Az AT1 angiotenzin és más Gq-fehérjéhez kapcsolt receptorok hatása a CB1 kannabinoid receptor működésére
Doktori értekezés
Dr. Turu Gábor
Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar Élettani Intézet Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Hunyady László Dr. Várnai Péter Hivatalos bírálók: Dr. Szűcs Mária Dr. Kőhidai László Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Gyires Klára Dr. Monos Emil Dr. Nusser Zoltán
Budapest, 2008
1
1. TARTALOMJEGYZÉK 1.
TARTALOMJEGYZÉK............................................................................................................................. 2
2.
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK.............................................................................................................................. 3
3.
BEVEZETÉS ............................................................................................................................................... 5 3.1. AZ ENDOKANNABINOID RENDSZER MEGISMERÉSÉNEK TÖRTÉNETE ...................................................... 5 3.2. ENDOKANNABINOIDOK 3.2.1. Az anandamid.................................................................................................................................. 6 3.2.2. A 2-arachidonil-glicerol.................................................................................................................. 7 3.3. AZ ENDOKANNABINOIDOK KELETKEZÉSE ÉS LEBONTÁSA...................................................................... 8 3.3.1. Az anandamid metabolizmusa ......................................................................................................... 8 3.3.2. A 2-AG metabolizmusa.................................................................................................................. 10 3.3.3. Az endokannabinoidok keletkezésének szabályozása .................................................................... 12 3.4. AZ ENDOKANNABINOID RENDSZER SZEREPE A SZERVEZETBEN ........................................................... 13 3.4.1. A CB1R szerepe a központi idegrendszerben................................................................................. 13 3.4.2. A CB1R szerepe a szervezet energiaháztartásában ....................................................................... 15 3.4.3. Szív- és keringési rendszer ............................................................................................................ 16 3.4.4. Mindenhol szerepe van a kannabinoidoknak?............................................................................... 18 3.5. A CB1R RECEPTOR MŰKÖDÉSE............................................................................................................ 18 3.5.1. A CB1R jelátvitele.......................................................................................................................... 19 3.5.2. Konstitutív vagy bazális aktivitás? ................................................................................................ 22 3.6. AZ ANGIOTENZIN II ÉS RECEPTORAI ..................................................................................................... 27
4.
CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................................... 29
5.
MÓDSZEREK ........................................................................................................................................... 30 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8.
6.
A MUNKÁNK SORÁN HASZNÁLT ANYAGOK ......................................................................................... 30 PLAZMID KONSTRUKCIÓK ................................................................................................................... 30 SEJTTENYÉSZETEK FENNTARTÁSA ÉS TRANSZFEKTÁLÁSUK ................................................................ 31 KONFOKÁLIS LÉZER MIKROSZKÓPIA ................................................................................................... 31 A 2-AG TÖMEGSPEKTROMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA ......................................................................... 32 CITOPLAZMATIKUS CA2+ MÉRÉSEK ..................................................................................................... 32 BIOLUMINESZCENS REZONANCIA ENERGIATRANSZFER (BRET) VIZSGÁLATOK .................................. 33 STATISZTIKAI ANALÍZIS ÉS DÓZIS-HATÁS GÖRBEELEMZÉS .................................................................. 36
EREDMÉNYEK ........................................................................................................................................ 37 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8.
A CB1R AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE ENERGIATRANSZFER SEGÍTSÉGÉVEL ............................................. 37 AT1R STIMULÁLÁSÁVAL FOKOZHATÓ A CB1R AKTIVITÁSA ............................................................... 38 A CB1R AT1R ÁLTALI TRANSZAKTIVÁLÁSA PARAKRIN ÚTON IS LÉTREJÖHET .................................... 41 A CB1R β-ARRESZTIN2 KÖTÉSÉNEK JELLEMZÉSE ............................................................................... 43 PARAKRIN TRANSZAKTIVÁCIÓ MÉRÉSE β-ARRESZTIN KÖTÉS VIZSGÁLATÁVAL .................................. 47 AT1R STIMULÁLÁSÁVAL FOKOZÓDIK A CHO SEJTEK 2-AG TERMELÉSE ............................................ 49 CB1R TRANSZAKTIVÁLÁSA MÁS Gq -FEHÉRJÉHEZ KAPCSOLT RECEPTOROKKAL ................................. 50 A DAGL GÁTLÁSA CSÖKKENTI A CB1R BAZÁLIS AKTIVITÁSÁT ......................................................... 51
7.
MEGBESZÉLÉS ....................................................................................................................................... 55
8.
KÖVETKEZTETÉSEK............................................................................................................................ 61
9.
ÖSSZEFOGLALÓ .................................................................................................................................... 62
10.
SUMMARY ........................................................................................................................................... 63
11.
IRODALOMJEGYZÉK ...................................................................................................................... 64
12.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ............................................................................................ 86
13.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................................................. 87
2
2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
2-AG - 2-arachidonil-glicerol 7TMR – hét-transzmembrán receptor α1-AR - α1-adrenerg receptor αo-Rluc – Renilla luciferázzal jelölt αo heterotrimer G-fehérje alegység αo-CFP – ECFP-vel jelölt αo heterotrimer G-fehérje alegység Ang II – angiotenzin II BAPTA - (1,2-bis(o-aminophenoxi)etán-N,N,N',N'-tetraacetát) βarr2-GFP – EGFP-vel jelölt β-arresztin2 βarr2Rluc – Renilla luciferázzal jelölt β-arresztin2 B2R - B2 bradikinin receptor B
BRET – biolumineszcens rezonancia energia transzfer AT1R – AT1-es angiotenzin receptor AT1R-YFP – EYFP-vel jelölt AT1-es angiotenzin receptor AT2R – AT2-es angiotenzin receptor AT2R-YFP – EYFP-vel jelölt AT2-es angiotenzin receptor CB1R – CB1-es kannabinoid receptor CB1R-DR/AA - D214A és R215A mutációkat tartalmazó CB1R CB1R-DR/AA-RFP – mRFP-vel jelölt D214A és R215A mutációkat tartalmazó CB1R CB1R-RFP – mRFP-vel jelölt CB1-es kannabinoid receptor CB1R-YFP – EYFP-vel jelölt CB1-es kannabinoid receptor CB2R – CB1-es kannabinoid receptor CHO sejt – kínai hörcsög ováriumsejt COS-7 sejt – majom vese fibroblaszt sejt COX-2 - ciklooxigenáz-2 DAG - diacil-glicerol DAGL – DAG lipáz DSE - depolarization induced suppression of excitation DSI - depolarization induced suppression of inhibition ECFP – kék fluoreszcens fehérje EGFP – zöld fluoreszcens fehérje EYFP – sárga fluoreszcens fehérje
3
FAAH - zsírsav-amid hidroláz HEK-293 sejt – humán embrionális vesesejt HFD – high fat diet KO – knockout M1R – M1 acetil-kolin receptor M2R – M2 acetil-kolin receptor M3R – M3 acetil-kolin receptor M4R – M4 acetil-kolin receptor M5R – M5 acetil-kolin receptor MAGL – monoacil-glicerol lipáz mRFP – piros fluoreszcens fehérje NAPE - N-acil-foszfatidil-etanolamid NAPE-PLD – NAPE - foszfolipáz D NArPE - N-arachidonil-foszfatidil-etanolamin PMSF - phenylmethylsulphonyl fluorid PI3K - foszfatidil-inozitol-3-kináz PIP2 - foszfatidil-inozitol-biszfoszfát PLA - foszfolipáz A PLC – foszfolipáz C Rhod-Ang II – Rhodaminnal jelölt angiotenzin II Rluc – Renilla luciferáz SHR - Spontaneously hypertensive rat THC - 9Δ-tetrahydrocannabinol YFP-β1 – EYFP-vel jelölt β1 heterotrimer G-fehérje alegység V1R - V1 vazopresszin receptor
4
3. BEVEZETÉS Az endokannabinoid rendszert a kannabinoid receptorok, az endokannabinoidok és azok metabolizmusában szereplő enzimek alkotják. A rendszernek szerepe van számos fiziológiai és patofiziológiai folyamatban. Jelentőségét először az idegrendszerben ismerték fel, de egyre több adat utal arra, hogy a rendszer nem idegrendszer-specifikus, hanem számos egyéb szövetben is megtalálható minden eleme. A receptorokra ható gyógyszereket egyre több megbetegedés
kezelésében
kezdik
használni,
ami
a
területen
végzett
kutatások
felgyorsulásának eredménye. Az endokannabinoid rendszer egyes elemei potenciális farmakológiai célpontok, pontosabb megismerésük elősegítheti a hatékonyabb, célzottabban ható gyógyszerek kifejlesztését. 3.1. AZ
ENDOKANNABINOID
RENDSZER
MEGISMERÉSÉNEK
TÖRTÉNETE A marihuánát évezredek óta használják, mint élvezeti szert és gyógyszert. A vadkender (Cannabis sativa) különböző készítményeit régészeti leletek szerint már az ókorban is alkalmazták terápiás vagy rituális célokra (1). Kínában már i.e. 3000 – körül használták, és i.sz.
200
körül
fájdalomcsillapításra,
már
megjelenik
a
étvágygerjesztőnek,
kínai
gyógyszerkönyvben.
hányáscsillapításra,
A
vadkendert
lázcsillapítónak
és
nőgyógyászati célokra is használták (2). Az 1940-es években izolálták az első kannabiszszármazékokat, a kannabinolt és a kannabidiolt, majd ezek pontos kémiai struktúráját is meghatározták, azonban a marihuána pszichés hatásaiért nem ezek voltak felelősek (3). Jelentős előrelépést jelentett a kannabisz kutatásában a 9Δ-tetrahydrocannabinol (THC) felfedezése, ugyanis ez a vegyület felelős a marihuána pszichoaktív hatásaiért (4). A THC megismerését követően negyedévszázad kellett ahhoz, hogy megtalálják a vegyület támadáspontját a szervezetben (3). A THC hatásai közé tartoznak emberben az eufória, relaxáció, a vazodilatátor hatás következtében kialakuló reflex tachycardia és a hypothermia. Egerekben jellegzetes, in vivo farmakológiai kísérletekben felhasználható tünetegyüttest (tetrádot) hoz létre, ami hypothermiából, hypomotilitásból, analgéziából és katalepsziából áll (5). Sokáig vita volt arról, hogy ezeket a központi idegrendszeri hatásokat receptoron fejti ki, vagy egyszerűen biológiai membránokon nem specifikus módon, ugyanis a THC erősen lipofil tulajdonságú molekula. Receptor létezése mellett szólt, hogy a THC egyik
5
sztereoizomerje sokkal kisebb farmakológiai hatásúnak bizonyult. A receptor létezésének farmakológiai bizonyítását receptorkötési vizsgálatokban jelentősen nehezítette a THC erősen lipofilitása. 1988-ban egy szintetikus kannabinoid, a CP-55,940 segítségével azonban sikerült bizonyítani specifikus kötőhely jelenlétét patkányagyban (6). A CP-55,940 kevésbé lipofil vegyület, és triciált származéka megfelelőnek bizonyult a kompetíciós kötési vizsgálatokhoz (6). 1990-ben publikálták az első kannabinoid receptor, a CB1 (CB1R) klónozását patkányagyból (7), majd három év múlva szekvencia-homológia alapján megtalálták a második kannabinoid receptort is, a CB2-t (CB1R) (8). Az IUPHAR (International Union of Basic and Clinical Pharmacology) jelenlegi nomenklatúrája szerint jelenleg ezt a két, héttranszmembrán szerkezetű fehérjét (7TMR) nevezzük kannabinoid receptornak (9). Egyre több adat szól azonban amellett, hogy más receptorok is szerepelnek a kannabinoidok hatásában (10), pl. a korábban orphan receptorként leírt GPR55 is közvetít kannabinoid hatásokat (11;12). A receptorok megismerését megelőzően kannabinoidoknak a Cannabis sativában található hatóanyagokat nevezték, azonban a kilencvenes évektől már kannabinoidnak nevezünk minden olyan vegyületet, ami a kannabinoid receptorokhoz (CB1R és
CB2R)
kötődik.
A
receptorok
felfedezését
követően
az
endogén
ligandok
(endokannabinoidok) keresése is megkezdődött. Az első endokannabinoidot, az anandamidot (N-arachidoniletanolamin) sertésagyból izolálták 1992-ben (13), majd ezt követte a 2arachidonil-glicerol (2-AG), mint CB1R és CB2R agonista leírása (14-16). Az említett két legismertebb endokannabinoid mellett azonban egyéb lipid természetű vegyületek is rendelkeznek több-kevesebb kannabinoid hatással, mint pl. a virodhamin, a noladin-éter, az arachidonildopamin és az inverz agonistaként leírt peptid, a hemopresszin. Ezeknek a vegyületeknek a fiziológiás szerepe azonban egyelőre nem tisztázott (3). 3.2. ENDOKANNABINOIDOK 3.2.1.
Az anandamid
Az anandamid felfedezésénél abból a feltételezésből indultak ki, hogy az endogén agonista is valószínűleg egy lipid természetű vegyület. Az izolálás kloroform-metanolos agyi extraktumból történt (13). Az anandamid elnevezés a szanszkrit „ananda” (öröm, boldogság) és a kémiai szerkezetre utaló amid szavak összetételéből ered. Kötődik CB1 és CB2 receptorhoz is és aktiválja őket, sőt az utóbbi időben a kannabinoid receptorokhoz sorolt GPR55-t is. Nagyobb affinitással kötődik a CB1R-hoz, mint a CB2R-hoz, a KD mindkét B
6
receptor esetében tizedmikromoláros koncentrációtartományban van (17). A különböző kísérletekben meghatározott Ki és EC50 jelentős mértékben eltérhet a nagy lipofilitásnak köszönhetően, hiszen a tényleges ligandkoncentráció a méréskor jelentősen függhet a kísérleti körülményektől, mint amilyen pl. az albumin koncentrációja és a méréshez használt eszközök anyaga (17). A CB1 és CB2 receptorokon parciális agonistaként hat, szemben a teljes agonista 2-AG-val. Létrehozza azokat a az in vivo hatásokat melyeket a THC is (18;19). Az anandamidnak nem a jelenlegi kannabinoid receptorok a kizárólagos támadáspontjai, mert pl. ioncsatorna vanilloid receptort (TRPV1) is aktivál, illetve egyéb ioncsatornák működését is befolyásolhatja (20;21).
1. ábra Az anandamid szerkezete
3.2.2.
A 2-arachidonil-glicerol
A 2-AG volt a következő molekula, amelyet endokannabinoidként ismertek fel. Napjainkban sokan ezt tekintik a fő endokannabinoidnak (22). A 2-AG termelődését trombin hatására vérlemezkékben már 1983-ban leírták, trombin hatására foszfolipáz C által mediált arachidonsav felszabadulásban mint köztitermék jelent meg (23). Keletkezéséről később ugyancsak beszámoltak PDGF-stimulált Swiss 3T3 sejtekben (24) és bradikininnel stimulált hátsó-gyöki neuronokban (25), azonban csak 1995-ben derült ki, hogy a 2-AG valójában a CB1- és CB2 receptorok agonistája (14-16). Az affinitása ezekhez a receptorokhoz jóval kisebb (mikromoláros KD), a különböző kísérletekben mért értékek ez esetben is igen nagy szórást mutatnak (16;17). A pontos meghatározást nehezíti ez esetben még az is, hogy a 2-AG gyorsan degradálódik. Ennek megfelelően nagyobb affinitást lehetett kimérni, ha észterázgátlókkal gátolták a 2-AG lebomlását (22). Mindenesetre a különböző szövetekben igen nagy a 2-AG koncentráció (22), a legtöbb helyen mikromoláros koncentrációtartományban. Tehát fiziológiásan is létrejöhet olyan koncentráció a szövetekben, ami elegendő a kannabinoid receptorok stimulálásához. Az anandamiddal szemben a 2-AG nem stimulálja a TRPV1-et, a GRP55 esetében pedig még nem teljesen tisztázott a szerepe (11;12).
2. ábra A 2-AG szerkezete
7
3.3. AZ ENDOKANNABINOIDOK KELETKEZÉSE ÉS LEBONTÁSA
3.3.1.
Az anandamid metabolizmusa
Az anandamid szintézisében több útvonal is lehetséges (3. ábra). Az elsőt agyszövetben írták le, ahol arachidonsav és etanolamid kondenzációját egy „anandamid szintáz” katalizálta (26), amiről a későbbiekben kiderült, hogy ez az enzim a zsírsav-amid hidroláz (fatty acid amid hydrolase, FAAH). Az enzim valójában nem a szintézist, hanem az anandamid degradációját katalizálja. Szintézist csak nagyon magas arachidonsav és etanolamid koncentrációk mellett lehetett megfigyelni, azonban ilyen koncentrációban ezek a vegyületek nem találhatók meg a szövetekben (27;28). Egy másik útvonal során, mely fiziológiás körülmények között is lejátszódhat, az N-arachidonil-foszfatidil-etanolamin (NArPE) foszfolipáz D általi hidrolízise során keletkezik az anandamid (29). A NArPE foszfatidiletanolamidból keletkezik egy acilcsoport (arachidonsav egy foszfolipid sn-1 pozíciójából) transzferével, amit egy N-aciltranszferáz katalizál (3. ábra), az enzimaktivitás fokozható Ca2+-al (30-33). Jelenleg a két enzim közül a foszfolipáz D-t azonosították molekuláris szinten (NAPE-PLD), ami különbözik a korábban ismert foszfolipáz D enzimektől (34). Az enzimaktivitást a Ca2+ fokozza, és szubsztrátként nem csak a NArPE, hanem más N-acilfoszfatidil-etanolamin lipidek is szerepelhetnek, melyekből további N-acil-etanolamid molekulák keletkeznek (34). A NArPE kimutatható mennyiségben van jelen a különböző szövetekben, ami lehetővé teszi ezen folyamatok lezajlását fiziológiás körülmények között is (29;30;32). A NAPE-PLD túlexpresszálása az anandamid mennyiségét növeli, a NArPE mennyiségét pedig csökkenti a sejtekben (35), ami az enzim szerepét megerősíti a szintézisben. Egy további lehetséges út az NArPE két lépésben történő hidrolízise. Az első lépést foszfolipáz A2 enzim katalizálja, majd a következő lépésben a keletkezett N-arachidonillizofoszfatidil-etanolamidból hasad le az anandamid egy lizo-foszfolipáz D katalizálásával (36). Másik lehetőség az N-acil-foszfatidil-etanolamid (NAPE) kétlépéses hidrolízise, mely során előbb egy foszfolipáz C (PLC) foszfatidil-anandamiot képez, majd egy foszfatáz (PTPN22) hatására keletkezik az anandamid (37).
8
3. ábra Az anandamid biszintézisének lehetséges útvonalai. Az ábrán használt, máshol nem definiált rövidítések: AEA – anandamid; PE – foszfatidil-etanolamin; NA-lizo-PE – N-arachidonil-lizofoszfatidil-etanolamidból, pAEA- foszfatidil-anandamid.
Az anandamid lebontásában legfontosabb szerepe a FAAH-nak van (4. ábra). A membránhoz kötött FAAH az amidáz enzimek csoportjába tartozik, 1996-ban azonosították a fehérjét (38). A FAAH anandamidon kívül egyéb zsírsav-amidokat és észtereket is hidrolizál, köztük a 2-AG-t is (39). FAAH knockout (KO) egerekben az anandamid mennyisége megnövekedett számos agyi területen, és ilyen állatoknak adott anandamid markánsabb CB1R általi hatásokat hoz létre. A KO egerek szöveteiben az anandamid hidrolízise a vad típusúakéhoz képest 50-100 szoros csökkenést mutatott (40;41). A metabolizációban, habár kisebb jelentőségűnek tűnnek, egyéb enzimek is szerepelhetnek, mint pl. a ciklooxigenáz-2 (COX-2) vagy különböző lipoxigenázok (42).
9
4. ábra Az anandamid lebontásában szereplő lehetséges útvonalak Az ábrán használt, a szövegben nem definiált rövidítések: PG-EA – prosztaglandin-etanolamid; HAEA – anandamid hidroxi származékok, EA – etanolamid; AA – arachidonsav, LOX - lipoxigenáz.
Bár az anandamid volt az elsőnek leírt endokannabinoid, ma már sokan megkérdőjelezik, hogy tényleg ez a vegyület lenne a CB1 és CB2 receptorok endogén agonistája (22). Emellett szól az, hogy az anandamid koncentrációja különböző szövetekben igen alacsony, azonban az nem zárható ki, hogy lokálisan, kis területeken magas koncentrációban van jelen. Kalcium jelre növekszik a szintézise, ez azonban nem növeli jelentősen az anandamid koncentrációját. Az anandamid csak parciális agonistaként hat a CB1- és CB2 receptorokra, ami szintén felveti annak lehetőségét, hogy nem ez az elsődleges ligand (22).
3.3.2.
A 2-AG metabolizmusa
A 2-AG szintézisében is több útvonalat ismerünk (5. ábra). A 2-AG keletkezés fő útvonala az sn-2 pozícióban arachidonsavat tartalmazó diacil-glicerol (DAG) hidrolízise, amit sn-1-szelektív DAG lipáz (DAGL) katalizál. Molekuláris szinten két DAGL-t azonosítottak, a DAGLα-t és a DAGLβ-t (43). A DAGLα és β membránhoz kötött enzimek, az enzimaktivitásukat a Ca2+ fokozza (43). A DAG foszfatidil-inozitol-biszfoszfátból (PIP2) keletkezik PLC enzim hatására. A membrán PIP2 sn-2 pozíciójában általában arachidonsav található (44), ami megfelelő szubsztrátot jelent a 2-AG szintézishez. Egy másik lehetőség a 2-AG termelődésére, hogy foszfolipáz A (PLA) hatására lizofoszfolipid, majd ezt követő
10
lizoPLC aktivitással 2-AG keletkezik (16). Bizonyos körülmények között a 2-AG szintézise történhet lizofoszfatidsavból egy foszfatáz hatására (45), vagy foszfatidsav hidrolízisével is (46;47). A számos lehetséges útvonal közül jelenleg a PLCβ - DAGL enzimeknek tulajdonítanak fontosabb szerepet (42;48).
5. ábra A 2-AG keletkezésében szereplő lehetséges útvonalak Az ábrán használt, a szövegben nem definiált rövidítések: PI - foszfatidil-inozitol; LPA – lizofoszfatidsav; lizo-PI – 1-lizo 2-arachidonil-foszfatidil-inozitol
A 2-AG lebontásában több lehetséges útvonalat is ismerünk (6. ábra) (42;49). A folyamatban monoacil-glicerol lipáz (MAGL) szerepel, azonban az enzimaktivitásért több másik enzim is felelős lehet. A MAGL-t először emberben és egérben azonosították molekuláris szinten (50;51), majd patkányban is (52). További enzimek fontos szerepére utal az a megfigyelés, hogy a MAGL csak mintegy 50%-ban felelős a 2-AG hidrolíziséért patkányagyban (53). Az anandamid lebontásában szereplő FAAH is képes 2-AG-t bontani (39). Olyan állatokban azonban amelyekben FAAH enzimet gátolták a 2-AG mennyisége az agyban nem növekedett (40;54;55), és FAAH KO állatokban a 2-AG hatása nem fokozódik (56). Ez azonban ez nem zárja ki a FAAH szerepét a fiziológiás metabolizmusban, hiszen hiánya esetén más enzimek átvehetik a szerepét. A 2-AG átalakításában szerepet játszhat még a COX-2 is (57;58). 11
6. ábra A 2-AG lebontásában szereplő lehetséges útvonalak Az ábrán használt, a szövegben nem definiált rövidítések: PG-G – prosztaglandin G; GL – glicerin, AA – arachidonsav.
3.3.3. Az endokannabinoidok keletkezésének szabályozása Az anandamid keletkezésének szabályozásában az extracelluláris vagy intracelluláris eredetű Ca2+ szerepel (59). A Ca2+ közvetlenül szabályozza a szintézisben szereplő enzimeket, és Gq/11 KO állatokban is létrejön anandamid termelődés-fokozódás Ca2+ jel hatására. Ugyanakkor, a bazális anandamid termelődésben szerepe lehet a Gq/11-fehérjéknek (60). A 2-AG keletkezés szabályozásának molekuláris mechanizmusáról is főleg neuronok vizsgálata alapján van ismeretünk. Neuronokban a 2-AG termelődése létrejöhet depolarizáció hatására (22;61-64), vagy bizonyos Gq/11-kapcsolt receptorok serkentését követően (65;66). Neuronokban a DAGL a posztszinaptikus membránban helyezkedik el felnőtt patkányokban (43). A Gq/11-kapcsolt 7TMR-ok esetében a 2-AG termelődés egy kálcium kelátor, a BAPTA jelenlétében is megtörténik, ami arra utal, hogy nem Ca2+-függő (65;66), szemben a DSI-vel (59;67;68). Egy újabb közlemény szerint a két lehetséges folyamatban a PLCβ szabályozása jelenti a kapcsolatot. A megemelkedett Ca2+ aktiválja az enzimet, csakúgy, mint a Gq/11fehérjék aktiválódása (69). Amennyiben 2-AG termelés szempontjából küszöb alatti ingereket (depolarizáció és metabotróp receptor stimulálása) alkalmazunk egyszerre, a PLCβ koincidencia detektorként működik, és a két hatás eredőjeként a kannabinoid termelődés fokozódik. Gq/11 KO állatok agyszövetében a bazális 2-AG mennyiség ugyan nem tér el a vad
12
típusú állatokétól, azonban depolarizáció és Ca2+ jel hatására nem fokozódik a termelődése. A bazális agyi 2-AG termelésben felmerülhet azonban a Gq/11-hez kapcsolt PLCβ-tól eltérő PLC izoformák szerepe (60). 3.4. AZ
ENDOKANNABINOID
RENDSZER
SZEREPE
A
SZERVEZETBEN
3.4.1.
A CB1R szerepe a központi idegrendszerben
A központi idegrendszerben legnagyobb mennyiségben expresszálódó 7TMR a CB1R. A CB1R markáns központi idegrendszeri expressziója megfelel a jellegzetes idegrendszeri kannabinoid hatásoknak, melyek kísérleti állatokban kannabinoidok adásával előidézhetők (hypothermia,
hypomotilitás,
analgézia
és
katalepszia,
a
jellegzetes
tetrád).
A
mozgáskontrollban szereplő két régió, a bazális ganglionok és a cerebellum markáns CB1R expressziót mutat. A limbikus rendszerben, az amygdalában, a frontális kéregben igen nagy számban expresszálódik CB1R, ami megfelelhet a kannabinoidok ismert analgetikus és emocionális hatásainak. Kisebb mértékben, de kimutathatóan expresszálódik egyéb fájdalomban szereplő régiókban is, mint a periaquaductális területen és a gerincvelő hátsó szarvban (70). További jellegzetes farmakológiai hatása a kannabinoidoknak, hogy jelentős mértékben rontanak bizonyos kognitív funkciókat, mint pl. a rövid távú memória és a figyelem (71). A CB1R markáns expressziója a hippocampusban és egyéb kortikális területeken megfelelhet ennek a megfigyelésnek (72). A CB1R expressziója azonban nem korlátozódik ezekre a területekre, hiszen az agy számos területén megtalálható kisebbnagyobb denzitásban (72), és egyre több központi idegrendszeri funkcióban mutatják ki a kannabinoid rendszer szerepét (59). A CB1R-t legnagyobb mértékben expresszáló területen, a kortikális
régiókban,
a
receptor
elhelyezkedése
jellegzetes:
főleg
GABA-erg
interneuronokban található. A GABA-erg neuronoknak két fő csoportját különböztetik meg, a CCK-t expresszáló és a parvalbumint expresszáló GABA-erg interneuronokat. A CB1R expressziója ezek közül a CCK-pozitív neuronokra korlátozódik (70). Más szövetekben, területtől függően más-más neuronokon is megtalálható, pl. a kisagyban expresszálják a glutamáterg granuláris sejtek is (73). A receptor jellegzetesen a neuronok axonján, illetve axonterminálisán helyezkedik el (70). A szubcelluláris lokalizáció kialakulásában szerepet tulajdonítanak a CB1R konstitutív internalizációjának, ami nem axonális területekről az axon
13
felé irányítja a receptorokat (74). Stimulálása gátolja különböző neurotranszmitterek felszabadulását, mint a GABA, glutamát, acetil-kolin, NA, szerotonin és CCK (70). A gátlásban szerepet játszik a CB1R által létrehozott N-, P- és Q-típusú kalciumcsatornák gátlása (lásd alább). A preszinaptikus elhelyezkedés és a neurotranszmitter-felszabadulás gátlása az alapja
a
jellegzetes
gátláscsökkentésnek
endocannabinoid
(depolarization
hatásnak,
induced
a
depolarizáció
suppression
of
által
inhibition,
kiváltott DSI)
és
excitációgátlásnak (depolarization induced suppression of excitation, DSE). A DSI-t a kilencvenes évek elején írták le (75;76). Akciós-potenciál sorozat, vagy tartós posztszinaptikus depolarizáció (tizedmásodperces, másodperces időtartam) átmenetileg gátolta a posztszinaptikus neuronban a GABA által kiváltott inhibitoros posztszinaptikus áramokat. A jelenség hátterében, mint kiderült endokannabinoidok általi retrográd szignalizáció áll (77;78). A posztszinaptikus sejtből endokannabinoidok keletkeznek depolarizáció hatására, ami a preszinaptikusan elhelyezkedő CB1R-okra hatva által gátolja a GABA (DSI) vagy glutamát (DSE) felszabadulást. A folyamatban Ca2+ hatására szabadul fel az endokannabinoid, mert a válasz Ca2+ kelátorokkal gátolható (67;68).
CB1R
elhelyezkedése Gi/o
Gi/o á tam u l g
7. ábra A CB1R jellegzetes
CB1R
t
eCB
GA B
Depolarizáció, Ca2+, Gq/11
a
központi
idegrendszerben A
A posztszinaptikus sejtből depolarizáció, kalcium jel, vagy Gq/11-kapcsolt 7TMR-ok stimulálására endokannabinoidok (eCB) szabadulnak fel, amelyek a preszinaptikus membránban elhelyezkedő Gi/o-kapcsolt CB1R stimulálásával gátolják a transzmitterek felszabadulását.
. A GABA illetve glutamát felszabadulás retrográd gátlása létrejöhet posztszinaptikus kolinerg és metabotróp glutamát receptorok stimulálásával is (65;66). A mechanizmust kalciumfüggetlennek írták le először (65;66), azonban úgy tűnik, hogy kis mértékű stimulálás esetén kalcium jel is szükséges az endokannabinoid felszabaduláshoz (69).
14
3.4.2.
A CB1R szerepe a szervezet energiaháztartásában
A kannabinoidok az energiaháztartás szabályozásában számos helyen szerepet játszanak. A CB1R gátlása rimonabanttal (SR141716A, CB1R antagonista) számos klinikai vizsgálatban hatékonyan csökkentette a testsúlyt és a kardiovaszkuláris megbetegedések kockázatát elhízott és diabéteszes betegekben (79-81). A rimonabant in vitro és in vivo kísérletekben is gátolta a zsírszövet növekedését, illetve a CB1R knockout állatokat nem lehet B
magas zsírtartalmú diétával felhizlalni (82-85). A kannabinoid receptorok számos helyen befolyásolják az energiaháztartást, szerepelnek pl. a hypothalamusban, táplálékfelvétel szabályozásában, a zsírszövet és máj metabolizmusában és a pancreas inzulintermelésében (86).
3.4.2.1. Centrális hatások A kannabinoidok a hypothalamusban az táplálékfelvétel stimulálásáért felelős, energiahomeosztázisban
szereplő
struktúrákat
stimulálják
(87)
illetve
részt
vesznek
a
táplálékfelvételhez szükséges motiváció létrejöttében is a nucleus accumbensben (88;89). Számos,
a
hypothalamusban
szereplő
táplálékfelvétel
szabályozásában
szereplő
neurotranszmitter felszabadulását és/vagy hatását befolyásolják, pl. növeli a neuropeptid Y felszabadulást (90) és felfüggeszti az α-MSH termelő proopiomelanokortin (POMC) neuronok GABAerg gátlását (91;92). A leptin hatásának közvetítésében szerepe van a hypotalamikus kannabinoid szintek csökkenésének (87). Expressziós rendszerben a CB1R fokozza az orexin-1 receptor általi Erk aktivációt, amit a receptorok dimerizációjával magyaráznak (93;94), és úgy tűnik a hypothalamusban is megfigyelhető kapcsolat a két receptor között (95). A táplálékfelvételben szereplő, gyomor-eredetű peptid hormon, a ghrelin hatására 2-AG termelődés fokozódik a hypothalamusban, és CB1R blokkolásával kivédhető a ghrelin táplálékfelvételt fokozó hatása (96;97). Összefoglalva elmondható, hogy a kannabinoidok a táplálékfelvétel fokozásában fontos szerepet játszanak.
3.4.2.2. Perifériás hatások Rimonabant kezelés során a kísérleti állatok táplálékfelvétele csak átmenetileg csökken, azonban az elhízást továbbra is gátolja, ami perifériás hatásokat feltételez (83). Számos
15
tanulmány kimutatta a kannabinoid rendszer elemeit a kísérleti állatok és az ember zsírszövetében (84;98-101). A CB1R gátlása leállítja a zsírsejtek proliferációját (102), stimulálása pedig fokozza a lipidcseppek képződését preadipocytákban és a zsírsejtek differenciálódását jelző marker, a PPAR-γ megjelenését (99). A CB1R aktiválása növeli egér zsírszövetben a lipoprotein lipáz aktivitást (103), ezzel fokozhatja a zsírsejtek zsírsavellátását, ami szükséges a trigliceridek szintéziséhez. A CB1R fokozza a zsírsejtek glükózfelvételét foszfatidil-inozitol-3-kináz
(PI3K)
aktiválásával
és
GLUT4
glukóztranszporter
transzlokációval (104). A CB1R expressziója a májban viszonylag kicsi (105), ennek ellenére egyre több adat utal arra, hogy a kannabinoidok és kannabinoid receptor antagonisták befolyásolhatják az intermedier anyagcserét a májban kifejtett hatásukkal (106). A rimonabant csökkentette elhízott patkányokban a máj szteatózisát (107). Magas zsírtartalmú diétán (high fat diet, HFD) tartott állatokban a máj anandamidtartalma már az elhízást megelőzően is megnő, továbbá fokozódik a CB1R expressziója is (108). Kannabinoidok hatására fokozódik a máj zsírsavszintézise
(109)
és
gátlásával
fokozni
lehet
a
glikogenolízist
(110).
Az
anyagcserehatások mellett a kannabinoidoknak a májban számos megbetegedés során lehet fontos szerepe, mint a cirrhosis és az akut májkárosodás (mint pl. az ischaemia) (111). A CB1R és a CB2R is megtalálható humán Langerhans sziget sejtjeiben, és CB1R stimulálásával fokozódik az inzulin és a glukagon szekréciója is in vitro (112). Az inzulinszekréció növelésében szerepe lehet a β-sejtekben kiváltott Ca2+ jelnek (113;114), azonban ez valószínűleg nem CB1R-, hanem CB2R-függő (113). Ezzel szemben egér Langerhans szigetekben csak CB1R mRNS-t találtak, és a CB1R-ok stimulálása gátolta a kalciumoszcillációkat és az inzulinszekréciót (115). HFD hatására fokozódik a pancreasban a 2-AG és az anandamid termelése egérben (116), és rimonabanttal gátolni lehet a szigetek pusztulását elhízott Zucker patkányokban (117).
3.4.3. Szív- és keringési rendszer A kannabinoid ligandok hatásairól a szív- és keringési rendszerben számos adat összegyűlt az elmúlt években, azonban kísérleti felállástól és kísérleti alanyoktól függően sok esetben igen eltérő eredmények születtek (118). Anandamid adását követően altatott kísérleti állatokban trifázisos válasz jelentkezik, egy kezdeti bradycardia és vérnyomásesés, amit egy átmeneti presszorválasz után egy újabb, de elnyújtott vérnyomáscsökkenés követ (119). A
16
vérnyomáscsökkenést fel lehet függeszteni CB1R blokkolóval, és valószínűleg szerepet játszik benne a szimpatikus tónus gátlása (120;121). Anandamid adásakor a hatásokban szerepet játszhatnak egyéb receptorok is, mint pl. a vanilloid receptor (122). 2-AG hatására szintén csökken a vérnyomás altatott patkányokban és egerekben, azonban ez tachycardiával párosult (123;124). A tachycardia ez esetben valószínűleg nem CB1R-on keresztül jön létre, hanem a 2-AG metabolizmusa során keletkező anyagok hatására (123;124). Egy szintetikus kannabinoid hatására (HU210) viszont jelentősen csökkent a perctérfogat altatott patkányokban, ami vérnyomásesést idéz elő (125). Ezt a hatást anandamiddal nem lehetett létrehozni. Éber patkányokban az anandamid bradycardiát, majd rövid depresszorhatást követően pedig hosszabb presszorhatást tapasztaltak (126-128). A hatás azonban nem volt minden esetben CB1R-függő, ugyanis egy részét a CB1R blokkolók nem védték ki, vagy pedig ciklooxigenáz gátlókkal meg lehetett előzni (126;128). A bradycardia vagustónus hatására jött létre, mert atropinnal gátolni lehetett (126;128). Szintetikus CB1R agonisták (WIN55,212-2, HU210) presszorválaszt hoznak létre a szimpatikus tónus növelésével (129), in vitro azonban gátolják a szimpatikus tónust (130). A beadott kannabinoidok területenként változóan vagy vazodilatációt vagy vazokonstrikciót hoznak létre (126-130). Egészséges patkányokban CB1R blokkolónak nem volt hatása a vérnyomásra és a regionális vérkeringésre, ami arra utal, hogy nyugalmi körülmények között az endokannabinoidok nem játszanak jelentős szerepet a vérnyomás szabályozásában (131;132). Hasonló következtetés vonható le a CB1R KO egerek vizsgálatából is (133). Spontán hipertenziós patkányokban azonban CB1R blokkolók adására markáns vérnyomás-emelkedés jön létre (131), ami arra utalhat, hogy patológiás körülmények között viszont szerepe lehet az endokannabinoidoknak a vérnyomás-szabályozásban. Izolált erekben a kannabinoidok általában vazodilatációt hoznak létre, de nagy különbségek figyelhetők meg szövettől, fajtól függően (134-136). Emberben, az állatmodellekkel ellentétben, kannabinoidok adására CB1R-on keresztül tachycardia jön létre, amit a megnövekedett keringő katekolamin hoz létre (137;138). További hatása, hogy a CB1R szívizomban közvetlen negatív inotróp hatású (139), ez a hatás szerepet játszhat abban, hogy CB1R agonisták javítják a szívinfarktus prognózisát állatmodellekben (140-142). Az elhízás növeli a magas vérnyomásnak és a kardiovaszkuláris megbetegedéseknek az esélyét (143). Elhízottakban az endokannabinoid rendszer elemei fokozott működést mutatnak és növekszik a plazma 2-AG koncentrációja is (106). Ellentétben a kannabinoidok vérnyomást csökkentő hatásával (137;138;144), ami kifejezett hipertenziós patkányokban (131), és azzal, hogy CB1R blokkolása növeli hipertenziós patkányokban a vérnyomást (131), 17
a legutóbbi klinikai vizsgálatokban a rimonabant, igaz kis mértékben, de csökkentette a vérnyomást elhízott magas vérnyomású egyénekben (80;145;146). A kannabinoidok kardiovaszkuláris hatásában szerepe lehet nemcsak perifériás, hanem központi idegrendszeri hatásoknak is (121), ami nehezíti a lipidoldékony, ezáltal a vér-agy gáton könnyen átjutó CB1R ligandok hatásmechanizmusának pontos megismerését. További B
komplikáló tényező az, hogy az endogén kannabinoidok egyéb receptorokon is tudnak hatni (10), illetve metabolizmusuk során képződhetnek aktív metabolitok (49). Az újonnan megismert kannabinoid receptor, a GPR55, ráadásul a CB1- és CB2 receptorral ellentétben kalcium jelet hoz létre (11) és elég nagy átfedést mutat a CB1R-al az endogén és szintetikus B
ligandok kötésében (11;12). A legtöbbször CB1R specifikus antagonistaként használt rimonabant pl. gátolja a GPR55 működését is (11;12). Elmondhatjuk, hogy a különböző endokannabinoidoknak markáns hatásai vannak a kardiovaszkuláris rendszerre, ezek fiziológiai jelentősége, illetve a hatások pontos mechanizmusa azonban még nincs teljesen feltérképezve (118).
3.4.4. Mindenhol szerepe van a kannabinoidoknak? A felsorolt szerveken, szöveteken kívül máshol is megtalálhatóak a kannabinoid rendszer elemei. Alig van olyan szövet a szervezetben, amelynek a kannabinoid rendszeréről még nem számoltak be. A korábban említetteken kívül megtalálható a harántcsíkolt izomzatban (147), szemben (148), gasztrointesztinális rendszerben (149), bőrben (150), vesében (117), reprodukciós rendszerben (151), tüdőben (152), immunrendszerben (153;154) és csontban (155). 3.5. A CB1R RECEPTOR MŰKÖDÉSE A CB1R-nak eddig három splice variánsát ismerjük. Elsőnek a teljes hosszúságú fehérjét ismertük meg, ehhez képest a másik kettőnek rövidebb az N-terminális extracelluláris régiója (156;157). Az egyik alternatív splice variáns, a CB1a receptor esetében, megjelenik egy, 28 aminosav hosszúságú szakasz is, ami a másik kettőben nem található meg (157). Az eltérő splice variánsok kimutathatók RNS szinten különböző szövetekben, de fehérjeszintű expressziójuk bizonytalan (156;157). Farmakológiájuk eltér a teljes hosszúságú CB1R-hoz képest, ugyanis a vizsgált endokannabinoidok közül csak a 2-AG aktiválja őket. A jelenleg
18
felhalmozódott tudásunk többnyire a teljes hosszúságú CB1R-ra vonatkozik, a splice variánsok in vivo jelentősége még nem tisztázott.
3.5.1.
A CB1R jelátvitele
A CB1R-t 1990-ben klónozták patkányagyból és a G-fehérjékhez kapcsolt 7transzmembrán szerkezetű fehérjék családjába tartozik (7). A CB1R jelátvitele jelentősen függ attól, hogy milyen rendszerben, milyen körülmények között és milyen agonistával történt stimulálás során vizsgálják a jelátvitelt. A klasszikus receptorműködési modellektől eltérően, amikor aktív és inaktív receptorkonformációt különböztettek meg, a jelenlegi elképzelések a 7TM receptorok esetében módosultak (158). A mai modellekben a receptornak több egymástól kicsit eltérő aktív konformációja lehetséges, és a különböző ligandok más-más konformációt képesek stabilizálni vagy létrehozni. Ezáltal valójában nem csak receptorra-, hanem ligandra jellemző jelátvitelről is beszélhetünk. A jelenség ugyan jelentősen nehezíti egy receptor működésének megértését, azonban lehetőséget kínál arra, hogy nem tisztán receptorspecifikus hatóanyagokat, hanem útvonal-specifikus anyagokat is kifejlesszenek (158).
3.5.1.1. G-fehérje aktiválás Az első leírt kannabinoid hatásra bekövetkező jelátviteli folyamat a cAMP szint csökkenése volt (159;160). A hatás pertussis toxinnal kivédhető volt, ami a heterotrimer Gi/ofehérjék szerepére utalt a folyamatban. A CB1R a Gi/o család minden tagját képes aktiválni, de kísérlettől, sejttípustól illetve agonistától függően különbözik az egyes G-fehérjék aktiválásának aránya (161-163). Sf9 sejtek membránjában a Gi- és Go-fehérjék aktiválásának aránya attól függően változott, hogy milyen agonistával serkentették a receptort (162). N18TG2 sejtekben a WIN55,212-2 teljes agonista volt, ha a Gi1, Gi2 és Gi3-fehérjéket vizsgálták, azonban a desacetyllevonantradol agonistaként viselkedett Gi1- és Gi2-fehérje esetén, de inverz agonistaként ha Gi3-at vizsgálták. A methanandamid (ami egy stabil, nem hidrolizáló anandamid analóg), agonista ha a Gi3-t, de inverz agonista ha a Gi1- vagy Gi2fehérjéket vizsgálunk. Tovább bonyolítja a jelátvitelt, hogy egy agonista esetén is változhat a jelátvitel kapcsolása, attól függően, hogy milyen agonistakoncentrációt vizsgálunk. WIN55,212-2 esetében megfigyelték, hogy eltérő hatáserősséggel képes aktiválni különböző 19
G-fehérjéket. A jelátvitelben szereplő G-fehérjék aránya attól függ, hogy milyen az agonistakoncentráció (164). Ezzel egybevágó adat, hogy a CB1R több eltérő affinitású kötőhellyel rendelkezhet, és ezek különböző receptorkonformációt jelenthetnek (161). A különböző receptorállapotok jelenlétét megerősítő további adat, hogy plazmon rezonancia spektroszkópiával megvizsgálva két agonista, a CP55,940 és a WIN55,212-2 eltérő konformációkat hozott létre (165). A receptor G-fehérjéhez való kötődését a felsorolt körülményeken kívül az is befolyásolja, hogy milyen szövetben, sejtben, vagy agyi régióban vizsgáljuk a jelátvitelt, feltehetően a célsejtek eltérő G-fehérje mintázata miatt (166-168). A legtöbb kísérletben a CB1R valamelyik Gi/o családba tartozó fehérjét aktiválja és a jelátvitele gátolható pertussis toxinnal (169). Bizonyos esetekben azonban megfigyelték Gsfehérjék aktiválódását is, illetve Ca2+ jel kialakulását is CB1R stimulálását követően (169). B
Amennyiben a CB1R-t expresszáló sejteket pertussis toxinnal előkezelték, a receptor stimulálása cAMP-koncentráció növekedést eredményezett (170;171). Más szerzők szerint, attól függően növekedett vagy csökkent a cAMP szint, hogy milyen adenilát-ciklázt koexpresszáltak a CB1R-al (). 1-es, 3-as, 5-ös, 6-os és 8-as izoforma koexpresszálása esetén gátlást, míg 2-es, 4-es és 7-es izoformák esetén aktiválást tapasztaltak (172). A Gs-fehérjéket azonban a Gi/o-fehérjékkel ellentétben nem lehetett koimmunprecipitálni a receptorral (173). Bizonyos kísérleti felállásokban a CB1R stimulálása kalcium jelet is létrehozhat, azonban ennek a mechanizmusa nem tisztázott. CB1R aktiválása Ca2+ jelet hozott létre N18TG és NG108-15 sejtekben, azonban C9 sejtekben már nem (174). A kalcium jel kivédhető volt pertussis toxinnal, ami Gi/o által közvetített jelátvitelre utal (174;175). Egy másik megfigyelés szerint azonban HEK sejtben expresszált CB1R stimulálása csak akkor vezetett kalcium jelhez, ha az agonista WIN55,212-2 volt (176). Ebben a kísérletben Gqfehérje által jött létre a kalcium jel. Ca2+ jelet szintén megfigyeltek inzulinoma sejtvonalon arachidonil-chloro-ethanolamiddal és anandamiddal történt stimuláció során, és a jelátvitel Gq/PLC függő volt. Az endogén szövetekben vizsgált CB1R által létrehozott kalcium jelek értékelésénél azonban már az újabb lehetséges kannabinoid receptornak (pl. GPR55) a szerepét is figyelembe kell venni. 3.5.1.2. Ioncsatornák működésének befolyásolása A CB1R stimulálása befelé rektifikáló K+ csatornák aktiválását is eredményezi. A hatás pertussis toxin-szenzitív, ami Gi/o-fehérjék szerepére utal a folyamatban (177;178). Az aktiválást anandamid és WIN55,212-2 is létrehozza. Xenopus laevis békapetében a
20
koexpresszált GIRK1 illetve GIRK4 befelé rektifikáló csatornákat a CB1R aktiválta (70;177;179). A csatornák aktiválódását neuronokban is ki lehet mutatni (180;181). A CB1R aktiválódása feszültségfüggő kalciumcsatornák működését is befolyásolja. Ltípusú kalciumcsatorna gátlását figyelték meg agyi artériák simaizomsejtjeiben (182), retina bipoláris sejtekben (183), nucleus tractus solitarii neuronokban, aktiválását pedig N18TG2 neuroblastoma sejtekben (184). N-típusú kalciumcsatorna gátlást neuronsejtekben számos kísérletben megfigyeltek (181;185-190), és a gátlás jelentős szerepet játszik az endokannabinoidok által létrehozott preszinaptikus gátlásban (59;169). P/Q csatornák működését szintén befolyásolja a CB1R aktivitása (178;190-193).
3.5.1.3. MAP-kináz kaszkádok aktiválása A mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) útvonalak gyakran aktiválódnak 7TMR-ok stimulációját követően. A 7TM receptorok aktiválódása befolyásolhatja többek között a sejtproliferációt, differenciálódást, sejtvándorlást és sejthalált a MAPK kaszkádok közvetítésével. CB1R stimulációja Erk1/2 aktiválódáshoz vezet számos sejtben in vitro és in vivo (169). A CB1R általi Erk1/2 aktiváció több mechanizmussal is létrejöhet, többek közt Gi/o-fehérjén keresztül (169), PI3K aktiválással (194), VEGF receptor transzaktiválással (195), adenil-cikláz gátlásán keresztül (196) és FYN Src tirozin kinázon keresztül (197). A Gfehérje aktiváláshoz hasonlóan azonban az Erk1/2 aktiválás útvonala is sejttípus és agonistafüggő folyamat. A CB1R stimulálása a p38 MAPK és JNK aktiválódását is B
eredményezi (198-200). Endothelsejtekben a CB1R aktiválódás Erk1/2, p38 MAPK és JNK útvonalakat is serkenti (198). Patkány hippocampus sejtekben kannabinoidok hatására aktiválódik a p38 MAPK, azonban JNK stimulálását nem lehetett kimutatni (201). Agykérgi neuron primer sejtkultúrát stimulálva THC-vel JNK aktiválódott (202), azonban más kísérletben nem lehetett kimutatni az Erk1/2, p38 MAPK és JNK aktivációt ha HU-210-el stimulálták a sejteket (203). Ezeket a különbségeket esetleg magyarázhatjuk azzal is, hogy a sejtek differenciálódása, érése során a különböző jelátviteli utak szerepe változhat (204). Neuro2a sejtekben a HU-210 Erk1/2 foszforilációt igen, de JNK és p38 MAPK aktiválódást nem okozott (205), habár más közleményben src kinázon keresztüli JNK aktivációról számoltak be (206;207). CHO sejtekben megfigyelték a JNK és p38 MAPK aktivációját THC hatására. A JNK aktiváció Gi/o-fehérje, PI3K és Ras függő volt, és szerepelt benne PDGF transzaktiváció. Ezzel szemben a p38 MAPK aktiváció nem volt PDGF-függő (199).
21
3.5.2. Konstitutív vagy bazális aktivitás?
3.5.2.1. A membránreceptorok konstitutív aktivitása A receptorok működésének korábbi modelljeiben két állapotot különböztettek meg: inaktív, agonistát és G-fehérjét nem kötő, és aktív, agonistát és G-fehérjét kötő konformációt. Az elképzelések szerint a receptor agonista kötődik a receptorhoz, és azt aktiválja (konformáció-indukciós modell). Ebben a modellben az antagonista kötődik az inaktív receptorhoz, és gátolja annak az aktiválódását. A későbbiekben azonban kiderült, hogy a korábban antagonistáknak tekintett vegyületek bizonyos esetekben nem csak az aktivációt gátolják, hanem csökkentik az alapaktivitást is (8. ábra). Az első ilyen megfigyelések deltaopioid receptorokkal történtek (208). Egy ligand „negatív hatékonysága” azonban nehezen magyarázható a korábbi receptorműködési modellel. Jobban értelmezhető a konstitutív aktivitás a receptorműködés konformáció-szelekciós modellje alapján. Ez esetben a receptor konformációja aktív és inaktív formák között valamilyen eloszlásban található és agonista hiányában az inaktív konformáció felé tolódik el az egyensúly. Az agonisták nagy affinitással kötődnek az aktív konformációhoz, az inverz agonisták pedig az inaktív konformációhoz, miközben azt stabilizálják. A tisztán neutrális antagonisták mindkét konformációhoz nagy affinitással kötődnek, így az eredeti, ligand hiányában kialakuló egyensúlyt stabilizálják (8. ábra). Mivel a receptorszám növelésével az aktív konformációban levő receptorok száma is nő, könnyen megérthető, hogy miért főleg expressziós rendszerekben figyelhető meg a konstitutív aktivitás. Expressziós rendszerekben ugyanis a receptorok száma általában magasabb, mint az endogénen expresszáló sejtekben. Több mint 60 7TMR-ról már kimutatták, hogy bizonyos körülmények között konstitutív aktivitással rendelkezik (209), és van, amelyeknél ez fiziológiás működésnek a feltétele (209). Habár a konformáció-indukciós és konformáció szelekciós modell könnyen értelmezhető, a receptorok működését egyik sem írja le tökéletesen. Az elmúlt 20 évben újabb elképzelések születtek a receptorműködés leírására, és egyre bonyolultabb modellek születtek (210). Érdemes megemlíteni, hogy a receptornak feltehetően nem csak egy, hanem számos aktív konformációja létezik, és egy ligand agonista, antagonista vagy inverz agonista tulajdonsága attól függően változhat, hogy milyen sejtválaszt vizsgálunk. Számos példa van arra, hogy egy ligand lehet neutrális antagonista egyik jelátvitelben és agonista, vagy éppen inverz agonista egy másik útvonalon
22
(158), és ilyen megfigyelések CB1R esetében is történtek (lásd fent). Ezt érdemes figyelembe venni abban az esetben is, ha azt tapasztaljuk, hogy különböző rendszerekben eltér a CB1R bazális aktivitása.
Seifert R, Wenzel-Seifert K., 2002 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366(5):381-416. 8. ábra Különböző ligandok hatása a receptoraktivitásra. A. különböző ligandok a receptor teljesen inaktív (R) és teljesen aktív (R*) állapotok között stabilizálják a receptort. A neutrális antagonisták a receptor alapállapotát, a parciális agonisták részlegesen aktív, a teljes agonisták a teljesen aktív állapotot stabilizálják. Az inverz agonisták az inaktív állapotba hozzák a receptort, megkülönböztetünk teljes, vagy parciális inverz agonizmust. B. A receptoraktivitás a külöböző ligandok koncentrációjának függvényében (209)
23
3.5.2.2. Bizonyítékok a CB1R konstitutív aktivitása mellett
A kannabinoid receptorok felfedezését követően hamarosan megjelentek a receptorok specifikus antagonistái (211). A CB1R specifikus antagonisták, mint a SR141716A, AM251, AM281 azonban nem csak az agonisták hatását védték ki, hanem inverz agonistaként viselkedtek expressziós rendszerekben és CB1R-t endogénen expresszáló szövetekben egyaránt (19;212;213). Két lehetőség merül fel a jelenség magyarázataként: vagy intrinsic konstitutív aktivitással rendelkezik a receptor, vagy az endogén szövetekben és expressziós rendszerekben folyamatosan endogén kannabinoid agonista keletkezik, ami stimulálja a receptort (214). A két lehetőség közül mégis az előbbi vált általánosan elfogadottá, és e mellett szólnak az alábbi érvek: • CHO sejtekben expresszált CB1R jelentős bazális aktivitást mutat, ennek ellenére a CHO sejtek felülúszójával nem sikerült csökkenteni a cAMP szintet CB1R-t endogénen expresszáló U373-MG sejtekben (215), ami endogén agonista jelenléte ellen szól • 2-AG és anadamid lebomlását gátló FAAH inhibitor phenylmethylsulphonyl fluorid (PMSF) nem befolyásolta a CHO sejtekből preparált membránben a [35S]-GTPγS kötést (216). • Ismert egy olyan CB1R mutáns (K192A) amely aktiválható WIN55,212-2 - vel, azonban már nem köt anandamidot (217). A mutáns receptort expresszáló sejtek stimulálása WIN55,212-2-vel ugyanolyan mértékű Ca2+ jel gátlást eredményezett, mint a vad típust expresszálóké. Ez arra utal, hogy a konstitutív aktivitása megmaradt, ugyanis ellenkező esetben WIN55,212-2-vel történő stimulálással nagyobb gátlást kellet volna detektálni. • BAPTA-val nem lehetett szignifikánsan csökkenteni a bazális aktivitást, pedig az endokannabinoidok keletkezésében szereplő enzimek jelentős része Ca2+-függőek (217). • A konstitutív vagy bazális aktivitás eldöntésében segíthetnek tiszta neutrális antagonistákkal végzett kísérletek. Három neutrális antagonistaként ismert vegyület, a NESS 0327, az O-2654 és a O-2050 nem mutat inverz agonista tulajdonságot (214;218;219) izolált membránon végzett [35S]GTPγS kötési vizsgálatban, annak ellenére, hogy kompetitíven gátolja más agonisták és antagonisták hatását. Ehhez hasonlóan, a kannabinol, egy másik kannabisz származék, tizedmikromoláros koncentrációban gátolja a CB1R agonista CP55940 kötődését, azonban még 10 μM-os koncentrációban sem befolyásolja CHO sejtek membránjának [35S]-GTPγS kötését (216). Ez arra utalhat, hogy vagy az endogén agonistát
24
nem tudja leszorítani, vagy pedig nem endogén agonista hozza létre a bazális aktivitást. Egy neutrális antagonista egyformán nagy affinitással kötődik a receptor aktív és inaktív konformációjához, stabilizálja annak agonista jelenléte nélküli konformációeloszlását. Ezekben az esetekben nem jött létre inverz agonista hatás, ezért ezek az adatok arra utalnak, hogy a receptor jelentős hányada agonista nélkül is aktív konformációban van. • További érv a konstitutív aktivitás mellett, hogy az SR141716A endogénen expresszáló szövetekben mikromoláros koncentrációban hoz létre inverz agonista hatást (213;218;220-222), annak ellenére, hogy a KD-je nanomoláros koncentrációban van. Tehát, ha az inverz agonista hatása úgy jönne létre, hogy a receptorról leszorítja az endogén agonistát, akkor nehezen képzelhető el, hogy csak a KD-hez képest 1000-szeres koncentrációban látható az inverz agonista hatás. A hatás könnyebben értelmezhető úgy, hogy a receptoron található egy kis affinitású kötőhely, ami a teljesen inaktív CB1R konformációt stabilizálja.
3.5.2.3. Ellenérvek A CB1R konstitutív aktivitása, illetve ennek fiziológiás jelentősége a felsorolt érvek ellenére nem teljesen egyértelmű. Számos endogén rendszerben nem lehet megfigyelni bazális aktivitást, vagy kivédhető BAPTA-val, ami az adott rendszerben bazális endokannabinoid jelenlétre utalhat (77;91;222-228). Ez arra utal, hogy a CB1R konstitutív aktivitása nem minden esetben detektálható. Más rendszerekben azonban kétségkívül van bazális aktivitás, különösen expressziós rendszerekben (214). Habár expressziós rendszerben a fent részletezett receptorműködés-modellekből következik, hogy bizonyos mértékű konstitutív aktivitás csupán a receptor túlexpresszálása következtében is létrejöhet (229), az irodalomban mégis inkább a receptor saját tulajdonságának tekintik a jelenséget. További szempont, hogy a CB1R igen nagy számban expresszálódik a központi idegrendszer egyes részein, ami felveti, hogy az expressziós szint miatt is lehet bizonyos konstitutív aktivitás. A fent felsorolt érvek sem feltétlenül fogadhatók el azonban érvként az ellen, hogy a nagyfokú bazális aktivitás létrejöttében esetleg szerepelnek endogén agonisták is: • Az endokannabinoidok lipofil vegyületek, ezért nem biztos, hogy a médiumban nagy koncentrációban jelenik meg abban az esetben, amikor a membránban már CB1R aktiváláshoz elegendő mennyiség található, így nem feltétlenül lehet a felülúszóval elegendő mennyiségű endokannabinoidot átvinni más sejtekre.
25
• Az endokannabinoidok lebontásában sejtfüggően számos enzim szerepelhet, pl. bizonyos sejtekben a COX-2, a PMSF hatástalansága ezért nem zárja ki az endokannabinoidok szerepét. Ráadásul FAAH gátlását követően patkányagyban nem növekszik a 2-AG mennyisége (54;55). További, a kérdést bonyolító tényező, hogy a PMSF a 2-AG szintézisben szereplő DAGL-t is gátolni tudja (230). • Annak ellenére, hogy a K192A mutációt tartalmazó CB1R stimulálásával nem lehet nagyobb Ca2+ jel gátlást létrehozni, nem biztos, hogy a mutáns receptor bazális aktivitása megmaradt. A receptor köt SR141716A-t, és gátolja az agonisták hatását, tehát antagonistaként viselkedik, azonban inverz agonista hatása eltűnik. Ez a jelenség magyarázható azzal, hogy a K192 aminosav szerepet játszik az SR141716A kötésében, és az inverz agonista hatáshoz szükséges (217), de magyarázható esetleg azzal is, hogy a bazális aktivitásért endogén agonisták szerepelnek. Mivel endogén agonistát (ez esetben anandamidot) nem köt a receptor, az SR141716A nem tud inverz agonista hatást kifejteni. • Az idézett cikkben ugyan nem volt szignifikáns a BAPTA hatása, más kísérletekben, endogénen CB1R-t expresszáló sejtekben gátolható volt BAPTA-val a CB1R bazális aktivitása, ráadásul az endogén kannabinoid 2-AG termelődés bizonyos esetekben kalciumtól független is lehet (65;66;223). • Az, hogy a neutrális antagonisták nem változtatják meg a CB1R bazális aktivitását, mindenképp amellett szólna, hogy ez esetben tényleg konstitutív aktivitásról van szó. A kérdés eldöntését viszont megnehezíti az a körülmény, ahogyan a neutrális antagonistákat definiálták. Ugyanis azokat a vegyületeket nevezi az irodalom CB1R neutrális antagonistáknak, amik nem változtatják meg a CB1R bazális aktivitását. Ez azt jelenti, hogy csak abban az esetben nevezhetjük e vegyületeket (O-2050, O-2654, NESS 0327) neutrális antagonistáknak, ha elfogadjuk, hogy a receptor konstitutívan aktív. Amennyiben viszont azt feltételezzük, hogy a bazális aktivitást endogén agonisták hozzák létre, akkor ezek a vegyületek inkább parciális agonistaként definiálhatók. Az O-2050 nevű vegyületet cikkben eredetileg ugyan nem karakterizálták (231), de a szabadalmi leírásból kiderül, hogy pl. [35S]GTPγS kötést vizsgálva hasonló mértékű parciális agonista hatása van, mint az ismert CB1R agonista THC-nak (232). • Az alapján nevezzük tehát neutrális antagonistának az említett vegyületeket, hogy nem változtatják meg a kísérletekben a CB1R aktivitást, amit konstitutívnak tekintünk. Ezek után nem tekinthető bizonyítékként, ha megfordítjuk az előbbi kísérleti gondolatmenetet, és azt mondjuk, hogy a receptor konstitutívan aktív, mert a neutrális antagonisták (amik azért
26
neutrális antagonisták mert nem változtatják meg a bazális aktivitást) nem változtatják meg a bazális aktivitást (214;219). Ez esetben ugyanis már a kísérlet tervezésekor szükségszerűen elfogadjuk a bizonyítani kívánt hipotézist, miszerint a receptor konstitutívan aktív. • SR141716A esetében a KD-nél nagyobb IC50 két módon értelmezhető: vagy egy kis affinitású kötőhelyen történő kötődés okozza az inverz agonista hatást, ami különbözik attól, amin a neutrális antagonista hatást létrehozza, vagy esetleg nem CB1R-hoz kötődik. Ez utóbbival egybevágó adat, hogy mikromoláros koncentrációban a SR141716A képes adenozin A1 receptort is gátolni patkány kisagyi membránpreparátumban (222). A fentiek alapján elmondható, hogy annak ellenére, hogy a CB1R-t az irodalomban általában konstitutívan aktív receptornak tekintik, a konstitutív aktivitás mellett szóló érvek ezt nem feltétlenül bizonyítják. Elgondolkodtató adat, hogy a különböző szövetekben mért 2AG mennyiség, egyenlő eloszlást feltételezve nagyjából a receptor Kd-jének megfelelő nagyságrendű koncentrációnak felel meg (16). Ha feltételezzük, hogy az eloszlás nem egyenletes, elképzelhető az is, hogy bizonyos helyeken lokálisan ettől jóval nagyobb koncentrációk is előfordulhatnak.
3.6. AZ ANGIOTENZIN II ÉS RECEPTORAI
Az angiotenzin II egy oktapeptid szerkezetű hormon, a renin-angiotenzin rendszer fő effektor molekulája. Az oktapeptid a tíz aminosavból álló angiotezin I-ből keletkezik az endothelen található (elsősorban tüdőben) angiotenzin konvertáz enzim általi hasítással. Az angiotenzin I angiotenzinogénből keletkezik (14 aminosavból álló peptid) renin hatására. A klasszikus elképzelések szerint a vesében keletkező renin termelése szabályozott, ez felelős a renin-angiotenzin rendszer szabályozásáért (233;234). Ma már ismert, hogy a reninangiotenzin rendszernek nem csak endokrin szerepe van. A különböző szövetekben jelen van az összes elem és ezek lokális renin-angiotezin rendszereket alkotnak (235). A lokális, szövetben keletkezett angiotenzin II koncentrációja sok esetben jelentősen meghaladhatja a plazmában mért értékeket (236). Az angiotenzin II-nek szerepet tulajdonítanak különböző kórélettani folyamatokban is, mint pl. a magasvérnyomás betegség és következményes érfalés szívizom-átépülési folyamatok. A metabolikus szindrómában szintén szerepet játszik a renin-angiotenzin rendszer (237;238). 27
Az angiotenzin II-nek két 7TM szerkezetű receptora ismert, az AT1 és az AT2 receptor (AT1R és AT2R). Az AT1R Gq/11—fehérjéket aktivál, az AT2 receptor jelátvitele kevésbé ismert, azonban stimulálását különböző foszfatázok aktiválása követi (239;240). Az angiotenzin II ismert hatásainak többségét az AT1R közvetíti. Az AT1R megtalálható számos szövetben, az érfalak simaizomzatában, vesében, központi idegrendszer egyes területein, de egyéb szövetekben is, mint pl. a zsírszövet (241).
28
4. CÉLKITŰZÉSEK Az idegrendszerben az endokannabinoidok keletkezését jól definiált struktúrákhoz kötik, ahol egymás közelében helyezkednek el a rendszer egyes elemei, a metabolizmusban szereplő enzimek és a CB1R (242;243). Ezzel szemben a periférián nem ismertek ilyen jól lokalizálható funkcionális egységek, hanem általában „endokannabinoid tónusról” beszélnek a szerzők. 2-AG megtalálható szinte minden szövetben, de a keletkezésük pontos helye és szabályozása kevésbé ismert, mint az idegrendszerben. A kannabinoid rendszernek egyre több fiziológiás és patológiás működésben tulajdonítanak szerepet, és ezek átfednek azokkal, amelyekben már ismert, hogy a renin-angiotenzin rendszer is jelen van. Mivel az AT1R Gq/11fehérjéket aktivál, felmerül, hogy esetleg az idegsejtekben már ismert muszkarinos acetilkolin-receptorok és metabotróp glutamát receptorok analógiájára, AT1R stimulálással is létrehozható endokannabinoid termelődés és kannabinoid receptor aktiválás. Célunk volt továbbá, hogy megvizsgáljuk nem neuronális sejtvonalakban, vajon további Gq/11-kapcsolt receptorok stimulálása hasonló választ eredményez-e. Kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestük a választ: Létrejöhet-e autokrin CB1R aktiváció a Gq/11-kapcsolt AT1R stimulásával expressziós B
rendszerben, nem neuronális sejtvonalban? Szerepet játszik-e a DAG lipáz a CB1R AT1R általi transzaktivációjában és történik-e endokannabinoid felszabadulás a sejtekben? Kimutatható-e endokannabinoid képződés egyéb Gq/11-kapcsolt 7TMR-ok aktiválódását követően nem neuronális sejtekben?
29
5. MÓDSZEREK 5.1. A munkánk során használt anyagok A patkány
o-CFP
G-fehérje alegységet Dr. N. Gautam-tól kaptuk (244). A humán β1 és
γ11 alegységeket a Missouri S&T cDNA Resource Center-től vettük. A patkány érfal simaizomból származó AT1AR cDNS-ét Dr. K. E. Bernstein (Emory University, Atlanta, GA) bocsátotta rendelkezésünkre (Murphy TJ,1991). A receptor Hind III és Not I restrikciós enzimekkel pcDNA™3.1 eukarióta expressziós vektorba lett illesztve, és influenza hemagglutinin epitóppal ellátva (245). Az epitóp jelenléte nem befolyásolta a receptor működését (245). Az AT2 receptort (AT2R) patkányagy DNS könyvtárból sokszorozták fel, majd pcDNA3.1-be illesztették (246). A β-arresztin2-EGFP (βarr2-GFP) konstrukciót Dr. Marc G. Caron (Duke University, Durham, NC) bocsátotta rendelkezésünkre (247). A candesartan az AstraZeneca (Mölndal, Svédország) ajándéka volt. A következő anyagok az Invitrogen™ Life Technologies (Carlsbad, CA) cégtől származtak: pcDNA™3.1, DMEM, Opti-MEM® I, magzati borjú szérum (FBS), Lipofectamine 2000™, Optifect™, Fura-2/AM, coelenterazine h, Neurobasal medium, Versene®. A szövettenyésztéshez használt flaskákat és lemezeket a Greiner Bio-One GmbH-tól (Frickenhausen, Németország) vásároltuk. Amennyiben másképp nem jelöltük, az összes többi anyag a Sigma-Aldrich-tól származik. A CB1R-t Lenkei Zsolt klónozta ki patkány simaizomból (248). Az mRFP-N1 vektort Dr. R. Tsien (University of California, San Diego, CA) bocsátotta rendelkezésünkre. 5.2. Plazmid konstrukciók A Renilla luciferázzal (Rluc) jelölt β-arresztin2 konstrukció (βarr2-Rluc) elkészítéséhez először a sárga fluoreszcens fehérjével (EYFP) jelölt változatot (βarr2-YFP) készítettük el. Ehhez a βarr2-GFP plazmidról felsokszoroztuk a β-arresztin2-t, majd a pEYFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) eukarióta expressziós vektorba illesztettük. Ezután a humanizált Rluc gént sokszorosítottuk a phRl-TK (Promega, Madison, WI) ko-riporter vektorról, majd beillesztettük a βarr2-YFP plazmid Age I és Not I restrikciós hasítási helyei közé, ezzel kicserélve az EYFP-t a Rluc-ra. A CB1R-YFP-t Lenkei Zsolt készítette (248). A CB1R-RFP készítéséhez a CB1R-YFP-ből a CB1R-t kódoló részt átklónoztuk mRFP-t tartalmazó vektorba. YFP-β1-et a β1 alegység EYFP-C1 vektorba (Clontech, Palo Alto, CA) történő átklónozásával készítettük. A Renilla luciferázzal jelölt αo fehérjét (αo-Rluc) az αo-CFP CFP 30
részének humanizált Renilla luciferázra történő cseréjével állítottuk elő. Az EYFP-val jelölt AT1AR és AT2R (AT1R-YFP és AT2R-YFP) készítéséhez a receptorokat pEYFP-N1 plazmidba illesztettük. A CB1R cDNS-ében a mutációkat irányított mutagenezissel, a Stratagene® cég (La Jolla, CA) QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit-jének segítségével hoztuk létre. A mutáció segítségével a CB1R konzervált DRY szekvenciájában cseréltük ki a az első két aminosavat kódoló szekvenciát alanint kódoló szekvenciára (D214A és R215A). 5.3. Sejttenyészetek fenntartása és transzfektálásuk A kísérletekhez a fehérjéket különböző emlős sejtkultúrákban expresszáltuk. A CHO hörcsög ovárium sejtvonalat Ham’s F12, a COS-7 majom vese fibroblaszt és a HEK-293 humán embrionális vese sejtvonalakat DMEM médiumban tartottuk, amely 10% FBS-t, 100 μg/ml streptomycint, 100 IU/ml penicillint, és pufferként nátrium bikarbonátot tartalmazott. A tenyésztést párásított, 5% CO2-ot tartalmazó inkubátorokban végeztük, 37 °C-on. A G-fehérje aktivitás BRET-tel történő méréséhez a CHO sejteket 6 lyukú vagy 10 cm-es szövettenyésztő lemezekre osztottuk (500 ezer sejt/pont illetve 4 millió sejt/10cm-es lemez). A HEK-293 és COS-7 sejteket 10 cm-es lemezre osztottuk 4 millió/lemez (HEK-293) illetve 2 millió/lemez (COS-7) mennyiségben. A sejteket osztást követő napon transzfektáltuk Opti-MEM® I médiumban, 2-2 μg plazmid DNS és 2 μl Lipofectamine2000™ felhasználásával a 6 lyukú, illetve 16-16 μg plazmid DNS és 16 μl Lipofectamine2000™ a 10 cm-es lemezek esetén. A parakrin transzaktiválás méréséhez a külön sejtben expresszált 7TMR-ok esetén a 7TMR-ok plazmidjából 3 μg-t (6 lyukún, pontonként), illetve 24 μg-t (10 cm-esen) használtunk. Hat órával a transzfektálást követőn a médiumot a sejteknek megfelelő komplett médiumra cseréltük. A konfokális mikroszkópos mérésekhez a CHO sejteket fedőlemezen növesztettük és Opti-MEM® I médiumban transzfektáltuk, 2-2 μg plazmid DNS és 2 μl Lipofectamine2000™ felhasználásával. 5.4. Konfokális lézer mikroszkópia A kísérleteket két nappal a transzfektálást követően végeztük. A konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz a HEK-293 (AT1R és AT2R esetében), illetve CHO (CB1R
31
esetében)
sejteket
fedőlemezen
növesztettük
és
Lipofectamine2000™
reagenssel
transzfektáltuk (βarr2-GFP és megfelelő receptorok). A parakrin transzaktivációs kísérletekhez a CB1R-DR/AA-RFP-t és a βarr2-GFP-t koexpresszáló, illetve az AT1R-YFP-t expresszáló sejteket a transzfektálást követő napon Versene®-el felszedtük, összekevertük, majd visszahelyeztük a fedőlemezre. A kísérleteket másnap végeztük. A felvételeket egy Zeiss LSM 510 konfokális lézer mikroszkóppal, 63x-os, 1,4 numerikus apertúrájú plan Apochromat immerziós objektívvel készítettük, multitrack módban. Az excitációhoz 25 milliwattos argon lézert (488 nm) és 1 milliwattos hélium/neon lézert (543 nm) alkalmaztunk. Az emissziót 500–530-nm-es szűk sávú filterrel detektáltuk a GFP és YFP, és egy 560-nm felett átengedő széles sávú filterrel az RFP esetében. Általában 1 μm optikai szeletvastagságú képeket készítettünk. A fluorofórok közötti átbeszélés elhanyagolható volt. 5.5. A 2-AG tömegspektrometriás meghatározása A 2-AG és az anandamid mérését Dr. Kunos György laboratóriumában végezték. A CHO sejteket 10 cm-es lemezen transzfektálták AT1R-ral a parakrin transzaktiválás mérésénél használt protokoll szerint (lásd fent). A sejteket 3,5 ml módosított Krebs–Ringer oldatban (120 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,7 mM MgSO4, 10 mM glukóz, 10 mM NaHepes, 53 pH 7,4) inkubálták 100 nM angiotenzin II (Ang II) jelenlétében, vagy anélkül a jelzett időpontokig, majd a sejteket a médiummal együtt kétszeres mennyiségű, belső standardként 7 ng D4-anandamidot tartalmazó kloroform:metanol (2:1, v/v) keverékkel extrahálták. A kloroform fázist elkülönítették, majd reextrahálták még két alkalommal, végül nitrogén alatt beszárították. Az extraktumot 100 μl kloroformban visszaoldották, fehérjementesítették 2 ml jéghideg acetonnal, majd centrifugálást követően a tiszta felülúszót kiszárították. A mintákat 50 μl metanolban reszuszpendálták és az endokannabinoid tartalmat folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrométerrel (HPLC-MS) határozták meg (249). 5.6. Citoplazmatikus Ca2+ mérések A kísérletekhez a CHO sejteket a BRET mérésen alapuló G-fehérje aktivitás mérésekor alkalmazott protokoll szerint transzfektáltuk, majd a méréseket a G-fehérje méréssel párhuzamosan végeztük a transzfektálást követő napon. A sejteket Versene®-el mobilizáltuk, centrifugáltuk, majd HEPES-sel pufferelt F-12 médiumban hagytuk regenerálódni 1 órát, és 32
45 percig töltöttük 2 μM Fura-2/AM-el, illetve a sejtek egy részét 60 μM BAPTA-AM-el. A kalciumméréseket átlátszó mérőoldatban (módosított Krebs–Ringer oldat, 120 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,7 mM MgSO4, 10 mM glukóz, 10 mM Na-Hepes, pH 7,4) reszuszpendált CHO sejteken (106 sejt/ml), egy DeltaScan fluoreszcens spektrofotométerrel (PTI, Lawrenceville, NJ) végeztük, 340 és 380 nm-en történő excitációval és 510 nm-en detektált emisszióval. A stimuláláshoz 100 nM Ang II-t, illetve 1 μM ionomycint használtunk. Az adatokat a Felix for Windows 1.42 programmal elemeztük. 5.7. Biolumineszcens rezonancia energiatranszfer (BRET) vizsgálatok A rezonancia energiatranszfer mérési technika az utóbbi évtizedben nagyon jelentős a molekuláris biológiai módszerré vált. Segítségével lehetővé vált élő sejtekben a különböző molekulák interakciójának vizsgálata. A módszer elve, hogy két vagy több fehérjét olyan fluorofórral jelölünk, hogy az egyik fluorofór emissziós spektruma átfedjen a másik abszorpciós spektrumával. Amennyiben a két fluorofór molekuláris közelségbe kerül, lehetővé válik, hogy az egyik fehérje által emittált energia a másikat excitálja (energiatranszfer történjék), és annak az emissziós spektrumában történjék emisszió. Az energiatranszfer a két molekula távolságának a hatodik hatványával fordítottan arányos. Ez azt eredményezi, hogy energiatranszfert csak abban az esetben tudunk detektálni, ha a két molekula molekuláris közelségbe kerül, ami a gyakorlatban 100 Å-nél kisebb távolságot jelent. Energiatranszfer segítségével tehát két molekula közelségét lehet vizsgálni. Energiatranszfer méréseket már számos felállásban lehet végezni (250), azonban a két legelterjedtebb módszer a fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) és a biolumineszcencia rezonancia energiatranszfer (BRET). A két módszer közti lényeges különbség, hogy FRET esetében a donor molekula egy fluoreszcens fehérje, aminek gerjesztéséhez egy külső fényforrásra van szükség, míg BRET esetében a donor egy Renilla luciferáz nevű enzim, és szubsztrát hozzáadását követően történik emisszió. A FRET előnye a BRETtel szemben, hogy képalkotó eljárásokban is használható, azonban BRET esetében jóval nagyobb érzékenységgel lehet interakciókat detektálni.
33
Eidne KA, és mtsi., 2002 Trends Endocrinol Metab 13:415-421. 9. ábra A BRET módszer elve Két fehérje (1 és 2) interakciójának a méréséhez az 1-es fehérjét Rluc-al, a 2-es fehérjét YFP-vel fuzináltatják és expresszálják. A Rluc szubsztrátjának, a coelenterazinnak a hozzáadása után, (a) esetben, amikor a fehérjék nem kapcsolódnak, az emittált fény spektrumában egy csúcsot detektálunk 485 nm-en. (b) esetben, amikor a fehérjék között szoros kapcsolat van, megjelenik az emisszióban egy 530 nm-es csúcs is. (251)
Méréseinkben BRET technikát használtunk. Az energiatranszfert a heterotrimer Gi/ofehérje jelzett α és β alegységei között detektáltuk. A mérést korábban már alkalmazták Gfehérje-aktivitás mérésére (252). Az aktiválódás során az alegységek egymáshoz képest elmozdulnak, ami az α alegységen elhelyezett fluorofór pozíciójától függően a BRET jel csökkenését vagy növekedését eredményezi (253). Az általunk használt αo alegységben a fluorofór a 92. és a 93. aminosav közé lett elhelyezve (244), és ennek a konstrukciónak a használatakor az energiatranszfer jel csökkenését eredményezi a G-fehérje aktiválódása (244). A CHO sejtekben koexpresszáltuk a CB1R-t, a αo-Rluc-t és a YFP-β1-et, illetve a jelöletlen γ11
alegységet.
Párhuzamos
mintákban
YFP-β1
helyett
jelöletlen
β1
alegységet
expresszáltattunk, hogy normalizálhassuk a mért BRET jeleket (lásd alább).
34
Inaktív receptor alegységek együtt van BRET jel
Aktív receptor szétvált alegységek nincs BRET jel A
αo
β
RlucYFP
γ
αo Rluc
β
γ
YFP
10. ábra a CB1R aktivitásának mérése Go-fehérje alegységek közötti BRET mérésével Inaktív receptor esetében a G-fehérje alegységek kapcsolódnak, köztük energiatranszfert lehet detektálni (bal oldal). CB1R stimulálásakor az alegységek szétválnak és a BRET jel lecsökken (jobb oldal). B
A méréseket a transzfektálást követő napon végeztük. A sejteket Versene®-nel szedtük fel, majd centrifugálást követően HEPES-sel pufferelt F12 médiumban (bazális aktivitás mérése során) vagy módosított Krebs–Ringer oldatban (120 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,7 mM MgSO4, 10 mM glukóz, 10 mM Na-Hepes, 53 pH 7,4) (többi kísérlet) szuszpendáltuk. A parakrin aktiválás mérése során a médium 1g/l albuminnal egészítettük ki. A bazális aktivitás mérésekor szuszpendálás előtt a sejteket 2 órán keresztül szérummentes médiumban tartottuk, illetve a sejtek egy részét 1 μM THL-el kezeltük elő. A parakrin transzaktivációs kísérletekben a THL-t 15 perccel a mérés előtt adtuk a már szuszpendált sejtekhez 1 μM koncentrációban. A mérések 96 lyukú fehér szövettenyésztő lemezen történtek, pontonként 100 –150 ezer sejttel 100 μl-ben, 5 μM coelenterazine h jelenlétében. A stimulálás 10 μl térfogatú 10X koncentrációjú ligandokkal történt. A mérések 3 párhuzamos pontpárokon (YFP-és és kontroll, nem YFP-és fehérjéket expresszáló sejtek) történtek minden mérésben. 1 másodperces, szekvenciális méréseket végeztünk 485 és 530 nm-es hullámhosszokon, egy Mithras LB 940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország) mikroplate luminométerrel, F485 (20 nm, coelenterazine-hoz) és F530 (25 nm, az EYFP-hez) szűk sávú filterekkel. A normalizált BRET hányadost úgy számoltuk, hogy a YFP-és fehérjét
35
expresszáló sejteken mért hányadosból kivontuk azt a hányadost, amit a fluoreszcens jelöléssel nem rendelkező (nem YFP-és) fehérje expresszálása esetén kaptunk. Az eredmények egy részét BRET%-ban fejeztük ki, ami az első stimulálást megelőző négy pont átlagához viszonyított százalékos értékeket jelöli. A BRET méréseket előmelegített médiumban, és 37 °C-ra termosztált műszerben végeztük. A receptorok és a β-arresztin2 közötti BRET méréséhez a receptorokat (AT1R, AT2R és CB1R) sárga fluoreszcens fehérjével jelöltük az intracelluláris C-terminális részen (AT1RYFP, AT2R-YFP és CB1R-YFP) és Rluc-zal fuzionált β-arresztin2-vel (βarr2-Rluc) koexpresszáltuk. Az angiotenzin II receptorokat HEK-293 sejtekben, a CB1R-t CHO sejtekben vizsgáltuk. A HEK-293 sejteket 96 lyukú, fehér falú szövettenyésztő lemezeken transzfektáltuk, majd 48 órával később a médiumot lecseréltük HEPESsel pufferelt F-12 médiumra, és hozzáadtuk a coelenterazine h-t 5 μM végkoncentrációban. A CHO sejteket 6 lyukú szövettenyésztő lemezeken transzfektáltuk és a méréseket a G-fehérje méréseknél leírt módon végeztük. 5.8. Statisztikai analízis és dózis-hatás görbeelemzés Az adatokat átlag ± az átlag szórása formában mutatjuk. A csoportok közötti különbségeket Holm-Sidak teszttel kombinált varianciaanalízissel vizsgáltuk, a SigmaStat for Windows 3.5 program (Systat Software Inc., Richmond, CA) segítségével. A 0,05-nél kisebb p értéket tekintettük szignifikánsnak. A dózis-hatás adatok analíziséhez nem-lineáris regressziót (görbeillesztést) végeztünk szigmoid dózis-hatás görbe modell felhasználásával, a GraphPad Prism 4.03 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com) program segítségével. Az értékelésnél az EC50 ± 95% konfidenciaintervallum értékeket hasonlítottuk össze. .
36
6. EREDMÉNYEK 6.1. A CB1R aktivitásának mérése energiatranszfer segítségével Kísérleteinkben szükségünk volt a CB1R aktivitásának a mérésére. Ehhez Go-fehérje alegységek
közötti
biolumineszcens
rezonancia
energiatraszfer
technikát
(BRET)
használtunk. Az α alegységet Renilla luciferázzal (αo-Rluc) jelöltük meg, a β alegységet pedig sárga fluoreszcens fehérjével (EYFP). Aktiváció során a G-fehérje alegységek elmozdulnak egymáshoz képest, és a két alegység közötti energiatranszfer jel megváltozik (244). A változás mértékéből következtethetünk a receptor aktivitására. Méréseinkhez CHO sejtben koexpresszáltunk CB1R-t jelölt α és β alegységekkel, illetve jelöletlen γ alegységgel, hogy a fehérjekomplexhez szükséges alegységek a megfelelő sztöchiometriai arányban legyenek. A 11. ábrán látható, hogy a kontroll sejtekben mérhető BRET jel CB1R agonista (2-AG) adására (piros görbe) lecsökken a nem stimuláltahoz viszonyítva (fekete görbe). Ha az agonistával serkentett állapotban CB1R inverz agonistát (AM251, kék görbe) adunk, a BRET jel a kontroll érték szintje fölé emelkedik. Amennyiben inverz agonistát adunk előbb, a kezdeti BRET jel emelkedik, ami megfelel annak, hogy a receptornak bazális aktivitása van. 2-AG adása AM251 után nem változtatja meg a BRET jelet, ami mutatja, hogy az agonistára létrejött BRET jel csökkenés a CB1R aktiválódása miatt történt. A tranziens transzfekcióból eredő BRET jel abszolút értékének szórása miatt a méréseinkben a továbbiakban a kezdeti BRET jelhez viszonyított változásokat ábrázoltuk százalékban kifejezve. 11. ábra A CB1R aktivitásának mérése Go-fehérjealegységek közötti BRET segítségével Szuszpendált CHO sejtekben mértük a G-fehérje aktivitást. A sejtek egy részét stimuláltuk 2-AGvel (10 μM) majd AM-251-t adtunk (piros), más részéhez előbb AM251et majd 2-AG-t adtunk (kék). A kontroll sejtekhez a stimulálás időpontjaiban médiumot adtunk (fekete) (n=3).
37
6.2. AT1R stimulálásával fokozható a CB1R aktivitása További kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy vajon egy Gq/11-kapcsolt receptor, az AT1R stimulálásával létrejöhet-e endokannabinoid termelés és ezáltal a koexpresszált CB1R aktiválása CHO sejtekben. CHO sejtekről nem ismert, hogy képesek lennének endokannabinoid szintézisre, azonban a szintézishez szükséges DAGL gyakorlatilag minden szövetben jelen van (43). Az AT1R-t és a CB1R-t CHO sejtekben koexpresszáltuk a jelölt Gfehérje alegységekkel, és vizsgáltuk vajon angiotenzin II (Ang II) hatására létrejön-e CB1R aktiválódás. A 12. ábrán látható, hogy Ang II adására BRET jel csökkenését tapasztaltuk (A panel, piros). Az Ang II hatását AM251 előkezeléssel teljesen ki tudtuk védeni (12. ábra, A panel, kék). Az endokannabinoid termelődésben szereplő enzimek egy része kalcium-függő (49), ezért megvizsgáltuk, hogy Ca2+ jel gátlása kivédi-e a CB1R transzaktiválódását.
12. ábra A CB1R aktiválása AT1R stimulálásával CHO sejtekben koexpresszáltunk AT1R-t és CB1R-t és mértük a Go-fehérje alegységek közötti BRETet. A. A sejteket Ang II-vel és WIN55,212-2-vel (WIN55, 1μM) (piros), illetve AM251-el majd Ang II-vel (kék) kezeltük. A kontroll sejtek médiumot kaptak (fekete). B. Az AT1R-t és CB1R-t koexpresszáló CHO sejteket BAPTA-AM-el töltöttük, Ang II-el majd WIN55-el stimuláltuk (piros), vagy médiumot adtunk a sejtekhez (fekete). C. Az AT1R-t és CB1R-t koexpresszáló CHO sejtek ionomycint (1μM) majd WIN55-öt (piros), vagy médiumot majd AM251-et (fekete) kaptak. D. A, B
38
és C paneleken ábrázolt adatok statisztikai értékelése. Az első stimulálást követő öt mérési pont átlaga a kontroll illetve az Ang II-vel vagy ionomycinnel stimulált mintákból (n=3; *, p<0,01). Az A, B és C panelek felső részében a Ca2+ jelek detektálása látható FURA2-vel.
Kontroll esetben Ang II hatására Ca2+ jel detektálható (12. ábra, A panel), azonban BAPTA-AM-el előkezelve a sejteket az Ang II hatására létrejövő Ca2+ jelet teljesen ki lehet védeni (12. ábra, B panel). A CB1R aktiválódása azonban ilyen körülmények között is létrejön (12. ábra, B panel). A továbbiakban megvizsgáltuk, vajon ionomycinnel kiváltott Ca2+ jel CHO sejtekben létrehoz-e CB1R aktiválódást. COS sejtekben DAGL expresszálása esetén ionomycinnel fokozható volt a sejtek 2-AG termelése (43). Ionomycin adására Ca2+ jelet lehet mérni a CHO sejtekben, azonban ez nem vezet hasonló mértékű CB1R aktiválódáshoz, mint az AT1R stimulálása (12. ábra, C panel). A kísérletekben mérhető volt minimális
CB1R
aktivitás-fokozódás,
azonban
ez
statisztikailag
nem
bizonyult
szignifikánsnak az adott kísérletszám mellett (12. ábra, D panel). Kontroll kísérletekben megvizsgáltuk, hogy amennyiben a CB1R-t vagy az AT1R-t nem expresszáljuk a rendszerben, észlelünk-e G-fehérje aktiválódást (13. ábra). Amennyiben a receptorok közül csak AT1R-t expresszáltattunk a sejtekben, Ang II vagy CB1R agonista WIN55,212-2 hatására nem tapasztaltunk BRET jel csökkenést (13. ábra, A panel). CB1R expressziója esetén, AT1R-t expresszáló sejtek nélkül, az Ang II nem csökkentette a BRET jelet, azonban a WIN55,212-2 igen, ami összhangban van azzal, hogy ezek a sejtek CB1R-t expresszálnak (13. ábra, B panel). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Ang II hatására létrejövő Go aktiválás CB1R-on keresztül jött létre.
13. ábra CB1R vagy AT1R expressziója nélkül nem aktiválódik a Go-fehérjét A. A sejtek AT1R-t és G-fehérje alegységeket expresszáltak, azonban CB1R-t nem, és Ang II-vel és WIN55-el (piros) kezeltük, vagy médiumot kaptak (kontroll, fekete). B. CHO sejtekben expresszáltattunk CB1R-t és G-fehérje alegységeket, azonban AT1R-t nem, és Ang II-vel majd WIN55-el (piros) kezeltük, vagy médiumot, majd AM251-et kaptak (fekete) (n=3).
39
Az endokannabinoidok közül a 2-AG keletkezése neuronokban Gq-kapcsolt receptorok stimulálása során kalciumtól függetlenül is létrejöhet (65;66), ezért megvizsgáltuk, vajon a transzaktiválás létrejön-e, ha a 2-AG keletkezését katalizáló DAGL-t gátoljuk az ismert DAGL gátló tetrahydrolipstatinnel (THL). A 14. ábra A panelén látható kontroll sejtekhez képest a B panelen látható, hogy THL előkezelést követően a CB1R aktiválódás elmarad Ang II hatására, ami a 2-AG szerepére utal a folyamatban. A C panelen látható a G-fehérje aktivitás kvantifikálása és összehasonlítása nem előkezelt sejtekkel. Ang II-vel történt stimulálás nem okozott szignifkáns BRET jel változást THL-el előkezelt sejtekben.
14. ábra THL kivédi az AT1R által létrehozott CB1R aktivációt. CHO sejtekben koexpresszáltunk AT1R-t és CB1R-t és mértük a Go-fehérje alegységek közötti BRET-et. A. A sejteket Ang II-vel (100 nM) majd candesartannal (1 μM) (piros), illetve AM251-el majd Ang II-vel (kék) kezeltük. A kontroll sejtek médiumot kaptak (fekete). B. Az A panelen látható kísérletet ismételtük THL előkezelés mellett. C. Az A és B panelen látható mérések kvantifikálása és statisztikai elemzése. A BRET jel változását ábrázoltuk a kontroll periódushoz (első 5 időpont) képest (n=3-4, *, p<0,01).
Adataink arra utalnak, hogy a AT1R stimulálása DAGL függő CB1R aktiválódáshoz vezet, és ez a transzaktiváció Ca2+ jeltől függetlenül jön létre.
40
6.3. A CB1R AT1R általi transzaktiválása parakrin úton is létrejöhet Hipotézisünk szerint az AT1R általi CB1R transzaktiválás endokannabinoid termelődéssel jön létre, azonban az egy sejtben koexpresszált receptorok esetében felmerülnek egyéb mechanizmusok is. Ilyen lehetséges mechanizmus a receptorok heterodimerizációja (254). Amennyiben azonban a transzaktiválás mechanizmusa endokannabinoid felszabadulás, a CB1R-nak aktiválódnia kell akkor is, ha nem azonos sejtben expresszáljuk a két receptort. A további kísérletekben az AT1R-t és a CB1R-t külön sejtekben expresszáltuk, majd a kísérletek előtt összekevertük a két különböző receptort expresszáló sejtet. A CB1R aktivitását így az egyik sejtben tudtuk mérni, míg a mellette levő sejtek AT1R-t expresszáltak.
15. ábra Pararkrin CB1R aktiválás Az AT1R-t és a CB1R-t külön CHO sejtekben expresszáltuk, majd mérés előtt összekevertük a szuszpendált sejteket és mértük a Go-fehérje aktivációját. A. A sejteket Ang II-vel (100 nM) majd WIN55-el (piros) vagy AM251-et követően Ang II-vel kezeltük (kék), vagy médiumot kaptak (fekete). B. Az AT1R-t expresszáló sejteket a mérés előtt 15 perccel előkezeltük THL-el (1μM), a sejteket Ang II-vel és WIN55-el (piros) kezeltük, vagy médiumot és AM251-et kaptak (fekete). C. Az A és B paneleken ábrázolt adatok statisztikai értékelése. Az első stimulálást követő öt mérési pont átlaga a kontroll illetve az Ang II-vel stimulált mintákból (n=3; *, p<0,01). D. A CB1R-t expresszáló sejtek számát állandó értéken tartva, az AT1R-t expresszálók mennyiségét növelve vizsgáltuk a CB1R relatív aktivitását Ang II stimulációra. A relatív aktivitás kiszámításánál 0%-nak vettük az AM251 adása után mért BRET jelet, 100%-nak pedig a WIN55,212-2-re mért választ.
41
A 15. ábra A panelén látható, hogy ilyen körülmények között is csökkent a BRET jel a CB1R-t expresszáló sejtekben Ang II-vel történt stimulálást követően, azaz aktiválódott a CB1R. Az aktivációt ez esetben is ki lehetett védeni AM251-el és az AT1R-t expresszáló sejtek THL előkezelésével (15. ábra A és B panel). A C panelen látható az eredmények kvantifikálása és statisztikai elemzése. Az AT1R-t expresszáló sejtek arányát 1/10 és 5/1 között változtatva konstans CB1R-t expresszáló sejtszám mellett, a létrejött CB1R aktiválódás mértéke egyre nagyobb volt (15. ábra, D panel), ami szintén arra utal, hogy az AT1R-t expresszáló sejtekből felszabaduló valamilyen endokannabinoid lehet a felelős az aktivációért. Megvizsgáltuk, létrejön-e a transzaktiválás akkor is, ha az AT1R receptort HEK-293 vagy COS-7 sejtekben expresszáljuk. A 16. ábra A és B panelén látható, hogy más sejtek esetén is megfigyelhető a jelenség, tehát a parakrin transzaktiváció nem CHO sejtspecifikus. A változás statisztikailag szignifikáns volt (C panel).
16. ábra CB1R aktiválása HEK-293 és COS-7 sejtekben expresszált AT1R-al HEK-293 (A) és COS-7 (B) sejtekben expresszáltunk AT1R-t, majd összekevertük CB1R-t és Go-fehérje alegységeket expresszáló CHO sejtekkel, majd Ang II-vel és AM251-el (piros) vagy AM251-el és Ang II-vel (kék) kezeltük. A kontroll sejtekhez médiumot adtunk a stimulusok időpontjában (fekete). C. Az A és B paneleken ábrázolt adatok statisztikai értékelése. Az első stimulálást követő öt mérési pont átlaga a kontroll illetve az Ang II-vel stimulált mintákból (n=4; *, p<0,01).
42
6.4. A CB1R β-arresztin2 kötésének jellemzése A transzaktiváció vizsgálatához a továbbiakban olyan kísérleti felállást igyekeztünk beállítani, ahol a G-fehérje aktiválódástól eltérő rendszerben tudjuk megvizsgálni a CB1R aktivációját. A legtöbb 7TMR aktivációját β-arresztin fehérjék kötődése követi, ami a továbbiakban a receptor internalizációját eredményezi. β-arresztin kötődés vizsgálatával így követhető a receptorok aktivációja. A receptor-β-arresztin kapcsolat különböző 7TMR-ok esetén eltérhet, és ez alapján két fő osztályba, A és B osztályba sorolhatók (255). Az A osztályba tartozó 7TMR-ok aktiválódást követően kötik a β-arresztin molekulát, azonban a kötés átmeneti, nagyon gyorsan szétválik a két fehérje (255). A β-arresztin kihelyeződik a membránon található receptorokhoz, azonban az internalizált receptoron már nem található meg, nem lokalizálódik intracelluláris vezikulákhoz. Ezzel szemben a B osztályba tartozó 7TMR-ok tartósan képesek β-arresztint kötni aktiválódás után és a két fehérje együtt található meg intracelluláris vezikulákon (255). CB1R aktivációját követően is megfigyelhető a βarresztin kötödése a receptorhoz (256;257). Kísérleteinkben megvizsgáltuk, vajon a CB1R melyik osztályba tartozik β-arresztin kötés szempontjából és β-arresztin kötését összehasonlítottuk az ismerten B osztályba tartozó AT1R-al és a nem internalizálódó 7TMR AT2 angiotenzin II receptorral (AT2R). Megvizsgáltuk továbbá, hogy a G-fehérje aktiváláshoz képest milyen érzékenységgel lehet detektálni a CB1R aktivációt β-arresztin kötődés segítségével. A receptorok β-arrestin2 kötését két felállásban, konfokális mikroszkóppal és energiatranszferrel vizsgáltuk. A konfokális mikroszkópos kísérletekhez a sejteket zöld fluoreszcens fehérjével jelölt β-arresztin2-vel (βarr2-GFP) és a megfelelő receptorokkal kotranszfektáltuk. Az AT1R-t és az AT2R-t rhodaminnal jelölt Ang II-vel (Rhod-Ang II) tettük láthatóvá, a CB1R-t pedig piros fluoreszcens fehérjével (RFP) jelöltük (CB1R-RFP). A 17. ábra A panelén látható, hogy a sejtek Ang II kezelését megelőzően az AT1R és AT2R expresszálása esetén is a βarr2-GFP diffúzan helyezkedik el a citoplazmában. Rhod-Ang II-vel stimulálva a korábbi adatoknak megfelelően
az
AT1R-t
expresszáló
sejtekben
a
βarr2-GFP
transzlokálódik
a
plazmamembránhoz, majd a piros Ang II-vel együtt megjelenik az intracelluláris vezikulákon (17. ábra, B panel). Ez a kép megfelel annak, hogy az AT1R β-arresztin kötés szempontjából a B osztályba tartozik (255). Az AT2R ugyan köti a Rhod-Ang II-t, azonban a receptor nem internalizál, és a βarr2-GFP sem transzlokálódik a membránhoz (17. ábra, C panel).
43
17. ábra Az AT1R és az AT2R βarresztin2 kötése βarr2-GFP-t és AT1R-t vagy AT2R-t expresszáló HEK-293 sejtekben látható a βarr2-GFP lokalizációja kontroll körülmények között (A), és 20 perc Rhod-Ang II-vel (50 nM) történt stimulációt követően (B és C). A B és C panelen felül látható a Rhod-Ang II, középen a βarr2-GFP, alul pedig ezeknek az egymásra vetített képe, ahol a kolokalizáló struktúrák sárga színűek.
Kontroll körülmények között a CB1R-RFP a plazmamembránon és intracelluláris B
vezikulákban helyezkedik el. Az intracelluláris vezikulák jelenléte a receptor konstitutív internalizációjára utal (248), azonban βarr2-GFP elhelyezkedése diffúz, sem a membránhoz, sem a vezikulákhoz nem lokalizálódik. Irodalmi adatokból ismert, hogy WIN55,212 hatására a
receptor
internalizálódik,
a
membránreceptor-szám
lecsökken,
az
intracelluláris
receptorszám pedig növekszik (248;258). WIN55,212-2-vel történő stimulálást követően βarr2-GFP kihelyeződik a plazmamembránhoz, jelezve a receptor aktivációját (18. ábra). A βarr2-GFP nem jelenik meg vezikulákon, ami tranziens receptor-β-arresztin kapcsolatra utal. A CB1R-t ez alapján az A osztályba sorolhatjuk.
18. ábra A CB1R β-arresztin2 kötése CHO sejtekben koexpresszáltunk CB1RRFP-t (bal oldal) és βarr2-GFP-t (jobb oldal). Felül a nem stimulált sejteket látjuk, alul pedig 20 perc stimulálást követően (WIN55,212-2, 1μM). A jobb oldali képek bal alsó sarkában a bekeretezett részt látjuk kinagyítva
44
Kontroll sejtekben a diffúz βarr2-GFP elhelyezkedés meglepő, annak ismeretében, hogy a CB1R konstitutívan aktív és a G-fehérje aktiváció mérésekor is kb. 50%-os bazális aktivitást mérünk (lásd később, 27. ábra). A megfigyelést kétféleképpen lehet magyarázni. Az egyik lehetőség az, hogy a konstitutív internalizáció mechanizmusa eltér a stimulációt követő internalizációtól. A másik lehetőség az, hogy a G-fehérje aktiválás és βarr2-GFP transzlokáció szempontjából eltérő a receptor érzékenysége és olyan 2-AG koncentrációknál ahol a G-fehérje aktiválás már maximális, esetleg még nem detektálható a βarr2-GFP kötése. A CB1R és a β-arresztin2 kötésének agonista-koncentráció függését BRET technikán alapuló méréssel vizsgáltuk. A BRET jelet a receptor és a β-arresztin2 között detektáltuk, ezáltal érzékenyebben lehet követni a két fehérje kapcsolódását, továbbá a módszer lehetőséget biztosít a kapcsolódás kvantifikálására.
19. ábra Az AT1R, az AT2R és a CB1R β-arresztin2 kötésének vizsgálata BRET-el EYFP-vel jelölt receptorok és Rluc-al β-arresztin2 közötti interakciót követtük BRET segítségével. Fekete: kontroll sejtek, piros: stimulált sejtek (100 nM Ang II, 1 μM WIN55,212-2, 10 μM 2-AG, n=3).
45
Először megvizsgáltuk a β-arresztin2 kötésének a kinetikáját és összevetettük más 7TMR-okkal. A mérésekhez a receptorokat EYFP-vel (AT1R-YFP, AT2R-YFP és CB1RYFP), a β-arresztint pedig Renilla luciferázzal (βarr2Rluc) jelöltük. A 19. ábrán látható, hogy stimulálásra a BRET jel az AT1R és a CB1R esetében növekszik, AT2R esetében viszont nem változik a konfokális mikroszkópban látottaknak megfelelően. 2-AG-vel történő stimulálás esetén a BRET jel növekedése átmeneti, 5-10 perc után csökken, ami megfelelhet a 2-AG lebomlásának. A továbbiakban megvizsgáltuk, hogyan változik a CB1R β-arresztin2 kötése az alkalmazott agonista koncentráció függvényében (20. ábra). Összevetve a G-fehérje aktiválás és a β-arresztin kötés dózis-hatás görbéjét láthatjuk, hogy β-arresztin kötés esetén a görbe kb. két nagyságrenddel jobbra tolt (EC50=1.93 μM, 95% konfidencia intervallum: 1.37 - 2.73 μM) a G-fehérje aktiváláshoz képest (EC50=39.94 nM, 95% konfidencia intervallum: 34.25 – 46.59 nM). A β-arresztin kötődés még alig detektálható, amikor a G-fehérje aktiválása már maximális. Ez megmagyarázza, hogy miért nem látható kontroll körülmények között βarr2GFP transzlokáció a membránhoz annak ellenére, hogy a receptor bazális aktivitása jól mérhető.
20. ábra A CB1R G-fehérje aktiválásának és βarresztin2 kötésének dózis-hatás görbéi Változó 2-AG koncentrációk mellett mértük a CB1R G-fehérje-aktiválását és β-arresztin2 kötését. A mért értékeket százalékban fejeztük ki, az ábrázolásnál és EC50 számításánál 0%-nak állítottuk be minimális értéket, 100%-nak pedig a Bmax -ot. B
Annak érdekében, hogy fokozzuk a CB1R β-arresztin kötés detektálásának az érzékenységét konfokális mikroszkópban, a 7TMR-okban konzervált, G-fehérje aktiváláshoz szükséges második intracelluláris hurkon található DRY szekvenciát (aszpartát-arginin-tirozin aminosavak) AAY (alanin-alanin-tirozin) szekvenciára cseréltük (CB1R-DR/AA). Egyes 7TMR-ok esetében a DRY szekvencia megváltoztatása megnövekedett β-arresztin kötést eredményezett (259). Az 21. ábrán látható, hogy DRY/AAY mutáns CB1R-RFP-t (CB1RDR/AA-RFP) koexpresszálva βarr2-GFP-vel CHO sejtben azt tapasztaltuk, hogy szemben a vad típusú receptorral, kontroll sejtekben is látható a βarr2-GFP transzlokáció a membránhoz
46
(21. ábra, bal oldal). A bazális membránlokalizáció fokozható WIN55,212-2-el és gátolható AM251-el (21. ábra, középen és jobb oldal). DRY mutáns CB1R WIN55,212-2-el történt serkentése esetén a βarr2-GFP transzlokációja a vad típusú receptorhoz képest fokozott, gyakorlatilag eltűnik a zöld fluoreszcencia a citoplazmából (21. ábra, középen). A mutáns CB1R fokozott βarr2-GFP kötése lehetőséget ad arra, hogy megfelelően nagy érzékenységgel tudjuk detektálni a CB1R aktivációját konfokális mikroszkópos mérésekben.
21. ábra A CB1R-DR/AA-RFP βarr2-GFP kötésének vizsgálata CHO sejtekben koexpresszáltunk CB1R-DR/AA-RFP-t és βarr2-GFP-t, majd vizsgáltuk a βarr2-GFP lokalizációját a sejtekben kontroll körülmények között (bal) és WIN55,212-2 (1 μM, középen), majd AM251 (10 μM, job) hozzáadását követően. A bal felső sarkokban a keretezett rész látható kinagyítva. A bal oldalon a nyilak a kontroll sejtekben is megfigyelhető βarr2-GFP membránlokalizációját jelzik.
6.5. Parakrin transzaktiváció mérése β-arresztin kötés vizsgálatával A továbbiakban megvizsgáltuk, hogy a beállított érzékeny rendszerben kimutatható-e AT1R serkentésekor a CB1R aktivációja. A kísérletekben azt néztük tehát, hogy történik-e βarresztin kötődés a CB1R-hoz amennyiben CB1R-t expresszáló sejtek melletti AT1R-t expresszáló sejteket stimulálunk Ang II-vel. Kontroll kísérletben, CB1R-DR/AA-RFP-t és βarr2-GFP-t expresszáló sejteket Ang II-vel stimulálva nem látunk βarr2-GFP transzlokációt a membránhoz (22. ábra). WIN55,212-2-vel történő stimulációval látható, hogy a sejtekben expresszálódik és aktiválható a CB1R .
47
22.ábra βarr2-GFP lokalizációja CB1R-DR/AA-RFP-t expresszáló CHO sejtekben CB1R-DR/AA-RFP-t és βarr2-GFP-t koexpresszáló sejteket stimuláltunk Ang II-vel (középen) majd WIN55,212-2-vel (jobb oldal).
A következő kísérletben CHO sejteket transzfektáltunk CB1R-DR/AA-RFP-vel és βarr2-GFP-vel, majd a transzfektálást követő napon AT1R-YFP-vel transzfektált sejtekkel összekeverve fedőlemezre helyeztük. Másnap konfokális mikroszkópban vizsgáltuk a βarr2GFP transzlokációját a membránhoz. A 23. ábra bal oldalán látható a CB1R-DR/AA-RFP-t expresszáló sejt, a jobb oldalon pedig ugyanebben a sejtben látható a βarr2-GFP. A jobb oldalon látható továbbá a CB1R-DR/AA-RFP-t expresszáló sejt mellett két, AT1R-YFP-t tartalmazó sejt. 23. ábra A CB1R aktivációja a szomszédos sejtek AT1R-ának stimulálásával Egymás mellett elhelyezkedő AT1R-YFP-t és CB1R-DR/AA-RFP-t meg βarr2-GFP-t expresszáló sejteket stimuláltunk Ang II-vel (alul). Bal oldalon látható az RFP (CB1R), jobb oldalon pedig az EGFP és EYFP (βarr2-GFP és AT1R-YFP). A jobboldali képek bal alsó sarkában nagyítva látható a kijelölt terület.
48
Az ábrán látható, hogy kontroll körülmények között (fent) a βarr2-GFP nagyobb része diffúzan található a citoplazmában és egy része a membránhoz lokalizálódik, a korábbiaknak megfelelően. A sejteket Ang II-vel stimulálva, 1 perc után már megfigyelhető, hogy a βarr2GFP eltűnik a citoplazmából, és a membránra helyeződik át (23. ábra, jobb oldal, lent). Ez az eredmény is azt mutatja, hogy AT1R serkentésekor endokannabinoid szabadul fel, ami aktiválni tudja a szomszédos sejtekben elhelyezkedő CB1R-t. 6.6. AT1R stimulálásával fokozódik a CHO sejtek 2-AG termelése A THL gátló hatása a CB1R AT1R általi transzaktivációjára a 2-AG szerepét valószínűsíti a folyamatban, ezért megvizsgáltuk, vajon AT1R stimulálásával valóban fokozódik-e CHO sejtek 2-AG termelése. CHO sejteket transzfektáltunk AT1R-al és kontroll illetve stimulált (1, 2, 3 és 5 perc, 100 nM Ang II) sejtekből lipidextrahálást követően tömegspektrometriás méréssel meghatároztuk a 2-AG mennyiségét. A 24. ábrán látszik, hogy Ang II stimulálást követően a 2-AG mennyisége nőtt a sejtekben és a növekedés kinetikája hasonlít arra a kinetikára, amit CB1R transzaktiválásnál láttunk. A méréssel igazoltuk, hogy a CHO sejtek képesek 2-AG termelésre AT1R stimulálása esetén. Eredményeink megerősítik, hogy az AT1R általi CB1R transzaktiváció mechanizmusában 2-AG termelés szerepel.
24. ábra CHO sejtek 2-AG termelése expresszált AT1R stimulálásakor Kontroll sejtekből illetve stimulálást követően lipidextrahálást végeztünk, majd meghatároztuk a sejtek 2-AG mennyiségét.
49
6.7. CB1R transzaktiválása más Gq -fehérjéhez kapcsolt receptorokkal Korábban már kimutatták néhány Gq-fehérjéhez kapcsolt 7TMR esetében, hogy aktiválódásuk endogén szövetekben 2-AG termelést eredményez. Ilyen receptorok a Gqkapcsolt metabotróp glutamátreceptorok, muszkarinos acetil-kolin receptorok, ghrelin receptor, CCKA receptor, orexin receptor. A további kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy vajon AT1R-tól eltérő, de Gq-aktiváló receptorokkal is látunk-e CB1R transzaktivációt a kísérleti rendszerünkben. CHO sejtekben expresszáltattunk CB1R-t és G-fehérje alegységeket, majd összekevertük mérés előtt a sejteket más receptort expresszáló sejtekkel. A 25. ábrán látható, hogy amennyiben M1, M3, M5 muszkarinos acetil-kolin receptort (M1R, M3R, M5R, mind Gq-kapcsolt) expresszáltattunk, carbachollal stimulálva BRET jel csökkenést, vagyis Go aktiválást tapasztaltunk. Ez megfelel azoknak az irodalmi adatoknak, hogy e receptorok aktiválódása endokannabinoid felszabadulást hoz létre neuronokban. Ezzel szemben a Gi/ofehérjékhez kapcsolt M2 és M4 muszkarinos acetil-kolin receptorok (M2R, M4R) expresszálása esetén carbachol stimuláció nem okozott CB1R aktiválódást. Ugyancsak parakrin CB1R aktivációt tudtunk elérni más Gq-aktiváló receptorokkal is, mint a V1 vazopresszin- (V1R), B2 bradikinin- (B2R) és az α1-adrenerg- (α1-AR) receptorok. B
25. ábra Parakrin CB1R aktiváció Gq/11-kapcsolt 7TMR-ok stimulálásával Az különböző 7TMR-okat és a CB1R-t külön CHO sejtekben expresszáltuk, majd mérés előtt összekevertük a szuszpendált sejteket és mértük a Go-fehérje aktivációját. Az első stimulálást követő öt mérési pont átlagát ábrázoltuk a kontroll illetve a stimulált mintákból (n=3; *, p<0,01). A stimuláláshoz carbacholt (10 μM, acetil-kolin receptorok esetén), phenylephrine-t (100 μM, α1-AR), bradikinint (100 nM, B2R) és AVP-t (100 nM, V1R) használtunk. B
50
Kontroll kísérleteinkből látszik, hogy CB1R vagy Gq/11-kapcsolt 7TMR expresszálása nélkül nem jön létre Go aktiválódás (26. ábra). Ez arra utal, hogy ez esetben is arról van szó, hogy a Gq/11-kapcsolt 7TMR-okat stimulálva parakrin úton aktiválódott a CB1R.
26. ábra A parakrin aktivációhoz szükséges a Gq/11-aktiváló 7TMR és a CB1R is A. CB1R-t és Go-fehérje alegységeket expresszáló sejteket stimuláltunk különböző agonistákkal. B. és C. Gq/11-kapcsolt 7TMR-okat expresszáló CHO sejteket kevertünk össze Go alegységeket expresszáló (de CB1R-t nem) sejtekkel, majd a megfelelő agonoistákkal stimuláltunk. Az első stimulálást követő öt mérési pont átlagát ábrázoltuk a kontroll, illetve a stimulált mintákból (n=3). (carbachol 10 μM, phenylephrine 100 μM, bradikinin 100 nM, AVP 100 nM)
6.8. A DAGL gátlása csökkenti a CB1R bazális aktivitását A CB1R nagy mértékű bazális aktivitását az irodalom a receptor saját tulajdonságának, konstitutív aktivitásnak tulajdonítja (214). A 14. ábrán egy érdekes dolgot lehet megfigyelni, mégpedig, hogy THL előkezelés hatására az AM251 kevésbé gátolta a CB1R bazális aktivitását, mint nem előkezelt sejtekben. Ez alapján felmerül, hogy a bazális aktivitást esetleg a
sejtben
folyamatosan
termelődő
endokannabinoidok
hozzák
létre.
A
kérdés
megválaszolásához DAGL gátló tetrahydrolipstatinnal (THL) előkezelt sejtekben vizsgáltuk a CB1R aktivitását BRET jel változás mérésével, illetve a CB1R internalizációjának követésével.
51
Két órás 1 μM THL előkezelést követően a G-fehérje aktiválódást mérve azt tapasztaltuk, hogy WIN55,212-2-vel stimulálva továbbra is lehet BRET jel csökkenést mérni, sőt a csökkenés mértéke még nagyobb volt, mint nem előkezelt sejtekben (27. ábra A és B panel). Ezzel szemben, inverz agonistát adva, a BRET jelnövekedés jelentősen kisebb volt, mint kontroll sejtekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a CB1R bazális aktivitása kisebb THL előkezelt, mint kontroll sejtekben. Megvizsgálva a bazális aktivitás gátlásának kinetikáját azt tapasztaljuk, hogy THL adását követően lassú folyamatos BRET jel növekedést (27. ábra, C panel), azaz CB1R aktivitás csökkenést látunk, ami arra utalhat, hogy a sejtekben levő 2-AG szint folyamatosan csökken. A változás sebessége összevethető más mérésekben kapott 2-AG hatásának lecsengésének sebességével (lásd fent, CB1R és β-arresztin közötti kapcsolat kinetikája 2-AG adása esetén, 19. ábra).
27. ábra THL előkezeléssel a CB1R bazális aktivitása csökkenthető CHO sejtekben követtük a CB1R aktivációját Go-fehérje alegységek közötti BRET segítségével. Kontroll (A) és THL előkezelt (1 μM, 3 óra, B) sejtekhez adtunk WIN55,212-2-t (1 μM) majd AM251-et (10 μM) (piros), AM251-et követően WIN55,212-2-t (kék) vagy csak médiumot (fekete). C. A CB1R aktivitását mértük kontroll körülmények között (fekete), illetve THL kezelést (kék) követően. D. Az A és B panelen látható mérések kvantifikálása és statisztikai elemzése. A BRET jel változását ábrázoltuk a kontroll periódushoz (első 5 időpont) képest (n=4, *, p<0,01).
52
A mérés végén adott AM251 kontroll és THL előkezelt sejtekben is azonos értékre növelte a BRET jelet, ami mutatja, hogy a BRET jel növekedése a kezelt sejtekben a CB1R aktivitásának a csökkenésével jött létre. A 27. ábra A és B panelén látható adatok statisztikai elemzése a D panelen látható. Látható, hogy AM251 hatására kisebb a BRET jel növekedése, azonban a várakozásoknak megfelelően WIN55,212-2 hatására a csökkenés nagyobb (27. ábra, D panel). A THL hatását megvizsgáltuk egyéb módszerekkel is. Ismert, hogy agonista hatására a CB1R aktiválódást követően internalizál. Az internalizáció azonban nem csak stimulált sejtekben figyelhető meg, hanem kontroll sejtekben is. A konstitutív internalizációnak megfelelően a receptorok jelentős hányada intracelluláris vezikulákban található. A konstitutív internalizáció gátolható CB1R inverz agonistával, ami arra utal, hogy a bazális aktivitás szükséges a konstitutív internalizációhoz (248). Kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy vajon a bazális aktivitás gátlása THL-el hogyan befolyásolja a CB1R internalizációját. A méréshez EYFP-vel jelölt CB1R-t (CB1R-YFP) expresszáltattunk CHO sejtekben és konfokális mikroszkópban vizsgáltuk a receptor lokalizációját. A 28. ábrán látható, hogy kontroll sejtekben a receptor megtalálható a sejtmembránban és intracelluláris vezikulákban egyaránt.
28. ábra THL előkezelés csökkenti a CB1R internalizációját CHO sejtekben CHO sejtekben expresszáltunk CB1R-YFP-t és konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk a receptor elhelyezkedését a sejtben. A. Reprezentatív felvételek kontroll nemstimulált (fent, balra), kontroll, WIIN55,212-2-el (1μM) stimulált (balra, lent), és THL-el előkezelt (1 μM, 3 óra) nem stimulált (jobbra, fent) és stimulált (jobbra, lent) sejtekről. B. Konfokális mikroszkópban készített felvételeken mértük a membrán- és az intracelluláris fluoreszcenciát majd a hányadost ábrázoltuk. (n=4-5, mintánként 20 sejt, *, p<0,05).
53
WIN55,212-2 adását követően a membránon látható fluoreszcencia csökken és a receptor főleg intracelluláris vezikulákban helyezkedik el. 3 óra THL előkezelést (1 μM) követően azonban a sejtfelszíni receptorszám növekszik, az intracelluláris vezikulák száma pedig csökken. A mérések kvantifikálásához a konfokális mikroszkóppal készített felvételeken lemértük a membránfluoreszcenciát és elosztottuk a teljes fluoreszcenciával (28. ábra, B panel). Mivel egy mintában levő egyes sejtek között is viszonylag nagy variancia volt a lokalizációban, méréseinket vakon végeztük (felvétel készítése, illetve a fluoreszcencia mérése, számolás), hogy kizárjuk a vizsgáló elvárásainak hatását a kapott eredményre. Mintánként 20 sejtről készült felvétel. A 28. ábra B panelén látható, hogy WIN55,212-2 hatására csökkent a hányados (fokozódott az internalizáció). THL-al előkezelve a sejteket az internalizáció lecsökkent, azonban WIN55,212-2–vel továbbra is a kezeletlen mintának megfelelő internalizációt lehetett létrehozni, ami arra utal, hogy a bazális aktivitás csökkent, de a CB1R aktiválhatósága megmaradt. Kollaborációban elvégzett kísérletekben (a kísérleteket Lenkei Zsolt munkacsoportja végezte) azt láttuk, hogy patkány hippocampus neuronokon is hasonló változás történik THL hatására, az expresszált jelölt CB1R intracelluláris vezikulákból áthelyeződött a sejttest plazmamembránjára. Az adatok alapján kijelenthető, hogy a THL előkezelés csökkenti a CB1R bazális aktivitását, ami G-fehérje aktivitásának és az internalizációnak a mérésével is igazolható volt. Adataink arra utalnak, hogy a CB1R bazális aktivitásában szerepe lehet a sejtekben folyamatosan termelődő 2-AG-nek. A bazális aktivitás nem csak CHO sejtvonalban volt gátolható THL-al, hanem CB1R-t endogénen expresszáló hippocampus neuronokon is hasonló mechanizmussal jön létre.
54
7. MEGBESZÉLÉS A kannabinoid rendszer működésének kutatása az utóbbi időben nagy mértékben felgyorsult, az elmúlt években már évi több ezer cikk jelenik meg a területen (260). A kannabinoid rendszert elsőként az idegrendszerben térképezték fel alaposabban, ami a jellegzetes idegrendszeri kannabinoid hatásoknak tudható be. A CB1R-t is mint agyi kannabinoid receptort említik sokszor a perifériás CB2R-al szemben, azonban az utóbbi évek kutatásai egyértelműen arra utalnak, hogy habár az expressziója kisebb a periférián, mint a központi idegrendszerben, a CB1R-nak itt is jelentős szerepe van. A CB2R szerepe pedig nem korlátozódik a perifériára, hanem feltehetőleg a központi idegrendszerben is részt vesz bizonyos szabályozási mechanizmusokban (261). Az endogén kannabinoidok egyéb receptorok működését is befolyásolják, így az endokannabinoid rendszer még összetettebbé válik (10). A központi idegrendszerben a kannabinoidok metabolizmusában szereplő enzimek egymás és a kannabinoid receptorok közelében helyezkednek el, ami jól szabályozott működést feltételez (242;243). Ezzel szemben áll az az adat, hogy pl. a 2-AG összkoncentrációja az agyban mikromoláros koncentrációban van, ami folyamatos receptoraktiválást feltételez (22). A 2-AG termelés depolarizáció vagy Gq/11-fehérjék aktiválódására termelődik és felszabadul a posztszinaptikus sejtben (49;59;70). Periférián a kannabinoidok termelődésének a pontos szabályozása azonban nem ismert, általában „endokannabinoid tónust” említenek. Számos szövetben kimutathatóan jelen van a 2-AG, és bizonyos esetekben, mint pl. az elhízás, a plazma, illetve bizonyos szövetek 2-AG koncentrációja megemelkedik. A fiziológiás kannabinoid termelődés és CB1R működés szabályozása a periférián jórészt ismeretlen. A 2-AG termelődésért felelős DAGL enzimek gyakorlatilag az összes szövetben megtalálhatók (43), így felmerült, hogy a szintén ubikviter PLCβ-val kapcsoltan bármely sejt képes lehet endokannabinoid termelésre. Kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy a koexpresszált, vagy szomszédos sejtekben külön expresszált Gq/11fehérjéhez kapcsolt receptorok képesek-e növelni a CB1R aktiválódását, vagyis lehetséges-e a CB1R autokrin vagy parakrin aktiválódása egy olyan sejtvonalban ami nem expresszál endogénen CB1R-t. Amennyiben ez lehetséges, az arra utalhat, hogy az endokannabinoid termelés egy általános, számos szövetben jelenlevő szignalizáció lehet Gq/11-kapcsolt receptorok esetében. Kísérleteinkhez
a
CB1R
aktiválódását
mértük
különböző
rendszerekben.
Energiatranszfer mérésével G-fehérjék alegységei között lehetővé vált a G-fehérje aktivitás
55
mérése, ugyanis az α és a βγ alegységek szétválása során a BRET jel lecsökken. Energiatranszfer mérések alapján merült fel az utóbbi időben, hogy a G-fehérje alegységek nem válnak szét, csak megváltozik a heterotrimer konformációja (253). Az α alegységet nem lehet a szokásos módon, az N- vagy C-terminálison megjelölni fluorofórokkal mert az tönkreteszi a fehérje működését. A kristályszerkezet alapján azonban találtak egyéb helyeket (hurkokat) a fehérjében, ahova a fluoreszcens fehérjéket el lehetett úgy helyezni, hogy az ne gátolja az alegység működését (253). Van olyan pozíció, ahova a fluorofórt behelyezve aktiválódás során nem nő, hanem csökken a BRET jel, amiből arra következtettek, hogy az alegységek nem válnak szét, hanem csak konformációváltozás történik. Az általunk használt konstrukció esetén a BRET jel csökkent agonistákkal stimulálva és nőtt antagonisták adására. A módszer lehetőséget ad arra, hogy folyamatosan detektáljuk a CB1R aktivitását élő sejtekben, önkontrollos kísérletekben. A beállított rendszer segítségével megvizsgáltuk, hogy Gq/11-kapcsolt
receptorok
stimulálásával
létrejön-e
endokannabinoid
termelődés.
Kísérleteinkben Gq/11-fehérjéhez kapcsolt AT1R-t koexpresszáltunk CB1R-al CHO sejtekben és Ang II stimulálás hatására a CB1R aktivitása fokozódott. A CB1R transzaktiválása gátolható volt THL-el, ez arra utal, hogy a mechanizmusban endokannabinoid (2-AG) termelés szerepelhet. Két 7TMR koexpressziója esetén azonban felmerül a receptorok dimerizációjának a lehetősége is (254). Két receptor dimerizációja befolyásolhatja a szignáltranszdukciós útvonalukat, egyik receptor gátlása a dimer másik felének a gátlását okozhatja, vagy megváltozhat a receptorok jelátviteli mechanizmusa (262). CB1R esetében is van példa dimerizációra más receptorokkal. A Gq/11-hez kapcsolt orexin-1 receptor esetében a CB1R koexpressziója az orexin A hatására létrejövő Erk1/2 aktiválás dózis-hatás görbéje balra tolódik (93). A hatásban nem merült fel az autokrin transzaktiválás lehetősége, a jelenséget dimerizációval magyarázzák (93). A koexpresszált μ-opioid receptor működését gátolja a koexpresszált CB1R aktivitása (219). CB1R és D2 dopamin receptor koexpressziója esetén CB1R stimulálása esetén a cAMP koncentráció csökkenése helyett annak emelkedését figyelték meg (170). Ha ezeket az irodalmi adatokat figyelembe vesszük, felmerülhet a mi esetünkben is a dimerizáció lehetősége. További kísérleteinkben külön sejtekben expresszáltattuk az AT1R-t és a CB1R-t, hogy kizárjuk a dimerizáció lehetőségét. Ilyen kísérleti felállásban is létrejött Ang II hatására a CB1R aktiválódása és ez is gátolható volt THL-el. A transzaktiválás létrejött akkor is ha az AT1R-t más sejtvonalban expresszáltattuk, és akkor is ha AT1R helyett más Gq/11-kapcsolt 7TMR-t stimuláltunk. A Gq/11-kapcsolt 7TMRok között kipróbáltunk muszkarinos acetil-kolin receptorokat is, aminek a szerepét 2-AG felszabadulásban már ismerik neuronokban (22). A kísérleteinkben tehát reprodukálni tudtuk 56
a más rendszerben már megfigyelt hatást, és a muszkarinos receptorokhoz hasonlóan működött nálunk a többi Gq/11-kapcsolt 7TMR is. A parakrin transzaktiválás, illetve endokannabinoid felszabadulás vizsgálatára egy másik megközelítést is alkalmaztunk. A 7TM receptorok stimulálását β-arresztin kötődése követi. A β-arresztin kötődése szerepet játszik a receptor deszenzitizációjában és interenalizációjában. Két β-arresztint ismerünk, a β-arresztin1-et és a β-arresztin2-t (263). Az aktivált receptorhoz kötődő β-arresztin meggátolja annak kötődését a G-fehérjékhez, és az internalizációban szereplő klatrin-burkos vezikulához irányítja (263). Mivel a β-arresztin kötése a legtöbb 7TMR-ra jellemző, a kötődés vizsgálata egy egységes módszer lehet a receptoraktivitás követésére (247). Kísérleteinkben megvizsgáltuk a CB1R β-arresztin2 kötésének jellegét, és összehasonlítottuk egyéb 7TMR-ok β-arresztin2 kötésével. Kísérleteink alapján a B osztályba tartozó AT1R-ral ellentétben, a CB1R az A osztályba tartozik, ugyanis a β-arresztin2 csak a membránon jelenik meg stimulálást követően. A β-arresztin2 kötésének követése ugyan hasznos módszer a 7TMR-ok aktiválódásának követésére, azonban az A osztályba tartozó receptorok esetében detektálási problémát jelenthet a gyenge interakció a βarresztinnel. A viszonylag kis jel felerősítésére már léteznek az irodalomban megoldások, melyek főleg a β-arresztin különböző mutációit használják (264). Kísérletünkben mi a CB1R DRY régiójában cseréltünk két aminosavat alaninra, ugyanis hasonló mutáció V2 vazopresszin receptor esetében növelte a β-arresztin kapcsolódását (259). A mutáció lehetővé tette, hogy kontroll körülmények mellet is láthatóvá váljon a két fehérje interakciója, stimulálásakor pedig a vad típushoz képest kifejezettebb transzlokáció történik. Az érzékenyebb rendszer lehetővé tette, hogy látható legyen a parakrin transzaktiváció konfokális mikroszkópban is. Érdemes megfigyelni, hogy a G-fehérje aktiválás és a β-arresztin kötés dózis-hatás görbéje között két nagyságrendi eltérés van (20. ábra). Ez megfelel annak, hogy a receptor a G-fehérjéhez képest nagy feleslegben van, egy receptor számos G-fehérjét képes aktiválni és már a receptorok kis százalékának az aktiválása is maximális G-fehérje aktivitást eredményez. Ezzel szemben egy aktivált receptorhoz egy β-arresztin molekula kapcsolódik (265), ami azt jelenti, hogy maximális kötődést akkor kapunk, ha a receptorok 100%-a aktív. Így az EC50 a Kd értékhez van közel β-arresztin kötés esetén, míg G-fehérje aktiválás esetén a Kd-hez képest balra tolt. Ez egy érdekes többletinformációt is jelent a számunkra. G-fehérje aktiválódás során igen nagy érzékenységgel detektáljuk az endokannabinoid felszabadulását, ami felveti annak a kérdését, hogy ez milyen 2-AG koncentrációnak felel meg, és fiziológiásan
lehetséges-e
ilyen
koncentrációval
CB1R-t
stimulálni.
A
konfokális 57
mikroszkóppal nyert adatok viszont arra utalnak, hogy a stimulált sejt közvetlen közelében, a sejttel közvetlenül érintkező sejtek membránjában a 2-AG koncentráció igen magas is lehet, a receptor Kd-je közeli (μM-os) érték valószínűsíthető. Az AT1R serkentését követő 2-AG termelés fokozódását tömegspektrometriával is igazoltuk. Érdemes megfigyelni, hogy nyugalmi körülmények között is már van 2-AG termelődés a sejtekben, ami felelős lehet a CB1R bazális aktivitásáért (24. ábra).
Az
eredményeink értékelésénél figyelembe kell venni, hogy különböző szövetekben, sejtekben eltérő lehet a különböző endokannabinoid metabolizmusban résztvevő enzimek expressziója és ez befolyásolhatja mind a bazális, mind a stimulus hatására létrejövő endokannabinoidtermelést. A kísérleteinket heterológ expressziós rendszerben végeztük, amelyekből nem vonhatók le következtetések arra vonatkozóan, hogy ez a folyamat végbemegy-e a szervezetben is, azonban felveti a lehetőségét ilyen szabályozási mechanizmusoknak. A jelenséget a továbbiakban endogén szövetekben is igazolnunk kell. AT1R általi CB1R transzaktivációt még nem figyeltek meg endogén szövetekben, azonban vannak olyan megfigyelések, amelyek lehetséges magyarázata lehet endokannabinoid felszabadulás és CB1R aktiválódás. AT1R által létrehozott bizonyos hatások egyértelműen kivédhetők pertussis toxinnal, ami Gi/o-fehérjék szerepét valószínűsíti a folyamatban, azonban expressziós rendszerekben az AT1R Gi/o-t aktiváló képessége még nem tisztázott (240). A kísérleteinkben mi nem láttunk közvetlen Go aktiválást AT1R stimulálásakor (13. ábra), azonban mi csak egy G-fehérje alegység-összetételt vizsgáltunk. Ebből ugyan nem lehet azt a következtetést levonni, hogy az AT1R nem képes Gi/o-fehérjéket aktiválni (lehetséges, hogy esetleg más összetételű Gi/o heterotrimert aktiválna), azonban felmerül, hogy bizonyos pertussis toxin szenzitív hatásokért esetleg kannabinoid receptor transzaktiváció felelős. Bizonyos ismert Ang II hatások esetén felmerül a a két receptor közötti kapcsolat. Ilyen pl., hogy Ang II hatására patkány hippocampusból csökken a GABA felszabadulás (266). A hippocampusban mind az AT1R, mind a CB1R expressziója magas, és pl. a glutamát egyik jellemző hatása hippocampális neuronokban, hogy CB1R függő módon csökkenti a GABA felszabadulást (59). Ang II hatásában szintén érdekes lenne megvizsgálni a kannabinoidok szerepét. Egy másik megfigyelés szerint hypothalamus nucleus paraventricularisban Ang II hatására a preszinaptikus membránból a GABA leadás csökken (267). A jelenségben ugyan nem vizsgálták még a kannabinoidok szerepét, de a hatás igencsak hasonlít arra, amit glutamát, vagy acetil-kolin hatására szintén megfigyelhetünk, és ez a hatás is kivédhető pertussis toxinnal (268).
58
Periférián is felmerül a kannabinoidok szerepe bizonyos hatásokban. Ugyan kontroll körülmények között a CB1R antagonisták nem hoznak létre jelentős változásokat a keringési rendszerben, SHR patkányokban jelentős vérnyomás-emelkedést okoznak (131). SHR patkányoknak a magas vérnyomásában jelentős szerepe van a renin-angiotenzin rendszernek, és esetleg itt érdemes lenne keresni a két rendszer közti kapcsolatot. Bradikinin esetében már korábban is felmerült a kannabinoidok szerepe a keringésben. Korábban felmerült, hogy az endothelből bradikinin hatásra a NO mellett felszabaduló, szintén vazodilatátor hatású vegyület esetleg endokannabinoid lenne, azonban ez a megfigyelés vitatott (269;270). A bradikinin védő szerepét szív-ischaemiában CB1R blokkolóval gátolni lehet (141). Valójában bradikinin hatására már leírtak korábban 2-AG termelődést még mielőtt a 2-AG-t endokannabinoidként megismertük volna (25). Kísérleteink is megerősítik, hogy bradikinin hatására ténylegesen történik endokannabinoid felszabadulás. α1AR és V1R stimulálásával is endokannabinoid felszabadulást tudtunk létrehozni, igaz, egy vizsgálatban nem találtak rimonabant hatást olyan állatokban, amelyekbe phenylephrint vagy vazopresszint infundáltak (271). Eredményeink arra utalnak, hogy Gq/11-kapcsolt 7TMR-ok stimulálása esetén expressziós rendszerben sejttípustól függetlenül endokannabinoid felszabadulás történik, azonban ennek fiziológiás jelentősége eldöntéséhez még további vizsgálatok szükségesek. A CB1R bazális aktivitását DAGL gátlóval sikerült gátolni, ami 2-AG szerepére utal a jelenségben. A THL-t az irodalom szerint DAGL gátlóként használják, és egyértelműen gátolni lehet vele a DAGL-t (43), azonban nem teljesen specifikus. Egy cikk szerint a THL CB1R antagonistaként viselkedik magas koncentrációk esetén (100 μM koncentráció körül) (272), azonban mások nem tapasztaltak ilyen hatást (64;273). A kísérleteinkben 1 μM THL nem gátolta a WIN55,212-2 hatását (21. ábra). Specifikusabb DAGL gátlók is ismertek az irodalomban, azonban ezek a gátlószerek nem sejtpermeabilisek, ezért a mi kísérleti felállásunkban nem használhatók (274). Felmerül a DAGL-ok siRNS általi lecsendesítése, azonban nem ismert még a kínai hörcsög DAGL-ok szekvenciája. Humán sejtvonalban (HEK-293) expresszálva a konstruktokat pedig nagyon kicsi és nem mindig reprodukálható bazális aktivitást tudtunk mérni. A bazális aktivitás eltérő mértéke különböző sejtvonalakban elvileg ellene szólhat annak, hogy az a receptor intrinzik tulajdonsága. Ez arra utalhat, hogy a különbség az eltérő endokannabinoidszinteknek köszönhető, azonban figyelembe kell venni azt is, hogy a bazális aktivitás mértékét befolyásolhatja a receptor, illetve a G-fehérje expressziójának a mértéke. A konstitutív aktivitás mellett szóló bizonyítékok jelentős része azonban CHO sejtekben történt méréseken alapszik (214). A THL hatása a CB1R aktivitására azt jelentheti, hogy a bazális aktivitás tehát attól függően változhat, hogy a sejtet milyen 59
egyéb hatások érik, milyen receptorai vannak és azoknak milyen az aktivitása. Megnövekedett PLC aktivitás a CB1R aktivitásnövekedésével egyéb szignáltranszdukciós utak elindulását is eredményezheti. A CHO sejtekben mért 2-AG koncentrációknál látszik, hogy már kontroll körülmények között is van bizonyos mértékű 2-AG termelés (19. ábra), ami felelős lehet a bazális aktivitásért. A
bazális
aktivitás
mértékét
internalizáció
mérésével
is
követtük.
Számos
közleményben a CB1R sejtfelszíni expressziója növekedett CB1R antagonista hatására (74;94;248;275), habár más kísérletekben azt látták, hogy a konstitutív internalizáció nem függ a bazális aktivitástól (257;276;277), attól függetlenül jön létre. A mi kísérleteinkben THL hatására a bazális aktivitás mellett a konstitutív internalizáció is gátolt volt. Mivel a WIN55,212-2 hatására létrejövő internalizációt a THL nem gátolta, feltehetően nem magát az internalizáció folyamatát gátolja a THL, hanem esetünkben ténylegesen a CB1R aktivitáscsökkenése hozta létre a hatást. Összefoglalva elmondható, hogy létrejöhet CB1R aktiváció Gq/11-kapcsolt AT1 és más receptorok stimulálása esetén, a transzaktiváció lehet autokrin és parakrin is, és a mechanizmusban a 2-AG felszabadulás szerepel. A THL hatására létrejövő bazális CB1R aktivitás-csökkenés pedig arra utal, hogy a bazális aktivitásban szerepet játszhatnak a sejtekben folyamatosan képződő endokannabinoidok.
60
8. KÖVETKEZTETÉSEK Kísérleteinkben kimutattuk, hogy AT1R stimulálásával aktiválható a koexpresszált CB1R CHO sejtekben. Kimutattuk, hogy AT1R stimulálását követően DAGL függő módon endokannabinoid szabadul fel CHO, COS-7 és HEK-293 sejtekben, mely képes más sejtekben expresszált CB1R parakrin aktiválására. Megállapítottuk, hogy parakrin CB1R aktiválás létrejön akkor is ha más Gq/11-fehérjét aktiváló receptorokat, M1R, M3R, M5R, V1R, B2R vagy α1-AR-t stimulálunk. BRET módszerrel és konfokális mikroszkóppal vizsgálva a CB1R β-arresztin2 kötését megállapítottuk, hogy a CB1R a 7TMR-ok A osztályába tartozik. Megállapíthatjuk továbbá, hogy a DRY/AAY mutáns receptor β-arresztin2 kötése fokozott a vad típusúéhoz képest. A mutáns CB1R segítségével konfokális mikroszkópos vizsgálattal is igazoltuk, hogy AT1R stimulálása parakrin CB1R is aktiválódást eredményez. A β-arresztin kötését vizsgálva a receptorokat megállapítottuk, hogy az AT2R nem köt β-arresztin2-t. Kimutattuk, hogy a CB1R bazális G-fehérje aktiválása és internalizációja gátolható B
THL-el, ami az endogén kannabinoidok szerepére utal a nyugalmi aktivitásban.
61
9. ÖSSZEFOGLALÓ Az endokannabinoid rendszer részt vesz számos fiziológiás és patofiziológiás folyamatban. Az endokannabinoidok az ismert hatásaikat CB1-es, CB2-es és egyéb, nem teljesen feltérképezett receptorokon fejti ki. A jelenleg ismert fiziológiás folyamatok jelentős részében szereplő két endokannabinoid, az anandamid és a 2-arachidonil-glicerol keletkezésének szabályozásáról idegrendszerben végzett vizsgálatok alapján van ismeretünk. Egyéb szövetekben ezek a folyamatok még jórészt ismeretlenek. Kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk, nem neuronális szövetben a CB1 receptor aktivitása fokozható-e koexpresszált, vagy szomszédos sejtekben expresszált Gq/11fehérjékhez kapcsolt AT1-es angiotenzin-, és egyéb receptorok által. Kísérleteinkben a CB1 receptor aktivitását heterotrimer Go-fehérje alegységek közti energiatranszfer segítségével és β-arresztin2 transzlokációjával vizsgáltuk CHO sejtekben. Megállapítottuk, hogy AT1R angiotenzin II-vel történt serkentése az azonos illetve szomszédos sejtekben CB1R aktivációjához vezet. Az aktivációt gátolni lehetett diacil-glicerol lipáz gátlóval, ami arra utal, hogy a folyamatban szereplő endokannabinoid a 2-arachidonil-glicerol. Kimutattuk továbbá, hogy AT1 receptor serkentését követően fokozódik a 2-arachidonil-glicerol termelődése CHO sejtekben. Megállapítottuk, hogy a CB1 receptor aktiválódik akkor is, ha más sejtekben expresszáljuk az AT1 receptort, és akkor is, ha más Gq/11-fehérjéhez kapcsolt receptorokat stimulálunk. Megállapítottuk továbbá, hogy a diacil-glicerol lipáz gátló tetrahydrolipstatin csökkenti a CB1 receptor bazális aktivitását, ami arra utal, hogy abban szerepet játszhatnak az endogénen termelődő endokannabinoidok.
62
10. SUMMARY Endocannabinoid system is involved in many physiological and pathophysiological regulations and conditions. Endocannabinoids act on CB1-, CB2- and other, presently less characterized receptors. Our knowledge on the regulation of the two main endocannabinoids, anandamide and 2-arachidonoyl glycerol is based on experiments made on neuronal tissues. The regulation of endocannabinoid production in other tissues is poorly understood. Our aim was to investigate, whether stimulation of AT1 angiotensin-, and other Gq/11coupled receptors leads to activation of CB1 receptors, expressed in the same or in neighboring cells in non-neural tissues. CB1 receptor activation was measured by energy transfer between the heterotrimeric Go-protein subunits, or by β-arrestin2 translocation to the receptors in CHO cells. We have shown, that stimulation of AT1 angiotensin receptors with angiotensin II led to activation of the CB1 receptor expressed in the same- and neighboring cells. Activation was blocked by diacylglycerol lipase inhibitor, suggesting the role of the 2arachidonoyl glycerol in the CB1 receptor activation. Stimulation of AT1 receptor led to production of 2-arachidonoyl glycerol in CHO cells. We have also shown, that CB1 receptor was activated, when AT1 was expressed in other cell types, and also when other Gq/11-coupled receptors were stimulated. Tetrahydrolipstatin, a diacylglycerol lipase inhibitor inhibited tonic activity of the CB1 receptor, suggesting that endogenously produced endocannabinoids are involved in basal Gprotein activation.
63
11. IRODALOMJEGYZÉK References 1. Adams, I. B. and Martin, B. R. (1996) Cannabis: pharmacology and toxicology in animals and humans Addiction. 91, 1585-1614 2. Zias, J., Stark, H., Sellgman, J., Levy, R., Werker, E., Breuer, A., and Mechoulam, R. (1993) Early medical use of cannabis Nature. %20;363, 215 3. Lambert, D. M. and Fowler, C. J. (2005) The endocannabinoid system: drug targets, lead compounds, and potential therapeutic applications J. Med. Chem. 48, 5059-5087 4. Gaoni, Y. M. R. (1964) Isolation, structure, and partial synthesis of an active constituent of hashish J. Am. Chem. Soc. 86, 1646-1647 5. Martin, B. R., Compton, D. R., Little, P. J., Martin, T. J., and Beardsley, P. M. (1987) Pharmacological evaluation of agonistic and antagonistic activity of cannabinoids NIDA Res. Monogr 79, 108-122 6. Devane, W. A., Dysarz, F. A., III, Johnson, M. R., Melvin, L. S., and Howlett, A. C. (1988) Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain Mol. Pharmacol. 34, 605-613 7. Matsuda, L. A., Lolait, S. J., Brownstein, M. J., Young, A. C., and Bonner, T. I. (1990) Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA Nature 346, 561-564 8. Munro, S., Thomas, K. L., and Abu-Shaar, M. (1993) Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids Nature 365, 61-65 9. Howlett, A. C. (2005) A short guide to the nomenclature of seven-transmembrane spanning receptors for lipid mediators Life Sci. 77, 1522-1530 10. Alexander, S. P. and Kendall, D. A. (2007) The complications of promiscuity: endocannabinoid action and metabolism Br. J. Pharmacol. 152, 602-623 11. Lauckner, J. E., Jensen, J. B., Chen, H. Y., Lu, H. C., Hille, B., and Mackie, K. (2008) GPR55 is a cannabinoid receptor that increases intracellular calcium and inhibits M current Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 2699-2704 12. Ryberg, E., Larsson, N., Sjogren, S., Hjorth, S., Hermansson, N. O., Leonova, J., Elebring, T., Nilsson, K., Drmota, T., and Greasley, P. J. (2007) The orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid receptor Br. J. Pharmacol. 152, 1092-1101 13. Devane, W. A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R. G., Stevenson, L. A., Griffin, G., Gibson, D., Mandelbaum, A., Etinger, A., and Mechoulam, R. (1992) Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor Science 258, 1946-1949
64
14. Mechoulam, R., Ben Shabat, S., Hanus, L., Ligumsky, M., Kaminski, N. E., Schatz, A. R., Gopher, A., Almog, S., Martin, B. R., Compton, D. R., and . (1995) Identification of an endogenous 2-monoglyceride, present in canine gut, that binds to cannabinoid receptors Biochem. Pharmacol. 50, 83-90 15. Stella, N., Schweitzer, P., and Piomelli, D. (1997) A second endogenous cannabinoid that modulates long-term potentiation Nature 388, 773-778 16. Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Nakane, S., Shinoda, A., Itoh, K., Yamashita, A., and Waku, K. (1995) 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, 89-97 17. McPartland, J. M., Glass, M., and Pertwee, R. G. (2007) Meta-analysis of cannabinoid ligand binding affinity and receptor distribution: interspecies differences Br. J. Pharmacol. 152, 583-593 18. Vogel, Z., Barg, J., Levy, R., Saya, D., Heldman, E., and Mechoulam, R. (1993) Anandamide, a brain endogenous compound, interacts specifically with cannabinoid receptors and inhibits adenylate cyclase J. Neurochem. 61, 352-355 19. Pertwee, R. G. and Ross, R. A. (2002) Cannabinoid receptors and their ligands Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 66, 101-121 20. Di, M., V, De Petrocellis, L., Fezza, F., Ligresti, A., and Bisogno, T. (2002) Anandamide receptors Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 66, 377-391 21. Ross, R. A. (2003) Anandamide and vanilloid TRPV1 receptors Br. J. Pharmacol. 140, 790-801 22. Sugiura, T., Kishimoto, S., Oka, S., and Gokoh, M. (2006) Biochemistry, pharmacology and physiology of 2-arachidonoylglycerol, an endogenous cannabinoid receptor ligand Prog. Lipid Res. 45, 405-446 23. Prescott, S. M. and Majerus, P. W. (1983) Characterization of 1,2-diacylglycerol hydrolysis in human platelets. Demonstration of an arachidonoyl-monoacylglycerol intermediate J. Biol. Chem. 258, 764-769 24. Hasegawa-Sasaki, H. (1985) Early changes in inositol lipids and their metabolites induced by platelet-derived growth factor in quiescent Swiss mouse 3T3 cells Biochem. J. 232, 99-109 25. Gammon, C. M., Allen, A. C., and Morell, P. (1989) Bradykinin stimulates phosphoinositide hydrolysis and mobilization of arachidonic acid in dorsal root ganglion neurons J. Neurochem. 53, 95-101 26. Devane, W. A. and Axelrod, J. (1994) Enzymatic synthesis of anandamide, an endogenous ligand for the cannabinoid receptor, by brain membranes Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91, 6698-6701 27. Arreaza, G., Devane, W. A., Omeir, R. L., Sajnani, G., Kunz, J., Cravatt, B. F., and Deutsch, D. G. (1997) The cloned rat hydrolytic enzyme responsible for the
65
breakdown of anandamide also catalyzes its formation via the condensation of arachidonic acid and ethanolamine Neurosci. Lett. 234, 59-62 28. Kurahashi, Y., Ueda, N., Suzuki, H., Suzuki, M., and Yamamoto, S. (1997) Reversible hydrolysis and synthesis of anandamide demonstrated by recombinant rat fatty-acid amide hydrolase Biochem. Biophys. Res. Commun. 237, 512-515 29. Di, M., V, Fontana, A., Cadas, H., Schinelli, S., Cimino, G., Schwartz, J. C., and Piomelli, D. (1994) Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central neurons Nature 372, 686-691 30. Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Tonegawa, T., Nakane, S., Yamashita, A., and Waku, K. (1996) Enzymatic synthesis of anandamide, an endogenous cannabinoid receptor ligand, through N-acylphosphatidylethanolamine pathway in testis: involvement of Ca(2+)-dependent transacylase and phosphodiesterase activities Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 113-117 31. Sasaki, T. and Chang, M. C. (1997) N-arachidonylethanolamine (anandamide) formation from N-arachidonylphosphatidylethanolamine in rat brain membranes Life Sci. 61, 1803-1810 32. Cadas, H., di Tomaso, E., and Piomelli, D. (1997) Occurrence and biosynthesis of endogenous cannabinoid precursor, N-arachidonoyl phosphatidylethanolamine, in rat brain J. Neurosci. 17, 1226-1242 33. Cadas, H., Gaillet, S., Beltramo, M., Venance, L., and Piomelli, D. (1996) Biosynthesis of an endogenous cannabinoid precursor in neurons and its control by calcium and cAMP J. Neurosci. 16, 3934-3942 34. Okamoto, Y., Morishita, J., Tsuboi, K., Tonai, T., and Ueda, N. (2004) Molecular characterization of a phospholipase D generating anandamide and its congeners J. Biol. Chem. 279, 5298-5305 35. Okamoto, Y., Morishita, J., Wang, J., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H., and Ueda, N. (2005) Mammalian cells stably overexpressing Nacylphosphatidylethanolamine-hydrolysing phospholipase D exhibit significantly decreased levels of N-acylphosphatidylethanolamines Biochem. J. 389, 241-247 36. Sun, Y. X., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Tonai, T., Murakami, M., Kudo, I., and Ueda, N. (2004) Biosynthesis of anandamide and N-palmitoylethanolamine by sequential actions of phospholipase A2 and lysophospholipase D Biochem. J. 380, 749-756 37. Liu, J., Wang, L., Harvey-White, J., Osei-Hyiaman, D., Razdan, R., Gong, Q., Chan, A. C., Zhou, Z., Huang, B. X., Kim, H. Y., and Kunos, G. (2006) A biosynthetic pathway for anandamide Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 13345-13350 38. Cravatt, B. F., Giang, D. K., Mayfield, S. P., Boger, D. L., Lerner, R. A., and Gilula, N. B. (1996) Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides Nature 384, 83-87
66
39. Goparaju, S. K., Ueda, N., Yamaguchi, H., and Yamamoto, S. (1998) Anandamide amidohydrolase reacting with 2-arachidonoylglycerol, another cannabinoid receptor ligand FEBS Lett. 422, 69-73 40. Cravatt, B. F., Demarest, K., Patricelli, M. P., Bracey, M. H., Giang, D. K., Martin, B. R., and Lichtman, A. H. (2001) Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 9371-9376 41. Clement, A. B., Hawkins, E. G., Lichtman, A. H., and Cravatt, B. F. (2003) Increased seizure susceptibility and proconvulsant activity of anandamide in mice lacking fatty acid amide hydrolase J. Neurosci. 23, 3916-3923 42. Basavarajappa, B. S. (2007) Critical enzymes involved in endocannabinoid metabolism Protein Pept. Lett. 14, 237-246 43. Bisogno, T., Howell, F., Williams, G., Minassi, A., Cascio, M. G., Ligresti, A., Matias, I., Schiano-Moriello, A., Paul, P., Williams, E. J., Gangadharan, U., Hobbs, C., Di Marzo, V., and Doherty, P. (2003) Cloning of the first sn1-DAG lipases points to the spatial and temporal regulation of endocannabinoid signaling in the brain J. Cell Biol. 163, 463-468 44. Michell, R. H. (1975) Inositol phospholipids and cell surface receptor function Biochim. Biophys. Acta 415, 81-47 45. Nakane, S., Oka, S., Arai, S., Waku, K., Ishima, Y., Tokumura, A., and Sugiura, T. (2002) 2-Arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphate, an arachidonic acid-containing lysophosphatidic acid: occurrence and rapid enzymatic conversion to 2-arachidonoylsn-glycerol, a cannabinoid receptor ligand, in rat brain Arch. Biochem. Biophys. 402, 51-58 46. Carrier, E. J., Kearn, C. S., Barkmeier, A. J., Breese, N. M., Yang, W., Nithipatikom, K., Pfister, S. L., Campbell, W. B., and Hillard, C. J. (2004) Cultured rat microglial cells synthesize the endocannabinoid 2-arachidonylglycerol, which increases proliferation via a CB2 receptor-dependent mechanism Mol. Pharmacol. 65, 999-1007 47. Bisogno, T., Melck, D., De Petrocellis, L., and Di, M., V (1999) Phosphatidic acid as the biosynthetic precursor of the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol in intact mouse neuroblastoma cells stimulated with ionomycin J. Neurochem. 72, 2113-2119 48. Matias, I. and Di, M., V (2006) Endocannabinoid synthesis and degradation, and their regulation in the framework of energy balance J. Endocrinol. Invest 29, 15-26 49. Di, M., V (2008) Endocannabinoids: synthesis and degradation Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 160, 1-24 50. Ho, S. Y., Delgado, L., and Storch, J. (2002) Monoacylglycerol metabolism in human intestinal Caco-2 cells: evidence for metabolic compartmentation and hydrolysis J. Biol. Chem. 277, 1816-1823 51. Karlsson, M., Contreras, J. A., Hellman, U., Tornqvist, H., and Holm, C. (1997) cDNA cloning, tissue distribution, and identification of the catalytic triad of 67
monoglyceride lipase. Evolutionary relationship to esterases, lysophospholipases, and haloperoxidases J. Biol. Chem. 272, 27218-27223 52. Dinh, T. P., Carpenter, D., Leslie, F. M., Freund, T. F., Katona, I., Sensi, S. L., Kathuria, S., and Piomelli, D. (2002) Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 10819-10824 53. Dinh, T. P., Kathuria, S., and Piomelli, D. (2004) RNA interference suggests a primary role for monoacylglycerol lipase in the degradation of the endocannabinoid 2arachidonoylglycerol Mol. Pharmacol. 66, 1260-1264 54. Fegley, D., Gaetani, S., Duranti, A., Tontini, A., Mor, M., Tarzia, G., and Piomelli, D. (2005) Characterization of the fatty acid amide hydrolase inhibitor cyclohexyl carbamic acid 3'-carbamoyl-biphenyl-3-yl ester (URB597): effects on anandamide and oleoylethanolamide deactivation J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 352-358 55. Kathuria, S., Gaetani, S., Fegley, D., Valino, F., Duranti, A., Tontini, A., Mor, M., Tarzia, G., La Rana, G., Calignano, A., Giustino, A., Tattoli, M., Palmery, M., Cuomo, V., and Piomelli, D. (2003) Modulation of anxiety through blockade of anandamide hydrolysis Nat. Med. 9, 76-81 56. Lichtman, A. H., Hawkins, E. G., Griffin, G., and Cravatt, B. F. (2002) Pharmacological activity of fatty acid amides is regulated, but not mediated, by fatty acid amide hydrolase in vivo J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 73-79 57. Patrignani, P., Tacconelli, S., Sciulli, M. G., and Capone, M. L. (2005) New insights into COX-2 biology and inhibition Brain Res. Brain Res. Rev. 48, 352-359 58. Kozak, K. R., Rowlinson, S. W., and Marnett, L. J. (2000) Oxygenation of the endocannabinoid, 2-arachidonylglycerol, to glyceryl prostaglandins by cyclooxygenase-2 J. Biol. Chem. 275, 33744-33749 59. Freund, T. F., Katona, I., and Piomelli, D. (2003) Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling Physiol Rev. 83, 1017-1066 60. Wettschureck, N., van der, S. M., Tsubokawa, H., Krestel, H., Moers, A., Petrosino, S., Schutz, G., Di, M., V, and Offermanns, S. (2006) Forebrain-specific inactivation of Gq/G11 family G proteins results in age-dependent epilepsy and impaired endocannabinoid formation Mol. Cell Biol. 26, 5888-5894 61. Makara, J. K., Mor, M., Fegley, D., Szabo, S. I., Kathuria, S., Astarita, G., Duranti, A., Tontini, A., Tarzia, G., Rivara, S., Freund, T. F., and Piomelli, D. (2005) Selective inhibition of 2-AG hydrolysis enhances endocannabinoid signaling in hippocampus Nat. Neurosci. 8, 1139-1141 62. Szabo, B., Urbanski, M. J., Bisogno, T., Di, M., V, Mendiguren, A., Baer, W. U., and Freiman, I. (2006) Depolarization-induced retrograde synaptic inhibition in the mouse cerebellar cortex is mediated by 2-arachidonoylglycerol J. Physiol 577, 263-280 63. Melis, M., Perra, S., Muntoni, A. L., Pillolla, G., Lutz, B., Marsicano, G., Di, M., V, Gessa, G. L., and Pistis, M. (2004) Prefrontal cortex stimulation induces 2-
68
arachidonoyl-glycerol-mediated suppression of excitation in dopamine neurons J. Neurosci. 24, 10707-10715 64. Hashimotodani, Y., Ohno-Shosaku, T., Maejima, T., Fukami, K., and Kano, M. (2008) Pharmacological evidence for the involvement of diacylglycerol lipase in depolarization-induced endocanabinoid release Neuropharmacology 54, 58-67 65. Kim, J., Isokawa, M., Ledent, C., and Alger, B. E. (2002) Activation of muscarinic acetylcholine receptors enhances the release of endogenous cannabinoids in the hippocampus J. Neurosci. 22, 10182-10191 66. Maejima, T., Hashimoto, K., Yoshida, T., Aiba, A., and Kano, M. (2001) Presynaptic inhibition caused by retrograde signal from metabotropic glutamate to cannabinoid receptors Neuron 31, 463-475 67. Glitsch, M., Parra, P., and Llano, I. (2000) The retrograde inhibition of IPSCs in rat cerebellar purkinje cells is highly sensitive to intracellular Ca2+ Eur. J. Neurosci. 12, 987-993 68. Lenz, R. A. and Alger, B. E. (1999) Calcium dependence of depolarization-induced suppression of inhibition in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons J. Physiol 521 Pt 1, 147-157 69. Hashimotodani, Y., Ohno-Shosaku, T., Tsubokawa, H., Ogata, H., Emoto, K., Maejima, T., Araishi, K., Shin, H. S., and Kano, M. (2005) Phospholipase Cbeta serves as a coincidence detector through its Ca2+ dependency for triggering retrograde endocannabinoid signal Neuron 45, 257-268 70. Howlett, A. C., Barth, F., Bonner, T. I., Cabral, G., Casellas, P., Devane, W. A., Felder, C. C., Herkenham, M., Mackie, K., Martin, B. R., Mechoulam, R., and Pertwee, R. G. (2002) International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors Pharmacol. Rev. 54, 161-202 71. Pattij, T., Wiskerke, J., and Schoffelmeer, A. N. (2008) Cannabinoid modulation of executive functions Eur. J. Pharmacol. 585, 458-463 72. Rinaldi-Carmona, M., Pialot, F., Congy, C., Redon, E., Barth, F., Bachy, A., Breliere, J. C., Soubrie, P., and Le Fur, G. (1996) Characterization and distribution of binding sites for [3H]-SR 141716A, a selective brain (CB1) cannabinoid receptor antagonist, in rodent brain Life Sci. 58, 1239-1247 73. Mailleux, P. and Vanderhaeghen, J. J. (1992) Distribution of neuronal cannabinoid receptor in the adult rat brain: a comparative receptor binding radioautography and in situ hybridization histochemistry Neuroscience 48, 655-668 74. Leterrier, C., Laine, J., Darmon, M., Boudin, H., Rossier, J., and Lenkei, Z. (2006) Constitutive activation drives compartment-selective endocytosis and axonal targeting of type 1 cannabinoid receptors J. Neurosci. 26, 3141-3153 75. Pitler, T. A. and Alger, B. E. (1992) Postsynaptic spike firing reduces synaptic GABAA responses in hippocampal pyramidal cells J. Neurosci. 12, 4122-4132
69
76. Llano, I., Leresche, N., and Marty, A. (1991) Calcium entry increases the sensitivity of cerebellar Purkinje cells to applied GABA and decreases inhibitory synaptic currents Neuron 6, 565-574 77. Wilson, R. I. and Nicoll, R. A. (2001) Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses Nature 410, 588-592 78. Ohno-Shosaku, T., Maejima, T., and Kano, M. (2001) Endogenous cannabinoids mediate retrograde signals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals Neuron 29, 729-738 79. Scheen, A. J., Finer, N., Hollander, P., Jensen, M. D., and Van Gaal, L. F. (2006) Efficacy and tolerability of rimonabant in overweight or obese patients with type 2 diabetes: a randomised controlled study Lancet 368, 1660-1672 80. Pi-Sunyer, F. X., Aronne, L. J., Heshmati, H. M., Devin, J., and Rosenstock, J. (2006) Effect of rimonabant, a cannabinoid-1 receptor blocker, on weight and cardiometabolic risk factors in overweight or obese patients: RIO-North America: a randomized controlled trial JAMA 295, 761-775 81. Van Gaal, L. F., Rissanen, A. M., Scheen, A. J., Ziegler, O., and Rossner, S. (2005) Effects of the cannabinoid-1 receptor blocker rimonabant on weight reduction and cardiovascular risk factors in overweight patients: 1-year experience from the RIOEurope study Lancet 365, 1389-1397 82. Ravinet, T. C., Arnone, M., Delgorge, C., Gonalons, N., Keane, P., Maffrand, J. P., and Soubrie, P. (2003) Anti-obesity effect of SR141716, a CB1 receptor antagonist, in diet-induced obese mice Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 284, R345-R353 83. Jbilo, O., Ravinet-Trillou, C., Arnone, M., Buisson, I., Bribes, E., Peleraux, A., Penarier, G., Soubrie, P., Le Fur, G., Galiegue, S., and Casellas, P. (2005) The CB1 receptor antagonist rimonabant reverses the diet-induced obesity phenotype through the regulation of lipolysis and energy balance FASEB J. 19, 1567-1569 84. Cota, D., Marsicano, G., Tschop, M., Grubler, Y., Flachskamm, C., Schubert, M., Auer, D., Yassouridis, A., Thone-Reineke, C., Ortmann, S., Tomassoni, F., Cervino, C., Nisoli, E., Linthorst, A. C., Pasquali, R., Lutz, B., Stalla, G. K., and Pagotto, U. (2003) The endogenous cannabinoid system affects energy balance via central orexigenic drive and peripheral lipogenesis J. Clin. Invest 112, 423-431 85. Hildebrandt, A. L., Kelly-Sullivan, D. M., and Black, S. C. (2003) Antiobesity effects of chronic cannabinoid CB1 receptor antagonist treatment in diet-induced obese mice Eur. J. Pharmacol. 462, 125-132 86. Bellocchio, L., Cervino, C., Pasquali, R., and Pagotto, U. (2008) The endocannabinoid system and energy metabolism J. Neuroendocrinol. 20, 850-857 87. Di, M., V, Goparaju, S. K., Wang, L., Liu, J., Batkai, S., Jarai, Z., Fezza, F., Miura, G. I., Palmiter, R. D., Sugiura, T., and Kunos, G. (2001) Leptin-regulated endocannabinoids are involved in maintaining food intake Nature 410, 822-825
70
88. Duarte, C., Alonso, R., Bichet, N., Cohen, C., Soubrie, P., and Thiebot, M. H. (2004) Blockade by the cannabinoid CB1 receptor antagonist, rimonabant (SR141716), of the potentiation by quinelorane of food-primed reinstatement of food-seeking behavior Neuropsychopharmacology 29, 911-920 89. Matias, I., Cristino, L., and Di, M., V (2008) Endocannabinoids: some like it fat (and sweet too) J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 100-109 90. Gamber, K. M., Macarthur, H., and Westfall, T. C. (2005) Cannabinoids augment the release of neuropeptide Y in the rat hypothalamus Neuropharmacology 49, 646-652 91. Hentges, S. T., Low, M. J., and Williams, J. T. (2005) Differential regulation of synaptic inputs by constitutively released endocannabinoids and exogenous cannabinoids J. Neurosci. 25, 9746-9751 92. Verty, A. N., McFarlane, J. R., McGregor, I. S., and Mallet, P. E. (2004) Evidence for an interaction between CB1 cannabinoid and melanocortin MCR-4 receptors in regulating food intake Endocrinology 145, 3224-3231 93. Hilairet, S., Bouaboula, M., Carriere, D., Le Fur, G., and Casellas, P. (2003) Hypersensitization of the Orexin 1 receptor by the CB1 receptor: evidence for crosstalk blocked by the specific CB1 antagonist, SR141716 J. Biol. Chem. 278, 2373123737 94. Ellis, J., Pediani, J. D., Canals, M., Milasta, S., and Milligan, G. (2006) Orexin-1 receptor-cannabinoid CB1 receptor heterodimerization results in both liganddependent and -independent coordinated alterations of receptor localization and function J. Biol. Chem. 281, 38812-38824 95. Crespo, I., Gomez, d. H., Rodriguez, d. F., and Navarro, M. (2008) Pretreatment with subeffective doses of Rimonabant attenuates orexigenic actions of orexin Ahypocretin 1 Neuropharmacology 54, 219-225 96. Tucci, S. A., Rogers, E. K., Korbonits, M., and Kirkham, T. C. (2004) The cannabinoid CB1 receptor antagonist SR141716 blocks the orexigenic effects of intrahypothalamic ghrelin Br. J. Pharmacol. 143, 520-523 97. Kola, B., Farkas, I., Christ-Crain, M., Wittmann, G., Lolli, F., Amin, F., HarveyWhite, J., Liposits, Z., Kunos, G., Grossman, A. B., Fekete, C., and Korbonits, M. (2008) The orexigenic effect of ghrelin is mediated through central activation of the endogenous cannabinoid system PLoS. ONE. 3, e1797 98. Bensaid, M., Gary-Bobo, M., Esclangon, A., Maffrand, J. P., Le Fur, G., Oury-Donat, F., and Soubrie, P. (2003) The cannabinoid CB1 receptor antagonist SR141716 increases Acrp30 mRNA expression in adipose tissue of obese fa/fa rats and in cultured adipocyte cells Mol. Pharmacol. 63, 908-914 99. Matias, I., Gonthier, M. P., Orlando, P., Martiadis, V., De Petrocellis, L., Cervino, C., Petrosino, S., Hoareau, L., Festy, F., Pasquali, R., Roche, R., Maj, M., Pagotto, U., Monteleone, P., and Di, M., V (2006) Regulation, function, and dysregulation of endocannabinoids in models of adipose and beta-pancreatic cells and in obesity and hyperglycemia J. Clin. Endocrinol. Metab 91, 3171-3180 71
100. Gonthier, M. P., Hoareau, L., Festy, F., Matias, I., Valenti, M., Bes-Houtmann, S., Rouch, C., Robert-Da Silva, C., Chesne, S., Lefebvre, d. C., Cesari, M., Di, M., V, and Roche, R. (2007) Identification of endocannabinoids and related compounds in human fat cells Obesity (Silver. Spring) 15, 837-845 101. Roche, R., Hoareau, L., Bes-Houtmann, S., Gonthier, M. P., Laborde, C., Baron, J. F., Haffaf, Y., Cesari, M., and Festy, F. (2006) Presence of the cannabinoid receptors, CB1 and CB2, in human omental and subcutaneous adipocytes Histochem. Cell Biol. 126, 177-187 102. Gary-Bobo, M., Elachouri, G., Scatton, B., Le Fur, G., Oury-Donat, F., and Bensaid, M. (2006) The cannabinoid CB1 receptor antagonist rimonabant (SR141716) inhibits cell proliferation and increases markers of adipocyte maturation in cultured mouse 3T3 F442A preadipocytes Mol. Pharmacol. 69, 471-478 103. Osei-Hyiaman, D., Harvey-White, J., Batkai, S., and Kunos, G. (2006) The role of the endocannabinoid system in the control of energy homeostasis Int. J. Obes. (Lond) 30 Suppl 1, S33-S38 104. Pagano, C., Rossato, M., and Vettor, R. (2008) Endocannabinoids, adipose tissue and lipid metabolism J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 124-129 105. Buckley, N. E., Hansson, S., Harta, G., and Mezey, E. (1998) Expression of the CB1 and CB2 receptor messenger RNAs during embryonic development in the rat Neuroscience 82, 1131-1149 106. Engeli, S. (2008) Dysregulation of the endocannabinoid system in obesity J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 110-115 107. Gary-Bobo, M., Elachouri, G., Gallas, J. F., Janiak, P., Marini, P., Ravinet-Trillou, C., Chabbert, M., Cruccioli, N., Pfersdorff, C., Roque, C., Arnone, M., Croci, T., Soubrie, P., Oury-Donat, F., Maffrand, J. P., Scatton, B., Lacheretz, F., Le Fur, G., Herbert, J. M., and Bensaid, M. (2007) Rimonabant reduces obesity-associated hepatic steatosis and features of metabolic syndrome in obese Zucker fa/fa rats Hepatology 46, 122-129 108. Osei-Hyiaman, D., DePetrillo, M., Pacher, P., Liu, J., Radaeva, S., Batkai, S., HarveyWhite, J., Mackie, K., Offertaler, L., Wang, L., and Kunos, G. (2005) Endocannabinoid activation at hepatic CB1 receptors stimulates fatty acid synthesis and contributes to diet-induced obesity J. Clin. Invest 115, 1298-1305 109. Guzman, M., Fernandez-Ruiz, J. J., Sanchez, C., Velasco, G., and Ramos, J. A. (1995) Effects of anandamide on hepatic fatty acid metabolism Biochem. Pharmacol. 50, 885-888 110. Herling, A. W., Gossel, M., Haschke, G., Stengelin, S., Kuhlmann, J., Muller, G., Schmoll, D., and Kramer, W. (2007) CB1 receptor antagonist AVE1625 affects primarily metabolic parameters independently of reduced food intake in Wistar rats Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 293, E826-E832 111. Caraceni, P., Domenicali, M., and Bernardi, M. (2008) The endocannabinoid system and liver diseases J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 47-52
72
112. Bermudez-Silva, F. J., Suarez, J., Baixeras, E., Cobo, N., Bautista, D., Cuesta-Munoz, A. L., Fuentes, E., Juan-Pico, P., Castro, M. J., Milman, G., Mechoulam, R., Nadal, A., and Rodriguez, d. F. (2008) Presence of functional cannabinoid receptors in human endocrine pancreas Diabetologia 51, 476-487 113. Juan-Pico, P., Fuentes, E., Bermudez-Silva, F. J., Javier Diaz-Molina, F., Ripoll, C., Rodriguez, d. F., and Nadal, A. (2006) Cannabinoid receptors regulate Ca(2+) signals and insulin secretion in pancreatic beta-cell Cell Calcium 39, 155-162 114. De Petrocellis, L., Marini, P., Matias, I., Moriello, A. S., Starowicz, K., Cristino, L., Nigam, S., and Di, M., V (2007) Mechanisms for the coupling of cannabinoid receptors to intracellular calcium mobilization in rat insulinoma beta-cells Exp. Cell Res. 313, 2993-3004 115. Nakata, M. and Yada, T. (2008) Cannabinoids inhibit insulin secretion and cytosolic Ca2+ oscillation in islet beta-cells via CB1 receptors Regul. Pept. 145, 49-53 116. Starowicz, K. M., Cristino, L., Matias, I., Capasso, R., Racioppi, A., Izzo, A. A., and Di, M., V (2008) Endocannabinoid dysregulation in the pancreas and adipose tissue of mice fed with a high-fat diet Obesity (Silver. Spring) 16, 553-565 117. Janiak, P., Poirier, B., Bidouard, J. P., Cadrouvele, C., Pierre, F., Gouraud, L., Barbosa, I., Dedio, J., Maffrand, J. P., Le Fur, G., O'Connor, S., and Herbert, J. M. (2007) Blockade of cannabinoid CB1 receptors improves renal function, metabolic profile, and increased survival of obese Zucker rats Kidney Int. 72, 1345-1357 118. Sarzani, R. (2008) Endocannabinoids, blood pressure and the human heart J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 58-62 119. Varga, K., Lake, K., Martin, B. R., and Kunos, G. (1995) Novel antagonist implicates the CB1 cannabinoid receptor in the hypotensive action of anandamide Eur. J. Pharmacol. 278, 279-283 120. Niederhoffer, N. and Szabo, B. (1999) Effect of the cannabinoid receptor agonist WIN55212-2 on sympathetic cardiovascular regulation Br. J. Pharmacol. 126, 457466 121. Niederhoffer, N., Schmid, K., and Szabo, B. (2003) The peripheral sympathetic nervous system is the major target of cannabinoids in eliciting cardiovascular depression Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 367, 434-443 122. Malinowska, B., Kwolek, G., and Gothert, M. (2001) Anandamide and methanandamide induce both vanilloid VR1- and cannabinoid CB1 receptor-mediated changes in heart rate and blood pressure in anaesthetized rats Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 364, 562-569 123. Jarai, Z., Wagner, J. A., Goparaju, S. K., Wang, L., Razdan, R. K., Sugiura, T., Zimmer, A. M., Bonner, T. I., Zimmer, A., and Kunos, G. (2000) Cardiovascular effects of 2-arachidonoyl glycerol in anesthetized mice Hypertension 35, 679-684
73
124. Varga, K., Wagner, J. A., Bridgen, D. T., and Kunos, G. (1998) Platelet- and macrophage-derived endogenous cannabinoids are involved in endotoxin-induced hypotension FASEB J. 12, 1035-1044 125. Wagner, J. A., Jarai, Z., Batkai, S., and Kunos, G. (2001) Hemodynamic effects of cannabinoids: coronary and cerebral vasodilation mediated by cannabinoid CB(1) receptors Eur. J. Pharmacol. 423, 203-210 126. Stein, E. A., Fuller, S. A., Edgemond, W. S., and Campbell, W. B. (1996) Physiological and behavioural effects of the endogenous cannabinoid, arachidonylethanolamide (anandamide), in the rat Br. J. Pharmacol. 119, 107-114 127. Lake, K. D., Compton, D. R., Varga, K., Martin, B. R., and Kunos, G. (1997) Cannabinoid-induced hypotension and bradycardia in rats mediated by CB1-like cannabinoid receptors J. Pharmacol. Exp. Ther. 281, 1030-1037 128. Gardiner, S. M., March, J. E., Kemp, P. A., and Bennett, T. (2002) Complex regional haemodynamic effects of anandamide in conscious rats Br. J. Pharmacol. 135, 18891896 129. Gardiner, S. M., March, J. E., Kemp, P. A., and Bennett, T. (2002) Influence of the CB(1) receptor antagonist, AM 251, on the regional haemodynamic effects of WIN55212-2 or HU 210 in conscious rats Br. J. Pharmacol. 136, 581-587 130. Ralevic, V. and Kendall, D. A. (2002) Cannabinoids inhibit pre- and postjunctionally sympathetic neurotransmission in rat mesenteric arteries Eur. J. Pharmacol. 444, 171181 131. Batkai, S., Pacher, P., Osei-Hyiaman, D., Radaeva, S., Liu, J., Harvey-White, J., Offertaler, L., Mackie, K., Rudd, M. A., Bukoski, R. D., and Kunos, G. (2004) Endocannabinoids acting at cannabinoid-1 receptors regulate cardiovascular function in hypertension Circulation 110, 1996-2002 132. Randall, M. D., Harris, D., Kendall, D. A., and Ralevic, V. (2002) Cardiovascular effects of cannabinoids Pharmacol. Ther. 95, 191-202 133. Ledent, C., Valverde, O., Cossu, G., Petitet, F., Aubert, J. F., Beslot, F., Bohme, G. A., Imperato, A., Pedrazzini, T., Roques, B. P., Vassart, G., Fratta, W., and Parmentier, M. (1999) Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effects of opiates in CB1 receptor knockout mice Science 283, 401-404 134. Pacher, P., Batkai, S., and Kunos, G. (2006) The endocannabinoid system as an emerging target of pharmacotherapy Pharmacol. Rev. 58, 389-462 135. Randall, M. D., Kendall, D. A., and O'Sullivan, S. (2004) The complexities of the cardiovascular actions of cannabinoids Br. J. Pharmacol. 142, 20-26 136. Mendizabal, V. E. and Adler-Graschinsky, E. (2007) Cannabinoids as therapeutic agents in cardiovascular disease: a tale of passions and illusions Br. J. Pharmacol. 151, 427-440
74
137. Huestis, M. A., Gorelick, D. A., Heishman, S. J., Preston, K. L., Nelson, R. A., Moolchan, E. T., and Frank, R. A. (2001) Blockade of effects of smoked marijuana by the CB1-selective cannabinoid receptor antagonist SR141716 Arch. Gen. Psychiatry 58, 322-328 138. Jones, R. T. (2002) Cardiovascular system effects of marijuana J. Clin. Pharmacol. 42, 58S-63S 139. Bonz, A., Laser, M., Kullmer, S., Kniesch, S., Babin-Ebell, J., Popp, V., Ertl, G., and Wagner, J. A. (2003) Cannabinoids acting on CB1 receptors decrease contractile performance in human atrial muscle J. Cardiovasc. Pharmacol. 41, 657-664 140. Lepicier, P., Bibeau-Poirier, A., Lagneux, C., Servant, M. J., and Lamontagne, D. (2006) Signaling pathways involved in the cardioprotective effects of cannabinoids J. Pharmacol. Sci. 102, 155-166 141. Lagneux, C., Adam, A., and Lamontagne, D. (2003) A study of the mediators involved in the protection induced by exogenous kinins in the isolated rat heart Int. Immunopharmacol. 3, 1511-1518 142. Bouchard, J. F., Lepicier, P., and Lamontagne, D. (2003) Contribution of endocannabinoids in the endothelial protection afforded by ischemic preconditioning in the isolated rat heart Life Sci. 72, 1859-1870 143. Neter, J. E., Stam, B. E., Kok, F. J., Grobbee, D. E., and Geleijnse, J. M. (2003) Influence of weight reduction on blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials Hypertension 42, 878-884 144. Kosersky, D. S. (1978) Antihypertensive effects of delta9-tetrahydrocannabinol Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 233, 76-81 145. Despres, J. P., Golay, A., and Sjostrom, L. (2005) Effects of rimonabant on metabolic risk factors in overweight patients with dyslipidemia N. Engl. J. Med. 353, 2121-2134 146. Van Gaal, L., Pi-Sunyer, X., Despres, J. P., McCarthy, C., and Scheen, A. (2008) Efficacy and safety of rimonabant for improvement of multiple cardiometabolic risk factors in overweight/obese patients: pooled 1-year data from the Rimonabant in Obesity (RIO) program Diabetes Care 31 Suppl 2, S229-S240 147. Pagotto, U., Marsicano, G., Cota, D., Lutz, B., and Pasquali, R. (2006) The emerging role of the endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance Endocr. Rev. 27, 73-100 148. Jarvinen, T., Pate, D. W., and Laine, K. (2002) Cannabinoids in the treatment of glaucoma Pharmacol. Ther. 95, 203-220 149. Sanger, G. J. (2007) Endocannabinoids and the gastrointestinal tract: what are the key questions? Br. J. Pharmacol. 152, 663-670 150. Dobrosi, N., Toth, B. I., Nagy, G., Dozsa, A., Geczy, T., Nagy, L., Zouboulis, C. C., Paus, R., Kovacs, L., and Biro, T. (2008) Endocannabinoids enhance lipid synthesis
75
and apoptosis of human sebocytes via cannabinoid receptor-2-mediated signaling FASEB J. 151. Rossato, M., Pagano, C., and Vettor, R. (2008) The cannabinoid system and male reproductive functions J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 90-93 152. Rice, W., Shannon, J. M., Burton, F., and Fiedeldey, D. (1997) Expression of a braintype cannabinoid receptor (CB1) in alveolar Type II cells in the lung: regulation by hydrocortisone Eur. J. Pharmacol. 327, 227-232 153. Klein, T. W., Newton, C., Larsen, K., Lu, L., Perkins, I., Nong, L., and Friedman, H. (2003) The cannabinoid system and immune modulation J. Leukoc. Biol. 74, 486-496 154. Wolf, S. A. and Ullrich, O. (2008) Endocannabinoids and the brain immune system: new neurones at the horizon? J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 15-19 155. Bab, I., Ofek, O., Tam, J., Rehnelt, J., and Zimmer, A. (2008) Endocannabinoids and the regulation of bone metabolism J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, 69-74 156. Ryberg, E., Vu, H. K., Larsson, N., Groblewski, T., Hjorth, S., Elebring, T., Sjogren, S., and Greasley, P. J. (2005) Identification and characterisation of a novel splice variant of the human CB1 receptor FEBS Lett. 579, 259-264 157. Shire, D., Carillon, C., Kaghad, M., Calandra, B., Rinaldi-Carmona, M., Le Fur, G., Caput, D., and Ferrara, P. (1995) An amino-terminal variant of the central cannabinoid receptor resulting from alternative splicing J. Biol. Chem. 270, 3726-3731 158. Kenakin, T. (2007) Functional selectivity through protean and biased agonism: who steers the ship? Mol. Pharmacol. 72, 1393-1401 159. Howlett, A. C. (1985) Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase. Biochemistry of the response in neuroblastoma cell membranes Mol. Pharmacol. 27, 429-436 160. Howlett, A. C. and Fleming, R. M. (1984) Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase. Pharmacology of the response in neuroblastoma cell membranes Mol. Pharmacol. 26, 532-538 161. Houston, D. B. and Howlett, A. C. (1998) Differential receptor-G-protein coupling evoked by dissimilar cannabinoid receptor agonists Cell Signal. 10, 667-674 162. Glass, M. and Northup, J. K. (1999) Agonist selective regulation of G proteins by cannabinoid CB(1) and CB(2) receptors Mol. Pharmacol. 56, 1362-1369 163. Mukhopadhyay, S., Shim, J. Y., Assi, A. A., Norford, D., and Howlett, A. C. (2002) CB(1) cannabinoid receptor-G protein association: a possible mechanism for differential signaling Chem. Phys. Lipids 121, 91-109 164. Prather, P. L., Martin, N. A., Breivogel, C. S., and Childers, S. R. (2000) Activation of cannabinoid receptors in rat brain by WIN 55212-2 produces coupling to multiple G protein alpha-subunits with different potencies Mol. Pharmacol. 57, 1000-1010
76
165. Georgieva, T., Devanathan, S., Stropova, D., Park, C. K., Salamon, Z., Tollin, G., Hruby, V. J., Roeske, W. R., Yamamura, H. I., and Varga, E. (2008) Unique agonistbound cannabinoid CB1 receptor conformations indicate agonist specificity in signaling Eur. J. Pharmacol. 581, 19-29 166. Sim, L. J., Hampson, R. E., Deadwyler, S. A., and Childers, S. R. (1996) Effects of chronic treatment with delta9-tetrahydrocannabinol on cannabinoid-stimulated [35S]GTPgammaS autoradiography in rat brain J. Neurosci. 16, 8057-8066 167. Breivogel, C. S., Sim, L. J., and Childers, S. R. (1997) Regional differences in cannabinoid receptor/G-protein coupling in rat brain J. Pharmacol. Exp. Ther. 282, 1632-1642 168. Breivogel, C. S. and Childers, S. R. (2000) Cannabinoid agonist signal transduction in rat brain: comparison of cannabinoid agonists in receptor binding, G-protein activation, and adenylyl cyclase inhibition J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 328-336 169. Howlett, A. C. (2005) Cannabinoid receptor signaling Handb. Exp. Pharmacol. 53-79 170. Glass, M. and Felder, C. C. (1997) Concurrent stimulation of cannabinoid CB1 and dopamine D2 receptors augments cAMP accumulation in striatal neurons: evidence for a Gs linkage to the CB1 receptor J. Neurosci. 17, 5327-5333 171. Abadji, V., Lucas-Lenard, J. M., Chin, C., and Kendall, D. A. (1999) Involvement of the carboxyl terminus of the third intracellular loop of the cannabinoid CB1 receptor in constitutive activation of Gs J. Neurochem. 72, 2032-2038 172. Rhee, M. H., Bayewitch, M., Avidor-Reiss, T., Levy, R., and Vogel, Z. (1998) Cannabinoid receptor activation differentially regulates the various adenylyl cyclase isozymes J. Neurochem. 71, 1525-1534 173. Mukhopadhyay, S., McIntosh, H. H., Houston, D. B., and Howlett, A. C. (2000) The CB(1) cannabinoid receptor juxtamembrane C-terminal peptide confers activation to specific G proteins in brain Mol. Pharmacol. 57, 162-170 174. Sugiura, T., Kodaka, T., Kondo, S., Tonegawa, T., Nakane, S., Kishimoto, S., Yamashita, A., and Waku, K. (1996) 2-Arachidonoylglycerol, a putative endogenous cannabinoid receptor ligand, induces rapid, transient elevation of intracellular free Ca2+ in neuroblastoma x glioma hybrid NG108-15 cells Biochem. Biophys. Res. Commun. 229, 58-64 175. Sugiura, T., Kodaka, T., Kondo, S., Nakane, S., Kondo, H., Waku, K., Ishima, Y., Watanabe, K., and Yamamoto, I. (1997) Is the cannabinoid CB1 receptor a 2arachidonoylglycerol receptor? Structural requirements for triggering a Ca2+ transient in NG108-15 cells J. Biochem. 122, 890-895 176. Lauckner, J. E., Hille, B., and Mackie, K. (2005) The cannabinoid agonist WIN55,212-2 increases intracellular calcium via CB1 receptor coupling to Gq/11 G proteins Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 19144-19149
77
177. Henry, D. J. and Chavkin, C. (1995) Activation of inwardly rectifying potassium channels (GIRK1) by co-expressed rat brain cannabinoid receptors in Xenopus oocytes Neurosci. Lett. 186, 91-94 178. Mackie, K., Lai, Y., Westenbroek, R., and Mitchell, R. (1995) Cannabinoids activate an inwardly rectifying potassium conductance and inhibit Q-type calcium currents in AtT20 cells transfected with rat brain cannabinoid receptor J. Neurosci. 15, 6552-6561 179. McAllister, S. D., Griffin, G., Satin, L. S., and Abood, M. E. (1999) Cannabinoid receptors can activate and inhibit G protein-coupled inwardly rectifying potassium channels in a xenopus oocyte expression system J. Pharmacol. Exp. Ther. 291, 618626 180. Guo, J. and Ikeda, S. R. (2004) Endocannabinoids modulate N-type calcium channels and G-protein-coupled inwardly rectifying potassium channels via CB1 cannabinoid receptors heterologously expressed in mammalian neurons Mol. Pharmacol. 65, 665674 181. Azad, S. C., Kurz, J., Marsicano, G., Lutz, B., Zieglgansberger, W., and Rammes, G. (2008) Activation of CB1 specifically located on GABAergic interneurons inhibits LTD in the lateral amygdala Learn. Mem. 15, 143-152 182. Gebremedhin, D., Lange, A. R., Campbell, W. B., Hillard, C. J., and Harder, D. R. (1999) Cannabinoid CB1 receptor of cat cerebral arterial muscle functions to inhibit L-type Ca2+ channel current Am. J. Physiol 276, H2085-H2093 183. Straiker, A., Stella, N., Piomelli, D., Mackie, K., Karten, H. J., and Maguire, G. (1999) Cannabinoid CB1 receptors and ligands in vertebrate retina: localization and function of an endogenous signaling system Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96, 14565-14570 184. Rubovitch, V., Gafni, M., and Sarne, Y. (2002) The cannabinoid agonist DALN positively modulates L-type voltage-dependent calcium-channels in N18TG2 neuroblastoma cells Brain Res. Mol. Brain Res. 101, 93-102 185. Caulfield, M. P. and Brown, D. A. (1992) Cannabinoid receptor agonists inhibit Ca current in NG108-15 neuroblastoma cells via a pertussis toxin-sensitive mechanism Br. J. Pharmacol. 106, 231-232 186. Felder, C. C., Briley, E. M., Axelrod, J., Simpson, J. T., Mackie, K., and Devane, W. A. (1993) Anandamide, an endogenous cannabimimetic eicosanoid, binds to the cloned human cannabinoid receptor and stimulates receptor-mediated signal transduction Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90, 7656-7660 187. Mackie, K., Devane, W. A., and Hille, B. (1993) Anandamide, an endogenous cannabinoid, inhibits calcium currents as a partial agonist in N18 neuroblastoma cells Mol. Pharmacol. 44, 498-503 188. Mackie, K. and Hille, B. (1992) Cannabinoids inhibit N-type calcium channels in neuroblastoma-glioma cells Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 3825-3829
78
189. Pan, X., Ikeda, S. R., and Lewis, D. L. (1996) Rat brain cannabinoid receptor modulates N-type Ca2+ channels in a neuronal expression system Mol. Pharmacol. 49, 707-714 190. Brown, S. P., Safo, P. K., and Regehr, W. G. (2004) Endocannabinoids inhibit transmission at granule cell to Purkinje cell synapses by modulating three types of presynaptic calcium channels J. Neurosci. 24, 5623-5631 191. Ho, B. Y., Stadnicka, A., Prather, P. L., Buckley, A. R., Current, L. L., Bosnjak, Z. J., and Kwok, W. M. (2000) Cannabinoid CB1 receptor-mediated inhibition of prolactin release and signaling mechanisms in GH4C1 cells Endocrinology 141, 1675-1685 192. Hampson, A. J., Bornheim, L. M., Scanziani, M., Yost, C. S., Gray, A. T., Hansen, B. M., Leonoudakis, D. J., and Bickler, P. E. (1998) Dual effects of anandamide on NMDA receptor-mediated responses and neurotransmission J. Neurochem. 70, 671676 193. Fisyunov, A., Tsintsadze, V., Min, R., Burnashev, N., and Lozovaya, N. (2006) Cannabinoids modulate the P-type high-voltage-activated calcium currents in purkinje neurons J. Neurophysiol. 96, 1267-1277 194. Galve-Roperh, I., Rueda, D., Gomez, d. P., Velasco, G., and Guzman, M. (2002) Mechanism of extracellular signal-regulated kinase activation by the CB(1) cannabinoid receptor Mol. Pharmacol. 62, 1385-1392 195. Korzh, A., Keren, O., Gafni, M., Bar-Josef, H., and Sarne, Y. (2008) Modulation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) by opioid and cannabinoid receptors that are expressed in the same cell Brain Res. 1189, 23-32 196. Davis, M. I., Ronesi, J., and Lovinger, D. M. (2003) A predominant role for inhibition of the adenylate cyclase/protein kinase A pathway in ERK activation by cannabinoid receptor 1 in N1E-115 neuroblastoma cells J. Biol. Chem. 278, 48973-48980 197. Derkinderen, P., Valjent, E., Toutant, M., Corvol, J. C., Enslen, H., Ledent, C., Trzaskos, J., Caboche, J., and Girault, J. A. (2003) Regulation of extracellular signalregulated kinase by cannabinoids in hippocampus J. Neurosci. 23, 2371-2382 198. Liu, J., Gao, B., Mirshahi, F., Sanyal, A. J., Khanolkar, A. D., Makriyannis, A., and Kunos, G. (2000) Functional CB1 cannabinoid receptors in human vascular endothelial cells Biochem. J. 346 Pt 3, 835-840 199. Rueda, D., Galve-Roperh, I., Haro, A., and Guzman, M. (2000) The CB(1) cannabinoid receptor is coupled to the activation of c-Jun N-terminal kinase Mol. Pharmacol. 58, 814-820 200. Paradisi, A., Pasquariello, N., Barcaroli, D., and Maccarrone, M. (2008) Anandamide regulates keratinocyte differentiation by inducing DNA methylation in a CB1 receptor-dependent manner J. Biol. Chem. 283, 6005-6012 201. Derkinderen, P., Ledent, C., Parmentier, M., and Girault, J. A. (2001) Cannabinoids activate p38 mitogen-activated protein kinases through CB1 receptors in hippocampus J. Neurochem. 77, 957-960 79
202. Downer, E. J., Fogarty, M. P., and Campbell, V. A. (2003) Tetrahydrocannabinolinduced neurotoxicity depends on CB1 receptor-mediated c-Jun N-terminal kinase activation in cultured cortical neurons Br. J. Pharmacol. 140, 547-557 203. Molina-Holgado, F., Pinteaux, E., Heenan, L., Moore, J. D., Rothwell, N. J., and Gibson, R. M. (2005) Neuroprotective effects of the synthetic cannabinoid HU-210 in primary cortical neurons are mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signaling Mol. Cell Neurosci. 28, 189-194 204. Downer, E. J., Gowran, A., and Campbell, V. A. (2007) A comparison of the apoptotic effect of Delta(9)-tetrahydrocannabinol in the neonatal and adult rat cerebral cortex Brain Res. 1175, 39-47 205. Graham, E. S., Ball, N., Scotter, E. L., Narayan, P., Dragunow, M., and Glass, M. (2006) Induction of Krox-24 by endogenous cannabinoid type 1 receptors in Neuro2A cells is mediated by the MEK-ERK MAPK pathway and is suppressed by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway J. Biol. Chem. 281, 29085-29095 206. He, J. C., Gomes, I., Nguyen, T., Jayaram, G., Ram, P. T., Devi, L. A., and Iyengar, R. (2005) The G alpha(o/i)-coupled cannabinoid receptor-mediated neurite outgrowth involves Rap regulation of Src and Stat3 J. Biol. Chem. 280, 33426-33434 207. He, J. C., Neves, S. R., Jordan, J. D., and Iyengar, R. (2006) Role of the Go/i signaling network in the regulation of neurite outgrowth Can. J. Physiol Pharmacol. 84, 687694 208. Costa, T. and Herz, A. (1989) Antagonists with negative intrinsic activity at delta opioid receptors coupled to GTP-binding proteins Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 7321-7325 209. Seifert, R. and Wenzel-Seifert, K. (2002) Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 366, 381-416 210. Kenakin, T. (2004) Principles: receptor theory in pharmacology Trends Pharmacol. Sci. 25, 186-192 211. Fowler, C. J., Holt, S., Nilsson, O., Jonsson, K. O., Tiger, G., and Jacobsson, S. O. (2005) The endocannabinoid signaling system: pharmacological and therapeutic aspects Pharmacol. Biochem. Behav. 81, 248-262 212. Landsman, R. S., Burkey, T. H., Consroe, P., Roeske, W. R., and Yamamura, H. I. (1997) SR141716A is an inverse agonist at the human cannabinoid CB1 receptor Eur. J. Pharmacol. 334, R1-R2 213. Sim-Selley, L. J., Brunk, L. K., and Selley, D. E. (2001) Inhibitory effects of SR141716A on G-protein activation in rat brain Eur. J. Pharmacol. 414, 135-143 214. Pertwee, R. G. (2005) Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CBI receptors Life Sci. 76, 1307-1324
80
215. Bouaboula, M., Perrachon, S., Milligan, L., Canat, X., Rinaldi-Carmona, M., Portier, M., Barth, F., Calandra, B., Pecceu, F., Lupker, J., Maffrand, J. P., Le Fur, G., and Casellas, P. (1997) A selective inverse agonist for central cannabinoid receptor inhibits mitogen-activated protein kinase activation stimulated by insulin or insulinlike growth factor 1. Evidence for a new model of receptor/ligand interactions J. Biol. Chem. 272, 22330-22339 216. MacLennan, S. J., Reynen, P. H., Kwan, J., and Bonhaus, D. W. (1998) Evidence for inverse agonism of SR141716A at human recombinant cannabinoid CB1 and CB2 receptors Br. J. Pharmacol. 124, 619-622 217. Pan, X., Ikeda, S. R., and Lewis, D. L. (1998) SR 141716A acts as an inverse agonist to increase neuronal voltage-dependent Ca2+ currents by reversal of tonic CB1 cannabinoid receptor activity Mol. Pharmacol. 54, 1064-1072 218. Ruiu, S., Pinna, G. A., Marchese, G., Mussinu, J. M., Saba, P., Tambaro, S., Casti, P., Vargiu, R., and Pani, L. (2003) Synthesis and characterization of NESS 0327: a novel putative antagonist of the CB1 cannabinoid receptor J. Pharmacol. Exp. Ther. 306, 363-370 219. Canals, M. and Milligan, G. (2008) Constitutive activity of the cannabinoid CB1 receptor regulates the function of co-expressed Mu opioid receptors J. Biol. Chem. 220. Meschler, J. P., Kraichely, D. M., Wilken, G. H., and Howlett, A. C. (2000) Inverse agonist properties of N-(piperidin-1-yl)-5-(4-chlorophenyl)-1-(2, 4-dichlorophenyl)-4methyl-1H-pyrazole-3-carboxamide HCl (SR141716A) and 1-(2-chlorophenyl)-4cyano-5-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxyl ic acid phenylamide (CP272871) for the CB(1) cannabinoid receptor Biochem. Pharmacol. 60, 1315-1323 221. Bass, C. E., Griffin, G., Grier, M., Mahadevan, A., Razdan, R. K., and Martin, B. R. (2002) SR-141716A-induced stimulation of locomotor activity. A structure-activity relationship study Pharmacol. Biochem. Behav. 74, 31-40 222. Savinainen, J. R., Saario, S. M., Niemi, R., Jarvinen, T., and Laitinen, J. T. (2003) An optimized approach to study endocannabinoid signaling: evidence against constitutive activity of rat brain adenosine A1 and cannabinoid CB1 receptors Br. J. Pharmacol. 140, 1451-1459 223. Neu, A., Foldy, C., and Soltesz, I. (2006) Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at CCK-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus J. Physiol. 224. Katona, I., Sperlagh, B., Sik, A., Kafalvi, A., Vizi, E. S., Mackie, K., and Freund, T. F. (1999) Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal interneurons J. Neurosci. 19, 4544-4558 225. Hoffman, A. F. and Lupica, C. R. (2000) Mechanisms of cannabinoid inhibition of GABA(A) synaptic transmission in the hippocampus J. Neurosci. 20, 2470-2479 226. Chevaleyre, V. and Castillo, P. E. (2003) Heterosynaptic LTD of hippocampal GABAergic synapses: a novel role of endocannabinoids in regulating excitability Neuron 38, 461-472 81
227. Breivogel, C. S., Walker, J. M., Huang, S. M., Roy, M. B., and Childers, S. R. (2004) Cannabinoid signaling in rat cerebellar granule cells: G-protein activation, inhibition of glutamate release and endogenous cannabinoids Neuropharmacology 47, 81-91 228. Zhu, P. J. and Lovinger, D. M. (2005) Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala J. Neurosci. 25, 6199-6207 229. Smit, M. J., Vischer, H. F., Bakker, R. A., Jongejan, A., Timmerman, H., Pardo, L., and Leurs, R. (2007) Pharmacogenomic and structural analysis of constitutive g protein-coupled receptor activity Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 53-87 230. Moriyama, T., Urade, R., and Kito, M. (1999) Purification and characterization of diacylglycerol lipase from human platelets J. Biochem. 125, 1077-1085 231. B.Martin, L. A. Stevenson R. G. Pertwee C. S. Breivogel W. Williams A. Mahadevan and R. K. Razdan. Agonists and silent antagonists in a series of cannabinoid sulfonamides. 2002. Ref Type: Conference Proceeding 232. Martin, B. R., Razdan, R. K., and Pertwee, R. G. Sulfonamide cannabinoid agonists and antagonists. (20050096379). 5-5-2005. Ref Type: Patent 233. Braun-Menendez, E., Fasciolo, J. C., Leloir, L. F., and Munoz, J. M. (1940) The substance causing renal hypertension J. Physiol 98, 283-298 234. Griendling, K. K., Murphy, T. J., and Alexander, R. W. (1993) Molecular biology of the renin-angiotensin system Circulation 87, 1816-1828 235. Kramkowski, K., Mogielnicki, A., and Buczko, W. (2006) The physiological significance of the alternative pathways of angiotensin II production J. Physiol Pharmacol. 57, 529-539 236. Danser, A. H. (2003) Local renin-angiotensin systems: the unanswered questions Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 759-768 237. Ferrario, C., Abdelhamed, A. I., and Moore, M. (2004) AII antagonists in hypertension, heart failure, and diabetic nephropathy: focus on losartan Curr. Med. Res. Opin. 20, 279-293 238. Sarzani, R., Salvi, F., Dessi-Fulgheri, P., and Rappelli, A. (2008) Renin-angiotensin system, natriuretic peptides, obesity, metabolic syndrome, and hypertension: an integrated view in humans J. Hypertens. 26, 831-843 239. Kambayashi, Y., Bardhan, S., Takahashi, K., Tsuzuki, S., Inui, H., Hamakubo, T., and Inagami, T. (1993) Molecular cloning of a novel angiotensin II receptor isoform involved in phosphotyrosine phosphatase inhibition J. Biol. Chem. 268, 24543-24546 240. Hunyady, L. and Catt, K. J. (2006) Pleiotropic AT1 receptor signaling pathways mediating physiological and pathogenic actions of angiotensin II Mol. Endocrinol. 20, 953-970 82
241. Goossens, G. H., Blaak, E. E., and van Baak, M. A. (2003) Possible involvement of the adipose tissue renin-angiotensin system in the pathophysiology of obesity and obesity-related disorders Obes. Rev. 4, 43-55 242. Yoshida, T., Fukaya, M., Uchigashima, M., Miura, E., Kamiya, H., Kano, M., and Watanabe, M. (2006) Localization of diacylglycerol lipase-alpha around postsynaptic spine suggests close proximity between production site of an endocannabinoid, 2arachidonoyl-glycerol, and presynaptic cannabinoid CB1 receptor J. Neurosci. 26, 4740-4751 243. Nyilas, R., Dudok, B., Urban, G. M., Mackie, K., Watanabe, M., Cravatt, B. F., Freund, T. F., and Katona, I. (2008) Enzymatic machinery for endocannabinoid biosynthesis associated with calcium stores in glutamatergic axon terminals J. Neurosci. 28, 1058-1063 244. Azpiazu, I. and Gautam, N. (2004) A fluorescence resonance energy transfer-based sensor indicates that receptor access to a G protein is unrestricted in a living mammalian cell J. Biol. Chem. 279, 27709-27718 245. Smith, R. D., Baukal, A. J., Zolyomi, A., Gaborik, Z., Hunyady, L., Sun, L., Zhang, M., Chen, H. C., and Catt, K. J. (1998) Agonist-induced phosphorylation of the endogenous AT1 angiotensin receptor in bovine adrenal glomerulosa cells Mol. Endocrinol. 12, 634-644 246. Hunyady, L., Bor, M., Balla, T., and Catt, K. J. (1994) Identification of a cytoplasmic Ser-Thr-Leu motif that determines agonist-induced internalization of the AT1 angiotensin receptor J. Biol. Chem. 269, 31378-31382 247. Barak, L. S., Ferguson, S. S., Zhang, J., and Caron, M. G. (1997) A beta-arrestin/green fluorescent protein biosensor for detecting G protein-coupled receptor activation J. Biol. Chem. 272, 27497-27500 248. Leterrier, C., Bonnard, D., Carrel, D., Rossier, J., and Lenkei, Z. (2004) Constitutive endocytic cycle of the CB1 cannabinoid receptor J. Biol. Chem. 279, 36013-36021 249. Wang, L., Liu, J., Harvey-White, J., Zimmer, A., and Kunos, G. (2003) Endocannabinoid signaling via cannabinoid receptor 1 is involved in ethanol preference and its age-dependent decline in mice Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 1393-1398 250. Trugnan, G., Fontanges, P., Delautier, D., and Ait-Slimane, T. (2004) [FRAP, FLIP, FRET, BRET, FLIM, PRIM...new techniques for a colourful life] Med. Sci. (Paris) 20, 1027-1034 251. Eidne, K. A., Kroeger, K. M., and Hanyaloglu, A. C. (2002) Applications of novel resonance energy transfer techniques to study dynamic hormone receptor interactions in living cells Trends Endocrinol. Metab 13, 415-421 252. Hebert, T. E., Gales, C., and Rebois, R. V. (2006) Detecting and imaging proteinprotein interactions during G protein-mediated signal transduction in vivo and in situ by using fluorescence-based techniques Cell Biochem. Biophys. 45, 85-109
83
253. Gales, C., Van Durm, J. J., Schaak, S., Pontier, S., Percherancier, Y., Audet, M., Paris, H., and Bouvier, M. (2006) Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 778-786 254. Milligan, G. and Smith, N. J. (2007) Allosteric modulation of heterodimeric Gprotein-coupled receptors Trends Pharmacol. Sci. 28, 615-620 255. Oakley, R. H., Laporte, S. A., Holt, J. A., Caron, M. G., and Barak, L. S. (2000) Differential affinities of visual arrestin, beta arrestin1, and beta arrestin2 for G proteincoupled receptors delineate two major classes of receptors J. Biol. Chem. 275, 1720117210 256. Daigle, T. L., Kearn, C. S., and Mackie, K. (2008) Rapid CB(1) cannabinoid receptor desensitization defines the time course of ERK1/2 MAP kinase signaling Neuropharmacology 54, 36-44 257. Daigle, T. L., Kwok, M. L., and Mackie, K. (2008) Regulation of CB1 cannabinoid receptor internalization by a promiscuous phosphorylation-dependent mechanism J. Neurochem. 106, 70-82 258. Jin, W., Brown, S., Roche, J. P., Hsieh, C., Celver, J. P., Kovoor, A., Chavkin, C., and Mackie, K. (1999) Distinct domains of the CB1 cannabinoid receptor mediate desensitization and internalization J. Neurosci. 19, 3773-3780 259. Barak, L. S., Oakley, R. H., Laporte, S. A., and Caron, M. G. (2001) Constitutive arrestin-mediated desensitization of a human vasopressin receptor mutant associated with nephrogenic diabetes insipidus Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 93-98 260. Vettor, R., Pagotto, U., Pagano, C., and Pasquali, R. (2008) Here, there and everywhere: the endocannabinoid system J. Neuroendocrinol. 20 Suppl 1, iv-vi 261. Onaivi, E. S., Ishiguro, H., Gong, J. P., Patel, S., Perchuk, A., Meozzi, P. A., Myers, L., Mora, Z., Tagliaferro, P., Gardner, E., Brusco, A., Akinshola, B. E., Liu, Q. R., Hope, B., Iwasaki, S., Arinami, T., Teasenfitz, L., and Uhl, G. R. (2006) Discovery of the presence and functional expression of cannabinoid CB2 receptors in brain Ann. N. Y. Acad. Sci. 1074, 514-536 262. Milligan, G., Canals, M., Pediani, J. D., Ellis, J., and Lopez-Gimenez, J. F. (2006) The role of GPCR dimerisation/oligomerisation in receptor signalling Ernst. Schering. Found. Symp. Proc. 145-161 263. Shenoy, S. K. and Lefkowitz, R. J. (2003) Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling Biochem. J. 375, 503-515 264. Heding, A. (2004) Use of the BRET 7TM receptor/beta-arrestin assay in drug discovery and screening Expert. Rev. Mol. Diagn. 4, 403-411 265. Hanson, S. M., Gurevich, E. V., Vishnivetskiy, S. A., Ahmed, M. R., Song, X., and Gurevich, V. V. (2007) Each rhodopsin molecule binds its own arrestin Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 104, 3125-3128
84
266. Hadjiivanova, C. H. and Georgiev, V. (1998) In vitro effect of angiotensin II on GABA release in rat hippocampus Neuropeptides 32, 431-434 267. Li, D. P., Chen, S. R., and Pan, H. L. (2003) Angiotensin II stimulates spinally projecting paraventricular neurons through presynaptic disinhibition J. Neurosci. 23, 5041-5049 268. Chen, Q. and Pan, H. L. (2007) Signaling mechanisms of angiotensin II-induced attenuation of GABAergic input to hypothalamic presympathetic neurons J. Neurophysiol. 97, 3279-3287 269. Randall, M. D. and Kendall, D. A. (1997) Involvement of a cannabinoid in endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated coronary vasorelaxation Eur. J. Pharmacol. 335, 205-209 270. Fulton, D. and Quilley, J. (1998) Evidence against anandamide as the hyperpolarizing factor mediating the nitric oxide-independent coronary vasodilator effect of bradykinin in the rat J. Pharmacol. Exp. Ther. 286, 1146-1151 271. Pfitzer, T., Niederhoffer, N., and Szabo, B. (2005) Search for an endogenous cannabinoid-mediated effect in the sympathetic nervous system Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 371, 9-17 272. Palomaki, V. A., Lehtonen, M., Savinainen, J. R., and Laitinen, J. T. (2007) Visualization of 2-arachidonoylglycerol accumulation and cannabinoid CB1 receptor activity in rat brain cryosections by functional autoradiography J. Neurochem. 101, 972-981 273. Uchigashima, M., Narushima, M., Fukaya, M., Katona, I., Kano, M., and Watanabe, M. (2007) Subcellular arrangement of molecules for 2-arachidonoyl-glycerolmediated retrograde signaling and its physiological contribution to synaptic modulation in the striatum J. Neurosci. 27, 3663-3676 274. Bisogno, T., Cascio, M. G., Saha, B., Mahadevan, A., Urbani, P., Minassi, A., Appendino, G., Saturnino, C., Martin, B., Razdan, R., and Di, M., V (2006) Development of the first potent and specific inhibitors of endocannabinoid biosynthesis Biochim. Biophys. Acta 1761, 205-212 275. Rinaldi-Carmona, M., Le Duigou, A., Oustric, D., Barth, F., Bouaboula, M., Carayon, P., Casellas, P., and Le Fur, G. (1998) Modulation of CB1 cannabinoid receptor functions after a long-term exposure to agonist or inverse agonist in the Chinese hamster ovary cell expression system J. Pharmacol. Exp. Ther. 287, 1038-1047 276. McDonald, N. A., Henstridge, C. M., Connolly, C. N., and Irving, A. J. (2007) An essential role for constitutive endocytosis, but not activity, in the axonal targeting of the CB1 cannabinoid receptor Mol. Pharmacol. 71, 976-984 277. McDonald, N. A., Henstridge, C. M., Connolly, C. N., and Irving, A. J. (2007) Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248
85
12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Turu, G.; Szidonya, L.; Gáborik, Z.; Buday, L.; Spät, A.; Clark, A.J.L.; Hunyady, L.: Differential ß-arrestin binding of AT1 and AT2 angiotensin receptors. FEBS Letters 580:41-5, (2006). Impakt faktor: 3,372. Turu, G.; Simon, A.; Gyombolai, P,; Szidonya, L.; Bagdy, G.; Lenkei, Z.; Hunyady, L.: The role of diacylgycerol lipase in constitutive and angiotensin AT1 receptorstimulated cannabinoid CB1 receptor activity. J. Biol. Chem. 282:7753-7, (2007). Impakt faktor: 5.581 Turu, G.; Várnai, P.; Gyombolai, P.; Szidonya, L.; Offertaler, L.; Bagdy, Gy.; Kunos, G; Hunyady, L.: Paracrine transactivation of the CB1 cannabinoid receptor by AT1 angiotensin and other Gq/11 protein-coupled receptors Közlésre benyújtva Az értekezés témájához kapcsolódó egyéb közlemények Szaszák, M.; Gáborik, Z.; Turu, G.; McPherson, P.S.; Clark, A.J.L.; Catt, K.J.; Hunyady, L.: Role of the proline-rich domain of dynamin-2 and its interactions with SH3 domains during endocytosis of the AT1 angiotensin receptor. J. Biol. Chem. 277:21650-6, (2002). Impakt faktor: 6,696. Hunyady, L., Turu, G.: The role of the AT1 angiotensin receptor in cardiac hypertrophy: angiotensin II receptor or stretch sensor? Trends Endocrinol. Metab. 15:405-8, (2004). Impakt faktor: 9,058. Szidonya, L.; Süpeki, K.; Karip, E.; Turu, G.; Várnai, P.; Clark, A.J.L.; Hunyady, L.: AT1 receptor blocker-insensitive mutant AT1A angiotensin receptors reveal the presence of G protein-independent signaling in C9 cells. Biochem. Pharmacol. 15;73(10):1582-92, (2007). Impakt faktor: 4.006. Karip, E., Turu, G., Süpeki, K., Szidonya, L.; Hunyady, L.: Cross-inhibition of angiotensin AT1 receptors support the concept of receptor oligomerization Neurochemistry International 51(5):261-7, (2007) Impakt faktor: 2.975
86
13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Elsősorban Dr. Hunyady Lászlónak szeretnék köszönetet mondani, aki élettan gyakorlatvezetőként felkeltette érdeklődésemet a tantárgy iránt, majd TDK-zni, később pedig PhD-hallgatónak hívott, és végig mindenben támogatta a munkámat, labor-, majd intézetvezetőként is egyaránt és megszerettette velem a kutatást. Dr. Várnai Péter sokat segített a molekuláris biológiai technikák elsajátításában, és bármikor fordulhattam hozzá kérdéseimmel. Köszönöm Dr. Spät Andrásnak, hogy kezdetben intézetvezetőként és programvezetőként lehetővé tette munkámat. Köszönettel tartozom programvezetőmnek, Dr. Ligeti Erzsébetnek a támogatásáért. Köszönöm Dr. Gáborik Zsuzsának, hogy segített a kísérletek kritikus értékelésében és hogy bármikor fordulhattam hozzá kérdéseimmel. Köszönöm Dr. Szaszák Mártának, hogy TDK-munkám során témavezetőként bevezetett a laborban folyó munkába. Köszönöm Dr. Szidonya Lászlónak a segítséget, amit munkám során mindvégig kaptam tőle, és köszönöm a barátságát. Hálával tartozom a labor összes jelenlegi és régi munkatársának, Dr. Balla Andrásnak, Dr. Cserző Miklósnak, Dr. Mihalik Balázsnak és Dr. Szekeres Máriának segítségükért, valamint a szakmai eszmecserékért és a barátságos hangulat megteremtésért. Köszönöm Bakacsiné Rácz Judit kitartó segítségét, amivel jelentősen hozzájárult a kísérletek elvégzéséhez. Köszönöm továbbá Süpeki Katinka, Szabolcsi Kata és Józan Jolán megbízható munkáját, valamint Schultz Mártonné Anikónak, hogy otthonossá tette a laborunkat. Köszönöm a velem dolgozó diákkörös hallgatók, Gara Zsófia, Nagy Vivien, Gyombolai Pál, Szalai Bence és Tóth Dániel segítségét. Köszönettel tartozom az Enyedi-, a Geiszt-, a Káldi-, a Ligeti-, a Mócsai-, a Spät-labor, és az Élettani Intézet összes dolgozójának minden segítségükért. Köszönöm szüleimnek, testvéremnek és családjának az önzetlen segítségét. Köszönöm feleségemnek és gyermekeimnek a támogatásukat és végtelen türelmüket.
87
