abszorpció 280 nm¹en való nyomon köve40 tésével határoztuk meg. A folyamatot mindegyik PEGezett dAb¹re megismételtük az egyedi elúciós térfogatok meghatározása céljából. Az oszlopra kalibrációs görbét készítettünk a molekulatömeg logaritmusa vs. Kav grafikus ábrázolásával. Ve=a fehérje elúciós térfogata (ml) 45 V 0 =holttérfogat [blue dextran elúciós térfogata (7,7 ml)] Vt=teljes oszloptérfogat (aceton elúciós térfogata: 22 ml) Az egyes PEG-ezett dAb¹ok natív molekulatömegét 50 az elúciós térfogat Kav értékké való átalakításával határoztuk meg. A Kav¹ok és molekulatömeg-standardok logaritmusa grafikus ábrázolásával készült kalibrációs görbét alkalmaztuk a PEG-ezett fehérjék tömegének 55 extrapolálására. A különféle PEG-ezett dAb¹ok, gélszûrõ oszloppal kapott kalibrációs görbe segítségével becsült méretét a 7. táblázat mutatja be. Mindegyik formátumra nézve, egerekben is meghatároztuk az in vivo szérum-félélet60 idõt. 63

1

HU 004 725 T2

2

7. táblázat A Vk dAb¹ok hidrodinamikai méretének és in vivo szérum-féléletidejének becsült értékei Megjegyzések: becsült méretet SDS-PAGE-val határoztuk meg. b Superose 12HR (Amersham Pharmacia) méretkizárásos kromatográfiával meghatározott hidrodinamikai méretek. a

Vk dAb-formátum

Lineáris/elágazó PEG mérete

Becsült méret (kDa)a

Hidrodinamikai méret (kDa)b

In vivo szérum-féléletidõ (tb1/2 óra)

TAR1–5–19 monomer

na

12

19,5

TAR1–5–19 diszulfid dimer

na

24

22

TAR1–5–19Fc fúzió

na

80

na

TAR1–5–19 monomer 30K PEG-MAL

30K lineáris

70

1100

TAR1–5–19 monomer 40K PEG-MAL

40K elágazó (2×20K)

95

1700

TAR1–5–19 dimer 40K PEG

40K elágazó (2×20K)

110

1990

39,5

TAR1–5–19 tetramer PEG-MAL

20K 4¹karos elágazó (4×5K)

90

200

12,7

TAR1–5–19 tetramer PEG-MAL

40K 4¹karos elágazó (4×10K)

>110

570

26,4

Ami a 7. táblázatból egyértelmûen látható az, hogy a PEG hozzáadásával lényeges mértékben megnõtt a dAb hidrodinamikai mérete. Ismételten, nem csak a PEG mérete, de a polimer szerkezeti is nagymértékben befolyásolhatja a hidrodinamikai méretet. Például a 2×20K és a 4×10K ugyanazon PEG-tartalommal bír, de a 2×20K hidrodinamikai mérete körülbelül háromszorosa a 4×10K-jénak. Ez annak a ténynek tudható be, hogy a 4×10K formátumban a PEG a molekula magjánál sûrûbben van csomagolva a 2×20K PEG-hez képest, így csökkentve lényegesen annak hidrodinamikai méretét. Ami még szintén egyértelmû, hogy összefüggés van a fehérje natív hidrodinamikai tömege és az in vivo szérum-féléletidõ között (lásd 15. ábra). Így, a gélszûréses kromatográfiával meghatározott hidrodinamikai méret alkalmazható a szérum-féléletidõ becslésére. A dAb módosítására alkalmazott PEG formátumától és méretétõl függetlenül (azaz lineáris vagy elágazó) látható, hogy a hidrodinamikai méret a szérum-féléletidõ jobb indikátora, mint a fehérje módosítására alkalmazott polimer összes tömege. Így, a gélszûréses kromatográfiával meghatározott hidrodinamikai méret alkalmazható a szérum-féléletidõ becslésére (lásd 15. ábra). 14. példa: PEG-ezett dAb¹ok proteázokkal szembeni stabilitása A módosítatlan és PEG-ezett fehérje proteázokkal szembeni stabilitását vizsgáltuk antigénkötés ELISAval történt nyomon követésével. Mivel a PEG-ezett fehérje alacsonyabb jelet generál az ELISA-ban, lényegesen magasabb dAb-koncentrációt kellett alkalmaznunk. 0,4 mM (5 mg/ml) monomeres és 25 mM (300 mg/ml) 40K PEG-ezett TAR1–5–19¹et emésztettünk 250 mg/ml proteázzal, minden proteáz esetében 100 ml¹es végtérfogatban. Az alkalmazott proteázok az alábbiak voltak: sertéspepszin, borjúeredetû nyers

0,5 1,2 >24 38,5 >36

25 nyálkahártya-peptidáz, sertés hasnyálmirigybõl származó elasztáz, borjú hasnyálmirigybõl származó nyers proteáz (I¹es típus) és patkánybélbõl készült por (Sigma). Minden emésztést 50 mM¹os Tris-pufferben (pH=8,0) végeztünk a pepszin kivételével (ami 30 20 mM¹os HCL-ben, pH=2-nél történt). A emésztéseket 37 °C¹on 30 percig inkubáltuk, és a reakciót 10 ml, 10× teljes proteázinhibitorok („Complete protease inhibitors”, Roche) törzsoldatának hozzáadásával állítottuk le. A mintákat a további feldolgozásig jégen tartottuk. 35 PBS-ben oldott 1 mg/ml TNF-fel elõzõleg bevont (12 óra, 4 °C) Maxisorb lemezt 2% Tween-20¹at tartalmazó PBS-sel (2% TPBS) blokkoltunk szobahõmérsékleten egy órán át. Az egyes proteáz-tesztmintákból 20¹20 ml¹t 2% TPBS-sel 200 ml¹re hígítottunk. A mintá40 kat az antigénnel bevont lemezekre transzferáltuk és szobahõmérsékleten egy órán át inkubáltuk. A lemezt 0,1% TPBS-sel mostuk, majd lyukanként 100 ml, Protein L¹HRP oldatot (Sigma) (1:2000 hígításban, 2%¹os TPBS-ben) mértünk be és egy órán át inkubáltuk. A le45 mezt elõbb 0,1% TPBS-sel, majd PBS-sel mostuk a színreakció elkezdése elõtt. Lyukanként 100 ml TMBoldatot mértünk be, majd a színreakció lefutása után a reakciót 100 ml 1 M¹os HCl hozzáadásával állítottuk le. A felkötõdött dAb szintjét közvetetten, az abszorbancia 50 450 nm¹en történt leolvasásával határoztuk meg [Versa maxplate-reader (Molecular devices)]. A proteázkezelés után megmaradt mûködõképes fehérje arányát a 450 nm¹en leolvasott eredményekbõl – a proteázt nem tartalmazó kontrollal összevetve – határoztuk meg. 55 A monomeres és 40K PEG TAR1–5–19, különféle proteázokkal szembeni stabilitását a 16. ábra mutatja be. Látható, hogy még a módosítatlan, monomeres dAb is mutat a proteázokkal szemben bizonyos mértékû rezisztenciát: peptidázos, elasztázos és patkánybélbõl készült 60 porral végzett kezelés után az antigénkötésben 64

1

HU 004 725 T2

~50–70%¹os, CBP-vel 90%¹os, pepszinnel és CBP-vel pedig 100%¹os csökkenés következett be. A proteázokkal szembeni rezisztencia feltehetõen a dAb kompakt feltekeredésének köszönhetõ, emiatt a proteázok talán kevésbé képesek hozzáférni a peptidvázhoz. A módosítatlan dAb-vel összehasonlítva, a 40K PEG-ezett TAR1–5–19 nagyobb mértékû stabilitást mutatott az összes proteázzal szemben, a pepszint kivéve. A fokozott stabilitás feltehetõen a dAb felszínének ilyen nagy, mobilis polimerrel való módosításának köszönhetõ. A felszíni PEG „bevonhatja” a fehérjét, így megvédi azt a proteázok kötõdésétõl és a peptidváz hasításától, ezáltal növelve a dAb¹ok, ezen enzimekkel szembeni stabilitását. Mindkét formátum, pepszinnel való teljes lebonthatóságában az alacsony pH¹jú denaturálókörülmények játszhatnak szerepet, aminek a vizsgálat alatt a dAb¹ok ki vannak téve. Az alacsonyabb pH a fehérje letekeredését okozhatja, ami lehetõvé teszi, hogy a pepszin jobban hozzáférjen a peptidvázhoz és hasítsa azt. 15. példa: PEG-ezett TAR2–10–27, Biacore alkalmazásával végzett kd és ka ráta analízise A PEG-ezésnek a TAR2–10–27, antigénjével szembeni kötõaffinitására gyakorolt hatását Biacore al-

2

kalmazásával vizsgálatuk. Az összes PEG-ezett formátumot TAR2–10–27cys (lásd 2. példa) alkalmazásával állítottuk elõ. Az alábbi módszertant alkalmaztuk az egyes PEG-ezett dAb formátumoknak az antigénnel 5 kapcsolatos disszociációs és asszociációs rátái meghatározására. Egy Biacore sztreptavidin szenzorchip áramlási celláját biotinilált, emberi TNFR1¹el (molekulánként körülbelül 1 biotin) vontuk be körülbelül 400 RU sûrûséggel. A dAb-okból vagy PEG-ezett dAb-okból 10 készült koncentrációsorozatot (2,6 mM, 770 nM, 260 nM, 77 nM és 2,6 nM) egymás után ráinjektáltuk (45 ml¹es injekció, 30 ml/min áramlási sebesség) a TNFR1¹el bevont áramlási cellára és egy nem bevont áramlási cellára (sztreptavidin) (szubtraktív görbét ge15 neráltunk oly módon, hogy a TNFR1¹el bevont áramlási cellával készült görbébõl kivontuk a nem bevont áramlási cellára kapott görbét). A disszociációs rátát a minta injektálása után 5 perccel analizáltuk (az egyes minták között a felszínt 10 mM glicin (pH=3) injektálásával re20 generáltuk). A Biacorral generált adatokat a görbeillesztõ szoftverrel (Biaevaluation 3.2) illesztettük és meghatároztuk az asszociációs konstanst (ka) és a disszociációs konstanst (kd) (8. táblázat).

8. táblázat A különbözõ PEG-ezett formátumú TAR2–10–27 asszociációs és disszociációs rátájának analízise. Blokkolt TAR2–10–27¹et N¹etil-maleimid alkalmazásával állítottunk elõ ka (M–1 S–1)

kd (S–1)

kD (a kd/ka átlagából) (M)

TAR210–27

1,60E06

8,52E-03

5,33E¹09

blokkolt TAR210–27

5,77E+05

5,96E-03

1,03E¹08

TAR210–275KMAL PEG

9,00E+04

0,011

1,22E¹07

TAR210–27 2×10K MAL PEG

1,20E+05

9,54E-03

7,95E¹08

TAR210–27 20K MAL PEG

7,99E+04

0,012

1,50E¹07

TAR210–27 30K MAL PEG

8,34E+04

7,69E-03

9,22E¹08

TAR210–27 2×20K MAL PEG

7,47E+04

5,17E-03

6,92E¹08

Formátum

A 8. táblázatból látható, hogy a PEG-lánc méretének növekedésével csökken a KD. A KD e változás fõként a ka csökkenése miatt van, miközben a PEG növekedésével a kd viszonylag változatlan marad. 16. példa: A PEG-ezett TAR1–5–19 hatékonyságának vizsgálata az arthiritis egy profilaktikus modelljében A Tg197 jelû egerek az emberi TNF-globin hibrid génjére transzgénikusak, és 4–7 hetes korú heterozigótákban krónikus, progresszív, a reumatoid arthritisnél szokásos szövettani sajátságokat mutató polyarthritis alakul ki [Keffer, Probert, Cazlaris, Georgopoulos, Kaslaris, Kioussis, Kollias, Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J., 10, 4025–4031 (1991)]. A PEG-ezett dAb [PEG-formátum: 2×20 k elágazó, 2 kapcsolási hely a dAb számára (azaz, 40K mPEG2 MAL2), aAb: TAR1–5–19 cys] arthritist meg-

45

50

55

60 65

elõzõ hatékonyságának Tg197 modelljében való teszteléséhez heterozigóta transzgénikus egereket 10¹10 állatból álló, hímeket és nõstényeket azonos számban tartalmazó csoportokra osztottunk. A kezelést 3 hetes korban végeztük, a tesztelendõ anyagok heti intraperitoneális injektálásával. A monomer TAR2–10–27cys PEG-ezése az 1.3.3 részben, az 1. példában körvonalazottak szerint történt. Minden fehérjekészítmény foszfáttal pufferelt sóoldatban volt feloldva és elfogadható szintû endotoxin jelenlétére nézve mindet leteszteltük. A vizsgálat „vak” vizsgálat volt. Az állatokat hetente lemértük és az arthritis makrofenotikus jeleire nézve az alábbi rendszer szerint pontoztuk: 0= nincs arthritis (normális megjelenés és görbület), 1= enyhe arthritis (ízületi torzulás), 2= közepes arthritis (duzzanat, deformált ízület), 3= súlyos arthritis (súlyosan károsodott mozgás). A vizsgálat kimenete egyértelmûen demonstrálta, hogy 10 mg/kg PEG-ezett TAR1–5–19 gátolta az arth-

1

HU 004 725 T2

ritis kialakulását (a sóoldatos kontroll és a kezelt csoport arthritis pontszámai között szignifikáns különbség állt fenn). Az 1 mg/kg¹os dózisú PEG-ezett TAR1–5–19 is a sóoldatos kontrollénál statisztikailag szignifikáns alacsonyabb átlagos arthritis pontszámot eredményezett (P<0,05%, a Wilcoxon-teszt normális megközelítése). 18. példa: A PEG-ezett TAR1–5–19 hatékonyságának vizsgálata az arthiritis egy terápiás modelljében A PEG-ezett dAb hatékonyságának az arthritis terápiás modelljében, a Tg197 modellben való teszteléséhez heterozigóta transzgénikus egereket 10¹10 állatból álló, hímeket és nõstényeket azonos számban tartalmazó csoportokra osztottunk. A kezeléseket 6 hetes korban kezdtük, amikor az állatokban már szignifikáns arthritis fenotípusok alakultak ki. A kezeléseket hetente kétszer, a tesztelendõ anyag 4,6 mg/kg dózisának intraperitoneális injekcióként való beadásával végeztük. A mintakészítés és a betegség pontozása a fenti 17. példában leírtak szerint történt. Az arthritis pontozása egyértelmûen demonstrálta, hogy a PEG-ezett TAR1–5–19 gátolta az arthritis progresszióját a terápiás modellben. Az 4,6 mg/kg¹os dózisú PEG-ezett TAR1–5–19 is a sóoldatos kontrollénál statisztikailag szignifikáns alacsonyabb átlagos arthritis pontszámot eredményezett a 9. héten (P<0,05%, a Wilcoxon-teszt normális megközelítésével). 19. példa: dAb hatékonysága lassú felszabadulást biztosító formátumban Lassú felszabadulást biztosító formátumból származó dAb hatékonyságának teszteléséhez, kis PEGmolekulával kapcsolt dAb¹t (ahol, a PEG 4×5 k volt), négy kötõhellyel a C¹terminális ciszteint tartalmazó dAb számára, a dAb TAR1–5–19 volt (azaz, 20K PEG 4¹karos MAL) töltöttünk egy 0,2 ml¹es ozmotikus pumpába. A fentiekben leírt terápiás Tg197 modellben, a 0,2 ml/4 hét felszabadítási arányú pumpát 6 hetes korú egerekbe szubkután implantáltuk. Ezen állatok arthritis pontszámai egyértelmûen lassabb mértékben növekedtek, mint az olyan állatoké, amelyekbe sóoldattal töltött pumpát implantáltunk. Ez az eredmény demonstrálja, hogy a dAb¹k lassú felszabadulást biztosító formátumban beadva is hatékonyak. 20. példa: VH és VL dAb¹ok PEG-ezése TCEP redukálóágens alkalmazásával Az 1.3. példában körvonalazott eljárásokban, MAL PEG-ezés elõtt a dAb felszíni tiolcsoportjainak redukálására ditiotreitolt (DTT) alkalmazunk. Ebben az eljárásban a PEG-ezés elõtt nem kell a redukálóágenst gélszûréssel vagy dialízissel eltávolítani, mivel a DTT még alacsony pH¹nál is gyorsan reagál a maleimidPEG-gel, megelõzve ezzel a polimer-dAb-konjugátum kialakulását. Egy alternatív eljárás az, ha valamilyen redukálóágenst, például TCEP, alkalmazunk. Redukciós potenciálja miatt, a TCEP alacsonyabb koncentrációkban is alkalmazható és viszonylag lassan reagál a

5

2

szabad maleimidet elõnyösen redukáló tiolokkal. Ennek megfelelõen, a dAb¹ok felszínén jelen lévõ tiol redukálható TCEP-pel és a MAL-PEG¹et közvetlenül a reakciókeverékhez adjuk. PEG-ezés elõtt nem kell a TCEP¹t gélszûréssel eltávolítani. A TCEP-redukciót követõ MAL-PEG hozzáadását ismételt ciklusokban is el lehet végezni a PEG-ezett dAb kitermelésének szignifikáns növelése céljából.

21. példa: VH és VL dAb¹ok N¹terminális PEGezése A VH és VL dAb¹ok PEG-ezésének egy alternatív módja, ha a PEG-ezést az N¹terminálison végezzük. Ez kétféleképpen érhetõ el: elõször, PEG-aldehid al15 kalmazásával, amelyet megfelelõ reakciókörülmények mellett alkalmazni lehet a fehérje N¹terminális aminjének szelektív módosítására. Ez azért lehetséges, mert az N¹terminális aminnak viszonylag alacsony a pKa-értéke (pKa ~6,5). Másodszor, MAL-PEG alkalmazásával 20 végzendõ irányított PEG-ezéshez, génsebészeti úton be lehet vinni cisztein aminosavat a fehérje N¹terminálisán. A fehérjét TCEP vagy DTT alkalmazásával (lásd 1.3. példa) redukálni lehet a PEG-MAL kívánt helyre való kapcsolása elõtt. 25 10

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Egy vagy két antitesteredetû, variábilis egydo30 mént tartalmazó, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 200 kDa és a PEG összmérete 20–60 kDa, ahol a hidrodinamikai méret Superose 6 HR vagy 12 HR gélkromatográfiás oszloppal lett meghatározva, 1,5 mg/ml polipeptidkon35 centráció és 0,5 ml/min áramlási sebesség mellett; és ahol mindegyik variábilis domén tartalmaz vázrégiót és mindegyik variábilis doménnek van antigénkötõhelye, és mindegyik variábilis domén a polipeptidben lévõ, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént, és 40 ahol a PEG az egy vagy két antitesteredetû, variábilis egydomén vázrégióiban lévõ aminosavon keresztül a polipeptidhez kötött, egy vagy több molekulaként van jelen. 2. Az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt poli45 peptid, amely antitesteredetû, variábilis egydomének multimerjét tartalmazza, és ahol a PEG összmérete 20–60 kDa. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol minden variábilis régió univerzális 50 vázat tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol minden variábilis régió a DP47, DP45 és DP38 alkotta csoportból választott VH vázat tartalmaz vagy VL vázat tartalmaz, amely DPK9. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti, PEG-gel kap55 csolt polipeptid, ahol a polipeptid aTNF¹re specifikus. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménhez az antitesteredetû, variábilis egydo60 mén cisztein vagy lizin aminosavához kapcsolódik. 66

1

HU 004 725 T2

7. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán található. 8. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a variábilis domén vázrégiójában, az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ régióban lévõ cisztein vagy lizin aminosavnál kapcsolódik. 9. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a 22. vagy 65. pozícióban lévõ cisztein aminosavnál, vagy a C¹ és/vagy N¹terminálistól legalább két aminosav távolságra lévõ lizin aminosavnál kapcsolódik. 10. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptid olyan DP47 VH vázat tartalmaz, amely a 22. vagy 65. pozíciójában lévõ cisztein aminosavnál vagy a 43., 65., 76. vagy 98. pozíciója közül egy vagy több pozícióban található lizin aminosavnál PEG-hez kapcsolódik. 11. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptid olyan DPK.9 Vk vázat tartalmaz, amely a 23. vagy 88. pozíciójában lévõ cisztein aminosavnál vagy a 39., 42., 45., 103. vagy 107. pozíciója közül egy vagy több pozícióban található lizin aminosavnál PEG-hez kapcsolódik. 12. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely a 13., 14., 15., 41., 42., 43., 62., 65., 87., 88., 89., 112., 115., 117., 119. és 120. pozíciók alkotta csoportból választott egy vagy több pozícióban lévõ cisztein vagy lizin aminosavhoz kapcsolt PEG¹et hordozó VH dAb¹ot tartalmaz. 13. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely a 15., 40., 41., 56., 57., 60., 80., 81., 100., 107. és 108. pozíciók alkotta csoportból választott egy vagy több pozícióban lévõ cisztein vagy lizin aminosavhoz kapcsolt PEG¹et hordozó Vk dAb¹ot tartalmaz. 14. A 6. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG a Gln13, Pro41 vagy Leu115 csoportból választott pozíciónál szubsztituált cisztein vagy lizin aminosavat tartalmazó nehézlánc-eredetû variábilis doménhez van kapcsolva. 15. Az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amelynek 1,3 és 170 óra közötti féléletideje van. 16. A 2. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt multimer, ahol a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének dimerje, trimerje vagy tetramerje. 17. A 2. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely antitesteredetû, variábilis egydomének homomultimerjét tartalmazza. 18. A 17. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a homomultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a homodimer második antitesteredetû variábilis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 67

2

egydoménje antitesteredetû variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. 19. A 2. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely antitesteredetû, variábilis egydomének heteromultimerjét tartalmazza. 20. A 19. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a heteromultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a heteromultimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. 21. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG-csoport elágazó PEG. 22. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, amely egy adott célantigént 80 nM–30 pM Kd-értékkel specifikusan köt. 23. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, amely egy adott célantigént 3 nM–30 pM Kd-értékkel specifikusan köt. 24. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, amely egy adott célantigént 100 nM–30 pM Kd-értékkel specifikusan köt. 25. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, amely felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározva 50 nM–20 pM disszociációs konstanssal (Kd) és 5×10–7–1×10–7 s–1 Koff sebességi állandóval disszociál le emberi aTNF-rõl. 26. A 25. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a kötõdést a PEG-gel kapcsolt polipeptid emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. 27. A 26. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG-gel kapcsolt polipeptid, standard sejtes vizsgálatban, 500 nM–50 pM ND50-értékkel neutralizál emberi aTNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. 28. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG PEG-gel kapcsolt aktív N¹hidroxil-szukcimid-észter formájában kapcsolódik valamelyik, oldószer által elérhetõ lizinhez. 29. A 28. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol az aktív N¹hidroxil-szukcimid-észter az alábbi csoportból választott: PEG–O–CH2CH2CH2–CO2–NHS; PEG–O–CH2–NHS; PEG–O–CH2CH2–CO2–NHS; PEG–S–CH2CH2–CO–NHS; PEG–O2CNH–CH(R)–CO2–NHS; PEG–NHCO–CH2CH2–CO–NHS; és PEG–O–CH2CO2–NHS; ahol R jelentése ((CH2)4)NHCO2(mPEG). 30. Az 1–27. igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG oldószer által elérhetõ ciszteinhez van kapcsolva az alábbi csoportból választott, szulfihidrilre szelektív reagenssel: maleimid, vinil-szulfon és tiol.

1

HU 004 725 T2

31. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptidben a PEG összmérete 20–40 kDa. 32. A 31. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptidben a PEG összmérete 20 vagy 40 kDa. 33. A 31. vagy 32. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a PEG egyetlen polimerként van jelen. 34. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, amely az alábbiak egyikére kötési specificitást mutat: ApoE, Apo-SAA, BDNF, kardiotrofin–1, EGF, EGFreceptor, ENA–78, Eotaxin, Eotaxin–2, Exodus–2, savas FGF, bázikus FGF, fibroblaszteredetû növekedési faktor 10, FLT3 ligandum, Fraktalkin (CX3C), GDNF, G–CSF, GM–CSF, GF¹b1, inzulin, gIFN, IGF–I, IGF–II, IL–1a, IL–1b, IL–2, IL–3, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–8, IL–9, IL–10, IL–11, IL–12, IL–13, IL–15, IL–16, IL–17, IL–18, aInhibin, bInhibin, IP–10, keratinocitaeredetû növekedési faktor–2, KGF, Leptin, LIF, Limfotaktin, Mülleri inhibitorszubsztancia („Mullerian inhibitory substance”), monocitaeredetû telepgátló faktor, monocitaeredetû attraktáns fehérje, M–CSF, MDC, MCP–1, MCP–2, MCP–3, MCP–4, MIG, aMIP–1, bMIP–1, aMIP–3, bMIP–3, MIP–4, mieloideredetû progenitorinhibitor-faktor–1, bNGF, NT–3, NT–4, Onkosztatin M, PDGF¹AA, PDGF¹AB, PDGF¹BB, PF–4, RANTES, SDF1a, SDF1b, SCF, SCGF, õssejt-faktor (SCF), TARC, TACE felismerési hely, aTGF, bTGF, bTGF 2, bTGF 3, TNF, aTNF, bTNF, TNF receptor I, TNF receptor II, TNIL–1, TPO, VEGF, VEGF-receptor 1, VEGF-receptor 2, VEGF-receptor 3, GCP–2,

5

10

15

20

25

30

68

2

GRO/MGSA, bGRO, gGRO, HCC1, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, IL–1R, IL–6R, IL–10R, és IL–18R. 35. A 19. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely polipeptidnek kettõs kötõspecificitása van és az alábbi párok alkotta csoportból választott célhoz kötõdik: TNF/bTGF, TNF/IL–1, TNF/IL–2, TNF/IL–3, TNF/IL–4, TNF/IL–6, TNF/IL–8, TNF/IL–10, TNF/IL–12, TNF/gIFN, IL–1/IL–8, IL–1/IL–10, IL–1/gIFN, IL–2/IL–3, IL–2/IL–4, IL–2/IL–5, IL–2/IL–6, IL–2/IL–7, IL–2/IL–10, IL–2/IL–12, IL–2/IL–15, IL–2/gIFN, IL–2/a/bIFN, IL–3/IL–4, IL–3/IL–5, IL–3/IL–6, IL–3/gIFN, IL–4/IL–5, IL–4/IL–6, IL–4/IL–10, IL–4/IL–12, IL–4/IL–13, IL–4/gIFN, IL–4/SCF, IL–5/IL–6, IL–5/gIFN, IL–6/IL–10, IL–6/IL–11, IL–6/gIFN, IL–10/IL–12, IL–10/gIFN, IL–12/IL–18, IL–12/gIFN, IL–18/gIFN, IL–18/gIFN és anti-TNF/anti–CD4. 36. A 31–35. igénypontok bármelyike szerinti, PEGgel kapcsolt polipeptid, ahol a dAb-nak vagy minden dAb-nak van aTNF¹re specifikus kötõhelye. 37. Gyógyászati készítmény, amely elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, PEG-gel kapcsolt polipeptidet és hordozót tartalmaz. 38. A 37. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a gyógyászati készítmény alkalmas orális beadásra vagy alkalmas az alábbi csoportból választott módon történõ parenterális beadásra: intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális injekció, implantáció, rektális és transzdermális beadás. 39. A 37. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a gyógyászati készítmény hosszan tartó felszabadulást biztosító parenterális vagy orális dozírozású készítmény.

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

69

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

70

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

71

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

72

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

73

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

74

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

75

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

76

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

77

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

78

HU 004 725 T2 Int. Cl.: C07K 16/24

79

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest