11
BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan utama, yaitu produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) dari ikan kerapu kertang, ikan gurame, dan ikan mas, dan uji bioaktivitas protein rGH pada ikan nila. Produksi Protein Rekombinan Hormon Pertumbuhan (rGH) Kloning Fragmen DNA Penyandi Protein GH Mature (mGH) Isolasi Plasmid cDNA GH. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit FlexiPrep dari Amersham Pharmacia Biotech dengan prosedur sesuai dengan manual. cDNA GH masing-masing ikan; kerapu kertang (Mulyadi et al. 2008), gurame (Nugroho et al. 2007) dan mas (berdasarkan database Bank Gen no. akses M27000) dalam bentuk plasmid pada vektor kloning pGEM-T Easy telah tertransformasi dalam bakteri konstruksi E.coli DH5α. Bakteri konstruksi diinkubasi pada suhu 37°C dalam media 2xYT (+Ampisilin) cair 8 ml di tabung L sampai warnanya pekat (± 20 jam). Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalam tabung mikro 1,5 ml, selanjutnya bakteri diendapkan dengan cara spin down 30 detik 12000 rpm pada suhu 4°C kemudian supernatannya dibuang. Selanjutnya ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan larutan 1 sebanyak 200 µl, divortex hingga pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 200 µl, tabung mikro dibolak-balik sekitar 10 kali sebelum ditambahkan dengan larutan 3 sebanyak 200 µl. Tabung dibolak-balik hingga terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, disentrifugasi sekali lagi dengan kecepatan dan lama waktu yang sama dengan sebelumnya. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro berisi isopropanol 420 µl. Dihomogenasi dengan vortex selama sekitar 1 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit selanjutnya dilakukan sentrifugasi 13000 rpm selama 15 menit. Setelah isopropanol (supernatannya) dibuang dengan bantuan aspirator, ke dalam tabung mikro berisi pelet DNA ditambahkan sephaglass 150 µl, dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit selanjutnya sentrifugasi 13.000 rpm selama 30
12
detik. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 200 µl larutan Wash Buffer dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang, dan diganti dengan etanol 70% dingin sebanyak 300 µl kemudian dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 30 detik. Setelah semua etanol dibuang, tabung mikro dibiarkan kering udara selama sekitar 10 menit, selanjutnya plasmid DNA dilarutkan dengan SDW sebanyak 3050 µl, dihomogenasi dengan vortex dan tabung mikro yang berisi plasmid dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi 13.000 rpm selama 1-2 menit. Selanjutnya supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke tabung yang baru menggunakan mikropipet. Sebanyak 1 µl hasil isolasi digunakan untuk elektroforesis dan selanjutnya diamplifikasi dengan PCR. Amplifikasi PCR. Untuk mendapatkan fargmen GH mature (mGH) masing-masing ikan dilakukan amplifikasi degan PCR. Primer yang digunakan untuk amplifikasi mGH ikan kerapu kertang (El-mGH) adalah primer forward ElmGH-F 5’- ctcgag cag cca atc aca gac ggc cag - 3’ dan primer reverse El-mGH-R 5’- aagctt cta cag ggt aca gtt ggc ctc agg - 3’ yang masing-masing dilengkapi dengan situs restriksi XhoI dan HindIII (digaris bawahi dan dicetak tebal). Primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan gurame (Og-mGH) adalah primer forward Og-mGH-F 5’- ggatcc cag cca atc aca gac agc cag - 3’ dan reverse Og-mGH-R 5’- gaattc cta cag agt gca gtt agc ttc tgg - 3’ yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan EcoRI. Selanjutnya primer untuk amplifikasi fragmen DNA GH mature ikan mas (Cc-mGH) adalah primer forward Cc-mGH-F 5’ggatcc tca gac aac cag cgg ctc ttc - 3’ dan reverse Cc-mGH-R 5’- gtcgac cta cag ggt gca gtt gga atc cag - 3’ yang dilengkapi dengan situs restriksi BamHI dan SalI. Reaksi PCR dilakukan dengan volume 10 µl yang mengandung 1 µl plasmid cDNA GH masing-masing ikan dari hasil isolasi, 1 µl primer GH mature forward maupun reverse (10 pmol/µl), 1 µl dNTP, 1 µl Ex Taq buffer, 0.05 µl Ex Taq polymerase (TAKARA) kemudian sisanya ditambahkan SDW. Selanjutnya proses PCR dijalankan pada suhu 94°C selama 3 menit (Pra PCR); (Denaturasi 94° C selama 30 detik; Annealing 67° C selama 30 detik; Extension 72° C selama 1
13
menit) sebanyak 35 siklus; dan Pasca PCR 72° C selama 3 menit: dan 4oC (tak hingga), untuk amplifikasi El-mGH dan Cc-mGH menggunakan suhu annealing 67°C, sedangkan Og-mGH menggunkan suhu annealing 69°C. Ligasi ke vektor kloning. Fragmen DNA produk PCR diligasi (disambungkan) ke vektor kloning pGEM-T Easy menggunakan T4 DNA ligase (TAKARA). Vektor pGEM-T Easy disentrifugasi agar kandungannya terkumpul pada dasar tabung, selanjutnya reaksi ligasi dicampur pada tabung mikro dengan komposisi: 6,5 µl 2x buffer ligasi; 0,5 µl Vektor pGEM-T Easy (50 ng); 1 µl T4 DNA ligase sebanyak; produk PCR sebanyak 5 µl; dan SDW 5,2 µl. Inkubasi dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang dan dilanjutkan semalaman di dalam refrigerator (suhu 4°C). Pembuatan Sel Kompeten. Sel kompeten adalah sel bakteri yang digunakan dalam proses transformasi, untuk kloning (perbanyakan) digunakan bakteri Escherichia coli DH5α, sedangkan untuk ekspresi digunakan bakteri Escherichia coli BL21 (DE3). Pembuatannya adalah; koloni tunggal bakteri E. coli DH5α atau BL21 (DE3) dikultur dalam 25 ml LB (komposisinya adalah 1 gram tryptone 1%, 0,59 gram yeast exstract 0,5%, dan 1 gram NaCl 1% di dalam 100 ml SDW ) kemudian diinkubasi (shaker) pada suhu 37 oC selama 16-18 jam. Selanjutnya 1% kultur E. coli diambil untuk dilakukan sub kultur dengan memasukkan ke dalam 25 ml LB yang baru kemudian selanjutnya diinkubasi selama 3 jam (peremajaan bakteri), selanjutnya kultur bakteri tersebut disimpan dalam wadah yang berisi es selama 30 menit. Kemudian, kultur bakteri sebanyak 1,5 ml dimasukkan ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit, supernatan yang terbentuk kemudian dibuang (dilakukan sebanyak 2 kali). Pelet yang ada dalam tabung mikro selanjutnya dicuci dengan menggunakan 1 ml NaCl mix dingin dan disentrifugasi selama 2 menit pada 5000 rpm, supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian ditambahkan CaCl2 mix dingin sebanyak 1 ml, selanjutnya di biarkan selama 20 menit dalam wadah yang berisi es, kemudian disentrifugasi kembali selama 2 menit pada 5000 rpm, selanjutnya supernatannya dibuang. Kemudian pelet yang terbentuk disuspensikan dengan 200 µl CaCl2 mix, selanjutnya campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit hingga 1 jam, kemudian siap digunakan sebagai sel kompeten.
14
Transformasi. Transformasi merupakan proses memasukkan plasmid yang mengandung fragmen DNA insersi ke dalam bakteri E. coli DH5α sebagai wahana kloning plasmid atau ke dalam bakteri E. coli BL21 sebagai wahana ekspresi protein. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan selama 20 hingga 30 menit di dalam wadah yang berisi es. Transformasi dilakukan dengan cara diberikan kejutan suhu 42 oC selama 45 detik. Setelah itu tabung mikro diinkubasi on-ice selama 2-3 menit. Selanjutnya, sebanyak 200 µl LB ditambahkan ke dalam tabung mikro. (Larutan LB mengandung 1 gram tryptone 1%, 0,59 gram yeast extract 0,5%, 1 gram NaCl 1% dengan pelarut 100 ml SDW). Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37oC selama 1,5 jam pada 200 rpm. Kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang mengandung IPTG, X-gal dan ampisilin, sehingga disingkat menjadi 2xYT (I, X, A). 2xYT mengandung tryptone 1,6%, yeast extract 1%, NaCl 0,5%, Bacto agar dalam SDW). Kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 16-18 jam. Identifikasi Transforman. Identifikasi dilakukan dengan metode cracking (Alimuddin et al. 2008). Koloni putih hasil transformasi yang tumbuh di atas agarosa 2xYT diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke ujung tabung mikro dan dilanjutkan dengan pembuatan master plate agarosa 2xYT (I, X dan A). Master plate kemudian diinkubasi pada suhu 37oC sekitar 8 jam. Ke dalam tabung mikro yang telah dioleskan bakteri ditambahkan 10 µl cracking buffer, 10 µl EDTA 1 M dan 1 µl loading buffer cracking berisi KCl 1 M dengan perbandingan volume 1:1. (Cracking buffer mengandung 0,2 gram saccharosa, 40 µl NaOH 5 M, 50 µl SDS 10% dan sisanya SDW hingga volume larutan menjadi 1 ml). Selanjutnya tabung mikro di Spin down pada 5000 rpm selama 2 hingga 3 detik kemudian divortex. Larutan tersebut disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya dielektriforesis sebanyak 10 µl supernatan yang terbentuk dengan gel agarose 0,7% untuk mengidentifikasi apakah bakeri yang sudah ditransformasi membawa plasmid yang berisi gen yang kita insersikan dan membandingkannya dengan kontrol, vektor pGEM-T Easy tanpa insersi fragmen DNA mGH.
15
Pembuatan Vektor Ekspresi Protein rGH Isolasi Fragmen GH Mature. Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung mGH (El-mGH, Og-mGH dan Cc-mGH) yang telah dikloning di dalam bakteri E coli DH5α kemudian diisolasi menggunakan kit GF-1 Plasmid DNA Extraction Kit (Vivantis) dengan prosedur yang sesuai dengan manual kit yang digunakan. Selanjutnya vektor pGEM-T Easy yang mengandung El-mGH (kerapu kertang) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi XhoI dan HindIII, vektor pGEM-T Easy yang mengandung Og-mGH (gurame) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan EcoRI, sedangkan vektor pGEM-T Easy yang mengandung Cc-mGH (mas) dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan SalI. Untuk mengeluarkan fragmen GH mature dari vektor pGEM-T Easy, pereaksinya adalah 5 µl masing-masing plasmid pGEM-T Easy yang mengandung mGH dimasukkan kedalam tabung mikro selanjutnya di tambahkan 5 µl Buffer (ElmGH: 10x M Buffer; Og-mGH: 10x K Buffer; Cc-mGH: 10x T Buffer), kemudian ditambahkan enzim restriksi masing-masing 1 µl, selanjutnya ditambahkan SDW sebanyak 38 µl. Fragmen mGH terpotong dan siap diligasikan ke vektor ekspresi protein. Preparasi Vektor Ekspresi. Vektor ekspresi yang akan digunakan adalah pCold 1 DNA (Takara-bio). Vektor ekspresi sebanyak 2 μl dimasukkan masingmasing ke dalam tabung mikro lalu dicampurkan dengan 5 µl 10x Buffer. Untuk El-mGH ditambahkan enzim restriksi XhoI dan HindIII, untuk Og-mGH menggunakan enzim BamHI dan EcoRI, dan untuk Cc-mGH menggunakan enzim BamHI dan SalI masing-masing 1 µl, kemudian ditambah SDW sebanyak 30 μl. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37° C selama 2 hingga 4 jam. Selanjutnya, vektor yang sudah dipotong kemudian disimpan pada suhu -20° C hingga akan digunakan. Ligasi mGH ke Vektor Ekspresi. Reaksi ligasi yang dilakukan meliputi 5 µl larutan mGH masing-masing El-mGH, Og-mGH, dan Cc-mGH; kemudian 0,5 µl pCold 1 DNA yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi; 6,5 µl 5x buffer ligasi, dan 1 µl enzim T4 DNA ligase (TAKARA). Selanjutnya larutan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian inkubasi dilanjutkan semalaman direfrigerator (suhu sekitar 4oC).
16
Transformasi ke E. coli BL21. Bakteri yang digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan rGH adalah bakteri E. coli BL21 yang sebelumnya sudah dibuat menjadi kompeten. Sebanyak 6,5 µl plasmid hasil ligasi yang sudah diinsersikan gen dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi sel kompeten. Kemudian, campuran ini didiamkan selama 20 hingga 30 menit di dalam wadah yang berisi es. Transformasi dilakukan dengan cara diberikan kejutan suhu 42oC selama 45-55 detik. Setelah itu tabung mikro diinkubasi on-ice selama 2-3 menit. Kemudian ditambahkan LB sebanyak 200 µl ke dalam tabung mikro. Selanjutnya diinkubasi pada shaker dengan suhu 37 oC selama 1,5 jam pada 200 rpm, kemudian bakteri disebar di dalam media agarosa 2xYT yang ditambahkan ampisilin. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16-18 jam. Identifikasi dan Peremajaan Transforman. Bakteri E. coli BL21 yang membawa plasmid pCold 1 DNA yang telah disisipi fragmen mGH ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan gurame (Og-GH), dan ikan mas (Cc-mGH) dicracking kemudian diidentifikasi untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut membawa plasmid yang berisi gen yang telah kita insersikan. Selanjutnya bakteri tersebut diremajakan dan dikultur secara massal untuk memproduksi protein rekombinan yang diekspresikan oleh plasmid pCold-mGH di dalam bekteri tersebut.
Produksi Protein rGH Ekspresi protein rGH di dalam E. coli BL21. Klon bakteri E. coli BL21 yang positif mengandung pCold-mGH dikultur selama 16-18 Jam dengan dishake pada tabung erlenmeyer dengan media 2xYT cair 200 ml tambah ampisilin, selanjutnya subkultur selama 2 jam pada suhu 37 oC dengan dishake. Selanjutnya kultur bakteri diberi kejutan dingin pada suhu 15oC selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl IPTG 100 mM, kultur dilanjutkan selama 24 jam dengan dishake pada suhu 15oC, kemudian pelet bakteri dikoleksi dengan disentrifugasi 4000 rpm selama 5 menit, selanjutnya pelet bakteri E. coli BL21 yang mengandung protein rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) dianalisis dengan teknik SDS-PAGE. Analisis protein rGH. Pelet BL21 hasil ekspresi kemudian diresuspensi dengan PBS (16 mM Na2HPO4-2H2O, 4 mM NaH2 PO4·2H2O, 120 mM NaCl, pH
17
7.4) ditambah 0.1% (w/v) Triton X-100 kemudian dilisis dengan alat sonikasi 6 siklus dengan kekuatan penuh menggunakan probe 9 mm, dengan perlakuan 1 menit dihidupkan dan 1 menit dimatikan sambil suspensinya dibenamkan di dalam es. Kemudian disentrifugasi untuk memisahkan material yang tidak larut dalam homogenate sel, protein rGH akan terikat di dalam pelet dan supernatannya dibuang, selanjutnya pelet yang terbentuk dicuci dua kali dengan 1 M NaCl yang berisis 1% (w/v) Triton X-100 dan terakhir dibilas dengan PBS, selanjutnya pelet bakteri yang mengandung protein rGH ikan kerapu kertang, ikan gurame dan ikan mas dianalisis dengan teknik SDS-PAGE. SDS-PAGE atau sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis merupakan teknik yang secara luas digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya dengan memigrasikannya pada gel elektroporesis atau SDS-PAGE berfungsi mengikat polipeptida sehingga terbentuk protein kompleks yang tereduksi sesuai dengan berat molekulnya. Protein dari 1 µg pelet bakteri dianalisis menggunakan metode SDS-PAGE dengan konsentrasi gel poliakrilamid 10%, dan protein divisualisasi menggunakan pewarna Coomassie Blue. Ukuran protein rGH diprediksi berdasarkan konsensus bahwa 10 kDa protein sama dengan 270 bp DNA.
Uji Bioaktivitas Protein rGH Bioaktivitas protein rGH ditentukan dengan menganalisis pertumbuhan ikan nila yang diinjeksi dengan rGH dan dibandingkan dengan ikan nila yang hanya disuntik dengan PBS atau protein dari pCold 1 tanpa fragmen DNA mGH. Juvenil ikan nila ukuran ±11 g/ekor diinjeksi dengan protein total (inclusion body) dengan dosis 1 µg pelet bakteri yang dilarutkan dalam 10 μl PBS per gram ikan. Injeksi dilakukan secara intramuscular seminggu sekali selama 4 minggu. Bobot ikan diukur seminggu sekali selama 2 bulan pengamatan dan diakhir dihitung kelulus hidupannya
Analisis Data Vektor kloning dan vektor ekspresi yang dihasilkan serta produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan (rGH) ikan kerapu kertang (El-mGH), ikan
18
gurame (Og-mGH), dan ikan mas (Cc-mGH) disajikan dalam bentuk gambar kemudian dianalisis dan dijabarkan secara deskriptif. Selanjutnya data hasil uji bioaktivitas di analisis ragam dan jika terjadi perbedaan antar perlakuan dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil.
