ÚJ DIFFERENCIÁCIÓS ÉS DIFFERENCIÁLDIAGNOSZTIKUS MARKEREK VIZSGÁLATA HUMAN HEPATOBLASTOMÁBAN
Doktori értekezés Dr. Halász Judit Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola
Témavezetı: Dr. Schaff Zsuzsa egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Hivatalos bírálók:
Dr. Bodó Miklós, egyetemi tanár Dr. Kovács Gábor, egyetemi docens
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Keller Éva, egyetemi tanár
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Abonyi Margit, egyetemi docens Dr. Simon Károly, osztályvezetı fıorvos
Budapest 2010
Tartalomjegyzék
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
4.
2. BEVEZETÉS - IRODALMI ÁTTEKINTÉS
5.
2.1. A gyermekkori májdaganatok
5.
2.2. Hepatoblastoma
7.
2.3. Tight junction
18.
2.3.1. Claudinok
21.
2.4. Delta-like protein
30.
3. CÉLKITŐZÉSEK, KÉRDÉSFELTEVÉS
33.
4. ANYAG ÉS MÓDSZER
35.
4.1. Betegek és szövetminták
35.
4.2. Szövettani és hisztokémiai módszerek
39.
4.2.1. Szövettani és hisztokémiai vizsgálatok
39.
4.2.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok
39.
4.2.2.1. CLDN-1,-2, -3, -4 és -7 ellenes antitestek alkalmazása
39.
4.2.2.2. Dlk-1, AFP, β-catenin, HSA, CK-7, CK-19, Ki-67 és PCNA ellenes antitestek alkalmazása
42
4.2.2.3. Az immunreakciók értékelése
45.
4.3. Molekuláris biológiai módszerek
46.
4.3.1. Real time RT-PCR (qPCR) vizsgálatok
46.
4.3.2. β-catenin mutáció analízis
48.
4.4. Statisztikai módszerek
49.
5. EREDMÉNYEK
50.
5.1. Claudin expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel
50.
5.1.1. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 expresszió vizsgálata a tumormentes, környezı májban
50.
5.1.2. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 expresszió vizsgálata hepatoblastomában
51.
5.2. Proliferációs (KI-67, PCNA) és egyéb markerek (HSA, CK-7) vizsgálatata human hepatoblastomában immunhisztokémiai módszerrel
2
55.
5.3. Claudinok génexpressziójának vizsgálata human hepatoblastomaban molekuláris biológiai módszerekkel
58.
5.3.1. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 mRNS expressziójának vizsgálata a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében (real time RT PCR) 58. 5.4. β-catenin expresszió vizsgálata human hepatoblastomában
60.
5.4.1. β-catenin expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel
60.
5.4.2. A β-catenin gén mutációjának vizsgálata molekuláris biológiai módszerrel (mutáció analízis)
62
5.5. DLK-1 fehérjeexpresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel
63.
5.5.1. DLK-1 fehérjeexpresszió vizsgálata human hepatoblastomában
63..
5.5.2. DLK-1 fehérjeexpresszió vizsgálata hepatocellularis carcinomában és egyéb daganatokban
64.
6. MEGBESZÉLÉS
69.
6.1 Claudinok expressziója human hepatoblastomában
69.
6.2. Dlk-1 expresszió humán hepatoblastomában
76.
7. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, KÖVETKEZTETÉSEK
80.
8. ÖSSZEFOGLALÁS
81.
9. SUMMARY
82
10. IRODALOMJEGYZÉK
83.
11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
108.
12. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
115.
3
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
AFP
alfa-fetoprotein
APC
adenomatosus polyposis coli
BWS
Beckwith-Wiedemann szindróma
CLDN
claudin
COG
Children Oncology Group
CPE
Clostridium perfringens enterotoxin
CCSG
Children’s Cancer Study Group
DLK-1
delta like protein
ECM
extracelulláris mátrix
EGF
epidermalis növekedési faktor
FA1
fetal antigén 1
FAP
familiaris adenomatosus polyposis
GSK-3β
glikogén szintáz kináz
HB
hepatoblastoma
HCC
hepatocellularis carcinoma
HPF
high power field
IBD
inflammatory bowel disease
LOH
loss of heterozygosity
OV-1
oval sejt asszociált antigén-1
PEComa
perivascularis epitheloid sejtes tumorok
POG
Pediatric Oncology Group
Pref-1
preadipocyta faktor
PRETEXT
Pre-Treatment Extension
SEER
Surveillance Epidemiology End Results
SIOPEL
International Childhood Liver Tumour Strategy Group
Tcf-4
T-sejt faktor
TJ
tight junction (sejtkapcsoló struktúrák)
TLCT
transitonalis májsejtes tumor
ZOG
zona glomerulosa specifikus protein
4
2. BEVEZETÉS - IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A GYERMEKKORI MÁJDAGANATOK A gyermekkori primer rosszindulatú májdaganatok az összes gyermekkori májdaganatnak kb. a 70 %-át alkotják. A Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) 1972 és 1992 között végzett vizsgálati adatai szerint a gyermekkori rosszindulatú májdaganatok évente mintegy 5 %-os növekedést mutatnak. Ez évente mintegy 100-150 új esetet jelent az USA-ban (Multerys és mtsai 1999). Más adatok szerint a rosszindulatú májdaganatok száma megduplázódott a korai ’80-as évekhez képest, amikor azok az összes gyermekkori malignus daganat kb. 2 %-át alkották (Kenney és mtsai 1998). Gyermekkorban a leggyakoribb primer rosszindulatú májdaganat a hepatoblastoma. Kialakulásának oka pontosan nem ismert, de tény, hogy a genetikai és környezeti tényezık mellett a fiúknál és a koraszülött, alacsony súllyal született kisgyermekeknél a daganat nagyobb gyakoriságot mutat (Weinberg és mtsai 1983). A hepatoblastoma leggyakrabban a 3 év alatti gyermekekben fordul elı. A hepatoblastoma diagnózisa az esetek nagy részében egyértelmő, mind a klinikai adatok (életkor, AFP szint), mind a szövettani kép tekintetében. Elıfordulnak azonban olyan esetek, amikor a patológus nehéz döntés elé kerül. Ide sorolható a megszokottnál idısebb életkorban megjelenı hepatoblastoma, mely ugyan ritka, de számolni kell vele, vagy az egyre több figyelemmel kitüntetett transitionalis májsejtes tumor (TLCT). A hepatoblastomát gyakoriságban a hepatocellularis carcinoma követi, mely a hepatoblastomától mind hisztológiailag, mind az életkort illetıen is különbözik. A harmadik leggyakoribb rosszindulatú primer májdaganat a differenciálatlan embryonalis sarcoma, amely az összes gyermekkori primer májdaganatnak kb. a 6 %-a (Stocker és mtsai 1978, Bisongo és mtsai 2002, Das és mtsai 2009). Az éreredető tumorok közül az igen agresszívan viselkedı angiosarcoma (Awan és mtsai 1996; Dimashkieh és mtsai 2004), valamint a biliáris duktusokból származtatható embryonalis rhabdomyosarcoma említendı, mely utóbbi fıként az 5 év alatti korosztályt érinti (Nicol és mtsai 2007). Leírtak már a májban primer extragonadalis csírasejtes tumort is (Brodeur és mtsai 1981, Verma és mtsai 2003), bár ez inkább, mint metasztázis fordul elı. Saját gyakorlatban találkoztunk a májban primer malignus rhabdoid tumorral, mely rendkívül ritka és 100 %-ban letalis kimenetelő (Halász és mtsai 2004).
5
A gyermekkori jóindulatú májdaganatok az összes gyermekkori primer májdaganatnak kb. a 30 %-át teszik ki, ezek közül a hemangioendothelioma és a hemangioma a leggyakoribb. A mesenchymalis hamartoma, mely tulajdonképpen fejlıdési anomália, szintén gyakori és sokszor differenciáldiagnosztikus problémát okozhat (Siddiqui és mtsai 2006) kiváltképp akkor, ha a daganatgyanús területrıl vastagtő-biopsziát vagy ékrezekciót kap vizsgálatra a patológus. Gyakori jelenség ugyanis, hogy a daganat körül mesenchymalis jellegő reaktív szövetszaporulat alakul ki, ami megtévesztı lehet. A hepatocellularis adenoma gyermekkorban igen ritka, elsısorban egyéb hajlamosító tényezıkkel összefüggésben alakul ki, úgymint Fanconi anaemia, 1 típusú glycogentárolási betegség vagy a tinédzserkorban elkezdett hormonális fogamzásgátlás. A focalis nodularis hyperplasia hasonlóan az adenomához a fiatal felnıttkor elváltozása. A gyermekkori májdaganatok összefoglalását az életkor függvényében az 1. táblázat mutatja.
1. táblázat: Gyermekkori májdaganatok életkor szerinti elıfordulása Finegold MJ, Lopez-Terrada DH, Bowen J, Washington MK, Qualman SJ; College of American Pathologists. (2007) Protocol for the examination of specimens from pediatric patients with hepatoblastoma. Arch Pathol Lab Med, 131: 520-9. adatainak felhasználásával
ÉLETKOR
JÓINDULATÚ Hemangioendothelioma Hemagioma Mesenchymalis hamartoma Teratoma
ROSSZINDULATÚ Hepatoblastoma Rhabdoid tumor Yolk sac tumor Csecsemıkor (0-1 év) Langerhans sejtes histiocytosis Megakaryoblastos leukemia Disszeminált neuroblastoma Hemangioendothelioma Hepatoblastoma Korai gyerekkor Hemangioma Rhabdomyosarcoma (1-3 év) Mesenchymalis hamartoma Inflamm. myofibroblastos tumor Perivasculáris epitheloid sejtes Hepatocellularis carcinoma tumorok (PEComa) Embryonalis sarcoma Kései gyerekkor Hemangioma Angiosarcoma (3-10 év) Cholangiocarcinoma Endocrin (gastrin) carcinoma Fibrolamellaris hepatocellularis cc. Hepatocellularis adenoma Focalis nodularis hyperplasia Hodgkin lymphoma Fiatal felnıttkor Biliaris cystadenoma Leiomyosarcoma Hemangioma
6
A hepatoblastoma bonyolult szöveti differenciálódása (lásd a hepatoblastoma részletes leírásánal), nem egészen világos hisztogenezise és néhány kifejezetten rossz prognózisú, erısen differenciálatlan és/vagy újonnan leírt altípusa miatt egyre gyakrabban vizsgált daganat.
2.2. HEPATOBLASTOMA A hepatoblastoma a csecsemıkor és a kisgyermekkor leggyakrabban elıforduló rosszindulatú primer májdaganata; de relative ritka, mivel az összes gyermekkori rosszindulatú daganatnak csupán 1 %-át alkotja (Perilingo és mtsai 2002). A rosszindulatú gyermekkori májdaganatok 50-60 %-a és megközelítıleg az összes gyermekkori májdaganat 40 %-a hepatoblastoma (Reynolds és mtsai 2004). Az 1990 és 1995 között végzett vizsgálatokban az éves incidencia az 1 év alatti gyermekekben 11,2 eset/millió, az összes gyermekre vonatkoztatva pedig 1,5 eset/millió volt, amely majdnem a kétszerese az 1975 és 1979 között elıforduló eseteknek (Willert és mtsai 2008). Magyarországon a májdaganatok a ’90-es évek adatai alapján 0,5-2 %-ban fordultak elı a gyermekkori daganatok között (Kemény és mtsai 2000). Az Országos Gyermek Tumorregiszter alapján Magyarországon ebben az idıszakban a gyermekkori májtumor incidenciája 1,81 eset/millió, a fiú/lány arány 1,2:1 volt. Az esetek 83 %-a volt hepatoblastoma (Országos Gyermek Tumorregiszter adatai alapján). Japánban és az USA-ban az alacsony (<1500 g), valamint a nagyon alacsony születési súly (<1000 g) és a hepatoblastoma gyakoribb elıfordulása között szignifikáns összefüggést találtak (Ikeda és mtsai 1997 és 1998; Tanimura és mtsai 1998, Feusner és Plaschkes
2002).
Koraszülöttek
esetében
a
daganat
gyakoribb
elıfordulását
magyarázhatja az is, hogy a koraszülött gyermekek túlélési esélyei jelentısen javultak az orvostudomány és a technika dinamikus fejlıdésének köszönhetıen. A rasszok tekintetében a fehér gyermekekben majdnem ötször gyakoribb a daganat elıforulása az afroamerikai gyerekekhez képest. Fiúkban a hepatoblastoma gyakoribb, mint a lányokban; a fiú-lány arány 1,7:1. Ez az arány magasabb Európában (1,6-3,3:1) és Taiwanban (2,9:1) (Willert és mtsai 2008). A hepatoblastoma általában 3 éves kor alatt jelentkezik, de az átlagéletkor a diagnózist illetıen 1 év. A daganat nagyon ritkán fordul elı fiatal felnıttekben és
7
extrém ritkán felnıttekben. Prognózisa az idısebb gyermekekben és a fiatal felnıttekben sokkal rosszabb, mint csecsemıkorban és a korai gyermekkorban (1-3 év). A hepatoblastoma a máj éretlen ún. precursor sejtjeibıl származtatható. Egyre több bizonyíték szól azonban amellett, hogy a daganat a máj pluripotens ıssejtjeibıl ered (Ruck és mtsa 2002). A hepatoblastoma fejlıdése morfológiailag nagymértékben hasonlít a normál máj fejlıdésére, ennek alapján felvetıdik, hogy a daganat egy a normál hepatogenezis alatt bekövetkezett „hiba” eredményeként alakul ki. A hepatoblastoma általában egyoldali; ezen belül gyakoribb a jobb lebeny érintettsége. A hepatocellularis carcinomával ellentétben, amely gyakran alakul ki cirrhosis talaján, a hepatoblastoma cirrhosismentes májban fejlıdik ki. Klinikailag általában tünetmentes hasi terimeként jelentkezik, gyakran ilyenkor már pulmonális áttétek is jelen vannak. A családi anamnézisben szerepelhet intestinalis polyposis vagy adenocarcinoma, amely gyakran familiaris adenomatosus polyposis (FAP) talaján alakul ki. Számos malformációt írtak le hepatoblastomával összefüggésben, mint pl. dongaláb, patkóvese, macroglossia, bal mellékvese hiánya stb (Finegold és mtsai 2007, Willert és 2008 mtsai). Hemihypertrophia vagy Bekwith-Wiedemann szindróma (Wiedemann 1983) esetén (BWS: macrosomia, macroglossia, visceromegalia, hasfali defektus, hemihypertrophia) legalább 4 éves korig feltétlenül ajánlott az alpha fetoprotein (AFP) mint diagnosztikus hepatikus marker - szérumszintjének ellenırzése, mivel ezek a szindrómák gyakran társulnak hepatoblastomával (Mannens és mtsai 1994, Willert és mtsai 2008). Metabolikus zavarok közül a hypoglycemia, glycogen tárolási betegség Ia, III, IV vagy a heterozigóta α-1 antitripszin hiány említhetı (Finegold és mtsai 2007). A környezeti faktorok közül anyai részrıl a hormonális fogamzásgátlószerek, clomiphen citrát, gonadotropin szedése, dohányzás, fémek, síkosító olajok és kenıanyagok, míg apai részrıl a fémek használatát hozták összefüggésbe a daganat gyakoribb elıfordulásával (Melamed és mtsai 1982, Buckley és mtsai 1989, Horta és mtsai 1997, Finegold és mtsai 2007).
Gentikai faktorok A hepatoblastomák karyotipizálása során számos kromoszómális eltérést találtak. Leggyakrabban a 2-es és a 20-as kromoszóma triszómiáját detektálták; ezeknek vélhetıen a tumorgenezis korai szakaszában lehet jelentıségük (Fletcher és mtsai 1991,
8
Tomlinson és mtsai 2002). A 20-as kromoszóma triszómiáját és hosszú karjának duplikációját megtalálták rhabdomyosarcomában is, mely felvetette a két daganat genetikai kapcsolatát, annál is inkább mivel mindkét tumorban megtalálható a Beckwith-Wiedemann szindróma lókusz hiánya: loss of heterozygosity (LOH) 11p (Steenman és mtsai 1999). A 8-as kromoszóma triszómiája szintén gyakori hepatoblastomában.
Ezen
kromoszómák
triszómiájának
klinikai
jelentısége
hepatoblastomában nem teljesen ismert, bár azt tudjuk, hogy a 8-as és a 20-as kromoszómák érintettsége rosszabb prognózissal jár (Weber és mtsai 2000). Számos kiváló közlemény foglalkozik a hepatoblastomában és néhány ritkább gyermekkori
primer
májdaganatban
megtalálható
abnormalitások
genetikai
feltérképezésével, melyek összefoglalását a 2. táblázat ismerteti.
2. táblázat: Genetikai abnormalitások és betegségek asszociációja human hepatoblastomával (Finegold MJ, Lopez-Terrada DH, Bowen J, Washington MK, Qualman SJ; College of American Pathologists. (2007) Protocol for the examination of specimens from pediatric patients with hepatoblastoma. Arch Pathol Lab Med 131: 520-9.) HB: hepatoblastoma, HCC: hepatocellularis carcinoma, FAP: Familiaris adenomatosus polyposis, BWS: Beckwith-Wiedemann szindróma. APC: adenomatosus polyposis coli
BETEGSÉG FAP BWS Li-Fraumeni szindróma Triszómia 18 Glycogen tárolási betegség Ia, III, IV
KROMOSZÓMÁLIS ELTÉRÉS
TUMOR TÍPUS HB, HCC vagy adenoma, biliaris adenoma HB, hemangioendothelioma HB, differenciálatlan sarcoma HB Hepatocellularis adenoma vagy carcinoma, HB
ÉRINTETT GÉN
5q21.22
APC
11p15.5
P57KIP2, egyéb
17p13
TP53
18 17
Glucose-6-phosphatase
Számos genetikai eltérés ezek közül más embryonalis tumorban is kimutatható, pl. a LOH 11p15-öt rhabdomyosarcomában és Wilms tumorban is leírták (BesnardGuerin és mtsai 1996; Karnik és mtsai 1998). Régóta ismert, hogy a familiaris adenomatosus polyposis szindrómában (FAP) szenvedı betegekben gyakrabban fordul elı hepatoblastoma (Hughes és mtsa 1992). Egy közlemény szerint húsz hepatoblastoma közül egy esetben biztosan megfigyelhetı a FAP elıfordulása (Hirschman és mtsai 2005). Az adenomatosus polyposis coli (APC) tumorszupresszor
9
gén csírasejtes mutációja vastagbél polyposishoz (FAP) és végül adenocarcinomához vezethet. Az APC gén az 5. kromoszómán helyezkedik el (5q21), egy 2843 aminosavból álló fehérjét kódol, mely a sejtadhézióban és egyéb jelátviteli folyamatokban játszik fontos szerepet. Mutációja a sporadikus hepatoblastomákban viszonylag ritka (Sanders és mtsai 2006). Az APC gén mutációja funkcióvesztéssel jár, amely során a β-catenin nevő protoonkogén (a Wnt jelátviteli út egyik fontos effektora és az APC egyik legfontosabb gátló faktora) citoplazmatikus degradációja nem történik meg, intracellulárisan akkumulálódik, majd transzlokálódik a sejtmagba és ott a TCF-4hez (T-sejt faktor) kötıdik. Ennek során a transzkripciós faktorok segítségével egyes oncogének pl.: c-myc, cyclin D1, TCF/LEF aktiválódnak, melyek serkentik a proliferációt, a dedifferenciációt és gátolják az apoptózist. A β-catenin nukleáris akkumulációját magában a β-catenin génben bekövetkezett mutáció (Buendia és mtsai 2002), valamint a wnt jelátviteli folyamatban szereplı egyéb proteineket (pl. AXIN) kódoló gének mutációja és így a fehérjék funkcióvesztése is okozhatja (Taniguchi és mtsai 2002). A β-catenin
mutáció, függetlenül a szövettani típustól, a hepatoblastomák közel 50%-ában megtalálható (Bläcker és mtsai 1999, Koch és mtsai 1999, Buendia és mtsai 2002). Emellett leírták hepatoblastomában a Hedgehog jelátviteli útvonal szerepét (Arsic és mtsai 2007), valamint a Wnt jelátviteli útvonal egyik jelentıs antagonistájának, a human Dickkopf-1 proteinnek az overexpresszióját is (Wirths és mtsai 2003). Tumor markerek A hepatocelluláris daganatok felismerésének vagy nyomonkövetésének a leghasznosabb markere a szérum AFP. A hepatoblastomák 80-90 %-ában, a hepatocellularis carcinomák 60-70 %-ában észlelhetı markáns AFP-szint emelkedés (Tomlinson és mtsai 2002). Hepatoblastomában az alacsony AFP vérszint (<100 ng/ml) kifejezetten rossz prognózissal jár (von Schweinitz és mtsai 1995, Van Tornout és mtsai 1997) és agresszív kemoterápiás kezelést von maga után. A hepatoblastoma szövettani felosztása A hepatoblastomák szövettani felosztása a ’60-as évektıl egészen a korai ’90-es évekig tartott. Az ún. hepatoblastoma klasszifikáció megalkotásának egyik fı célja az volt, hogy a daganat elkülöníthetı legyen a gyermekkori hepatocellularis carcinomától.
10
Felismerték ugyanis, hogy a hepatoblastoma hisztopatológiája jelentıs eltéréseket mutat a májsejtek fejlıdése és érése tekintetében. Ez a koncepció azonban csak a fetalis és az embryonalis szubtípusra igaz, a késıbb identifikált kissejtes differenciálatlan és a macrotrabecularis szubtípusokra nem. A daganat szövettani klasszifikációját 3. táblázat mutatja.
3. táblázat: A hepatoblastomák szövettani klasszifikációja (Zimmermann A.. (2005) The emerging family of hepatoblastoma tumours: From ontogenesis to oncogenesis. Eur J of Cancer, 41: 1503–1514.) alapján
Tisztán epithelialis típus Fetalis (tisztán fetalis) szubtípus Embryonalis/kevert fetalis és embryonalis szubtípus Macrotrabecularis szubtípus Kissejtes differenciálatlan szubtípus (anaplasticus) Kevert epithelialis és mesenchymalis típus Teratoid elemeket tartalmazó Teratoid elemeket nem tartalmazó (nem-teratoid) Hepatoblastoma, nem osztályozható típusai
1. Tisztán epithelialis típus Fetalis szubtípus A normális újszülöttkori (fetalis) májsejtektıl a hepatoblastoma mitotikusan inaktív, tisztán fetalis szubtípusa nehezen különíthetı el. A tumorsejtek nagyobbak, mint a normális fetalis hepatocyták, a mag/citoplazma arány a mag javára tolódik el. A mitotikus aktivitásuk alacsony (≤2 mitózis/10 nagy nagyítású látótér [HPF=X40 objektív]). A tumorsejtek növekedési mintázata hasonlít a normális májsejtek elrendezıdésére: kötegeket, trabekulákat alkotnak, melyek 1-3 sejtsor vastagságúak, vagy a tumorsejtek kisebb mezıkben, nodulusokban helyezkednek el. Extramedullaris vérképzés (normoblastok) és epeszekréció gyakran látható a daganatban. A glycogen tartalomtól függıen a citoplazma eosinophil vagy világos (világos sejtes típus) lehet,
11
gyakran láthatunk vacuolumokat a felhalmozott lipidcseppek eredményeként (1/A és 1/B ábra).
A
B
1. ábra: A hepatoblastoma fetalis komponensének szövettani képe A: A daganatot eosinophilen festıdı tumorsejtek építik fel, melyek a normális májsejtekhez nagyfokban hasonlítanak. B: A fetalis komponens világossejtes (glycogen gazdag) variánsa. (HE, A-B: 600X)
Fetalis/embryonalis szubtípus A fetalis komponens mellett basophil festıdéső, leginkább clusterekben elhelyezkedı, kissé elongált, ovoid alakú sejtekbıl felépülı embryonalis komponens is megjelenik. Ezek sejtmagja kissé hosszúkás, hyperchrom, a mag/citoplazma arány a mag javára tolódik el, a mitotikus aktivitás kifejezett. A tumorsejtek gyakran képeznek pszeudorozettákat (szabálytalan alakú mirigyes vagy acináris struktúrák centrális szők lumennel).
A
sejtek
leginkább
a
blastema
sejtekhez
hasonlítanak,
differenciáldiagnosztikailag ezért az ún. „kis, kerek, kék sejtes” daganatokat (nephroblastoma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, lymphomák) kell kizárnunk. (2/A és 2/B ábra).
12
A
B 2. ábra: A hepatoblastoma embryonalis komponensének szövettani képe A: A daganatsejtek pszeudorozettákat (nyíl) képeznek. B: A daganatsejtek nagyobb, összefüggı mezıbe rendezıdnek (HE, A-B: 600X).
A két komponens gyakran keveredik egymással, ilyenkor a különbözı érettségő (fetalis/embryonalis) daganatsejtek egymástól való elkülönítése a HE festett metszeteken nem könnyő feladat. Legtöbbször azonban a komponensek egymástól jól elkülönülten, kisebb-nagyobb csoportokba vagy mezıkbe rendezıdnek (3. ábra).
13
e f
3. ábra: Hepatoblastoma fetalis/embryonalis szubtípusának szövettani képe f: fetalis komponens, e: embryonalis komponens (HE, 600X)
Kissejtes differenciálatlan szubtípus Eredetileg anaplasztikus hepatoblastomának nevezték, helyette 1989-ben Haas és munkatársai javasolták a kissejtes differenciálatlan hepatoblastoma elnevezést (Haas és mtsai 1989). Differenciáldiagnosztikailag leginkább a neuroblastoma vagy egyéb a „kis, kerek, kék sejtes” tumorok tagjai jönnek számításba (Lack és mtsai 1982). Amennyiben
egy
komplett
hepatoblastoma
rezekátumban
focalisan
kissejtes
differenciálatlan komponens található, az a túlélést kedvezıtlenül befolyásolja (Haas és mtsai 2001). Felmerült, hogy a tumort alkotó kismérető sejtek esetleg a stem/pluripotens sejtekbıl származnának. A hipotézist alátámasztja, hogy az ultrastruktúrális és az immunohisztokémiai vizsgálatok (CK-7, albumin, oval sejt asszociált antigén OV-1 és OV-6) nagyfokú hasonlóságot mutatnak a kismérető és az oval sejtek között patkány és károsodott humán májban is (Ruck és mtsai 1997).
14
Macrotrabecularis hepatoblastoma és egyéb májtumorok érett hepatocellularis morfológiával Ide tartozik a macrotrabecularis hepatoblastoma, a felnıtt típusú hepatocellularis carcinoma és egy újonnan leírt magas malignitású daganat, a transitionalis májsejtes tumor (transitional liver cell tumor: TLCT). Ez utóbbi fıként idısebb gyermekekben és fiatal felnıttekben jelenik meg. A daganat igen agresszív, biológiai viselkedésében eltér a szokványos hepatoblastomatól. Kifejezetten magas AFP szinttel jár. Átmenetet képvisel a hepatoblastoma és a hepatocellularis carcinoma között (Zimmermann 2005).
2. Kevert (epithelialis és mesenchymalis) típus Az epithelialis komponensek mellett stromalis elemek is láthatóak a tumorban. Ezek zömében fibroblastokból, myofibroblastokból és osteoidból állnak. Gyakran látható kiterjedt osteoidképzıdés a kemoterápiás kezelések következményeként is (Saxena és mtsai 1993, Heifetz és mtsai 1997). Jelenleg még nem tudjuk, hogy van-e prognosztikai jelentısége a stromalis elemeknek. Egyes szerzık szerint az osteoid és a chondroid elemek jelenléte jobb prognózist jelent (Haas és mtsai 1989), míg más tanulmányok nem tudtak ilyen összefüggést kimutatni (Heifetz és mtsai 1997). A mesenchymalis elemek lehetnek nem-teratoid és teratoid megjelenésőek (intestinalis, neuralis, rhabdomyoblastoid, melanocytás).
3. Hepatoblastoma cholangioblastos és organoid megjelenéssel Zimmermann, Libbrecht és munkatársaik olyan hepatoblastoma eseteket közöltek, amelyekben a periférián a tumornodulus körül atypusos cholangiocytaszerő sejtek vékony szegélye volt látható. A sejtek zöme dupla réteget alkotott, ezek leginkább egy abnormális megjelenéső un. „ductal plate”-re hasonlítottak („ductal plate tumor”) (Zimmermann és mtsai 2002, Libbrecht és mtsai 2003). Nincs bizonyíték arra, hogy ezek a sejtek esetleg egy már meglévı ductusokból származnának (ductularis reakció) (Roskams és mtsai 2004). Az organoid csoportot a hamartomaszerő hepatoblastoma és a bimodalis differenciációt mutató éretlen hepatikus tumor alkotják (Allison és mtsai 1956, Gornicka és mtsai 2001). A HB szövettani szubtípusainak százalékos megoszlását a 4. ábra szemlélteti.
15
21 %
5%
7%
kevert kis sejtes differenciálatlan tisztán fetalis fetalis/embryonalis
67%
4. ábra: A hepatoblastoma szövettani típusainak százalékos megoszlása (Weinberg AG, Finegold MJ. (1983) Primary hepatic tumours of childhood. Hum Pathol, 14: 512–537.)
Az
újonnan
felismert
szövettani
típusok
ismeretében
megalkották
a
hepatoblastoma új szövettani klasszifikációját, amelyben a szövettani típus és szubtípusok osztályozása mellett a tumortípusra jellemzı kockázati tényezık is szerepelnek (standard kockázat, intermedier és magas kockázat).
Kezelési elvek A hepatoblastoma kezelése az európai SIOPEL (International Childhood Liver Tumour Strategy Group) csoport szerint elsısorban a szisztémás kemoterápiás kezelésen, másodsorban a tumor minél eredményesebb sebészi eltávolításán alapul (Exelby és mtsai 1975, Quinn és mtsai 1985, Pritchard és mtsai 2000). A ’90-es évek elején a Wilms tumor kezelésében alkalmazott preoperatív kemoterápia eredményessége inspirálta a SIOPEL megalkotóit arra, hogy olyan kezelési stratégiát dolgozzanak ki a gyermekkori májdaganatokra (HB és HCC), amely a májbiopsziát követı preoperatív kemoterápián és az azt követı sebészi beavatkozáson alapul (Pritchard és mtsai 2000). Amennyiben a klinikai és a szövettani vizsgálat indokolja, a betegek még posztoperatív kemoterápiában is részesülnek. A kezelés elıtt a tumor szektoriális elhelyezkedését és kiterjedését képalkotó vizsgálatok (UH, CT, MR) segítségével az un. PRETEXT system
16
(Pre-Traetment Extension) alapján rendszerezik, mely magába foglalja a lokalizációt, a véna és az extraabdominalis érintettséget, valamint a távoli metastasisokat is. Észak Amerikában a Children’s Cancer Study Group (CCSG), a Pediatric Oncology Group (POG) és a Children’s Oncology Group (COG) a SIOPEL csoporttal ellentétben elsıdlegesnek a tumor sebészi eltávolítását tartja, és csak ezután kapnak a betegek kemoterápiás kezelést (Czauderna és mtsai 2006). A különbözı terápiás megközelítések ellenére az 5 éves túlélési eredmények hasonlóan 70 % felett vannak (Roebuck és mtsa 2006).
17
2.3. TIGHT JUNCTION (TJ) A sejt-extracellularis matrix és a sejt-sejt kapcsolatok alapvetı fontosságúak a szöveti szervezıdés kialakulásában és fenntartásában. Az állati és emberi endothel, valamint az epithel sejtek között többféle, eltérı funkciójú sejtkapcsoló struktúra különböztethetı meg (Ebnet 2008). Ezen sejtkapcsoló struktúrák, az úgynevezett zonula occludens vagy „tight junction” (TJ), a zonula adherens, a desmosoma (macula adherens), a hemidesmosoma és a gap junction (réskapcsolódás, connexinek, cadherinek, catheninek) (5. ábra). Az ún. horganyzó kapcsolatokat, mint a zonula adherenst, a desmosomát és a hemidesmosomát a cadherinek, az integrinek, a desmoglein, a desmocollin, a laminin és a plakoglobin építik fel.
5. ábra: Az intercelluláris kapcsolatok sematikus rajza (Balkovetz DF. (2006) Claudins at the gate: determinants of renal epithelial tight junction paracellular permeability. Am J Physiol Renal Physiol, 290: 572-579.)
A TJ folyamatos, körkörösen elhelyezkedı, övszerő struktúra az epithelialis és az endothelialis sejtek apicalis és basolateralis határán (Smith és mtsai 2008). A TJ szinte gallérszerően fut körbe a két sejt közötti felszínen. Olyan szoros intercellularis kapcsolatot teremt, hogy a sejtfelszínen elhelyezkedı glikokalix eltőnik és a sejtmembrán két külsı rétege összeolvad („kissing points”) (6. ábra) (Furuse és mtsai 1998, 1999, Tsukita és mtsai 2000, Sawada és mtsai 2003).
18
6. ábra: Tight junction térbeli szerkezet („kissing points”) Tsukita S. és Furuse M. (2000) alapján (Tsukita S, Furuse M. (2000) Pores in the wall: claudins constitute tight junction strands containing aqueous pores. J Cell Biol, 149: 13-16.)
A TJ-k csoportosíthatóak aszerint, hogy hány sejt között létesítenek kapcsolatot: ezek szerint vannak bicellularis TJ-k, melyek két szomszédos sejt között képzıdnek és tricellularis TJ-k, melyek három sejt találkozásánál alakulnak ki (Ikenouchi és mtsai 2005). Funkciójukat tekintve a TJ-k egyrészt intercelluláris kapcsolatot hozhatnak létre, másrészt lezárják és kompartmentekre osztják a sejtek közötti teret (Förster és mtsai 2008). A TJ-k, mint kapcsoló fehérjek, összekapcsolják az ıket felépítı proteineket az aktin-citoszkeletonnal. Korábban azt gondolták, hogy a TJ molekulák elsısorban statikus funkciót töltenek be, azaz feladatuk csak a különbözı kompartmentek elkülönítése lenne. Azóta a TJ-k számos egyéb funkcióját is feltérképezték. A TJ olyan szelektív szemipermeabilis barrier, amely szabályozza a paracelluláris diffúziót (Shen és mtsai 2008), a víz és az oldatok transepithelialis átjutását, valamint a szelektív protein transzportot („gate”, azaz kapufunkció). Emellett biztosítják a sejtek polaritását is („fence”, azaz kerítés funkció). A paracellularis barrier funkció (kapufunkció) biztosítja a szükségtelen vagy toxikus molekulák kizárását, a víz és az ionok belsı homeosztázisát a szervezetben (Tsukita és mtsai 2008). Felismerték, hogy a TJ-t alkotó molekulák a jelátvitel többlépcsıs folyamatának is résztvevıi, reagálnak a membrán felıl érkezı különbözı szignálokra;
19
kapcsolódnak a kinázokhoz és a Ras-hoz (Matter és Balda 2003, Shen és mtsai 2008, Förster 2008, Gonzalez–Mariscal és mtsai 2003, 2007). A TJ proteinek molekuláris felépítését elsıként S. Tsukita japán kutató írta le 1993-ban. Az elsı TJ fehérje melyet izoláltak az occludin volt, mely nevét a zonula occludens alapján (a TJ szinonímája) kapta (Furuse és mtsai 1993). Eredményeikre alapozva azt gondolták, hogy a TJ felépítésében az occludin elsıdleges szerepet tölt be. Késıbb igazolták, hogy a TJ kialakulása occludin hiányos egerekben is megtörténik. Ez vetette fel, hogy az occludinon kívül más fehérjéknek is részt kell venniük a TJ-k felépítésében. Végül ez vezetett 1998-ban a claudinok (CLDN) felfedezéséhez (Furuse és mtsai 1998). Az elsıként felfedezett claudin molekulákat CLDN-1 és CLDN-2-nek nevezték el. Nevüket a latin „claudere”, azaz „lezár” igébıl kapták, mely pontosan leírja a molekulák egyik alapvetı funkcióját. A claudin géncsaládot 1999-ben Morita és mtsai azonosították. A TJ legjelentısebb fehérjéi a transzmembrán claudinok. A TJ-k felépítésében a claudinokon kívül több mint 40 különbözı protein vesz részt. Jellegzetességüket illetıen többféle elnevezés és csoportosítás látott napvilágot (4. táblázat) (Ebnet 2008, Förster 2008, Gonzales-Mariscal és mtsai 2003, Mitic és Anderson 1998, Shen és mtsai 2008, Tsukita és Furuse 1999, Tsukita és mtsai 2008, Tsukita és Furuse 2000). 4. táblázat: A TJ-t felépítı fehérjék csoportosítása. (González-Mariscal L, Lechuga S, Garay E. (2007) Role of tight junctions in cell proliferation and cancer. Prog Histochem Cytochem, 42: 1-57.) INTEGRÁNS MEMBRÁNFEHÉRJÉK Occludin Claudinok (24 tag) JAM-1, -2, -3, -4 Tricellulin CRB3
CITOPLAZMATIKUS FEHÉRJÉK PDZ doménnal rendelkezık PDZ doménnal nem rendelkezık ZO-1, -2, -3 Cingulin Pals1 Symplekin MAGI-1, -2, -3 7H6 PAR-3, -6 Pilt PATJ JEAP MUPPI1 AF-6
A proteinek a TJ-ban különféle hatásokra létrejövı állandó mozgásban vannak. Ezek a mozgások olyan struktúrális vagy funkcionális eltéréseket eredményezhetnek, melyek a sejt életét alapvetıen befolyásolják. A TJ-ben a proteinek mozgása, azaz a TJ átépülése szabályozott folyamat (Shen és mtsai 2008). A korábban kizárólag statikusként leírt TJ modellt így felváltotta az ún. dinamikus modell, mely
20
szerint a TJ-t alkotó fehérjék közötti kapcsolat átmeneti és állandóan változik (Shen és mtsai 2008). 2.3.1. CLAUDINOK A claudin molekulacsalád elsı tagjait Furuse és munkatársai fedezték fel 1998ban, amikor csirke májsejteken az occludintól eltérı molekulatömegő és felépítéső fehérjét izoláltak. Az elsı felfedezett molekulák a CLDN-1 és CLDN-2 nevet kapták. Gerincesekben a GenBank adatbázisában jelenleg 24 különbözı claudint jegyeznek, melyek egymással nagyfokú szekvenciahomológiát mutatnak (Chiba és mtsai 2003, Matsuda és mtsai 2004, Katoh, Katoh 2003, Tsukita, Furuse 2001, Tsukita és mtsai 2008). Ez a tény a claudin családon belüli alcsoportokra, és egyben a funkcióik közötti átfedésre is utal. A különbözı claudinokat kódoló génszakaszok a 3., 7., 13., 16., 17., 21. és 22. kromoszómán találhatóak (Mitic és mtsai 1998). A claudin gének 20-27 kDA közötti molekula tömegő proteineket kódolnak, ezek az occludinnal nem mutatnak szekvencia homológiát (Oliveira és Morgado-Díaz 2007). A claudin géncsalád phylogenetikai családfáját már korábban feltérképezték (7. ábra) (Morita és mtsai 1999), melyet a közelmúltban kiegészítettek (Hewit és mtsai 2006).
7. ábra: A claudin géncsalád phylogenetikai családfája (Morita K, Furuse M, Fujimoto K, Tsukita S. (1999) Claudin multigene family encoding fourtransmembrane doain protein components of tight junction strands. Proc Natl Acad Sci U S A, 96: 511516.)
21
A claudinok alkotják a TJ-k gerincét (Nishimura és mtsai 2001). A fehérje molekula négy transzmembrán domént, két extracellularis hurkot, valamint rövid intracitoplazmatikus N és C terminális régiót (CT) tartalmaz. A két extracellularis hurok közül az elsı az ún. intercellularis cipzár kialalkításában játszik szerepet. A molekula C terminális része viszonylag állandó, az alkotó aminosavak száma azonban eltérı a fehérjecsalád egyes tagjaiban (Furuse és mtsai 1998, González-Mariscal és mtsai 2003, Turksen és mtsai 2004) (8. ábra).
N
C
8. ábra: A claudinok, mint transzmembrán proteinek (Turksen K, Troy TC. (2004) Barriers built on claudins. J Cell Sci, 117: 2435-2447. ábrája kiegészítve)
A TJ C terminális (CT) vége PDZ-kötı doménnal rendelkezik (Oliveira, Morgado-Díaz 2007), mely a fehérje-fehérje interakciókban vesz részt. A PDZ doménen keresztül a TJ a citoplazmatikus fehérjékhez tud kötıdni. A claudin és occludin fehérje C terminálisa pl. a MAGUK (membrane-associated guanylate kinase-like homologue) perifériás proteinek (ZO-1, -2, -3) PDZ doménjéhez, majd annak ZO-1 részével az actin filamentumokhoz (Itoh és mtsai 1999, Tsukita és Furuse 1999) és a ZO-2-vel a miozinhoz kötıdik (Mitic és mtsai 2000). A CT vég a kinázokhoz való kötıdésben és a foszforilációs hely kialakításában is szerepet játszik (Itoh és mtsai 1999). A TJ-t felépítı fehérjék intra- és intercellularis kapcsolatait személteti a 9. ábra.
22
9. ábra: A tight junction és adherens junctio fehérjéinek és intracellularis kapcsolatainak sémás ábrázolása A claudinok a ZO-1 fehérjén keresztül az aktinhoz kötıdnek. Az adherens junctiokat alkotó cadherin a cateninekhez, illetve az aktinhoz és a myosinhoz kapcsolódik. (Förster C. (2008) Tight junctions and the modulation of barrier function in disease. Histochem Cell Biol, 130: 55-70.)
Az intercellularis kapcsolatokban a claudinok egymással homo- vagy heterodimereket, esetleg triméreket alkotva kapcsolódnak össze (CLDN-1/CLDN-1, CLDN-1/CLDN-4, CLDN-2/CLDN-2, CLDN-1/CLDN-4, CLDN-4/CLDN-4). A claudinok, mint TJ proteinek elsıdleges funkciói a „gate” vagy kapufunkció (az intercellularis rések lezárása, a paracelluláris szelektív diffúzió irányítása) és a „fence” vagy kerítésfunkció (az apicalis és basolateralis membrán közötti fehérjék és lipidek eltérı összetételének fenntartása). Szelektív ioncsatornaként (CLDN-2, -4 és 16) pl. a CLDN-16 (paracellin-1) a Henle-kacs felszálló szárának sejtjeiben a paracelluláris magnézium csatorna mőködését biztosítja. Ennek mőködési zavara herediter hypomagnesinaemiát okoz (Simon és mtsai 1999). A CLDN-5 az endothel sejtekben levı TJ-k alkotója. A speciális lokalizációnak terápiás konzekvenciája lehet (antiangiogenetikus terápia) (Hewitt és mtsai 2006).
23
A különbözı kórokozók, mint baktériumok, vírusok, allergének is célpontként használhatják a TJ-t. Számos kórokozó, így a Rota vírus, vagy a Helicobacter pylori toxinja növelheti az intestinalis sejtek közti paracellularis tér permeabilitását. (Sawada és mtsai 2003). A CLDN-3 és CLDN-4 a gyakran a hasmenéssel járó Clostridium perfringens enterotoxinjának (CPE) a receptora. A CPE C terminálisa kötıdhet az intestinális hámsejteken lévı CLDN-3-hoz és CLDN-4-hez, míg az N terminális pórusokat formál a plazmamembránban (Katahira és mtsai 1997, McClane és McDonel 1979, Morita és mtsai 1999). A CLDN-4-hez kötıdött CPE más receptor-ligand komplex kialakulását indukálja, mely végül a sejt gyors líziséhez vezet. Azon hámsejtek, melyek nem expresszálják a CLDN-3 és -4 fehérjéket, nem károsodnak a CPE hatására. Mindez felveti annak lehetıségét, hogy egyes claudinok terápiás célpontként is szolgálhatnak. A claudinok szerv- és szövetspecifikus molekulák. A TJ-k szorossága határozza meg, hogy milyen típusú hám alakul ki, és ez összefügg azzal, hogy a claudinok milyen kombinációban és arányban vannak jelen az adott kapcsolatban (Gonzalez–Mariscal és mtsai 2003). A sejtadhéziós molekulák és egyéb intercelluláris kapcsolódási komplexek, valamint az azokat alkotó komponensek expressziós változása fontos szerepet játszik a sejtek integritásának megırzésében, a polaritás kialakításában, valamint a sejtek közötti interakció csökkenésével a daganatok keletkezésében és a progresszióban is (Sawada és mtsai 2003, van Grevenstein és mtsai 2006). Soini és munkatársainak vizsgálatai alapján a CLDN-1, -2, -3, -4, -5 és -7 fehérjék használható markerek lehetnek az epithelialis daganatoknak a lymphomáktól, lágyrészdaganatoktól és a naevussejtes tumoroktól való elkülönítésében (Soini és mtsai 2006).
Emellett a
claudinoknak szerepük van a sejtek növekedésének és differenciációjának szabályozásában is. Számos claudin fokozott vagy csökkent expresszióját figyelték meg a carcinogenesis folyamatában (Tsukita és mtsai 2008). A daganatos invázióban feltehetıen a TJ megváltozott struktúrája is szerepet játszik (Sawada és mtsai 2003, González-Mariscal és mtsai 2007). A következıkben az általunk vizsgált claudinok ismertetésére kerül sor.
24
CLDN-1: A CLDN-1 génje a 3. kromoszómán (3q28-q29) található (http://www.genenames.org/data). Az általa kódolt integráns membránfehérje elemi fontosságú a TJ szerkezetében (Shen és mtsai 2008). Az egyes sejtek találkozási pontjain homofil interakcióval kapcsolódnak egymáshoz, azaz homodiméreket alkotnak. A CLDN-1 immunhisztokémiai módszerrel, fagyasztva-töréses és immunfluoreszcens technikákkal specifikusan a plazmamembránon, lineáris elrendezıdében jelenik meg (Furuse és mtsai 1998). Általában a magas rezisztenciájú hámokban jelenik meg; nélkülözhetetlen alkotója a bır barrierjének. Az áteresztı ún. „leaky” hámokból hiányzik (Gonzalez és mtsai 2003). Expresszióját számos humán daganatban leírták. Oralis laphámrákban a CLDN-1 fokozott expressziója megnövekedett invázióval és aggresszív hisztológiai képpel függött össze (Dos Reis és mtsai 2008). Oesophagus eredető laphám daganatokban a CLDN-1 magasabb expresszióját találták a nem daganatos laphámhoz képest. A normál hámhoz képest a CLDN-1 (és CLDN-7) expresszió emelkedik a cervix diszplasztikus elváltozásaiban (CIN) és csökken az invazív rákban a diszplasztikus elváltozásokhoz képest (Sobel és mtsai 2006). A colon praemalignus gyulladásos megbetegedéseiben a CLDN-1 (és CLDN-2) expressziójának növekedése észlelhetı. A szerzık szerint ez annak a jele, hogy a hám már az IBDasszociált (gyulladásos bélbetegség) neoplasia korai szakaszában van (Weber és mtsai 2008). Primer colorectalis carcinoma sejteket vizsgálva a CLDN-1 expressziója ugyancsak fokozott volt (Smith és mtsai 2008). A papillaris pajzsmirigy carcinoma és annak nyirokcsomó metasztázisa magas CLDN-1 expressziót mutat (Németh és mtsai 2009). A CLDN-1 (CLDN-6 és CLDN-9) molekulának a Hepatitis C vírus sejtbe való belépésében is jelentıs szerepet tulajdonítanak. Ez az említett claudin molekulák antivirális terápiában való jelentıségét veti fel (Evans és mtsai 2007, Zheng és mtsai 2007). CLDN-2:
Génje
az
X
kromoszómán
(Xq22.3-23)
helyezkedik
el
(http://www.genenames.org/data). A CLDN-2 szintén alapköve a TJ-nak, de szemben a CLDN-1-el, a plazmamembrán mentén nem folytonos kötegeket képez, hanem kisebb behúzódásokat mutat. Ez néha a citoplazma belsı területein is megmutatkozik. A CLDN-1-hez hasonlóan homofil kapcsolatokat alkot (Furuse és mtsai 1998). A CLDN-2 fıként a specifikusan átjárható hámokban jelenik meg, pl. a vese proximális tubulusaiban és a plexus choroideusban (Gonzalez és mtsai 2007). Kationszelektív
25
csatornák felépítésében vesz részt (Amasheh és mtsai 2002). Expresszióját a valódi hámtumorokon túl néhány más entitásban is leírták, így melanomában, Spitz naevusban, fibrosus histiocytomákban és nem differenciált sarcomákban (Soini 2005). Oesophagus adenocarcinomában a CLDN-2 fehérjeszintje magasabb volt, mint annak a praecancerosus, Barrett oesophagus elváltozásában. Barrett oesophagusban és az abból kialakuló adenocarcinomákban emelkedett CLDN-2 expressziót találtak a normál foveoláris epithel CLDN-2 expressziójához képest (Gyırffy és mtsai 2005). Patkány májban pedig porto-centralis irányban emelkedı CLDN-2 expressziót találtak (Rahner és mtsai 2001). CLDN-3:
Génje
a
7.
kromoszómán
(7q11)
található
(http://www.genenames.org/data). Immunreakciója membranózus, lineáris. A CLDN-3nak CPE-kötı kapacitása van. CPE hatására a sejtek lízise következik be (Gonzalez és mtsa 2003 és 2007, Kominsky és mtsai 2003, Sukumar és Kominsky 2003). Emberi és állati emlıtumor sejtvonalakon CPE hatására a daganatsejtek pusztulását észlelték. A nem hámeredető daganatok általában nem adják a CLDN-3 reakciót (Soini 2005). Intestinalis típusú gyomordaganatokban a magas CLDN-3 expresszió jobb prognózissal társult, míg a diffúz típusú gyomordaganatokban expressziója alacsonyabb volt (Sanada és mtsai 2006). (Emellett a CLDN-18 emelkedett expressziója is megfigelhetı az intestinalis típusú gyomorrákokban.) Pancreasban a CLDN-3 az endokrin differenciáció markere (Borka és mtsai 2007). Takaki és mtsai szerint (2001) a CLDN-3 a ZO-1 proteinnel együtt jelentıs szerepet játszik a máj regenerációjában. CLDN-4: Genetikailag a 7. kromoszómán (7q11.23) kódolt TJ-fehérje ((http://www.genenames.org/data). Szintén CPE-receptor potenciállal rendelkezik, ezért szerepe ugyancsak fontos lehet a daganatellenes terápiában (Kominsky és mtsai 2003, Sukumar és Kominsky 2003). Membránhoz kötött immunreakciót ad. Jelenléte esetén a nátriumtranszport csökkenése folytán, a sejtek között zajló iontransport konduktanciája csökken. Elsısorban a kevéssé áteresztı hámokban mutatható ki (Gonzalez és mtsa 2003). Nyálmirigyekben a barrier kialakításában van szerepe (Michikawa és mtsai 2008). Expressziója számos human daganatban emelkedik vagy csökken. Fokozottan expresszálódhat például az emlırákok egyes típusaiban (Kominsky és mtsai 2003, Tıkés és mtsai 2005), pancreas carcinomában (Borka és mtsai 2007, Michl és mtsai 2001, 2003), prostata carcinomában (Landers és mtsai 2008), ovarium carcinomában
26
(Agarwal és mtsai 2005, Rangel és mtsai 2003) és cholangiocellularis carcinomában (Lódi és mtsai 2006, Németh és mtsai 2009, Nishino és mtsai 2008). CLDN-7:
A
kódoló
(http://www.genenames.org/data).
gén
a
Erıteljesen
17.
kromoszómán
expresszálódik
szinte
található valamennyi
hámeredető tumorban (Soini 2005, Soini és Talvensaari 2006). A hepatocelluláris carcinomákban a reakció általában gyengébb, mint a többi tumorban (Soini 2005). Expressziója csökkent az emlıtumorokban (Tıkés és mtsai 2005); cervixcarcinomában (Sobel és mtsai 2005); fej-nyak tumorokban (Gonzalez és mtsa 2003 és 2007, Bello és mtsai 2008) és az uterus hámdaganataiban (Gonzalez és mtsai 2007). Az oesophagealis laphámrákokban az áttétképzıdés, ill. progresszió egyik jellegzetes markerének tekintik a CLDN-7 expressziójának csökkenését (Usami és mtsai 2006). Máj ovál/progenitor sejtjekben CLDN-7 expresszió mutatkozott a különbözı cytokeratinok (CK-7, CK-8, CK-18, CK-19), AFP és GGT pozitivitás mellett. Az Ep-CAM–CLDN-7 komplex a normál hepatocyták mellett a hepatocellularis carcinoma sejtekben is detektálható; szerepe lehet a metasztázisképzésben, ill. a tumoros progresszióban (Yovchev és mtsai 2007).
A CLDN-5 elsısorban az endothelsejtekben található TJ-k formálásában vesz rész
(Gonzalez
és
mtsai
2003),
génje
a
22q11
lókuszon
található
(http://www.genenames.org/data). A gén deletioja mutatható ki velo-cardio-facialis syndromában (Gonzalez és mtsai 2007, http://www.genenames.org/data). A normál erek endothelje mellett jelenlétét pancreas adenocarcinomában is kimutatták (Gonzalez és mtsai 2007). Kísérletes adatok bizonyítják a CLDN-5 jelenlétét colonepithel sejtvonalon (Amasheh és mtsai 2005), itt azonban a barrier funkció kialakításában játszik szerepet. Érdekes, hogy a vesének csupán az artériás ereiben mutatható ki, míg a capillarisokban és a vénákban nem (Morita és mtsai 1999). A vér-agy gát és a plexus choroideus sejtjeiben (epi- és endothelialis) is megjelenik (Lippoldt és mtsai 2000, Lippoldt és mtsai 2000). Újabb adatok szólnak arról, hogy a CLDN-5 más daganatokban is elıfordulhat. Nyelıcsı laphámtumoraiban expressziója a proliferációval korrelál (Takala és mtsai 2007). A gyomorrákok közül a diffúz típusban alacsonyabb CLDN-5 expressziót találtak az intestinalis típushoz képest (Soini és mtsai 2006). Az ovarium malignus daganataiban az CLDN-5 erıteljesen expresszálódik (Soini és Talvensaari
27
2006). Az emlı ductalis carcinomája nagyobb mennyiségben tartalmaz CLDN-5-öt, mint a lobularis szubtípus. A vascularis daganatok CLDN-5 pozitívak (Soini 2005).
A hepatoblastoma claudin expressziójára vonatkozóan nincs adat az irodalomban.
Az egyes claudinok különbözı daganatokban leírt expresszióját az 5. táblázat foglalja össze.
28
5. táblázat: Claudinok expressziója különbözı eredető daganatokban Gonzalez-Mariscal (Gonzalez-Mariscal és mtsai 2007) eredményeivel kiegészítve Claudin CLDN-1
CLDN-2
CLDN-3
CLDN-4
CLDN-5 CLDN-7
CLDN-10 CLDN-18
Tumor emlı cervix endometrium carcinoma colon elszarusodó laphám nyelıcsı gyomor máj (hepatocellularis carcinoma) pancreas (exocrin) pajzsmirigy carcinoma (papillaris) cervix endometrium carcinoma colon, Nyelıcsı pancreas (exocrin) emlı colon, nyelıcsı, gyomor pancreas (endokrín) ovarium prostata uterus húgyhólyag tüdı (kissejtes) agy epeúti daganatok emlı cervix colon, nyelıcsı, gyomor elszarusodó /el nem elszarusodó laphám ovarium, uterus pancreas (exocrin) prostata húgyhólyag agy pancreas emlı cervix nyelıcsı gyomor, colon pancreas (endocrin) ovarium, uterus húgyhólyag prostata agy máj (hepatocellularis carcinoma) gyomor
29
Expresszió csökkent csökkent emelkedett/csökken emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkeett emelkedett csökkent emelkedett/csökkent emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett csökkent emelkedett csökkent/emelkedett csökkent emelkedett csökkent/emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett csökkent emelkedett csökkent csökkent emelkedett/csökkent emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett emelkedett csökkent emelkedett emelkedett
2.4. DELTA-LIKE PROTEIN (dlk-1) A dlk-1 egy sejtfelszíni transzmembrán protein, mely hat EGF-szerő elemet tartalmazó extracellularis doménnel, egy transzmembrán doménnel és egy rövid intracellularis farokkal rendelkezik (11. ábra) (Laborda és mtsai 2000 és 1993; Jensen és mtsai 1994, Paulsen és mtsai 2001, Smas és mtsai 1997, Takada és mtsai 2000, Wylie és mtsai 2000).
11. ábra: A dlk-1 protein szerkezete SP: szignalpeptid, PRO: proteáz target régió, TM: transzmembrán régió, INT: intramembrán regió. (Baladron V, Ruiz-Hidalgo MJ, Nueda ML, Diaz-Guerra MJ, Garcia-Ramirez JJ, Bonvini E, Gubina E, Laborda J (2005) Dlk acts as a negative regulator of NOTCH1 activation through interactions with specific EGF-like repeats. Exp Cell Res, 303: 343–359.)
A fehérjét, amely az epidemalis-növekedési-faktor szerő (EGF-like), ún. homeotic fehérjecsalád tagja, a DLK-1 gén kódolja. Ide tartoznak a Notch receptorok és azok ligandjai is (Laborda és mtsai 2000 és 1993). A fehérjecsalád tagjai EGF-szerő doménjeik révén szabályozzák a sejtek viselkedését, és részt vesznek a sejtek differenciációs-döntési mechanizmusaiban is (Laborda és mtsai 2000, Artavanis és mtsai 1995, Garcés és mtsai 1999). A dlk-1 protein aminosav szekvenciája és cisztein gazdag régiói az individuális EGF-szerő ismétlıdésekben nagyon hasonlítanak a delta proteinre (innen az elnevezés), mely a Drosophilában elıforduló Notch receptor ligand (Artavanis és mtsai 1999). A Notch ligandok olyan transzmembrán proteinek, amelyek az N-terminális, ún. DSL doménjük révén reagálnak a Notch proteinekkel (Shimizu és mtsai 1999 és 2000, Felli és mtsai 1999, Fehon és mtsai 1990). A poszttranszlációs modifikáció és a ligandokkal való interakció egy olyan proteolítikus kaszkádot indít be, mely során a Notch intracellularis doménje elválik a plazmamembránról, transzlokálódik a magba, ahol egy CSL (CBF-1, suppressor of hairless, LAG-1/RBP-Jk) elnevezéső DNS-kötı
30
proteinnel lép interakcióba. Ennek során egy olyan transzkripciós aktivációs komplex jön létre, amely a differenciációs folyamatokban részt vevı gének aktiválását végzi (Aster és mtsai 1997, Ikeuchi és mtsai 2003, Blaumueler és mtsai 1997, Brou és mtsai 2000, Kimberly és mtsai 2003). A dlk-1 molekula funkciója nem ismert. Egyes közlemények szerint a Notch1 jelátviteli folyamat negatív regulátora (Baladron és mtsai 2004). Néhány közlemény a perifériás és a központi idegrendszerben betöltött szerepét taglalja (Costaglioli és mtsai 2001, Jensen és mtsai 2001). A dlk-1 számos embryonalis szövetben expresszálódik (máj, nyelv, csigolyák, vázizomzat, porc és hasnyálmirigy), az érett szervezetben pedig a mellékvese zona glomerulosajában, az agyalapi mirigy somatotroph sejtjeiben, a központi idegrendszer monoaminerg neuronjaiban, a here és az ovarium Leydig- és hilusi sejtjeiben, valamint az endokrin pancreas β-sejtjeiben van jelen. A dlk-1, mint különbözı szövetekben jelenlevı
fehérje,
számos
elnevezéssel
bír:
preadipocyta
faktor-1
(Pref-1),
neuroendokrin pG2 (human mellékvese specifikus mRNS), SCP-1, zona glomeruosa specifikus protein (ZOG) vagy fetal antigén-1 (FA1) (Smas és mtsa 1993, Tornehave és mtsai 1996, Floridon és mtsai 2000, Hedlund és mtsai 2003, Jensen és mtsai 1999 és 2001). Smas és mtsai (1993) a dlk-1 proteint az adipocyta differenciáció inhibitoraként (Pref-1) azonosították. A dlk-1 protein a human és az egér embrionális máj hepatoblastjaiban erısen kifejezıdik, míg a biliaris epithelium és a hemopoetikus sejtkompartmentben nem mutatható ki (Floridon és mtsai 2000, Tanimizu és mtsai 2004). A felnıtt patkányok májában a kísérletes módszerekkel elıidézett és a hepatoblastokhoz sok hasonlóságot mutató bipotenciális ovalis/progenitor sejtekben (a biliaris epitheliumban nem) az AFP és DLK-1 gének transzkripciója/transzlációja szintén jól ismert (Santoni és mtsai 2005). A dlk-1 protein expresszióját számos humán daganatban leírták (Laborda és mtsai 1993, Hsiao és mtsai 2005, Tornehave és mtsai 1996, Fukuzawa és mtsai 2005, Turányi és mtsai 2009, Jin és mtsai 2008). Neuroblastomában a daganatsejtek dlk-1 negatívak,
ganglioneuroblastomában
és
ganglioneuromában
csak
az
érett
ganglionsejtek és a neurogén stroma mutat dlk-1 pozitivitást, azaz a dlk expresszió a chromaffin daganat differenciációjának, érésének kiváló markere (Hsiao és mtsai 2005). Wilms tumorban a tubularis struktúrák és a blastema sejtjei egyaránt dlk-1
31
negatívak, pozitív reakciót kizárólag a myogén differenciációt mutató elemek mutatnak (Fukuzawa és mtsai 2005). Leírták a dlk-1 expresszióját bır neurofibromában (Van Limpt és mtsai 2003), mielodiszpláziás szindrómában (Länger és mtsai 2004), overexpressziójának gátló hatását a hemopoetikus sejtdifferenciációban (Li és mtsai 2005), valamint glioblastoma multiforme sejtvonalakban is, ahol expressziója fokozta a transzformált fenotípus kialakulását (Yin és mtsai 2006). Közölték mellékvesekéreg carcinoma, phaeocromocytoma és adenoma dlk-1 pozitivitását, valamint vizsgálták expresszióját világossejtes veserákban és angiomyolipomában is, melyek mind negatívak voltak (Turányi és mtsai 2009). Biliaris atresiában a dlk-1 protein overexpressziója és a fibrogenezis között írtak le szoros összefüggést, miszerint a dlk-1 szerepet játszik a máj stellata sejtjeinek myofibroblastokká való transzformálásában (Huang és mtsai 2004).
32
3. CÉLKITŐZÉSEK, KÉRDÉSFELTEVÉS
A legújabb adatok szerint a hepatoblastoma prognózisa, mint egyéb gyermekkori malignus
daganatok
differenciálódással
esetében alapvetıen
is
(Wilms
tumor,
összefügg.
A
neuroblastoma), hepatoblastoma
a
szöveti
különbözı
differenciáltságú szövettani típusaiban és/vagy szubtípusaiban a daganat pontosabb eredetét feltáró markerek vizsgálata intenzív kutatás tárgya. Egyes embryonalis markerek hepatoblastokban való expressziója egyre inkább a daganat embryonalis és/vagy fetalis progenitor sejt eredetét támasztja alá. A claudin molekulák expressziós profiljának vizsgálata számos szervben és daganatban ígéretes eredményeket mutat. Ez egyrészt a molekula funkciójának pontos felderítéséhez, másrészt a különbözı differenciáltságú és prognózisú daganatok vagy daganattípusok (szubtípusok) elkülönítéséhez nyújt segítséget. Mindezek alapján célunk volt, hogy megvizsgáljuk a claudin molekulák és a hepatoblastokban
fiziológiásan
elıforduló
dlk-1
fehérje
jelenlétét
humán
hepatoblastomák eltérı differenciáltságú epithelialis komponenseiben.
A következı kérdések megválaszolását tőztük ki célul:
1. Expresszálódnak-e a vizsgált claudin fehérjék human hepatoblastomában? Vizsgálni kívántuk a CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 fehérjék expresszióját human hepatoblastomákban immunhisztokémiai módszerrel.
2. A vizsgált claudinok vonatkozásában látható-e expressziós különbség a daganat eltérı differenciáltságú epithelialis komponensei (embryonalis és fetalis) között? Célunk volt a fetalis és az embryonalis hámkomponens CLDN1, -2, -3, -4 és -7 expressziós mintázatátának összehasonlítása az immunhisztokémiai reakciók és az RT-PCR módszer során kapott eredmények alapján.
33
3. Van-e összefüggés a szöveti differenciáció, a proliferatios markerek (PCNA, Ki-67) és a vizsgált claudinok expressziója között? Vizsgálni kívántuk a hepatoblastomák
különbözı
differenciáltságú,
azaz
eltérı
proliferációs
készséggel rendelkezı két hámkomponensében (fetalis és embryonalis) egyes claudinok és bizonyos proliferációs markerek (Ki-67, PCNA) expresszióját immunhisztokémiai
módszerrel,
és
célunk
volt
azokat
egymással
összehasonlítani.
4. Kimutatható-e a vizsgált hepatoblastomákban a Wnt/β-catenin jelátvitel károsodása? Célunk volt a hepatoblastomák β-catenin expressziójának fehérje szintő vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel, ezen belül a daganat embryonalis és fetalis komponensének β-catenin expressziós mintázatát kívántuk egymással összehasonlítani. Terveztük a két komponens Wnt/β-catenin jelátvitel károsodását jelzı mag-pozitív eseteibıl a β-catenin gén mutációs analízisének elvégzését, mellyel a génben bekövetkezett lehetséges mutáció(k) igazolása és a mutáció(k) jellegének pontos identifikálása volt célunk.
5. Kifejezıdik-e
a
hepatocellularis vonatkozású
dlk-1
fehérje
carcinomában
daganatokban
human és
hepatoblastomában,
egyéb,
human
differenciáldiagnosztikai
(ganglio/neuroblastoma,
Wilms
tumor,
infantilis hemangioenothelioma, medulloblastoma, rhabdoid tumor, AFP pozitív csírasejtes tumorok, máj MPNST)? Vizsgálni és egymással összehasonlítani kívántuk a human hepatoblastoma, human hepatocellularis carcinoma és a fentebb felsorolt egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatok dlk-1 fehérjeexpressziós mintázatát immunhisztokémiai módszerrel és annak szerepét elemeztük a differenciáldiagnosztikában.
34
4. ANYAG ÉS MÓDSZER 4.1. Betegek és szövetminták A Semmelweis Egyetem II. sz. Pathológiai Intézetének és az I. Sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetének archívumából kiválasztott, formalin fixált, paraffinba ágyazott blokkjaiból készült metszeteken végeztünk retrospektív vizsgálatokat a Semmelweis
Egyetem
Regionális
Etikai
Bizottságának
engedélyével
(TUKEB#172/2003). Vizsgálatainkban összességében 31 db humán hepatoblastoma, 24 db human hepatocellularis carcinoma és 30 db egyéb differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganat (Wilms tumor, ganglio/neuroblastoma, medulloblastoma, rhabdoid tumor, infantilis hemangioendothelioma, mesenchymalis hamartoma, máj MPNST és AFP pozitív csírasejtes tumorok) szerepelt. A claudinokkal végzett vizsgálatainkhoz 14 db hepatoblastoma esetet használtunk fel, melyek szövettanilag az epithelialis típus közül tisztán fetalis, valamint fetalis/embryonalis, ill. kevert típusok voltak. Egyéb szövettani típusokat, mint macrotrabecularis,
kissejtes
differenciálatlan
és
egyéb
típusú
hepatoblastoma
tanulmányunkban nem vizsgáltunk. Itt a kevesebb esetszám oka egyrészt a vizsgálatok idıpontjában rendelkezésünkre álló eleve kevesebb esetszám, valamint az, hogy a claudinokkal végzett vizsgálatokban az anyagok kizárólag a II. sz. Pathológiai Intézetbıl származtak; másrészt a mőtétet megelızı kemoterápia okozta kiterjedt tumorelhalás, vagy a reziduális tumor nem megfelelı mérete volt. A komponensek közötti festıdésbeli eltérések értékeléséhez megfelelı nagyságú területekre volt szükség. A molekuláris pathológiai vizsgálatokban ahhoz, hogy a fetalis és az embryonalis
komponens
a
blokkok
területén
jól
elkülöníthetı,
illetve
makrodisszekálható legyen, ugyancsak megfelelı nagyságú területekre volt szükség. Ez tovább csökkentette az esetszámot (5 db eset). A 14 db hepatoblastoma esetnél a továbbiakban HSA, CK-7, Ki-67, PCNA és β-catenin reakciókat is elvégeztünk (részletezve lásd késıbb).
35
A dlk-1 fehérje kimutatását mind a 31 db hepatoblastoma esetében, a hepatocellularis carcinomákban és a fentebb részletezett egyéb daganatokban végeztük el. A betegek adatait (kor, nem, tumortípus, szövettani jellemzık) a 6., 7., és a 8. táblázat foglalja össze. A dlk-1 kimutatása vezérelte vizsgálatainkban, azaz minden esetben (31 db) elvégeztük az AFP és a CK-19 immunhisztokémiai reakciókat is. A diagnózis megállapítása haematoxilin-eosin (H&E) festett metszeteken történt. A vizsgálatokhoz a leletek alapján kiemelt metszeteket ismételten áttekintettük és a megfelelı területet tartalmazó blokkot kiválasztottuk.
36
6. táblázat: A vizsgált hepatoblastoma esetek jellemzıi a nem, kor és a szövettani típusok szerint. (a félkövéren kiemelt esetek (14 db) a claudinokkal történt vizsgálatokban szerepeltek) F: fiú, L: lány, W: tisztán epithelialis, M: kevert, f: fetalis, e: embryonalis (átlagéletkor: 3,16)
ESTSZÁM 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31.
KOR (ÉV) 3 5 5 1 0,5 1 1 2 0,5 1 7 1 4 1 1 10 3 3 3 2 5 1 2 14 1 4,5 1 4 5 5 0,5
NEM
SZÖVETTAN
F L F L F F F L L L F L F L F F F F F F L L F F L L L F L L F
W M W W M M M W M W W W W M M Wf W W W W W W W Wf M W W M Wf Wf W
37
DOMINÁNS KOMPONENS f f e e f f e f e f f f e e e f e e f f e f f f f e e f f f f
7. táblázat: A vizsgált human hepatocellularis carcinoma esetek jellemzıi a kor, nem és a szövettani típus szerint. F: férfi, N: nı, PG: pseudoglandularis, TR: trabecularis, SO: solid (átlagéletkor: 61,3)
ESTSZÁM 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.
KOR (ÉV) 56 73 64 57 77 57 70 53 54 50 62 54 78 53 59 49 51 49 68 64 68 68 60 79
SZÖVETTANI TÍPUS PG SO TR PG SO SO PG TR PG PG TR PG PG PG TR SO TR TR SO PG SO SO TR PG
NEM F F F F F F F N F F F F F N F F F F F F F N F N
GRADE II III III II II III III III III II II III II II II III III II II II III III II II
8. táblázat: Egyéb daganatos esetek jellemzıi a nem és a kor szerint. a: 2 yolk sac, 1 teratocarcinoma, 1 seminoma és 2 éretlen teratoma, b: hónap, F: férfi, N: nı, AFP: alfa fetoprotein, MPNST: malignant peripheral nerve sheath tumor
TUMOR TÍPUS Germ cell tumor a Wilms tumor Ganglio/Neuroblastoma Medulloblastoma Rhabdoid tumor Inf. hemangioendothelioma Mesenchymális hamartoma Máj MPNST
ÉLETKOR TARTOMÁNY (ÉV) 20-51 1-11 0,5-17 1-19 1 1-3 b 0,5 23
ÁTLAGÉLETKOR
NEM F/N
ESETSZÁM
EGYÉB
22,8 5,7 3,2 7,6 2 -
6/0 4/1 3/6 3/2 1/0 2/0 0/1 0/1
6 5 9 5 1 2 1 1
AFP +
38
4.2. Szövettani és hisztokémiai módszerek 4.2.1. Szövettani és hisztokémiai vizsgálatok A minták fixálása a SE II. sz. Patológiai Intézet és a SE I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet biopsziás laboratóriumi protokollja szerint, 10%-os pufferolt formalinban történt 24 órán át, melyet paraffinos beágyazás követett. A diagnózis megállapítása haematoxilin-eosin (H&E) festett metszeteken történt. Kiegészítı festésként picrosirius festést alkalmaztunk a kötıszövetes átalakulás detektálására, valamint perjódsav-Schiff (PAS), diasztáz emésztett PAS reakciókat és Berlini kék festéseket alkalmaztunk. A vizsgálatokhoz a kiemelt metszeteket ismételten áttekintettük a kérdéses elváltozást tartalmazó blokk kiválasztására.
4.2.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok 4.2.2.1. CLDN-1,-2, -3, -4 és -7 ellenes antitestek alkalmazása Paraffinba ágyazott, 3-4 µm vastag metszeteken végeztünk immunhisztokémiai vizsgálatokat. A metszeteket deparaffináltuk. Az endogén peroxidáz aktivitás blokkolása után antigénfeltárás, majd az elsıdleges antitestek alkalmazása következett. A claudin ellenes primer antitestek mindegyike a Zymed (Zymed Inc., San Francisco, CA, USA) cégtıl származott.
9. táblázat: Elsıdleges CLDN-1, -2, -3, -4, és -7 ellenes antitestek és azok jellemzıi
ANTITEST claudin-1 claudin-2 claudin-3 claudin-4 claudin-7
KLONALITÁS poliklonális (nyúl) monoklonális (egér) poliklonális (nyúl) monoclonális (egér) poliklonális (nyúl)
GYÁRTÓ CÉG Zymed, SanFrancisco, CA, USA Zymed, SanFrancisco, CA, USA Zymed, SanFrancisco, CA, USA Zymed, SanFrancisco, CA, USA Zymed, SanFrancisco, CA, USA
39
HIGÍTÁS 1:80 1:20 1:80 1:100 1:100
Az immunhisztokémiai reakciókat minden esetben frissen metszett anyagokon végeztük és a Ventana ES automata immunfestıvel processzáltuk (Ventana Medical System Inc., Tucson, AZ, USA). A másodlagos antitestek biotinilált anti-egér ill. anti-nyúl savók voltak (Ventana, Zymed), melyeket 1:100-as hígításban, 1 órán át, szobahımérsékleten inkubáltunk, majd avidin-biotin-peroxidázt (ABC, DAKO) alkalmaztunk a jel erısítésére. Kromogénként 3,3’diaminobenzidin (DAB) szolgált (Ventana). Az automata alkalmazása során a jel elıhívása a Ventana iVIEW kit DAB detection Kittel történt, mely a következıket tartalmazta a cég által megadott adatok alapján: inhibitor (3% H2O2), PAB 10%-os BSA-ban higítva, biotinizált Ig, SA-HRP (fehérje stabilizáló), DAB (0,2%), H2O2 (0,04%), hematoxylin és „bluing reagens” (Ref.: 760-091). Az automatán végzett immunhisztokémiai reakció menetét a 9. táblázatban foglaltuk össze.
9. táblázat: CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 ellenes antitesttel végzett immunhisztokémiai vizsgálat részletei
FOLYAMAT
1. Paraffinos metszet, 3-4 µm 2. Deparaffinálás
3. Mosás
4. Antigénfeltárás
5. Mosás 6. Automatába helyezés
7. Endogén peroxidáz blokkolás
8. Mosás
ANYAG, CÉG
Xylol (Reanal), 96%, 70%, 50%, DI felületkezelı keverék (etanol, metanol, propanol) (Reanal, Budapest, Hungary) Desztillált víz, APK mosópuffer (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) DAKO target retrieval solution (citrátpuffer pH6) (DAKO Glostrup, Denmark) S1699 Desztillált víz, APK mosópuffer Ventana ES immunfestı automata (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) Inhibitor oldat (H2O2 tartalmú) CAT.: 253-2187 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) APK mosópuffer
40
IDİTARTAM, MIKROHULLÁMENERGIA, HIGÍTÁS
2x10’ szobahımérséklet, 96, 70, 50%, 3x5’szobahımérséklet
2x1’ 2x1’ 3’ 850W, majd 30’ 170W. Gyári oldat 10x-es higítása 2x1’ 2x1’
3’ 41oC 1’ 41oC
CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 ellenes antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálat részletei (9. táblázat folytatása)
FOLYAMAT 9. Primer antitest
10. Mosás 11. Secunder antitest
12. Mosás 13. Streptavidinkonjugálás
14. Mosás 15. Magfestés
16. Automatából kivétel 17. Mosás 18. Dehidrálás
19. Fedés
ANYAG, CÉG CLDN-1: poliklonális (nyúl) CAT.: 187362 (Zymed, San Francisco, CA, USA) CLDN-2: monoklonális (egér) CAT.: 187363 (Zymed, San Francisco, CA, USA) CLDN-3: poliklonális (nyúl) CAT.: 341700 (Zymed, San Francisco, CA, USA) CLDN-4: monoklonális (egér) CAT.: 187341 (Zymed, San Francisco, CA, USA) CLDN-7: poliklonális (nyúl) CAT: 349100 (Zymed, San Francisco, CA, USA) APK mosópuffer Biotinilált secunder antitest (kecske anti-egér, kecske antinyúl) CAT.: 253-2188 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) APK mosópuffer Streptavidin-torma-peroxidáz konjugátum iVIEW-DAB KIT Ref.: 760-091 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) APK mosópuffer Hematoxilin CAT.: 760221 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ,USA) Blueing reagens AT.: 760237 (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) Desztillált víz 96% DI felületkezelı keverék (etanol, metanol, propanol) (Reanal) Xylol (Reanal) Sakura GLCTM mounting medium (Sakura Finetek Europe B.V. The Netherlands)
41
IDİTARTAM, MIKROHULLÁMENERGIA, HIGÍTÁS 1:80 30’ 41oC 1:20 30’ 41oC 1:80 30’ 41oC 1:100 30’ 41oC 1:100 30’ 41oC 1’ 41oC 5’ 41oC 1’ 41oC 5’ 41oC 1’ 41oC 2’ 41oC 2’ 41oC
96% 3x10’ 2x5’
A negatív kontroll készítésénél az elsıdleges antitest helyett nem-immun nyúl és egér szérumot használtunk az elsıdleges antitestnek megfelelı hígításban, illetve az elsıdleges antitesttel való inkubálást elhagytuk. Pozitív kontrollként az antitestet gyártó cég (Zymed Inc, San Francisco, CA, USA) által ajánlott szövetmintákat használtuk: a CLDN-1 kimutatásához bırbıl származó epitheliumot, CLDN-2, -3, -4 kimutatásához normál colon nyálkahártyát, a CLDN-7 detektálására emlı ductushámsejteket.
4.2.2.2. Dlk-1, AFP, β-catenin, HSA, CK-7, CK-19, Ki-67 és PCNA ellenes antitestek alkalmazása Az antitestek közül a dlk-1, AFP, CK-19 és β-catenin reakciókat kizárólag manuálisan, a HSA, CK-7, Ki-67 és PCNA reakciókat pedig a Ventana ES immunfestı automatával (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA) végeztük a 9. táblázatban ismertetett módszerrel. A jel elıhívása a Ventana iVIEW kit DAB detection Kittel történt. A Ki-67, PCNA, CK-7, és AFP ellenes antitestek a DAKOCytomation, Glostrup, Dánia, a βcatenin ellenes antitest a BD Transduction, San Diego, CA, USA, a HSA ellenes antitest a Novocastra, New Castle, UK, a dlk-1 ellenes antitest a R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, a CK-19 ellenesantitest pedig a Biogenex, San Remon, CA, USA cégektıl kerültek beszerzésre. Az antitestek jellemzıit a 10. táblázat foglalja össze.
42
10. táblázat: Dlk-1, AFP, β-catenin, HSA, CK-7, CK-19, Ki-67 és PCNA ellenes antitestek jellemzıi
ANTITEST Ki-67 PCNA β-catenin HSA CK-7 AFP dlk-1 CK-19
KLONALITÁS Monoclonalis (egér) Polyclonalis (nyúl) Monoclonalis (egér) monoclonalis (egér) monoclonalis (egér) Poliklonalis (nyúl) Poliklonalis (kecske) monoclonalis (egér)
GYÁRTÓ CÉG
HÍGÍTÁS
ANTIGÉNFELTÁRÁS
DAKO - M7240
1:120
Tris-EDTA
DAKO - M0879
1:5000
Tris EDTA
BD Transduction - 610154
1:200
Vector
Novocastra – 760-4350
1:50
Vector
DAKO - M7018
1:800
Protease-1
DAKO – A0008
1:100
R&D Systems – AF1144
1:100
Biogenex - MU246-UC
1:50
10 perc kuktában pH:7,0 citrát pufferben 10 perc kuktában pH:7,0 citrát pufferben 10 perc kuktában pH:7,0 citrát pufferben
Vector: Vector Unmascing Solution (H 3300) - Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA; 1: 3’ 850 W, 12’ 180W mikrohullámú sütıben Protease-1: Ventana (760-2018), Tucson, AZ, USA, 4 perc Ventana ES automatában Tris-EDTA: Reanal, Budapest, Hungary: Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 99,8% Lot.: A0249360, Etiléndiamin-tetraecetsav, EU szám: 200-449-4: 0,01M Tris 145 ml, 0,001 M EDTA 105 ml; 3’ 850W, 30’ 180W mikrohullámú sütıben
A manuálisan végzett reakciók közül az AFP, a CK-19 és a dlk-1 esetében a Vectastain ABC Elite Kit (Vector Laboratories, Burlingname, CA, USA); a β-catenin esetében a Dako Cytomation EnVision+ System Labelled Polymer-HRP Anti-Mause (Dako North
America,
Inc.
USA)
detektálórendszert
alkalmaztuk.
Kromogénként
3,3’-
diaminobenzidin (DAB) szolgált (CELL MARQUE, USA). Ezek menetét a 11. táblázat foglalja össze.
43
11. táblázat: A manuálisan végzett immunhisztokémiai reakciók részletei az egyes antitesteknek megfelelıen
DEPARAFFINÁLÁS
ANTIGÉN FELTÁRÁS
dlk-1, AFP, CK-19 3 x 10 min. xylol 5 min abs. ethanol 5 min 96%-os ethanol 5 min 70%-os ethanol 5 min DH2O 5 min 1 X PBS
β-catenin 3 x 10 min. xylol 5 min abs. ethanol 5 min 96%-os ethanol 5 min 70%-os ethanol 5 min DH2O 5 min 1 X PBS
Vector antigénfeltáró oldattal (H 10 min kuktában pH: 7,0 citrát 3300) 1:200, MW: 850 W 2’ majd pufferben 240 W 20’
mosás 3x5’ PBS 3%-os hidrogénperoxiddal ENDOGÉN PEROXIDÁZ (95 ml methanol / 5 ml 30%-os BLOKKOLÁS H2O2 45 min inkubálás mosás 3x5’ PBS MOSÁS normál lószérum (Jackson Immunoresearch) FEHÉRJE BLOKKOLÁS CAT.: 008 000 121) 1:50 szobahın 30’ (Vectastain ABC Elite Kit – CAT.: PK4000) mosás 3x5’ PBS MOSÁS dlk-1: 1:100, AFP: 1:100 CK-19: 1:50 PRIMER ANTITEST 1h szobahın mosás 3x5’ PBS MOSÁS anti kecske-biotinált antitest CAT.: BA9500 SZEKUNDER ANTITEST szobahın 30’ (Vectastain ABC Elite Kit – CAT.: PK 4000) mosás 3x5’ PBS MOSÁS DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) CAT.: SK-4100 ELİHÍVÁS elıhivás 3-5 min mikroszkópos ellenırzés mellett 1 min hematoxilin 5 min 70%-os ethanol 5 min 96%-os ethanol MAGFESTÉS 5 min abs. ethanol fedés MOSÁS
mosás 3x5’ PBS 3%-os hidrogénperoxiddal (95 ml methanol / 5 ml 30%-os H2O2 45 min inkubálás mosás 3x5’ PBS DAKO Protein blokkoló (CAT.: X0909) Szobahın 60’ (North America, Inc. USA) mosás 3x5’ PBS 1: 200 O/N inkubálás 4 CO mosás 3x5’ PBS anti-egér (DAKO EnVision+) CAT.: K4001 szobahın 30’ mosás 3x5’ PBS DAB Substrate (CMD401, CellMarque, USA) elıhivás 3-5 min mikroszkópos ellenırzés mellett 1 min hematoxilin 5 min 70%-os ethanol 5 min 96%-os ethanol 5 min abs. ethanol fedés
A negatív kontroll készítésénél az elsıdleges antitest helyett nem-immun nyúl és kecske szérumot használtunk az elsıdleges antitestnek megfelelı hígításban, illetve az elsıdleges antitesttel való inkubálást elhagytuk.
44
A HSA és a CK-7 kimutatásához pozitív kontrollként humán máj-és epeúti sejteket, a CK-19-hez tranzícionális hámot, a β-cateninhez, a Ki-67-hez és a PCNA-hoz nyirokcsomót használtunk.
Az
AFP
és
a
dlk-1
kimutatásához
pozitív
kontrollként
acetaminofluorén/partialis hepatectomia kísérlettel elıídézett patkány máj ovális sejteket használtunk (Jensen és mtsai 2004, Paku és mtsai 2004, Am J Pathol 164, 1347-1359, 2004).
4.2.2.3. Az immunreakciók értékelése
A vizsgálatokban az immunreakciók értékelését szemikvantitatív módon három, egymástól független patológus végezte (H.J., Sch.Zs. és N.P). A claudinokkal, valamint a Ki-67, PCNA, HSA, AFP és CK-7 ellenes antitesttekkel végzett vizsgálatokban a szemikvantitatív analízis a következık szerint zajlott: 10 random kiválasztott nagy nagyítású látótérben (400X) 100-100 sejtet vizsgáltunk. A reakciót körkörös komplett vagy inkomplett lineáris membrán-pozitivitásnál értékeltük pozitívként, kivéve a CLDN-2 reakciót, amelynél minden esetben granuláris citoplazmatikus festıdést kaptunk. Az immunreakciók eredményét a pozitívan festıdı sejtek százalékában fejeztük ki.
A szemikvantitatív értékelésnél a következı pontrendszert alkalmaztuk: 5 pont = 81-100%, 4 pont = 61-80% 3 pont = 41-60% 2 pont = 21-40% 1 pont = 6-20% 0 pont = ≤ 5%
A 0 értéket immuhisztokémiai szempontból negatívnak tekintettük. A dlk-1 vizsgálatokban az immunhisztokémiai reakciók erısségét szemikvantitatív pontrendszerben (- és +++ között) értékeltük, és meghatároztuk a pozitívan reagáló sejtek százalékos arányát, valamint a festıdés mintázatát (cytoplasmaticus / membranosus / canalicularis / pontszerő).
45
4.3. Molekuláris biológiai vizsgálatok 4.3.1. Real time (valós idejő) RT-PCR (qPCR) vizsgálatok 4.3.1.1. RNS izolálás A H&E-festett metszetek elemzése után összességében 5 db formalin fixált, paraffinba ágyazott hepatoblastoma esetet (4., 5., 11., 14. és 17. számú - lásd 6. táblázat) tartottunk alkalmasnak a molekuláris biológiai vizsgálatok elvégzésére. Az esetet reprezentáló metszetnél a megfelelı nagyságú fetalis és embryonalis komponenst tartalmazó területet (nekrózis és vérzés kizárásával) mikroszkópos ellenırzés mellett makrodisszekáltuk, majd a blokknak megfelelıen 2-8 db, 5-5 µm vastag natív metszetbıl elvégeztük a teljes RNS izolálását. A vizsgálatot a High Pure RNA Paraffin Kit-tel végeztük (Roche, Indianapolis, Indiana, USA). A proteináz K emésztést követıen (Proteinase K, recombinant PCR grade: Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Németország) (16 óra) az RNS tisztítását a gyártó cég által ajánlott protokoll szerint végeztük. Az RNS integritását gélfuttatással és az optikai spektrum alapján bizonyítottuk. A koncentráció meghatározása után a tisztított RNS-t a felhasználásig -80°C-on tároltuk. 4.3.1.2. Reverz transzkripció 500 ng teljes RNS-bıl reverz transzkripcióval cDNS-t állítottunk elı (25°C - 10 perc, 42°C - 50 perc, 95°C - 5 perc és 4°C - ∞) MuLV reverz transzkriptáz, (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA: 10 perc 25 °C, 50 perc 42 °C és 5 perc 95 °C) és random hexamer (Applied Biosystems) segítségével RNáz inhibitor jelenlétében (Applied Biosystems). A reakcióelegy összetételét a 12. táblázat foglalja össze 12. táblázat: A cDNS szintézise ÖSSZETEVİK RT Puffer dNTP mix Random hexamer 20 U/ µl RN-áz gátló 50U/ µl Reverz Transzkriptáz RNS templát dH2O
TÉRFOGAT 2 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 1 µl 500 ng 4,5 µl
Össztérfogat:
10 µl
46
GYÁRTÓ CÉG Boehringer 145376 Roche D 8220 Applied Biosystems, CA, USA Applied Biosystems, CA, USA Applied Biosystems, CA, USA Eppendorf 0032006159
4.3.1.3. qPCR reakciók a CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 mRNS expressziójának kimutatásához A SYBR Green alapú qPCR-hez mintánként 12,5 µl Sybr Green Master Mixet (BIORAD, Hercules, Calif. 1708882), az általunk megtervezett primerekbıl (Primer Expressz program segítségével - Applied Biosystems) 300 nM koncentrációban 0,5-0,5 µl-t (250 nM végkoncentrációig), az elıállított cDNS mintákból 2 µl-t, valamint 9,5 µl desztillált vizet használtunk fel. A reakciókat az ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) készülékkel végeztük a következı paraméterek szerint:
Kezdeti denaturálás
95°C: 2 perc
Denaturálás
95°C: 20 másodperc
Primer kötıdés
63°C: 30 másodperc
Szintézis
72°C: 1 perc
Ciklusszám: 40 A termék homogenitásának ellenırzésére olvadáspont analízist végeztünk 55°C-95°Con. Ez a termékek homogenitását és a primerek specifikus kötıdését támasztotta alá. A mérések 96-os plate-ekben, triplikátumokban történtek a kontroll génekkel párhuzamosan futtatott reakcióban. A vizsgálatokhoz referencia génként a β-actin háztartási (housekeeping) gént alkalmaztuk. A PCR termékek méretének ellenırzésére a reakció termékekbıl 10 µl-t megfuttattunk 2%-os agaróz gélen. A primerek szekvenciáját a 13/a. és 13/b. táblázat ismerteti. 13/a. táblázat: Forward primerek (szekvencia 5’-3’) és jellemzıik
GÉN
β-actin
MÉRET (BP)
SZEKVENCIA
CCTGGCACCCAGCACAAT
GI (GENE IDENTIFICATION)
1031-1048
18
15928802
CLDN-1
GCGCGATATTTCTTCTTGCAGG
378-399
22
9966780
CLDN-2
CTCCCTGGCCTGCATTATCTC
273-293
21
9966780
CLDN-3
CTGCTCTGCTGCTCGTGTCC
732-751
20
21536298
CLDN-4
GGCTGCTTTGCTGCAACTGTC
741-761
21
14790131
CLDN-7
CATCGTGGCAGGTCTTGCC
813-831
19
24496764
47
13/b. táblázat: Reverz primerek (szekvencia 3’-5’) és jellemzıik
GÉN
MÉRET (BP)
SZEKVENCIA
GGGCCGGACTCGTCATAC
β-actin
GI (GENE IDENTIFICATION)
1157-1174
18
15928802
CLDN-1
TTCGTACCTGGCATTGACTGG
470-490
21
9966780
CLDN-2
ACCTGCTACCGCCACTCTGT
344-363
20
9966780
CLDN-3
TTAGACGTAGTCCTTGCGGTCGTAG
836-860
25
21536298
CLDN-4
GAGCCGTGGCACCTTACACG
829-848
20
14790131
CLDN-7
GATGGCAGGGCCAAACTCATAC
909-930
22
24496764
4.3.2. β-catenin mutáció-analízis Négy db immunhisztokémiailag magi pozitivitást mutató hepatoblastoma esetet (fetalis/embryonalis) választottunk ki a β-catenin mutáció-analízis elvégzésére (5., 11., 14. és 17. számú - lásd 6. táblázat). Ezek mindegyike egyszerre tartalmazott megfelelı mennyiségő fetalis és embryonalis komponenst. A vizsgálathoz 2-8 db, 5 µm vastagságú szövetmetszetet készítettünk, melyekbıl PCR Template Kit-tel (Roche) izoláltunk DNS-t. A direkt szekvenálás céljára elıször egy 232 bázispár hosszúságú terméket amplifikáltunk a β-catenin gén potenciálisan pontmutációt hordozó 3. exonjáról ABI Prism BigDye Terminator Kit-tel, az alábbi primerekkel: Fwd 5’- AGCTGATTTGATGGAGTTG3’ (815-833) és Rev 5’- ACCAGCTACTTGTTCTTGAG-3’ (1027-1046) (RefSeq GI: 6682315). A talált mutációkat kétirányú szekvenálással erısítettük meg. A szekvenálás ABI373 (Applied Biosystems) berendezésen történt.
48
4.4. Statisztikai módszerek Az immunhisztokémiai statisztikai analízist a claudin, β-catenin és proliferációs markerek (Ki-67 és PCNA) esetében Mann-Whitney U teszttel végeztük, amely során az immunhisztokémiai
pontértékeket
hasonlítottuk
össze
a
hepatoblastoma
különbözı
epithelialis (fetal/embryonal) sejtcsoportjaiban. Az értékeket szignifikánsnak tekintettük, ha P<0,05. A dlk-1 vizsgálatokban az értékelés eredményeit tartalmazó kontingencia-táblákat Fisher’s exact tesztnek vetettük alá. A molekuláris patológiai vizsgálatok során az adatok analíziséhez és a statisztikai vizsgálatokhoz a REST software-t (Relative Expression Software Tool, www.wzw.tum.de/gene-quantification) (Pfaffl és mtsai 2002) és a Pairwise Fixed Reallocation Randomization Testet használtuk. A relatív kvantifikációhoz referencia génként β-actin használtunk. Az értékeket valamennyi statisztika esetében akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P<0,05.
49
5. EREDMÉNYEK
5.1.
CLAUDIN
FEHÉRJEEXPRESSZIÓ
VIZSGÁLATA
HUMAN
HEPATOBLASTOMÁBAN IMMUNHISZTOKÉMIAI MÓDSZERREL
5.1.1. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 expresszió vizgálatata a tumormentes, környezı májban A reakció a CLDN-1 esetében membranózus és lineáris, a CLDN-2 esetében citoplazmatikus és granuláris volt. •
A CLDN-1 reakció lineáris membránpozitivitása fıként az epeúti hámsejtekben volt megfigyelhetı, mely a sejtek lumináris pólusán erısebb festıdést mutatott. A hepatocyták leginkább csak a májsejtek alkotta acinusok lumináris (apikális) pólusán mutattak gyenge membranózus reakciót.
•
A CLDN-2 granuláris, citoplazmatikus festıdése a hepatocyták többségében és az epeutak sejtjeiben volt megfigyelhetı.
•
A CLDN-3, CLDN-4 és CLDN-7 reakciók lineáris membránpozitivitása az epeúti hámsejtekben mutatkozott, erısebb festıdéssel a lumináris pólusokon. Helyenként igen gyenge expresszió a hepatocyták alkotta acinusok lumináris (apikális) pólusán is megfigyelhetı volt. Az említett claudinokat a hepatocyták azonban többnyire nem expresszálták.
50
5.1.2. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 expresszió vizsgálata hepatoblastomában A vizsgált claudinok közül csupán a CLDN-1 és a CLDN-2 fehérjék fokozott expressziója volt megfigyelhetı a daganat epithelialis (fetalis/embryonalis) komponenseiben. A reakció a CLDN-1 esetében membranózus és lineáris, a CLDN-2 esetében citoplazmatikus és granuláris volt. A CLDN-1 és a CLDN-2 reakciók esetében a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensei között egyértelmő expressziós különbség mutatkozott.
•
A CLDN-1 a fetalis komponensben erıs membranózus expressziót mutatott, mely csaknem teljesen körbevette a sejthatárt, a daganat „lépesmézszerő” megjelenését eredményezve (11/A ábra). Az embryonalis komponens, szórványos pozitivitást leszámítva, negatív volt.
•
A CLDN-2 a fetalis komponensben erıs citoplazmatikus és granuláris festıdést mutatott (11/B ábra), míg az embryonalis komponens, szórványos pozitivitást leszámítva, negatív volt. A fetalis komponensben gyakori jelenség volt, hogy a reakció jellegzetesen a pszeudorozetták (acináris struktúrák) luminalis (apikális) pólusára lokalizálódott.
•
A CLDN-3 expresszió lényegileg a tumor mindkét komponensében negatív volt, elvétve egy-egy területen a fetalis komponens acináris struktúráiban gyenge apicalis pozitivitás mutatkozott.
•
A CLDN-4 expresszió a tumor mindkét komponensében negatív volt.
•
A CLDN-7 expresszió a CLDN-4-hez hasonlóan a tumor mindkét komponensében negatív volt.
51
A
B
11. ábra: A: A CLDN-1 protein membranózus expressziója a fetalis komponensben. B: A CLDN-2 citoplazmatikus, granuláris expressziója a fetalis komponensben. A nyíl a daganatejtek által alkotott pszeudorozetták (acináris struktúrák) luminális (apikális) pólusára mutat (A-B: 600x).
A hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensének claudin fehérjeexpressziós mintázatát a 12. ábra foglalja össze.
52
e
HE
e
f
CLDN-1
f
A
B CLDN-2
e
e
f C
D
CLDN-3
f
CLDN-4
CLDN-7
e
e
f
f
E
F
12. ábra: A CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 proteinek expressziója a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében. A hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponense hematoxilineosin (H&E) festéssel (A). A CLDN-1 reakcióval (B) a fetalis komponens (f) élesen elhatárolódik az embryonalistól (e). Az embryonalis komponens negatív. A CLDN-2 reakció (C) hasonló képet mutat azzal a különbséggel, hogy itt a reakció granuláris és citoplazmatikus. A CLDN-3 (D), CLDN-4 (E) és CLDN-7 (F) reakciók a tumor mindkét komponensében negatívak. (A-F: 400x)
53
Az immunhisztokémiai szignifikancia-vizsgálatokat a Mann-Whitney U teszt segítségével végeztük el, melyek eredményét a 14. táblázat szemlélteti.
14. táblázat: A CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 ellenes antitestekkel végzett immunhisztokémiai vizsgálatok szemikvantitatív analízise a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében. A megadott érték a claudin expresszió középértékét ± standard hibát (mean ± S.E.) mutatja. CLDN: claudin; P: szignifikancia (P<0,05), NS: nem szignifikáns (MannWhitney U teszt)
CLDN-1 CLDN-2 CLDN-3 CLDN-4 CLDN-7
Embryonal komponens
Fetalis komponens
P
0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.5 ± 0.5 0.0 ± 0.0 0.4 ± 0.4
4.2 ± 0.4 4.4 ± 0.3 0.6 ± 0.4 0.0 ± 0.0 0.5 ± 0.3
0.0008 0.0005 NS NS NS
54
5.2. PROLIFERÁCIÓS (Ki-67, PCNA) ÉS EGYÉB MARKEREK (HSA, CK-7) VIZSGÁLATA
HUMAN
HEPATOBLASTOMÁBAN
IMMUNHISZTOKÉMIAI
MÓDSZERREL
A Ki-67 és a PCNA szignifikánsan magasabb nukleáris expressziót mutatott az embryonalis komponensben a fetalishoz képest. A HSA a fetalis komponensben erıs citoplazmatikus festıdést mutatott, míg az embryonalis komponens negatív volt. A CK-7 reakció a tumor mindkét komponensében negatív volt (13/ A, B és C ábra).
e e
f A
f
B
Ki-67
PCNA
e
f C 13.
ábra:
Proliferációs
HSA markerek
és
a
HSA
expressziójának
vizsgálata
immunhisztokémiai módszerrel human hepatoblastomában. A: A Ki-67 reakció az embryonalis komponensben dominál. embryonalis komponensben.
B: A PCNA fokozottabban expresszálódik az
C: A HSA a fetalis komponensben erıs citoplazmatikus
pozitívitást mutat, míg az embryonalis komponens negatív. e: embryonalis, f: fetalis (A-C: 400x)
55
Az immunhisztokémiai szignifikancia-vizsgálatokat a Mann-Whitney U teszt segítségével végeztük el, melyek eredményét a 15. táblázat szemlélteti.
15. táblázat: A HSA, CK-7,
PCNA és
Ki-67 ellenes antitestekkel végzett
immunhisztokémiai vizsgálatok szemikvantitatív analízise a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében. A megadott érték HSA, CK-7, PCNA és Ki-67 expresszió középértékét ± standard hibát (mean ± S.E.) mutatja; p: szignifikancia (P<0,05), NS: nem szignifikáns (Mann-Whitney U teszt) Ki-67 és PCNA %-ban számolva.
HSA CK-7 PCNA % Ki-67 %
Embryonal komponens 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 86.8 ± 4.1 10.7 ± 2.7
Fetalis komponens 4.3 ± 0.3 0.0 ± 0.0 67.3 ± 4.7 4.1 ± 0.6
P 0.0018 NS 0.013 0.0312
Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeit az alábbi grafikonok segítségével is szemléltetjük (15/A és 15/B ábra).
56
*
*
*
15/A ábra: CLDN-1, -2, -3, -4, -7, HSA és CK-7 fehérjék expressziója a hepatoblastoma fetalis
és
embryonalis
komponensében
az
immunhisztokémiai
vizsgálatok
kiértékeléséhez használt pontértékek függvényében. A CLDN-1, CLDN-2 és HSA expresszió a hepatoblastoma fetalis komponensében szignifikánsan magasabb az embryonalis komponenshez képest. *: szignifikáns eltérés (P<0,05)
*
*
15/B ábra: A PCNA és Ki-67 proliferációs markerek expressziója a hepatoblastoma fetalis
és
embryonalis
komponensében
az
immunhisztokémiai
vizsgálatok
kiértékeléséhez használt %-ok függvényében. A függıleges tengelyen a kiértékeléshez használt százalékos eredmények szerepelnek. Mindkét marker a hepatoblastoma embryonalis komponensében mutat szignifikánsan magasabb expressziót a fetalis komponenshez képest. *: szignifikáns eltérés (P<0,05)
57
5.3.
CLAUDINOK
GÉNEXPRESSZIÓJÁNAK
VIZSGÁLATA
HUMAN
HEPATOBLASTOMÁBAN MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL 5.3.1. CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 mRNS expressziójának vizsgálata a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében (real time RT PCR) A kiválasztott öt hepatoblastoma eset paraffinos blokkjaiból makrodisszekcióval kinyert epithelialis, azaz fetalis és embryonalis komponensekben elvégzett mRNS expresszió vizsgálati eredményei az immunhisztokémiai reakciók során kapott eredményekkel korreláltak. A CLDN-1 mRNS expresszió szignifikánsan magasabb volt a fetalis komponensben (23-fold; P = 0.001) az embryonalis komponenshez képest. A CLDN-2 esetében hasonló eredményeket kaptunk (8.5-fold; P = 0.001). A CLDN-3, -4 és -7 mRNS expresszió (3.5, 2- és 2.2-fold) a fetalis komponensben ugyan magasabb volt, az expressziós különbségek azonban nem voltak szignifikánsak (16/A és 16/B ábra).
16/A ábra: A Real time RT PCR produktumainak 2 %-os agaróz gélen vizsgált elektroforézise. A CLDN-1 és CLDN-2 esetében erısebb expresszió látható a fetalis komponensében.
58
25
*
Fold change
20 15
*
10 5 0 CLDN-1
CLDN-2
CLDN-3
CLDN-4
CLDN-7
16/B ábra: CLDN-1, -2, -3, -4 és -7 mRNS fold change különbség a fetalis komponensben az embryonalishoz képest. (* szignifikáns különbség, P<0,05)
59
5.4. β-CATENIN EXPRESSZIÓ VIZSGÁLATA HUMAN HEPATOBLASTOMÁBAN 5.4.1. β-catenin expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel Az
általunk
vizsgált
14
hepatoblastoma
esetbıl
összesen
13-ban
láttunk
citoplazmatikus/magi festıdést. A fetalis és embryonalis komponensek 9/14 és 6/9 esetben mutattak citoplazmatikus/magi festıdést (17/A és 17/B ábra). A két hámkomponens között a β-catenin festıdésében nem mutatkozott szignifikáns különbség (16. táblázat).
17/A. ábra: β-catenin fehérjeexpresszió a hepatoblastoma fetalis komponensében Citoplazmatikus és magi festıdés (nyíl) egyaránt látható a daganatsejtekben. (400x)
60
17/B ábra: β-catenin fehérjeexpresszió a hepatoblastoma embryonalis komponensében Citoplazmatikus és magi festıdés (nyíl) egyaránt látható a daganatsejtekben (400x).
16. táblázat: A β-cateninnel végzett immunhisztokémiai reakciók szemikvantitatív analízise human hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponensében. A megadott érték a β-catenin expresszió középértékét ± standard hibát (mean ± S.E.) mutatja. P: szignifikancia (P<0,05), NS: nem szignifikáns (Mann-Whitney U teszt).
β-catenin
EMBRYONAL
FETAL
P
63.2±17.2
51.7±13.3
NS
61
5.4.2. A β-catenin gén mutációjának vizsgálata molekuláris biológiai módszerrel (mutáció analízis) A makrodisszekált mintákból (4 db, fetalis és embryonalis komponenst egyaránt tartalmazó esetek: 5., 11., 14. és 17. számú - lásd 6. táblázat) származó PCR amplikonok nukleotid szekvenciája a β-catenin génben egy-egy esetben mutatott missens mutációt mind a fetalis mind az embryonalis komponensben. Mindkét mutáció a 3. exon 37-es kodonjában jött létre, ahol a TCT→TGT váltás egy szerin→cisztein cserét eredményezett (18. ábra).
18. ábra: A β-catenin mutáció analízis során végzett szekvenálás diagramja. A mutáció során a TCT kodonban a citozin guaninra cserélıdött. Ezt a kék színő görbével átfedésben lévı fekete színő görbe megjelenése szemlélteti (nyíl).
62
5.5.
DLK-1
FEHÉRJEEXPRESSZIÓ
VIZSGÁLATA
IMMUNHISZTOKÉMIAI
MÓDSZERREL
5.5.1. Dlk-1 fehérjeexpresszió vizsgálata human hepatoblastomában
Mind a 31 db formalin fixált, paraffinba ágyazott hepatoblastoma blokkokból készített metszeteken elvégzett dlk-1 immunhisztokémiai reakció pozitív eredményt adott. A daganatban a festıdés a legtöbb esetben (5-50 %) focalis, míg a környezı tumormentes májszövet minden esetben negatív volt. Pozitív reakció fıként a tumor epithelialis komponenseiben (fetalis, embryonalis) volt detektálható, míg a mesenchymalis elemek (kevert hepatoblastoma) negatív festıdést mutattak (19. ábra). A legtöbb esetben a dlk-1 festıdés fıként a daganatsejtek felszínére lokalizálódott, néhány esetben azonban citoplazmatikus festıdés is mutatkozott. Az immunhisztokémiai vizsgálat eredményeit a 17. táblázat foglalja össze. Habár a dlk-1 reakció a jobban differenciált fetalis komponensben általában erısebb volt, a dlk-1 expressziója a két komponens között nem mutatott szignifikáns különbséget. A dlk-1 fehérjének a daganatban látható különbözı festıdési mintázatát a 20. ábra szemlélteti. Az egyik hepatoblastoma esetünk ismert tüdıáttétjében a reakció ugyancsak pozitív volt (21. ábra). Pozitív AFP immunhisztokémiai reakció minden hepatoblastoma esetünknél kimutatható volt. Az AFP és a dlk-1 reakciók eloszlása nem mutatott átfedést egymással.
19. ábra: Dlk-1 expresszió kevert (epithelialis/mesenchymalis) hepatoblastomában A daganat mesenchymalis elemei negatív, míg az epithelialis elemek pozitív reakciót adtak (400x).
63
17. táblázat: A dlk-1 fehérje expressziójának vizsgálati eredményei human hepatoblastomaban F: fiú. L: lány, W: tisztán epithelialis (f: tisztán fetalis), M: mixed, f: fetalis, e: embryonalis (SIOPEL szerint osztályozva); CA: kanalikuláris, CY: citoplazmatikus, M: membranózus, D: szemcsés (dot like).
ESTSZÁM
KOR (ÉV)
NEM
SZÖVETTAN
DOMINÁNS KOMPONENS
REAKCIÓ %
REAKCIÓ INTENZITÁSA
REAKCIÓ MINTÁZATA
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31.
3 5 5 1 0.5 1 1 2 0.5 1 7 1 4 1 1 10 3 3 3 2 5 1 2 14 1 4.5 1 4 5 5 0.5
F L F L F F F L L L F L F L F F F F F F L L F F L L L F L L F
W M W W M M M W M W W W W M M Wf W W W W W W W Wf M W W M Wf Wf W
f f e e f f e f e f f f e e e f e e f f e f f f f e e f f f f
11-40 1-10 1-10 1-10 > 40 > 40 11-40 1-10 11-40 1-10 1-10 11-40 11-40 11-40 1-10 1-10 11-40 1-10 > 40 1-10 11-40 1-10 11-40 1-10 1-10 1-10 1-10 1-10 11-40 > 40 11-40
+ + + + + + ++ ++ + + + + ++ + ++ +++ ++ + ++ + + + ++ + + + + + ++ ++ ++
CA CY M CY M M CY M CA CY M M CA CA CY D CY CA M M M M M CY M CY M CY CY CY/M CA
64
A
B
C
D
20. ábra: A dlk-1 reakciónak az immunhisztokémiai vizsgálatok során látott különbözı festıdési mintázata human hepatoblastomában. A: membranózus/citoplazmatikus, B: kanalikuláris, C: citoplazmatikus, D: membranózus (A-D: 400x)
65
21. ábra: Dlk-1 pozitivitás human hepatoblastoma tüdıáttétjében. A dlk-1 fehérjét erısen expresszáló daganatsejtek jól kirajzolódnak a tüdıszövetben. A daganatáttét mellett az alveolusok láthatóak (nyíl) (40x).
5.5.2. Dlk-1 fehérjeexpresszió vizsgálata hepatocellularis carcinomában és egyéb daganatokban
Összességében 22 db
hepatocellularis carcinomát, valamint 30 db egyéb
differenciáldiagnosztikai vonatkozású [6 db AFP pozitív csírasejtes tumort (2 db yolk sac, 1 db teratocarcinoma, 1 db seminoma és 2 db éretlen teratoma), 5 db Wilms tumort, 9 db ganglio/neuroblastomát, 5 db medulloblastomát, 1 db rhabdoid tumort, 2 db infantilis hemangioendotheliomát, 1 db mesenchymalis hamartomát és 1 db máj MPNST-t (malignant peripheral nerve sheath tumor)] vizsgáltunk meg a dlk-1 fehérjeexpressziójának kimutatására (18. és 19. táblázat). A hepatocellularis carcinomák közül egy esetben láttunk focalis gyenge festıdést (ennek részletezését lásd a megbeszélés c. fejezetben), a többi HCC és megvizsgált egyéb daganat (az érett ganglionsejtek kivételével, melyek dlk-1 pozitívak voltak) mindegyike negatív reakciót adott a dlk-1 fehérjével. A hepatoblastoma, hepatocellularis carcinoma és a
66
különbözı eredető egyéb daganatok differenciáldiagnosztikáját a dlk-1 fehérje expressziós profilja alapján a 20. táblázat szemlélteti.
18. táblázat: Dlk-1 és egyéb markerek vizsgálata human hepatocellularis carcinomában immunhisztokémiai módszerrel. F: férfi, N: nı, PG: pseudoglandularis, SO: solid, TR: trabecularis
ESTSZÁM
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.
KOR (ÉV)
NEM
SZÖVETTANI TÍPUS
GRADE
AFP
CK-19
DLK-1
56 73 64 57 77 57 70 53 54 50 62 54 78 53 59 49 51 49 68 64 68 68 60 79
F F F F F F F N F F F F F N F F F F F F F N F N
PG SO TR PG SO SO PG TR PG PG TR PG PG PG TR SO TR TR SO PG SO SO TR PG
II III III II II III III III III II II III II II II III III II II II III III II II
+ + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + +
+ -
67
19. táblázat: Dlk-1 fehérjeexpresszió vizsgálata különbözı eredető tumorokban immunhisztokémiai módszerrel. a: 2 yolk sac, 1 teratocarcinoma, 1 seminoma és 2 éretlen teratoma, b: hónap, F: férfi, N: nı, MPNST: malignant peripheral nerve sheath tumor
Tumor típus Germ cell tumor a Wilms’ tumor Ganglio/Neuroblastoma Medulloblastoma Rhabdoid tumor Infantilis hemangioendothelioma Mesenchymal hamartoma Máj MPNST
Életkor tartomány (év) 20-51 1-11 0.5-17 1-19 1 1-3 b 0.5 23
Átlagéletkor 22.8 5.7 3.2 7.6 2 -
Nem F/N 6/0 4/1 3/6 3/2 1/0 2/0 0/1 0/1
Esetszám
Dlk-1
6 5 9 5 1 2 1 1
*az érett ganglionsejtek kivételével
20. táblázat: A hepatoblastoma, hepatocellularis carcinoma és a különbözı eredető egyéb daganatok differenciáldiagnosztikája a dlk-1 fehérje expressziós profilja alapján n= esetszám
TUMORTÍPUS
DLK-1 EXPRESSZIÓ
hepatoblastoma (n=31) hepatocellularis carcinoma (n=24) AFP pozitív csírasejtes daganatok (yolk sac, seminoma, teratocarcinoma, éretlen teratoma) (n=6) Wilms tumor (n=5) rhabdoid tumor (n=1) infantilis hemangioendothelioma (n=2) medulloblastoma (n=5) ganglio/neuroblastoma (n=9)
+ -*
* érett ganglionsejtek kivételével
68
-* -
6. MEGBESZÉLÉS
6.1 Claudinok expressziója human hepatoblastomában
A hepatoblastoma eredetére, differenciációjára, természetére és kezelésére vonatkozó irodalom rendkívül gazdag. Napjainkig számos, a növekedéssel vagy a sejtciklus szabályozásával kapcsolatos abnormális mőködést írtak le a daganatban. Bizonyos növekedési vagy a sejtciklusra (pl. ciklus ellenırzıpontok) közvetlenül ható számos faktor expressziója ismert a daganatban. Egyes citokinek - mint pl. a Polo-like kinase-1 (PLK1 onkogén) expresszióját is közölték hepatoblastomában, melynek fokozott expressziója rosszabb prognózissal jár (Yamada és mtsai 2004). Szintén rosszabb prognózissal jár a Sakamoto és mtsai (2009) által hepatoblastomában leírt MT1G gén hipermetilációja is. Leírták a glypican3 (sejtfelszíni glikoprotein) hepatoblastomában való expresszióját is. A glypican-3 expressziójának fokozódása a májrákok egyik jellegzetessége (Zynger és mtsai 2008, Capurro és mtsai 2003). A daganat eredetének pontosabb felvázolásával és ebbıl eredıen bizonyos szubtípusok szokatlan biológiai viselkedésével ugyancsak számos kiváló közlemény foglalkozik (Zimmermann 2005; Weber és mtsai 2000; Ruck és mtsa 2002). A
hepatoblastoma
szövettani
megjelenésének
spektruma
a
differenciáció
szempontjából igen széles: a spektrum alján a kifejezetten éretlen, ún. kissejtes differenciálatlan, tetején a tisztán epithelialis, érett fetalis forma foglal helyet. Közöttük helyezkednek el a különbözı érettségő hámkomponenseket változó mértékben tartalmazó szubtípusok és a makrotrabekuláris hepatoblastoma. A daganat speciális típusai, mint a cholangioblastos és organoid hepatoblastoma külön entitást alkotnak. A
hepatoblastoma
kezelésében
a
stádium
mellett
a
daganat
szöveti
differenciálódásának alapvetı szerepe van. A hepatoblastoma differenciáltsági fokát alapvetıen meghatározó epithelialis, azaz fetalis és embryonalis komponensek morfológiai elkülönítésére azonban kevés marker áll rendelkezésre. Von Schweinitz és mtsai (1996) az Ecadherin molekula, Kiss és mtsai (1998) a TGF-α fetalis komponensben való magasabb expresszióját közölte. Ez vetette fel, hogy egyéb sejtfelszíni markerek expresszióját is hasznos lenne megvizsgálni hepatoblastomában, kiemelten a daganat egyes hámkomponenseiben.
69
Amikor a claudin molekulacsalád elsı tagjait felfedezték, funkciójukat elsısorban statikusnak gondolták. Azóta a tight junction proteinek szöveti lokalizációját (sejt-és szövetspecificitását), funkcióját és a sejtek életében betöltött szerepét alaposabban feltérképezték. A sejtadhéziós molekulák és egyéb intercelluláris kapcsolódási komplexek, valamint az azokat alkotó komponensek fontos szerepet játszanak a sejtek integritásának megırzésében, a polaritás kialakításában. A sejtek közötti interakció megváltozásának a daganatok keletkezésében és a progresszióban is szerepe van (Sawada és mtsai 2003, van Grevenstein és mtsai 2006). A daganatos progresszió során a sejtkapcsolatok változása, többnyire azok csökkenése észlelhetı. Mindez a tumorsejtek disszeminációját, végsı soron metasztázis kialakulását eredményezheti. Ez a TJ fehérjék expressziójának csökkenésével mutat korrelációt (Sobel és mtsai 2006, Smith és mtsai 2008, Tsukita és mtsai 2008). Emellett azonban számos olyan közlemény is megjelent, amelyekben a tumoros progresszió a TJ proteinek expressziójának növekedésével korrelált (Leotlela és mtsai 2007, Németh és mtsai 2009, Song és mtsai 2008). A TJ „gerincét” alkotó claudin család tagjainak expressziós változásai különös jelentıséggel bírnak ebben a folyamatban (Smith és mtsai 2008). Ennek tükrében vizsgáltuk meg a claudin fehérjék viselkedését human hepatoblastoma eseteinkben. Hepatoblastomában
elsıként
írtuk
le
a
claudinok
expresszióját.
Jelen
tanulmányban megállapítottuk, hogy a vizsgált claudinok közül (CLDN-1, -2, -3, -4 és -7) hepatoblastomában csupán a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék mutattak fokozott expressziót. A CLDN-1 és a CLDN-2 fehérjék expressziójának mértéke jelentıs eltérést mutatott a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponense között. A CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék az érettebb fetalis komponensben szignifikánsan magasabb expressziót mutattak a fetalis komponenshez képest. Az embryonalis komponens (szórványos, gyenge expressziót leszámítva) negatív volt. A CLDN-3 fehérje alig (fetalis komponens acinaris struktúrái) vagy egyáltalán nem expresszálódott a daganatban. A CLDN-4 és -7 expresszió mindkét hámkomponensben negatív volt. Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeit a molekuláris biológiai vizsgálatok (Real Time RT-PCR) megerısítették, azaz a CLDN-1 és -2 mRNS expresszió a daganat fetalis komponensében szignifikánsan magasabb volt az embryonalis komponenshez képest. A hepatoblastoma egyéb epithelialis szubtípusait, mint a kissejtes differenciálatlan és a makrotrabekuláris hepatoblastomát tanulmányunkban nem vizsgáltuk.
70
Proliferációs markerek kifejezıdését is megvizsgáltuk hepatoblastoma eseteink fetalis és embryonalis komponensében. A hepatoblastomát alkotó daganatsejtek differenciáltságának foka a sejtproliferációval szoros összefüggést mutatott. A daganat érettebb, fetalis komponensét felépítı daganatsejtek proliferációs készsége (PCNA, Ki-67) szignifikánsan
alacsonyabb
volt
az
éretlenebb
embryonalis
komponenst
felépítı
daganatsejtjeihez képest. Megállapításunkat Kiss és mtsai-nak (1998) vizsgálatai is támogatják, miszerint a PCNA és cyclin D1 proliferációs markerek expressziója az érett fetalis komponensben szignifikánsan alacsonyabb. Ez fokozott TGF-α produkcióval járt együtt. Számos közlemény foglalkozik a CLDN-1 fehérjének a különbözı daganatokban való expressziójával, és néhány ezek közül annak a proliferációs és/vagy az inváziós készséggel való összefüggését is taglalja. A CLDN-1 expressziójának növekedését találták pl. colorectalis carcinomákban, sıt a CLDN-1 nukleáris lokalizációja is észlelhetı volt annak metasztázisaiban (Dhawan et és mtsai 2005, Smith és mtsai 2008). Primer colorectalis carcinoma sejteket vizsgálva a CLDN-1 expressziója ugyancsak fokozott volt. Ez viszont nem fokozta a daganatos sejtproliferációt, ám növelte az extracellularis matrixon (ECM) keresztül történı inváziót. Az emelkedett CLDN-1 expressziót mutató metasztatikus colorectalis carcinoma sejtvonalban csökkent az apoptosis, valamint a daganatsejtek leválásának mértéke az edény faláról (Smith és mtsai 2008). Mindezek azt igazolják, hogy a CLDN-1 fontos szerepet tölt be a daganatsejtek proliferációjának szabályozásában. Vizsgálatunkban a magasabb szöveti differenciáció fokozott CLDN-1 és CLDN-2 expresszióval és alacsonyabb proliferációs készséggel járt. A CLDN-3, -4 és -7 fehérjék expressziója a daganat mindkét komponensében igen alacsony volt (≤ 5 %), így ezek esetében ilyen irányú következtetéseket nem lehetett levonni. Feltételezhetı, hogy a CLDN-1 és a CLDN-2 proteinek hepatoblastomában, mint inhibitorok vesznek részt a sejtproliferáció szabályozásában. Ismert, hogy a különbözı jelátviteli folyamatok aktivitásának fokozódása bizonyos oncogének aktiválásához vezet. Az aktivált oncogének pedig serkenthetik a proliferációt, a dedifferenciációt és gátolhatják az apoptózist. Számos daganat keletkezésében mutatható ki ez a folyamat, melynek legjellegzetesebb képvielıje a Wnt/β-catenin jelátviteli útvonal (Reya és Clevers 2005). A különbözı sejtadhéziós molekulák és jelátviteli útvonalak, elsısorban az E-cadherin és a Wingless-Wnt jelátviteli út, jelentıs szerepet játszanak a β-cateninen keresztül a carcinogenesis folyamatában (Sawada és mtsai 2003, Hirohashi és Kanai 2003,
71
Tobioka és mtsai 2004, Lioni és mtsai 2007). Ezekben a folyamatokban a TJ, mint multiprotein komplex vesz részt (Gonzalez-Mariscal és mtsai 2003, Ivanov és mtsai 2004). Hepatoblastomán kívül humán hepatocellularis carcinomában is szoros összefüggés igazolódott a β-catenin nukleáris akkumulációja és a megnövekedett proliferációs készség (Ki-67) között. A fokozottan proliferáló, alacsonyan differenciált (G III) és β-catenin pozitív hepatocellularis carcinomák sejtmembránjukon redukált E-cadherin expressziót mutattak. Az eredményeket összevetvén Inagawa és mtsai (2002) arra a következtetésre jutottak, hogy HCC-ben a β-catenin nukleáris akkumulációja, valószínőleg a tumoros sejtproliferáció stimulálásán keresztül, hatással van a sejtadhéziós rendszer reductiójára, amely közvetve kihat a daganatos progresszióra és a túlélésre. Egér hepatoblastokon végzett vizsgálatok során pedig az igazolódott, hogy a β-catenin fontos szerepet játszik a máj morfogenezisében, úgymint a hepatoblastok érésében, expanziójában és azok túlélésében (Tan és mtsai 2008). Az immunhisztokémiai reakciók során az általunk vizsgált 14 hepatoblastoma eset közül 13 esetben volt kimutatható a Wnt/ β-catenin jelátvitel károsodása, amely a β-catenin magi/cytoplazmatikus festıdésében nyilvánult meg. A mutáció analysis vizsgálatok a βcatenin génjének 3. exonjában bekövetkezett pontmutációt igazoltak az általunk kiválasztott embryonalis és fetalis komponenst egyaránt tartalmazó esetekben. Mindez megerısíti azt a tényt, hogy a Wnt/β-catenin jelátvitel károsodása a hepatoblastomák patogenezisében szerepet játszik. Egyes közlemények (Park és mtsai 2001, Takayasu és mtsai 2005) hepatoblastomában arról számolnak be, hogy a β-catenin az éretlen embryonalis komponensben szignifikánsan magasabb expressziót mutat a fetalis komponenshez képest. Ezek szerint a β-catenin nukleáris akkumulációja a hepatoblastomák szövettanilag éretlen, embryonalis komponensével ill. a daganat
szövettanilag
rosszul
differenciált
formáival
szoros
összefüggést
mutat;
következésképpen a β-catenin nukleáris akkumulációja hepatoblastomában fontos prognosztikus faktor. Fenti szerzık ezen megállapításását vizsgálataink nem támasztották alá. Esetünkben ugyanis a két komponens β-catenin expressziója között nem mutatkozott szignifikáns eltérés. Az irodalmi és saját eredményeink eltérésének pontos oka nem ismert. Véleményünket látszik alátámasztani Udatsu és mtsai-nak (2000) vizsgálata, amelyben a βcatenin
gén
mutációját
tanulmányozták
a
hepatoblastomák
különbözı
szövettani
szubtípusaiban (tisztán fetalis, fetalis/embryonalis, makrotrabekuláris és kevert). Ennek során nem találtak korrelációt a mutáció elıfordulása és a hisztológiai szubtípus között. Mindez felveti, hogy a β-catenin génben bekövetkezett mutáció esetleg a pluripotens hepatikus blastema sejtekben alakul ki.
72
Colorectalis carcinomák esetében figyelték meg, hogy a fokozott CLDN-1 expresszió megnövekedett Wnt jelátviteli aktivitással jár, míg a CLDN-1 expresszió gátlása ezt megakadályozza (Miwa és mtsai 2000, Smith és mtsai 2008). Feltételezésük szerint a CLDN1 expresszió colorectalis carcinomákban a Wnt/β-catenin jelátviteli útvonal által szabályozott. Resnick és mtsai (2005) azonban, ugyancsak colorectalis rákokban, azt találták, hogy a magasabb tumor grade, a rekurrencia és a rosszabb túlélés a CLDN-1 csökkent expressziójával korrelál. Ez viszont ellentmond az elıbbiekben felvázolt Wnt/β-cateninCLDN-1 expresszió között fennálló összefüggéseknek.
Ezzel egyidıben más szerzık
(Dhawan és mtsai 2005), ugyancsak colorectalis carcinomákban, a CLDN-1 fokozott expresszióját és nukleáris lokalizációját közölték, amely az E-cadherin-β-catenin/Tcf jelátvitelnek a CLDN-1 általi szabályozását feltételezi. Mindez megerısíti a claudinok különbözı jelátviteli folyamatokban betöltött fontos szerepét. Vizsgálatainkban nem észleltük a fokozott CLDN-1 expresszióval járó megnövekedett Wnt jelátviteli aktivitást, azaz a hepatoblastoma CLDN-1-et (és CLDN2-t) fokozottan expresszáló fetalis komponensében nem volt szignifikánsan magasabb a β-catenin nukleáris akkumulációja a claudin-1-negatív embryonalis komponenssel szemben. markerek
Érdekes azonban, hogy a CLDN-1 és CLDN-2, valamint a proliferációs expressziója
között
szoros
összefüggés
mutatkozott
a
szöveti
differenciálódásnak megfelelıen. Itt utalunk az elızıekben felvetettekre, miszerint hepatoblastomában a CLDN-1 és CLDN-2 proteinek a sejtproliferáció inhibitorai lennének. Feltételezhetı, hogy a claudinok többféle módon is kapcsolódnak a jelátviteli útvonalakhoz, ebbıl adódóan változhat a tumorprogresszióban betöltött szerepük. A különbözı tumorokra egyedi claudin mintázat jellemzı. Változhat a claudin fajtája és expressziójának szintje is az idıben a daganatprogressziónak megfelelıen és szövetspecifikusan is; indikátorai és/vagy aktív résztvevıi is lehetnek a folyamatoknak. A claudin expresszió utalhat a daganatok prognózisára is. Számos daganat esetében igazolódott ez. A vesedaganatok közül a papilláris típusban a CLDN-1 expressziója rövidebb túléléssel járt és independens prognosztikai indikátornak bizonyult (Fritzsche és mtsai 2008). A CLDN-1 fokozott expressziója a melanoma sejtek motilitásának növekedésével jár (Leotlela és mtsai 2007). Emlıdaganatokban a CLDN-1 hiánya szerepet játszik az invázió és metasztázis kialakulásában, emellett a CLDN-7 szerepét is leírták az invázió és a tumorprogresszió létrejöttében (Kominsky és mtsai 2003). Egyes szerzık tüdırákokban a CLDN-1-nek invázió/metasztázis gátló szerepet tulajdonítanak (Chao és mtsai 2009). A jobb
73
prognózisú endometrioid carcinomát alacsony CLDN-1 és magas CLDN-2 expresszió, a rosszabb prognózisú sero-papillaris formát a magas CLDN-1 és alacsony CLDN-2 expresszió jellemezi (Sobel és mtsai 2006). Fokozott CLDN-1 expresszió jellemezi a papillaris pajzsmirigyrákokat és azok nyirokcsomó metasztázisait (Németh és mtsai 2009). A colorectalis carcinomákban leírt csökkent CLDN-1 expresszió rosszabb prognózissal jár (Resnick és mtsai 2005). A CLDN-1 csökkent expresszió HCC-ben rosszabb prognózissal jár (Higashi és mtsai 2007). Cheung és mtsai szerint (2005) a CLDN-10 a recidív HCC kiváló markere. Gyomorcarcinoma progressziója során a CLDN-2 expressziója fokozódik (Song és mtsai 2008). Ovarium daganatokban a malignitás fokozódásával a CLDN-3 és -4 expresszió is emelkedik, amely a cystadenomák és cystadenocarcinomák elkülönítésében jelenıs szereppel bír (Rangel és mtsai 2003). Az irodalmi adatokból ismert, hogy hepatoblastomában a domináló fetalis komponens jelenléte jobb prognózissal jár (Ortega és mtsai 2000, Perilongo és mtsai 2004). A daganat legdifferenciáltabb formája a tisztán fetalis típusú epithelialis hepatoblastoma. Ez a típus csak sebészi kezelést igényel (Haas és mtsai 2001). Az eltérı differenciáltságú hámkomponensek azonosítása a daganatban ezért alapvetı fontosságú. Mivel ismert, hogy az egyes claudinok expressziójának prognosztikus szerepe lehet, úgy véljük, hogy a CLDN1 és CLDN- 2 expressziónak a hepatoblastoma hámkomponensei közötti jellegzetes megoszlása utalhat erre. Ennek igazolására azonban további vizsgálatok szükségesek, mivel tanulmányunkban a CLDN-1 és -2 expresszió változását és annak a túléléssel való összefüggését nem vizsgáltuk. Az irodalmi adatok tükrében azonban nem szabad elfelejteni, hogy a claudinok és egyéb TJ molekulák dinamikusan változnak a carcinogenesis során és ennek egyes szakaszaiban eltérı funkciót tölthetnek be. Ugyancsak szem elıtt kell tartani, hogy a TJ proteinek erısen sejt-, szövet- és szervspecifikusak, így a különbözı daganatokra vonatkozó ezirányú megfigyeléseket illetıen nem szabad általánosítani. Az egyes tumorok elkülönítésében, vagy az altípusok differenciálásában is jelentıs lehet a TJ rajzolat ismerete. A CLDN-4 magas expressziója elkülöníti az intrahepatikus cholangiocellularis carcinomát a hepatocellularis carcinomától (Lódi és mtsai 2006). A CLDN-1 és -2 alapján elkülöníthetı az endometrialis carcinoma két formája (Sobel és mtsai 2006).
Borka és mtsai (2007) a pancreas exocrin és endocrin daganatainak claudin
expressziós mintázatát ismertette. A CLDN-1 lehetıvé teszi a perineurinoma elkülönítését a hasonló szöveti képet mutató mesenchymalis daganatoktól (Folpe és mtsai 2002). A tüdı neuroendocrin differenciációt mutató kissejtes carcinomái és carcinoid tumorai eltérı CLDN-
74
1, -3 és -4 expressziót mutatnak (Moldvay és mtsai 2007). A pajzsmirigy daganatok közül pl. a papillaris forma speciálisan elkülöníthetı a magas CLDN-1 expresszió révén (Németh és mtsai 2009). A hepatoblastoma hámkomponenseinek egymáshoz és a daganat egészéhez viszonyított aránya a daganat differenciáltsági fokának meghatározója. A vizsgálatok során azt találtuk, hogy a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék expressziós rajzolata alapján a hepatoblastoma fetalis és embryonalis komponense egymástól jól elkülöníthetı. Mindez arra utal, hogy hepatoblastomában a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék differenciációs markernek tekinthetıek. Vizsgálatainkban a CLDN-2 fehérje a CLDN-1-hez hasonló expressziós rajzolatot mutatott, de a CLDN-1 lineáris membránpozitivitása helyett megjelenése granuláris és cytoplazmatikus volt. Érdekes megfigyelés, hogy a CLDN-2 több esetben a fetalis komponenst felépítı daganatsejtek által alkotott pszeudorozetták vagy acináris struktúrák luminális (apikális) pólusán adott erıs granuláris citoplazmatikus reakciót. A CLDN-2 ezen sajátos festıdési mintázatának tanulmányozása további vizsgálatok tárgya lehet. A CLDN-2 protein általában az ún. „lyukas”, „áteresztı” hámokban expresszálódik, mint pl. a vese proximális tubulusai (Gonzáles-Mariscal és mtsai 2003). A CLDN-2 fehérje speciális jelenléte a gasztrointesztinális hámsejtekben és az azokból kiinduló daganatokban a szervspecificitásra hívja fel a figyelmet (Aung és mtsai 2006). A CLDN-3 és -4 a Clostridium perfingens enterotoxinjaként funkcionál, mely specifikusan a sejt lízisét eredményezi. A CLDN-3-at vagy CLDN-4-et erısen expresszáló daganatoknál ennek szelektív terápiás konzekvenciája is lehetne (Michl és mtsai 2003). Vizsgálatainkban a CLDN-3 csak néhány esetben, a daganaton belül is csak a fetalis komponens daganatsejtjei által alkotott pseudorozetták luminalis részén adott gyenge lineáris membranózus reakciót. A CLDN-4 a tumor mindkét komponensében negatív volt. Ennek tehát hepatoblastomában nincs terápiás jelentısége. A CLDN-7 fehérjeexpresszió hasonlóan negatív eredményt adott a daganat mindkét komponensében. Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményei a CLDN-3, -4 és -7 esetében szintén korreláltak a molekuláris biológiai vizsgálatok eredményeivel.
75
6.2. Dlk-1 expresszió humán hepatoblastomában
A hepatoblastoma eredete nem egészen világos. Napjainkig számos olyan kiváló közlemény jelent meg, melyek ennek tisztázására különbözı markereknek a hepatoblast sejtvonalakon ill. hepatoblastomában való kifejezıdését vizsgálják. Ruck és mtsai (1997) human hepatoblastoma esetek tanulmányozása során észlelte, hogy a daganat kisebb csoportba rendezıdı kismérető epithelialis sejtjei ultrastruktúrálisan és immunhisztokémiailag is nagyon hasonlítanak a rágcsálók ovalis (oval/stem cell) sejtjeihez. Sattler és mtsai (2000) közleményükben mind a hepatocyta, mind pedig a cholangiocyta vonalra jellemzı markereket (CK-8, CK-18, CK-19, vimentin és actin) expresszáló kissejtes differenciálatlan hepatoblastoma esetét ismertette. Fiegel és mtsai (2004) CD34, Thy1, c-kit, CK-18, CK-7 és CD56 pozitivitást mutató sejteket detektáltak human hepatoblastomákban. Ennek alapján a hipotézis, mely szerint a májbeli ıssejtek jelentıs szerepet játszanak a hepatoblastoma hiszto- (onto-) genezisében, egyre megalapozottabbnak tőnik. Mindezek igazolására olyan sejtfelszíni markereket kerestek, melyek alkalmazásával a kísérleti körülmények között elıidézett hepatoblastok izolálhatóak. Tanimizu és mtsai (2003) az adipocyta differenciációt gátló preadipocyta faktor-1 (Pref-1) (Smas és Sul 1993, 1997) néven ismerté vált dlk-1 protein magas expresszióját találta fetalis egér májsejtekben. A dlk-1 expresszió alapján a hepatoblastokat elkülönítették, majd azokat izolálták. A dlk-1 pozitív hepatoblastok legnagyobb része mind a hepatocyta, mind pedig a cholangiocyta markereket egyaránt expesszálta. Egér embriókkal végzett kísérletek során az is kiderült, hogy a máj fejlıdése (differenciálódása) során a dlk-1 mennyisége (mRNS) fokozatosan csökken, majd a neonatalis és a felnıtt típusú májsejtekbıl teljesen eltőnik (Tanimizu és mtsai 2003). Mindezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a dlk-1 a máj organogenezisének kezdeti szakaszában, azaz a fetalis májban expresszálódik, amely az éretlen májsejteket, a biliáris epithelsejteket és ezek közös progenitor sejtjeit, a hepatoblastokat tartalmazza. Az éretlen hepatocyták és a hepatoblastok egyaránt expresszálják a dlk-1 proteint, míg a hepatoblastok a biliaris epithelsejtekké történı differenciálódásuk során ezt a képességüket fokozatosan elveszítik. Nem sokkal késıbb ugyanez a munkacsoport ismertette patkány májban az acetaminofluorén/partialis hepatectomia kísérletek során elıidézett oval sejtek dlk-1 pozitivitását, melyek CK-19 és AFP pozitivitást egyaránt mutattak, és magas proliferációs készséggel rendelkeztek (Tanimizu és mtsai 2004). Jensen és
76
munkacsoportja a máj regeneratórikus folyamataiban speciálisan jelenlévı proliferáló duktuláris sejtek dlk-1 pozitivitását írta le (Jensen és mtsai 2004). Vizsgálataink kezdetén nem találtunk adatot arra vonatkozóan, hogy human hepatoblastomában vizsgálták volna a dlk-1 fehérjeexpresszióját immunohisztokémiai módszerrel. A fenti adatok figyelembevételével tanulmányoztuk a dlk-1 protein expresszióját humán hepatoblastomában, hepatocellularis carcinomában (HCC) és eltérı szöveti differenciációt
mutató
egyéb,
differenciáldiagnosztikai
vonatkozású
daganatokban
immunhisztokémiai módszerrel és terveztük azok egymással való összehasonlítását. A hepatoblastoma eseteink mindegyike expresszálta a dlk-1 fehérjét. A dlk-1 protein a hepatoblastomáknak csak az epithelialis komponenseiben (embryonalis, fetalis) expresszálódott, a mesenchymalis elemek minden esetben negatívak voltak. Eseteink nagyrészében a dlk-1 festıdés fıként a daganatsejtek felszínére lokalizálódott, amely azt a tényt látszik igazolni, miszerint a dlk-1 protein egy nagy extracellularis doménnel rendelkezı transzmembrán protein. Habár az epithelialis komponensek közül a dlk-1 expresszió intenzitása az embryonalis komponensben erıteljesebb volt, az expresszió eloszlása nem mutatott összefüggést a hisztológiai szubtípussal. Közleményünket követıen jelent meg López-Terrada és mtsai (2009) tanulmánya, amely a Wnt és Notch jelátviteli utak aktivitásának a hepatoblastoma hisztológiai szubtípusaival való összefüggéseit taglalja. Ezek szerint a Wnt aktiváció a hepatoblastoma predominánsan embryonalis elemeket tartalmazó és kevert típusában, míg a Notch aktiváció (amely a cholangiocyta differenciációhoz szükséges) a hepatoblastoma tisztán fetalis szubtípusában volt fokozottabb. A dlk-1 protein az általuk vizsgált hepatoblastoma esetek mindegyikében expresszálódott, az embryonalis komponens dlk-1 expressziója azonban szignifikánsan magasabb volt a tisztán fetalis típus dlk-1 expressziójához képest. Fenti szerzık ezen megállapításását vizsgálataink nem támasztották alá. Ennek oka nem ismert. Hepatoblastoma eseteink mindegyikében kimutatható volt az AFP expresszió, melynek eloszlása nem mutatott átfedést a dlk-1 expressziójával. Megvizsgáltuk hepatocellularis carcinomákban is a dlk-1 fehérjeexpresszióját immunhisztokémiai módszerrel. Tanulmányunkban csupán egyetlen nem-típusos HCC esetben mutatkozott gyenge, focalis dlk-1 pozitivitás, mely AFP és CK-19 koexpressziót is mutatott. A fennmaradó HCC esetek mindegyike dlk-1 negatív volt. Lee és mtsai (2006) a közelmúltban olyan HCC szubtípust írtak le, amelynek génexpressziós profilja a fetalis hepatoblastokéval mutat átfedést és jellegzetességük az AFP és CK-19 koexpresszió. Érdekes megfigyelés, hogy a négy AFP és CK-19 koexpressziót mutató HCC eseteink közül
77
csak egyben láttunk dlk-1 pozitivitást. Felmerült, hogy esetünk esetleg a fent említett ritka HCC szubtípus közé tartozik, egyéb karakterisztikumok hiányában azonban ez csak feltételezés. Egyes szerzık (Huang és mtsai 2006) HCC-ben a dlk-1 emelkedett fehérje- és mRNS expresszióját találták. Más szerzık ehhez hasonló eredményeket kaptak (Jin és mtsai 2008). Luo és mtsai (2006) által végzett microarray alapú transzkripciós genomikus vizsgálat eredményeként a dlk-1 mRNS expressziója kiemelkedıen magasabb volt hepatoblastomában HCC-hez viszonyítva. A vizsgált hepatoblastomáknak azonban csak egy részében mutatkozott a DLK-1 gén fokozott aktivitása. Ennek okát nem magyarázzák. Eredményeink ezektıl való eltérése magyarázható egyrészt a módszertani különbségekkel (pl. kölönbözı antitestek alkalmazása), másrészt azzal, hogy a fehérje és a mRNS expresszió nem mindig korrelál egymással. Prokurat és mtsai (2002) az agresszívan viselkedı májdaganatoknak az idısebb gyermek- és fiatal felnıttkorban elıforduló ritka formáját írta le, melyet felépítı daganatsejtek morfológiailag a hepatoblastok és a hepatocyták közötti átmenetnek felelnek meg. A tumor, melyet AFP és nukleáris β-catenin pozitivitás jellemez, ennek megfelelıen az átmeneti májsejtes daganat (TLCT) elnevezést kapta. Saját gyakorlatban találkoztunk egy 16 éves leány hasonló morfológiát mutató májdaganatával. Habár a daganat fokozott HSA- és nukleáris β-catenin expressziót mutatott, az összes publikált TLCT esetekkel ellentétben immunhisztokémiailag AFP negatív volt, és a szérum AFP érték sem mutatott emelkedést. A daganatot diffúz és erıs dlk-1 pozitivitás jellemezte. A morfológiának az immunhisztokémiai eredményekkel való összevetése után a daganat hovatartozása nem volt egyértelmő számunkra (AFP negativitás), ezért kihagytuk a tanulmány által megvizsgált eseteket feltüntetı táblázatokból. Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy a dlk-1 kiválóan alkalmas a nehezen besorolható eseteknek a tipikus HCC-tıl való elkülönítésére. Pozitív
dlk-1
expresszió
mutatkozott
két
hepatoblastoma
esetünk
ismert
tüdıáttétjeiben is, amely azt mutatja, hogy a dlk-1 protein a hepatoblastoma metasztázisainak detektálásában is használható marker. A
dlk-1
protein
hepatoblastoma-specifikus
expressziójának
igazolására
megvizsgáltunk néhány olyan daganatot is, amelyek egy részérıl az irodalmi adatok alapján tudtuk,
hogy
dlk-1
negatívitás
jellemzi
ıket.
Másrészt
megvizsgáltunk
egyéb,
differenciáldiagnosztikai szempontból szóba kerülı egyéb daganatokat is (Wilms tumor, AFP pozitivitást mutató csírasejtes tumorok, ganglio/neuroblatoma, rhabdoid tumor, MPNST,
78
medulloblastoma, infantilis hemangioendothelioma és mesenchymalis hamartoma). A csírasejtes tumorokat az AFP pozitivitásuk alapján választottuk ki, amelyek esetében az AFP és a dlk-1 koexpressziót kívántuk tanulmányozni. Ezen daganatok dlk-1 negativitása, valamint a két markernek hepatoblastomában és HCC-ben látható eltérı eloszlása azt bizonyítja, hogy a két gén regulációja nem azonos. A ganglioneuroblastoma érett ganglionsejtjeit leszámítva (az irodalmi adatoknak megfelelıen) egyetlen daganat esetében sem mutatkozott dlk-1 pozitívitás. Megfigyelésünk támogatja azon feltételezésünket, mely szerint a dlk-1 protein alkalmas a hepatoblastomának elsısorban a hepatocellularis carcinomától, másodsorban néhány gyakrabban elıforduló szolíd gyermekkori malignus daganattól való elkülönítésére.
79
7. AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ EREDMÉNYEI, KÖVETKEZTETÉSEK
7.1. Human hepatoblastomában elsıként írtuk le a claudinok expresszióját. A hepatoblastoma epithelialis komponenseiben a vizsgált claudinok közül a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék fokozott jelenléte igazolódott. A CLDN-3, -4 és -7 nem mutatott értékelhetı pozitivitást. 7.2. A CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék a hepatoblastoma epithelialis komponensei közül a fetalis komponensben szignifikánsan magasabb expressziót mutattak az embryonalis komponenshez képest. Az embryonalis komponens (szórványos pozitivitást leszámítva) negatív volt. A Real Time RT-PCR vizsgálatok eredményei az immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeivel korreláltak. Mindez arra utal, hogy hepatoblastomában a CLDN-1 és CLDN-2 fehérjék differenciációs markernek tekinthetıek. 7.3. Hepatoblastomában a magasabb szöveti differenciáció fokozott CLDN-1 és CLDN-2 expresszióval és alacsonyabb proliferációs készséggel jár. Igazoltuk, hogy a magasabb szöveti differenciációt jelzı CLDN-1 és -2 expresszió és a sejtproliferáció között fordított összefüggés áll fenn. 7.4. A hepatoblastomák csaknem mindegyikében (14/13) kimutattuk a β-catenin nukleáris akkumulációját, melynek eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A kiválasztott esetek közül mind a fetalis, mind az embryonalis komponenst illetıen egy-egy esetben igazolódott a β-catenin génjében (3. exon) bekövetkezett pontmutáció. Mindez arra utal, hogy a Wnt/β-catenin jelátvitel károsodása a hisztológiai szubtípustól függetlenül játszik szerepet a hepatoblastoma patogenezisében. 7.5. Hepatoblastoma eseteink mindegyike expresszálta a dlk-1 fehérjét. Az expresszió eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A hepatocellularis carcinomák csaknem mindegyike (24/23) és a megvizsgált egyéb, differenciáldiagnosztikai vonatkozású daganatok is mind dlk-1 negatívak voltak. Fentiek alapján bizonyítottuk, hogy a dlk-1 protein alkalmas a hepatoblastomának
elsısorban
a
hepatocellularis
carcinomától
való
elkülönítésére,
expressziója így felhasználható a gyermekkori rosszindulatú hepatocellularis daganatok differenciáldiagnosztikájában.
80
8. ÖSSZEFOGLALÁS
A hepatoblastoma (HB) a csecsemıkor és a kisgyermekkor leggyakoribb rosszindulatú primer májdaganata. Etiológiája és kialakulásának mechanizmusa tisztázatlan. A claudinok (CLDN) a tight junction típusú sejtkapcsoló struktúrák felépítésében résztvevı proteinek, melyek megváltozott expressziós mintázata a carcinogenesis folyamatában nyomonkövethetı. A dlk-1 a máj organogenezisének kezdeti szakaszában, a fetalis májban is expresszálódó fehérje. Munkánk célja volt, hogy megvizsgáljuk a CLDN-1, -2, -3, -4, -7 és a hepatoblastokban fiziológiásan elıforduló dlk-1 fehérje expresszióját humán hepatoblastomák eltérı
differenciáltságú
epithelialis
(fetalis
és
embryonalis)
komponenseiben
immunhisztokémiai és Real Time RT-PCR módszerrel. Eredményeink és következtetéseink az alábbiak: 1. Elsıként írtuk le a CLDN-ok expresszióját HB-ban. A tumor epithelialis (fetalis/embryonalis) komponenseiben a vizsgált CLDN-ok közül a CLDN-1 és a CLDN-2 fehérjék fokozott jelenléte igazolódott. A CLDN-3, -4 és -7 reakciók nem mutattak értékelhetı pozitivitást. 2. A CLDN-1 és -2 fehérjék a HB epithelialis komponensei közül a fetalis komponensben szignifikánsan magasabb expressziót mutattak az embryonalis komponenshez képest. Az embryonalis komponens (szórványos pozitivitást leszámítva) negatív volt. A Real Time RT-PCR vizsgálatokkal hasonló eredményeket kaptunk. Mindez arra utal, hogy HB-ban a CLDN-1 és -2 fehérjék differenciációs markereknek tekinthetıek. 3. A magasabb szöveti differenciáció fokozott CLDN-1 és -2 expresszióval és alacsonyabb proliferációs készséggel jár. 4. A β-catenin nukleáris akkumulációját a HB-ák csaknem mindegyikében (14/13) kimutattuk, melynek eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A β-catenin génjében bekövetkezett pontmutáció mind a fetalis, mind az embryonalis komponensben egy-egy esetben igazolódott. Mindez arra utal, hogy a Wnt/βcatenin jelátvitel károsodása a hisztológiai szubtípustól függetlenül játszik szerepet a HB patogenezisében. 5. HB eseteink mindegyike expresszálta a dlk-1 fehérjét. Az expresszió eloszlása nem korrelált a hisztológiai szubtípussal. A típusosos hepatocellularis carcinomák (HCC) mindegyike és a megvizsgált egyéb daganatok is mind dlk-1 negatívak voltak. Fentiek alapján bizonyítottuk, hogy a dlk-1 protein alkalmas a HB-nak elsısorban a HCC-tıl való elkülönítésére, expressziója így felhasználható a gyermekkori rosszindulatú hepatocellularis daganatok elkülönítésében.
81
9. SUMMARY Hepatoblastoma (HB) is the most frequent malignant primary liver tumor in infancy and early childhood, with unknown etiology and mechanism of development. Claudins (CLDNs) are integral proteins of the cell junction structures, the tight junction and changes in the expression pattern of these proteins can be kept track of during the carcinogenetic process. Dlk-1 is a protein expressed in the early organogenetic, fetal phase of the liver. Our aim was to study the expression of CLDN-1, -2, -3, -4, -7 and dlk-1 in the epithelial (fetal and embryonal) components of human hepatoblastomas (HBs), using immunohistochemical and RT-PCR techniques. Results and conclusions: 1. We were the first to describe the expression of CLDNs in human HBs. In the epithelial HB components CLDN-1 and -2 were found to show significant expression, while CLDN-3, -4 and -7 showed only slight positivity. 2. CLDN-1 and -2 were markedly expressed in the fetal components as compared with the embryonal components, in which case negative expression was found (disregarding sporadical positivity). Similar results were obtained by Real Time RT-PCR analyses. These findings refer to the fact that CLDN-1 and -2 proteins appear to be the markers of differentiation in HBs. 3. Higher tissue differentiation is accompanied by enhanced CLDN-1, -2 expression and lower proliferative ability in HBs. 4. The nuclear accumulation of β-catenin was demonstrated in almost all our studied HB cases (14/13), the distribution of which did not show correlation with histological subtype. β-catenin gene point mutation was proved in certain cases in both the fetal and embryonal components. These findings refer to the fact that damage to the Wnt/β-catenin signalling plays role in the pathogenesis of HBs regardless of histological subtype. 5. All our HB cases expressed the dlk-1 protein. Distribution of the expression did not correlate with the histological subtype. All the studied tipical hepatocellular carcinoma (HCC) cases as well as all the other tumor cases showed dlk-1 negativity. Based on the above, we proved that the dlk-1 protein is suitable for differentiation between HB and first of all HCC. The expression of this protein can therefore be of value in the differential diagnostics of childhood malignant hepatocellular neoplasms.
82
10. IRODALOMJEGYZÉK Agarwal R, D’Souza T, Morin PJ. (2005) Claudin-3 and claudin-4 expression in ovarian epithelial cells enhances invasion and is associated with increased matrix metalloproteinase-2 activity. Cancer Res, 65: 7378-7385.
Allison RM, Willis RA. (1956) An ossifying embryonic mixed tumour of an infant’s liver. J Pathol Bacteriol, 72: 155–159.
Amasheh S, Meiri N, Gitter AH, Schoneberg T, Mankertz J, Schulzke JD, and Fromm M. (2002) Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. J Cell Sci, 115: 4969-4976.
Arsic D, Beasley SW, Sullivan MJ. (2007) Switched-on Sonic hedgehog: a gene whose activity extends beyond fetal development-to oncogenesis. J Paediatr Child Health, 6: 421-3.
Artavanis-Tsakonas S, Matsuno K, Fortini ME. (1995) Notch signaling. Science, 268: 225– 232.
Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. (1999) Notch signalling: cell fate control and signal integration in developmentt. Science, 284: 770–776.
Aster JC, Robertson ES, Hasserjian RP, Turner JR, Kieff E, Sklar J. (1997) Oncogenic form of NOTCH1 lacking either the primary binding site for RBP-Jn or nuclear localization sequences retain the ability to associate with RBP-Jn and activate transcription. J Biol Chem, 272: 11336– 11343.
Aung PP, Mitani Y, Sanada Y, Nakayama H, Matsusaki K, Yasui W. (2006) Differential expression of claudin-2 in normal human tissues and gastrointestinal carcinomas. Virchows Arch, 448: 428-434.
Awan S, Davenport M, Portmann B, Howard ER. (1996) Angiosarcoma of the liver in children. J Pediatr Surg, 31: 1729 –1732.
83
Badve S, Logdberg L, Lal A, de Davila MT, Greco MA, Mitsudo S, Saxena R. (2003) Small cells in hepatoblastoma lack ‘‘oval’’ cell phenotype. Mod Pathol, 16: 930–936.
Baladron V, Ruiz-Hidalgo MJ, Nueda ML, Diaz-Guerra MJ, Garcia-Ramirez JJ, Bonvini E, Gubina E, Laborda J. (2005) Dlk acts as a negative regulator of NOTCH1 activation through interactions with specific EGF-like repeats. Exp Cell Res, 303: 343–359.
Balkovetz DF. (2006) Claudins at the gate: determinants of renal epithelial tight junction paracellular permeability. Am J Physiol Renal Physiol, 290: 572-579.
Bello IO, Vilen ST, Niinimaa A, Kantola S, Soini Y, and Salo T. (2008) Expression of claudins 1, 4, 5, and 7 and occludin, and relationship with prognosis in squamous cell carcinoma of the tongue. Hum Pathol, 39: 1212-1220.
Besnard-Guérin C, Newsham I, Winqvist R, Cavenee WK. (1996) A common region of loss of heterozygosity in Wilms' tumor and embryonal rhabdomyosarcoma distal to the D11S988 locus on chromosome 11p15.5. Hum Genet, 97: 163-70.
Bisogno G, Pilz T, Perilongo G Ferrari A, Harms D, Ninfo V, Treuner J, Carli M. (2002) Undifferentiated sarcoma of the liver in childhood: A curable disease. Cancer, 94: 252–257.
Bläker H, Hofmann WJ, Rieker RJ, Penzel R, Graf M, Otto HF. (1999) Beta-catenin accumulation and mutation of the CTNNB1 gene in hepatoblastoma. Genes Chromosomes Cancer, 25: 399-402.
Blaumueller CM, Qi H, Zagouras P, Artavanis-Tsakonas S. (1997) Intracellular cleavage of Notch leads to a heterodimeric receptor on the plasma membrane. Cell, 90: 281– 291.
Borka K, Kaliszky P, Szabó E, Lotz G, Kupcsulik P, Schaff Zs, Kiss A. (2007) Claudin expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas. Virch Arch, 450: 549-557.
84
Brodeur GM, Howarth CB, Pratt CB Caces J, Hustu HO. (1981) Malignant germ cell tumors in 57 children and adolescents. Cancer, 48: 1890 –1898.
Brou C, Logeat F, Gupta N, Bessia C, LeBail O, Doedens JR, Cumano A, Roux P, Black RA, Israel A. (2000) A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrinmetalloprotease TACE. Mol. Cell, 5: 207– 216.
Buckley JD, Sather H, Ruccione K, Rogers PC, Haas JE, Henderson BE, Hammond GD. (1989) A case-control study of risk factors for hepatoblastoma: a report from the Childrens Cancer Study Group. Cancer, 64: 1169–1176.
Buendia MA. (2002) Genetic alterations in hepatoblastoma and hepatocellular carcinoma: common and distinctive aspects. Med Pediatr Oncol, 39: 530-5.
Capurro M, Wanless IR, Sherman M, Deboer G, Shi W, Miyoshi E, Filmus J. (2003) Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 125: 89-97.
Chao YC, Pan SH, Yang SC, Yu SL, Che TF, Lin CW, Tsai MS, Chang GC, Wu CH, Wu YY, Lee YC, Hong TM, Yang PC. (2009) Claudin-1 is a metastasis suppressor and correlates with clinical outcome in lung adenocarcinoma. Am J Respir Crit Care Med, 179: 123-133.
Cheung ST, Leung KL, Ip YC, Chen X, Fong DY, Ng IO, Fan ST, So S. (2005) Claudin-10 expression level is associated with recurrence of primary hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 11: 551-556.
Chiba H, Gotoh T, Kojima T, Satohisa S, Kikuchi K, Osanai M, Sawada N. (2003) Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morphology in F9 embryonal carcinoma cells. Exp Cell Res, 286: 288-297.
85
Costaglioli P, Come C, Knoll-Gellida A, Salles J, Cassagne C, Garbay B. (2001) The homeotic protein dlk is expressed during peripheral nerve development, FEBS Lett, 509: 413– 416.
Czauderna P, Otte J-B, Roebuck DJ (2006) Surgical treatment of hepatoblastoma in children. Pediatr Radiol 36: 187-191.
Das C.J., Dhingra S., Gupta A.K., Iyer V., Agarwala S. (2009) Imaging of paediatric liver tumours with pathological correlation. Clin Radiol, 64: 1015-1025.
Dhawan P, Singh AB, Deane NG, No Y, Shiou SR, Schmidt C, Neff J, Washington MK, Beauchamp RD. (2005) Claudin-1 regulates cellular transformation and metastatic behavior in colon cancer. J Clin Invest, 115: 1765-1776.
Dimashkieh HH, Mo JQ, Wyatt-Ashmead J, Collins MH. (2004) Pediatric hepatic angiosarcoma: Case report and review of the literature. Pediatr Dev Pathol, 7: 527–532.
Dos Reis PP, Bharadwaj RR, Machado J, MacMillan C, Pintilie M, Sukhai MA, PerezOrdonez B, Gullane P, Irish J, Kamel-Reid S. (2008) Claudin 1 overexpression increases invasion and is associated with aggressive histological features in oral squamous cell carcinoma. Cancer, 113: 3169-3180.
Ebnet K. (2008) Organization of multiprotein complexes at cell-cell junctions. Histochem Cell Biol, 130: 1-20.
Evans MJ, von Hahn T, Tscherne DM, Syder AJ, Panis M, Wolk B, Hatziioannou T, McKeating JA, Bieniasz PD, Rice CM. (2007) Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature 446: 801-805.
Exelby PR, Filler RM, Grosfeld JL (1975) Liver tumors in children in the particular reference to hepatoblastoma and hepatocellular carcinoma: American Academy of Pediatrics Surgical Section Survey–1974. J Pediatr Surg, 10: 329–337.
86
Fehon RG, Kooh PJ, Rebay I, Regan CL, Xu T, Muskavitch MA, Artavanis-Tsakonas A. (1990) Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell, 61: 523–534.
Felli MP, Maroder M, Mitsiadis MT, Campese AF, Bellavia D, Vacca A, Mann RS, Frati L, Lendahl U, Gulino A, Screpanti, I. (1999) Expression pattern of notch1, 2 and 3 and Jagged1 and 2 in lymphoid and stromal thymus components: 18 distinct ligand–receptorinteractions in intrathymic T cell development. Int Immunol, 11: 1017– 1025.
Feusner J, Plaschkes J. (2002) Hepatoblastoma and low birth weight: a trend or chance observation? Med Pediatr Oncol, 39: 508-9.
Fiegel HC, Glüer S, Roth B, Rischewski J, von Schweinitz D, Ure B, Lambrecht W, Kluth D. (2004) Stem-like cells in human hepatoblastoma. J Histochem Cytochem, 52: 1495-501.
Finegold MJ, Lopez-Terrada DH, Bowen J, Washington MK, Qualman SJ; College of American Pathologists. (2007) Protocol for the examination of specimens from pediatric patients with hepatoblastoma. Arch Pathol Lab Med, 131: 520-9.
Fletcher JA, Kozakewich HP, Pavelka K, Grier HE, Shamberger RC, Korf B, Morton CC. (1991) Consistent cytogenetic aberrations in hepatoblastoma: a common pathway of genetic alterations in embryonal liver and skeletal muscle malignancies? Genes Chromosomes Cancer, 3: 37–43.
Floridon V, Jensen CH, Thorsen P, Nielsen O, Sunde L, Westergaard JG, Thomsen SG, Teisner B. (2000) Does fetal antigen 1 (FA1) identify cells with regenerative, endocrine and neuroendocrine potentials? A study of FA1 in embryonic, fetal, and placental tissue and maternal circulation. Differentiation, 66: 49–59.
Folpe AL, Billings SD, McKenney JK, Walsh SV, Nusrat A, Weiss SW. (2002) Expression of claudin-1, a recently described tight junction-associated protein, distinguishes soft tissue perineurioma from potential mimics. Am J Surg Pathol, 26: 1620-1626.
87
Förster C. (2008) Tight junctions and the modulation of barrier function in disease. Histochem Cell Biol, 130: 55-70.
Fritzsche FR, Oelrich B, Johannsen M, Kristiansen I, Moch H, Jung K, Kristiansen G. (2008) Claudin-1 protein expression is a prognostic marker of patient survival in renal cell carcinomas. Clin Cancer Res, 14: 7035-7042.
Fujita K, Katahira J, Horiguchi Y, Sonoda N, Furuse M, Tsukita S. (2000) Clostridium perfringens enterotoxin binds to the second extracellular loop of claudin-3, a tight junction integral membrane protein. FEBS Lett, 476: 258-261.
Fukuzawa R, Heathcott R W , Morison I M , Reeve A E. (2005) Imprinting, expression, and localisation of DLK1 in Wilms tumours. J Clin Pathol, 58: 145–150.
Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S. (1998) Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol, 141: 1539-1550.
Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S. (1993) Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol, 123: 1777-1788.
Furuse M, Sasaki H, Tsukita S. (1999) Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands. J Cell Biol, 147: 891-903.
Garce´s C, Ruiz-Hidalgo MJ, Bonvini E, Goldstein J, Laborda J. (1999) Adipocyte differentiation is modulated by secreted delta-like (dlk) variants and requires the expression of membrane-associated dlk. Differentiation, 64: 103– 114.
González-Mariscal L, Betanzos A, Nava P, Jaramillo BE. (2003) Tight junction proteins. Prog Biophys Mol Biol, 81: 1-44.
González-Mariscal L, Lechuga S, Garay E. (2007) Role of tight junctions in cell proliferation and cancer. Prog Histochem Cytochem, 42: 1-57.
88
Górnicka B, Ziarkiewicz-Wróblewska B, Michalowicz B, Pawlak J, Wróblewski T, Krawczyk M, Wasiutyński A, Kappeler A, Zimmermann A. (2001) Immature hepatic tumour of bimodal differentiation in a young adult patient: a novel lesion expressing beta-catenin and mimicking a distinct phase of hepatogenesis. J Hepatol, 34: 955–961.
Gyırffy H, Holczbauer Á, Nagy P, Szabó Zs, Kupcsulik P, Páska Cs, Papp J, Schaff Zs, Kiss A. (2005) Claudin expression in Barrett's esophagus and adenocarcinoma. Virch Arch, 447: 961-968.
Haas JE, Feusner JH, Finegold MJ. (2001) Small cell undifferentiated histology in hepatoblastoma may be unfavorable. Cancer, 92: 3130–3134.
Haas JE, Muczynski KA, Krailo M, Ablin A, Land V, Vietti TJ, Hammond GD. (1989) Histopathology and prognosis in childhood hepatoblastoma and hepatocarcinoma. Cancer, 64: 1082–1095.
Halász J, Kovács M, Illyés G, Máttyus I, Szolnoki J, Szabó A, Verebély T, Schaff Z. (2004) Malignus rhabdoid tumor a májban. Orv Hetil, 145: 1439-43.
Hedlund GP, Carlsson HE, Shieck E, Nilsson I, Lundblad C, Arons S, Iversen AK, Looman C Jensen HE, Hau J. (2003) Fetal antigen 1 (FA1) in the adult rat adrenal gland, ovary and pituitary gland. In Vivo, 17: 1–4.
Heifetz SA, French M, Correa M, Grosfeld JL. (1997) Hepatoblastoma: the Indiana experience with preoperative chemotherapy for inoperable tumours: clinicopathological considerations. Pediatr Pathol Lab Med, 17: 857–874.
Hewitt KJ, Agarwal R, Morin PJ. (2006) The claudin gene family: expression in normal and neoplastic tissues. BMC Cancer, 6: 186.
89
Higashi Y, Suzuki S, Sakaguchi T, Nakamura T, Baba S, Reinecker HC, Nakamura S, Konno H. (2007) Loss of claudin-1 expression correlates with malignancy of hepatocellular carcinoma. J Surg Res, 139: 68-76.
Hirohashi S, Kanai Y. (2003) Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci, 94: 575-581.
Hirschman BA, Pollock BH, Tomlinson GE. (2005) The spectrum of APC mutations in children with hepatoblastoma from familial adenomatous polyposis kindreds. J Pediatr, 147: 263-6.
Horta BL, Victora CG, Menezes AM, Halpern R, Barros FC. (1997) Low birthweight, preterm births and intrauterine growth retardation in relation to maternal smoking. Paediatr Perinat Epidemiol, 11: 140–151.
Hsiao CC, Huang CC, Sheen JM Tai MH, Chen CM, Huang LL, Chuang JH. (2005) Differential expression of delta-like gene and protein in neuroblastoma, ganglioneuroblastoma and ganglioneuroma. Mod Pathol, 18: 665-662.
Huang CC, Chuang JH, Huang LL, Chou MH, Wu CL, Chen CM, Hsieh CS, Lee SY, Chen CL. (2004) The human Delta-like 1 homologue is implicated in the progression of liver fibrosis in biliary atresia. J Pathol, 202: 172–179.
Huang J, Zhang X, Zhang M, Zhu JD, Zhang YL, Lin Y, Wang KS, Qi XF, Zhang Q, Liu GZ, Yu J, Cui Y, Yang PY, Wang ZQ, Han ZG. (2007) Up-regulation of DLK1 as an imprinted gene could contribute to human hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis, 5: 1094-103.
Hughes LJ, Michels VV. (1992) Risk of hepatoblastoma in familial adenomatous polyposis. Am J Med Genet, 43: 1023–1025.
Ikeda H, Hachitanda Y, Tanimura M, Maruyama K, Koizumi T, Tsuchida Y. (1998) Development of unfavorable hepatoblastoma in children of very low birth weight: results of a surgical and pathologic review. Cancer, 82: 1789–1796.
90
Ikeda H, Matsuyama S, Tanimura M. (1997) Association between hepatoblastoma and very low birth weight: a trend or a chance? J Pediatr, 130: 557-60.
Ikenouchi J, Furuse M, Furuse K, Sasaki H, Tsukita Sa, Tsukita Sh. (2005) Tricellulin constitutes a novel barrier at tricellular contacts of epithelial cells. J Cell Biol, 171: 939-945.
Ikeuchi T, Sisodia SS. (2003) The Notch ligands, Delta1 and Jagged2, are substrates for presenilin-dependent „gamma-secretase” cleavage. J Biol Chem, 278: 7751– 7754.
Inagawa S, Itabashi M, Adachi S, Kawamoto T, Hori M, Shimazaki J, Yoshimi F, Fukao K.(2002) Expression and prognostic roles of beta-catenin in hepatocellular carcinoma: correlation with tumor progression and postoperative survival.Clin Cancer Res,8: 450-6.
Itoh M, Furuse M, Morita K, Kubota K, Saitou M, Tsukita S. (1999) Direct binding of three tight junction-associated MAGUKs, ZO-1, ZO-2, and ZO-3, with the COOH termini of claudins. J Cell Biol, 147: 1351-1363.
Ivanov AI, Nusrat A, Parkos CA. (2004) Endocytosis of epithelial apical junctional proteins by a clathrin-mediated pathway into a unique storage compartment. Mol Biol Cell, 15: 176188.
Jelnes P, Santoni-Rugiu E, Rasmussen M, Friis SL, Nielsen JH, Tygstrup N, Bisgaard HC. (2007) Remarkable phenotypic heterogeneity displayed by oval cells in rat and mouse models of stem cell-mediated liver regeneration. Hepatology, 45: 1462–147.
Jensen CH, Erb K, Westergaard LG, Kliem A, Teisner B. (1999) Fetal antigen 1, an EGF multidomain protein in the sex hormone-producing cells of the gonads and the microenvironment of germ cells. Mol Hum Reprod, 5: 908–913.
Jensen CH, Krogh TN, Højrup P, Clausen PP, Skjødt K, Larsson LI, Enghild JJ, Teisner B. (1994) Protein structure of fetal antigen 1. A novel circulating human epidermal-growth-
91
factor-like protein expressed in neuroendocrine tumors and its relation of the gene products dlk and pG2. Eur J Biochem, 225: 83–92.
Jensen CH, Meyer M, Schroder HD, Kliem A, Zimmer J, Teisner B. (2001) Neurons in the monoaminergic nuclei of the rat and human central nervous system express FA1/dlk. Neuroreport, 12: 3959–3963.
Jensen, C.H., Jauho, E.I., Santoni-Rugiu, E., Holmskov, U., Teisner, B., Tygstrup, N., Bisgaard, H.C. (2004) Transit-amplifying ductular (oval) cells and their hepatocytic progeny are characterized by a novel and distinctive expression of delta-like protein/preadipocyte factor 1/fetal antigen 1. Am. J. Pathol, 164: 1347–1359.
Jin ZH, Yang RJ, Dong B, Xing BC. (2008) Progenitor gene DLK1 might be an independent prognostic factor of liver cancer. Expert Opin Biol Ther, 8: 371-7.
Karnik P, Chen P, Paris M, Yeger H, Williams BR. (1998) Loss of heterozygosity at chromosome 11p15 in Wilms tumors: identification of two independent regions. Oncogene, 17: 237-40.
Katahira J, Inoue N, Horiguchi Y, Matsuda M, Sugimoto N. (1997) Molecular cloning and functional characterization of the receptor for Clostridium perfringens enterotoxin. J Cell Biol, 136: 1239-1247.
Katoh M, Katoh M. (2003) CLDN23 gene, frequently down-regulated in intestinal-type gastric cancer, is a novel member of claudin gene family. Int J Mol Med, 11: 683-689.
Kenney LB, Miller BA, Ries LA, Nicholson HS, Byrne J, Reaman GH. (1998) Incidence of cancer in infants in the U.S.: 1980–1990. Cancer, 82: 1396 –1400.
Kemény V, Méder Ü, Babosa M, Kontor E, Hajmássy Zs, Schaff Zs. (2000) Gyermekkori májtumor Magyarországon: két rendhagyó eset. Magyar Onkológia 44: 271 –274.
92
Kimberly WT, Esler WP, Ye W, Ostaszewski BL, Gao J, Diehl T, Selkoe DJ, Wolfe MS. (2003) Notch and the amyloid precursor protein are cleaved by similar gamma-secretase(s), Biochemistry, 42: 137– 144.
Kiss A, Szepesi A, Nagy P, Schaff Zs. (1998) Expression of transforming growth factor alpha in hepatoblastoma. Cancer, 83: 690- 7.
Koch A, Denkhaus D, Albrecht S, Leuschner I, von Schweinitz D, Pietsch T. (1999) Childhood hepatoblastomas frequently carry a mutated degradation targeting box of the betacatenin gene. Cancer Res, 59: 269-73.
Kominsky SL, Argani P, Korz D, Evron E, Raman V, Garrett E, Rein A, Sauter G, Kallioniemi OP, Sukumar S. (2003) Loss of the tight junction protein claudin-7 correlates with histological grade in both ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast. Oncogene, 22: 2021-2033.
Laborda J. (2000) The role of the epidermal growth factor-like protein dlk in cell differentiation. Histol Histopathol, 15: 119–129.
Laborda J, Sausville EA, Hoffman T, Notario V. (1993) Dlk: a putative mammalian homeotic gene differentially expressed in small cell lung carcinoma and 43 neuroendocrine tumor cell line. J Biol Chem, 268: 3817– 3820.
Lack EE, Neave C, Vawter GF. (1982) Hepatoblastoma. A clinical and pathologic study of 54 cases. Am J Surg Pathol, 6: 693–705.
Landers KA, Samaratunga H, Teng L, Buck M, Burger MJ, Scells B, Lavin MF, Gardiner RA. (2008) Identification of claudin-4 as a marker highly overexpressed in both primary and metastatic prostate cancer. Br J Cancer, 99: 491-501.
Länger F, Stickel J, Tessema M, Kreipe H, Lehmann U. (2004) Overexpression of delta-like (Dlk) in a subset ofmyelodysplastic syndrome bone marrow trephines. Leuk. Res, 28: 1081– 1083.
93
Lee SK, Moon J, Park SW, Song SY, Chung JB, Kang JK. (2005) Loss of the tight junction protein claudin 4 correlates with histological growth-pattern and differentiation in advanced gastric adenocarcinoma. Oncol Rep, 13: 193-199.
Lee JS, Heo J, Libbrecht L, Chi I, Kaposi-Novák P, Calvisi DF, Mikaelyan A, Roberts LR, Demetris AJ, Sun Z, Nevens F, Roskams T, Thorgeirsson SS. (2006) A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat Med, 12: 410–416.
Leotlela PD, Wade MS, Duray PH, Rhode MJ, Brown HF, Rosenthal DT, Dissanayake SK, Earley R, Indig FE, Nickoloff BJ, Taub DD, Kallioniemi OP, Meltzer P, Morin PJ, Weeraratna AT. (2007) Claudin-1 overexpression in melanoma is regulated by PKC and contributes to melanoma cell motility. Oncogene, 26: 3846-3856.
Libbrecht L, Desmet V, Roskams T. (2003) Stages of normal and aberrant intrahepatic bile duct development in a mixed hepatoblastoma. Histopathology, 42: 618–620.
Li L, Forman SJ, Bhatia R. (2005) Expression of DLK1 in hematopoietic cells results in inhibition of differentiation and proliferation. Oncogene, 24: 4472–4476.
Lioni M, Brafford P, Andl C, Rustgi A, El-Deiry W, Herlyn M, Smalley KSM. (2007) Dysregulation of claudin-7 leads to loss of E-cadherin expression and the increased invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells. Am J Pathol, 170: 709-721.
Lippoldt A, Kniesel U, Liebner S, Kalbacher H, Kirsch T, Wolburg H, and Haller H. (2000) Structural alterations of tight junctions are associated with loss of polarity in stroke-prone spontaneously hypertensive rat blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res, 885: 251-261
Lippoldt A, Liebner S, Andbjer B, Kalbacher H, Wolburg H, Haller H, and Fuxe K. (2000) Organization of choroid plexus epithelial and endothelial cell tight junctions and regulation of claudin-1, -2 and -5 expression by protein kinase C. Neuroreport, 11: 1427-1431
94
Lódi Cs, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Szijártó A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Paku S, Illyés Gy, Kiss A, Schaff Zs. (2006) Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas. Mod Pathol, 19: 460-469.
López-Terrada Dolores, Preethi H. Gunaratne, Adekunle M. Adesina MD, Joseph Pulliam, David M. Hoang, Yummy Nguyen, Toni-AnnMistretta, JudithMargolin, Milton J. Finegold. (2009) Histologic subtypes of hepatoblastoma are characterized by differential canonical Wnt and Notch pathway activation in DLK+ precursors. Hum Pathol, 6: 783-94.
Luo JH, Ren B, Keryanov S, Tseng GC, Rao UN, Monga SP, Strom S, Demetris AJ, Nalesnik M, Yu YP, Ranganathan S, Michalopoulos GK. (2006) Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology, 44: 1012-24.
Mannens M, Hoovers JM, Redeker E, Verjaal M, Feinberg AP, Little P, Boavida M, Coad N, Steenman M, Bliek J. (1994) Parental imprinting of human chromosome region 11p15.3-pter involved in the Beckwith-Wiedemann syndrome and various human neoplasia. Eur J Hum Genet, 2:3-23.
Matsuda M, Kubo A, Furuse M, Tsukita S. (2004) A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells. J Cell Sci, 117: 1247-1257.
Matter K, Balda MS. (2003) Signalling to and from tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol, 4: 225-236.
McClane BA, McDonel JL. (1979) The effects of Clostridium perfringens enterotoxin on morphology, viability, and macromolecular synthesis in Vero cells. J Cell Physiol, 99: 191200.
Melamed I, Bujanover Y, Hammer J, Spirer Z. (1982) Hepatoblastoma in an infant born to a mother after hormonal treatment for sterility. N Engl J Med, 307: 820.
95
Michl P, Buchholz M, Rolke M, Kunsch S, Löhr M, McClane B, Tsukita S, Leder G, Adler G, Gress TM. (2001) Claudin-4: A new target for pancreatic cancer treatment using Clostridium perfringens enterotoxin. Gastroenterology, 121: 678-684.
Michl P, Barth C, Buchholz M, Lerch MM, Rolke M, Holzmann KH, Menke A, Fensterer H, Giehl K, Lohr M, Leder G, Iwamura T, Adler G, Gress TM. (2003) Claudin-4 expression decreases invasiveness and metastatic potential of pancreatic cancer. Cancer Res, 63: 62656271.
Michikawa H, Fujita-Yoshigaki J, and Sugiya H. (2008) Enhancement of barrier function by overexpression of claudin-4 in tight junctions of submandibular gland cells. Cell Tissue Res, 334: 255-264.
Mitic LL, Anderson JM. (1998) Molecular architecture of tight junctions. Annu Rev Physiol, 60: 121-142.
Mitic LL, Van Itallie CM, Anderson JM. (2000) Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions I. Tight junction structure and function: lessons from mutant animals and proteins. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 279: 250-254.
Miwa N, Furuse M, Tsukita S, Niikawa N, Nakamura Y, Furukawa Y. (2000) Involvement of claudin-1 in the beta-catenin/Tcf signaling pathway and its frequent upregulation in human colorectal cancers. Oncol Res, 12: 469-476.
Moldvay J, Jackel M, Páska Cs, Soltész I, Schaff Zs, Kiss A. (2007) Distinct claudin expression profile in histologic subtypes of lung cancer. Lung Cancer, 57: 159-167.
Morita K, Furuse M, Fujimoto K, Tsukita S. (1999) Claudin multigene family encoding fourtransmembrane domain protein components of tight junction strands. Proc Natl Acad Sci USA, 96: 511-516.
Multerys M, Goodman MT, Smith MA et al. In: Ries LAG, Smith MA, Gurney JG et al, eds. Cancer Incidence, Survival among Children, Adolescents: United States SEER Program
96
1975–1995. Hepatic Tumors. Bethesda, MD: National Cancer Institute, 1999: 91-97, SEER Program, NIH Pub. No 99–4649.
Németh J, Németh Z, Tátrai P, Péter I, Somorácz A, Szász AM, Kiss A, Schaff Z. (2009) High Expression of Claudin-1 Protein in Papillary Thyroid Tumor and its Regional Lymph Node Metastasis. Pathol Oncol Res, (Epub ahead of print).
Nicol K, Savell V, Moore J, Teot L, Spunt SL, Qualman S; Children's Oncology Group, Soft Tissue Sarcoma Committee. (2007) Distinguishing undifferentiated embryonal sarcoma of the liver from biliary tract rhabdomyosarcoma: A Children’s Oncology Group study. Pediatr Dev Pathol, 10: 89 –97. Nishino R, Honda M, Yamashita T, Takatori H, Minato H, Zen Y, Sasaki M, Takamura H, Horimoto K, Ohta T, Nakanuma Y, Kaneko S. (2008) Identification of novel candidate tumour marker genes for intrahepatic cholangiocarcinoma. J Hepatol, 49: 207-216.
Nishimura M, Kaltizaki M, Ono Y, Morimoto K, Takeuchi M, Inoue Y, Imai T, Takayi Y. (2002) JEAP, a novel component of tight junctions in exocrine cells. J Biol Chem, 277: 55835587.
Oliveira SS, Morgado-Diaz JA. (2007) Claudins: multifunctional players in epithelial tight junctions and their role in cancer. Cell Mol Life Sci, 64: 17-28.
Ortega JA, Douglass EC, Feusner JH, Reynolds M, Quinn JJ, Finegold MJ, Haas JE, King DR, Liu-Mares W, Sensel MG, Krailo MD. (2000) Randomized comparison of cisplatin/vincristine/fluorouracil and cisplatin/ continuous infusion doxorubicin for treatment of pediatric hepatoblastoma: a report from the Children's Cancer Group and the Pediatric Oncology Group. J Clin Oncol, 18: 2665–2675.
Paku S, Nagy P, Kopper L, Thorgeirsson SS. (2004) 2-acetylaminofluorene dose-dependent differentiation of rat oval cells into hepatocytes: confocal and electron microscopic studies. Hepatology, 39: 1353-61.
97
Park WS, Oh RR, Park JY, Kim PJ, Shin MS, Lee J. (2001) Nuclear localization of betacatenin is an important prognostic factor in hepatoblastoma. J Pathol, 193: 483-90.
Paulsen M, Takada S, Youngson NA, Benchaib M, Charlier C, Segers K, Georges M, Ferguson-Smith AC. (2001) Comparative sequence analysis of the imprinted Dlk1-Gtl2 locus in three mammalian species reveals highly conserved genomic 25 elements and refines comparison with the Igf2-H19 region. Genome Res, 11: 2085–2094.
Perilongo G, Dall'Igna P, Sainati L. (2002) Modern treatment of childhood hepatoblastoma: what do clinicians and pathologists have to say to each other? Med Pediatr Oncol, 39: 474-7.
Perilongo G, Shafford E, Maibach R, Aronson D, Brugières L, Brock P, Childs M, Czauderna P, MacKinlay G, Otte JB, Pritchard J, Rondelli R, Scopinaro M, Staalman C, Plaschkes J; International Society of Paediatric Oncology-SIOPEL 2. (2004) Risk-adapted treatment for childhood hepatoblastoma. final report of the second study of the International Society of Paediatric Oncology--SIOPEL 2. Eur J Cancer, 40: 411-21.
Pritchard J; Brown J; Shafford E; Perilongo G; Brock P; Dicks-Mireaux C; Keeling J; Phillips A; Vos A; Plaschkes J (2000) Cisplatin, doxorubicin, and delayed surgery for childhood hepatoblastoma: a successful approach—results of the first prospective study of the International Society of Pediatric Oncology. J Clin Oncol, 18: 3819–3828.
Prokurat A, Kluge P, Kosciesza A. (2002) Transitional liver cell tumours (TLCT) in older children and adolescents: a novel group of agressive hepatic tumours expressing beta-catenin. Med Pediatr Oncol, 39: 510–518.
Quinn JJ, Altman AJ, Robinson HT, Cooke RW, Hight DW,. Foster JH. (1985) Adriamycin and cisplatin for hepatoblastoma. Cancer, 56: 1926–1929.
Rahner C, Mitic LL, Anderson JM. (2001) Heterogeneity in expression and subcellular localization of claudins 2, 3, 4, and 5 in the rat liver, pancreas, and gut. Gastroenterology, 120: 411-422.
98
Rangel LB, Agarwal R, D’Souza T, Pizer ES, Alo PL, Lancaster WD, Gregoire L, Schwartz DR, Cho KR, Morin PJ. (2003) Tight junction proteins claudin-3 and frequently overexpressed in ovarian cancer but not in ovarian cystadenomas. Clin Cancer Res, 9: 25672575.
Rangel LB, Agarwal R, D’Souza T, Pizer ES, Alo PL, Lancaster WD, Gregoire L, Schwartz DR, Cho KR, Morin PJ. (2003) Tight junction proteins claudin-3 and claudin-4 are frequently overexpressed in ovarian cancer but not in ovarian cystadenomas. Clin Cancer Res, 9: 25672575.
Reya T, Clevers H. (2005) Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature, 434: 843-50.
Reynolds P, Urayama KY, Von Behren J, Feusner J. (2004) Birth characteristics and hepatoblastoma risk in young children. Cancer, 100: 1070-6.
Resnick MB, Konkin T, Routhier J, Sabo E, Pricolo VE. (2005) Claudin-1 is a strong prognostic indicator in stage II colonic cancer: a tissue microarray study. Mod Pathol, 18: 511-8.
Roebuck D.J., Perilongo G. (2006) Hepatoblastoma: an oncological review. Pediatr Radiol, 36: 183–186.
Roskams TA, Theise ND, Balabaud C, Bhagat G, Bhathal PS, Bioulac-Sage P, Brunt EM, Crawford JM, Crosby HA, Desmet V, Finegold MJ, Geller SA, Gouw AS, Hytiroglou P, Knisely AS, Kojiro M, Lefkowitch JH, Nakanuma Y, Olynyk JK, Park YN, Portmann B, Saxena R, Scheuer PJ, Strain AJ, Thung SN, Wanless IR, West AB. (2004) Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology, 39: 1739–1745.
Ruck P, Xiao JC, Pietsch T, Von Schweinitz D, Kaiserling E. (1997) Hepatic stem-like cells in hepatoblastoma: expression of cytokeratin 7, albumin and oval cell associated antigens detected by OV-1 and OV-6. Histopathology, 31: 324–329.
99
Sakamoto LH, de Camargo B, Cajaiba M, Soares FA, Vettore AL. (2009) MT1G hypermethylation: a potential prognostic marker for hepatoblastoma. Pediatr Res, (Epub ahead of print).
Sanada Y, Oue N, Mitani Y, Yoshida K, Nakayama H, Yasui W. (2006) Downregulation of the claudin-18 gene, identified through serial analysis of gene expression data analysis, in gastric cancer with an intestinal phenotype. J Pathol, 208: 633-642.
Sanders RP, Furman WL. (2006) Familial adenomatous polyposis in two brothers with hepatoblastoma: implications for diagnosis and screening. Pediatr Blood Cancer, 47: 851-4.
Santoni-Rugiu E, Jelnes P, Thorgeirsson SS, Bisgaard HC (2005) Progenitor cells in liver regeneration: molecular responses controlling their activation and expansion. APMIS, 113: 876–902.
Sattler B, Gunawan B, Lorf T, Müller D, Ringe B, Füzesi L. (2000) Undifferentiated smallcell hepatoblastoma. Pathologe, 21: 456-9.
Sawada N, Murata, M, Kikuchi K, Osanai M, Tobioka H, Kojima T, Chiba H. (2003) Tight junctions and human diseases. Med Electron Microsc, 36: 147-156.
Saxena R, Leake JL, Shafford EA, Davenport M, Mowat AP, Pritchard J, Mieli-Vergani G, Howard ER, Spitz L, Malone M. (1993) Chemotherapy effects on hepatoblastoma. A histological study. Am J Surg Pathol, 17: 1266–1271.
Shen L, Weber CR, Turner JR. (2008) The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. J Cell Biol, 181: 683-695.
Shimizu K, Chiba S, Kumano K, Hosoya N, Takahashi T, Kanda Y, Hamada Y, Yazaki Y, Hirai H. (1999) Mouse jagged1 physically interacts with notch2 and other notch receptors. Assessment by quantitative methods. J Biol Chem, 274: 32961– 32969.
100
Shimizu K, Chiba S, Saito T, Kumano K, Hirai H. (2000) Physical interaction of Delta1, Jagged1, and Jagged2 with Notch1 and Notch3 receptors. Biochem Biophys Res Commun, 276: 385-9.
Siddiqui MA, McKenna BJ. (2006) Hepatic mesenchymal hamartoma: A short review. Arch Pathol Lab Med, 130: 1567–1569.
Simon DB, Lu Y, Choate KA, Velazquez H, Al-Sabban E, Praga M, Casari G, Bettinelli A, Colussi G, Rodriguez-Soriano J, McCredie D, Milford D, Sanjad S, Lifton RP. (1999) Paracellin-1, a renal tight junction protein required for paracellular Mg2+ resorption. Science 285: 103-106.
Smas, C.M., Sul, H.S. (1993) Pref-1, a protein containing EGF-like repeats, inhibits adipocyte differentiation. Cell, 73: 725–734.
Smas CM, Sul HS. (1997) Molecular mechanisms of adipocyte differentiation and inhibitory action of pref-1, Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 7: 281–298.
Smith J.J, Deane NG, Dhawan P, Beauchamp RD. (2008) Regulation of metastasis in colorectal adenocarcinoma: A collision between development and tumor biology. Surgery, 144: 353-366.
Sobel G, Németh J, Kiss A, Lotz G, Szabó I, Udvarhelyi N, Schaff Z, Páska C. (2006) Claudin 1 differentiates endometrioid and serous papillary endometrial adenocarcinoma. Gynecol Oncol, 103: 591-598.
Sobel G, Szabó I, Páska C, Kiss A, Kovalszky I, Kádár A, Paulin F, Schaff Z. (2005) Changes of cell adhesion and extracellular matrix (ECM) components in cervical intraepithelial neoplasia. Pathol Oncol Res, 11: 26-31.
Song X, Li X, Tang Y, Chen H, Wong B, Wang J, Chen M. (2008) Expression of claudin-2 in the multistage process of gastric carcinogenesis. Histol Histopathol 23: 673-682.
101
Soini Y, Tommola S, Helin H, Martikainen P. (2006) Claudins 1, 3, 4 and 5 in gastric carcinoma, loss of claudin expression associates with the diffuse subtype. Virchows Arch, 448: 52-58.
Soini Y and Talvensaari-Mattila A. (2006) Expression of claudins 1, 4, 5, and 7 in ovarian tumors of diverse types. Int J Gynecol Pathol, 25: 330-335.
Soini Y. (2005) Expression of claudins 1, 2, 3, 4, 5 and 7 in various types of tumours. Histopathology, 46: 551-560.
Steenman M, Tomlinson G, Westerveld A, Mannens M. (1999) Comparative genomic hybridization analysis of hepatoblastomas: additional evidence for a genetic link with Wilms tumor and rhabdomyosarcoma. Cytogenet Cell Gene, 86: 157–161.
Stocker JT, Ishak KG. Undifferentiated (embryonal) sarcoma of the liver: report of 31 cases. (1978) Cancer, 42: 336-348.
Sukumar S and Kominsky SL. Claudins as markers for early detection, diagnosis, prognosis and as targets of therapy for breast cancer (JHU Ref. DM-3995). Johns Hopkins Medicine. Technology Licencing Opportunities. 2003.
Takada S, Tevendale M, Baker J, Georgiades P, Campbell E, Freeman T, Johnson MH, Paulsen M, Ferguson-Smith AC. (2000) Delta like and Gtl2 are reciprocally expressed, differentially methylated linked imprinted genes on mouse 39 chromosome 12. Curr Biol, 10: 1135– 1138.
Takaki Y, Hirai S, Manabe N, Izumi Y, Hirose T, Nakaya M, Suzuki A, Mizuno K, Akimoto K, Tsukita S, Shuin T, Ohno S. (2001) Dynamic changes in protein components of the tight junction during liver regeneration. Cell Tissue Res, 305: 399-409.
Takala H, Saarnio J, Wiik H, and Soini Y. (2007) Claudins 1, 3, 4, 5 and 7 in esophageal cancer: loss of claudin 3 and 4 expression is associated with metastatic behavior. APMIS, 115: 838-847.
102
Takayasu H, Horie H, Hiyama E, Matsunaga T, Hayashi Y, Watanabe Y, Suita S, Kaneko M, Sasaki F, Hashizume K, Ozaki T, Furuuchi K, Tada M, Ohnuma N, Nakagawara A. (2001) Frequent deletions and mutations of the beta-catenin gene are associated with overexpression of cyclin D1 and fibronectin and poorly differentiated histology in childhood hepatoblastoma. Clin Cancer Res, 7: 901-908.
Tan X, Yuan Y, Zeng G, Apte U, Thompson MD, Cieply B, Stolz DB, Michalopoulos GK, Kaestner KH, Monga SP. (2008) Beta-catenin deletion in hepatoblasts disrupts hepatic morphogenesis and survival during mouse development. Hepatology, 47: 1667-79.
Taniguchi K, Roberts LR, Aderca IN, Dong X, Qian C, Murphy LM, Nagorney DM, Burgart LJ, Roche PC, Smith DI, Ross JA, Liu W. (2002) Mutational spectrum of beta-catenin, AXIN1, and AXIN2 in hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Oncogene, 21: 486371.
Tanimizu, N., Nishikawa, M., Saito, H., Tsujimura, T., Miyajima, A. (2003) Isolation of hepatoblasts based on the expression of Dlk/Pref-1. J. Cell Sci, 116: 1775–1786.
Tanimizu N, Tsujimura T, Takahide K, Kodama T, Nakamura K, Miyajima A. (2004). Expression of Dlk/Pref-1 defines a subpopulation in the oval cell compartment of rat liver. Gene Expr Patterns, 5: 209-18.
Tanimizu N, Miyajima A. (2004) Notch signaling controls hepatoblast differentiation by altering the expression of liver-enriched transcription factors. J Cell Sci, 117: 3165–3174.
Tanimura M, Matsui I, Abe J, Ikeda H, Kobayashi N, Ohira M, Yokoyama M, Kaneko M. (1998) Increased risk of hepatoblastoma among immature children with a lower birth weight. Cancer Res, 58: 3032-5.
Tobioka H, Isomura H, Kokai Y, Tokunaga Y, Yamaguchi J, Sawada N. (2004) Occludin expression decreases with the progression of human endometrial carcinoma. Hum Pathol, 35: 159-164. 103
Tomlinson GE, Finegold MJ. Tumors of the liver. In: Pizzo PA, Poplack DG, eds. Principles and Practice of Pediatric Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa: Lippincott Williams & Wilkins; 2002: 847–865.
Tornehave D, Jansen P, Teisner B, Rasmussen HB, Chemnitz J, Moscoso G. (1996) FA1 immunoreactivity in endocrine tumors and during development of the human fetal pancreas: negative correlation with glucagon expression. Histochem Cell Biol, 106: 535–542.
Tıkés AM, Kulka J, Paku S, Szik A, Páska C, Novák PK, Szilák L, Kiss A, Bögi K, Schaff Zs. (2005) Claudin-1, -3 and -4 proteins and mRNA expression in benign and malignant breast lesions: a research study. Breast Cancer Res, 7: 296-305.
Tsukita S, Furuse M. (1999) Occludin and claudins in tight-junction strands: leading or supporting players? Trends Cell Biol, 9: 268-273.
Tsukita S, Furuse M, Itoh M. (2001) Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 285-293.
Tsukita S, Furuse M. (2000) Pores in the wall: claudins constitute tight junction strands containing aqueous pores. J Cell Biol, 149: 13-16.
Tsukita S, Yamazaki Y, Katsuno T, Tamura A, Tsukita S. (2008) Tight junction-based epithelial microenvironment and cell proliferation. Oncogene, 27: 6930-6938.
Turányi E, Dezsı K, Paku S és Nagy P. (2009) DLK is a novel immunohistochemical marker for adrenal gland tumors. Virchows Arch, 455: 295–299.
Turksen K, Troy TC. (2004) Barriers built on claudins. J Cell Sci, 117: 2435-2447.
Udatsu Y., Kusafuka T., Kuroda S., Miao J., Okada A. (2000) High frequency of β-catenin mutations in hepatoblastoma. Pediatr Surg Int, 17: 508-512.
104
Usami Y, Chiba H, Nakayama F, Ueda J, Matsuda Y, Sawada N, Komori T, Ito A, and Yokozaki H. (2006) Reduced expression of claudin-7 correlates with invasion and metastasis in squamous cell carcinoma of the esophagus. Hum Pathol, 37: 569-577.
Van Grevenstein WM, Hofland LJ, Jeekel J, van Eijck CH. (2006) The expression of adhesion molecules and the influence of inflammatory cytokines on the adhesion of human pancreatic carcinoma cells to mesothelial monolayers. Pancreas, 32: 396-402.
Van Limpt VA, Chan AJ, Van Sluis PG, Caron HN, Van Noesel CJ, Versteeg R. (2003) High delta-like 1 expression in a subset of neuroblastoma cell lines corresponds to a differentiated chromaffin cell type. Int. J. Cancer, 105: 61–69.
Van Tornout JM, Buckley JD, Quinn JJ, Feusner JH, Krailo MD, King DR, Hammond GD, Ortega JA. (1997) Timing and magnitude of decline in alpha-fetoprotein levels in treated children with unresectable or metastatic hepatoblastoma are predictors of outcome: a report from the Children’s Cancer Group. J Clin Oncol, 15: 1190–7.
Verma M, Agarwal S, Mohta A. (2003) Primary mixed germ cell tumour of the liver-a case report. Indian J Pathol Microbiol, 46: 658–659.
Von Schweinitz D, Hecker H, Harms D, Bode U, Weinel P, Bürger D, Erttmann R, Mildenberger H. (1995) Complete resection before development of drug resistance is essential for survival from advanced hepatoblastoma—a report from the German Cooperative Pediatric Liver Tumor Study HB-89. J Pediatr Surg, 30: 845–852.
Von Schweinitz D, Leuschner I, Glüer S, Pietsch T. (1996) Expression of cell adhesion molecules and common acute lymphoblastic leukaemia antigen in hepatoblastoma. Virchows Arch, 429: 235-41.
Weber RG, Pietsch T, von Schweinitz D, Lichter P. (2000) Characterization of genomic alterations in hepatoblastomas: a role for gains on chromosomes 8q and 20 as predictors of poor outcome. Am J Pathol, 157: 571–588.
105
Weber CR, Nalle SC, Tretiakova M, Rubin DT, Turner JR. (2008) Claudin-1 and claudin-2 expression is elevated in inflammatory bowel disease and may contribute to early neoplastic transformation. Lab Invest, 88: 1110-1120.
Weinberg AG, Finegold MJ. (1983) Primary hepatic tumours of childhood. Hum Pathol, 14: 512–537.
Willert J, Catanzarite V, Hilfiker M, Daneshmand S. (2008) Prenatal diagnosis of fetal hepatoblastoma: case report and review of the literature. J Ultrasound Med, 27: 1095-8.
Wirths O, Waha A, Weggen S, et al. (2003) Overexpression of human Dickkopf-1, an antagonist of wingless/WNT signaling, in human hepatoblastomas and Wilms' tumors. Lab Invest 83:429-34.
Wylie AA, Murphy SK, Orton TC, Jirtle RL. (2000) Novel imprinted DLK1/GTL2 domain on human chromosome 14 contains motifs that mimic those 15 implicated in IGF2/H19 regulation, Genome Res 10: 1711– 1718.
Yamada S, Ohira M, Horie H, Ando K, Takayasu H, Suzuki Y, Sugano S, Hirata T, Goto T, Matsunaga T, Hiyama E, Hayashi Y, Ando H, Suita S, Kaneko M, Sasaki F, Hashizume K, Ohnuma N, Nakagawara A. (2004) Expression profiling and differential screening between hepatoblastomas and the corresponding normal livers: identification of high expression of the PLK1 oncogene as a poor-prognostic indicator of hepatoblastomas. Oncogene, 23: 5901– 5911.
Yin D, Xie D, Sakajiri S, Miller CW, Zhu H, Popoviciu ML, Said JW, Black KL, Koeffler HP. (2006) DLK1: increased expression in gliomas and associated with oncogenic activities. Oncogene, 25: 1852–1861.
Yovchev MI, Grozdanov PN, Joseph B, Gupta S, Dabeva MD. (2007) Novel hepatic progenitor cell surface markers in the adult rat liver. Hepatology, 45: 139-149.
106
Zheng A, Yuan F, Li Y, Zhu F, Hou P, Li J, Song X, Ding M, Deng H. (2007) Claudin-6 and claudin-9 function as additional coreceptors for hepatitis C virus. J Virol, 81: 12465-12471.
Zimmermann A. (2002) Hepatoblastoma with cholangioblastic features (cholangioblastic hepatoblastoma) and other liver tumours with a bimodal differentiation in young patients. Med Pediatr Oncol, 39: 487–491.
Zimmermann A. (2005) The emerging family of hepatoblastoma tumours: From ontogenesis to oncogenesis. Eur J of Cancer, 41: 1503–1514.
Zynger DL, Gupta A, Luan C, Chou PM, Yang GY, Yang XJ. (2008) Expression of glypican 3 in hepatoblastoma: an immunohistochemical study of 65 cases. Hum Pathol, 39: 224-30.
107
11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
Megjelent közlemények impact faktora (IF): 18,378
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke (IF: 4,98):
1. Halász J, Holczbauer A, Páska C, Kovács M, Benyó G, Verebély T, Schaff Z, Kiss A. (2006) Claudin-1 and claudin-2 differentiate fetal and embryonal components in human hepatoblastoma. Hum Pathol, 37 (5): 555-61. IF: 2,810
2. Dezso K, Halász J*, Bisgaard HC, Paku S, Turányi E, Schaff Z, Nagy P. (2008) Delta-like protein (DLK) is a novel immunohistochemical marker for human hepatoblastomas. Virchows Arch, 452 (4): 443-8. IF: 2,082
3. Jakab Cs, Halász J, Kiss A, Szász A. M, Schaff Zs, Rusvai M, Kulka J. (2008) Külsı pozitív
kontrollok
alkalmazása
claudin-expressziós
immunhisztokémiai
vizsgálatokban. Magyar Állatorvosok Lapja, 130 (7): 433-438. IF: 0,088
*megosztott elsı szerzı
Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények:
1. Jakab C, Halász J, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Abonyi TZ, Kulka J. (2009) Claudin-5 protein is a new differential marker for histopathological differential diagnosis of canine hemangiosarcoma. Histol Histopathol, 24 (7): 801-13. IF: 2,194
2. Aigelsreiter A, Janig E, Sostaric J, Pichler M, Unterthor D, Halasz J, Lackner C, Zatloukal K, Denk H. (2009) Clusterin expression in cholestasis, hepatocellular carcinoma and liver fibrosis. Histopathology, 54 (5): 561-70. IF: 4,131
3. Jakab Csaba, Halász Judit, Kiss András, Schaff Zsuzsa, Pekár Magdolna, Keszthelyi Rita, Meczker Ágnes, Kulka Janina. (2007) Szöveti multiblokk (tissue micro-array-
108
TMA) technika az állatorvosi onkopatológiai vizsgálatokban. Magyar Állatorvosok Lapja, 129 (5): 310-315. IF: 0,104
4. Jakab Cs, Dudás Gy Z, Horváth É, Tóth A, Halász J. (2008) A májbiopsziás vizsgálatok jelentısége a kisállatpraxisban. Magyar Állatorvosok Lapja, 130 (1): 3947. IF: 0,088
5. Jakab Cs, Halász J, Kiss A, Schaff Zs, Pekár M, Szabára Á, Kulka J. (2008) A claudin-5
fehérje
expressziójának
vizsgálata
kutyák
emlımirigyeinek
és
emlıcarcinomáinak nyirokér endothelsejtjein immunhisztokémiai módszerrel. Magyar Állatorvosok Lapja, 130 (5): 296-303. IF: 0,088
6. Jakab C, Halász J, Kiss A, Schaff Z, Szász AM, Rusvai M, Tóth ZA, Kulka J. (2008) Evaluation of microvessel density (MVD) in canine mammary tumours by quantitative immunohistochemistry of the claudin-5 molecule. Acta Vet Hung, 56 (4): 495-510. IF: 0,624
7. Jakab C, Halász J, Szász AM, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Kulka J. (2008) Expression of claudin-1, -2, -3, -4, -5 and -7 proteins in benign and malignant canine mammary gland epithelial tumours. J Comp Pathol, 139 (4): 238-45. IF: 1,398
8. Jakab C, Halász J, Szász AM, Batmunkh E, Kiss A, Schaff Z, Rusvai M, Gálfi P, Kulka J. (2008) Expression and localisation of claudin-1, -2, -3, -4, -5, -7 and -10 proteins in the normal canine mammary gland. Acta Vet Hung, 56 (3): 341-52. IF: 0,624
9. Fuszek P, Horvath HC, Speer G, Papp J, Haller P, Fischer S, Halasz J, Jaray B, Szekely E, Schaff Z, Papp A, Bursics A, Harsanyi L, Lukovich P, Kupcsulik P, Hitre E, Lakatos PL. (2006) Location and age at onset of colorectal cancer in Hungarian patients between 1993 and 2004. The high number of advanced cases supports the need for a colorectal cancer screening program in Hungary. Anticancer Res, 26 (1B): 527-31. IF: 1,479
109
10. Fuszek P, Horváth HC, Speer G, Papp J, Haller P, Halász J, Járay B, Székely E, Schaff Z, Papp A, Bursics A, Harsányi L, Lukovich P, Kupcsulik P, Hitre E, Lakatos PL. (2006) A colorectalis rákok lokalizációjának változása Magyarországon 1993 és 2004 között. Orv Hetil, 147 (16): 741-6.
11. Sobel G, Halász J, Bogdányi K, Szabó I, Borka K, Molnár P, Schaff Z, Paulin F, Bánhidy F. (2006) Prenatal diagnosis of a giant congenital primary cerebral hemangiopericytoma. Pathol Oncol Res, 12 (1): 46-9. IF: 1,241
12. Csak T, Folhoffer A, Horvath A, Halász J, Diczházi C, Schaff Z, Szalay F. (2006) Holmes-Adie syndrome, autoimmune hepatitis and celiac disease: a case report. World J Gastroenterol, 12 (9): 1485-7.
13. Lakatos PL, Gyori G, Halasz J, Fuszek P, Papp J, Jaray B, Lukovich P, Lakatos L. (2005) Mucocele of the appendix: an unusual cause of lower abdominal pain in a patient with ulcerative colitis. A case report and review of literature. World J Gastroenterol, 11 (3): 457-9.
14. Vereckei A, Vándor L, Halász J, Karádi I, Lengyel M. (2004) Infective endocarditis resulting in rupture of sinus of Valsalva with a rupture site communicating with both the right atrium and right ventricle. J Am Soc Echocardiogr, 17 (9): 995-7. IF: 1,427
15. Halász J, Kovács M, Illyés G, Máttyus I, Szolnoki J, Szabó A, Verebély T, Schaff Z. (2004) Malignant rhabdoid tumour in the liver. Orv Hetil, 145 (27): 1439-43.
16. Lakatos PL, Halász J, Keresztes K, Fuszek P, Jäckel M, Poros A, Morvay K, Lakatos L. (2004) A familiaris adenomatosus polyposisról egy eset kapcsán. Orv Hetil, 145 (15): 813-7.
17. Horvath A, Folhoffer A, Lakatos PL, Halasz J, Illyes G, Schaff Z, Hantos MB, Tekes K, Szalay F. (2004) Rising plasma nociceptin level during development of HCC: a case report. World J Gastroenterol, 10 (1): 152-4.
110
18. Lakatos PL, Lakatos L, Fuszek P, Lukovich P, Kupcsulik P, Halász J, Schaff Zs, Papp J. A nyelıcsı és a gastrooesophagealis junctio daganatainak gyakorisága és szövettani megoszlása 1993-2003 között. (2005) Orv Hetil, 146 (9): 411-6.
19. Csák T, Folhoffer A, Horváth A, Osztovits J, Halász J, Diczházi Cs, Schaff Zs, Szalay F. (2006) Autoimmun hepatitis, coeliakia és Holmes-Adie-szindróma együttes elıfordulása. Magy Belorv Arch, 59 (1): 55-58.
Az értekezéssel összefüggı, lektorált folyóiratban megjelent, idézhetı absztrakt:
1. Judit Halasz, A. Kiss, A. Holczbauer, Cs. Paska, M. Kovács, G. Benyo, K. Galantai, T. Verebely and Zs. Schaff. Expression of claudins in human hepatoblastoma. Z Gastroenterol 2005; 43.
2. Dezsı K, Halász J, Paku S, Bisgaard HC, Schaff Zs, Nagy P. DLK a potential new immunohistochemical marker for hepatoblastoma: 43rd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Milan, Italy, April 23-27, 2008 Journal of Hepatology 48:(S2) p. S153. (2008).
3. Halász J, Holczbauer Á, Kiss A, Páska Cs, Kovács M, Benyó G, Galántai I, Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005 Virchows Arch 447: 2005 (2005).
4. Halász J, Horváth A, Folhoffer A, Szalay F, Nagy P, Schaff Zs. Hepatocellular carcinoma in biliary cirrhosis with stem cell markers XXVI International Congress of the International Academy of Pathology, Montreal, Canada, 16-21 September, 2006 Modern Pathol 19 S3: 122-123 (2006).
111
Egyéb kutatási témából készült, idézhetı absztraktok:
1. Horváth A, Hantos M, Tekes K, Halász J, Illyés Gy , Schaff Zs, Folhoffer A, Lakatos PL, Szalay F. Hepatocellular carcinoma in a patient with primary biliary cirrhosis. Is nociceptin a marker for HCC? FALK Symposium, Freiburg, Germany, 2004. Z Gastroenterol 2003;41:439.
2. A Horvath, Folhoffer, T Csak, PL Lakatos, MB Hantos, K Tekes, A Szijarto, P Kupcsulik, A. Kiss, J Halasz, Z Schaff, F Szalay. High nociceptin content in human hepatocellular carcinoma tissue. DDW, New Orleans, USA, 2004. Gastroenterol 2004, 40 Suppl 1: A250.
3. Aigelsreiter, A; Janig, E, Halasz, J, Lackner, C, Sostaric, J, Pichler, M, Stumptner, C, Unterthor, D, Kufferath, I, Zatloukal K, Denk, H. (2007): Clusterin expression in cholestasis and liver fibrosis Virchows Archive 2007; 451(2):132-132.-21th European Congress of Pathology; SEPT 8-13; Istanbul, TURKEY.
4. Aigelsreiter, A; Halasz J, Lackner C, Sostaric J, Reihs R, Stark K, Kufferath I, Pichler M, Stumptner C, Zatloukal K, Denk H (2007): Hepatocellular carcinomas with Mallory bodies and/or Intracellular hyaline bodies: Correlation with steatohepatitic features Virchows Archive 2007; 451(2):370-370.-21th European Congress of Pathology; SEPT 8-13, 2007; Istanbul, TURKEY.
5. Gyıri G, Fuszek P, Járay B, Halász J, Schaff Zs, Lukovich P, Abonyi M, Lakatos PL. Mucocele of the appendix: An unusual cause of lower abdominal pain in a patient with ulcerative colitis. A case report. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 1-5, 2004 Z. Gastroenterol 42: 414, 2004 (2004).
112
Egyéb kutatási témából készült, nem idézhetı absztraktok:
1. Horváth A, Hantos M, Tekes K, Halász J, Illyés Gy , Schaff Zs, Folhoffer A, Lakatos PL, Szalay F. Hepatocellular carcinoma in a patient with primary biliary cirrhosis. Is nociceptin a marker for HCC? 45th Annual Meeting of the Gastroenterology Society, Balatonaliga, Hungary, 2003.
2. Halász J, Horváth A, Folhoffer A, Lakatos PL, Illyés Gy, Hantos BM, Tekes K, Nagy P, Szalay F, Schaff Zs. Primary biliaris cirrhosis in hepatocellular carcinoma. 63th Congress of Pathology, Balatonszéplak, Hungary, 2004.
3. Judit Halász, Margit Kovács, György Illyés, István Máttyus, Judit Szolnoki, Antal Szabó, Tibor Verebély, Zsuzsa Schaff. Malignant rhabdoid tumor in the liver. FALK Symposium, Freiburg, Germany, 2004.
4. Judit Halasz, A. Kiss, A. Holczbauer, Cs. Paska, M. Kovács, G. Benyo, K. Galantai, T. Verebely and Zs. Schaff. Expression of claudins in human hepatoblastoma. FALK Symposium, Berlin, Germany, 2005.
5. P. Valyi, K. Danyi, J. Halasz, Z. Schaff, A. Fazekas, K. Bogi. Expression of the tight junction associated claudins in normal human gingiva. Joint meeting of the Continental European Division and Scandinavian Divison of the IADR, Amsterdam, Netherland, 2005.
6. P. Valyi, K. Danyi, J. Halasz, Z. Schaff, A. Fazekas, K. Bogi. Expression of occludin and ZO-1 in healthy stratified gingival epithelium. Joint meeting of the Continental European Division and Scandinavian Divison of the IADR, Amsterdam, Netherland, 2005.
7. Halasz J., Kiss A., Holczbauer A., Paska Cs., Kovacs M., Benyo G., Verebely T., Schaff Zs. Claudin expression in human hepatoblastoma. 64th Congress of Pathology, Pécs, Hungary, 2005.
113
8. Halasz J., Verebely T., Kovacs M. VIP secreted ganglioneuroblastoma which caused WDHA-syndrome. 64th Congress of Pathology, Pécs, Hungary, 2005.
114
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet fejezem ki Mindazoknak, akik az értekezés elkészítésében segítségemre voltak.
Elsıként szeretnék köszönetet mondani Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, aki már diákként is meghatározó és példaértékő egyéniség volt számomra, aki lehetıvé tette és mindvégig bíztató szavaival támogatta, egyengette ezen munka létrejöttét, rezidensi, tudományos és egyéb intézeti tevékenységemet.
Szeretném köszönetemet kifejezni Kádár Anna professzor asszonynak, aki mindvégig támogatta tudományos munkámat és a Doktori Iskolába való jelentkezésemet.
Köszönet Nagy Péter professzor úrnak az értekezés elkészítésében nyújtott sok segítségért és hogy gondjaimmal hozzá mindig fordulhattam.
A tudományos pályámat Kiss András docens úr kísérte végig és folyamatosan segített a kísérletekben, azok értékelésében, a tudományos közlemények megírásában és számos baráti tanáccsal látott el.
Kovács Margit docens asszonynak, aki a pathológiára és az életben való eligazodásra tanított. Akinek biztatása és építı kritikája nélkülözhetetlen volt számomra. Neki is hálás köszönettel tartozom.
Pekár Zoltánné Magdinak, aki a molekularis biológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok elvégzésében segített, és aki nemcsak munkatársként, hanem barátként is mindig támogatott. Neki külön szeretném kifejezni hálámat.
Munkám során az intézet és a Molekuláris Pathologiai Laboratórium számos munkatársával dolgoztam együtt. Itt szeretném kiemelten megköszönni Páska Csillának a statisztikai elemzésekben és a metodikában nyújtott sok segítségét, és hogy gondjaimmal hozzá mindig fordulhattam. Köszönet Holczbauer Ágnesnek a molekuláris biológiai
115
vizsgálatok elvégzésében nyújtott segítségéért. Köszönet a Genoid Kft-nek a mutáció analysis vizsgálatokban nyújtott segítségéért.
Hasonlóan köszönettel tartozom az intézet asszisztenseinek. Az immunhisztokémiai vizsgálatok kivitelezésében Sklánitzné Samodai Erikának, Bornemissza Ilonának és Azuham Francisnének. A rutin hisztológiai laboratóriumból köszönet a sok segítségért Tordainé Szabó Hedvignek.
Rigóné Káló Elvirának is sok köszönettel tartozom az angol nyelvő publikációk nyelvi korrekciójáért. Schönfeld Tibor a cikkeimben levı képek formázásban, a cikkek és a dolgozat technikai problémáinak megoldásában segített, köszönet érte.
Végül szeretnék köszönetet mondani családomnak, akik munkám során mindig nagy szerettel támogattak, biztattak és lelkesítettek. Itt szeretném kiemelten megköszönni férjemnek és édesanyjának a mindennapokban nyújtott odaadó segítségét, hálás köszönet érte.
116