12 menjadi planlet/tanaman. Hormon NAA cenderung menginduksi embrio somatik secara langsung tanpa pembentukan kalus. Embrio somatik yang dihasilkan lebih normal dan mudah dikecambahkan menjadi planlet/tanaman, tetapi jumlahnya lebih sedikit (Bhojwani dan Razdan 1989). Penggunaan jenis eksplan yang bersifat meristematik umumnya memberikan keberhasilan pembentukan embrio somatik yang lebih tinggi. Eksplan yang digunakan dapat berupa aksis embrio zigotik muda dan dewasa, kotiledon, mata tunas, epikotil maupun hipokotil (Vesco dan Guerra 2001). Untuk inisiasi kalus umumnya digunakan auksin 2,4-D saja atau dikombinasikan dengan sitokinin. Zat pengatur tumbuh 2,4-D efektif dalam menginduksi kalus, hal ini telah dibuktikan dalam penelitian Sari et al. (2005) bahwa penggunaan 2,4-D secara tunggal pada konsentrasi rendah mampu menginduksi kalus gambir. Winarsih et al. (2003) juga menyebutkan bahwa persentase eksplan menghasilkan embrio kakao akan lebih tinggi jika menggunakan auksin (2,4-D 2 mg/L) yang lebih tinggi konsentrasinya dan konsentrasi sitokinin rendah (adenin 0.1 mg/L) dibandingkan dengan menggunakan konsentrasi auksin (2,4-D) rendah.
3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan tempat Penelitian ini akan dilakukan di laboratorium Bioteknologi dan Pemuliaan Pohon serta rumah kaca SEAMEO-BIOTROP. Penelitian berlangsung selama 14 bulan, yaitu dari bulan Mei 2011 sampai dengan Juli 2012. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah: laminar air flow cabinet, autoklaf, timbangan analitik dengan ketelitian 10-4 digit, hot plate dengan magnetic stirer, botol kultur, gelas ukur (500 mL dan 1000 mL), gelas piala 500 mL dan 1000 mL, cawan petri, pengaduk, sendok, gunting, pinset dan skalpel, lampu bunsen, penghitung waktu, rak kultur, sprayer. Bahan yang digunakan adalah anakan matoa, embrio, endosperma, media dasar Murashige-Skoog (MS), zat pengatur tumbuh naphthalen acetic acid (NAA) dan Kinetin, indole butirat acid (IBA), aquades, alkohol, deterjen, bakterisida (Agrept 20WP), fungisida (Dithane M-45 80WP), kertas lakmus, Hiponex merah, gelas plastik, plastik bening, karet gelang, tissue, pasir dan arang sekam yang telah disterilkan. 3.3 Metode Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap yaitu: penelitian pendahuluan dan penelitian utama. 3.3.1 Penelitian pendahuluan Eksplan yang akan digunakan diperoleh dari anakan matoa hasil cabutan alam yang dipelihara secara intensif yang diambil bagian pucuk dan daunnya,
13 serta buah yang diperoleh dari alam juga yang diambil embrio dan bagian endosperm. Penelitian tahap ini ditujukan untuk pengujian beberapa perlakuan teknik sterilisasi yang akan diterapkan untuk memperoleh eksplan steril dalam jumlah banyak. Perlakuan teknik sterilisasi yang dilakukan adalah : S1 : Penggunaan bakterisida 0.2 g/100 mL dan fungisida 0.2 g/100 mL dengan lama perendaman 5 menit S2 : Penggunaan bakterisida 0.2 g/100 mL dan fungisida 0.2 g/100 mL dengan lama perendaman 10 menit S3 : Penggunaan bakterisida 0.4 g/100 mL dan fungisida 0.4 g/100 mL dengan lama perendaman 5 menit S4 : Penggunaan bakterisida 0.4 g/100 mL dan fungisida 0.4 g/100 mL dengan lama perendaman 10 menit. Persiapan Alat dan Bahan Alat-alat seperti cawan petri, gunting, pinset dan skalpel yang akan digunakan dalam kegiatan ini disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Air destilasi yang akan digunakan disterilkan dengan menggunakan autoklaf selama 30 menit, laminar air flow cabinet disterilisasi dengan menggunakan alkohol. Fungisida dan bakterisida yang telah ditimbang dicampurkan dalam 100 ml air steril lalu diaduk (setiap perlakuan). Eksplan pucuk yang akan digunakan diambil dari semai atau anakan yang berasal dari alam dengan ukuran berkisar antara 1−3 ruas teratas (pucuk dorman). Eksplan daun diambil dari semai yang berasal dari alam. Eksplan embrio dan endosperma diambil dari buah yang diambil dari pohon induk. Seluruh eksplan yang telah disiapkan sebelumnya dicuci di bawah air mengalir hingga bersih. Tahap selanjutnya eksplan yang telah dibersihkan dimasukkan dalam larutan fungisida dan bakterisida sesuai perlakuan. Pembuatan Media Dasar MS Pembuatan media dasar MS menggunakan acuan Gunawan (1992). Tahapan pembuatan media dasar MS yang pertama adalah mempersiapkan larutan stok sesuai dengan konsetrasi yang ditetapkan yaitu stok A dan B 20 mL, C dan D 10 mL, E dan F 5 mL, Vitamin 1 mL, myo-inositol 10 mL (Lampiran 1). Setelah itu gula sebanyak 30 g dimasukkan dan tambahkan aquades sebanyak 500 mL dan larutkan di atas hot plate. Selanjutnya, larutan stok yang telah disiapkan dimasukkan lalu diukur pH (pH 5.6–5.8) dan tambahkan aquades hingga tanda tera. Tahap berikutnya agar-agar sebanyak 8 g dimasukkan dan aduk hingga mendidih. Tahap terakhir media tersebut dituang ke dalam botol kultur dan selanjutnya di sterilisasi dalam autoclave selama 15 menit. Penanaman Eksplan pada Media MS Setelah eksplan-eksplan tersebut selesai diberikan perlakuan, tahap berikutnya adalah penanaman eksplan pada media MS yang telah dibuat. Penanaman dilakukan dalam laminar air flow cabinet (LAFC). Eksplan-eksplan tersebut ditiriskan pada cawan petri yang telah dialasi dengan tissue steril. Selanjutnya eskplan dipotong dengan ukuran kurang lebih 1 ruas (untuk pucuk,
14 daun dan endosperma) dan embrio yang telah dipotong dari biji lalu ditanam pada media MS yang telah disiapkan. Pengamatan dan Pengukuran Eksplan yang telah diberi perlakuan selanjutnya ditanam pada media dasar MS dan disimpan pada ruang inkubasi dan diamati. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 3 minggu dengan melihat ada atau tidaknya kontaminasi yang muncul serta berapa banyak eskplan yang tidak terkontaminasi. Data pengamatan selanjutnya digunakan untuk menghitung Persentase eksplan kontaminasi dan eksplan steril dengan menggunakan rumus: Persentase eksplan steril (ES)
=
Jumlah eksplan steril x 100 % Total seluruh eksplan
Persentase eksplan kontaminasi (EK)= Jumlah eksplan kontaminasi x 100% Total eksplan yang ditanam
3.3.2 Penelitian Utama Penelitian utama terdiri dari 2 sub-penelitian, yaitu : a. Pengaruh media pada pembentukan organogenesis eksplan matoa Pada penelitian ini dilakukan pembentukan akar dan daun hingga tahap aklimatisasi, bahan tanaman (eksplan) yang digunakan berupa pucuk dan embrio matoa. b. Induksi kalus embriogenik, bahan tanaman (eksplan) yang digunakan berupa daun dan bagian endosperma. 3.3.2.1 Pengaruh media pada pembentukan organogenesis eksplan Pembuatan media perlakuan Pembuatan media MS dengan penambahan zat pengatur tumbuh sesuai masing-masing perlakuan antara lain : media MS yang diperkaya dengan NAA 0.5 ppm + Kinetin 1 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 1 ppm + Kinetin 1.5 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 1.5 ppm + Kinetin 2 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 2 ppm + Kinetin 2.5 ppm. Pembentukan organogenesis Eksplan (pucuk dan embrio) hasil sterilisasi selanjutnya dikulturkan pada media MS yang diperkaya dengan zat pengatur tumbuh untuk pembentukan organ. Eksplan yang telah ditanam selanjutnya disimpan pada ruang inkubasi dan diamati setiap hari. Pengamatan dan pemeliharaan Eksplan yang telah ditanam pada botol kultur selanjutnya disimpan pada ruang kultur dengan suhu 25 0C serta lama penyinaran 12 jam per hari. Pengamatan setiap hari dan pengukuran dilakukan satu minggu sekali selama 4
15 bulan setelah penanaman. Pengamatan yang dilakukan adalah waktu munculnya daun, jumlah daun yang muncul, waktu terbentuknya akar dan jumlah akar (dihitung pada akhir penelitian). Aklimatisasi Planlet hasil organogenesis selanjutnya di aklimatisasi pada media pasir dengan arang sekam dengan perbandingan 1:1 (v/v). Media pasir dan arang sekam yang akan digunakan sebagai perlakuan terlebih dahulu disterilisasi dengan autoklaf supaya bebas dari mikroorganisme yang dapat menyebabkan kematian planlet. Planlet matoa yang berada di dalam botol dikeluarkan dan dicuci pada air mengalir dengan tujuan agar tidak ada media agar-agar yang terikut, selanjutnya planlet tersebut dicelupkan pada larutan hormon IBA 1 ppm selama 5 menit lalu ditanam pada media perlakuan yang telah disiapkan. Planlet yang diaklimatisasi disemprot dengan pupuk daun (hiponex merah) seminggu sekali. Pengamatan dilakukan setiap hari dan pengukuran dilakukan seminggu sekali selama 2 bulan setelah penanaman pada media. Pengamatan dilakukan dengan mengamati jumlah planlet yang hidup, jumlah daun dan jumlah akar. Rancangan Penelitian dan Analisis Data Rancangan yang digunakan dalam pembentukan organogenesis adalah rancangan acak lengkap (RAL), yang terdiri dari 5 perlakuan dan 10 ulangan. Perlakuan yang diberikan adalah sebagai berikut: A : Media MS yang tidak diperkaya dengan zat pengatur tumbuh B : Media MS yang diperkaya dengan NAA 0.5 ppm + Kinetin 1 ppm C : Media MS yang diperkaya dengan NAA 1 ppm + Kinetin 1.5 ppm D : Media MS yang diperkaya dengan NAA 1.5 ppm + Kinetin 2 ppm E : Media MS yang diperkaya dengan NAA 2 ppm + Kinetin 2.5 ppm Model matematis rancangan acak lengkap menurut Mattjik (2002) adalah : Yij = μ + αi + εij ; i = A, B, C, D, E j = 1,2, 3,...,10 Keterangan : Yij : Respon pertumbuhan pucuk pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ : Nilai tengah pengamatan
αi εij
: Pengaruh perlakuan media ke-i : Galat percobaan dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j
Data yang diperoleh selanjutnya diolah menggunakan perangkat statistik SAS dan apabila terdapat data yang signifikan maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan.
16 3.3.2.2 Pengaruh media untuk induksi kalus embriogenik Pembuatan media perlakuan Pembuatan media MS dengan penambahan zat pengatur tumbuh sesuai masing-masing perlakuan antara lain: media MS yang diperkaya dengan NAA 0.5 ppm + Kinetin 1 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 1 ppm + Kinetin 1.5 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 1.5 ppm + Kinetin 2 ppm, media MS yang diperkaya dengan NAA 2 ppm + Kinetin 2.5 ppm. Penanaman eksplan Eksplan (daun dan endosperma) yang digunakan untuk induksi kalus diperoleh dari hasil penelitian pendahuluan. Eksplan dipotong-potong dengan ukuran ± satu ruas (lebih kurang 1 cm) lalu ditanam pada media perlakuan yang telah dibuat pada tahap pertama. Inkubasi, pemeliharaan dan pengamatan Eksplan yang telah ditanam pada botol kultur disimpan pada ruang inkubator dengan suhu 25 0C serta lama penyinaran 12 jam per hari. Pengamatan setiap hari dan pengukuran dilakukan satu minggu sekali selama 6 bulan setelah penanaman. Pengamatan yang dilakukan adalah waktu terbentuknya kalus, persentase kalus embriogenik, persentase kalus non-embriogenik, persentase kalus yang tidak terbentuk dan warna kalus. Rancangan Penelitian dan Analisis Data Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL), yang terdiri dari 4 perlakuan dan 10 ulangan. Perlakuan yang diberikan adalah sebagai berikut: M1 : Media MS yang diperkaya dengan NAA 0,5 ppm + Kinetin 1 ppm M2 : Media MS yang diperkaya dengan NAA 1 ppm + Kinetin 1.5 ppm M3 : Media MS yang diperkaya dengan NAA1.5 ppm + Kinetin 2 ppm M4 :Media MS yang diperkaya dengan NAA 2 ppm + Kinetin 2.5 ppm Model matematis rancangan acak lengkap menurut Mattjik (2002) adalah : Yij = μ + αi + εij ; i = A, B, C, D j = 1,2, 3,...,10 Keterangan : Yij : Respon pertumbuhan pucuk pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
μ αi εij
: Nilai tengah pengamatan : Pengaruh perlakuan media ke-i : Galat percobaan dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j
Data yang diperoleh selanjutnya diolah menggunakan perangkat statistik SAS dan apabila terdapat data yang signifikan maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan.
