Antibiotikum érzékenység meghatározása
Antibakteriális szerek
• Célja: a mikroba érzékenységének, illetve rezisztenciájának meghatározása az antimikrobás szerrel szemben. • A tesztelni kívánt antibiotikumok köre függ: – A patogéntől és annak generikus rezisztenciájától. – A fertőzés helyétől és az antibiotikum penetrációjától. Pl. meningitis esetén attól, hogy a szer képes-e a liquorba jutni. – Nozokomiális vagy közösségben szerzett fertőzés.
• A vizsgálatokhoz a megfelelő módszert kell választani. Pl. anaerobok esetén a korongdiffúziós módszer nem használható.
Definíciók •
MIC: minimum inhibitory concentration, minimális gátló koncentráció. Az a legkisebb koncentrációja egy antimikrobás szernek, amely még hatásosan gátolja az adott törzs növekedését.
•
Minél kisebb a MIC értéke, annál hatásosabb az antimikrobás szer.
• •
A mikroba faj jellemzésére az alábbi populációs mutatókat használjuk: – MIC értékhatárok: a törzsek között tapasztalható két szélső MIC érték. – MIC 50: az a koncentráció, amely a törzsek 50%-át gátolja. – MIC 90: az a koncentráció, amely a törzsek 90%-át gátolja.
•
Ezeknek a populációs mutatóknak meghatározásában van szerepe.
a
határértékek
– Határértékek: MIC értékek, amelyek kijelölik az érzékenységi kategóriákat.
• Ha a törzs MIC értéke az alsó határértékkel megegyezik vagy az alatt van, a törzs érzékeny az adott szerrel szemben. • Ha a törzs MIC értéke az felső határértékkel megegyezik vagy a fölött van, a törzs rezisztens az adott szerrel szemben. • Ha a törzs MIC értéke a két határérték között van, a törzs mérsékelten érzékeny.
• MBC (minimum bactericidal concentration, minimális baktericid koncentráció) és MFC (minimum fungicidal concentration, minimális fungicid koncentráció): egy antibiotikum azon legkisebb koncentrációja, amely a kórokozó egyedeinek döntő többségét (99.9 %) elpusztítja.
• Ha ez az érték nem különbözik jelentősen a MIC értéktől, a szer baktericid/fungicid.
• Ha
ez a különbség nagy, a szer bakteriosztatikus/fungisztatikus. Ezek a szerek is képesek a mikroba elpusztítására, de olyan magas koncentrációban, amely a szervezet számára toxikus.
1
SBT •
SBT: serum bactericidal titer, szérum baktericid koncentráció: a beteg szérumának (esetleg liquornak) az a legnagyobb hígítása, amely mikrobicid a betegből izolált mikrobával szemben
•
Az antibiotikum hatásosságát a kezelt beteg szérumában vizsgáljuk.
•
Hígítási sort készítünk a szérumból, majd a betegből izolált törzsön elvégezzük a tesztet.
•
Azt a legnagyobb hígítást keressük, ahol baktericid hatás érvényesül.
•
Munkaigényes, nem standardizálható.
•
Néhány krónikus fertőzés esetén fontos lehet a teszt elvégzése.
Kvantitatív módszerek Idő-ölőhatás görbék •
Adott mennyiségű antibiotikummal kiegészített, inokulált leves tápfolyadékon végezzük. Csíraszám meghatározást végzünk a leoltás pillanatában, ezután meghatározott időpontokban.
•
A csíraszám-változást az idő függvényében ábrázolva kapjuk meg az időölőhatás görbét.
•
Információt nyújt az antibiotikum hatásának kinetikájáról.
•
Rutin diagnosztikában nem használatos.
Kvantitatív módszerek Agarhígításos módszer
• Több antibiotikum együttes hatása vizsgálható, majd a kapott görbe összehasonlítható az antibiotikumok különkülön felvett görbéivel.
• Tápagart tartalmazó csészesorozaton végezzük. A táptalajok kettes léptékű antibiotikum hígítási sort tartalmaznak. Minden csészére azonos sűrűségű inokulumot oltunk. • A MIC egyenlő azon legkisebb antibiotikum koncentrációval, ahol növekedés még nem tapasztalható. • Nem értékelhető:
• Szinergizmus: a kombináció hatása nagyobb a két szer külön-külön mért hatásának összegénél. • Additív kölcsönhatás: a két szer hatása összeadódik. • Indifferens kölcsönhatás: a kombináció hatása nem tér el jelentősen a hatékonyabb szer önmagában mért hatásától.
– Ha a növekedési kontrollon nincs növekedés. – Ha alacsonyabb antibiotikum koncentráció esetén nincs növekedés, míg nagyobb antibiotikum koncentráció esetén van. – Ha a negatív kontrollon is van növekedés.
• Antagonizmus: a kombináció hatása kisebb a hatékonyabb szer önmagában mért hatásánál.
Kvantitatív módszerek Leveshígításos módszer • •
• •
Vancomycin sensitivity testing in MRSA isolates
• •
A vizsgálatokat hasonló az agarhígításos módszerben, de folyékony táptalajban végezzük. A MIC egyenlő azon legkisebb antibiotikum koncentrációval, amely még jelentősen gátolta a növekedést (nincs látható zavarosság). Mikrodilúció: mikroplate-n végezzük kis térfogatban (100-200 µl). Előnye, hogy kisebb anyagmennyiségekkel dolgozhatunk. Makrodilúció: üvegcsövekben végezzük nagyobb térfogatban (1 ml). Előnye, hogy az eredmények könnyebben leolvashatók. Drága és időigényes módszer. Nem értékelhető: – ld. az agarhígításnál.
Ann. Trop. Med. Publ. Health (2012) 5: 178-180.
2
Kvantitatív módszerek MBC/MFC meghatározása •
A MIC meghatározásához használt mikro- és makrodilúciós csöveket használjuk hozzá.
•
A MIC érték feletti csövekből (ahol nem volt növekedés) leoltást végzünk szilárd táptalajra.
•
MBC/MFC az a koncentráció, ahol a mikrobák 99,9%-a elpusztul.
•
Általában két párhuzamos leoltást végzünk. Ha a párhuzamosok közt a különbség kétszeresnél nagyobb, nem értékelhető a teszt.
Baktericid antibiotikum
Bakteriosztatikus antibiotikum MBC
MBC
MIC
MIC
16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.12
0.06
0.03
16
antibiotikum koncentráció (mg/l)
•
•
• •
2
1
0.5
0.25
0.12
0.06
0.03
Szemikvantitatív módszerek Határérték módszer •
Alapja egy műanyag csík, amely egyik felszínén hordozó anyagba felvitt antibiotikumot tartalmaz, koncentráció gradiens szerint. Az antibiotikum a táptalajba diffundál. A koncentráció gradiens a táptalajban is fennmarad. Az antibiotikum gátolja a mikroba növekedését elliptikus zónában a gradiensnek megfelelően. Ahol a gátlási zóna metszi a csíkot az a koncentráció érték a MIC. Könnyű használni, de drága.
4
antibiotikum koncentráció (mg/l)
Kvantitatív módszerek E-teszt •
8
• • • • •
Az antimikrobás hatást a két határértéknek megfelelő koncentráció értéken vizsgáljuk. Folyékony és szilárd táptalajon is beállíthatjuk a két koncentráció értéket. Ha egyik csőben vagy táptalajon sincs növekedés, a mikroba érzékeny. Ha a magasabb koncentráció mellett nincs, de a kisebb mellett van növekedés, a mikroba mérsékelten érzékeny. Ha mindkét koncentráció mellett van növekedés, a mikroba rezisztens. Nem értékelhető: – Ha a magasabb koncentrációnál van, a kisebbnél nincs növekedés. – A negatív kontrollban van növekedés. – Az antibiotikum mentes csőben nincs növekedés.
3
Szemikvantitatív módszerek Korongdiffúziós vagy Kirby-Bauer módszer
Szemikvantitatív módszerek Rezisztencia szűrés •
Hasonló a határérték módszerhez, de csak a magasabb koncentráció értéket használjuk.
•
Ha növekedést rezisztens.
•
Heterorezisztencia Enterococcusok rezisztenciájának használható.
látunk
a
•
Antibiotikummal átitatott papír lemezeket helyezünk agar táptalajra, melyre előzőleg kioltottuk a baktériumokat. Az antibiotikum a táptalajba diffundál.
•
Nem használható anaerobok, lassan növő mikrobák esetén, de olcsó, könnyen használható.
•
A gátló zónák mérete függ:
mikroba
vizsgálatra és aminoglikozid azonosítására
– Az antibiotikum koncentrációjától. – A baktérium antibiotikum-érzékenységétől. – Az antibiotikum diffúziós képességétől.
•
A megfelelő standardokkal zónaátmérőkből következtethetünk mikroba érzékenységére.
Szemikvantitatív módszerek Korong diffuziós vagy Kirby-Bauer módszer
β-laktamázok kimutatása •
•
Amennyiben az antibiotikum könnyen képes a táptalajba diffundálni, a gátló zónák átmérőjéből kalibrációs görbe készíthető a MIC meghatározására. • A korongdiffúziós módszer mellett kvantitatív módszert is kell végezni a különböző törzseknél MIC értékek kvantitatív meghatározásához. • A zónaátmérőket a MIC értékek logaritmusának függvényében ábrázoljuk. • Ha egyenes illeszthető a pontokra, az ismeretlen MIC meghatározható a zóna átmérőből. • Ha nem illeszthető a pontokra megfelelő egyenes, nem állapítható meg biztonsággal az ismeretlen MIC.
a a
• •
Mikor fontos? – Ha csak a β-laktamáz felelős a rezisztenciáért (Haemophilus). – Ha a tenyésztéses módszernél megbízhatóbb (N. gonorrhoeae). Hátrány: ha nincs β-laktamáz aktivitás, még nem jelenti, hogy a törzs érzékeny β-laktámokra. Hogyan detektálható: – Nitrocefin próba: a nitrocefin egy cefalosporin származék, amelynél ha a laktám-gyűrű felhasad színes termék keletkezik (sárgából piros színváltozás). Haemophilus, Neisseria, Staphylococcus, Enterococcus. – Jodometriás próba: a laktámgyűrű felhasadásakor redukáló hatású csoport keletkezik, amely a jódot redukálja, és ez keményítővel kimutatható. N. gonorrhoeae. – Acidimetriás próba: a laktámgyűrű felhasadásakor keletkező karboxil csoport okozta pH csökkenés indikátorral kimutatható. N., Staphy., Haemoph.
+ -
+ -
ESBL kimutatása •
A III generációs cefalosporinok hidrolizisére is képes.
•
A β-laktamázok β-laktamáz inhibitorokkal gátolhatók. Így a cefalosporin hatásos az inhibitor jelenlétében (in vitro).
•
E-teszt esetén az egyik vég cefalosporinnal, cefalosporinnal és klavulánsavval átitatott.
a
másik
• Korongdiffúziós módszer esetén egy cefalosporinnal átitatott, és egy másik, cefalosporint és klavulánsavat tartalmazó korongot helyezünk ugyanarra a leoltott agarra. • A teszt pozitív, ha a két zóna közti különbség nagyobb, mint 5 mm. • Cefalosporintól 2 cm-re elhelyezett klavulánsav-tartalmú korong felé a cefalosporin gátlási zónája megnyúlik.
4
Meticillin rezisztens S. aureus PBP2a fehérjéjének kimutatása
•
Monoklonális antitestek segítségével, latex agglutinációval.
A rezisztencia gének kimutatása közvetlenül is történhet PCR segítségével.
5
