Proměnlivost a evoluce rostlin
Petr Smýkal Katedra botaniky, PřF UPOL 2012/13
Metody detekce a analýzy variability a evoluce rostlin
1. Morfometrie 2. Biochemické markery 3. Mikrosatelitní markery 4. Retrotransposonové markery 5. Genově specifické markery 6. Markery pro fylogenetické analýzy
Morphometrics refers to the quantitative analysis of form, a concept that encompasses size and shape. Morphometric analyses are commonly performed on organisms, and are useful in analyzing their fossil record, the impact of mutations on shape, developmental changes in form, covariances between ecological factors and shape, as well for estimating quantitative-genetic parameters of shape. Morphometrics can be used to quantify a trait of evolutionary significance, and by detecting changes in the shape, deduce something of their ontogeny, function or evolutionary relationships. A major objective of morphometrics is to statistically test hypotheses about the factors that affect shape Three general approaches to form are usually distinguished: • traditional morphometrics • landmark-based morphometrics • outline-based morphometrics
PC1
P C2
PC 3
PC4
PC5
V ar ia n ce
4 .4 29
2 .7 8 3
1 .8 3 8
1 .1 80
0 .8 6 7
% T o ta l c o n t r ib u t io n
2 9 .53
1 8.5 5
1 2 .2 6
7 .8 7
5 .7 9
% A cc u m u la t ed
2 9 .53
4 8.0 9
6 0 .3 5
6 8 .22
7 4 .0 0
E ig en v a lu es
MorphologicalMatrix ofdescriptors eigenvalues and vectors of principa E ig en v ec t o rs
field and fodder pea assessed in morphologi
S t ip u les- c h a r ac t er o f a n t h o c y a n sp o t
0 .9 17
-0,0 9 5
F lo w e r - v ex illu m co lo u r
-0,1 2 3 -0 ,2 5 6 -0 ,05 4 Qualitative traits 0 ,8 98 -0,0 9 4 -0 ,2 8 0 -0 ,03 7 (15) 0 ,8 76 -0,0 7 8 -0 ,2 5 3 -0 ,10 2
L e afle t- m a r g in sh a p e o n t h e s ec o n d r ea lle af
0 ,0 84
F lo w e r - w in g s co lo u r
S ee d - fu n ic u lu s st a b ilit y
0 ,2 69 Eigenvalues
-0,1 6 6
-0,1 8 7
0 ,6 9 4
0 ,2 8 2
-0 ,53 1
-0,0 8 0
-0,1 7 1
0 ,6 7 7
-0 ,09 0
0 ,5 1 8
L e afle t- m a r g in sh a p e a t t h e fir s t flo w e r in g n o d e
0 ,0 80
0 ,7 3 5
0 ,2 9 4
-0 ,41 4
-0,1 4 6
S ee d - c olo u r a t fu ll r ip en e ss
0 ,8 05
-0,0 8 6
0 ,3 4 4
0 ,1 95
-0,1 4 0
Variance
S ee d - c ot y le d o n s c o lo u r
% Total contribution 0 ,0 78 0 ,0 0 0
0 ,7 3 6
0 ,4 30
-0,2 5 5
L e af- t y p e
0 ,2 35 % Accumulated
0 ,7 3 0
-0 ,1 0 5
0 ,2 68
0 ,2 1 0
S ee d - h ilu m c o lo u r
Eigenvectors
0 ,5 75
-0,1 6 5
0 ,0 6 2
-0 ,04 8
0 ,4 9 1
0 ,1 01
0 ,7 3 0
0 ,0 2 4
0 ,0 58
-0,0 3 6
-0 ,3 8 4
0 ,2 46
0 ,3 0 5
-0 ,1 2 2
0 ,4 58
0 ,0 2 4
L e afle t- c o lou r
Plant-seeds0 ,2number 34 0 ,4 6 0
L e afle t- sh ap e (in th e fir st flo w e r in g n o d e ) L e afle t- a p p e x sh a p e S ee d - t est a c o lo u r S ee d - su r fa c e
Quantitative traits (8)
65 0 ,6 1 5 Plant-pods0 ,1number
0
0
0 ,7 34
-0,0 9 6
0 ,0 4 6
-0 ,28 4
0 ,1 1 4
0 ,5 09
-0,0 4 8
0 ,4 0 6
0 ,2 30
-0,1 4 8
Stem-lenght to first productive node Stem-length
0
0
Thousand seeds weight
-0
Plant-seeds weight Stem-lenght of internode under the first productive node Stem-number of sterile nodes
0
0
0
* Values in the bold are larger than the treshold (average from
Morphological - cathegorical data variation ECN
NAZEV
Shluk
Lodyha Lodyha Lodyha délka do Lodyha déka pod Lodyha poèet Lodyha Lodyha vìtvení Lodyha Lístek tvar v Lístek tvar okraje List typ tvar délka 1. prod. nodu 1. prod nodem sterilních nodù typ vìtví na bázi olistìní 1 kvìt nodu u 2 prav listu
Var. koeficient 0,0 Adept 1 1 Alan 1 1 Bohatyr 1 1 Janus 1 1 Komet 1 1 Merkur 1 1 Pegas 1 1 Primus 1 1 Romeo 1 1 Sonet 1 1 Baryton 2 1 Hardy 2 1
L0100762 L0100777 L0100530 L0100732 L0100736 L0100763 L0100766 L0100765 L0100688 L0100761 L0100978 L0100982
ECN
NAZEV
L0100762
Adept
L0100762 L0100762
12,5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
12,9 5 6 4 5 5 5 6 5 6 5 5 5
20,2 6 6 5 6 6 5 5 6 6 6 6 6
11,3 5 6 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4
75,5 6 4 4 8 9 9 5 9 7 6 1 1
50,3 1 3 3 1 3 2 2 2 1 2 1 1
82,7 7 7 6 6 6 7 6 7 6 6 1 1
67,2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1 1
23,1 2 5 3 3 3 3 2 2 2 4 0 0
43,0 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 0 0
Lodyha Lodyha Lodyha poèet Lodyha Lístek tvar Lístek tvar Lístek tvar Lodyha délka do 1. déka pod 1. sterilních Lodyha vìtvení Lodyha v 1 kvìt okraje u 2 okraje v 1 Lístek tvar Lístek Opakování Lodyha tvar délka prod. nodu prod nodem nodù typ vìtví na bázi olistìní List typ nodu prav listu kvìt nodu vrcholu barva
A
1
4
5
6
5
9
1
7
5
2
1
1
2
7
Adept
B
1
4
5
6
5
9
0
7
5
2
1
1
2
7
Adept
C
1
4
5
7
5
5
1
5
5
3
1
1
2
3
"Traditional" morphometrics Traditional morphometrics analyzes lengths, widths, masses, angles, ratios and areas. In general, traditional morphometric data are measurements of size. A drawback of using many measurements of size is that most will be highly correlated; as a result, there are few independent variables despite the many measurements. In landmark-based geometric morphometrics that spatial information is contained in the data, because the data are coordinates of landmarks (landmark points): discrete anatomical loci that are arguably homologous in all individuals in the analysis.
D'Arcy Wentworth Thompson (1860 - 1948) Vydání 1917
Základy biologické matematiky
Transformační mřížky
Procrustes-based geometric morphometrics Shape analysis begins by removing the information that is not about shape. By definition, shape is not altered by translation, scaling or rotation. Thus, to compare shapes, the non-shape information is removed from the coordinates of landmarks. There is more than one way to do these three operations. One method is to fix the coordinates of two points to (0,0) and (0,1), which are the two ends of a baseline. In one step, the shapes are translated to the same position (the same two coordinates are fixed to those values), the shapes are scaled (to unit baseline length) and the shapes are rotated. An alternative, and preferred method, is Procrustes superimposition. This method translates the centroid of the shapes to (0,0); the x centroid of the centroid is the average of the x coordinates of the landmarks of an individual, and the y coordinate of the centroid is the average of the y-coordinates. Shapes are scaled to unit centroid size, which is the square root of the summed squared distances of each landmark to the centroid. The configuration is rotated to minimize the deviation between it and a reference, typically the mean shape. In the case of semi-landmarks, variation in position along the curve is also removed. Because shape space is curved, analyses are done by projecting shapes onto a space tangent to shape space. Within the tangent space, conventional multivariate statistical methods such as multivariate analysis of variance and multivariate regression, can be used to test statistical hypotheses about shape.
Popis fenotypového projevu Semeno-barva v plné zralosti 1. světležlutá 2. žlutorůžová 3. vosková/dvoubarevná 4. žlutozelená 5. šedozelená 6. tmavozelená 7. světlehnědá 8. hnědá 9. černá Číselné zhodnocení průměrných pozic souřadnic L,a,b v CIE-LAB barevném prostoru (3D)
Colour deviation: ΔEa,b ΔEa,b=(ΔL2+Δa2+Δb2)1/ 2
Linum: velikost a tvar semen; parametry průměrné hodnoty Kalibrace Area – 0,08 µm/px Flax Amon Bonet Jantar Jitka Lola Marylin Rina
Area
EqDiameter
8,01a 7,42ab 9,34a 7,37ab 8,76a 7,83ab 7,04b
3,192 3,056 3,445 3,061 3,336 3,155 2,992
Perimeter MaxFeret
11,190 12,033 12,082 10,584 11,851 11,367 10,269
4,585 4,814 4,953 4,164 4,731 4,471 4,125
MinFeret
Circularity
Elongation
2,338 2,266 2,518 2,398 2,522 2,393 2,298
0,804 0,755 0,802 0,828 0,785 0,771 0,839
1,962 2,065 1,969 1,738 1,878 1,873 1,798
Statistické rozdíly (ANOVA, α<0.05)
Vyhodnocení dat v programu MATLAB R2009a … shluková analýza všechny parametry
Area statisticky odlišné od odrůdy AMON
hnědá semena
žlutá semena
Heritabilita a vzájemná korelace znaků Matrix of eigenvalues and vectors of principal components for 15 qualitative characters of field and fodder pea assessed in morphological trials
PC1
Principal components (PC) PC2 PC3 PC4 PC5
PC6
Variance
4.429
2.783
1.838
1.180
0.867
0.790
% Total contribution
29.53
18.55
12.26
7.87
5.79
5.27
% Accumulated
29.53
48.09
60.35
68.22
74.00
79.27
Stipules-character of anthocyan spot
0.917
-0,123
-0,256
-0,054
-0,095
0,010
Flower-wings colour
0,898
-0,094
-0,280
-0,037
-0,166
-0,023
Flower-vexillum colour
0,876
-0,078
-0,253
-0,102
-0,187
-0,087
Leaflet-margin shape on the second realleaf
0,084
0,694
0,282
-0,531
-0,080
0,069
Seed-funiculus stability
0,269
-0,171
0,677
-0,090
0,518
0,151
Leaflet-margin shape at the first flowering node
0,080
0,735
0,294
-0,414
-0,146
0,116
Seed-colour at full ripeness
0,805
-0,086
0,344
0,195
-0,140
-0,055
Seed-cotyledons colour
0,078
0,000
0,736
0,430
-0,255
-0,119
Leaf-type
0,235
0,730
-0,105
0,268
0,210
-0,216
Seed-hilum colour
0,575
-0,165
0,062
-0,048
0,491
-0,393
Leaflet-colour
0,101
0,730
0,024
0,058
-0,036
-0,443
Leaflet-shape (in the first flowering node)
0,234
0,460
-0,384
0,246
0,305
0,406
Leaflet-appex shape
0,165
0,615
-0,122
0,458
0,024
0,227
Seed-testa colour
0,734
-0,096
0,046
-0,284
0,114
0,181
Seed-surface
0,509
-0,048
0,406
0,230
-0,148
0,277
Eigenvalues
Eigenvectors
Biochemické markery Isozymy (isoenzymy) – enzymy odlišující se v aminokyselinové sekvenci ale katalyzující stejnou chemickou reakci first described by R. L. Hunter and Clement Markert (1957) who defined them as different variants of the same enzyme having identical functions and present in the same individual. This definition encompasses (1) enzyme variants that are the product of different genes and thus represent different loci (described as isozymes) and (2) enzymes that are the product of different alleles of the same gene (described as allozymes).
Aspartate Aat-A Aat-B aminotransferase 3 4 4 2 1 2 3 Acid phosphatase Acp-A 1 4 7 Diaphorase Dia-A Dia-B 2 1 Esterase Est-A Est-B 3 3 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 2 3 Glutamate dehydrogenase Gdh-A 2 2 2 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 5 1
Aat-C 3 4 3
Isocitrate dehydrogenase 2 3 Leucine aminopeptidase 1
Idh-A 2 1 Lap-A 4
Idh-B
Malate dehydrogenase 1
Mdh-A 2
Mdh-B 2 4 1 Pgi-B
Mdh-C 2
Pgd-A 3 1 Pgm-B
Pgd-B
? 2 Phosphoglucose isomerase Pgi-A ? 4 6-Phospho-gluconate dehydrogenase 2 4 4 1 Phosphogluco-mutase Pgm-A 2 2 2 2 Superoxide dismutase Sod-A 1 1
1
Lagercrantz 1988 Lundquist 1979 Poulsen et al. 1983 Muona et al. 1987
Acp-B Bergmann 1978 Lunquist 1977 Lagercrantz 1988
Est-C 2 Gpdh-A
Bergmann 1973 Scholz & Bergmann 1984 Muona et al. 1987
Gdh-B Scholz & Bergmann 1984 Lundquist 1979 Lagercrantz 1988
Gpi-A
Gpi-B Lagercrantz 1988
Scholz & Bergmann 1984 Lagercrantz 1988 Lap-B Bergmann 1973
?
Mdh-D Poulsen et al. 1983 Scholz & Bergmann 1984 Lagercrantz 1988 Muona et al. 1987 Pgd-C Poulsen et al. 1983 Lagercrantz 1988 Poulsen et al. 1983 Scholz & Bergmann 1984
Sod-B Lagercrantz 1988
Výhody isozymových markerů: • • • •
Univerzálnost Jednoduchost stanovení Vysoký polymorfismus Ko-dominance (možnost detekce heterozygotů)
Nevýhody isozymových markerů: • • • • •
Nutnost práce s čerstvým materiálem Závislost na ontogenetickém stáří a typu pletiva Vliv prostředí – problém porovnání mezi lokalitami, lety Limitovaný polymorfismus Dostupnost přibližně 40 isozymových systémů
Proteiny zásobních orgánů – semen/hlíz
SDS-PAGE (denaturační podmínky elektroforetické separace)
Podobné výhody i nevýhody jako isozymy, menší polymorfismus, ale i menší závislost na prostředí
Genetický marker je známá sekvence DNA, která může být jednoduše identifikována. Lze jej popsat jako jistý druh variace, způsobený mutací či pozměněním původní sekvence, který se sleduje na předem daném místě.
Genetickým markerem může být krátká sekvence DNA, například úsek DNA se změnou jednoho páru bází (SNP marker), případně delší repetitivní úsek, zvaný mikrosatelit. Některé běžné typy genetických markerů jsou • RFLP (neboli Restriction Fragment Length Polymorphism) • AFLP (neboli Amplified Fragment Length Polymorphism) • RAPD (neboli Random Amplification of Polymorphic DNA) • VNTR (neboli Variable Number of Tandem Repeat) • SNP (neboli Single Nucleotide Polymorphism) • STR (neboli Short Tandem Repeat)
RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) No knowledge of the DNA sequence for the targeted gene is required, as the primers will bind somewhere in the sequence, but it is not certain exactly where. RAPD markers are decamer (10 nucleotide length) DNA fragments from PCR amplification of random segments of genomic DNA with single primer of arbitrary nucleotide sequence and which are able to differentiate between genetically distinct individuals, although not necessarily in a reproducible way. Nevýhody: Dominantní marker, nízká reprodukovatelnost, homoplasie fragmentů
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Výhody: Univerzálnost Není nutné znát sekvenci DNA Vysoký polymorfismus Fingerprinting – hodně dat/experiment
Nevýhody: Technická a metodická náročnost Riziko homoplasie
Mikrosatelitní markery Typy- klasifikace (dle sekvence):
• Perfect / simple perfect – složené z jednoho motivu (CA)n DI/TRI/TETRA – CA/CCA/CCAA • Simple imperfect repeats – přerušený motiv (CA)n N (CA)n
• Compound repeats – složené ze 2 a více motivů (CA)n (GA)n • Interupted compound repeats – přerušené, složené s mutací (CCA)n NN(GCA)n+1
Mikrosatelitní markery V genech
- v kódujících oblastech (exonech) často Trinukleotidové
- v intronech , UTR oblastech, promotorech
Mezi geny
- intergenerické
Mechanismus vzniku
• Single-strand slippage (svezení) DNA polymerasy během replikace • Unequal crossing over a genová konverze během DNA rekombinace • Interakce mezi replikační svezením a rekombinací
Mikrosatelitní markery - detekce
1) PCR amplifikace
------- Forward primer--->>>>>> A1 A2 A3 A4
TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT--GAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC TGAATGGTGACAACACCTCTACTCAGTTCACACGTGTGTGTGTGTG--------------------AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGAAATTTCATCTGAACAAATGCTTCTGCAC <<<< ---Reverse primer --------
Nutnost znát sekvenci přilehlou k repetici – tj. druhová specificita což je nejnákladnější pro vývoj nových SSR markerů pro daný druh a omezuje to následně i transferibilitu
Mikrosatelitní markery - detekce 1) Elektroforetická separace fragmentů (odlišení cca 8-10 bp) 2-3% NuSieve agarózový gel, 10-12% PAGE
------- CACACACACACA ----------- A -------- CACACA ---------------------- B -------- CACACACACACACACA ---- C
C
A B
Mikrosatelitní markery automatická fragmentační analýza
Mikrosatelitní markery - detekce 1) Elektroforetická separace fragmentů ( ideálně 1- 2 bp) sekvenační denaturační Urea-akrylamidový gel (6% PAGE)
2) • •
Detekce barvení gelu (EtBr/UV nebo Ag/ VIS) fluorescenční značení primerů - automatizace
Mikrosatelitní markery – odečet velikosti 1) Elektroforetická separace fragmentů Fluorescenčně značené fragmenty - odečet laserem, přesný standard
Mikrosatelity a stabilita
Mikrosatelitní markery Výhody: * vysoký polymorfismus – multi-alelismus * ko-dominance (možnost detekce heterozygotního stavu, směsi) * jednoduchost aplikace metodiky * Mapovatelnost – znalost pozice (lokusu)
Nevýhody: * homoplasie, vysoká mutační rychlost (10-3 – 10-4 na lokus a generaci) * přenos mezi druhy není zcela možný/ aplikovatelný * pro de novo vyvinutí - potřeba sekvenování, obohacené knihovny * přesnost odečtu alel
Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)
Výhody:
* vysoký polymorfismus * není třeba spec. primerů * jednoduchost aplikace metodiky Nevýhody: * malá reprodukovatelnost * dominantní marker
GENOM Geny versus mobilní elementy
Genomové duplikace
Složení eukaryotického genomu (hrách) množství repetitivních sekvencí, méně genů
60 - 80 % repetetivní DNA, 20 – 40% geny + regulační sekvence
Retrotransposony
Transposony
Rozdíl mezi transposony a retrotransposony Transposony cut and paste
šíření mechanismem inzerce v daném místě
nestabilní/mobilní
Retrotransposony copy and paste
stabilní četnost v genomu
X 100 nevhodné
využití jako markeru
x 1000/100 000
vhodné / fylogeneticky informativní
LTR retrotransposons Ty1-copia type Ty3-gypsy type non-LTR retrotransposons autonomous LINE non-autonomous SINE E. coli Yeast Fruitfly human pea Arabidopsis Medicago Lotus maize wheat
4.403 genes 5.538 13.350 30.000 30.000 25.000 30.000 30.000 25.000 25.000
4.6 Mb size 13 120 3.500 4.000 100 550 400 4.500 17.000
Repetetivní sekvence jsou často ve shlucích
Mla lokus rezistence ječmene k padlí - Weis et al. Plant Cell 2002
Retrotransposony a mikrosatelity
----------------/ 1045 bp /----------------------------------------------------------------------------- microsatellite repeat motif ----------------------------/ 277 bp / Pisum_sat-arvense Pisum_elatius Pisum_abyssinicum Pisum-sativum (c4) Pisum_fulvum Lotus_corniculatus Phaseolus_vulgaris Cicer_arietinum Lupinus_angustifolius Vigna_radiata Lupinus_albus Glycine_max Medicago_truncatula Vicia_sativa Vicia_narbonensis Vicia_faba Lathyrus_sativus Lens_culinaris Trifolium_repens Arachis_hypogea Senna_ meridionalis Cassia_sp. Sophora_tomentosa Schotia_afra Erythrina_caffra Delonia_regia Bauhinia_sp. Accacia_karaoo Leucena_leucephala Gleditchia_triacantha
GTGGTTCTATAAATAGA-CCCCTTGGGTAGAAGCATTATCACTCAGACTGAAACTCAAGTAAAGACTTGGAATTTCGTT (TC)23 ACTC GTGGTTCCATAAATAGAACCC-TTGGGTAGAAGCATTGTCACTCTTTTTGTTTCT (TC)7 GC GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCACAAAGTGCGGTTGCATTATTTTCGTTTTCT (TC)8 ACTC GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCACAGTCGGTTGCATTCTTTTCGTTT (TC)14 ATACTCT GTGGTTCTATAAATAGAGCTC-TTGTGCAGAAGCTTTGCAAGTGAATACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC)7 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTTGCGGTTGCATTCTTTTCGTTT (TC)5 ACTCATC GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCATTAAATGGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC)3 AC(TC)6 AC(TC)2 GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTTACTCCACAGTAACTCATGAGACAGACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC)5 GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTAACTCATGAGAAAGAAAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTTGTA (TC)5 GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTGTCACTCCATTCCACTCAGACAGAAATTCAAGTAGAGACTTGGAATTTTGTCTCC (TC)10 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAAAAGCATTGTAACAGACTTGAAATTTCGTTTCT (TC)26 TACACTCTTAC GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAGAAGCATTGTTACACTTGCAATTTCGTTT (TC)22 TAC(TC)3 TATACGTC GTGATTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTTGAAGCATTATCAAAAGTTGTGAAACCCTAGCCGCCGC (TC)3TAAACCTTGT(TC)3 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCTGGAGCATTTAGATCTGATGAAAATTTGGTCTTGAAATCCTAGCCATATTT (TC)2 TTAT (CT)4ACTC GTGAGTCTATAAAAGGAACCC-TTGTGCTGAAGCTTTCATCTAATGAAATTCGGTTTTGAC (TC)6 GTGATTCTATAAATAGATCCC-TTGTGATGAAGCATTTTCACTTGATGCAATTTCTTCTTGC (TC)3AC(TC)4AC(TC)3TTTATC(TA)3TC(TA)4TATCTGTCC TTTGTTCTATAAATAAAACCT-TTGTGCAGAAGCATTCACTCTTGATGAAAATTTGGACTGCGAAACCCTAACCGTATT (TC)4 GC (TC)4ACTC GTGGTTGTATAAATTGAACAC-TTGTGCATAAGCTAAGTTCAATTGTTGAAACCCTACTGAATTTC (TC)3 CC (TC)3 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCTGAAGCAATTCCCTTGATGAAAATTTGGTCTTGAAAGTCTTATTGC (TC)20 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGTATTTGTTCAGATGAAAATTTTGCTT (TC)10 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTGGCGGTTGCATTATTTCGTTTT (TC)9 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCATTTTTGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC)9(AC)2TC GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAGCAAAAATTTGCGGTTGCATTCTTTTCGTTTTCACTCT (TC)6 GTAGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGCAGAAACATATATAGCGTTTGCATTTCGTTT (TC)6 GTGGTTCTATAAATAGAACTC-TTGTGCAGAAGCATTCATGGCGGTTGCATTATTTTCGTTT (TC)4 AC (TC)6 GTGGTTCTAAAAATAGAACCC-TTGTGCAAAAGCATTGATTGCGGTTGCATTATTTTTGTTT (TC)2 AC(TC)10 AC(TC)6 GTTCTATGAATAGAACTC----TTGTGCAGAAGCATTGTATGGGAATACAACGCAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC)8 GTGGTTCTATAAATAGAACCCCTTGGGTAGAAGCATTTAGACTCCAGACAACACAACTGAAGAGTTGGAATTTCGTA (TC)7 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGGGTAGAAGCATTATCACTCTTGCATTTTCGTT (TC)6 GTGGTTCTATAAATAGAACCC-TTGTGTAGAAGCATTGACACATTTGAAATTTCGTT (TC)11
ACTCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCAT ACTCAAAGC-CTTCATCCGT --TCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCAC GCTCGAAGG-CTTCATTCGT --TCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAAGCCTTCATTCAC ACTCAAAAGCCTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCAT ACTCAAAG-TCTTCTTTTGT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT TGAATCTTCGTTGGAATTGG ACTCAAAG-CTTTCGTTCGT ACTCA-AGGTTTCCGTTCGT ACTCA-AGGTTTCCGTTCGT ACCCAAAGC-CTTCAAGCAT ACTCAAAGGCCTTCATTCAT ACTCAAAG-TTTTCGTTCAT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCAT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT ATCAAAGC--CTTCATTCGT ACTCACTCAAAGCCTCCATT ACTCAAAGC-CTTCATTCAT ACTCAAAGC-CTTCACTCAC ACTCAAAGC-CTTCAGTCGT ACTCAAAGC-CTTCATTCGT
Smýkal et al. Heredity 103: 157167, 2009
Aplikace retrotransposonů jako markerů
Příklad SSAP analýzy s PDR-1 elementem TaqI digest
Genomic DNA PDR-1 • • • •
adaptor
genomic DNA restriction adaptor ligation PCR amplification gel separation – analysis
Nevýhody: jako AFLP – technicky náročné na přesnost provedení mnoho kroků – možnost chyby
Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP) Long Terminal Repeat
LTR
Gag Primer Binding Site
Pol
LTR PPT
Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP)
Vliv výběru retrotransposonu na IRAP
Vliv metody isolace DNA a Taq polymerázy na IRAP fingerprinting
Vliv koncentrace Mg na IRAP fingerprinting
Inter-Retrotransposone Amplified Polymorphism (IRAP) RETROTRANSPOSONOVÉ MARKERY B C D F G 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1
Nr. 2 4 5 14
Odrůda Alan Bohatýr Canis Jackpot
A 0 0 0 0
I 0 0 0 0
J 0 0 0 0
M 1 1 1 1
8 10 12 19
Garde Grana Harnas Madonna
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
16 13 18
Kamelot Herold Menhir
0 0 0
1 1 1
0 0 0
0 0 0
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
1 1 1
15 27
Janus Romeo
0 0
1 1
1 1
1 1
1 1
1 1
0 0
0 0
1 1
34 11 25 23
Zekon Hardy Primus Merkur
0 0 0 0
1 1 1 1
1 1 1 1
0 0 0 0
1 1 1 1
1 1 1 1
0 0 0 0
0 0 0 0
1 1 1 1
29 30
Sonet Sponsor
0 0
1 1
1 1
1 1
1 1
0 0
0 0
0 0
1 1
33 35
Tyrkys Olivín
1 1
1 1
1 1
1 1
1 1
0 0
0 0
0 0
1 1
32 7 3 6 9 21 24 28 31 17 1
Terno Catania Baryton Carrera Gotik Komet Power Smaragd Tempra Lantra Adept
0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0
1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1
0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1
1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1
0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0
Odrůdy hrachu Cyclop a Ogre LTR fingerprinting
REMAP - Retrotransposon x Mikrosatelitní polymorfismus
SSR repetice
Výhody použití IRAP / REMAP / iPBS metod • • • •
jednoduchost není třeba žádných předchozích kroků, jen isolované DNA – PCR univerzálnost (iPBS) vhodné pro studium vnitrodruhového polymorfismu/diverzity
Nevýhody: • • • • •
menší reprodukovatelnostst – jako u jiných fingerprintových metod potřeba použití stejné Taq polymerázy odečitatelnost délkového polymorfismus fragmentů problematické srovnání mezi laboratořemi homoplasie fragmentů mezi odlišnými druhy
Retrotransposon-based insertion polymorphism (RBIP)
N r.
+ -
Ye a r
R B I P -1
R B I P -2
R B I P -3
R B I P -4
R B I P -5
R B I P -6
R B I P -7
R B I P -8
R B I P -9
R B I P -1 0
R B I P -1 1
00581
H S 3 0 - 1 8 n s l.
Na m e
1977
+
0
+ '/'-'
+
+
+
+
-
0
+
-
00582
L U - D IK Z L .
1979
-
+
+
+
+
+
0
+
0
-
-
00583
LU -D K Z E L
1979
0
+
+
-
-
+
+
-
0
-
-
00584
T o la r
1980
+
+
+
+
+
+
+
-
0
+
-
00585
C H -719
1979
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
-
00586
Odeon
1980
-
0
+
+
+
+
+
-
0
+
-
00603
T y rky s
1983
-
0
+
+
+
+
-
+
+
+
-
00604
H M 1 9 2 6 n s l.
1983
-
0
+
-
-
+
0
-
0
+
+ '/'-'
00605
H C 5 2 n s l.
1983
+
+
+
+
+
-
+
-
0
+
-
00606
L U F K n s l.
1983
+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
-
00607
H S 1 6 5 0 2 n s l.
1983
-
0
+
-
-
-
-
+
0
+
-
00624
S e n a to r
1971
+
+
+
+
+
+
-
+
0
+
-
00642
Ju n a k
1985
+
+
+
-
-
+
-
+
0
-
-
00644
E m e r a ld
1984
-
+
+
-
-
+
-
+
0
-
-
Flavell et al. 1998, 2003 Jing et al. 2005, 2010
High throughput analysis
Retrotransposon-based insertion polymorphism (RBIP) Heterozygote No PCR amplification (primer mismatch)
Flavell et al. 1998, 2003 Jing et al. 2005
Pisum Vavilovia Lathyrus Vicia Trifolium I I I I I
TE2
+ element
TE1
TE1
TE3
- element
Pisum Vavilovia Lathyrus
Pisum Vavilovia Lathyrus Vicia Trifolium I I I I I
Vicia Trifolium
TE2 I 25
I 20
I 15
I 10
I 5
milióny let
Pisum Vavilovia Lathyrus Vicia Trifolium I I I I I
TE3
element
obsazené místo (+)
PCR amplifikace prázdné místo (- )
Inzerce retrotransposonu jako fylogenetická značka
Alu- elementy a lidská diversita
Hrách
SSAP
Retrotransposonové markery Výhody: * Abundatní složka eukaryotických genomů * Dominantní (IRAP/SSAP) / ko-dominantní markery (RBIP) * Rychlá aplikace na nové druhy
Nevýhody: • Dominantní markery (IRAP/SSAP) nepřesné pro fylogenezi – • vhodné pro studium vnitrodruhové diverzity • Ko-dominantní (RBIP) – přesné, ale náročné na vývoj
Genově specifické markery
Využití syntenie s modelovými organismy
Hrách Versus
Medicago truncatula
Single nucleotide polymorphism
EXON 1
Intron 1
EXON 2
EXON 3
Intron 2
AGCcTATT 55 bp
EXON 1
250 bp EXON 3
EXON 2 AGCgTATT 55 bp
200 bp
indel – inzertion / deletion
Distribuce a typy SNP(ů)
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Gen po genu - sekvenováním
Pomalé, nákladné – vhodné pro menší počet vzorků
Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (dCAPS)
Cleavage Amplified Polymorphic Sequence (CAPS-PCR) GTTCTCTTTGTTGCACGTAATTAACTCATCATTCTTGTATATTAATTAAT
GTTCTCTTTGTTGCACGTAAGTAACTCATCATTCTTGTATATTAATTAAT
1. PCR 2. štěpení X
Pokud existuje vhodné restrikční místo v cílovém fragmentu
MseI site TTAA
Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (dCAPS)
Pokud NEexistuje vhodné restrikční místo v cílovém fragmentu Nutno jej vytvořit nově v PCR primeru Následně je rozdíl jen o délku primeru (16-25 bp) – potřeba dobrého rozlišení
Genově specifické markery – CAPS/dCAPS Výhody: • ko-dominantní • locus-specifické • jednoduše hodnotitelné a interpretovatelné • lehce adaptovatelné mezi laboratořemi • Nejlépe pro mapování mezi 2 genotypy/rodiči Nevýhody: • nutnost sekvenování • často malý polymorfismus mezi příbuznými genotypy • malá produktivita - gen po genu
Kolik SNPs detekujeme versus kolik vzorků najednou
Specificita detekce dané během PCR reakce
Detekce založená na rozdílné Tm teplotě
Hybridizací na chipech
Možnosti detekce SNP polymorfismu 1 Hybridization-based methods 1.1 Dynamic allele-specific hybridization 1.2 Molecular beacons 1.3 SNP microarrays
2 Enzyme-based methods 2.1 Restriction fragment length polymorphism 2.2 PCR-based methods 2.3 Flap endonuclease 2.4 Primer extension (Illumina Infinium) 2.5 5’- nuclease (TaqMan) 2.6 Oligonucleotide ligase assay 3 Other post-amplification methods based on physical properties of DNA 3.1 Single strand conformation polymorphism 3.2 Temperature gradient gel electrophoresis 3.3 Denaturing high performance liquid chromatography 3.4 High-resolution melting of the entire amplicon 3.5 Use of DNA mismatch-binding proteins 3.6 SNPlex 4 Sequencing
Kodominantní marker – odlišení i heterozygota P1 P2
F1
F2 R odolný S náchylný
AA aa S
R
Aa
aa
S
R
AA Aa S
S
aa
AA
R
S
aa AA R
S
Dominantní marker – nutnost 2 analýz P1 P2
F1
AA
Aa
aa
F2
Aa
aa
aa
Aa
AA
Aa
Mathematical evaluation and data scoring Used methods :
• genetic distances calculations - coefficients of dis-/similarity • ordination, clustering (PCA, PCO, MDS) • dendrograms (cluster analysis - UPGMA, Ward´s method)
• allele frequencies, genetic distances between groups • model-based (Bayesian inference)
Data evaluation and scoring Distance-based approaches
Distribution of Nei genetic distances in investigated set of pea germplasm genetic distance distribution SSR+RBIP data 35 30 25 20 15 10 5 0
0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0,85 0,9 0,95 1,0
UPGMA analysis of 450 pea accessions Klatovsky_zeleny Liblicky_bastard Jupiter Purpurviolett-Sc Kleine-Weissenfe Hadmerslebener-G CL_16.4 Detenicky_milion Viktoria_CL16.6 CL_19.1 CL_19.6 Cesky_banan Diosecky_Kentisc CL_18.5 Milevsky_krajovy Zborovicky_Vikto Strengs-Weihenst Kapucin_drobnozr Nor Hindukusch-326 Mahndorfer-gelbe Wachserbse-ProfP-183 Nordost-Felderbs Ornamenta Rustica Onsa Verno CL_18.7 Stupicky_velkozr Konservova-kralo Satelliet-TP Waldmanns-GruneAga Columba Lincoln-Mutant Lohmans-WeenderNFG-Peluschke Weissbluhende-Ni Stehgolt Mala-Porynanka Zeiners-Grune-Ba Labores Waldmanns Dorina Pisum-var-chloro Sprinter Ruga Jenaer-gelbe-Vik Libella Terras-Brunschwi Maipal WAW-111-12 Erbi Folger Hodinger Slovensky_konser Eminent Klarus Strubes-fruehe-V Ollesheimer Bulba-Vereduna CH-719 Brunsviga Jumboka Hallorengold Waldmanns-Goldku Round-Ale-Ohlsen Zeleny_nizky Borek Walwitzer-gelbePoneka Mir Maiperle Spath-Stamm-225 Alerfruheste-Mai Kolumba Nejranejsi_majov Trinetto VM Lumir Nordsaat SG-C-3225 Livia Kralice_I LU_FK Salzmunder-Edelp Orion Neuer-Riesen-Sch Schors-Rappoldsh Viktoria_800 Orlik Maibote Rosakrone Hrach_Pardubic Stupicka Altex Terrasol_zluty Nejranejsi_BXB Dukat Muck Bezuponkovy Meteor Hindukusch Stupicky_zeleny Moravsky_Hrotovi Proteus Inter Prebohaty Zidlochovicky_Fo Skory_Express Predchudce Lantra DE_29 Swanhild Raman Radim Favorit Auralia Livia Nievo Herold Leigensteiner Salzmunder-klein LU-DK Fruhe-Harzerin Zeiners-Gold Dornburger-gelbe Dalibor Cebeco-63118-671 Juno Saxa Salzmunder-gelbe Ode-Danielle Nordost-fruhe-Gr Rimpaus-grune-Vi Flavanda Exalda Peragis-grune-Pe Trintella Grapis Waldmanns-Futtef Bitenax Parel-CB Angela Vitallette Unica Paloma Stijfstro-CB Zwaan-Aurora Ben Corona-Imperial Lorina Gitana Trino Frostar Belinda Rurik Margot Mansholt-Pluk Pfluckerbse Elvira NO Othello Finale Pauli Birte Proco Juran Buchsbaum-fruhe Var-episcopi Rivalin Sirena Trio PSS-659/76/Grata Neugatersleben-5 BI-1416 Junior Cicero LU-M Folger Bohatyr 30-18 Odeon Ruhm-von-Vietz Juwel Pura Saxa Colmo DE_989 Podripan Durana Mansholt-Fluth Zelka Vitalis Rondo-CB Boordevol Maro Skinado Frimento-RS Profino Triton Mansholt-Kort-Gr Hijlkema-Unica Murilo Profal Karina Vares Hylgro Spikent-RS Dick-Trom Laga Pluto Parade Miranda Allround Fertigolt Harolt Maxi Recette Bodil Solara Danielle Dippes-gelbe-Vik Twist Nordost-kleine-W Zeiners-Frankoni Servo Legio Fertila Evi Eurofin Mercurio-Nr35 Haco Ondra Dash Unica VilmorinIII Ridonia Porta Cebeco-59-61-65Zidlochovicky_Vi KR.1946 Luzsanyi Olivin Janus Adept Primus Sonet Tenor Gotik Zekon Liliput Trim Pisum-acacium HM-1926 Junak HS_16502 Senator Pegas PR_20.2 Neuga Emerald Alfetta Alan Multipod Markana Hrach_Policky Komet SG-L-7 Romeo Mansfelder-Grune Julie Merkur Saturn Menhir PR_20.24 Heralda HS Clipper Hanak SG-C-6253 Tonus LU_70 Kleinwanzlebener Kralicky_ovalny Zeiners-kurz-gut Erbse-Verbendert Citrina Balikova Krineruv-zelenyAndrea HM-117 Lucienhofer-Wint HM-6 CH-17 Hohenheimer-Rosa Friedburger-gelb Irina Lisa Waldmanns-Waldor Violetta-Rehuher Zeiner-kurz-gut Kronenerbse Nadja Golf 10 Fridol Superette 810-67 Vertiroy Prinsa Montana Vinco HC_52 Carrera Madria Maretta Mathilde Mandy Maja Graue-Erbse2 Konserva Emigrant M.2.820.2 Ruhmers-gelbe-Vi Ridana Calypso Impala Cebeco-1429/17 Renata Carrera HM_1926 Angerner-Futtere LU-DIK Marbel Kapucin_belokvet Luna HXP KR_178 Avola Dragamova Leo Neuga BI-1439-Kukuli Express Ascona Saxa CL_37.3 DE_7 HS_4092-60 P_speciosum PR_19.5 P_speciosum2 Nike Vlasta Pyram DE_104 Tyrkys Tolar PR_19.7/37.3c Venus Heros Sirius Trumpf Kamelot Helena Jubilejny Klatovska_jarni PR_19.7/37.3a Pisum_umbellatum Felicitas BII-867 766 Smaragd NSL34/52 Ina jarni PR_19.7/37.3b Char Zidovicka_Edelpe Algera Polaris CH_7/79 Kocovce_11 KR_240 Triofin Prochazkova_B Kapucin Dora WAW-180-45 WPXVT Kocovska_108 PR_17.5 Arvika Tyla Exzellenz PPT_II Zeiners-Tiefgrun StrZhor_KR31 Moravan Dia Moravska_krajova Vesna 320/32 Frauenlob-Streng Bartel Schobi Iulich Lowadis Rival Holandsky Gulzower-St. Lancet Asta Bento Baltersbacher Bargkamp Tigra Magnus Rovar Lisette Hohenheimer-grun Finri Big Polarette Milion_zeleny Viktoria_75 Milion_zluty Slovensky_expres Echo HS-70-267 Ruhmers-gelbe-Vi Zborovicky_zluty Violeta
dry-seed
dry-seed fodder
Klatovsky_zelenyMW
fodder
CZ fodde
0.32
0.49
0.66
Coefficient
0.83
1.00
T ree D ia gram for 1 63 Variables W ard`s me th od Dissimilarities fro m m atrix
Ward´s hierarchical cluster analysis (minimalization of statistical variability within clusters maximalization between - as ANOVA) RBIP + SSR loci dissimilarities matrix 0,12 0,1 0,08 0,06
S ilhouette
0,04 0,02 0 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Silhouette method for cluster number estimation
K la t ov s ky_ z e len y Nike K la to v ska _ ja rn i CH_7 /7 9 Pr ot eu s Hr a ch _ Polic ky PR_1 9 .5 PR_2 0 .2 Pr o ch a zko v a_ B Bez u p on kov y S tu picka _ jar n i He le na Ju b ilejn y PR_ 20 .2 4 3 20 / 32 Mo ra v s ka _ kr a jo va W PXV T Ko c ov c e _1 1 HS 4 09 2 -6 0 S iriu s n s l_ 34 /5 2 Orio n HS 30 -1 8 Po lar is HM- 11 7 Py ra m CH_1 7 Ina Do ra A n d re a K o co v s ka _ 10 8 Dia PR_1 7 .5 Pc o nv a r- s pe c io s um1 L u na Ty la Pc o nv a r- s pe c io s um2 HS -7 0 _ 2 67 Ch a r L iv ia L ib licky _b a s ta rd Dios e c ky _ K en t is ch Te rr a so l_ z lu ty Z b or o vicky _V ikt or ia Z bo r ov ic ky_ z lu ty S lo ve n s ky _ e xp re s V ikto r ia _ 75 PPT_ II V ikt or ia _ 80 0 S ko r y_ Ex pr e ss K la ru s Nejra n ejsi_BX B Pre d ch u d ce Stu p ic ky_ z e le ny Z id lo c h ov ic ky _Fo lg e r Po d r ipa n Jup it er CL _1 8 .7 Pre b oh a ty Stu p icky _ ve lko zr n ny _ Mo ra v s ky _ Hro to v ic ky _ Or lik Od eo n Milio n_ z e le ny De te n ic ky _ milion CL _1 8 .5 Mile v sky _ kr a jov y CL _1 6 .4 V ikto r ia CL _1 6 .6 CL _1 9 .1 CL _1 9 .6 Duka t DE- 29 Ra d im PR_1 9 .7 _ 37 . 3b Hr a ch _ Pa r d ub ic Tr im A dept Go tik PR_1 9 .7 _ 37 . 3c V e sn a Dio s ec ky _Ex p re s s- 7 66 Ces ky_ b a na n B a likov a DE-7 HC_5 2 Mor a va n L U-DK _ ZEL S G- C-6 2 53 To la r Lu z s an y i Oliv in Ju lie So n e t HM-6 Me rku r SG-L -7 Me nh ir S lo v en s ky _ kon s e rv o vy Lilip u t Ju ra n Ra man K r a lic ky_ o v aln y Ju n io r S mar a gd He r os St ra n ec ka_ Z h or _ KR3 1 S G- C-3 2 25 Ka p uc in K ap u c in _d r ob n o zr n ny HX P K ap u c in_ b e lo kv e ty K ra lice _ I Int e r Ne jr an e js i_ ma jo vy V M_ 10 L umir Ju n ak HS_ 1 6 50 2 Bo r ek Da lib o r Z e le ny _ n iz ky Z id o vicka _ Ed e lp er le B o h at y r CH- 71 9 DE_ 10 4 DE_ 98 9 HM-1 9 26 HM_ 1 92 6 Zidloc h o vicky _ V ikt o r KR_ 1 9 46 Primu s Pe ga s Z e ko n L U_7 0 Ja n us A la n Ko me t S a tu rn Clip p e r K a me lo t He ro ld L U-DIK _ Z L . Ha n ak A lf et ta Mu lt ip od Eme ra ld PR_1 9 .7 _ 37 . 3a Ro meo To nu s Te n o r CL _3 7 .3 A lg e ra S e n at o r V la s ta KR. 17 8 A r vika Pis u m- v a r.u mb e lla tu m KR. 24 0 Me te o r Tyr kys L U- M L U_FK
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 Linkage D is tan ce
2.5
3.0
3.5
4.0
Multivariate statistics ordination approaches •
to condense the differences into fewer characters and visualize them in multidimensional space
•
to identify the most discriminating characters
Principal component analysis (PCA) of morphological descriptors 4
Parametric data
field peas
3
Livia Junak
PCA1: 33.2% PCA2: 18.5%
Komet
Janus
2
nsl. HM-117 Bohatyr
T enor
LU FK nsl. T yrkys Menhir Multipod Dukat
TMoravan onus
Kralicky ovalny
LU-DK ZEL
finds components that accounts for as much original variance as possible
Ina
nsl. Nike HS-70 Kocovska 108 267 Vesna
Klarus
OdeonHelena Dia PPT .II nsl.
Podripan
Milion zeleny
Luna
Algera CL 19.6
Dalibor
Raman Meteor
0
HS 30-18 nsl. Detenicky milion nsl.zluty T errasol nsl. 34/52 CL 18.5 CL 16.4 Zidlochovicky Folger
LU-DIK ZL.
Inter
Smaragd
Factor2
Moravska krajova
Klatovska jarni Jubilejny
nsl. LU 70 Emerald HM-1926 nsl. HC 52 nsl. DE 104 nsl. Jupiter
nsl. Char nsl. WPXVT
nsl. CH-17 nsl. KR.178 Polaris Gotik Adept
Merkur HM-6 HM 1926 nsl. Primus T olar SG-C-6253 SaturnHanak LU-M nsl. Heros
Borek
Viktoria CL 16.6 Liblicky bastard Radim
Juran
Milevsky krajovy
PR 20.2 Prochazkova B Milion zluty Zborovicky zluty
Klatovsky zeleny Zidovicka Edelperle Kapucin belokvety
Stupicka jarni DE 7 nsl. Kapucin drobnozrnny
-1
Dora
Stranecka Zhor nsl. KR 31
Pegas
CH-719 Alan nsl. SG-L-7 Clipper T rim Luzsanyi DE 989 nsl. Romeo
1
Sirius
Julie
Alfetta
Andrea
nsl. HS 4092-60
Olivin
nsl. 320/31
Orlik
nsl. KR.240
CH 7/79 n.sl. T yla
Zekon
Kamelot Sonet
HS 16502 nsl.
PR 17.5 Proteus
Junior Kralice I nsl.
Orion
MoravskyZborovicky hrotovicky Viktoria krajovy Pisum sativum var. umbellatum CL 19.1 PR 19.5 Arvika PR 20.24 P.sat. convar. Stupicky zeleny PR 19.7 - 37.3speciosum c
29-nsl. PRDE 19.7 37.3 b Hrach z Policky Viktoria 800
KR.1946
P.sat. convar. speciosum
Senator Predchudce
Kocovce nsl.11
PR 19.7 / 37.3 a Viktoria 75
Prebohaty Slovensky konservovy
CL 18.7
Zidlochovicky Viktoria rany HXP nsl.
-2
Cesky banan Stupicky velkozrnny VM 10 zluty Pyram
Bezuponkovy nsl. Nejranejsi BXB
Nejranejsi majovy Lumir
Vlasta
Slovensky expres
Liliput
Balikova Hrach z Pardubic CL 37.3 Diosecky Kentisch
-3
Diosecky Express 766 Skory Express
Kapucin Zeleny nizky
-4
fodder peas -5 -6
-4
-2
0 Factor1
2
4
6
Období: <1960 Období: 1960-180 Období: >1980
Bayesian and other models-based methods
Molecular data analysis by Bayesian inference STRUCTURE software -2300 -2500 -2700 -2900
Gotik 0,946 0,003 0,006 0,006 0,004 0,007 0,027 Arvika 0,003 0,966 0,003 0,006 0,01 0,005 0,006 Viktoria_80 0,006 0,006 0,957 0,008 0,013 0,006 0,005
-3100
K=7
-3300 -3500 -3700 0
10
20
30
The genetic diversity and evolution of field pea (Pisum) studied by high throughput retrotransposon based insertion polymorphism (RBIP) marker analysis. JING R., VERSHININ A., GRZEBYTA J., SHAW P., SMÝKAL P., MARSHALL D., AMBROSE M., ELLIS T.H.N., FLAVELL A.J. (2010)
Markery pro fylogenetické studie
Požadavky: 1.) univerzálnost – aplikovatelnost napříč druhy, rody i čeleděmi
2.) dostatečný polymorfismus 3.) liniovost – možnost sledování linie (maternální dědičnost)
DNA barcoding • Chloroplastové sekvence (matK, rbcLA, trnSG)
• Jaderně kódované (Internal transcribed spacer rDNA – ITS)
Chloroplastová DNA
• 100 – 250 kb • kruhová DNA • 10 -100 kopií na buňku
Následně: • vysoká stabilita DNA • robustnost PCR detekce • možnost detekce i z herbářových materiálů
matK
Fylogram odvozený na základě analýzy cpDNA (matK, trnSG)
Vnitřní transkribovaný mezerník (ITS) mezi rDNA geny
Výhody : • Univerzálnost • Možnost detekce hybridizace • Dostatečná variabilita i uvnitř druhu Uznaný v rámci barcoding projektu
