!HU000007312T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 312
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0307824 2003. 06. 27.
(73) Jogosult: Exonhit Therapeutics S. A., 75013 Paris (FR)
FR
(72) Feltalálók: SCHWEIGHOFFER, Fabien, F-94120 FONTENAY SOUS BOIS (FR); DESIRE, Laurent, F-75014 Paris (FR); RESINK, Annelies, b-3001 HEVERLEE (BE); ROUQUETTE, Magali, F-31000 Toulouse (FR) (54)
HU 007 312 T2
A61K 31/437
(21) Magyar ügyszám: E 04 767477 (22) A bejelentés napja: 2004. 06. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040767477 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1638559 A1 2005. 01. 06. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1638559 B1 2010. 01. 06.
(2006.01) A61P 25/16 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05000302 PCT/FR 04/001630
(74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Pirazolo-piridinek alkalmazása kognitív zavarok kezelésére
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 312 T2
A találmány szakterülete A jelen találmány a biológiai, genetikai és az orvosi tárgykörbe tartozik. Különösen a neurodegeneratív kórképek kezelésére és ezen belül a neurodegeneratív kórképekben szenvedõ betegek kognitív képességeinek javítására vagy megkönnyítésére alkalmas új készítményekre és eljárásokra vonatkozik. A találmány különösen a pirazolo-piridin-csoport vegyületeinek neurodegeneratív betegségben szenvedõ betegek kognitív képességeinek javítására való alkalmazásán alapul. A találmány a különbözõ neurodegeneratív kórképek, különösen az Alzheimer-kór, vagy a keringési demencia által érintett betegek állapotának javításában alkalmazható.
5
10
15 A találmány háttere Számos neurodegeneratív kórkép leírásában szerepel az apoptózis, vagy programozott sejthalál jelenségével kapcsolatos állapot vagy komponens. Itt említhetjük mind a központi idegrendszer neurodegeneratív kórképeit [pl. az amiotrófiás laterális szklerózist (SLA), a Parkinson-betegséget, az Alzheimer-betegséget vagy a keringési demenciát], mind pedig a perifériás, nevezetesen okuláris degeneratív betegségeket. Ezen kórképek kezelése alapvetõen tüneti, nevezetesen a gyulladásos jelenségekkel kapcsolatos kezelés, de a komplex mechanizmusok és anyagcsere-folyamatok és az okozati tényezõk változatossága miatt kevésbé a rendellenességek valódi okainak kezelése. A bejelentõ WO03/016563 nemzetközi szabadalmi bejelentése a neurotoxicitás új molekuláris céljait, valamint a neurodegeneratív kórképek kezelésének új terápiás megközelítéseit ismerteti. Ezek a megközelítések egy 4¹es típusú foszfodiészteráz hatásának vagy kifejezõdésének modulálására alapulnak. A bejelentõ PCT/FR04/00366 nemzetközi bejelentése okuláris neurodegeneratív kórképeknek egy 4¹es típusú foszfodiészteráz hatásának vagy kifejezõdésének modulálásán alapuló új kezelési megközelítéseit javasolja. A WO01/78709, WO01/81348, WO01/81345 és WO03/045949 bejelentések pirazolo-piridineknek egyes neurológiai kórképekkel kapcsolatos esetekben való terápiás alkalmazásáról számolnak be, mint például a peptidaggregátumok képzõdése (WO01/78709), a tau-fehérje foszforilálása (WO01/81348) vagy a GSK–3 enzim blokkolása (WO01/81345 és WO03/045949). A WO02/098878 bejelentés trifluormetil-purinok PDE4-gátlóként való alkalmazását írja le kognitív zavarok kezelésében. A találmány összefoglalása A jelen találmány most a megváltozott percepciós, nevezetesen az Alzheimer-betegségben megfigyelhetõ kognitív percepciós betegségek új terápiás stratégiájára vonatkozik. Ezek a stratégiák egy vagy több, a feltalálók által felismert anyagcsere-folyamat modulálásán alapulnak, amelyek az idegsejtekben végbemenõ apoptózis és excitotoxicitás megjelenésével, kifejlõdésével és elõrehaladásával vannak kapcsolatban, és kü-
20
25
30
35
40
45
50
55
2
lönösen a neurodegeneratív és a kognitív funkciós betegségekre vonatkoznak. A jelen találmány különösen az etazolate kognitív hiányosságok, jelesül az Alzheimer-betegségben jelentkezõ kognitív hiányosságok kezelésében mutatott elõnyös és figyelemre méltó tulajdonságainak igazolásán alapul. A jelen találmány neurodegeneratív betegségben szenvedõ betegek kognitív zavarainak kezelésére vagy csökkentésére szolgáló új terápiás stratégiákat is javasol. A jelen találmány etazolate vagy sója vagy észtere humán betegek kognitív percepciójának javítására szolgáló gyógyszerkészítmény elõállítására való alkalmazására vonatkozik. A jelen találmány humán beteg kognitív percepciójának javítására szolgáló, etazolateot vagy sóját vagy észterét tartalmazó készítményre is vonatkozik. Anélkül, hogy egy hatásmechanizmushoz ragaszkodnánk, úgy tûnik, hogy a találmány szerinti vegyületeknek a kognitív rendellenességekre való váratlan és elõnyös jótékony hatása a GABA(A) receptorok és a mitokondriumok szintjén kifejtett kettõs hatásával magyarázható. A jelen találmány a betegek agyában három eredeti, a PDE4, az AKAP1 és a GABA(A)RAPL1 mRNS kifejezõdésének megváltozásával jellemzett molekuláris folyamat azonosítását ismerteti. Ezek a folyamatok az excitotoxicitással és/vagy a neuronhalál jelenségével idõben egybeesnek és igazolják a kognitív zavarokkal kapcsolatban a GABA szignalizáció megváltozásának megtörténtét. Így a jelen találmány egyrészt az Alzheimer-betegségben szenvedõ betegek prefrontális kortexébõl, másrészt az azonos korú kontrollcsoport egyedei agyának azonos részébõl izolált, a GABA(A) receptor epszilon-alegységét kódoló mRNS-splicing eltéréseit fedi fel. Ez a felfedezés különösen érdekes, mert ez a fehérje a GABA(A) receptor prezentálásában és deszenzibilizálásában játszik szerepet és mert az öregedés és az életkorhoz kötõdõ folyamatok a GABA(A) receptorok deszenzibilizálásához szükséges idõtartam növekedésével járnak. Ez a folyamat és nevezetesen a kognitív hiányok tehát kompenzálhatók a GABA csatorna és a mitokondriumok szintjén ható találmány szerinti vegyületekkel. A jelen találmány új és lényeges elemekkel járul hozzá a GABA(A) receptornak az Alzheimer-betegség, és általánosabban a kognitív rendellenességek kezelésében terápiás célként való kiválasztásához, és így lehetõvé teszi a pirazolo-piridin-vegyületcsaládnak neurodegeneratív betegségek, mint az Alzheimer-betegség és a keringési demencia kezelésében megfigyelt biológiai és terápiás hatásának megértését, és különösen a kognitív zavarok kezelését. A példákban szereplõ eredmények illusztrálják e vegyületeknek averzív helyzetekben lévõ állatok memorizálóképességének javulásában mutatott hatékonyságát.
A találmány részletes leírása A neuronhalál két fõ oka az excitotoxicitás és az 60 apoptózis. Az apoptózis több módja a mitokondriumból 2
1
HU 007 312 T2
ered, és az apoptózis megjelenésének egyik kritikus pontja például a mitokondrium permeabilitási tranzíciós pórus (MPTP) megnyílása. A szabad gyököknek (ROS) a mitokondrium mûködési zavara miatti feleslegben való keletkezése kibillenti az apoptózis egyensúlyát és a neuronok excitotoxicitástól való sebezhetõségét okozza. Ez a két jelenség, a szabad gyökök túltermelése és az excitotoxicitás szerepel az életkor és a neurodegeneratív betegségek, mint pl. az Alzheimer-betegség, a keringési demencia, a Parkinson-betegség és az SLA következtében a neuronhalált okozó kórfolyamat mechanizmusában. Kimutatták, hogy a szabad gyökök legalábbis részben ténylegesen felelõsek az idõs agy hiányosságaiért. Az oxidatív stress szerepet játszik az Alzheimer-betegség, a keringési demencia, a Parkinson-betegség, és az SLA elõrehaladásában. Az oxidatív stress a prooxidánsok és antioxidánsok homeosztázisa megbomlásának eredménye, amely a toxikus szabad gyökök képzõdéséhez vezet. A feltalálók a (WO99/46403 sz. bejelentésben leírt) DATAS technika alkalmazásával kvalitatív differenciális screeninggel létrehozták 60 napos modelláltatok agyának RNS-splicing eseményeinek repertóriumát. A repertórium agy- és gerincvelõmintákból izolált RNSekbõl indult ki, a neuronok elõzetes izolálása nélkül, annak érdekében, hogy maximális, a kórfejlõdéshez kapcsolódó alternatív splicing eseményeket vehessenek figyelembe. Az így elõállt repertórium több mint 200 különbözõ, az excitotoxicitás jelenségének kulcsszereplõivel, mint pl. a káliumcsatornákkal és a NMDAreceptorral kapcsolatos szekvenciát tartalmaz. A repertóriumot alkotó szekvenciák specificitását igazolja az a tény, hogy a tényleges genetikai kifejezõdésnek az azonos differenciális kvalitatív elemzése 90 napos állatokon egy eltérõ repertóriumhoz vezetett, amelybõl a excitotoxicitás különbözõ markerei hiányoztak. A splicing változásainak elemzése igazolja, hogy a molekuláris események a kórfolyamat stádiuma szerint különbözõek. Különösen érdekes és váratlan módon a 60 napos kontroll- és transzgenikus állatok RNS¹én lefolytatott DATAS vizsgálat lehetõvé tette a 4B foszfodiészteráz, az AKAP1 („A kinase anchoring protein”) és a GABA(A)RAPL1 [„GABA(A) Receptor Association Protein Like 1”] mRNS-ébõl származó cDNS egy töredékének izolálását. A cAMP¹t hidrolizálni képes PED4B fehérje a cAMP intracelluláris koncentrációjának szabályozására hat. Az AKAP1 a (cAMP által aktivált) A fehérjekináz szabályozó alegységét rögzíti a mitokondriális membránhoz, és szabályozza a mitokondriális tranzíciós pórus aktivitását. A kapott eredmények szerint a kóros idegszövetben a PDE4B kifejezõdése a megfelelõ RNS szerkezeti módosulása következtében hangsúlyosabb, jelesül a 3’ nem kódoló részben lévõ egyik régió törlése miatt. Ez az eredmény teljesen összhangban van az mRNS destabilizációs szekvenciájának a DATAS módszerrel azonosított szekvenciában való jelenlétével. A PDE4B mRNS destabilizációs szekvenciájának splicing során
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
vagy poliadenilációs alternatívák alkalmazásával való törlése stabilizálódáshoz, azaz ezen RNS kódolórésze kifejezõdésének erõsödéséhez vezethet. Ez különösen a kóros egyedek agyában és nem a kontrollegyedeknél jelentkezik. Az AKAP1-bõl származó fragmentum azonosítása egyébként megmutatja ennek a fehérjének a szerepét az excitotoxicitás és a neuronhalál folyamatainak fejlõdésében. Az AKAP1 az A fehérjekináz szabályozó alegységével és a perifériás benzo-diazepin-receptorral (PBR) kerül kölcsönhatásba, amely részt vesz a mitokondriális tranzíciós pórusnak az apoptózis lefolyására jellemzõ nyitásában. Következésképpen a találmány azt sugallja, hogy az AKAP1 a PBR-nek a sejthalál, mint pl. a neuronhalál jelenségébe való beavatkozását szabályozza. A GABA(A)RAPL1-bõl származó fragmentum azonosítása a GABA(A) receptortól függõ szignalizáció deregulációját mutatja. Ez a megfigyelés teljesen összhangban van a neurotranszmitternek, mint szinaptikus átvitel gátlónak a fontosságával, nevezetesen a GABA(A) receptorral való kölcsönhatása útján. Ez a gátlás lehetõvé teszi a neuronok védelmét a tartós izgatással szemben, amely az excitotoxicitás útján a neuronhalálhoz vezethet. Munkáink tehát jelzik a GABA(A) receptor deszenzibilizálásában és prezentációjában szerepet játszó ezen szabályozási szint változását. A jelen találmány szerinti felfedezés különösen illusztrálja a GABA szignalizáció változásának jelenlétét a kognitív zavarokkal kapcsolatban. A jelen találmány egyrészt az Alzheimer-betegségben szenvedõ betegek prefrontális kortexébõl, másrészt az azonos korú kontrollcsoport egyedei agyának azonos részébõl izolált, a GABA(A) receptor epszilon-alegységét kódoló mRNSsplicing eltéréseit is felfedi. A humán patológiában ennek az alegységnek eddig semmiféle rendellenességét nem jelezték. A jelen találmány tehát a kognitív funkciók zavaraira új terápiás stratégiai javaslatot tesz lehetõvé, amely az idegsejtekben az excitotoxicitás és az apoptózis megjelenésével, kifejlõdésével és elõrehaladásával kapcsolatos anyagcsereutak módosításán alapul, és különösen megfelelõ a neurodegeneratív betegségek esetében. Ez a bejelentés a pirazolo-piridinek családjába tartozó vegyületeknek, mint pl. az etazolate kognitív hiányok, különösen az Alzheimer-betegség és a keringési demencia kezelésében való elõnyös és jelentõs hatásait dokumentálja. A találmány összefüggésében a „kezelés” megelõzõ, gyógyító, tüneti kezelést és a beteg ellátását (a szenvedés csökkentését, az élettartam növelését, a betegség elõrehaladásának lassítását, a neuronok túlélésének javítását, a neuronok excitotoxicitástól vagy az apoptózistól való megvédését stb.) is jelenti. A kezelést lehet ezenkívül más hatóanyagokkal vagy kezelésekkel kombinálni, különösen a kórkép késõi folyamataira irányultan, mint pl. kaszpázinhibitorokkal vagy más aktív vegyületekkel.
1
HU 007 312 T2
A találmány különösen alkalmas a betegek kognitív hiányosságainak kezelésére, azaz e hatások csökkentésére és/vagy a betegek kognitív percepciójának javítására. Az etazolate a (II) képletnek felel meg.
2
kitin és származékai és cellulóz-éterek). Oldószerek vagy oldatok például a Ringer-oldat, víz, desztillált víz, foszfátpufferek, foszfáttal pufferelt sóoldatok és más konvencionális folyadékok. A találmány alkalmazható emlõsöknél, nevezete5 sen embereknél. A példákban bemutatott eredmények illusztrálják az etazolate hatékonyságát az excitotoxicitás, az oxidativ stress és az agyi oxigénhiány körülményeinek kitett neuronok túlélésének javításában, és ál10 latok memorizálóképességének averzív helyzetben való javításában. A jelen találmány további aspektusai és elõnyei az alábbi példákban szerepelnek.
(II) 15 A vegyület lehet só, észter racém, aktív izomer stb. formában. A vegyületnek a sejteket szabad gyököktõl való védõképessége in vitro igazolható. A jelen találmány így elõször javasolja szabad gyökök modulálását és a GABA(A) receptor modulálását összekötõ terápiás beavatkozást a neurodegeneratív betegségekkel kapcsolatos kognitív hiányosságok kezelésére szolgáló terápiás célként. A találmány egyes kiviteli módjai szerint a találmány ezen betegségek korai szakaszában fellépõ kognitív hiányok kezelésére alkalmazható. A találmány különösen alkalmas az Alzheimer-betegség, a keringési demencia, a Huntington chorea és a Parkinson-betegség esetében. A jelen találmány szerint alkalmazott vegyület különbözõ módon lehet formázva és adagolva. Az adagolás minden a szakember által ismert módon történhet, elõnyösen orálisan vagy injekcióban, szisztémás vagy lokális módon. Az injekció tipikusan intraokuláris, intraperitoneális, intracerebrális, intravénás, intraartériás, szubkután, vagy intramuszkuláris lehet. Az adagolás elõnyös módja az orális vagy szisztémás adagolás. Az adagokat a szakember választhatja meg. Tipikusan 0,01 mg¹tól 100 mg/kg¹ig terjedõ mennyiségû vegyület injektálandó. Az egyszeri beadott adagok például 0,5tõl 40 mg¹ig terjednek. Ismételt injekciók adhatók, esetlegesen más aktív hatóanyagokkal vagy minden gyógyszerészetileg elfogadható vivõanyaggal kombinálva (pl. pufferek, sóoldatok, izotóniás oldat, stabilizálóágensek jelenlétében stb.). A gyógyszerészetileg elfogadható vivõanyag vagy hordozó választható a pufferoldatok, oldószerek, kötõanyagok, stabilizálók, emulgeálók stb. közül. Puffervagy hígítóoldatok különösen a kalcium-foszfát, a kalcium-szulfát, a laktóz, a cellulóz, a kaolin, a mannit, a nátrium-klorid, a keményítõ, a porcukor és a hidroxipropil-metil-cellulóz (HPMC) (a késleltetett felszabadulás céljából). Kötõanyagok például a keményítõ, a zselatin, a volumennövelõ oldatok, mint pl. a szacharóz, a glükóz, a dextróz, a laktóz stb. oldatai. Természetes vagy szintetikus gumik is alkalmazhatók, mint pl. az alginát, a karboxi-metil-cellulóz, a metil-cellulóz, a poli(vinil-pirrolidon) stb. Egyéb hordozók például a cellulóz és a magnézium sztearát. A készítmények tartalmazhatnak stabilizálószereket, mint pl. poliszacharidokat (gumiarábikum, agar, alginsav, guargumi és tragakanta,
20
25
30
35
Az ábrák magyarázata 1. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása a kisagy szemcsesejtjeinek NMDA/szerin által okozott mérgezésével szemben. 2. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása a kisagy szemcsesejtjeinek kainsav által okozott mérgezésével szemben. 3. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása a kéregneuronoknak NMDA/szerin által okozott mérgezésével szemben. 4. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása a kéregneuronoknak kainsav által okozott mérgezésével szemben. 5. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása a ventrális gerincvelõsejteknek NMDA/szerin által okozott mérgezésével szemben. 6. ábra: Az etazolate idegvédõ hatása az SH¹SY5Y sejteknek 6¹hidroxi-dopamin által okozott mérgezésével szemben. 7. ábra: Az etazolate védõ hatása patkány agyi infarktus modellben. Példák
40
45
50
55
60 4
1. példa: PDE4, AKAP1 és GABA(A)RAPL1 azonosítása az excitotoxicitás molekuláris céljaiként A differenciális mennyiségi elemzést a különbözõ stádiumban lévõ állati agymintákból kivont poliadenilált (poly A+) RNS-bõl végeztük, a neuronok elõzetes izolálása nélkül, annak érdekében, hogy a kórkép fejlõdéséhez kötõdõ lehetséges legtöbb alternatív splicing eseményt tudjunk figyelembe venni. A poly A+ RNS-mintákat a szakember által ismert eljárásokkal állítottuk elõ. Különösen szóba jöhet kaotropikus anyagokkal, mint guanidin-tiocianát való kezelést követõen az összes RNS oldószeres (pl. fenol, kloroform) extrakciója. Az ilyen módszerek a szakember számára ismertek [(lásd Maniatis et al., Chomczynsli et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156], és könnyen megvalósíthatók a kereskedelemben hozzáférhetõ kitekkel. Az összes RNS-bõl a poli A+ RNS¹ek klasszikus, a szakember számára ismert és a kereskedelemben hozzáférhetõ kitekkel elõállíthatók. Ezek a poli A+ RNS¹ek a reverz transzkriptáz segítségével végbemenõ inverz transzkripció reakciómátri-
1
HU 007 312 T2
xaként szolgálnak. Elõnyösen RN¹áz H¹aktivitásmentes reverz transzkriptázt használunk, amely lehetõvé teszi a hagyományos reverz transzkriptázzal elõállított szálainál hosszabb komplementer DNS elsõ szálainak elõállítását. Ilyen RN¹áz H¹funkció nélküli reverz transzkriptáz készítmények a kereskedelemben hozzáférhetõk. A kórkép fejlõdési kinetikájának minden pontjában (30 nap, 60 nap és 90 nap) a poli A+ RNS-eket és a cDNS egyes láncokat transzgenikus (T) és szingenikus (C) kontrollállatokból nyertük ki. A DATAS módszernek megfelelõen minden kinetikus ponthoz mRNS (C) és cDNS (T) hibrideket és mRNS (T) és cDNS (C) reciprok hibrideket állítottunk elõ. Ezeket a heteroduplex mRNS/cDNS preparátumokat ezt követõen a DATAS módszer protokolljainak megfelelõen tisztítottuk. A komplementer DNS-sel nem párosított RNSszekvenciákat az összepárosított RNS¹t lebontó RN¹áz H enzimmel felszabadítottuk a heteroduplexbõl. Ezek a nem párosított szekvenciák reprezentálják az egyébként egymáshoz képest homológ RNS¹ek közti minõségi különbségeket. Ezek a minõségi különbségek az RNS szekvencia bármely helyén lehetnek, akár az 5’¹, 3’¹helyzetben vagy a szekvencia belsejében és nevezetesen a kódolószekvenciában is. A lokalizáció helye szerint ezek a szekvenciák nemcsak splicing módosítások lehetnek, hanem transzlokációk vagy törlõdések következményei is. A különbözõ minõségi eltéréseket mutató RNSszekvenciákat ezután a szakember által ismert, és különösen a DATAS technikára vonatkozó szabadalom szerinti módszerekkel klónozzuk. Ezeket a szekvenciákat cDNS-könyvtárakba csoportosítjuk, amelyek a differenciált minõségi könyvtárakat tartalmaznak. Egy könyvtár tartalmazza az egészséges állapotnak megfelelõ exonokat és intronokat, míg a többi gyûjtemény a kóros állapotoknak megfelelõ splicing eseményeket. A klónok differenciált kifejezõdését a különbözõ tanulmányozott körülmények mellett kinyert messenger RNS-bõl reverz transzkripcióval nyert szondákkal való hibridképzéssel igazoltuk. A differenciált klónhibrideket késõbbi elemzésre félretettük. A DATAS módszerrel azonosított szekvenciák a kóros és az egészséges állapotok közötti splicing keretében differenciáltan kifejezõdött intronoknak és/vagy exonoknak felelnek meg. Ezek a splicing események specifikusak a kórfejlõdés adott szakaszának vagy az egészséges állapotnak megfelelõen. A szekvenciáknak az adatbázisokkal való összehasonlítása alapján osztályozhatók a megkapott információk és javasolható a szekvenciák diagnosztikus vagy terápiás fontosság szerint átgondolt kiválasztása. A DATAS eljárásnak a kontroll és a transzgenikus 60 napos állatok RNS¹én való végrehajtása során lehetõvé vált a 4B foszfodiészteráz mRNS-ébõl származó cDNS-töredék izolálása. Ez a töredék egy, specifikusan a kontrollállatokban jelen lévõ exon töredékének
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
felel meg, és így a 60 napos stádiumban a transzgenikus SOD1 G93A állatokban ez specifikusan törlõdött. Ez a fragmens az egér PDE4B stopkodonjától számított 377–486 nukleotidokra terjed ki (a GenBank-ban AF208023 szám alatt hozzáférhetõ szekvencia). Ez a szekvencia 2912 bázist tartalmaz, amelybõl a törölt bázisok a 2760–2869 tartománynak felelnek meg. Ez egy nem kódoló régió és a kontroll- és a transzgenikus állatok között differenciáltan fejezõdik ki, vagy egy nem kódoló 3’¹exon alternatív használata, vagy két alternatív poliadenilációs hely használata következtében. A DATAS eljárásnak a kontroll és a transzgenikus 60 napos állatok RNS¹én való végrehajtása során lehetõvé vált az AKAP1 mRNS-ébõl származó cDNS-töredék izolálása is. Ez a töredék egy, specifikusan a kontrollállatokban jelen lévõ exon töredékének felel meg, és így a 60 napos stádiumban a transzgenikus SOD1 G93A állatokban ez specifikusan törlõdött. Ez a fragmens a GenBank NM 009648 szám alatti szekvencia 1794–2322 nukleotidtartományával homológ. Ez egy kódolórégió és a kontroll- és a transzgenikus állatok között az alternatív splicing következtében differenciáltan fejezõdik ki. A DATAS eljárásnak a kontroll és a transzgenikus 60 napos állatok RNS¹én való végrehajtása során lehetõvé vált az GABA(A)RAPL1 mRNS-ébõl származó cDNS-töredék izolálása is. Ez a töredék egy, specifikusan a kontrollállatokban jelen lévõ exon töredékének felel meg, és így a 60 napos stádiumban ez a transzgenikus SOD1 G93A állatokban specifikusan törlõdött. Ez a fragmens a GenBank BC024706 szám alatti szekvencia 1055–1461 nukleotidtartományával homológ. Ez a régió a 3’ nem kódoló régió származéka és differenciáltan fejezõdik ki a kontroll- és a transzgenikus állatok között. Ezek az elemek teszik lehetõvé a jelzõutak tisztázását és definiálását és azt mutatják, hogy a GABA(A)R-függõ szignalizáció az Alzheimer-betegség által érintett betegek agyában módosultnak látszik. Az egyrészt az Alzheimer-betegség által érintett betegek prefrontális kortexébõl kivont mRNS¹ek, másrészt az azonos korú kontrollegyének agyának azonos területébõl kivont mRNS¹ek DATAS módszerrel végzett kvalitatív differenciális screening segítségével végzett elemzése valójában bizonyította a GABA(A)RAP¹ot [GABA(A) Receptor Associated Protein] kódoló mRNSének splicing módosulását. Ez a módosulás a GenBank NM 007278.1 sz. alatt nyilvántartott szekvencia 273¹as bázisának szintjénél lévõ 135 intronbázis megtartását mutatja. Ez a megtartás módosítja a GABA(A)RAP fehérje nyitási fázisát és így a funkcionalitását. Ez a fehérje szerepet játszik a GABA(A) receptor prezentációjában és deszenzibilizálásában és a DATAS elemzés módosulást mutat a szinaptikus aktivitás szabályozásának ezen a szintjén. A GABA-szignalizáció a szinaptikus aktivitás egyik leghatásosabb negatív szabályozómechanizmusa. A GABA(A) receptornak a GABA neuromediátor által való ingerlése során ez az ioncsatorna-receptor beengedi a neuronok repolarizációjában részt vevõ klório-
1
HU 007 312 T2
nokat. A GABA(A) receptor 2 alfa-alegységet, két bétaalegységet és egy kiegészítõ, alapvetõen delta¹, epszilon- vagy gamma-alegységet tartalmazó pentamer formát mutat. A GABA(A) receptor agonisták anxiolitikus hatásúak, de emlékezetgátlók. A GABA(A) receptor antagonisták anxiogének, remegést okoznak és emlékezetjavítók. Ismert továbbá, hogy az Alzheimer-betegség által érintett betegek agyában a GABA(A) receptor egyik alegysége, a béta3-alegység kevéssé kifejezett. A hippokampuszban jelen lévõ epszilon-alegységbõl – amely az Alzheimer-betegség fejlõdésében az egyik elõször módosuló agyi struktúra – származnak a GABA(A) receptor eredeti farmakológiai tulajdonságai. Ennek megfelelõen az egy epszilon-alegységet tartalmazó GABA(A) receptorhoz a béta-alegységeken keresztül való kapcsolódásnál farmakológiai hatóanyagok, mint a pirazolo-piridinek, pl. a tracazolate és etazolate felgyorsítják a GABA(A) receptornak a GABA neurotranszmitterrel való kölcsönhatása utáni deszenzibilizálását. Ez a hatás különösen érdekes, mert az öregedés összefügg a GABA(A) receptor deszenzibilizálásához szükséges idõtartam növekedésével. Az epszilon-alegységnek a jelen találmány szerint leírt, az életkorhoz kötõdõ betegségek, mint az Alzheimer-betegség lefolyásában szerepet játszó GABA(A) receptorok deszenzibilizálásához szükséges idõtartammal kapcsolatos módosulása kompenzálható a betegek gyógyszerhatóanyagokkal, mint a pirazolo-piridinek, pl. tracazolate és etazolate, való kezelése útján. Ez utóbbi vegyület elõnye, hogy egyidejûleg PDE4-inhibitor is, amelynek szerepét az excitotoxicitásban a jelen találmány mutatja be. A szignalizáció ezen útjának befolyásolhatósága neurodegeneratív betegségek különösen hatásos kezeléseihez vezethet, nevezetesen a kognitív funkciók megváltozásával kapcsolatos neurodegeneratív betegségeknél, mint pl. az Alzheimer-betegségnél és a keringési demenciánál. 2. példa: Az excitotoxicitás gátlása Ebben a példában kisagyi szemcsesejteket, kérgi neuronokat és ventrális gerincvelõsejteket tenyésztettünk az alábbiakban leírt módszerekkel. Primer kisagyi szemcsesejttenyészet 7 napos Wistar-patkányokat dekapitáltunk és a kisagyat kipreparáltuk. Az agyhártya eltávolítása után a szövetet kis méretre daraboltuk és 15 percig 37 °C¹on tripszinnel kezeltük. A sejteket triturálással szétválasztottuk és 300 000 sejt/cm2 sûrûségben tenyészteni kezdtük 10% borjú magzati szérummal és 2 mM glutaminnal kiegészített Basal Eagle táptalajban. Másnap 10 mM antimitotikus ARA-C¹t adtunk hozzá a gliasejtek szaporodásának meggátlására. A sejteket 9 nap tenyésztés után a toxikus anyagok, 50 mM kainsav vagy 100 mM N¹metil-D-aszpartát 10 mM D¹szerin jelenlétében való hozzáadása elõtt etazolate inhibitorral kezeltük. A 8¹bróm-cAMP¹t közvetlenül a toxikus anyagok
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
elõtt adtuk hozzá. Minden kezelést legalább két különbözõ tenyészetben és legalább duplikálva végeztünk el. 6 óra inkubálás után a toxicitást MTT-teszttel mértük. Az eredményeket a nem kezeltek átlagára normálva Wilcoxon-próbával statisztikusan elemeztük. A szignifikanciát p kisebb vagy egyenlõ 0,05 szintben határoztuk meg. Primer kéregsejttenyészet 16 napos Wistar-patkányembriókat metszettünk ki és az agykérget kipreparáltuk. 37 °C¹on 25 percig tripszinnel emésztettük, majd a sejteket triturációval szétválasztottuk. A sejteket 10% lószérummal és 10% borjú magzati szérummal, valamint 2 mM glutaminnal együtt Minimal Essential Media táptalajba oltottuk 300 000 sejt/cm2 sûrûségben. 4 nap tenyésztés után a táptalaj felét 5% lószérummal és 2 mM glutaminnal kiegészített Minimal Essential Media táptalajjal helyettesítettük. Ugyanazon a napon 10 mM 5¹fluor-2-dezoxiuridin antimitotikumot adtunk hozzá. 7 és 11 nap tenyésztés után a táptalaj felét kondicionált táptalajra cseréltük. Az 5% lószérumot és 2 mM glutamint tartalmazó kondicionált táptalajt felhasználás elõtt egy éjszakán át agykérgi asztrocita sejtszõnyeggel érintkeztettük. A 14. napon a sejteket a toxikus anyagok, 10 mM D¹szerin jelenlétében 50 mM kainsav vagy 20 mM N¹metil-Daspartát hozzáadása elõtt etazolate-inhibitorral kezeltük. Minden kezelést legalább két különbözõ tenyészetben és legalább duplikálva végeztünk el. 6 óra inkubálás után a toxicitást MTT-teszttel mértük. Az eredményeket a nem kezelt átlagára normálva Wilcoxonpróbával statisztikusan elemeztük. A szignifikanciát p kisebb vagy egyenlõ 0,05 szintben határoztuk meg. Primer ventrális gerincvelõsejt-tenyészet A sejteket 14 napos Wistar-patkányembriókból izoláltuk. A terhes patkányokat megérkezésükkor szén-dioxiddal megöltük. Az embriósorozatot kiemeltük és PBS¹t tartalmazó dobozba tettük. Minden embrió gerincvelõjét kipreparáltuk és a ventrális gerincvelõt elválasztottuk a dorzális gerincvelõtõl. A ventrális gerincvelõket ezután 37 °C¹on 20 percig tripszinnel kezeltük. A tripszin hatását egy Leibovitz 15 táptalajból 20% lószérumból, N2 (1X) Supplementbõl, 20% glukózból (3,2 mg/ml), 7,5/bikarbonátból (1,8 mg/ml) és L¹glutaminból (2 mM) álló táptalaj hozzáadásával állítottuk le. A sejteket triturációval szétválasztottuk. A felhalmozódott szövettömeget eltávolítottuk és a disszociált sejteket mennyiségileg tripánkék színezéssel határoztuk meg. A sejteket 250 000 sejt/cm2 sûrûségben neurobasal táptalajt, 2% lószérumot, B27 (1X) Supplement¹et, és glutamint (2 mM) tartalmazó táptalajba oltottuk. 3 napos in vitro tenyésztés után ARA¹C antimitotikumot (5 mM) adtunk hozzá a gliasejtek termelésének gátlása céljából. A sejteket 37 °C¹on 9 napig tenyésztettük nedvesített inkubátorban (5% CO2). 9 napos tenyésztés után a sejteket a toxikus anyag, 10 mM D¹szerin jelenlétében 25 mM N¹metil-D-aszpartát (NMDA) hozzáadása elõtt etazolate-inhibitorral kezeltük. Minden kezelést legalább két különbözõ tenyészetben és leg-
1
HU 007 312 T2
alább duplikálva végeztünk el. A toxikus NMDA/D¹szerinnel való 3 órás inkubálás után a toxicitást MTT-teszttel mértük. Az eredményeket a nem kezelt átlagára normálva Wilcoxon-próbával statisztikusan elemeztük. A szignifikanciát p kisebb vagy egyenlõ 0,05 szintjében határoztuk meg. MTT-teszt A toxicitást az MTT-teszttel mértük. A vegyületekkel való inkubálás után minden mérõhelyen 0,5 mg/ml végsõ koncentrációig MTT¹t adtunk. A lemezeket ezután 30 percig 37 °C¹on sötétben inkubáltuk. A táptalajt leszívtuk és a kristályokat 500 ml DMSO-ban (dimetilszulfoxid) újraszuszpendáltuk. 550 nm¹en olvastuk le az abszorbciót és a túlélési százalékot számoltuk ki. Eredmények A kapott eredményeket a 1–5. ábrákon szemléltetjük. Ezek az eredmények a találmány szerinti vegyületeknek a neuronális túlélésre vonatkozó védõhatását illusztrálják. A neuronoknak a találmány szerinti inhibitorral való együttes kezelése során az excitotoxicitás indukálásánál (NMDA/Szerin és/vagy kainsav) dózisfüggõ védõhatást figyeltünk meg. Az 1. és 2. ábrán az etazolate segítségével a kisagy szemcsesejtjein kapott eredményeket mutatjuk be. Az eredmények az mutatják, hogy az etazolate az NMDA/szerin kezelésnél 40%¹os, míg a kainsav toxicitásával kapcsolatban 50%¹os védõhatást tesz elérhetõvé. A 3. és 4. ábra az etazolate kérgi neuronokra való hatásának eredményeit mutatja be. Az eredmények az mutatják, hogy az etazolate az NMDA/szerin kezelésnél 47%¹os, míg a kainsav toxicitásával kapcsolatban 40%¹os védõhatást tesz elérhetõvé. Az 5. ábra az etazolate ventrális gerincvelõre való hatásának eredményeit mutatja be. Az eredmények az mutatják, hogy az etazolate az NMDA/szerin kezelésnél 36%¹os védõhatást tesz elérhetõvé. A jelen találmány tehát nem csupán a PDE4B és a GABA(A) receptorok szerepét dokumentálja az excitotoxicitás mechanizmusaiban, hanem az excitotoxicitással kapcsolatos stress következtében a neuronok túlélését megtartó inhibitorok képességét is.
védõfaktor-hatását a 2. és 3. példa szerinti eredmények erõsítik meg.
5
10
15
20
25
30
35
40
45 3. példa: Az oxidatív stress gátlása Ebben a példában az SH¹SY5Y sejtvonal sejtjeit a szakember számára ismert módszerekkel tenyésztettük. Ezek humán neuroblast sejtszármazékok és tulajdonságaik egy korai fejlõdési fázisban lévõ neuronprekurzorra jellemzõek. Az oxidatív stresst a mérgezõ 6¹hidroxi-dopamin (6¹OHDA) alkalmazásával idéztük elõ. A toxicitást MTT-teszttel mértük. A 6. ábra az etazolate SH¹SY5Y sejtekre való hatásának eredményeit mutatja be. Az eredmények az mutatják, hogy az etazolate a 6¹OHDA kezelésnél 40%¹os védõhatást tesz elérhetõvé. Az etazolate tehát ROS által indukált sejthalál potenciális in vitro védõfaktora. Az etazolate potenciális
2
50
55
60 7
4. példa: Oxigénhiányos állapot tanulmányozása patkányban Az etazolate védõhatását patkány agyi infarktus modellen értékeltük. E vizsgálat során az arteria carotis internában és az arteria cerebri mediában intracavitáris elzáródással agyi infarktust provokáltunk. Egy 8 patkányból álló csoportot (10 mg/kg, po.) etazolate-tal kezeltünk az elzáródás elõtt és többszõr utána is. Egy másik 8 patkányból álló csoportot az L¹NAME kontrollvegyülettel (1 mg/kg, ip.) kezeltünk az elzáródás elõtt és többször utána is. Egy további 8 patkányból álló csoportot csak a vivõanyaggal kezeltük. A hatást klinikai megfigyeléssel, funkcionális neurológiai tesztekkel és a vizsgálat után az infarktus méretének meghatározásával értékeltük. A kapott eredmények azt mutatják, hogy az etazolate a kontrollhoz képest az infarktus méretét átlagosan 28%-kal csökkentette (lásd a 7. ábra példáját). Másrészt a hipoaktivitás javulását figyeltük meg az etazolate-tal kezelt csoportnál a kontrollcsoporthoz képest (31% az etazolate-csoportnál szemben a 42%-kal a kontrollcsoportnál). Ezenkívül az állatok neurológiai értékelése kimutatta a javulást a kezelt csoportban a kontrollcsoporthoz képest. 5. példa: Vizes medencés labirintusteszt (Morrismedencében) Ezt a tesztet patkányok averzív helyzetben mutatott memorizálási képességének és a térbeli információ kezelési képességének értékelésére használják. Az állat feladata abból áll, hogy távoli jelzések segítségével találja meg egy áttetszõvé tett vízzel telt medencébe merülõ láthatatlan „menedék platformot” Az elrendezés lehetõvé teszi a kontrollállat memóriájának értékelését (a platform minden vizsgálati napon azonos helyen marad). E teszt segítségével lehet a tesztelt állatoknak a hippokampusz funkcióitól függõ emlékezési teljesítményét értékelni. A teszt különösen alkalmas arra, hogy a felnõtt (10 hónapos) és idõs (30 hónapos) patkányok teljesítményét megkülönböztethessük. A hippokampusz az Alzheimer-betegség korai szakaszában megváltozott funkciókat mutató agyi struktúra. A Morris-medencés teszt a szakember által tehát különösen elismert, mivel ezzel az Alzheimer-betegség és más kognitív hiányokkal kapcsolatos kórképek kezelésére szánt vegyületek farmakológiai tulajdonságait lehet értékelni. Az etazolate-tal szájon át kezelt (3 mg/kg és 10 mg/kg), valamint csak a vivõanyaggal kezelt idõs patkányokat használtunk ehhez a vizsgálathoz. Az állatoknak a Morris-medencében mutatott teljesítményét felnõtt patkányok kontrollcsoportjához hasonlítottuk. A 3 mg/kg etazolate-kezelés enyhén javította az idõs patkányok teljesítményét. A 10 mg/kg kezelés jelentõsen közelítette az idõs patkányok teljesítményét a felnõtt kontrollcsoportéhoz. Ez az eredmény azt jelzi, hogy az etazolate a hippokampusztól függõ kognitív és emlékezési tulajdonságokat javítja, ami lehetõvé teszi az életkorhoz kötõdõ
1
HU 007 312 T2
hiányok csökkentését. Ezen eredmény az etazolate¹ot az életkorhoz kötõdõ kognitív zavarok kezelésére, nevezetesen az Alzheimer-betegség kezelésére alkalmasnak minõsíti. 5 6. példa: Humán klinikai alkalmazás Ez a példa írja le az etazolate humán alkalmazási feltételeit neurodegenerativ betegségek kezelésében. Ez a példa leírja a találmány humán terápiás lehetõségeit és a humán alkalmazás feltételeit. Ebben a vizsgálatban az etazolate növekvõ (0,5, 1, 2, 5, 10 és 20 mg) egyszeri dózisait adagoltuk orálisan 0,5 és 5 mg¹os kapszulák formájában önkéntes fiatal egészséges férfiak 8 tagú különbözõ és szekvenciális csoportjainak. Ezt a vizsgálatot egyetlen centrumban végeztük el, kettõs vak próbával, és a 8 tagú csoportból két személy placebót kapott. A klinikai toleranciát (kedvezõtlen hatások, klinikai tünetek, artériás vérnyomás vagy szívfrekvencia változása), elektrokardiográfiás (EKG felvétel) és biológiai (hematológia és biokémia, vizeletvizsgálat) paramétereket értékeltük az adagolást követõ 24 órán keresztül. Minden személynél plazmavizsgálatot végeztünk a termék beadása elõtt és után különbözõ idõpontokban (0.25, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00, 6.00, 8.00, 10.00, 12.00 és 24.00 órával). A termékre vizeletvizsgálatot is végeztünk beadás elõtt és után összegyûjtött vizeletbõl (4, 4–8, 8–12 és 12–24 órával). A növekvõ adagok beadási szakasza végén egy további 6 fõs csoport kapott kétszeri ismétléssel, éhgyomorra és zsírban gazdag étkezés után etazolate¹ot. Ennek a második résznek a célja az volt, hogy összehasonlítsuk a termék vérszintjét a két adagolási feltétel mellett. A klinikai toleranciát (kedvezõtlen hatások, klinikai tünetek, artériás vérnyomás vagy szívfrekvencia változása), elektrokardiográfiás (EKG felvétel) és biológiai (hematológia és biokémia, vizeletvizsgálat) paramétereket értékeltük az adagolást követõ 24 órán keresztül. Minden személynél plazmavizsgálatot végeztünk a termék beadása elõtt és után különbözõ idõpontokban (0.25, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00, 6.00, 8.00, 10.00, 12.00 és 24.00 órával). A termékre vizeletvizsgálatot is végeztünk beadás elõtt és után összegyûjtött vizeletbõl (4, 4–8, 8–12 és 12–24 órával). Humán klinikai vizsgálatokban való alkalmazhatóság érdekében gyomornedvnek ellenálló kapszulát is kifejlesztettünk ehhez a termékhez.
2
A növekvõ dózisú alkalmazási vizsgálat elsõ fázisában kapott eredmények azt mutatták, hogy az etazolate jól tolerálható volt és nem voltak másodlagos hatásai. A plazmavizsgálat még igazolta a termék nagy dózisban való jó humán abszorpcióját is.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 10
1. A (II) képletû etazolate
15
20
(II)
vagy ennek sója vagy észtere alkalmazása humán beteg kognitív percepciójának javítására szolgáló gyógyszerkészítmény elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jel25 lemezve, hogy a beteg Alzheimer-betegségben, Parkinson-betegségben vagy Huntington choreában érintett. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkal30 mazás, azzal jellemezve, hogy a készítményt orálisan vagy szisztémásan adagoljuk. 4. A (II) képletû etazolate¹ot,
35
40 (II) vagy annak sóját, vagy észterét tartalmazó, humán be45 teg kognitív percepciójának javítására szolgáló készítmény.
8
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
9
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
10
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
11
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
12
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
13
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
14
HU 007 312 T2 Int. Cl.: A61K 31/437
15
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
