!HU000004255T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 255
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 5/06
(21) Magyar ügyszám: E 04 701001 (22) A bejelentés napja: 2004. 01. 09. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040701001 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1644484 A1 2005. 01. 20. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1644484 B1 2008. 09. 17.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: PCT/EP03/07551 2003. 07. 11.
(73) Jogosult: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH, 24063 Kiel (DE)
WO
(72) Feltalálók: KREMER, Bernd, Karl, Friedrich, 24107 Kiel (DE); Fändrich, Fred, 24105 Kiel (DE); Schulze, Maren, 24238 Wittenberger Passau (DE) (54)
(2006.01) C12N 5/08 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05005620 PCT/EP 04/000109
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Öntoleranciát indukáló autológ monocitaeredetû sejtek és azok alkalmazása gyógyászati készítményekben
(57) Kivonat
HU 004 255 T2
A találmány tárgyát monocitaeredetû sejtek képezik páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek, különösen autoimmun betegségek és allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére, és a sejteket tartalmazó gyógyászati készítmények. Ezek a sejtek
autológok azon páciens vonatkozásában, akinek azokat beadják. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás autológ szabályozó T¹sejtek létrehozására és/vagy szaporítására.
A leírás terjedelme 34 oldal (ezen belül 12 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 255 T2
A találmány tárgyát monocitaeredetû autológ sejtek képezik, amelyek képesek immunológiai öntolerancia kiváltására páciensben. Ezeket a sejteket ezt követõen „STIC”-nek („self-tolerance inducing cells”) nevezzük. A találmány tárgyát képezik továbbá STIC alkalmazása gyógyászati készítményekben megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek, elõnyösen autoimmun betegségek és allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. A találmánnyal kapcsolatban az „autológ” kifejezés azt jelzi, hogy a STIC¹ek azon páciens vérébõl származó monocitákból származnak, akinek a STIC-eket beadjuk. Kimutattuk, hogy a találmány szerinti sejtek képesek szabályozó T¹sejtek (TregcD4+25+) indukálására. A találmány tárgyát képezi tehát szabályozó T¹sejtek indukálása és/vagy in vitro elõállítása. Az immunrendszer védi a szervezetet a potenciálisan patogén antigénektõl, mint például mikroorganzimusoktól, míg normálisan nem reagál magának a szervezetnek az alkotóelemeivel; azaz az egészséges immunrendszer tolerálja a „saját antigéneket”. Megzavart öntolerancia akkor fordul elõ, amikor specifikus adaptív (szerzett) immunválasz alakul ki saját antigének ellen. Az idegen antigének elleni adaptív immunválasz normál következménye az antigénnek a szervezetbõl való kiürülése. Amikor az adaptív immunválasz saját antigének ellen alakul ki, azonban általában lehetetlen az immuneffektor mechanizmusok számára, hogy teljesen eliminálják az antigént, ily módon fenntartott válasz alakul ki. Ennek következménye az, hogy az immunitás effektor útvonalai krónikus gyulladásos szöveti sérülést okoznak, amely halálos is lehet (lásd Immuno Biology 5, „The Immune System In Health and Betegség”, kiad.: Garland Publishing, 2001, 13. fejezet, 501–522. old.). Az adaptív immunválaszok antigénspecifikus T¹ és/vagy B¹sejtek aktiválásával iniciálódnak, és úgy vélik, hogy az autoimmunitás is ugyanígy iniciálódik (Immuno Biology, mint fent, 501. old.). A találmány egy elõnyös megvalósítási módjának tárgya autoimmun betegségek kezelése és/vagy megelõzése STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazásával. Az autoimmun betegségek két fõ mintázatát lehet megkülönböztetni. Olyan betegségek, amelyekben az autoimmunitás megjelenése a szervezet specifikus szerveire korlátozódnak, „szervspecifikus” autoimmun betegségekként ismertek, míg a „szisztémás” autoimmun betegségekben a szervezet számos szövete érintett. A szervspecifikus autoimmun betegségek példái közé tartozik a Hashimoto-thyroiditis és Graves-betegség, amelyek elsõsorban a pajzsmirigyet érintik, és az I¹es típusú cukorbetegség, amely a hasnyálmirigyszigeteket érinti. A szisztémás autoimmun betegségek példái a szisztémás lupus erythematosus és az elsõdleges Sjogren-szindróma, amelyben olyan különbözõ szövetek, mint például a bõr, vesék és agy mindegyike érintett lehet (lásd Immuno Biology, mint fent, 503. old.).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Vannak olyan autoimmun betegségek, amelyekrõl elsõsorban azt gondolják, hogy a T¹sejtek közvetítik, például az inzulinfüggõ cukorbetegség, reumatoid arthritisz és sclerosis multiplex, míg más esetekben a sejtfelszíni vagy mátrix antigének elleni ellenanyagok kialakulása játszik domináns szerepet, mint például autoimmun hemolitikus anémia, autoimmun trombocitopenia purpura, Goodpasture-szindróma, pemphigus vulgaris vagy akut reumás láz; egy még másik csoport az immunkomplex betegségek, amelyekben a T¹sejtek és B¹sejtek egyaránt részt vesznek, mint például a kevert esszenciális cyroglobulinemia, szisztémás lupus erythematosus vagy reumatoid arthritisz (lásd Immuno Biology, mint fent, 13.1. ábra az 502. oldalon). A találmány egy további megvalósítási módjának tárgya allergiák kezelése gyógyászati készítményekbe kiszerelt találmány szerinti STIC-ekkel. Újabban azt javasolták, hogy a szabályozó T¹sejtek fontos szerepet játszanak az immun-homeosztázis szabályozásában, azaz bármilyen fertõzõ vagy antigénfüggõ cél elleni szervezett immunválaszban, beleértve az öntoleranciát is, lásd Takeshi Takahashi és Shimon Sakaguchi, International Review of Cytology, 225, 1–32. old. (2003); Shimon Sakaguchi, Vox Sang 83, 151–153. old. (2002), Kathryn J. Wood és Shimon Sakaguchi, Nature Reviews Immunology, 3. 199–210. old. (2003). Amint Takahashi és mtsai. (mint fent, 1. oldal, kivonat) megállapítja, „gyûlik a bizonyíték arra, hogy a önreaktív T¹sejtek T¹sejtek-közvetítette domináns szabályozása hozzájárul az immunológia öntolerancia fennmaradásához, és annak megváltozása vezethet az autoimmun betegségek kialakulásához. Az ilyen szabályozó T¹sejt-populációk elkülönítésére tett kísérletek feltárták, hogy a CD4+-populációban található CD25+ sejtek a normális naiv állatokban – beleértve az embereket is – rendelkeznek a szabályozó aktivitással. A CD25+ plusz CD4+ szabályozó T¹sejteket a normális csecsemõmirigy termeli, mint a T¹sejtek funkcionálisan elkülöníthetõ alpopulációját. Ezek kritikus szerepet játszanak nemcsak az autoimmunitás megakadályozásában, de a különféle immunválaszok szabályozásában is.” A T¹sejt-közvetített autoimmun betegségek mellett az immunrendszer B¹sejt-kompartmentje kiválthat autóagresszív betegségeket, amelyek a saját sejtek (beleértve a hízósejteket), szövetek és szervi szerkezetek elleni ellenanyagok termelõdésével kapcsolatosak. Jól ismert, hogy a B¹sejt aktiválása a T¹sejtes segítségtõl függ, oly módon, hogy a segítõ T¹sejtek stimulálják a klonális B¹sejt-expanziót a specifikus antigének prezentálása után. Az antigének fragmentált allergénekbõl származhatnak, és azután a T¹sejtekben kismolekulás peptidekké processzálódhatnak. Ezek azután MHC-függõ módon prezentálódhatnak az antigénspecifikus aktiválás érdekében. Az egyrészrõl allergiás betegségekhez vezetõ, másrészrõl megzavart öntoleranciát indukálni képes specifikus allergének (lásd fent) által okozott szabályozatlan vagy túlzott B¹sejt-aktiválás megakadályozása érdekében a szabályozó T¹sejtek képesek megzavarni
1
HU 004 255 T2
a T¹sejt-asszociált B¹sejt-aktiválódást, és megakadályozni a túlzott és szabályozatlan ellenanyag-termelést. Az autoimmun betegségekhez hasonlóan az allergiás betegségek tehát befolyásolhatók és szabályozhatók a szabályozó T¹sejtek (CD4+/CD25+ T¹sejtek) mennyiségének növelésével. Közelebbrõl, EAE-ban („experimental allergic encephalomyelitis”) szenvedõ egerekben kimutatták, hogy a betegség mérséklõdött néhány héttel azután, hogy CD4b T¹sejteket adtak be ezeknek az állatoknak, és hogy a kúra a betegség további indukálása elleni rezisztenciával jár együtt [Bach, J. F., „Regulatory T Cells under Scrutiny”, Nature Reviews Immunology 3:189–198. old. (2003); Lando, Z. és mtsai., „Effect of cyclophosphamide on suppressorcell activity in mice unresponsive to EAE”, J. Immunol. 123:21 556–2160. old. (1979)]. Ezek a hatások hasonlóak a NOD egerekben mutatótokhoz, amelyekben az autoimmun cukorbetegség lefolyása megállítható CD4+-sejtek beadásával, ami az egerek további védelméhez vezet az autoimmun betegségek újbóli megjelenése ellen (Bach, J. F., mint fent). Az autoimmun reakciókkal együtt járó allergiás betegségek példái az összes nem saját fehérje, és a szervezetbe bejutó szerves és szervetlen anyagok által indukált allergiák minden típusa. Különösen fontosak ebben a vonatkozásban a pollen által indukált allergiák, mint például szénanátha, és allergének, mint például drogok, vegyszerek, vírusok, baktériumok, gombák, por, élelmiszer-komponensek, fémek, gázok, állati szervezetek komponensei, mint például bõr hámladék és szõr, és állati exkrétumok által indukált allergiák. Mindeddig nem voltak elérhetõk hatásos terápiás szerek a megzavart öntolerancia miatti betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. A szervspecifikus autoimmun betegségek esetében általában szubsztitúciós kezelést, transzplantációt vagy gyulladásellenes szerekkel, mint például kortizonnal végzett tüneti kezelést alkalmaznak. A szisztémás autoimmun betegségek esetében gyakran immunszuppresszív szereket alkalmaznak kezelésként. Nyilvánvalóan ezek a „terápiák” sok szempontból problémásak, és súlyos mellékhatásokkal járnak. Úgy becsülik, hogy a populációnak akár 5%¹a is érintett az autoimmun betegségek által (Sakagushi, mint fent, 151. old., bal oldali oszlop). Tehát szükség van hatásos módozatokra a megzavart öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, amelyek könnyen használhatók és amelyek nem járnak együtt az ilyen betegségek kezelésében eddig alkalmazott eljárásokkal és szerekkel kapcsolatos egészséget veszélyeztetõ mellékhatásokkal és magas költségekkel. Tehát a találmány alapját képezõ probléma javított módozatok biztosítása az öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. A probléma megoldására gerincesekbõl, elõnyösen emlõsökbõl, elõnyösebben emberekbõl származó autológ monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazását javasoljuk. Ezek a sejtek az alább ismertetett találmány szerinti eljárással nyerhetõk,
2
amely eljárás a szabályozó T¹limfociták (CD4+/CD25+ T¹sejtek) mennyiségének növelésére képes módosított sejteket eredményez egy személy szervezetében. Megközelítõleg 105 sejt/testtömeg¹kg (BW) beadása 5 után ezek a sejtek alkalmasak a megzavart öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. M. Lopez és mtsai. [European Cytokine Network, 5. kötet, 4. szám, 411–414. old. (1994)] beszámolnak au10 tológ vér monociták alkalmazásáról az autológ makrofágok számának növelésére, rák immunterápiás vizsgálatokban történõ újrainfúzióhoz. Az autológ makrofágok magas számának újrainfúziója jól tolerált volt, és nem figyelték meg a TNF-alfa, IL–6 vagy oldható CD 15 14 szintjének növekedését a páciensek plazmájában (413. oldal, bal oldali oszlop, 1. és 2. bekezdés).
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: GM–7 eredeti monocitikus sejtekhez való kötõdési kapacitásának áramlási citometriás meghatározása a sejtek találmány szerinti módosítása elõtt (bal oldali grafikon) és után (jobb oldali grafikon). Az x tengely mutatja a kötõdött sejtek számát. 2. ábra: CD14+ monociták kevert limfocita tenyészete B egyén (GM–7–: szürke oszlop; GM–7+: fekete oszlop), válaszoló sejtek MHC-diszharmonikus A donorból, és B donorból származó besugárzott sejtekbõl a CD14+/GM–7+ és CD14+/GM–7– sejtek szuppresszor aktivitásának összehasonlítására. 3. ábra: A CD14+-monociták és CD2+-lymfociták és a TAIC-ként ható CD–14+/CD3+-sejtek mennyiségének meghatározása a monocita frakcióban, annak meghatározására, hogy a sejtek tisztítása befolyásolja¹e a monociták dúsítását a tenyésztés kezdetekor az immunszuppresszív CD14+/CD3+-sejtek kialakulásakor. 4. ábra: PHA-stimulált limfociták (PhaLy) és TAIC („Mo+Ly” vagy „Mo”) kevert limfocita tenyészete, elõinkubálva két kísérletben indolamin-2,3-dioxigenáz (IDO) inhibitorával (1–MT) az 1–MT-nek a TAIC szuppresszor aktivitására gyakorolt hatásának meghatározására. 5. ábra: GM–7-expresszió áramlási citometriás meghatározása páciensek vérében operáció után a TAIC injektálása után (bal oldali ábra) és elõtt (jobb oldali ábra), a TAIC-nak az in vivo GM–7-expresszióra gyakorolt hatásának meghatározására vérsejtekben. 6. ábra: Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek vastagbélmetszeteinek H & E festése, amelyek egy kezeletlen 3. állatcsoport (6A/B. ábra), egy elsõ, STIC¹el a
1
7. ábra:
8. ábra:
9. ábra:
10. ábra:
11. ábra:
HU 004 255 T2
DSS-kezelést követõ +1. napon kezelt állatcsoport (6C/D. ábra), egy negyedik, a +1. napon „kontrollsejtekkel” kezel állatcsoport (6E. ábra) és egy STIC¹el a +7. napon kezelt állat (6F. ábra) vastagbelének az állapotát illusztrálják. (2,5× nagyítás a 6A/C/E. ábrákon; 10× nagyítás a 6B/D/F. ábrákon). Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek testtömegének változása egy háromhetes idõszakban a DSS-kezelés vége után. Az 1. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük a +1. napon, a 2. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük a +7. napon, a 3. csoport állatai ( ) kezeletlenek voltak, míg a 4. csoport állatait (·) „kontrollsejtekkel” kezeltük a +1. napon. Az értékek csoportonként 5–7 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±15% alatt van. Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek vastagbélmetszeteinek hisztokémiai értékelésének eredményei. Az 1. csoport állatait STIC¹el kezeltük a +1. napon, a 2. csoport állatait STIC¹el kezeltük a +7. napon, a 3. csoport állatai kezeletlenek voltak, míg a 4. csoport állatait „kontrollsejtekkel” kezeltük a +1. napon. (0 érték=egészséges nem feltûnõ lelet; 1 érték=minimális kolitisz; 2 érték=közepes kolitisz; 3 érték=súlyos kolitisz; és 4 érték=ulceratív kolitisz, a teljes nyálkahártya roncsolásával kísérve). A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egereinek testtömegváltozása az egerek tömegéhez viszonyítva 6 héttel a kísérlet kezdete után, amikor azok a sejtterápiát kapták. Az 1. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük 6 hét után, a 2. csoport állatai ( ) nem voltak kezelve, és a 3. csoport állatait ( ) „kontroll sejtekkel” kezeltük 6 hét után. Az értékek csoportonként 6 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±15% alatt van. A vastagbél hosszának (10A. ábra) és a lép tömegének (10B. ábra) mérése STIC¹et kapó egerek (1. csoport); kezeletlen kontroll egerek (2. csoport) és „kontroll sejteket” kapó egerek (3. csoport) esetében a krónikus kísérletes kolitisz CD62L+/CD4+ SCID transzfer modelljében. Az értékek átlagértékek ±SEM. A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egerek hisztokémiailag festett vastagbélmetszeteinek értékelése hat héttel a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
sejtek átvitele után. Az 1. csoport állatai STIC¹et kaptak, a 2. csoport állatai kezeletlenek voltak és nem kaptak sejtinjekciót, míg a 3. csoport állatai „kontrollsejteket” kaptak. Az értékek átlagértékek ±SEM. (0 érték=egészséges nem feltûnõ lelet; 1 érték=minimális kolitisz; 2 érték=közepes kolitisz; 3 érték=súlyos kolitisz; és 4 érték=ulceratív kolitisz, a teljes nyálkahártya roncsolásával kísérve). 12. ábra: A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egerek vastagbélmetszeteinek H & E festése, amely a 2. csoport két kezeletlen állata (12A/B. ábra), a „kontroll sejtekkel” kezelt 3. csoport két állata (12C/D. ábra) és a STIC¹el kezelt 1. csoport két állata (12E/F) vastagbelének az állapotát illusztrálják. (100× nagyítás) A találmány összefoglalása A monocitaeredetû autológ öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) elõállítására szolgáló eljárás alapvetõ lépései az alábbiak: (a) monocitákat izolálunk azon páciens vérébõl, akinek a sejteket be kell adni; (b) a monocitákat megfelelõ tenyésztõ tápközegben szaporítjuk, amely növekedést segítõ szerként makrofág-kolóniastimuláló faktort (amelyet a leírásban ezentúl M¹CSF-nek nevezünk) tartalmaz; (c) a monocitákat g¹interferonnal (amelyet a leírásban ezentúl g¹IFN-nek nevezünk) stimuláljuk; és (d) a c) lépésben kialakult öntoleranciát indukáló sejteket kinyerjük a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl való elválasztásával. Hasonló eljárást ismertetnek a DE 102 31 655.4 számú német szabadalmi bejelentésben és a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi iratban. A fent említett korábbi szabadalmi bejelentésekben az elõállított sejteket „transzplantátumelfogadást indukáló sejteknek” (TAIC) nevezik. Azokat allogén donor szövet elfogadásának indukálására alkalmazzák a recipiensben. Nagy jelentõsége van annak, hogy a DE 102 31 655.4 és PCT/EP03/07551 bejelentésekben ismertetett TAIC¹ek a donor monocitáiból származnak, és a transzplantátum befogadásának érdekében adják be azokat a recipiensnek. Ez azt jelenti, hogy a TAIC¹ek allogének a TAIC¹el kezelendõ személy szempontjából. Ezzel szemben a jelen találmány az „autológ kezelés” koncepcióján alapszik; ez azt jelenti, hogy a megzavart öntoleranciától, különösen autoimmun betegségektõl és/vagy allergiáktól szenvedõ személyt öntoleranciát indukáló sejtekkel (STIC) kezeljük, amelyek autológ monocitákból származnak. Tehát, míg a TAIC és STIC egyaránt monocitákból származnak lényegében ugyanazon folyamat révén, a TAIC allogén a kezelt páciens szempontjából, míg a STIC autológ ebben a vonatkozásban.
1
HU 004 255 T2
A STIC elõállítására szolgáló eljárás vonatkozásában kimutatják, hogy a g¹IFN-sel történõ stimuláció döntõ lépést jelent (lásd a 2. példát). A találmány szerint a monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) kifejezés azt a sejt populációt jelenti, amelyet a fent ismertetett eljárás (d) lépésében nyerünk ki. Ez a sejtpopuláció a monocitákból származó sejtek mellett – amelyek öntolerancia indukálására hatásosak – limfocitákat is tartalmaz, lásd a 4. példát, valamint opcionálisan továbbá olyan sejteket is, amelyek a mononukleáris sejt frakcióból származnak, mint például granulociták. A monocitákból származó sejtek mennyisége a STIC-populációban elõnyösen 50–90%, elõnyösebben 60–70%, a teljes sejtszámra vonatkoztatva. A találmány szerinti értelemben a „teljes sejtszám” kifejezés alatt a kérdéses sejtpopulációban található élõ sejtek mennyiségét értjük. Ezt a mennyiséget a „tripánkék festékkizárási módszerrel” határozhatjuk meg, mivel ez a festék lehetõvé teszi az élõ sejtek optikai eszközökkel történõ megkülönböztetését a nem élõ sejtektõl. A STIC¹t általában 104–106 sejt per testtömegkilogram, elõnyösen 10 5 sejt per testtömegkilogram mennyiségben alkalmazzuk öntolerancia indukálására. Az STIC beadását többször is végrehajthatjuk. A találmány szerinti STIC kockázatmentesnek bizonyult rosszindulatú daganatok kialakulása szempontjából, mind állati tesztekben, mind tenyészetben; ez egy olyan eredmény, amelytõl eltérõre semmiképpen sem lehetett számítani az eredeti monocitaeredetû sejtek természete miatt, amelyekbõl a találmány szerinti sejtek származnak. Amint alább részletesen ismertetjük, további optimalizált öntolerancia-indukáló tulajdonságú sejt-szubpopulációk izolálhatók a STIC-ben jelen lévõ sejtek frakciójából, amelyek monocitákból származnak. Az eredeti sejtek (monociták) g¹interferonnal történõ in vitro tenyésztését követõen STIC¹ek alakulnak ki, amelyek sejtek olyan szubpopulációját tartalmazzák, lásd a 3. példát, amelyek kötik a GM–7 monoklonális ellenanyagot, amelyet DSM ACC2542 hibridóma sejtvonal expresszál. A GM–7 monoklonális ellenanyag egy IgG2a izotípusú immunglobulin ellenanyag, amely a kappa-izotípust mutatja. Ezen ellenanyag jellemzõ tulajdonsága az erõs kapacitása a találmány szerinti tenyésztõ körülmények között módosított monociták kötésére, mivel az eredeti monocitikus sejteket nem ismeri fel, azaz az ellenanyag kötõdése az eredeti sejtekhez nem megy végbe (lásd a 3. példát). Ezenfelül 20 önkéntessel demonstráltuk, hogy a GM–7 nem köti a humán sejteket a perifériás vérben, lásd az 5. ábrát. Amint a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetik, az ellenanyagot egérnek TAIC-kal (ami a STIC-nek felel meg) a szakember számára ismert eljárásokkal történõ immunizálásával állították elõ (Davis, W. C., „Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols”, kiad.: New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995). Azután hibridóma sejtvonalat állítottak elõ az ellenanyagot termelõ B¹sejtek és az egérbõl származó mielóma sejtek fuzionáltatásá-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
val. Ilyen sejtvonalak elõállítására alkalmazott eljárások ismertek a szakterületen [Davis, W. C., „Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols”, kiad.: New York: Humana Press Inc. Totowa, (1995) Kohlerr G. Milstein, C., „Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature 256, 495–497. old. (1975)]. A GM–7 ellenanyagot termelõ hibridóma sejtvonal letétbe lett helyezve a Budapesti Szerzõdés szerint a DSMZ-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Braunschweig, Germany) a DSM ACC2542 letéti szám alatt. Az 1. ábrán bemutatjuk a GM–7 kötési kapacitását áramlási citometriával meghatározva monocitikus sejtekhez találmány szerinti in vitro módosítás után. Látható, hogy a mononukleáris sejtfrakcióból közvetlenül nyert CD14-pozitív monociták nem kötik a GM–7 ellenanyagot (a szürkén jelzett felhõ egybevág a nem jelzett ellenanyagkontrollal). Ezzel szemben az M¹CSF jelenlétében végzett tenyésztést és g¹IFN¹al történõ stimulálást követõen a monociták egy része olyan antigént expresszál, amelyet felismer a GM–7 monoklonális ellenanyag. A GM–7 monoklonális ellenanyagot K¹IgG2a izotípusúnak jellemeztük. A találmány szerinti eljárás ennek megfelelõen változáshoz vezet a módosított monociták sejtmembránján az antigénexpresszió fenotípusos mintázatában (1. ábra). A GM–7 monoklonális ellenanyag specifikusan köti azt a sejtpopulációt, amely – a találmány szerinti eljárással elõállított sejtek közül – a leghatékonyabb öntolerancia-indukáló sejteket indukálják (lásd az 5. ábrát). Tehát a találmány egy elõnyös megvalósítási módjának tárgya ilyen STIC, amely képes a GM–7 ellenanyaghoz való kötõdésre. Ezeket a sejtek a továbbiakban STICGM7-nek nevezzük. A GM–7 ellenanyag tehát a találmány szerint egy rendkívül hatékony és könnyen kezelhetõ ágenst képvisel öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) szelektálására és tisztítására. Az ellenanyag révén lehetséges a találmány szerint homogén és nagyon hatékony STICpopuláció létrehozása. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) lépésben kialakult öntoleranciát indukáló sejtek, amelyek a GM–7 ellenanyaghoz kötõdõ antigént expresszálnak, akár közvetlenül kiszelektálhatók a tenyésztõ tápközegbõl a c) lépés után, vagy azokat a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl a fenti találmány szerinti eljárás d) lépése szerinti elválasztása után nyert sejtpopulációból szelektálhatók ki, a DSM ACC2542 hibridóma sejtvonal által termelt GM–7 ellenanyaghoz való kötéssel. A találmány szerinti STIC¹ek kiszelektálásához az ellenanyagot érintkezésbe hozzuk a mintával olyan körülmények között, amely lehetõvé teszi az ellenanyag kötõdését a mintában jelen lévõ öntoleranciát indukáló sejtekhez. A kötési reakcióban keletkezõ reakciókomplexeket azt követõen elválasztjuk a mintától. Ebbõl a célból az ellenanyagot immobilizálhatjuk egy hordozóanyagra a mintával való érintkeztetés elõtt, például hozzáköthetjük kromatográfiás célra alkalmas mátrixhoz, vagy úgynevezett „mágneses gyöngyökhöz”. Ez az eljá-
1
HU 004 255 T2
rás lehetõvé teszi az öntoleranciát indukáló sejtek szelektálását és koncentrálását nagy térfogatú mintából. Az öntoleranciát indukáló sejtek kinyeréséhez az ellenanyag és az öntoleranciát indukáló sejtek közötti kötést megszüntetjük a reakciókomplexek mintából történõ izolálása után. Ezt a szakterületen ismert eljárásokkal hajthatjuk végre, mint például kompetitív leszorítással vagy sóoldatokkal végzett mosással. Megfelelõ eljárásokat ismertetnek például Utz U. és mtsai. [„Analysis of the T¹cell Receptor repertoire of human T¹cell leukémia virus type¹1 (HTLV–1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV–1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion”, J. of Virology Feb. 1996, 843–851. old.]. Ezenfelül a GM–7 monoklonális ellenanyag lehetõvé teszi a találmány szerinti monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek minõségi és mennyiségi meghatározását a páciens vérében és/vagy szöveti mintáiban in vitro. A reakciókomplexek kialakulását a mintában – amely az öntoleranciát indukáló sejtek jelenlétét és adott esetben mennyiségét jelzik – ismert eljárásokkal detektáljuk. A reakciókomplexek detektálásához ebben az esetben lehetséges a GM–7 ellenanyag kapcsolása („jelölés”) például közvetlenül detektálható molekulához, amely például kovalensen van kötve az ellenanyaghoz. Megfelelõ detektálható molekulákat nagyszámban leírtak a molekuláris diagnosztika területén, közéjük tartoznak többek között fluoreszcens festékek, mint például fluoreszcein-izotiocianát vagy tetrametil-rodamin-5izotiocianát, lumineszcens festékek, radioaktívan jelzett molekulák és enzimek, mint például peroxidázok (vö.: Lottspeich, F., Zorbas, H., „Bioanalytik”, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin, 1998). Az ellenanyag detektálása függ a jelölésre választott molekulától. A találmány szerint a GM–7 ellenanyagot a fluoreszcein-izotiocianát (FITC) fluoreszcens molekulához kapcsoltuk oly módon, hogy az ellenanyag detektálását áramlási citometriával és/vagy fluoreszcens mikroszkópiával detektálhassuk. Ellenanyagok FITC¹el történõ jelölésére szolgáló eljárások ismertek a szakterületen dolgozó szakember számára. Más megoldásképpen a reakciókomplexet detektálhatjuk kétlépéses eljárásban is másodlagos ellenanyagok alkalmazásával. Ebben a vonatkozásban a GM–7 ellenanyagot egy további jelzett ellenanyaggal való reakcióval detektálhatjuk (vesd össze: Lottspeich, F., Zorbas, H., „Bioanalytik”, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). Ez a kétlépéses detektálási eljárás számottevõen érzékenyebb, mint a találmány szerinti ellenanyag kötésének közvetlen jelölése, mivel számos jelzett másodlagos ellenanyag kötõdhet a GM–7 ellenanyaghoz (szignál-amplifikáció). A GM–7 ellenanyag ennek megfelelõen lehetõvé teszi a STIC detektálását a STIC¹el kezelt páciens perifériás vérében, például „monitorozás” formájában, ami alatt a perifériás vérben található sejtek számát specifikus idõközönként meghatározzuk. A szakember számára nyilvánvaló, hogy elõ lehet állítani monocitákból származó STIC elleni monokloná-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
lis ellenanyagokat nem humán gerincesekbõl is, különösen fõemlõsök és sertések találmány szerint módosított monocitáiból származók ellen. Ebben a vonatkozásban a megfelelõ gazdaállatok immunizálását és a megfelelõ hibridóma sejtvonal létrehozását a fent a humán eredetû STIC esetében ismertetett módon hajtjuk végre. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjának tárgya a találmány szerinti STIC egy alpopulációja, amely együtt expresszálja a sejtfelszínén a CD3 és CD14 antigéneket. Ezeket a sejteket a továbbiakban STICCD3+/CD14+-nek nevezzük. Amint alább részletesebben ismertetjük, ezekrõl a sejtekrõl kimutattuk, hogy szabályozó T¹limfociták kialakulását indukálják. A CD3 és CD 14 felszíni antigéneket együtt expresszáló STIC-eket közvetlenül kiszelektálhatjuk a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) lépésében kialakult sejtek közül, vagy azokat a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl a fent említett találmány szerinti eljárás d) lépése szerinti elválasztása után szelektálhatjuk ki, vagy más megoldásképpen az STICGM7 populációból szelektálhatjuk ki azokat. Ezenfelül a PCT/EP03/07551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésbeli TAIC¹ra hivatkozva kimutattuk, hogy a leírásban fent ismertetett eljárással elõállított sejtek erõsen expresszálják a Foxp3, CTLA4 és Integrin aEb7 géneket (lásd például 6. példát, amely a PCT/EP03/07551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés 12. példájának felel meg). Ezzel szemben ezek a gének nem vagy csak kismértékben expresszálódnak az eredeti monocitákban. A Foxp3, CTLA4 és Integrin a E b 7 gének felülszabályozása tehát a STICCD3+/CD14+ sejtek jellemzõje. Amint a 6. példában tárgyaljuk, a FoxP3, CTLA4 és Integrin aEb7 markerek expresszióját korábban csak szabályozó T¹limfocitákon írták le. A felszínükön a CD4 és CD25 antigéneket expresszáló T¹limfociták szabályozó T¹limfociták egy alpopulációja, amelyek „szuppresszor sejteknek” is neveznek. A funkciójuk a szervezet immunválaszának a szuppresszálása. Közelebbrõl, a Foxp3¹at specifikus transzkripciós faktornak találták, amely a szabályozó T¹sejtek kialakulásának génszabályozásra szolgál, és amely specifikusan expresszálódik ezeken a sejtekben. A találmány szerint elõnyös, hogy a STIC CD3+/CD14+ -sejtek legalább 1×10–9, elõnyösebben legalább 5×10–9, és különösen elõnyös módon legalább 1×10–8 mg Foxp3-RNS¹t expresszálnak per mg totál-RNS. A CTLA4¹t hasonlóképpen a szabályozó T¹limfociták, különösen CD4/CD25-pozitív T¹limfociták szabályozó funkciója detektálásának markerének tekintik (lásd a 6. példában idézett szakirodalmat). A találmány szerint a STICCD3+/CD14+-sejteket elõnyösen legalább 5×10–7, elõnyösebben legalább 3×10–6 és különösen elõnyös módon legalább 5×10–6 mg CTLA4-RNS¹t expresszálnak per mg totál-RNS. Az integrin aEb7¹t – amely az epitéliális kadherint ismeri fel – nemrégiben Lehmann és mtsai. [PNAS 99, 13 031–13 036. old. (2002)] nagyon hatékony szabályozó T¹limfociták új markereként írták le, amely kölcsönhatásba lép az epitéliális környezettel. Az integrin
1
HU 004 255 T2
aEb7 RNS expressziójának a STICCD3+/CD14+-sejtekben a találmány szerint elõnyösen legalább 1×10–12, elõnyösebben legalább 1×10–11, és különösen elõnyös módon legalább 1×10–10, és legelõnyösebben legalább 1×10–9 mg mennyiségûnek kell lennie per 1 mg totálRNS. Amint a 6. példa táblázatában bemutatjuk, a találmány szerinti sejtek közvetlen együtt-tenyésztése limfocitákkal a szabályozó T¹limfociták, különösen a limfocita-populáció CD4+/CD25+ sejtjei számának szignifikáns növekedéséhez vezet, a Foxp3, CTLA4 és Integrin aEb7 gének erõs felülszabályozásával. A példa továbbá demonstrálja, hogy ez a hatás nem figyelhetõ meg, ha a találmány szerinti sejtek közvetetten vannak együtt tenyésztve limfocitákkal. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szabályozó T¹limfociták kialakulásának és/vagy szaporításnak találmány szerinti sejtekkel való stimulálása részt vesz az öntolerancia ezen sejtek általi indukálásában. A 7. példa (amely a PCT/EP03/B7551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés 13. példájának felel meg) igazolja a találmány szerinti sejtek részvételének hipotézisét immunválasz szuppressziójának indukálásában, hivatkozva a PCT/EP03/07551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés TAIC-jára (lásd fent). Ebben a példában a recipiens állatokból származó limfocitákat inkubáltunk a megfelelõ donor állatból származó immunszuppresszív sejtekkel in vitro, A tolerancia indukálásához a donoreredetû TAIC¹al elõinkubált recipiensbõl származó limfocitákat injektáltunk az állatokba TAIC helyett. A donorspecifikus toleranciát növelni tudtuk ezen a módon, míg azokban az állatok, amelyeknek donoreredetû TAIC¹al nem elõinkubált recipiens limfocitákat adtunk be, nem alakult ki tolerancia. A találmány szerinti STIC¹et alkalmazhatjuk gyógyászati készítményként. A fent ismertetett találmány szerinti eljárás d) lépésében nyert sejteket közvetlenül alkalmazhatjuk. Az így kapott populációk teljes sejtszámának körülbelül 10–50%¹át limfociták és granulociták alkotják, amelyek az eredeti monocitaizolátumból erednek (mononukleáris sejtfrakció). Ezek a sejtek támogatják a találmány szerinti monocitaeredetû STIC kialakulását a tenyésztési lépésben (lásd a 4. példát); és nem zavarják az öntolerancia indukálását, ha a találmány szerinti STIC¹et gyógyászati készítményként alkalmazzuk. Azonban a találmány egy tovább elõnyös megvalósítási módja szerint a STICGM7 és/vagy STICCD3+/CD14+ szubpopulációkat izolálhatjuk a találmány szerinti eljárással (lásd fent) kapott STIC populáció összességébõl, és alkalmazhatjuk öntolerancia indukálásra. Tenyésztõ tápközegben (lásd a 2. példát), a STIC és/vagy a STICGM7 és/vagy a STICCD3+/CD14+ legalább 48 órán keresztül eltarthatók anélkül, hogy az öntoleranciát indukáló hatásukat elvesztenék. A gyógyászati készítményben való alkalmazásra a például humán AB0-kompatibilis szérumban (univerzálisan alkalmazható) felszuszpendált STIC és/vagy a STICGM7 és/vagy STICCD3+/CD14+ szubpopulációkat intravénásan vagy rövid transzfúzióval adhatjuk be.
2
Ebben a vonatkozásban gyógyászati készítmények tartalmazhatnak találmány szerinti STIC¹et kombinálva hagyományos gyulladásellenes ágensekkel és/vagy hagyományos immunszuppreszánsokkal, mint például 5 szteroidok, elõnyösen kortizon, metotrexát, ciklofoszfamid, azatioprin, 5¹amino-szalicilsav (5¹ASA), TNF¹a ellenanyagok, a¹interferon és B¹sejt ellenanyagok, mint például Rituximab, szervspecifikus vagy szisztémás autoimmun betegségek kezelésére. Ezenfelül a találmány szerinti STIC¹et alkalmazhat10 juk allergiák kezelésére kombinálva antihisztaminokkal, teofilinkészítményekkel, b¹mimetikumokkal, szteroidokkal, elõnyösen kortizonnal, és kromoglicinsavval. 15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
A találmány részletes leírása A találmány szerinti eljárás kiindulási sejtjei autológ vérmonociták, azaz azon páciens vérébõl származó monociták, akinek a találmány szerinti sejteket be kell adni. Elõnyösen az autológ monociták humán vérbõl származnak. A monocitákat bármilyen izolálási eljárással nyerhetjük, különösen leukaforézissel, vagy a teljes vér mononukleáris frakciójából („buffy coat”). A leukaforézis különösen elõnyös. A leukaforézis általános kifejezés egy többlépéses eljárásra, kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ aferézis készülék alkalmazásával, ahol humán pácienstõl teljes vért vesznek le, frakciókká választanak el, és a frakciókat, kivéve a mononukleáris sejtes frakciót, visszaadják a humán páciensnek. Ezt az eljárást például az EP 0 591 194 B1 számú európai szabadalmi iratban tovább részletezett módon hajthatjuk végre. Más megoldásképpen a vért elõször elválaszthatjuk – antikoagulánssal végzett szokásos kezelés után – plazmára és fehér- és vörösvérsejtekre, a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, elõnyösen centrifugálással. A centrifugálás után a plazma a felülúszóban lesz jelen, és alatta van egy réteg, amely az összes fehérvérsejtet tartalmazza. Ezt réteget „buffycoat”-nak is nevezzük. Ez alatt van a vörösvérsejteket tartalmazó fázis (hematocrit). A találmány szerinti eljárás vonatkozásában a mononukleáris sejtfrakciót elõször izoláljuk, és elválasztjuk a monociták kinyeréséhez, például ismert eljárásokkal végzett centrifugálással. Egy elõnyös eljárási megvalósítási mód szerint a mononukleáris sejtfrakciót limfocita-elválasztási közegre (Ficoll–Hypaque) visszük fel, és lecentrifugáljuk (lásd az 1. példát). Az 1. példa ismerteti a találmány egy elõnyös megvalósítási módját, ahol az eritrocitákat és elpusztult sejteket, amelyek esetleg még mindig a mononukleáris sejtfrakcióban találhatók, elválasztjuk centrifugálással, és a fehérvérsejtek, köztük a monociták izolátumként vannak jelen az elválasztási közegen. Azután a fehér fázist óvatosan lepipettázhatjuk, és a monociták izolátumban való dúsítására ismételten lecentrifugáljuk és megmossuk. Az eljárás folyamán a monociták a centrifugacsõ alján gyûlnek össze a limfociták egy részével. A találmány szerinti eljárás egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a monocitákat tartalmazó izolátum elõállítására való körülményeket úgy szabályoz-
1
HU 004 255 T2
zuk, hogy az izolátum körülbelül 10–50% limfocitát tartalmazzon a monociták mellett, a teljes sejtszámra vonatkoztatva. Elõnyösen az izolátum körülbelül 50–90%, különösen elõnyös módon körülbelül 60–70% monocitát és körülbelül 10–50%, különösen elõnyös módon 20–50% limfocitát tartalmaz, mindegyiket a teljes sejtszámra vonatkoztatva, ahol a különbséget opcionálisan granulociták adják. Amint a 4. ábrán bemutatjuk, a nagyságrendileg 20–30%-ban – a teljes sejtszámra vonatkoztatva – jelen lévõ limfociták az eredeti monociták M¹CSF-sel és g¹interferonnal történõ tenyésztése folyamán szignifikánsan nagyobb mennyiségû CD3/CD14 duplán pozitív STIC kialakulásához vezet, mint amikor csak néhány limfocita (körülbelül 5%) van jelen (lásd a 3. ábrát). Megfelelõ mennyiségû STIC elõállításához elõször a monociták szaporításának lehetõvé tételére van szükség. Ebbõl a célból a monociták esetében alkalmas ismert tenyésztõ tápközeget alkalmazhatunk; azonban a tápközegnek tartalmaznia kell az M¹CSF növekedési faktort (makrofágkolónia-stimuláló faktor). Az M¹CSF¹et (más néven CSF¹1) monociták, fibroblasztok, limfociták és endotéliális sejtek termelik. Az M¹CSF koncentrációja tápközegben elõnyösen 2–20 mg/l tápközeg, elõnyösebben 4–6 mg/l és különösen elõnyös módon 5 mg/l. Elõnyösen a tenyésztõ tápközeg nem tartalmazza a granulocita-makrofág kolonia-stimuláló faktort (GMCSF), mert a STIC hozama csökkentett ezen faktor jelenlétében. Ezt követõen vagy egyidejûleg a sejteket g¹IFN¹el kell stimulálni, azaz azokat g¹IFN jelenlétében kell tenyészteni. A monociták g¹IFN¹el történõ stimulálása egy kezdeti szaporítási fázis után történik, amely 3–6 napig tart a növekedési faktort tartalmazó tenyésztõ tápközegben. Elõnyösen az M¹CSF jelenlétében végzett tenyésztés kezdete utáni 4. napon megkezdjük a g¹IFN stimulációt, és ezt a stimulációt folytatjuk elõnyösen 24–72 órán keresztül, elõnyösebben 48 órán keresztül inkubálási körülmények között, azaz 37 °C¹on és 5% CO2 atmoszférában. A g¹IFN koncentrációja a tápközegben 0,1–20 ng/ml, elõnyösen 1–10 ng/ml és különösen elõnyösen 5 ng/ml lehet. A g¹IFN stimulációt egyidejûleg kezdhetjük a monociták szaporításával a növekedési faktort tartalmazó tenyésztõ tápközegben. Azonban 3–6 napon keresztül tartó kezdeti szaporítási fázis utáni stimuláció elõnyös, amint fent jeleztük. A sejtek szaporítása és g¹IFN¹el történõ stimulációja összességében elõnyösen nem tart tovább, mint 8 nap. Mindenestre a g¹IFN kezelést úgy hajtjuk végre, hogy a szaporítási fázis után legalább 24 órán keresztül tartson, maximum 72 órán keresztül, elõnyösen 48 órán keresztül. A sejtek szaporítási és stimulációs periódusa következésképpen összesen elõnyösen 4–8 napig tart. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a szaporítást és g¹interferon stimulációt a 2. példában ismertetett módon hajtjuk végre oly módon, hogy a monocitákat elõször a növekedési faktort tartalmazó
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
tenyésztõ tápközegben szaporítjuk, és a g¹IFN¹t hozzáadjuk a tenyésztõ tápközeghez 3–6 nappal késõbb, olyan mennyiségben, hogy a tápközeg 0,1–20 ng/ml, elõnyösen 1–10 ng/ml és különösen elõnyösen 5 ng/ml koncentráció alakuljon ki. Elõnyösen a találmány szerinti eljárást olyan tenyésztõedényekben hajtjuk végre, amelyek felszínét elõzõleg magzati borjúszérummal (FCS) vagy elõnyösen humán AB0-kompatibilis szérummal vontuk be (lásd a 2. példát). Az FCS-sel történõ bevonás a tenyésztõedény felszínének FCS-sel való bevonásával történik az alkalmazást megelõzõen, amit egy néhány órás kölcsönhatási periódus követ, például 4–72 órán keresztül, elõnyösen 1248 órán keresztül és különösen 24 órán keresztül, és a felszínhez hozzá nem tapadt FCS megfelelõ módon történõ eltávolítása. A humán AB0-kompatibilis szérummal történõ bevonást ugyanilyen módon hajtjuk végre. A tenyésztési lépés alatt a sejtek leülepszenek a tenyésztõedény aljára körülbelül 24 óra elteltével. Az adhezív tulajdonságaik miatt a monociták és az eljárás alatt a monocitákból keletkezõ STIC¹ek hozzátapadnak a tenyésztõedény aljához. Ha, amint a 2. példában ismertetjük, a tenyésztõt tápközeget lecseréljük a tenyésztés folyamán, a felülúszót elõször óvatosan távolítjuk el, például pipettázással vagy dekantálással, és azt követõen friss tenyésztõ tápközeggel töltünk be. Elõnyösen azonban a fenékhez tapadt sejteket nem vagy csak óvatosan mossuk, oly módon, hogy a jelen lévõ limfocitákat ne távolítsuk el. A letapadt sejtek eltávolítását mechanikai úton végezhetjük, például éles sejtkaparóval vagy spatulával. A találmány szerinti eljárás egy elõnyös megvalósítási módja szerint azonban a sejtek teljes eltávolítását megfelelõ enzimmel, mint például tripszinnel történõ kezeléssel végezzük (lásd a 2. példát). A tripszin oldatot (0,1–0,025 g/l, elõnyösen 0,05 g/l) hagyjuk hatni a sejteken 2–10 percig 35–39 °C¹on, elõnyösen 37 °C¹on, 5% CO2 jelenlétében. Az enzimaktivitást azután szokásos módon blokkoljuk, és a szabadon lebegõ STIC-eket szokásos módon centrifugálással kinyerjük. Azután azok alkalmasak azonnali alkalmazásra, opcionálisan felszuszpendálva megfelelõ közegben, például PBS-ben. Azonban azokat több napig is eltarthatjuk, különösen megközelítõleg 2¹3 napig, tápláló tápközegben (lásd a 23. példát), ahol ez a tároló tápközeg nem tartalmazza a növekedési faktort és a g¹interferont sem. A sejteket STIC-ként tárolhatjuk ilyen tápláló tápközegben legalább 48 órán keresztül. Hosszabb idõszakon keresztül történõ tároláshoz a sejteket mélyfagyaszthatjuk. Élõ sejtek mélyfagyasztására szolgáló protokollok ismertek a szakterületen, vö. Griffith M. és mtsai., („Epithelial Cell Culture, Cornea”, „Methods of tissue engineering”, szerk.: Atala A. és Lanza R. P., kiad.: Academic Press 2002, 4. fejezet, 131140. old.). Egy elõnyös szuszpenziós közeg a találmány szerinti sejtek mélyfagyasztására AB0-kompatibilis szérum vagy FCS, mindkettõ kiegészítve DMSO-val. A találmány egy megvalósítási módja szerint a c) vagy d) lépésekben kinyert öntolerancia-indukáló sejte-
1
HU 004 255 T2
ket tovább tisztíthatjuk azokra a sejtekre, amelyek kötõdnek a GM–7 ellenanyaghoz, hogy STICGM7 szubpopulációt nyerjünk. Az ilyen tisztításra szolgáló eljárásokat részletesen ismertetünk fentebb. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint olyan sejteket szelektálunk ki a STIC-populációból, amelyek együtt expresszálják a sejtfelszínükön a CD3 és CD 14 antigéneket. Ilyen sejtek kiszelektálására alkalmas eljárások ismertek a szakterületen. Ilyen eljárások példái a „Fluorescent-Activating Cell Sorting” (FACS), az „Immuno Magnetic Bead Sorting” és a „Magnetic Activated Cell Sorting” (MACS), vagy az úgynevezett „Rosetting Method” [lásd GmeligMeyling F. és mtsai., „Simplified procedure for the separation of human T¹ and non-T-cells”, Vox Sang. 33, 5–8. old. (1977)]. A STICCD3+/CD14+ STIC-szubpopuláció kiszelektálása közvetlenül a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) vagy d) lépése után történhet, vagy a STICGM7szubpopulációból. Az utóbbi végrehajtási út azt jelenti, hogy a STICCD3+/CD14+ sejtek lépésenkénti dúsítása történik. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint magukat a találmány szerinti STICCD3+/CD14+ szubpopuláció sejtjeit alkalmazzuk autoimmun betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására. Ilyen autoimmun betegségek példái: – Reumatikus betegségek autoimmun jellemzõkkel, különösen reumatoid artritisz, SLE, Sjogrenbetegség, szkleroderma, dermatomiozitisz, polimiozitisz, Reiter-szindróma; – cukorbetegség; – a vér és véredények autoimmun betegségei, különösen autoimmun hemolitikus anémia (AIHA), autoimmun thrombocytopenic purpura (ITP), antifoszfolipíd ellenanyag szindróma, vaszkulitisz (polyarteritis nodosa csoport, Wegener-féle granulomatózis, hiperszenzitivitásos vaszkulitisz, óriássejtes arteritisz) szisztémás lupus erythematosus, kevert esszenciális cyroglobulinémia; – a máj autoimmun betegségei, különösen autoimmun hepatititsz, elsõdleges biliáris cirrózis és elsõdleges szklerózisos kolangitisz; – a pajzsmirigy autoimmun betegségei, különösen a Hashimoto-betegség, Graves-betegség; – a központi idegrendszer autoimmun betegségei, különösen sclerosis multiplex, miaszténia grávisz; és – bullózus bõrbetegségek, különösen pemphigus vulgaris, pemphigus vegetans, pemphigus foliaceus, Senear-Usher szindróma és Brazilian pemphigus. A STIC hasznosságát öntolerancia indukálására egerekben mutatjuk meg autoimmun betegségre hasonlító mesterségesen indukált kolitisz két modelljében (lásd a 8. és a 9. példát). Ezek a modellek a nátrium-dextrán-szulfát (DSS)indukált krónikus kolitisz (8. példa) és a krónikus kolitisz CD62L+/CD4+ SCID transzfer modellje egerekben
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
(9. példa). Az egerekben mindkét modellben krónikus kolitisz alakul ki, olyan tünetekkel, amelyek hasonlítanak a humán colitis ulcerosára. Mindkét modellrendszerben a STIC¹ek beadása röviddel a betegség megjelenése után a kolitisz tipikus tüneteinek a szuppresszálásához vezet, összehasonlítva a kezeletlen állatokkal vagy olyan állatokkal, amelyeket STIC¹et nem tartalmazó „kontroll sejtekkel” kezeltünk (lásd a 8. és a 9. példát). Amint fent tárgyaltuk, a túlzott immunreakciók szerepet játszanak az allergiák kialakulásában is. Bach és mtsai. (mint fent) kimutatták, hogy CD4+ sejtek, amelyek CD4+/CD25+ sejtek szubpopulációját tartalmazzák, enyhíthetik a kísérletes allergiás enkefalomielitisz (EAE) elõrehaladását. Mivel, amint a leírásban bemutatjuk, a STIC¹ek beadása a CD4+/CD25+ T¹sejt-populáció növekedésének indukálását eredményezi, a sejtek hasznosak allergiák kezelésére is. Ily módon a találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazunk allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. Gyógyászati készítmények találmány szerinti élõ STIC-eket tartalmazhatnak, amelyeket a találmány szerinti eljárás d) lépésében nyerhetünk, felszuszpendálva gyógyászatilag elfogadható hordozóban, elõnyösen körülbelül 1×105–1×107 sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 1×106 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint magukat a találmány szerinti STICGM7 szubpopuláció sejtjeit alkalmazzuk megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására. A találmány egy megvalósítási módja szerint ilyen gyógyászati készítmény találmány szerinti élõ STICGM7 sejteket tartalmazhat, amelyek kötõdnek a GM–7 ellenanyaghoz, felszuszpendálva gyógyászati hordozóban, elõnyösen körülbelül 1×106–1×108 sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 1×106 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A találmány legelõnyösebben megvalósítási módja szerint az ilyen gyógyászati készítmény találmány szerinti élõ STICCD3+/CD14+ sejteket tartalmazhat, amelyek együtt expresszálják a CD3 és CD14 antigéneket, elõnyösen körülbelül 5×105–5×107 sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 5×106 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A fent ismertetett gyógyászati készítmények a találmány szerinti sejteket fiziológiásan jól tolerált közegben felszuszpendálva tartalmazhatják. Megfelelõ közeg például a Ringer-oldat, fiziológiás sóoldat vagy 5–20% humán albuminoldat vagy hasonlók. A találmány szerinti STIC-eket tartalmazó gyógyászati készítményeket különbözõ utakon keresztül adhatjuk be a betegség által érintett testtájék(ok) függvényében. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban a gyógyászati készítményeket intravénásan, intraportálisan, szubkután, intradermálisan, intraperitoneálisan vagy intratekálisan adhatjuk be. A gyógyászati készít-
1
HU 004 255 T2
ményeket továbbá közvetlenül a specifikus szervbe, mint például a májba vagy izomba adhatjuk be, inhalálással vagy a testüregekbe. A hatóanyagként STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazhatjuk autoimmun betegségek megelõzésére is, olyan esetekben, amikor ismert a betegség kialakulásáért felelõs gén. Ha egy személyt egy vagy több autoimmun betegséggel kapcsolatos gént hordozónak diagnosztizálunk, a betegség kialakulását megakadályozhatjuk monocitákból származó STIC beadásával az élet korai stádiumában. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint autológ STIC¹et tenyésztünk együtt autológ limfocitákkal és a gén által expresszált peptiddel. Ez a megfelelõ géntermékre specifikus autológ szabályozó T¹limfociták kialakulásához vezet. Ezeket a szabályozó T¹limfocitákat újra beadhatjuk a személynek, amint a 7. példában ismertetjük (amely megfelel a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi irat 13. példájának). A találmány egy további megvalósítási módja szerint a STIC¹et alkalmazhatjuk olyan esetek megelõzésre is, ahol az autoimmun betegség szakaszosan fordul elõ, mint például reumatoid artritisz esetében. Ha a STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményt a betegség elsõ vagy egy következõ megjelenése után adjuk be, a további megjelenéseket megakadályozhatjuk. A találmány szerinti sejtkészítmények élõ STIC¹et tartalmazhatnak, amelyeket a találmány szerinti eljárás d) lépésében nyerünk. Más megoldásképpen a készítmények a STICGM7 sejtek szubpopulációjába tartozó sejteket tartalmazhatnak, amelyek kötõdnek a GM–7 ellenanyaghoz, vagy STICCD3+/CD14+ sejteket, amelyek együtt expresszálják a CD3 és CD14 antigéneket a sejtfelszínükön. A készítmények a sejteket elõnyösen körülbelül legalább 1×105, elõnyösebben legalább 5×10 5 és legelõnyösebben legalább 1×10 6 sejt/ml mennyiségben tartalmazhatják, folyékony hordozóközegben felszuszpendálva. A közeg lehet sejttenyésztõ tápközeg vagy a sejtek által jól tolerált transzport közeg, mint például 5–20% humán albumin oldat. Más megoldásképpen a készítményben található sejtek mélyfagyasztva lehetnek megfelelõ tárolóközegben, mint például RPMI 50% humán albumin oldattal és 10% DMSO-val. Végezetül a találmány tárgyát képezi olyan eljárás, ahol a találmány szerinti öntoleranciát indukáló sejteket (STIC, STICGM7 vagy STICCD3+/CD14+) autológ szabályozó T¹limfociták in vitro létrehozására vagy szaporítására alkalmazunk. Amint a 6. példában (amely a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi irat 12. példájának felel meg) bemutatjuk, a STIC-nek megfelelõ TAIC közvetlen in vitro együtt-tenyésztése limfocitákkal szabályozó T¹limfociták, különösen CD4+/CD25+ limfociták szignifikáns proliferációjához vezet. Tehát lehetséges szabályozó T¹limfociták, különösen CD4+/CD25+ limfociták létrehozása és/vagy szaporítása egy személy monocitáiból származó STIC¹ek és autológ limfociták közvetlen együtt tenyésztésével. A találmány szerinti értelemben a közvetlen együtt tenyésztés azt jelenti, hogy a STIC-eket és limfocitákat
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
közvetlen fizikai kontaktusban tenyésztjük együtt ugyanabban a tápközegben, mint ahogyan az idézett 6. példában bemutatjuk. Ebben az eljárásban a tápközeg elõnyösen a megfelelõ sejteket, azaz STIC¹et és limfocitákat körülbelül azonos sejtszámmal tartalmazza, és mindegyik mennyisége elõnyösen legalább 1×105, elõnyösebben legalább 5×105 legelõnyösebben legalább 1×106 sejt/ml folyékony hordozóközegben felszuszpendálva; a közeg sejttenyésztõ tápközeg vagy a sejtek által jól tolerált transzport közeg, mint például 5–20% humán albumin oldat lehet. Az együtt tenyésztést elõnyösen fiziológiás körülmények között végezzük, körülbelül 37 °C¹on, például inkubátorban, elõnyösen körülbelül 3–5 napon keresztül, elõnyösebben 4 napon keresztül. A 7. példában (amely a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi irat 13. példájának felel meg) kimutattuk, hogy a transzplantátum elfogadását nemcsak a donor monocitáiból létrehozott TAIC recipiensnek történõ beadásával indukálhatjuk, hanem recipiens limfocitáknak a recipiensnek történõ újrabeadásával is, amelyeket elõzõleg közvetlenül együtt tenyésztettünk in vitro donor monocitákból fent ismertetett módon elõállított TAIC¹al. Hasonlóképpen öntoleranciát indukálhatunk olyan autológ limfociták páciensnek történõ beadásával, amelyeket korábban közvetlenül együtt tenyésztettünk a páciens saját monocitáiból elõállított STIC¹el. A találmány egy további megvalósítási módja szerint tehát szabályozó T¹limfociták állíthatunk elõ in vitro a kezelendõ személybõl származó limfocitákból, a személy limfociátinak közvetlen együtt tenyésztésével a személy monocitából származó STIC-ekkel. Az együtt tenyésztett limfociták visszaadása a recipiensnek öntolerancia indukáláshoz vezet, amint a 7. példában bemutatjuk. Az így elõállított szabályozó T¹limfocitákat FACS¹al izolálhatjuk, amint a leírásban ismertetjük (lásd fent), és gyógyászati készítményben alkalmazhatjuk megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, ahol a sejtek gyógyászatilag elfogadható hordozóban vannak felszuszpendálva, amint fent ismertettük. A találmányt a továbbiakban részletesebben ismertetjük példákon keresztül. Ha nem definiáljuk a példákban, az alábbi összetételû tápközegeket és anyagokat alkalmazzuk:
1. Penicillin/sztreptomicin oldat: 10 000 egység penicillin G nátriumsójaként és 1000 pg sztreptomicin sztreptomicin-szulfát per ml fi50 ziológiás nátrium-klorid-oldat (NaCl 0,85%) (Gibco katalógus szám: 15140122). 2. Tripszin-EDTA 0,5 g tripszin és 0,2 g EDTA (4 Na)/l 55 3. RPMI 1640 [1×, folyékony (11875)] L¹Glutamint tartalmaz Az RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640¹es közegek dúsított kiszerelések, amelyeket széles kör60 ben alkalmazhatunk emlõssejtek esetében. 10
HU 004 255 T2
Komponens
Molekulatömeg
Konc. (mg/l)
Molaritás (nM)
Szervetlen sók Kalcium-nitrát (Ca(NO3)2 4H2O) Kálium-klorid (KCl) Magnézium-szulfát (MgSO4)
236
100,00
0,424
75
400,00
5,30
120
48,84
Nátrium-klorid (NaCl)
58
6000,00
Nátrium-bikarbonát (NaHCO3)
84
2000,00
23,800
142
800,00
5,63
Glukóz
180
2000,00
11,10
Glutation, redukált
307
1,50
0,0032
Fenolvörös
398
5,00
0,0125
174
200,00
Nátrium-foszfát (Na2HPO4)
0,407 103,44
További komponensek
Aminosavak L-Arginin
1,10
L-Aszparagin
132
50,00
0,379
L-Aszparaginsav
133
20,00
0,150
L-Cisztein-dihidroklorid
313
65,00
0,206
L-Glutaminsav
147
20,00
0,136
L-Glutamin
146
300,00
2,05
75
10,00
0,133
L-Hisztidin
155
15,00
0,0967
L-Hidroxi-prolin
131
20,00
0,153
L-Izoleucin
131
50,00
0,382
L-Leucin
131
50,00
0,382
L-Lizin-hidroklorid
146
40,00
0,219
L-Metionin
149
15,00
0,101
L-Fenil-alanin
165
15,00
0,0909
L-Prolin
115
20,00
0,174
L-Szerin
105
30,00
0,286
L-Treonin
119
20,00
0,168
L-Triptofán
204
5,00
0,0245
Glicin
L-Tirozin-dinátrium, ¹dihidrát
261
29,00
0,110
L-Valin
117
20,00
0,171
244
0,20
0,008
Vitaminok Biotin D-kalcium-pantotenát
477
0,25
0,0005
Kolin-klorid
140
3,00
0,0214
Fólsav
441
1,00
0,0022
i-Inozitol
180
35,00
0,194
Niacinamid
122
1,00
0,0081
p-amino-benzesav (PABA)
137
1,00
0,0072
Piridoxin HCl
206
1,00
0,0048
Riboflavin
376
0,20
0,0005
Tiamin HCl
337
1,00
0,0029
B12-vitamin
1355
0,005
0,00000369
Referencia: Moore G. E., és mtsai., J. A. M. A. 199, 519. old. (1967)
11
1
HU 004 255 T2
4. PBS (Dulbecco-féle foszfát-pufferelt sóoldat) vö. J. Exp. Med. 98, 167. old. (1954): Komponens
g/l
5 KCl
0,2
KH2PO4
0,2
NaCl
8,00
Na2PHO4
1,15
5. Ficoll–Hypaque: Limfocitaelválasztási közeg (szacharóz/epiklórohidrin-kopolimer Mg 400 000; sûrûség 1,077, nátrium-diatrizoáttal beállítva).
10
15
6. L¹Glutamin Folyadék: 29,2 mg/ml 7. Makrofág-kolóniastimuláló faktor (M¹CSF) Rekombináns humán M¹CSF E. coli-ból; monomer (18,5 kDa) 135 aminosav-oldallánc, beleértve az N¹terminális metionint; 37 kDa molekulatömegû homodimerként van jelen; (SIGMA katalógusszám: M 6518) 8. g¹Interferon (g-IFN) Rekombináns humán g¹IFN E. coli-ból; 16. 7 kDa fehérje, amely 143 aminosav-oldalláncot tartalmaz (CHEMICON katalógusszám: IF002)
20
25
Mindkét eljárással a frissen kinyert 50 ml mennyiségû sejtfrakciót azután két 25 ml¹es részre osztottuk, és 25 ml Ficoll–Hypaque elválasztóközegre rétegeztük, amelyet elõzõleg két 50 ml¹es Falcon-csõbe tettünk. Ezt a készítményt 30 percen keresztül centrifugáltuk 2500 rpm¹en fékezés nélkül. Azután a mononukleáris sejtfrakcióban még mindig jelen lévõ eritrociták és elpusztult sejtek a Ficool-fázis alatt voltak, míg a fehérvérsejtek, beleértve a monocitákat, el voltak szeparálódva a Ficoll¹on fehér középsõ fázisként. Ezt követõen a fehér középsõ fázist, beleértve a monocitákat, óvatosan eltávolítottuk pipettázással, és összekevertük 10 ml foszfátpufferelt sóoldattal (PBS). Ezt azt azután háromszor lecentrifugáltuk 10 percen keresztül 1800 rpm¹en fékezéssel, a felülúszót pipettázással eltávolítottuk mindegyik centrifugálási eljárás után, és friss PBS¹t adtunk. A centrifugacsõ (Falcon-csõ) alján összegyûlt sejtcsapadék tartalmazta a mononukleáris sejtfrakciót, azaz a monocitákat. c) A 8. és 9. egérkísérletekhez (amelyeket genetikailag azonos egerekkel végeztünk) szükséges monocitákat szingenikus donor egerek lépébõl nyertük. A lépeket kispórusú szitán nyomtuk át kis nyomással, és az így elválasztott sejteket újra elszuszpendáltuk PBSben. A felszuszpendált lépsejteket rárétegeztük 25 ml Ficoll–Hypaque-elválasztási közegre, amelyet elõzõleg 50 ml¹es Falcon-csövekbe tettünk. Az eljárást azután a fent ismertetettel azonos módon folytattuk.
30 2. példa A monociták szaporítása és módosítása A monociták tenyésztését és szaporítását az alábbi összetételû tenyésztõ tápközegben hajtottuk végre:
9. Nátrium-dextrán-szulfát Sigma-Aldrich 31403, só, molekulatömeg: 40 kDa 1. példa Monociták elválasztása teljes vérbõl A teljes vért két különbözõ módszerrel vettük le humán páciensektõl: a) Leukaforézis: a leukaforézist COBE® Spectra aferézis rendszerrel (Gambro BCT, Lakewood, CO, USA) hajtottuk végre mononukleáris módban (MNZ) a gyártó utasításai szerint (COBE Spectra Version 4.7/5.1/6.0/7.0). b) vér komponensek hagyományos elválasztása: 450 ml teljes vért összekevertünk háromkamrás zacskóban 63 ml stabilizátor oldattal, amely minden liter vízben 3,27 g citromsavat, 26,3 trinátrium-citrátot, 25,5 g dextrózt és 22,22 nátrium-dihidroxi-foszfátot tartalmazott, hogy elkerüljük a vér koagulációját és tápláljuk a sejteket. Az oldat pH¹ja 5,6–5,8 volt. A vér komponenseinek elválasztásához „éles centrifugálást” hajtottunk végre a véren 4000 rpm¹el 7 percen keresztül 20 °C¹on. Ez a sejtes és nem sejtes komponensek három rétegbe való rétegzõdését eredményezte. A zacskónak az erre szolgáló összenyomó készülékben történõ alkalmazásával az eritrocitákat azután átnyomtuk az alsó zacskóba, a plazmát átnyomtuk a felsõ zacskóba, és az úgynevezett „buffy-coat” a középsõ zacskóban maradt és megközelítõleg 50 ml térfogatot tartalmazott.
2
35
RPMI 1640 tápközeg Magzati borjúszérum (FCS), vagy alternatív megoldásként AB0-kompatibilis szérum
40
Penicillin/Sztreptomicin oldat Teljes térfogat
45
50
55
60 12
440 ml 50 ml
5 ml 500 ml
A tenyésztõ tápközeg 2,5 pg/500 ml M¹CSF¹et tartalmazott. Az 1. példában izolált monocitákat felszuszpendáltuk 106 sejt mennyiséggel 10 ml tenyésztõ tápközegben, és átvittük Petri-csészére (100 mm átmérõ). A Petri-csészét elõzõleg feltöltöttük tiszta inaktivált FCS-sel, és az FCS¹t leöntöttük 24 órával késõbb, annak érdekében, hogy ily módon FCS-sel bevont csészét nyerjünk. A Petri-csészét megfelelõ fedõvel befedtük, és 3 napig inkubátorban tartottuk 37 °C¹on. A sejtek a Petri-csésze fenekére ülepedtek 24 óra elteltével. A második napon a felülúszót lepipettáztuk, és a Petri-csészét újra megtöltöttük 10 ml friss tenyésztõ tápközeggel. A 4. napon 50 ng g¹interferon adtunk hozzá 10 ml tenyésztõ tápközegben, és a csészét megint lefedtük és további 48 órán keresztül az inkubátorban tartottuk 37 °C¹on.
1
HU 004 255 T2
Azután PBS-sel 1:10 arányban meghígított 10 ml tripszinoldatot pipettáztunk a Petri-csészébe. A lefedett Petri-csészét 10 percen keresztül az inkubátorban tartottuk 37 °C¹on. Azután végrehajtottuk a Petri-csésze aljához tapadt sejtek elválasztását sejtkaparóval oly módon, hogy a sejtek nagyobb része (>90%) a felülúszóban lebegett. A teljes felülúszót (10 ml tripszinoldat +10 ml tápközeg) lepipettáztuk, beleöntöttük egy 50 ml¹es Falconcsõbe, és 10 percen keresztül centrifugáltuk 1800 rpm¹en. A felülúszót azután eldobtuk, és friss tenyésztõ tápközeget (mint fent) adtunk a csapadékhoz (a megmaradt sejtcsapadék), 1 ml tenyésztõ tápközeget adva 106 sejtenként. A sejtszám meghatározása a pontos dózis meghatározásához ismert eljárásokkal történt, vö. Hay R. J., „Cell Quantification and Characterisation”, „Methods of Tissue Engineering”, kiad.: Academic Press 2002, 4. fejezet, 55–84. old. Ezt a sejtszuszpenziót lecentrifugáltuk (1800 rpm, 10 perc, lásd fent), és a sejtcsapadékot vagy PBS-ben, vagy emberben történõ alkalmazásra NaCl-ban (fiziológiás) vettük fel. Ezt követõen az intravénás beadás közvetlenül vagy 48 órán belül történhet. Más megoldásképpen a centrifugálás és a tripszint tartalmazó felülúszó eldobása után FCS/DMSO¹t adtunk a sejtekhez fagyasztóközegként, és mélyfagyasztottuk 10 ml térfogatban. A fagyasztóközeg 95% FCS¹t és 5% DMSO¹t tartalmazott. Mindegyik esetben megközelítõleg 106 sejtet 1 ml közegben vettünk fel, és az alábbi lépésekben hûtöttünk le: 30 perc jégen; 2 óra –20 °C¹on elõhûtött Styropor dobozban; 24 óra –80 C Styropor-ban; A tárolás kis csövekben történt folyékony nitrogénben (N2) –180 °C¹on. Az 1. ábrán az eredeti monocitikus sejtek tenyésztése és g¹IFN stimulációja után nyert monociták antigénexpressziójának fenotípusos változásait mutatjuk be, áramlási citometriával meghatározva. Az eredeti monocitikus sejtek tenyésztése és g¹IFN stimulációja GM–7 szignifikánsan megnövekedett kötéséhez vezet a módosítás után (jobb oldali grafikon az 1. ábrán), összehasonlítva a módosítás elõtti sejtekkel (bal oldali grafikon az 1. ábrán). Az alábbi 3–7. példák a WO 2004/007701 számú nemzetközi közzétételi iratból vannak átvéve. Ezek az ott feltárt transzplantátumelfogadást indukáló sejteket (TAIC) jellemzik. A PCT/EP03/07551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerinti TAIC és a jelen találmány szerinti öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) hasonlósága miatt (lásd fent) az ezen példákban bemutatott eredmények vonatkoznak a STIC-ekre is. Pontosabban, az alábbi 3–7. példák eredményei azt mutatják, – hogy optimalizált szuppresszor-funkciójú sejtpopulációt izolálhatunk az eredeti monociták M¹CSF-sel való tenyésztésével és g¹IFN-stimulációjával nyert TAIC populációból a GM–7 monoklonális ellenanyag alkalmazása révén (3. példa);
5
10
2
– hogy a monocitafrakcióban található limfocitáknak nagy hatása van a TAIC-ként hatásos CD14+/CD3+-sejtek keletkezésére (4. példa); – hogy az 1¹metil-triptofán IDO-inhibitornak nincs hatása a TAIC szuppresszor-funkciójára (5. példa); – hogy az A¹donor TAIC-ának közvetlen in vitro együtt-tenyésztése a B¹donor limfocitáival indukálja a szabályozó T¹limfociták, azaz CD4+/CD25+limfociták kialakulását (6. példa); és – hogy a donor TAIC és a recipiens limfociták fizikai sejt-sejt kölcsönhatása in vivo indukálja olyan szabályozó T¹limfociták keletkezését, amelyek képesek a szerv-kilökõdés megakadályozására (7. példa).
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
3. példa A GM–7 ellenanyag kötõdése a TAIC-hoz A GM–7 monoklonális ellenanyagot egerek humán TAIC¹al történõ immunizálásával állították elõ, amelyet a PCT/EP03/07551 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett módon állítottak elõ. Az ellenanyagot termelõ hibridóma sejteket letétbe helyezték a „Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen” intézetnél a DSM ACC2542 hozzáférési szám alatt. Az alább ismertetett eredmények azt demonstrálják, hogy az ellenanyag specifikusan kötõdik egy olyan antigénhez, amely csak olyan CD14+ sejteken expresszálódik, amelyeket alávetettek 6 napos ex situ módosításnak M¹CSF-sel és 2 napos stimulálásnak g¹IFN¹el a találmány szerint. Az 1. ábrán bemutatjuk a GM–7 kötési kapacitását áramlási citometriával meghatározva monocitikus sejtekhez in vitro módosítás után, azaz TAIC¹cá történõ transzformálás után. Látható, hogy a „buffy-coat”-ból közvetlenül nyert CD14-pozitív monociták nem kötik a GM–7 ellenanyagot (bal oldali kép; a szürke felhõ felel meg az ellenanyag kontrollnak). Ezzel szemben a monociták egy része olyan antigént expresszál az M¹CSF¹el történõ tenyésztés és g¹IFN¹el történõ stimulálás után, amelyet a GM–7 monoklonális ellenanyag felismer. A 2. példában ismertetett tenyésztés után az átalakult monociták körülbelül 80%¹a képes kötni a GM–7 monoklonális ellenanyagot (jobb oldali kép). Egy további kísérletben a CD14+/GM–7+ sejtek szuppresszor aktivitását összehasonlítottuk CD14+/GM–7– sejtekével kevert limfocita tenyészetben (MLC). Az MLC¹t az alábbi irodalmi helyen leírt módon hajtottuk végre: Kurnick, J. T., „Cellular Assays”, „Diagnostic Immunopathology”, szerk.: Colvin R. B., Bhan A. K., McCluskey, R. U., kiad.: Raven Press, New York, 751–771. old. (1994). Ebben a példában a TAIC egy B személybõl származik. Amint a 2. ábrán bemutatjuk, szignifikáns különbség van a GM–7-pozitív és GM–7-negatív TAIC szuppresszor aktivitása között. Az M¹CSF¹el végzett 6 napos kezeléssel és a g¹IFN¹el végzett 2 napos stimulációval nyert TAIC populációnak csak a GM–7-pozitív frakciója mutat szignifikáns inhibíciós hatást az A személy válaszoló sejtjeinek T¹sejt proliferációs aktivitására a B személy sejtjeivel történõ stimuláció után.
1
HU 004 255 T2
4. példa Limfociták hatása CD3+/CD14+-sejtekre monocitatenyésztés folyamán A CD14+/CD3+-sejtek létrehozásakor a monocitafrakcióban jelen lévõ limfociták TAIC-ként való hatásosságát két különbözõ összeállítás összehasonlításával határoztuk meg. Az elsõ összeállításban (amelyet ezt követõen „Mo”-nak jelölünk) a monocita frakciót kezdetben az 1. példában ismertetett „buffy-coat” középsõ fázisából vettük. Amint a 2. példában ismertettük, a sejteket azután átvittük az M¹CSF¹el való tenyésztési lépésbe. A tenyésztés kezdetétõl számított egy órán belül a szövettenyésztõ flaska aljához tapadó monocitákat ötször megmostuk 10 ml PBS-sel, és tenyészetben jelen lévõ limfociták mennyisége ily módon <5%¹ra (4,8±2,4%) csökkent, míg az így kapott feldúsult monociták (CD14+) mennyisége 90% felett (92±5,6%) volt. Az összeállításban lévõ további sejtkomponensek B¹limfociták és granulociták voltak. A második összeállításban (amelyet ezt követõen „Mo+Ly”-nek jelölünk) lévõ sejteket szintén az 1. példában ismertetett „buffy-coat”-ból származó monocitafrakcióként vettük le. Azonban a „Mo” összeállítástól eltérõen a szövettenyésztõ flaska aljához tapadó sejteket csak egyszer mostuk meg a tenyésztési fázis kezdetétõl számított 24 óra elteltével, amint a 2. példában ismertettük. Ennek eredményeképpen olyan sejtpopulációt kaptunk, amely 45±5,3% CD14+-monocitából és 23,5±8,9% CD2+-limfocitából állt. Csakúgy mint a „Mo” összeállításban, limfociták és granulociták szintén voltak ebben az összeállításban is. A megfelelõ sejttípusok mennyiségének meghatározását a teljes sejtpopuláción belül áramlási citometriával hajtottuk végre egyenként három kísérletben (lásd a 3. ábrát). Az eredményeket átlagértékként adjuk meg standard deviációval. Nem lehet meghatározni CD14+/CD3+-sejteket sem a „Mo” összeállításban, sem a „Mo+Ly” összeállításban a tenyésztés kezdetekor (d 0=0. nap). Ötnapos tenyésztési periódus után a kísérletet leállítottuk, és a sejteket jellemeztük FACS-elemzéssel a sejteknek a szövettenyésztõ flaskák aljáról a 2. példában ismertetett módon történõ leválasztása után. Azt találtuk, hogy a CD14+-sejtek relatív mennyisége csökken ezekben az összeállításokban, 92%-ról 42%¹ra a „Mo” összeállításban, és 45%-ról 28%¹ra a „Mo+Ly” összeállításban. Látszólag a limfociták gyorsabban proliferálódnak, mint a monociták. A limfociták relatív mennyisége a megnövekedett 4,8%-ról 69,8%¹ra a „Mo” összeállításban és 23,5%-ról 50,6%¹ra a „Mo+Ly” összeállításban. A tenyésztés folyamán a TAIC-ként hatásos CD14+/CD3+sejtek keletkeznek mindkét tenyészetben. Ebben a vonatkozásban fontos, a CD14+/CD3+-sejtek szignifikánsan nagyobb növekedését figyeljük meg a „Mo+Ly” összeállításban 32,0±5,3% mennyiségben, ellentétben a „Mo” összeállítás csak 7,2±3,2% értékével. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a sejtek megtisztítása a monociták több mint 90% relatív mennyiségre történõ dúsításával a tenyésztés kezde-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
tekor negatív hatással van az immunszuppresszív CD14+/CD3+-sejtek keletkezésére a TAIC-populációban, míg a az 1. és 2. példában ismertetett eljárás a CD14+/CD3+-sejtek szignifikánsan magasabb hozamához vezet. 5. példa Az 1¹methyl-triptofán IDO-inhibitor hatásának meghatározása a TAIC immunszuppresszor aktivitására Annak tisztázása érdekében, hogy az indolamin2,3-dioxigenáz (IDO) 1¹metil-triptofán (1¹MT) inhibitora befolyásolja¹e a „Mo” és „Mo+Ly” összeállításokban (lásd a 4. példát) létrehozott TAIC szuppresszor funkcióját, különféle kevert limfocita-tenyészeteket (MLC) hoztunk létre PHA-val (fitohemagglutinin) stimulált T¹sejtekkel 1¹MT jelenlétében és hiányában. Ezekben a kevert limfocita tenyészetekben 50 000 limfocitát 2 mg PHA-val átvittünk 96¹mérõhelyes lemezek mérõhelyeire, amit 144 órás proliferációs periódus követett (amit „PhaLy” jelöl). A csak tápközegben PHA nélkül tenyésztett limfociták jelentették a további kontrollt (Amit „Ly” jelöl). A különbözõ tenyészetekben található PHA-stimulált limfociták meghatározása érdekében az alábbi 4 összeállítást futtattuk és vizsgáltuk meg: PhaLy+”Mo+Ly” PHA-stimulált limfociták és TAIC (105 sejt a 4. példa szerinti „Mo+Ly” összeállításból). PhaLy+”Mo+Ly”+1-MT PHA-stimulált limfociták és TAIC 2 mmol 1¹MT jelenlétében (105 sejt a 4. példa szerinti „Mo+Ly” összeállításból). PhaLy+„Mo” PHA-stimulált limfociták és TAIC (105 sejt a 4. példa szerinti „Mo” összeállításból). PhaLy+„Mo”+1-MT PHA-stimulált limfociták és TAIC 2 mmol 1¹MT jelenlétében [105 sejt a 4. példa szerinti „Mo” összeállításból]. 144 órás tenyésztés után az összes kontrollt és tenyészetet tovább tenyésztettük 24 órán keresztül 3[H]timidin jelenlétében („pulzáltuk”), és azután meghatároztuk a beépült radioaktívan jelzett timidin mennyiségét beütésszámként (cpm), lásd a 4. ábrát. Ebben az elrendezésben a meghatározott radioaktivitás mennyisége a DNS¹be beépült jelzett timidin mennyiségének a mértéke, és ezáltal a limfociták proliferációs sebességének a mértéke. A 4. ábrán bemutatott értékek megfelelnek három kísérlet három meghatározása átlagértékeinek, mindenhol a standard deviáció jelzésével. Az eredmények az demonstrálták, hogy a PHA-val nem stimulált limfociták („Ly”) nem proliferálnak szignifikánsan, az átlagos megfigyelt radioaktivitás 367 cpm (lásd a 4. ábrát). Ezzel szemben a 2 mg PHA-val végzett stimuláció szignifikáns növekedéshez vezet a limfociták („PhaLy”) proliferációjában, a legmagasabb
1
HU 004 255 T2
mért beépülés átlagos értéke 18459 cpm ezekben a mintákban. A TAIC hozzáadása a limfocitatenyészetekhez egyértelmûen csökkentette a proliferáció sebességét, erõsen, ha a 4. példa „Mo+Ly” összeállításából való sejteket adtunk (PhaLy+„Mo+Ly”, meghatározott érték 1498 cpm), és kevésbé erõsen, amikor a 4. példa „Mo” összeállításából való sejteket adtunk (PhaLy+„Mo”, mért érték 3369 cpm). A 2 mmol 1¹metil-triptofán (1¹MT) „Mo+Ly” és „Mo” stimulált limfocitákat tartalmazó összeállításokhoz való hozzáadása után kapott eredmények azt demonstrálták, hogy az 1¹metil-triptofán (1¹MT) szinergisztikusan növeli a TAIC szuppresszor funkcióját, miáltal a csökkenés erõsebb volt a „Mo+Ly” összeállításból való TAIC¹al (mért érték 267 cpm), mint a „Mo” összeállításból való TAIC¹al (mért érték 390 cpm). 6. példa Humán TAIC in vitro együtt tenyésztése allogén limfocitákkal szabályozó T¹limfociták létrehozására Annak vizsgálatára, hogy a TAIC indukálja¹e szabályozó T¹limfociták, azaz CD4/CD25+-limfociták kialakulását a recipiensben, TAIC és limfociták számos különbözõ in vitro tenyészetét futtattuk le, és elemeztük az azokból keletkezõ szabályozó T¹limfociták létrejöttét. Ebbõl a célból A jelû donorból származó TAIC¹ot közvetlenül vagy közvetetten in vitro együtt tenyésztettünk B jelû donorból való limfocitákkal. A közvetlen együtt tenyésztésben a TAIC (az A jelû donoré) és a limfociták (a B jelû donoré) közvetlen sejt-sejt érintkezését tettük lehetõvé, míg a közvetett együtt tenyésztésben egy membrán („sejttenyészet inszert”, 0,4 mm pórusméret, Falcon, rendelési szám: 353090) lehetõvé tette a tápközeg kicserélõdését, de gátolta a két sejtpopuláció fizikai érintkezését. A közvetlen vagy közvetett együtt tenyésztést elõnyösen 3–5, elõnyösebben 4 napon keresztül hajtottuk végre inkubátor körülmények között, azaz 37 °C¹on és 5% CO2 atmoszférában. A tenyésztés után meghatároztuk a szabályozó T¹sejtek (CD4+/CD25+) számát mindkét összeállításban, valamint a kontrollokban, ahol a TAIC vagy a limfociták önmagukban voltak tenyésztve. Ezenfelül abban a kontroll összeállításban, ahol a TAIC volt önmagában tenyésztve, meghatároztuk a CD3+/CD14+-sejtek számát, amelyek a legszignifikánsabb szuppresszor funkciójú komponensét képviselik a TAIC sejtpopulációnak a kevert limfocitatenyészetben. Mindegyik összeállításban meghatároztuk a sejtek felszíni antigénjeit FACS elemzéssel, és elemeztük az adott sejtpopulációk mennyiségét az összes sejtmennyiségre vonatkoztatva. Ezenkívül PCR-rel meghatároztuk a szabályozó T¹sejtek által specifikusan expresszált 3 új fõgén (Foxp3, CTLA–4 és Integrin aEb7) relatív expresszióját az adott sejtpopulációkban (lásd a táblázatot). A foxp3 egy specifikus transzkripciós faktor, amelyet a szabályozó T¹sejtek fejlõdése szabályozó génjének tekintenek, és amelyet specifikusan expresszálnak ezek a sejtek [lásd Hori, S. és mtsai., „Control of Regulatory
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
2
T¹cell Development by the Transcription Factor Foxp3”, Science 229, 1057–1061. old. (2003)]. A CTLA–4 egy további faktor, amelyet a CD4+/CD25+-T-sejtek szabályozó funkciója meghatározásának markereként alkalmaznak [lásd Khattri, R. és mtsai., „An essential role for Scurfin in CD4+/CD25+ T regulatory cells”, Nature Immunology, online közlemény, doi: 10,1038/ni909 (2003); Shimizu, J. és mtsai., „Stimulation of CD25+/CD4+ regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance”, Nature Immunology, online közlemény, doi: 10,1038/ni759 (2003); Cobbold, S. P. és mtsai., „Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance”, Transpl. Int. 16(2), 66–75. old. (2003)]. Az integrin aEb7 egy integrin, amely kötõdik az epitéliális katherinhez, és amely alkalmazható a szabályozó CD25+-T-sejtek leghatásosabb szubpopulációjának markereként [lásd Lehmann, J. és mtsai., „Expression of the integrin aEb7 identifies unique subsets of CD25+ as well as CD25– regulatory T cells”, PNAS 99(20), 13 031–13 036. old. (2002)]. A Foxp3¹, CTLA–4 és integrin aEb7-expresszió meghatározását kvantitatív PCR-rel hajtottuk végre GAPDH és b¹actin, két „housekeeping” gén kontrollként való alkalmazásával; a meghatározott értékeket egyrészrõl egymáshoz viszonyítottuk, a CD14+/CD3– sejtek esetében kapott értéket 1¹nek tekintve; másrészrõl az abszolút RNS mennyiségeket mg per összRNS-ként adtuk meg, annak érdekében, hogy a TAIC által in vitro kiváltott szuppresszió mért értékét és a kétszeresen pozitív CD4+/CD25+ sejtek kialakulását korreláljuk a megfelelõ gének expressziós arányával. A kvantitatív PCR-hez szokásos eljárásokat alkalmaztunk, amelyek ismertek a szakember számára (lásd Lottspeich, F., Zorbas, H., „Bioanalytika”, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). A táblázat azt mutatja, hogy a közvetlen együtt tenyésztésben nyert limfociták populációjában a kétszeresen pozitív CD4+/CD25+ sejtek százaléka sokszorosára növekszik 8,7% értékig, összehasonítva a közvetett együtt tenyésztésben nyert CD4+/CD25+ limfociták vagy a kontroll mennyiségével, amely közel azonos, sorrendben 2,38% és 2,65%. A CD4+/CD25+ sejtek szubpopulációja expresszálja a legmagasabb relatív mennyiségû mRNS¹t az összes tesztelt gének közül, összehasonlítva a CD4+/CD25+ sejtekben kapott expresszióval (lásd a táblázatot). Míg a Foxp3 expressziója körülbelül egy 10¹es faktorral emelkedett (37 versus 3,75), a CTLA–4 expressziója még magasabb maximális expressziót ér el (4699 versus 0,376). A harmadik fõ gén, a integrin aEb7 expressziójának a növekedése a CD4+/CD25+ sejtekben az együtt tenyésztés folyamán közel ugyanolyan magas, mint a CTLA–4¹é, mivel az integrin aEb7 mRNS abszolút mennyisége 1,4×10 –9 ¹re emelkedik a CD4+/CD25+ sejtekben, összehasonlítva a 3,4×10–12 mg mRNS/mg össz-RNS értékkel a CD4+/CD25– sejtekben.
1
HU 004 255 T2
2
Táblázat: A specifikus sejtpopulációk mennyiségének meghatározása a sejtek összes mennyiségében közvetlen és közvetett együtt tenyésztés után a sejtfelszíni CD3, CD4, CD14, CD25 markerekre vonatkoztatva, és három gén (Foxp3, CTLA–4 és integrin aEb7) relatív expressziójának és abszolút mennyiségének meghatározása ezekben a sejtpopulációkban. Kontroll
TAIC
Közvetlen együtttenyésztés
Közvetett együtttenyésztés
limfociták
limfociták
limfociták
CD14+/ CD3+
CD14+/ CD3–
CD4+/ CD25+
FACS (% pozitív sejtek)
41
20
Relatív Foxp3-expresszió (PCR)
50
1
Abszolút RNSmennyiség Foxp3
1,6×10–8
3,2×10–10
4,8×10–9
8×10–10
1,2×10–8
1,2×10–9
Relatív CTLA4-expresszió (PCR)
12 500
1
0,375
0,1
4699
0,376
Abszolút RNSmennyiség CTLA4
6,5×10–6
5,2×10–10
1,9×10–10
5,2×10–10
2,4×10–8
1,9×10–10
Abszolút RNAmennyiség Integrin aEb7
3,4×10–9
nem detektálható
1,4×10–9
3,4×10–12
2,65 15
A közvetett együtt-tenyésztés után a Foxp3-mRNS relatív mennyisége a CD4+/CD25+ szubpopulációban csak 10, és még alacsonyabb, mint a kontroll limfocitái által expresszált relatív mennyiség, amelyek 15 relatív mennyiségû Foxp3-mRNS¹t expresszálnak. A kontroll limfocitái által expresszált CTLA–4mRNAS relatív mennyisége csak 0,375 a CD4+/CD25+-populációban és 0,1 a CD4+/CD25– populációban. A CTLA–4 expressziója a TAIC CD14+/CD3+ szubpopulációjában hasonló volt a Foxp3 expressziójához, és szintén szignifikánsan magasabb, mint az összes többi sejtpopuláció. Ebben a vonatkozásban megemlítendõ, hogy a CTLA–4 expresszió (12 500 relatív érték) sokszor több volt a CD14+/CD3+-szubpopulációban, mint a Foxp3expresszió, amely 50 relatív értéket mutatott. Az integrin aEb7 expressziója nem volt detektálható a TAIC CD14+/CD3– szubpopulációjában, míg hasonlóan a két másik analizált gén expressziójához, az integrin expressziója a TAIC CD14+/CD3+-szubpopulációjában – abszolút étekként mérve mg RNS per mg össz-RNS – a legmagasabb értéket érte el (3,4×10–9 mg/mg össz RNS). A Foxp3, CTLA–4 és integrin aEb7 limfocitamarkerek szignifikánsan megemelkedett expressziója – összehasonlítva a normál limfocitákkal – a monocitákból származó TAIC¹on teljességgel váratlan, és mindeddig nem figyelték azt meg monocitákon vagy monocitákból származó sejteken. Összefoglalva, ezen példa fent bemutatott eredményei a következõket demonstrálják: Ha valaki abból a
CD4+/ CD25–
CD4+/ CD25+
30,8
8,7
1,5
37
CD4+/ CD25–
49 3,76
CD4+/ CD25+
2,38 10 3,2×10–9
CD4+/ CD25–
27,6 1,5 4,8×10–10
feltételezésbõl indul ki, hogy a Foxp3¹, CTLA–4¹, és in30 tegrin aEb7-expresszió szintje korrelál az adott sejt immunológiai szabályozó tulajdonságaival, itt demonstráltuk, hogy a TAIC CD3+/CD14+ szubpopulációjának szuppresszoraktivitása kapcsolatos a három gén magas szintû expressziójával. Ez még meglepõbb, amikor 35 figyelembe vesszük, hogy ezeket a markereket mindmáig csak limfocitákon írták le, de sohasem monocitaeredetû sejteken. Azt is kimutattuk továbbá, hogy a TAIC közvetlen együtt-tenyésztése limfocitákkal szignifikánsan na40 gyobb mennyiségû CD4+/CD25+ limfocitához vezet, összehasonlítva a közvetett együtt-tenyésztéssel és csak limfociták tenyésztésével. Ez alátámasztja azt a feltételezést, hogy in vivo (azaz páciensben) is kialakulnak szabályozó T¹limfociták a TAIC beadása után. 45 Ezek az eredmények összhangban vannak a CD4+/CD25+ limfociták ismert immunszabályozó funkciójával és azzal a ténnyel, hogy ezen sejtek Foxp3CTLA–4- és integrin aEb7-mRMS tartalma szignifikánsan magasabb, mint a közvetett együtt-tenyésztett lim50 focitákban vagy kontroll limfocitákban. 7. példa Transzplantátumtolerancia in vivo indukálása TAIC-al in vitro együtt-tenyésztett limfocitákkal 55 A 6. példában bemutatott eredmények és konklúziókat megerõsítettük in vivo állatkísérletben. Ebben a példában kiválasztott beltenyésztett kombinációból való állatokat oltottunk be a recipiensbõl származó olyan limfocitákkal, amelyeket elõzõleg 5 napon ke60 resztül közvetlenül együtt-tenyésztettünk a donorból 16
1
HU 004 255 T2
származó TAIC¹al. Más állatokat a recipiensbõl származó olyan limfocitákkal oltottunk be, amelyek kontrollként egyedül voltak tenyésztve tápközegben. Azokban az állatokban, amelyek az allogén szívátültetés elõtt a recipienstõl származó autológ együtt-tenyésztett limfocitákat kaptak, donorspecifikus tolerancia alakult ki, míg a kontroll állatokban, amelyek naiv nem együtt-tenyésztett kontroll limfocitákat kaptak a recipiensbõl, a transzplantált szív akut módon kilökõdött 10–14 napon belül. Ezt mutatja a GM–7 expresszió áramlási citometriás meghatározása is a páciensek vérében az operáció után a TAIC¹al együtt-tenyésztett limfociták beadása elõtt (bal oldali ábra) és azután (jobb oldali ábra). A GM–7¹et megkötõ sejtek frakciója az injekció elõtti körülbelül 0,5%-ról körülbelül 21%¹ra emelkedett az injekció után, jelezve a GM–7 kötésére képes szabályozó T¹sejtek kialakulását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fizikai sejt-sejt kölcsönhatás a donor TAIC és recipiens limfociták között szabályozó T¹sejtek keletkezését indukálja, amelyek önmagukban képesek módosítani a recipiens szingenikus immunrendszerét oly módon, hogy a potenciálisan alloreakív T¹sejtek szuppresszálódnak és ezáltal a szervkilökõdés meggátlódik. 8. példa Öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazása nátrium-dextrán-szulfát (DSS)-indukált krónikus kolitisz kezelésére Kolitisz kémiailag kiváltható egerekben nátriumdextrán-szulfát orális beadásával az ivóvízen keresztül. Hét napos idõszakon keresztül történõ beadás akut kolitisz kialakulását eredményezi, és az ismételt beadás, amely DSS beadásának legalább négy ciklusát tartalmazza 10 napos normál vízadagolással, krónikus kolitisz kialakulását eredményezi, amely hasonlít a humán colitis ulecerosára. Ez a rendszer jól be van állítva immunológiai és molekuláris vizsgálatokra [lásd például Herfarth, H. és mtsai., „Nuclear factor aB activity and intestinal inflammation in dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis in mice is suppressed by gliotoxin”, Clin. Exp. Immunol. 120, 59–65. old. (2000); Egger, B és mtsai., „Mice lacking transforming growth factor a have an increased susceptibility to dextran sulfate-induced colitis”, Gastroenterology 113, 825–832. old. (1997)], és a leírásban a STIC lehetõségének vizsgálatára alkalmazzuk a humán autoimmun colitis ulcerosa¹ra hasonlító DSS-indukált kolitisz krónikus verziójának kezelésére. Normál nõstény BALB/c egereket (egyenként 20 g) tartottunk víz és szokásos táp korlátlan hozzáférésével. Az egerek négy ciklust kaptak 5% (w/v) nátriumdextrán-szulfátot tartalmazó vízbõl (DSS; ezt az oldatot a leírásban ezt követõen DSS víznek nevezzük), majd kezeletlen vizet a következõ rend szerint: elsõ ciklus: 1–7. nap DSS víz (7 nap); 8–17. nap normál víz (10 nap); második ciklus: 18–24. nap DSS víz (7 nap); 25–34. nap normál víz (10 nap);
harmadik ciklus:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
35–41. nap DSS víz (7 nap); 42–51. nap normál víz (10 nap); és negyedik ciklus: 52–58. nap DSS víz (7 nap). Az 58. nap után az összes egér a krónikus kolitisz tüneteit mutatja, amely legalább két hónapig eltart (6A. és 6B. ábra). Az egereket ezután véletlenszerûen négy különbözõ csoportba osztottuk: 1. csoport (n=5): a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +1. napon (59. nap) az egerek 62,5 nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0,25 ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd 30 másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 5×106 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 2. csoport (n=7): a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +7. napon (65, nap) az egerek 5 nemzetközi egységnyi heparint kaptak 25 ml PBSben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd 30 másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 5×10 6 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 3. csoport (n=12): elsõ kontrollcsoport, amely DSS kezelést kapott, de nem kapott semmilyen sejtinjekciót. 4. csoport (n=6): második, DSS vízzel kezelt kontroll csoport; a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +1. napon (59. nap) az egerek 62,5 nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0,25 ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd 30 másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 5×106 „kontrollsejtet” (lásd a 1. példát) intravénásan 1 ml PBSben (a „kontrollsejtek” csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke, amely a tenyésztés elõtti sejteket reprezentálják a STIC 2. példa szerinti elõállításához, azaz szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejtek). Az összes egeret feláldoztuk a 79. napon, három héttel a DSS vízzel történõ táplálás befejezése után. A kísérlet folyamán hetente háromszor megmértük az állatok tömegét a DSS beadás során és az azt követõ három hétben. Az állatok testtömegének változását (tömeggyarapodás vagy ¹vesztés) százalékban fejezzük ki az egerek 59. napon mért tömegéhez viszonyítva, amikor a sejtterápiát kapták. Az 5–15% tartományba esõ változásokat tekintjük szignifikánsnak. Az egerek testtömegének változásait a DSS kezelés vége utáni három hétben a 7. ábrán mutatjuk be.
1
HU 004 255 T2
Amint látható, a STIC beadása a +1. napon (1. csoport=) megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodáshoz vezet, amely nem található meg sem a kezeletlen állatokban (3. csoport= sem a „kontrollsejtekkel” a +1. napon kezelt állatokban (4. csoport=·), sem a +7. napon STIC¹el kezelt állatokban (2. csoport= ) a betegség lefolyása alatt. Az értékek csoportonként 5–7 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±15% alatt volt. Egy további kísérletben a vastagbélszövetet szövettanilag megfestettük Hematoxilin & Eozin (H & E) festéssel. A H & E festést a Woods, A. E. és Ellis, R. C. (szerk.) („Laboratory Histopathology: A Complete Reference”, 1. & 2. kötet; kiad.: Churchill & Livingstone, 1994) irodalmi helyen ismertetett módon hajtottuk végre. A megfestett nyálkahártya állapotát két függetlenül dolgozó patológus értékelte, akik nem ismerték a kísérleti beállításokat, az alábbi séma szerint: 0¹ás érték, egészséges, nem feltûnõ lelet; 1¹es érték, minimális kolitisz; 2¹es érték, közepes kolitisz; 3¹as érték, súlyos kolitisz; és 4¹es érték, ulceratív kolitisz, együtt a teljes nyálkahártya elpusztításával. Az értékelés eredményeit a 8. ábrán mutatjuk be. Három héttel a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusának befejezése után a 3. csoportkontroll állataiban (nem volt sejt injekció) az átlagos érték körülbelül 4 volt, míg az 1. csoport (STIC beadása a +1. napon) vagy a 2. csoport állataiban (STIC beadása a +7. napon) szignifikánsan csökkent átlagos értékek voltak, sorrendben körülbelül 1 (1. csoport) és körülbelül 1,5 (2. csoport). A „kontrollsejtekkel” kezelt állatokban (4. csoport) az átlagos érték körülbelül 3 volt, ami majdnem olyan magas, mint a kezeletlen egereké (3. csoport). Ezek az eredmények összhangban vannak a megfestett vastagbélmetszetek szövettani értékelésével (H & E festés, lásd fentebb), amint a 6. ábrán látható. Ez az értékelés a legkritikusabb a STIC¹el végzett kezelés hatásosságának meghatározásában. A 6A. (2,5× nagyítás) 6B. (10× nagyítás) ábrák a 3. csoport kezeletlen állatai vastagbelének az állapotát illusztrálják nagyrészt tönkretett nyálkahártyával és a körülvevõ szöveteket erõsen elárasztották a gyulladásos sejtek. Ezek az ábrák a kolitiszt elõrehaladott stádiumait mutatják. A kezeletlen állatok kolitiszének az elõrehaladásával (6A/B. ábra) ellentétben a nyálkahártya morfológiája nagymértékben megmaradt az 1. csoport állataiban, amelyek STIC¹et kaptak a +1. napon [6C. (2,5× nagyítás) és 6D. (10× nagyítás) ábra]. A gyulladás és a nyálkahártya pusztulásának csak csekély jelei láthatók ezekben az állatokban, a környezõ szövetek elárasztása nélkül. A „kontrollsejtekkel” a +1. napon kezelt 4. csoport állatai (6E. ábra; 2,5× nagyítás) és egy STIC¹el a +7. napon kezelt 2. csoportbeli állat (6F. ábra; 2,5× nagyítás) vastagbélmetszetei egyaránt az elõrehaladott kolitisz tüneteit mutatják nagymértékben elpusztult nyálkahártyával és a környezõ szövetek gyulladásos sejtek általi erõs elárasztásával, hasonlóan a kezeletlen állatokhoz (6A/B. ábra).
5
10
15
20
25
2
A fenti kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a kolitisz indukálására beadott DSS kezelés vége utáni +1. napon beadott STIC képes szuppresszálni vagy egyértelmûen csökkenteni a kolitisz tüneteit. A STIC¹el kezelt állatokban nincs szignifikáns tömegvesztés (7. ábra), és a szövettani értékelésük szignifikánsan kisebb, mint a kezeletlen állatoké (8. ábra), és a vastagbél nyálkahártyájának általános állapota majdnem normális, amint vastagbélmetszetek szövettani festésébõl látható (6C/D. ábra). A +7. napon beadott STIC (2. csoport) nem képes a STIC beadása elõtti 7 napos idõszak alatt kialakult kolitisz kezelésére. Habár nem történik meg a kolitisz kialakulásának visszafordítása, a betegség elõrehaladása megáll, amint egy 2. csoportbeli állat alacsonyabb szövettani értékébõl látszik, összehasonlítva egy kezeletlen 3. csoportbeli állattal (8. ábra). Ez a jelenség specifikus a DSS-indukált kolitisz ezen példában alkalmazott modelljére, és nem lehet egyszerûen átvinni más körülményekre. A szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejteket képviselõ csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke nem alkalmas kolitisz kezelésére, mivel az ezekkel a sejtekkel kezelt állatok (4. csoport) a kezeletlen állatokéhoz hasonlóan súlyos kolitisz tüneteit mutatják (6E/F.; 7. és 8. ábra). Ez egyértelmûen bizonyítja, hogy a STIC képes a kolitisz kezelésére, és nem az olyan sejtek, amelyek jelen vannak azon sejtek keverékében, amelyekbõl a STIC kialakul a tenyésztés folyamán.
30
35
40
45
50
55
60 18
9. példa Öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazása SCID egerekben CD4+/CD62L+ limfociták átvitelével indukált kolitisz kezelésére Kolitisz mesterséges indukálása SCID (súlyos kombinált immundeficiencia) egerekben egy másik megközelítési mód a STIC és azok autoimmun betegségek kezelésére való lehetõségének elemzésére. A SCID egerek nem tartalmaznak sem T¹, sem B¹sejteket. Az immunrendszerüket helyre lehet állítani pajzsmirigysejtek specifikus szubpopulációjának bevitelével. Ezek a sejtek, amelyeket CD4+CD62L+ vagy CD62Lhigh sejteknek nevezünk, újra benépesítik az immunrendszert, de a szabályozás hiánya miatt krónikus gyulladással járó spontán kolitisz kialakulását is indukálják. Ezt a modell rendszer az úgynevezett „krónikus kísérletes kolitisz CD62L+/CD4+ SCID transzfer modellje egérben” [lásd például Mudter, J. és mtsai., „A new model of chronic colitis in SCID mice induced by adoptive transfer of CD62L+ CD4+ T cells: Insights into the regulatory role of interleukin¹6 on apoptosis”, Pathobiology 70, 170–176. old. (2002)], amely lehetõvé teszi a kolitisz mint autoimmun betegség kialakulásában szerepet játszó sejtpopulációk specifikusabb elemzését. A leírásban ezt a modellt alkalmazzuk STIC lehetõségének vizsgálatára deregulált immunrendszer által indukált kolitisz kezelésére. Ez a modell mechanisztikusabb vizsgálatokat tesz lehetõvé, de gyengébb rendszernek tartják, mint a DSS modell rendszert (lásd a
1
HU 004 255 T2
fenti 8. példát), mert az immunrendszer nem népesedik be teljesen. SCID BALB/c egerek (egyenként 18–22 g) intraperitoneális injekciót kaptak 1×106 CD4+/CD62L-selectinhigh T¹sejtekkel PBS-ben, amelyeket normál BALB/c egerek lépébõl izoláltunk a „Macs” mágneses gyöngy szortírozó rendszer (Milteny Biotechy Germany) alkalmazásával. Az egereket vízhez és szokásos táphoz való korlátlan hozzáférés mellett tartottuk. A CD4+/CD62L-selectinhigh T¹sejtek átvitele utáni 4–6 héten belül az egerekben kolitisz alakul ki. A kolitisz kialakulását a tömegváltozás értékelésével határozzuk meg. Az egereket ezután véletlenszerûen három különbözõ csoportba osztottuk: 1. csoport (n=10): a kolitisz CD4+/CD62L-selectinhigh T¹sejtek beadásával történõ indukálása után 6 héttel az egerek 62,5 nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0,25 ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd 30 másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 5×106 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 2. csoport (n=10): elsõ kontroll csoport, amely csak a CD4+/CD62L-selectinhigh T¹sejteket kapta, de nem kapott semmilyen további sejtinjekciót a 6 hét után. 3. csoport (n=10): második kontrollcsoport, amely CD4+/CD62L-selectinhigh T¹sejteket kapott. Hat hét elteltével az egerek 62,5 nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0,25 ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd 30 másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 5×10 6 „kontrollsejtet” (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. A „kontrollsejtek” ugyanazok, mint a 8. példában definiáltak (csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek nem tenyésztett keveréke). Az összes patkányt feláldoztuk 1–12 héttel a betegséget indukáló T¹sejtek átvitele után, vagy amikor a kontroll állatokban kolitisz jelei alakultak ki, a 2. kontroll csoport állatainak tömegváltozása alapján értékelve. Hasonlóan a 8. példában ismertetett DSS modellhez, az állatok testtömegét hetente háromszor mértük a kísérleti idõszak folyamán. Az állatok testtömegének változását százalékosan adjuk meg (tömeggyarapodás vagy ¹vesztés) az egereknek a kísérlet megkezdése utáni 6 héttel mért tömegéhez viszonyítva, amikor a sejtterápiát kapták. Ismét az 5–15% tartományba esõ változásokat tekintjük szignifikánsnak. Az egerek testtömegének változásait a teljes kísérleti idõszak alatt a 9. ábrán mutatjuk be. 6 hét elteltével az összes csoport egereinek majdnem azonos a testtömege. Míg a STIC beadása 6 hét után (1. csoport= )
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 19
2
megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodáshoz vezet, a kezeletlen csoportba tartozó egerek (2. csoport= ), valamint a 6 hét elteltével a „kontroll sejtekkel” kezelt egerek (3. csoport= ) csökkent testtömeg-gyarapodást (2. csoport) vagy semmilyen gyarapodást sem (3. csoport) mutatnak a betegség lefolyása alatt. Az értékek csoportonként 6 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±15% alatt volt. Az állatok feláldozása után azonnal meghatároztuk a vastagbél hosszát és a lép tömegét. Mindkét érték lehetõvé teszi a gyulladás mértékének a megbecslését, de nem nagyon érzékenyek. A 10. ábrán bemutatjuk a vastagbél hosszának (10A. ábra) és a lép tömegének (10B. ábra) mérésének eredményeit. Amint ebbõl az ábrából láthatjuk, a STIC¹el kezelt állatok (1. csoport) vastagbele szignifikánsan hosszabb (körülbelül 11 cm) és a lépük szignifikánsan kisebb (körülbelül 5 mg), mint a kontroll állatoké. A 2. csoportbeli kontrollállatoknak rövidebb a vastagbele (körülbelül 10,3 cm) és megnagyobbodott a lépük (körülbelül 100 mg), súlyos gyulladást jelezve, míg a kontrollsejteket kapó állatokban (3. csoport) a kolitisz kevésbé súlyos tünetei alakulnak ki (vastagbél hossza körülbelül 10,6 cm és a lép tömege körülbelül 60 mg), összehasonlítva a kontroll állatokkal (2. csoport), de elõrehaladott kolitisz, összehasonlítva a STIC¹el kezelt állatokkal (1. csoport). Ezután egy további kísérletben a vastagbélszövetet szövettanilag megfestettük Hematoxilin & Eozin (H & E) festéssel [Woods, A. E. és Ellis, R. C. (szerk.), „Laboratory Histopathology: A Complete Reference”, 1. & 2. kötet; kiad.: Churchill & Livingstone, 1994] irodalmi helyen ismertetett módon hajtottuk végre. Amint már ismertettük a 8. példában, a nyálkahártya állapotát két függetlenül mûködõ patológus értékelte, akik nem ismerték a kísérleti beállításokat. A nyálkahártya értékelési rendszer ugyanaz volt, mint a 8. példában: 0¹ás érték, egészséges, nem feltûnõ lelet; 1¹es érték, minimális kolitisz; 2¹es érték, közepes kolitisz; 3¹as érték, súlyos kolitisz; 4¹es érték, ulceratív kolitisz, együtt a teljes nyálkahártya elpusztításával. Az átlagos értékeket a 11. ábrán mutatjuk be. Hat héttel a kezelés átvitele után a 2. csoportbeli kontrollállatokban, amelyek nem kaptak sejtinjekciót, az átlagos érték körülbelül 3 volt, súlyos kolitiszt jelezve. Az 1. csoportbeli, STIC¹et kapó egerekben és a 2. csoportbeli, 6 hét után kontrollsejteket kapó egerekben szignifikánsan csökkent értékeket kaptunk, sorrendben körülbelül 1,5 (minimális kolitiszt jelezve; 1. csoport) és körülbelül 2,5 (közepes kolitiszt jelezve; 2. csoport). Ezek az eredmények ismételten összhangban állnak a H & E festett vastagbélmetszetek szövettani értékelésének eredményeivel, amint a 12. ábráról látható (100× nagyítás). A 12A/B. ábrák mutatják be a 3. csoportbeli állatok vastagbelének állapotát, amelyek kezeletlenek maradtak a kolitisz CD62Lhigh T¹sejtekkel történõ indukálása után. Mindkét példa mononukleáris sejtekkel való kifejezett beszûrõdést és jelentõs nyálkahártya-integritás csökkentést, tüszõréteg-károso-
1
HU 004 255 T2
dást, és a nyálkahártya alatti réteg és izom propria beszûrõdését mutatja. „Kontrollsejtek” (vér¹, csontvelõ és lépszövetbõl származó, nem M¹CSF- és g¹interferonstimulált monociták) leírt módon történõ beadása nem akadályozza meg a mononukleáris sejtek beszûrõdését és a nyálkahártya-veszteséget, amint a 12C/D. ábrákon bemutatjuk. Mindkét minta jelentõs nyálkahártya alatti limfocitabeszûrõdést is mutat, de az izom propria még intakt marad. A STIC kolitisz CD62Lhigh T¹sejtekkel történõ indukálása utáni beadása alapvetõen javítja a nyálkahártya-integritást (12E/F. ábra). Mindkét minta vastagbélmetszeteiben csak kisebb limfocitabeszûrõdést, tüszõréteg-veszteség hiányát és a nyálkahártya alatti réteg és izom propria rétegek károsodásának hiányát láthatjuk az elemzett bélszakaszokon. Hasonlóan a nátrium-dextrán-szulfát (DSS) indukált krónikus kolitisz kezelésére beadott STIC¹el kapott eredményekhez (lásd a 8. példát), kimutatjuk a krónikus kísérletes kolitisz CD62L+/CD4+ SCID transzfer egérmodellje alkalmazásával, hogy a STIC képes szuppreszálni vagy egyértelmûen javítani az indukált kolitisz tüneteit. A STIC¹el kezelt egerek megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodást mutatnak (9. ábra), a vastagbelük szignifikánsan hosszabb (10A. ábra), és a lépük tömege szignifikánsan kisebb (10B. ábra), mint a kontrollcsoport egereié, amelyek a vastagbél súlyos gyulladásában szenvednek. Végezetül a STIC¹el kezelt egerek szövettani értékelése szignifikánsan alacsonyabb a kezeletlen állatokkal összehasonlítva (11. ábra), és az STIC¹el kezelt egerek vastagbélmetszeteinek a szövettani elemzése a kolitisz kisebb vagy semmilyen tüneteit sem mutatják (12. ábra). Összehasonlítva a kolitisz STIC¹el történõ kezelésének hatásaival, a szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejteket reprezentáló csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke szignifikánsan kisebb hatást mutat, mivel az ezen sejtekkel kezelt állatok (3. csoport) súlyosabb tüneteket mutatnak, mint amit a STIC¹el kezelt állatokban találtunk (9.‚ 10A/B., 11. és 12. ábra). Ellentétben a 8. példában a DSS modell rendszerrel kapott eredményekkel, a CD62Lhigh sejtekkel indukált kolitisz modellben a kontrollsejtek képesek javítani a tüneteket bizonyos mértékben, mivel az kontrollsejteket kapó állatok kevésbé súlyos tüneteket mutatnak a semmilyen sejtett nem kapott kontrollállatokhoz hasonlítva. A 8. példa eredményeivel összhangban ez megint egyértelmû bizonyíték arra, hogy a tsz STIC¹ek képesek autoimmun betegségek kezelésre.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló sejtek elõállítására, azzal jellemezve, hogy a) azon páciens vérébõl izolált monocitákat, akinek a sejteket be fogjuk adni, in vitro többszörözünk alkalmas tenyésztõ tápközegben, amely tartalmazza az M¹CSF celluláris növekedési faktort;
55
60 20
2
b) a monocitákat egyidejûleg vagy az a) lépést követõen g¹IFN¹t tartalmazó tenyésztõ tápközegben tenyésztjük; és c) a b) lépésben kialakult sejteket kinyerjük, a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl való elválasztásával. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monociták humán eredetûek. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monocitákat a vérbõl úgy izoláljuk, hogy a monociták mellett limfociták is jelen vannak legalább 10% mennyiségben az izolátum teljes sejtszámára vonatkoztatva. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben kialakult sejteket vagy a c) lépésben kinyert sejteket a DSM ACC2542 hibridóma sejtvonal által termelt ellenanyagokhoz való kötõdés alkalmazásával szelektáljuk. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben kialakult vagy c) lépésben kinyert sejtek vagy a 4. igénypont szerinti szelekciós lépésben nyert sejtek közül kiszelektáljuk azokat a sejteket, amelyek együtt expresszálják a felszínükön a CD3 és CD 14 antigéneket. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M¹CSF koncentráció a tenyésztõ tápközegben 1–20 mg/l. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést követõen a monocitákat 24–72 órán keresztül tenyésztjük g¹IFN¹t tartalmazó tenyésztõ tápközegben, a g¹IFN jelenlétében való tenyésztést 3–6 nappal az a) lépésbeli tenyésztést követõen kezdve. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a g¹IFN koncentráció a tenyésztõ tápközegben 0,1–20 ng/l. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a teljes tenyésztési idõszak az a) és b) lépésekben 4–8 nap. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont c) lépése után vagy a 4. és 5. igénypont szelekciós lépése után a sejteket felszuszpendáljuk alkalmas sejttenyésztõ tápközegben vagy PBS-ben vagy NaCl oldatban. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket fagyasztó közegben szuszpendáljuk fel, és azt követõen mélyfagyasztjuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fagyasztóközeg magzati borjúszérumot (FCS) vagy humán AB0-kompatibilis szérumot és DMSO¹t tartalmaz. 13. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1–3. vagy 6–10. igénypontok c) lépésében nyert sejteket vagy a 4. vagy 5. igénypont szelekciós lépésében nyert sejteket gyógyászati készítménnyé szereljük ki. 14. Felszínükön a CD3 és CD14 antigéneket együtt expresszáló sejtek, páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, amelyek az 1–12. igénypontok szerinti eljárások bármelyikével nyerhetõk.
1
HU 004 255 T2
15. A 14. igénypont szerinti sejtek, azzal jellemezve, hogy humán eredetûek. 16. Sejtkészítmény, amely 14. vagy 15. igénypont szerinti sejteket tartalmaz alkalmas tápközegben. 17. Gyógyászati készítmény, amely monocitaeredetû sejteket tartalmaz, amelyek együtt expresszálják a CD3 és CD 14 antigéneket a felszínükön, páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. 18. Gyógyászati készítmény, amely 14. vagy 15. igénypont szerinti sejteket vagy 16. igénypont szerinti sejtkészítményt, vagy az 1. igénypont c) lépésében nyert sejteket vagy a 4. igénypont szerinti szelekciós lépéssel nyert sejteket tartalmaz. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, autoimmun betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. 20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. 21. A 14. vagy 15. igénypont szerinti sejtek, vagy az 1–3. vagy 6–10. igénypontok c) lépésében nyert sejtek, vagy 4. vagy 5. igénypont szerinti szelekciós lépésben nyert sejtek, vagy a 16. igénypont szerinti sejtkészítmény alkalmazása páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény gyártására. 22. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, autoimmun betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az autoimmun betegség egy vagy több betegség az alábbiak közül választva: autoimmun jellemzõkkel rendelkezõ reumatikus betegségek, diabetes mellitus, a vér és véredények autoimmun betegségei, a máj autoimmun betegségei, a pajzsmirigy autoimmun betegségei, a központi idegrendszer autoimmun betegségei, és bullózus bõrbetegségek. 24. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. 25. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az allergia a nem saját fehérjék, szerves
5
10
15
20
25
30
35
40
21
2
anyagok és/vagy szervetlen anyagok által indukált allergiák közül van választva. 26. A 25. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az allergia a szénanátha és/vagy drogok, vegyszerek, vírusok, baktériumok, gombák, élelmiszerkomponensek, fémek, gázok, állati bõrhámladék, szõr és/vagy állati exkrétumok közül van választva. 27. A 14. vagy 15. igénypont szerinti öntoleranciát indukáló sejtek, vagy az 1–3. vagy 6–10. igénypontok c) lépésében nyert sejtek, vagy 4. vagy 5. igénypont szerinti szelekciós lépésben nyert sejtek, vagy a 16. igénypont szerinti sejtkészítmény alkalmazása autológ szabályozó T¹limfociták in vitro létrehozására és/vagy szaporítására. 28. A 27. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az autológ szabályozó T¹limfociták együtt expresszálják a CD4 és CD25 antigéneket a sejtfelszínükön. 29. Eljárás autológ szabályozó T¹limfociták létrehozására és/vagy szaporítására, azzal jellemezve, hogy 14. vagy 15. igénypont szerinti öntoleranciát indukáló sejteket, vagy az 1–3. vagy 6–10. igénypontok c) lépésében nyert sejteket, vagy 4. vagy 5. igénypont szerinti szelekciós lépésben nyert sejteket, vagy a 16. igénypont szerinti sejtkészítményt együtt tenyésztünk autológ T¹limfocita készítménnyel. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, ahol a szabályozó T¹limfocitákat a tenyésztõ tápközegbõl kinyerjük. 31. A 29. vagy 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szabályozó T¹limfociták együtt expresszálják a CD4 és CD25 antigéneket a sejtfelszínükön. 32. A 29–31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szabályozó T¹limfocitákat FACS alkalmazásával végrehajtott válogatással nyerjük ki a tenyésztõ tápközegbõl. 33. A DSM ACC2542 hibridóma sejtvonal által termelt ellenanyagok alkalmazása az 1–14. igénypontok bármelyike szerinti eljárással nyert, páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas sejtek detektálására és/vagy szelektálására.
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
22
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
23
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
24
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
25
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
26
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
27
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
28
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
29
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
30
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
31
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
32
HU 004 255 T2 Int. Cl.: C12N 5/06
33
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
