fnaialab llrniab
AGR,IPLf]S
ISSN Og5+ ^, O72g
Adoutlah, Nla'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasl, Andt Nlurft
: PENGARUH
SUPLEMENTASI BERBAGAI SERAT KOMERSIL TERHADAP KADAR KOLESTEROL SERUM DAN DAGING PADA MENCIT (Musmusculuc)
A. Bahrun z RESPON TANAIvIAN
KEDELAI (Glyicine max L. Merr) TERHADAP SISTEM
PENGAIRAN. NIuhIdTn : TOLERAT{SI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMAI{ ALU. MINIUM PADA STADIA BIBIT
Takdlr Salll, Nlohamad Agvs Settadt, Srlhadl Agungprlyono, Nlozes R. Toehhere dan Artef Boedtono : PENGARUH PENGERINGBEKUAN TERHADAP PERUBAHAI{ MORFOLOGI SPERMATOZAA DOMBA Nluhammod Tauftk dan Syalr : ISOLASI DNA PLASMID DENGAN METODE MINIPREP QIAPREP (ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP) IUIuKhtaT : PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNG IKAI{ KERAPU TIKUS (Cromileptes altiuelis) DI KECAMATAN SOROPIA
Gusno Ff.S. dan Abdul Rahman: AIIALISIS PROTEIN DAN ISOZIM PLANLET PISAhIG BARAT.IGA}I HASIL INDUKSI FILTRAT FOC DAN BDB SECARA IN-YITRO
L.IW. HaTofah : PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI KEBIJAKAN PEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKAT PEDESAAN DI PROVINSI SULAWESI TENGGARA) Hg/MflTUI Ho,dTN' : DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATEN BUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARA
ISKAndaT : PENGARUH PENYAJIAN PESAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAI{N VISUALISASI MELALUI VIDEO TERHADAP PENINGKATAN PENGETAHUAI{ PETAI{I
Ayub NI. Padanssran : ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAI{ INVESTASI OPTIMAL SEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARA
Husna, Robtatul Adau:tyah, Ls Ode Altmuddtn dan Fatsol Danu Tuheteru : STATUS KEANEKARAGAMAN CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA) PADA EMPAT TANAMAN LOKAL SULAWESI TENGGARA
DAFTAR ISI Halaman
PENGARUH SUPLEMENTASI Bf,RBAGAI Sf,RAT KOMERSIL TERHADAP KADAR KOLESTEROL SERUM DAN DAGING PADA MENCIT (Mus masculus) Adawtyah, Ma'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasi, Andi
RESPON TANAMAN KEDELAI (Glyictne max
L
Murfi
* 89
'85
Merr) TORIIADAP SISTEM
PENGA,IRAN. A.
Bahrun
90-97
TOLERANSI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMAN ALUMINIUM PADA STADIA BIBIT
Muhidln.....
98
H Pf, NG ERING BI]KUAN TERHADAP PERU BAHAN MORI'OLOG I SPERMATOZOA DOMBA TaWir Saill, Mohamad Agus Setiodi, Srlhadi Agungpriyono, Mozes R.Toelihere dan Arlef Boedlono. ..........
107
TSOLASI DNA PLASMID DENGAN METODDE MINIPREP QIAPREP (ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP) MahantmadTautihdanSyair ........
ll8-122
-
106
Pf, NGARU
_tt7
PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNG IKAI{ KERAPU TIKUS (Cromilqta altlvelis) DI Kf,CAMATAN SOROPIA
Mukhtar
123
-
133
- 137
138
-
148
149
*
157
158-
166
167
-
172
173
- lg2
132
ANALISIS PROTDIN DAN ISOZIM PLANLET PISANG BARANGAN HASIL INDUKSI FILTRATFOC DAN BDBSECARA IN-VITRO
Rahman................... PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI Gusna H.S, dan Abdul
KEBIJAKAN PEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKAT PEDESAAN DI PROVINSI SULAWESI TENGGARA) L.M. Harafah
..................
DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATEN BUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARA Hamlrul Hadini .. .... ..... . ... PENGARUH PENYAJIAN Pf,SAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAAN VIDEO TERHADAP PENINGKATAN PENGETAHUAN PETANI
VISUALISASI MELALUI Is
kandar..........
ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAN INVE.STASI OPTIMAL SEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARA Ayub M.
Padangaran
...........:..........
STATUS CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA) PADA EMPAT TANAMAN LOKAL SULAWEST TENGGARA Husna, Robidul Adowiyah, La Ode Albnuddin dan Faisol Danu
Tuhderu
AGRIPLUS, Volume 16 Nomor: 02 Mei 2006, ISSN 085+0U8
ISOLASI DNA PLASMID DENGAI\I METODDE MINIPREP QIAPREP (ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPRNP QIAPREP) OIeh : Muhammad TauJik dan Syair
I)
ABSTRACT Plasmids are relatively small, circular r,rolecules of DNA that carry genes both for their own replication and usually carry genes that confer drug resistance. The aim of this experiment was to isolate plasmid of bactearia. A research conducted in Laboratory of Microbiolog5r, Medicine Faculty, Hasanuddin University, Makassar. Ten samples of bacteria were used. The isolation methode used was to isolation with Miniprep qiaprep. The results showed that the methode was good use for isolation DNA plasmid of group of Corynebacteria. Whereas plasmid was not founded from sample group of Lactobacillus. Key words: Corynebcrterir, DNA Plasmid, Isolation, Lectobacillus, and miniprep qiaprep.
PENDAHULUAN
Di
dalam sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik. Molekul DNA kromosom berbentuk lingkaran yang berukuran amat besar dan teletak dalam inti. Selain itu juga mengandung molekul DNA yang disebut plasmid. Plasmid terdapat
bebas dalam sitoplasma sel bakteri. DNA Plasmid bakteri berbentuk sirkuler yang berukuran sekitar I kilobasa (kb) sampai lebih dari 400 kb atau bisa disebut megaplasmid. Prefiifelder (1987) melaporkan bahwa ukuran plasmid antara 0.2-4% dari ukuran kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri, artinya tidak tergantung pada kromosom inang. Kemampuan plasmid untuk bereplikasi sendiri disebut automous replication. Menurut Hayes (1986) rekombinasi beberapa plasmid dapat berintegrasi dengan kromosom dengan demikian plasmid dapat berstatus sebagai plasmid dan kromosom. Dalam keadaan berintegrasi dengan kromosom, replikasinya dikontrol oleh kromosom. Plasmid bakteri dapat berpindah dari satu sel ke sel lain. sehingga dapat mengakibatkan terjadinya proses transfer gen diantara sel-sel tersebut dan plasmid bertanggungjawab terhadap keragaman genetik bakteri. Plasmid dapat juga menyandikan gengen yang berhubungan dengan kemampuan sel
inang untuk beradaptasi terhadap
kondisi lingkungan yang baru dan mempengaruhi sifat fenotipe dari inangnya. (Campbell. 1981).
Mekanisme replikasi plasmid secara
umum sama dengan replikasi kromosom. Pada beberapa plasmid, replikasi terjadi dengan dua arah dan pada plasmid lain terjadi dengan satu arah (Watson et al., 1983).
Replikasi pada plasmid maupun kromosom membutuhkan beberapa fungsi replikasi yang umum mengawali polimerisasi. Plasmid high copy number pada Escherichia coli selain membutuhkan enzin DNA polimerase III juga membutuhkan enzin DNA polimerase I untuk memulai replikasinya. DNA plasmid bereplikasi dalam keadaan tetap bulat melingkar, dan dapat diisolasi dalam bentuk relaxation complex, dimana DNA terikat pada proteinprotein. Bila kompleks ini dipanaskan atau ditambahkan alkali, enzim proteolitik ataupun detergen, akan terjadi relaksasi dan terbentuklah nrc& DNA yang bulat melingkar (Dale 1994). Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan memanfaatkan sifat fisik dari molekul DNA supercoil. Molekul-molekul ini lebih kompak daripada nick atau linear dupleks dan pada ultta sentrifugasi lebih cepat diendapkan. Ukuran molekul-molekul DNA plasmid dapat dibedakan dengan pemisahan menggunakan agarose gel' elektroforesis. Dan setelah dilakukan pewarnaan dengan ethidium bromide, molekul-molekul DNA dapat dilihat dibawah
sinar ultra violet. Teknik ini memberikan kesempatan untuk dapat mempelajari/ menganalisa enzim endonuclease maupun enzim lain dalam plasmid (Brown l99l).
t) Sn/ Pengajar Jurusan Budlda;a Peranidn Fdkultas Perlanian llniversilas Haluoleo, Kerdari.
ut
119
Elemen genetik pada plasmid dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lain dengan konjugasi dan tansformasi. Apabila transfer DNA plasmid terjadi oleh adanya kontak antar sel bakteri maka peristiwa ini disebut konjugasi. plasmid diklasfikasikan menjadi konjugatif plasmid dan nonkonjugatif plasmid. Pada plasmid konjugatif terdapat tra gen, sedangkan pada plasmid non konjugatif tidak ada. Adanya gen tra tersebut plasmid dapat ditransfer dari satu sel ke sel lain. Mobilisasi plasmid nonkonjugatif dapat dimediasi oleh plasmid konjugatif (Goto 1990). DNA plasmid dapat diisolasi dari sel bakteri inangnya dengan beberapa cara. Kualitas dan kuantitas DNA plasmid yang diperoleh sangat bergantung dengan metode yang digunakan. Saat ini, telah dikembangkan metode isolasi DNA plasmid menggunakan Kit (QIAprep Miniprep) yang telah dijual bebas. Metode ini sangat mudah dan cepat serta dapat menghasilkan DNA yang cukup banyak. Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah mengisolasi DNA plasmid bakteri asam laktat dan bakteri patogen dengan metode (QIAprep Miniprep).
Metode Isolasi DNA Plasmid Bakteri
di
pada 13.000 rpm sampai terbentuk pelet berwana putih. Supernatan dipindahkan ke dalam spin kolom QiAprep. dengan cara
dekantasi atau dipipet. Tabung disentrifugasi 13.000 rpm selama I menit. Cairan di dasar kolom dibuang. Kolom dicuci dengan menambahakan 0,5 ml bufer PB dan disentrifugasi I menit 13.000 rpm. Setelah sentri-
fugasi cairan di
dasar kolom dibuang dan ditambahkan 0,75 ml bufer PE dan disentrifugasi selama 1 menit pada 30.000 rpm. Tahap aklrir kolom dimasukkan ke dalam tabung ependorf baru dan ditambahkan 50 pl bufer EB atau akubidest, inkubasi
selama I menit dan sentrifugasi selama menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
I
Penyiapan Agarose Gel (Sambrook et al.1989)
Pencetak gel dibersihkan dan dikeringkan dan diletakkan pada permukaan meja yang datar. Sisir gel di letakkan di bagian atas dan bagian tengah aparatus pencetak gel dengan menggunakan waterpas untuk mengetahui aparatus pencetak gel dalam
BAHAI\I DAN METODE
Penelitian dilaksanakan
250 pl bufer P1. Kemudian ditambahkan lagi 350 p! bufer N3 dan dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung 5-6 kali. Selanjutnya disentrifugasi selama l0 menit
Labora-
torium Mikobiologi Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin. Metode isolasi DNA plasmid menggunakan kit (QIAprep Miniprep) yang tekniknya lebih sederhana dan hasilnya
lebih murni. Isolat bakteri yang digunakan adalah L. bulgaris, C. ferundii (isolat A), L. acedo/hilus, C. ferundii (isolat B), L. cassei, C. ferundii (isolat C), L. lactis (isolat Al), C. ferundii (isolat D), L. lactis (isolat A2), dan C. ferundii (isolat E). Prosedur kerja sebagai berikut: Kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung ependorf sebanyak 1 ml kemudian untuk memisahkan medium dengan sel bakteri dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Pellet yang diperoleh dilarutkan dengan menambahkan AGRIPLUS, Yolume 76 Nomor
keadaan seimbang. Pada penelitian ini satu lembar agarose ukuran l0 X l5 cm digunakan satu sisir gel pada bagian. Bufer elektroforesis (TBE 0,5 x) digunakrrn untuk membuat gel dan mengisi tangki elektroforesis. Gel dibuat dengan rnenimbang I g agarose yang kemudian di larutkan ke dalam gelas kimia yang telah berisi 50 rnl bulbr l'BE 0,5 X schingga
konsentrasi yang di gunakan adalah 2%. Campuran tersebut dipanaskan dengan &ol plate saynbil diadLrk sampai agarose larut. Mendinginkan campuran tersebut dan setelah dingin dituang ke dalam aparatus pencetak
gel.
Diperhatikan jangan sampai
ada
gelembung udara yang terbentuk. Gel akan mengeras setelah 30-45 menit pada suhu ruang. Secara hati-hati Sisir gel dilepaskan dan gel diletakkan ke dalam tangki elektro-
foresis. BufTer elektrotbresis ditambahkan sampai gel terendam (tinggi buffer kurang
: 02 Mei 2006, ISSN 085NU8
120
lebih I mm di atas permukaan gel). Sampel DNA plasmid bakteri dan loading dye dicampur masing-masing 12 pl dan 3 pl secara berturut-turul dengan bantuan mikropipet sampel DNA diisikan ke dalam sumur gel. Tutup tangki elektroforesis, dan aparatus elektroleresis dihubungkan dengan aliran listrik sehingga DNA akan bergerak ke arah anoda. Aparatus elektroforesis diaktifkan pada
75 volt sampai loading dye yang berwarna biru berada kira-kira 5 mm dari bagian bawah gel. Tahap akhir, aliran listrik dimatikan dan tutup tangki eletroforcsis dibuka, kemudian gel diangkat dari tangki dan direndam dalam etirlium bromida selama l0 menit untuk diamati di bawah cahaya ultraviolet. Visualisasi gel pada transiluminator dan
Gambar
l.
Hasil elektroforesis gel
agarose
menunjukkan adanya DNA plasmid pada kelompok bakteri Citrobacter sp (kolom 2,4,6,8, dan l0). Keterangan: kolom 1 sampai l0 secara berturutturut adalah: L. bulgaris, C. ferundii (isolat A), L. acedo/hilus, C. ferundii (isolat B), L. cassei, C. ferundii (isolat C), L. lactis (isolat Al), C. ferundii (isolat D), L. Iactis (isolat A2), dan C. ferundii (isolat E).
membuat foto gel.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini berhasil diisolasi DNA plasmid isolat bakteri yang digunakan.
Visualisasi pada agarose gel elektroforesis mendapatkan pita-pita yang menunjukkan adanya DNA plasmid yang
Hasil isolasi menggunakan metode Miniprep berhasil mendeteksi DNA plasmid bakteri kelompok Citrobacter sp. tetapi DNA plasmid semua isolat asal bakteri asam laktat (BAL) tidak berhasil diisolasi (Gambar I kolom l, 3, 5, 7 dan 9). Hasil ini berbeda dengan yang telah dilaporkan oleh Stanisch
juga berhasil
diisotasi namun belum diketahui berapa ukuran dari DNA plasmid rersebut (Gambar 1). Pada gambar tersebut terlihat adanya plasmid-plasmid pada bakteri Citrobacter .ferundii (isolat A pada kolom 2), C. ferunrtii (isolat R pada kolonr 41, C. ferundii (isolat C pada kolorn 6), Citrohut.tcr .farundii (isolat D pada kolorn 8) dan ('. ./arwulii(isolat E pada
(1984) bahwa Lactobacillus mempunyai
plasmid. Kemungkinan tidak adanya plasmid yang berhasil diisolasi pada sampel tersebut adalah adanya mekanisme curing plasmid. Curing plasmid merupakan proses hilangnya plasmid secara spontan dari sel bakteri. proses
kolorn l0).
tersebut dapat diakibatkan karena penambahan
bahan kirnia atau secara fisik. Dapat juga terjadi karena penghambatan replikasi pada DNA plasmid yang tidak disertai dengan penghambatAn terhadap replikasi kromosom, sehingga dalam beberapa periode keturunan plasmid akan hilang dari sel (Dale 1994). Selain itu sampel BAL berasal atau diisolasi dari makanan (media) yang telah difermentasi.
Diduga selama proses pertumbuhan BAL
tidak pernah atau sangat jarang AGRIPLUS, Volume 16 l\fomor
:
02 Mei 2006, ISSN 0g54-0129
terpapar
121
dengan antibiotik. Sementara kelompok bak-
dalam ultra-sentrifugasi atau terkena
teri Citrobacter mungkin diisolasi dari bahan yang sering terpapar dengan antibiotik sehingga hasil elektroforesis menunjukkan adanya plasmid. Adanya plasmid pada kelompok bakteri Citrobacter juga dimungkinkan karena termasuk kelompok bakteri patogen. Seperti diketahui bahwa plasmid bakteri membawa gen yang mensandikan ketahanan terhadap antibiotik' atau bakteriosin (plasmid R) (Savagado 2004). Keberdaan gen tersebut merupakan salah satu strategi dari bakteri untuk mempertahankan keberadaannya. Umumnya bakteri patogen memiliki satu atau beberapa plasmid yang berfungsi untuk bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan atau pada media yang mengandung antibiotik.
lakuan elektroforesis oleh suatu medan listrik. Oleh karena itu fragmen-fragmen DNA dapat
dipisahkan dengan elektroforesis yaitu suatu proses dimana medan listrik digunakan untuk
menggerakkan fragmen-fragmen DNA melalui ge-gel agarose yang berpori. Fragmenfragmen yang lebih kecil bergeiak lebih cepat daripada fragmen-fragmen yang lebih besar,
sehingga ukuran besarnya fragmen dapat diperkirakan dengan membandingkan posisiposisinya dalam gel dengan posisi molekulmolekul DNA yang telah diketahui ukurannya.
KESIMPULAN DAN SARAN
Plasmid R membuat sel inang menjadi resisten
terhadap satu atau beberapa antibiotih dan dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lain yang tidak mempunyai plasmid R, serta dapat berpindah dengan sendirinya dari satu sel ke lain. Adanya plasmid pada genus tersebut juga
telah dilaporkan oleh Stanisch
(1984). R dari
Keberhasilan mengisolasi plasmid Citrobacter memungkinkan untuk mengembangkan menjadi vektor bagi DNA rekombinan, plasmid dengan gen resisten dapat digunakan sebagai penanda seleksi dalam rekayasa genetik (Becker et al.2Q00). Beberapa peneliti melaporkan bahwa untuk mengekstraksi DNA bakteri perlu memper-
hatikan media tumbuh yang digunakan, spesifikasi dan sensitivitas, dan kecepatan
Isolasi DNA plasmid menggunakan
metode QIAprep Miniprep
bakteri Citrobacter Sp, sedangkan pada kelompok bakteri Lactobacillus sp tidak ditemukan adanya plasmid. Perlu penelitian lanjutan menggunakan teknik ekstraksi yang
lebih (modifikasi) sesuai dengan karakater bakteri gram positif.
DAFTAR PUSTAKA Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J. 2000. The
worl of the cell. The Cumming Publishing
AGRfPLUS, Volume 16 Nomot
Benjamin/ Company.
Amsterdam.8TSp
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning
Gen.
Yayasan Essential Medica Yogyakarta. 274p
Campell
sumuran tempat memasukkan sampel. Diduga ukuran DNA plasmid bakteri tersebut cukup
besar yang ditunjukkan dengan pergerakan yang lambat pada saat diberi medan listrik 70 volt. Watson et al (1992) menguraikan bahwa DNA supercoil mendapatkan konfigurasi yang lebih padat daripada ekuivalennya yang relaxed. Jadi DNA supercoil bergerak lebih cepat daripada DNA relaxed bila diendapkan
berhasil
mendeteksi adanya plasmid pada kelompok
senhifugasi menentukan keberhasilan ekstasi (Louws dan Cuppels 2001; Ogunbanwo 2003).
Hasil elektroforesis selama kurang lebih 1 jam dengan konsentrasi agar ZYo menunjukkan bahwa DNA plasmid bakteri Citrobacter masih berada sedikit dibawah
per-
'4,. 1981. Evolutionary significance of accessory DNA elements in bacteria. Annual Review of Microbiology 35:5583
Dale
iW.
1994, Molccular Genetics Jhons Wiley & Sons. 287p
of
Bacteria.
Louws FJ and Cuppcls.200l . Moleculer Technique s. Di dalam: Schaad NW, Jones JB, and Chun
W. editor: Plant
: 02 Mei 2006, ISSN 085+0U8
122
Pathogenic Bacteria. Minnesota. Hlm.32 l -337
Goto
M.
1990. Fundamental
APS
Savagado 2004. Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from Burkina Faso Fermented Milk. Pakistan Journal of Nutrition 3 (3):174-179
Press.
.
of Bacterial
plant
pathology. Academic Press. 342p
Stanisich
Watson JD, Witkowski J, Gilman M, and Zoller M. 1992. Recombinant DNA. Second Edition. Scientific American Books. New
VA.
in Microbiology 17:5-33 '
York. 626 p.
Torres-Pacheco
ST. 2003. lnfluence of cultural condition on the production of
Ogunbanwo,
Sambrook
Bartletl Pul., Inc. Boston.
Hal:247-280.
AGRIPLUS,Volume 16 Nomot
Gatzon-Tiznado JK,
RiveraBustamante. 1996. Detection and Distribution of Geminiviruses in Mexico and the Souther United States. Phytopathology 86: 1 I 86-1 192.
Preifelder D. 1987. Plasmids. Microbial Genetics.
&
IJA,
Brown 4., Beccera Flora Dan
bacteriocin by Lactobacillus brevis OGl. African Journal of Biotechnology vol.2(7):179-184 Jones
1984. Identification and analysis of plasmid at the genetic level. Di dalam: Bennett PM and Grisnted J . Methods
J, Frietsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition. CSH Cold Spring Harbor Laboratory Press.
:
02 Mei2006, ISSN0SS+0128
