!HU000004110T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 110
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/59
(21) Magyar ügyszám: E 05 815953 (22) A bejelentés napja: 2005. 11. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050815953 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1809663 A1 2006. 05. 18. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1809663 B1 2008. 09. 17.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20040105639 2004. 11. 09. 20040628717P 2004. 11. 17.
(73) Jogosult: Ares Trading S. A., Aubonne (CH)
EP US
(72) Feltalálók: Valax, Pascal, Chernex (CH); Wenger, Pierre, Grilly (FR); Stanley, Anne, Rotorua (NZ); Delegrange, Lydia, Lutry (CH); Capponi, Luciano, Chatel Saint Denis (CH) (54)
(2006.01) A61K 38/04 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06051070 PCT/EP 05/055815
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
FSH tisztítására szolgáló eljárás
(57) Kivonat
HU 004 110 T2
A találmány tárgyát rekombináns FSH vagy rekombináns FSH-variáns kitisztítására szolgáló új eljárás képezi. A találmány szerinti megoldás elõnye, hogy im-
munaffinitás-kromatográfia alkalmazása nélkül is nagyfokú tisztaságot biztosít.
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 110 T2
A találmány tárgya A találmány tárgya follikulus stimuláló hormon (FSH) tisztításának témakörével kapcsolatos. A találmány elõzményei A follikulus stimuláló hormon (FSH) a gonadotropinok osztályába tartozó injektálható protein. Az FSH¹t férfi és nõi terméketlenség és reprodukciós zavarok kezelésére alkalmazzák. Természetes körülmények között az FSH¹t a hipofízis termeli. Gyógyászati célból az FSH elõállítható rekombináns módon (rFSH), vagy posztmenopauzális nõk vizeletébõl vonható ki (uFSH). Az FSH¹t nõkben ovulációindukció (OI), valamint asszisztált reprodukciós technológiákban (ART) kontrollált petefészek-hiperstimuláció (COH) elõidézésére veszik igénybe. Egy tipikus ovulációindukciós kezelési eljárásban a pácienst kb. 6–12 napos periódusban naponta FSH¹t vagy annak egy változatát tartalmazó injekcióval kezelik (kb. 75–300 NE FSH/nap). A tipikus kontrollált petefészek-hiperstimulációs eljárásban a pácienst kb. 6–12 napos periódusban naponta FSH¹t vagy annak egy változatát tartalmazó injekcióval kezelik (kb. 150–600 NE FSH/nap). Az FSH¹t oligospermiában szenvedõ férfiak spermatogenezisének indukálására is felhasználják. Hypogonadotrop hypogonadismusban szenvedõ férfiakban a hetente háromszor 150 NE FSH és hetente kétszer 2500 NE hCG beadását tartalmazó kombinált kezelés eredményesen javította a spermiumszámot [Burgues és munkatársai: Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980–6]. Az FSH termékenységi zavarok kezelésében betöltött jelentõsége miatt nagy tisztaságú és nagymértékben specifikus aktivitású FSH¹ra van szükség. Az FSHkezelés ismételt injekciós kezelést tartalmaz. A nagymértékben tisztított FSH-készítmények beadhatók szubkután, ezáltal a páciens saját magát kezelheti, ami kényelmesebbé teszi a kezelést, és javítja a páciens együttmûködési készségét. Lynch és munkatársai [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12–19] humán hipofíziseredetû FSH tisztítására szolgáló eljárást ismertettek. Az eljárás anion- és kationcserélõ kromatográfiát, immunaffinitás-extrakciót és méretkizárásos kromatográfiát tartalmaz. Az eljárás 1990 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg specifikus aktivitású hipofíziseredetû FSH¹t és 16 NE/mg LH¹t eredményezett. A proteintartalmat száraz tömeg alapján állapították meg, vagy oldatban 280 nm¹en mért abszorpciónál (feltételezve, hogy 1 g/L esetében az A2801 cm egyenlõ 1¹gyel). A WO 98/20039 számú nemzetközi közzétételi irat (IBSA Institut Biochimique SA) humán vizeleteredetû FSH humán menopauzális gonadotropinoknak (hMG)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
nevezett vizeletkivonatból történõ tisztításának folyamatát ismerteti. Az eljárásban DEAE típusú gyengén bázikus anioncserélõ gyantákon végzett ioncserélõ kromatográfiát ligandumként antrakinonszármazékot tartalmazó gyantán végzett affinitáskromatográfia követ. A folyamat eredményeként LH¹mentes vizeleteredetû FSH nyerhetõ, amelynek specifikus aktivitása 6870 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg. A proteintartalom meghatározásakor feltételezték, hogy a protein 1 mg/ml¹es vizes oldatának 277 nm¹en, kvarcküvettában, 1 cm úthossznál mért optikai sûrûsége 0,62. A WO 00/63248 számú nemzetközi közzétételi irat (Instituto Massone SA) gonadotropinok, köztük FSH humán vizeletbõl történõ kitisztításának folyamatát ismerteti. A folyamat a következõ lépéseket tartalmazza: szulfopropil típusú erõs kationos gyantán történõ ioncserélõ kromatográfia, erõs anionos gyantán végzett ioncserélõ kromatográfia, valamint hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC). A módszer 8400 NE/mg specifikus aktivitású (Steelman-Pohley method: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604–616) és 75 NE FSH¹ra jutó kevesebb mint 1 NE LH biológiai aktivitású (patkány ondóhólyag tömegnövekedés módszer; Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) FSH-preparátumot eredményezett. Proteintartalmát Lowry-módszerrel állapították meg [O. H. Lowry és munkatársai, J. Biol. Chem., 1951, 193, 265]. Az 5990288 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Musick és munkatársai) FSH biológiai mintákból, például humán hipofízisbõl vagy humán posztmenopauzális vizeletbõl történõ kitisztítására szolgáló eljárást ismertet. A folyamat Fractogel EMD SO3–650M oszlopon történõ kationcserélõ kromatográfiát, majd Mimetic Orange 1 gyantán végzett színezékaffinitás-kromatográfiát tartalmaz, amelyeket Bakerbond Wide Pore HI¹Propyl gyantán történõ hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia követ. Az eljárás 7066 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg specifikus aktivitású humán hipofíziseredetû FSH¹t és kevesebb mint 1 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg LH¹t, valamint 6298 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg vizeleteredetû FSH¹t és kevesebb mint 3 NE (immunvizsgálati eljárásban)/mg LH¹t eredményezett. A proteintartalmat 280 nm¹en mért abszorpció alapján állapították meg (feltételezve, hogy 1 g/L esetében az A2801 cm egyenlõ 1¹gyel). Chiba és munkatársai [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205–218] kutyahipofízis-eredetû gonadotropinok, többek közt FSH kitisztítását szolgáló, Concanavalin (Con) A affinitás kromatográfiát, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát (HIC) és Cu++-ionokat alkalmazó immobilizált fémion kromatográfiát tartalmazó eljárást ismertettek. Az eljárás eredményeként kapott FSH specifikus aktivitása 2,17 NE/g proteinnek adódott, ehhez a biológiai aktivitást FSH radioreceptor vizsgálati eljárással, a protein-
1
HU 004 110 T2
tartalmat „BioRad protein assay kit”-tel (BioRad Laboratories CA USA) állapították meg. A WO 88/10270 számú nemzetközi közzétételi irat (Instituto di Ricerca Serono SPA) humán FSH vizeletbõl történõ kitisztítására szolgáló eljárást ismertet. A folyamat divinil-szulfonnal Sepharose 4B¹hez rögzített FSH-specifikus monoklonális ellenanyagokkal végzett immunkromatográfiát tartalmaz, amit reverz fázisú HPLC követ. Az így nyert FSH-mentes LH¹tól és egyéb, vizeleteredetû proteinektõl és liofilizált porának specifikus aktivitása 6200 NE/mg (Steelman–Pohley-módszer). Tisztaságának köszönhetõen ez volt az elsõ, szubkután beadásra alkalmas FSH-készítmény. Továbbra is jelentõs igény mutatkozik az FSH és FSH-variánsok tisztítására szolgáló új eljárások iránt. Közelebbrõl, olyan tisztítási eljárásokra van szükség, amelyek nem tartalmaznak költséges immunaffinitáskromatográfiás lépéseket. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát rekombináns FSH vagy rekombináns FSH-variáns tisztítására szolgáló új eljárás képezi. Egy szempontból a találmány tárgyát humán FSH vagy FSH-variáns rekombináns nyers FSH¹t tartalmazó folyadékból történõ tisztítására szolgáló eljárás képezi, amely a következõ, tetszõleges sorrendben végrehajtható lépéseket foglalja magában: (1) színezékaffinitás-kromatográfia; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia; és (3) reverz fázisú kromatográfia. Az ábrák rövid leírása Az 1. ábra a találmány szerinti megoldást, vagyis a következõ lépésekbõl álló tisztítási folyamatot mutatja be: színezékaffinitás-kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia, reverz fázisú kromatográfia. A 2. ábra a találmány egy specifikus megvalósítási módjának folyamatábráját tartalmazza, vagyis a következõ lépésekbõl álló tisztítási folyamatot mutatja be: ultrafiltráció/diafiltráció, anioncserélõ kromatográfia, színezékaffinitás-kromatográfia, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia, reverz fázisú kromatográfia, anioncserélõ kromatográfia, nanofiltráció, ultrafiltráció/diafiltráció. Rövidítések A találmány szerinti megoldás leírásában a következõ rövidítéseket alkalmaztuk: DF: diafiltráció FSH: follikulus stimuláló hormon
2
r-FSH: rekombináns FSH hFSH: humán FSH r-hFSH: rekombináns humán FSH BV: ágytérfogat („bed volume”) 5 DEAE: dietil-amino-etil ELISA: enzimkapcsolt immunvizsgálati eljárás DAC: színezékaffinitásos kromatográfia IMAC: immobilizált fémion affinitás kromatográfia OD: optikai sûrûség 10 HIC: hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia HPLC: nagy teljesítményû folyadékkromatográfia IRMA: immunradiometriás vizsgálati eljárás KD vagy kD: kilodalton HCP: gazdasejtprotein, az FSH expressziójára hasz15 nált gazdasejtbõl származó proteinek IPC: folyamatszabályozás IEF: izoelektromos fokuszálás PES: poliéterszulfon RP-HPLC: reverz fázisú nagy teljesítményû folyadék20 kromatográfia Q FF: anioncsere Q Sepharose FF (oszlopon) RT: szobahõmérséklet UF: ultrafiltráció WFI: injekciós beadásra szánt víz 25 A találmány szerinti megoldás részletes ismertetése A találmány tárgyát rekombináns humán FSH vagy rekombináns FSH-variáns nyers FSH¹t tartalmazó fo30 lyadékból történõ kitisztítására szolgáló eljárás képezi, amely a következõ, tetszõleges sorrendben végrehajtható lépéseket tartalmazza: (1) színezékaffinitás-kromatográfia; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia; és 35 (3) reverz fázisú kromatográfia. A találmány szerinti tisztítási eljárás nagy mennyiségû, nagy tisztaságú, gyógyszerré kiszerelhetõ [például Gonal¹F (Serono)] FSH¹t eredményez. A talál40 mány szerinti megoldás elõnye, hogy immunaffinitáskromatográfia alkalmazása nélkül is nagyfokú tisztaságot biztosít. A találmány szerinti tisztítás kiindulóanyagaként szereplõ nyers FSH rekombináns FSH¹t tartalmazó sejttenyészetbõl származik. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a 45 találmány szerinti tisztítási eljárás néhány vagy összes lépésében antioxidáns vagy antioxidáns és gyökfogó hatással bíró szabad aminosav vagy dipeptid alkalmazására kerül sor. Közelebbrõl, az antioxidáns az 50 r¹hFSH tisztítására és/vagy koncentrálására és/vagy filtrálására alkalmazott pufferek bármelyikében jelen lehet. Az antioxidáns megakadályozza az FSH feldolgozás során bekövetkezõ oxidációját. Az alkalmazott antioxidáns elõnyösen L¹metionin. Az L¹metionin kon55 centrációja elõnyösen kb. 10–100 mM. További antioxidánsok lehetnek például a t¹butil-4-metoxi-fenol, a 2,6bisz(1,1-dimetil-etil)-4-metil-fenol; a kálium- vagy nátrium-bimetabiszulfit, a nátrium-biszulfit. Antioxidáns és gyökfogó hatású szabad aminosavak és dipeptidek 60 például a hisztidin, a taurin, a glicin, az alanin, a karno3
1
HU 004 110 T2
zin, az anszerin, az 1¹metil-hisztidin vagy ezek kombinációi. Jellemzõen a kiindulóanyagot az elsõ kromatográfiás lépésben bekövetkezõ megkötés elõtt elõször derítik, majd kívánt esetben (például ultrafiltrációval) koncentrálják és/vagy (például diafiltrációs lépésben) pufferrel szemben kicserélik. A kromatográfiás lépésekben polimer és agaróz alapú gyanták egyaránt használhatók. Membránkromatográfia is igénybe vehetõ, ebben az esetben a gyantát funkcionalizált membrán helyettesíti. A következõkben részletesen bemutatjuk a találmány szerinti megoldásban alkalmazott három tisztítási lépést (affinitáskromatográfiát, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát, reverz fázisú kromatográfiát). A színezékaffinitás-kromatográfiás lépés (1) A találmány szerinti eljárás színezékaffinitás-kromatográfiás lépést tartalmaz (1). A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a színezékaffinitás-kromatográfiás lépést immobilizált ligandumként szakember számára jól ismert festékvegyületet, például Cibacron Blue F3G-A¹t tartalmazó gyantával végezzük. A szakember számára jól ismert „immobilizált” kifejezés azt jelenti, hogy a ligandum derivatizált, abban az értelemben, hogy kémiailag a gyantához van kötve. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen elõnyös gyanta a Blue Sepharose FF (beszerezhetõ az Amersham Biosciences Inc.¹tõl). A Blue Sepharose FF technikai jellemzõit az alábbiakban ismertetjük.
az Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), a Blue sepharose HP (Amersham), a Cibacron Blue 3GA (Sigma). Az immobilizált színezékaffinitás-kromatográfiában az elúciós lépést elõnyösen foszfátpufferrel, különösen 5 elõnyösen nátrium-foszfát-pufferrel kell végezni. Az eluens pH¹ja elõnyösen 6,0 vagy a körüli és 11,5 vagy a körüli pH¹érték közötti, még elõnyösebben 6,5 vagy a körüli és 8,0 vagy a körüli pH¹érték közötti, különösen elõnyösen pedig 7,0 vagy a körüli pH¹értékû. A 7,0 kö10 rüli pH fenntartására alkalmas további pufferek például a MES, a Bis-Tris, az ADA, a PIPES, az ACES, a BES, a MOPS, a TES, a HEPES. A színezékaffinitás-kromatográfia elúciós lépéséhez alkalmazott puffernek a vezetõképesség fokozása érdekében sót, elõnyösen nát15 rium-kloridot kell tartalmaznia. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a színezékaffinitás-kromatográfia egyes lépéseiben a terméket tartalmazó (ekvilibráló¹, mosó¹, eluáló¹) pufferek antioxidánst, például L¹metionint tar20 talmaznak. Erre a célra alkalmazható további antioxidánsok a t¹butil-4-metoxi-fenol, a 2,6-bisz(1,1-dimetiletil)-4-metil-fenol; a kálium- vagy nátrium-bimetabiszulfit, a nátrium-biszulfit. 25
30
Technikai specifikáció
Ligandum
Cibacron Blue F3G¹A
Ligandumkapcsolási eljárás
triazinkapcsolás
Kötõkapacitás
=18 mg humán szérumalbumin/ml
Mátrix
nagymértékben keresztkötött agaróz, 6%
Kizárási limit (Mr)
4×106
Részecskemérettartomány
45–165 mm
Lineáris áramlási ráta*
=7,5 cm/h
Ligandumdenzitás
=7 mmol Cibacron Blue/ml közeg
pH-stabilitás
4–12 (hosszú távon), 3–13 (rövid távon)
Kémiai stabilitás
40 °C¹on 7 napig (70% etanol, 6 M guanidin-hidroklorid, 8 M karbamid)
A találmány szerinti eljárás más, hasonló jellemzõkkel rendelkezõ gyantákkal is elvégezhetõ. Ilyen, alternatív gyanták például a Toyopearl AF¹blue-HC–650M (Tosoh Bioscience), a Toyopearl SuperButyl 550, a Toyopearl Phenyl 650, a Blue Cellthru BigBead (Sterogene), a SwellGel Blue (Pierce), a Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (Sigma), az Affi-Gel Blue (BioRad),
2
35
40
45
50
55
60 4
A hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás lépés (2) A találmány szerinti eljárás hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás lépést is tartalmaz (2). A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiára például Toyopearl Butyl 650M gyanta (beszerezhetõ a Tosoh Biosep Inc.¹tõl) alkalmazásával kerül sor. A (2) lépés más, hasonló jellemzõkkel rendelkezõ gyanták alkalmazásával is elvégezhetõ. Ilyen, alternatív gyanták például a Phenyl Sepharose 6 Fast Flow („low sub”); a Phenyl Sepharose 6 Fast Flow („high sub”); a Butyl Sepharose4 Fast Flow; az Octyl Sepharose 4 Fast Flow; a Phenyl Sepharose High Performance; a SOURCE 15ETH; a SOURCE 15PHE [Amersham Biosciences; (800) 826–3593; www.amershambiosciences.com]. További, hasonló tulajdonságú gyanták a Hydrocell C3 vagy C4 és a Hydrocell Phenyl [BioChrom Labs Inc., (812) 234–2558; www.biochrom.com]. A HIC gyantán a kötõdés nagy vezetõképességû pufferrel érhetõ el, ami só [például NaCl, (NH4)2SO4 vagy Na2SO4] hozzáadásával állítható elõ. A hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia során az elúció elõnyösen a mobil fázis vezetõképességének (sókoncentrációjának) csökkentésével, 6 vagy a körüli és 8 vagy a körüli pH¹érték közötti, elõnyösebben 6,5 vagy a körüli és 7,5 vagy a körüli pH¹érték közötti, legelõnyösebben pedig 7 vagy a körüli pH¹értékû pufferrel érhetõ el. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában alkalmazott rendszer pufferként elõnyösen 7 vagy a körüli pH¹jú nátrium-foszfátot és ammónium-szulfátot tartalmaz. Fentebb ismertettünk a találmány szerinti megoldásban alternatív módon használható puffereket. A találmány egy különlegesen elõnyös megvalósítási módjában a HIC (2) lépésében a terméket tartal-
1
HU 004 110 T2
mazó (ekvilibráló¹, mosó¹, eluáló¹) pufferek antioxidánst, például L¹metionint is magukban foglalnak. Fentebb ismertettünk a találmány szerinti megoldásban alternatív módon használható antioxidánsokat. 5 A reverz fázisú kromatográfiás lépés (3) A találmány szerinti eljárás reverz fázisú kromatográfiás (RPC) lépést is tartalmaz (3). Az RPC elõnyösen SOURCE 30 RPC gyanta (beszerezhetõ az Amersham Biosciencestõl) alkalmazásával végezhetõ el. A harmadik (3) lépés szakember számára jól ismert, hasonló jellemzõkkel rendelkezõ egyéb gyantákkal is elvégezhetõ. A kromatográfia elõnyösen enyhén alkalikus pH¹jú, például 7–8,5¹es vagy a körüli pH¹értékû, elõnyösebben 7,5–7,6¹es vagy a körüli pH¹értékû mobil fázisú puffereléssel végezhetõ. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a pufferanyag ammóniumacetát. A 7,6¹es vagy a körüli pH¹értéknek megfelelõ pufferek például a BES, a MOPS, a foszfát, a TES, a HEPES. Az ebben a lépésben alkalmazott pufferoldatok szerves modifikálóanyagot is tartalmazhatnak, amelynek koncentrációja a kromatográfiás lépés különbözõ fázisainak (töltés, mosás, elúció és regeneráció) megfelelõen módosul. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a szerves modifikálóanyag vízzel vegyülõ szerves oldószer, elõnyösen alkohol (például metanol, etanol stb.), legelõnyösebben 2¹propanol (izopropanol). A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában az RPC lépésben a terméket tartalmazó (ekvilibráló¹, mosó¹, elúciós) pufferek antioxidánst, például L¹metionint tartalmaznak. A fentiekben már említést tettünk az erre a célra felhasználható egyéb antioxidánsokról. Opcionális további 0. tisztítási lépés – ioncserélõ kromatográfia A – fentiekben vázolt – három fõ tisztítási lépésen túl a találmány szerinti megoldás további tisztítási lépéseket is tartalmazhat. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány szerinti tisztítási eljárás elõnyösen erõs anioncserélõ gyantával végzett, különösen elõnyösen kvaterner ammóniumgyantát, például a következõ jellemzõkkel rendelkezõ Q Speharose FF¹et (beszerezhetõ az Amersham Biosciencestõl) alkalmazó, elõzetes ioncserélõ kromatográfiás lépést is tartalmaz: Ioncserélõ típusa erõs anionos Teljes kapacitás (mmol/ml) 0,18–0,25 Kizárási limit (globularis proteinek) 4×106 Gyöngyalak: szferikus, 45–165 mm Gyöngyszerkezet: keresztkötött agaróz, 6% Mûködési pH¹stabilitás: 2–12 Tisztítási pH¹stabilitás: 1–14 Lineáris áramlási ráta 25 °C¹on, 1 bar, 15 cm¹es ágy (bed) magasság, XK 50/30 oszlop: 400–700 cm/h
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
Alternatív módon, a (0) ioncserélõ kromatográfiás lépés például Fractogel EMD TMAE HICAP gyantával (beszerezhetõ a Merck KGaA-tól, Darmstadt, Németország) vagy a hozzá hasonló, az alábbiakban bemutatotthoz tulajdonságokkal rendelkezõ gyantával is végrehajtható: Oszlop
Fractogel(R) EMD TMAE
Katalógusszám
1.16887
Részecskeméret, S¹típus
20–40 mm
Kromatográfia típusa
ioncserélõ kromatográfia
Funkcionális csoport
trimetil-amino-etil-csoport (Q¹típus)
Monomer szerkezet
CH2=CH–CONH–(CH2)2 N+(CH3)3
Proteinkötõ kapacitás
120 mg BSA/ml gél
pH-stabilitási tartomány
pH 2¹tõl pH 12¹ig
pK-érték
>13
Elúciós körülmények
magas sókoncentráció
Nyomási határérték (ágyazat 150×10 mm)
20 bar (a nyomás csökken az oszlopban)
Mûködési hõmérséklet
4 °C és szobahõmérséklet között
Tartósítószer
20% etanol
Használatra kész kazetta
50–10 mm
Tömeges kiszerelés, S¹típusok
100 ml, 500 ml
Lineáris áramlási ráta
1,27–6,35 cm/perc
Az ioncserélõ kromatográfiás lépés elõnyösen enyhén alkalikus pH¹jú (például 7,2¹es vagy a körüli és 9,0¹es vagy a körüli pH¹érték közötti, vagy 8,0¹es vagy a körüli és 9,0¹es vagy a körüli pH¹érték közötti, legelõnyösebben pedig 8,5¹es vagy a körüli pH¹értékû) pufferrel végezhetõ. Erre a célra megfelelõ pufferek például a borátpuffer, a trietanol-amin/imino-diecetsav Tris, az ammónium-acetát, a tricin, a bicin, a TES, a HEPES, valamint a TAPS. Leginkább elõnyös a 8,5¹es vagy a körüli pH¹értékû borátpuffer alkalmazása. Az ioncserélõ gyantáról történõ elúció a mobil fázis vezetõképességének só, elõnyösen NaCl hozzáadásával történõ fokozásával érhetõ el. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában az ioncserélõ kromatográfiában a terméket tartalmazó (ekvilibrációs, mosó- és eluáló¹) pufferek antioxidánst, elõnyösen L¹metionint tartalmaznak. A fentiekben már említést tettünk az erre a célra felhasználható egyéb antioxidánsokról. Mindezek alapján a találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: (0) anioncserélõ kromatográfia, elõnyösen erõs anioncserélõ gyantán [elõnyösen kvaterner ammóniumgyantán, amilyen például a Q Sepharose FF vagy a Fractogel EMD TMAE]; (1) színezékaffinitás-kromatográfia [elõnyösen Blue Sepharose FF¹en];
1
HU 004 110 T2
(2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia [elõnyösen Toyopearl Butyl 650M¹en]; (3) reverz fázisú kromatográfia [elõnyösen Source 30 RPC¹n]. 5 Opcionális további (–1) tisztítási lépés – ultrafiltráció/diafiltráció Az ioncserélõ kromatográfiás (0) lépést megelõzõen a nyers FSH koncentrálását célzó ultrafiltrációs lépésre is szükség lehet. Az ultrafiltráció (vagy diafiltráció) elvégzésére elõnyösen 3–10 kD vagy a körüli küszöbértékû, legelõnyösebben pedig 8 kD¹os vagy a körüli küszöbértékû membrán alkalmazásával kerül sor.
10
Opcionális további (4) tisztítási lépés – anioncserélõ kromatográfia A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti eljárás egy második anioncserélõ kromatográfiás lépést (4) is tartalmaz. Ebben elõnyösen Fractogel EMD TMAE HICAP gyanta (beszerezhetõ a Merck KGaA-tól, Darmstadt, Németország), vagy a fentiekben leírtak szerint ahhoz hasonló jellemzõkkel bíró gyanta alkalmazható. Alternatív módon, a második anioncserélõ kromatográfiás lépés Q Sepharose FF, vagy egyéb, a fentiekben leírtak szerint ahhoz hasonló jellemzõkkel bíró gyanta alkalmazásával végezhetõ el. Az anioncserélõ kromatográfiás, színezékaffinitáskromatográfiás, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás (HIC), reverz fázisú kromatográfiás és második anioncserélõ kromatográfiás lépések tetszõleges sorrendben hajthatók végre, bár elõnyös, ha elõször egy anioncserélõ kromatográfiás lépésre kerül sor. A fennmaradó színezékaffinitás-kromatográfiás, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás (HIC), RPC és opcionális második anioncserélõ kromatográfiás lépések tetszõleges sorrendben hajthatók végre, bár elõnyös, ha a következõ sorrendben követik egymást: (0) anioncserélõ kromatográfia, (1) színezékaffinitás-kromatográfia, (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC), (3) reverz fázisú kromatográfia RPC és (4) második anioncserélõ kromatográfia.
15
Opcionális további tisztítási lépés (5) – ultrafiltráció/diafiltráció A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában bármely kromatográfiás lépést követõen (de különösen egy reverz fázisú kromatográfiás lépés után) az FSH-minta koncentrálására kerülhet sor. Ez a lépés a kívánt vegyületet nagy mennyiségben tartalmazó termék kinyerése érdekében elõnyösen diafiltrációval kombinált ultrafiltrációval végezhetõ. Az ultrafiltráció (vagy diafiltráció) elvégzésére elõnyösen 3–10 kD vagy a körüli küszöbértékû, legelõnyösebben pedig 5 kD¹os vagy a körüli küszöbértékû membrán alkalmazásával kerül sor. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a következõ lépések elvégzésére az alábbi sorrendben kerül sor:
45
20
25
30
35
40
50
2
(–1) ultrafiltráció (elõnyösen 8 kD¹os vagy a körüli küszöbértékû membránnal); (0) anioncserélõ kromatográfia (elõnyösen Q Sepharose FF oszlopon); (1) színezékaffinitás-kromatográfia (elõnyösen Blue Sepharose FF oszlopon); (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) (elõnyösen Butyl 650M oszlopon); (3) reverz fázisú kromatográfia (RPC) (elõnyösen Source 30 RPC oszlopon); (4) anioncserélõ kromatográfia erõsen bázikus anioncserélõ gyantán (elõnyösen TMAE hicap gyantán); és (5) ultrafiltráció (elõnyösen 5 kD¹os küszöbértékû membránnal). Kívánt esetben, különösen az FSH-készítménynek a sejttenyészetbõl származó vírusokkal vagy vírusszerû részecskékkel történõ szennyezõdése veszélyének csökkentése érdekében, vírusmentesítõ lépésként, az FSH-minta nanofiltrációjára is sor kerülhet. A nanofiltráció a tisztítási folyamat bármely szakaszában elvégezhetõ, különösen elõnyös azonban az, ha a második ioncserélõ kromatográfiás, vagy a reverz fázisú kromatográfiás, vagy a hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás lépések után kerül rá sor. A nanofiltráció egynél többször, például kétszer is elvégezhetõ. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: (–1) ultrafiltráció (elõnyösen 8 kD¹os vagy a körüli küszöbértékû membránnal); (0) anioncserélõ kromatográfia (elõnyösen Q Sepharose FF alkalmazásával); (1) színezékaffinitás-kromatográfia (elõnyösen Blue Sepharose FF alkalmazásával); (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) (elõnyösen Butyl 650M alkalmazásával); (3) reverz fázisú kromatográfia (RPC) (elõnyösen Source 30 RPC alkalmazásával); (4) anioncserélõ kromatográfia erõsen bázikus anioncserélõ gyantán (elõnyösen TMAE hicap gyantán); (4’) nanofiltráció; (5) ultrafiltráció (elõnyösen 5 kD¹os küszöbértékû membránnal). A találmány szerinti megoldás elõnye, hogy a tisztítási eljárás nem tartalmaz költséges immunaffinitáskromatográfiás lépést, azonban ennek ellenére nagymértékben tiszta és specifikus biológiai aktivitással rendelkezõ FSH¹t eredményez. A találmány szerinti tisztított FSH nem tartalmaz továbbá az immunaffinitásos kromatográfiának köszönhetõ nemkívánatos szennyezõdéseket (például a gyantából kioldott immunglobulinokat).
55 Tárolás/liofilizálás A fentiekben ismertetett találmány szerinti tisztítási eljárás eredményeként kapott, tisztított FSH¹t tartalmazó folyékony keverék változatlan formában fagyasztva 60 tárolható, vagy liofilizálással (fagyasztva szárítással) 6
1
HU 004 110 T2
eltávolítható belõle az oldószer. Az így nyert folyékony vagy liofilizált termék az „ömlesztett FSH” („bulk”). FSH-kiszerelések A találmány szerinti, vagy a találmány szerinti eljárással tisztított FSH vagy FSH-variáns kiszerelhetõ intramuszkuláris vagy szubkután injekciós beadásra, elõnyösen szubkután beadásra szánt készítményként. Az FSH-kiszerelés lehet fagyasztva szárított, amely esetben azt közvetlenül az injekcióbeadás elõtt injekciókészítésre szolgáló vízben oldjuk fel. Az FSH-kiszerelés lehet folyékony is, ebben az esetben elõzetes feloldás nélkül, közvetlenül injektálható. Az FSH-kiszerelés egy- vagy többadagos egyaránt lehet. A többadagos kiszerelésnek elõnyösen bakteriosztatikus ágenst, például benzil-alkoholt, metakrezolt, timolt vagy fenolt, elõnyösen benzil-alkoholt vagy me-
2
takrezolt is tartalmaznia kell. Az egyadagos kiszerelések is tartalmazhatnak bakteriosztatikus ágenst. A találmány szerinti FSH ismert kötõanyagokkal és stabilizálószerekkel, például szacharózzal és mannitol5 lal is kiszerelhetõ. Tartalmazhat emellett antioxidánst, például metionint is. Tartalmazhat továbbá szörfaktánst, például TWEEN¹t (elõnyösen TWEEN 20¹at), vagy Pluronicot (elõnyösen Pluronic F68¹at). Egy különösen elõnyös többadagos kiszerelésben 10 a találmány szerinti eljárással elõállított FSH kiszerelésére szacharózzal, foszfátpufferrel (pH=7), Pluronic F68-cal, metioninnal és metakrezollal vagy benzil-alkohollal együtt, injekció készítésére szánt vízben oldva kerül sor. 15 A rekombináns FSH egy különösen elõnyös, szubkután vagy intramuszkuláris injekciós beadásra szánt, folyékony többadagos kiszerelése a következõ:
A többadagos folyékony FSH-kiszerelések összetevõi Összetevõ száma
Leírás
300 NE FSH
450 NE FSH
900 NE FSH
22,2 (305 NE)
33,3 (458 NE)
66,7 (916 NE)
30,0
45,0
90,0
1
rhFSH (mg/kazetta)
2
Szacharóz (mg/kazetta)
3
NaH2PO4H2O (mg/kazetta)
0,225
0,337
0,675
4
Na2HPO42H2O (mg/kazetta)
0,555
0,832
1,665
5
Pluronic F68 (mg/fiola)
0,050
0,075
0,150
6
Metionin (mg/fiola)
0,050
0,075
0,150
7
m-krezol (mg/fiola)
1,50
2,25
4,50
8
pH
9
injekció készítésére szánt víz
Javallatok A találmány szerinti FSH bármely, FSH¹t igénylõ kezelésben történõ igénybevételre alkalmas. Különösen alkalmas szubkután beadásra ovulációindukcióban, asszisztált reprodukciós technológiákban a szabályozott petefészek-hiperstimulációban, és az oligospermia kezelésében. Más gonadotropinokkal, például LH¹val és hCG-vel együtt is alkalmazható. Az FSH hatását erõsítõ további vegyületekkel, például klomifen citráttal, aromatáz gátlókkal, például Anastrozole-lal, Letrozole-lal, Fadrozole-lal és YM–511-gyel együtt is igénybe vehetõ.
7,0
7,0
7,0
szükség szerint 0,5 ml¹hez
szükség szerint 0,75 ml¹hez
szükség szerint 1,5 ml¹hez
40
45
50 Szekvenciák 1. azonosító számú szekvencia: humán glikoprotein a alegység 2. azonosító számú szekvencia: hFSH b alegység 3. azonosító számú szekvencia: hFSH b alegység 1. változat 4. azonosító számú szekvencia: hFSH b alegység 2. változat 5. azonosító számú szekvencia: hFSH b alegység 3. változat
55
60 7
A follikulus stimuláló hormon, vagy a leírásban alkalmazott FSH megnevezés a teljes hosszúságú, érett proteinként elõállított humán FSH¹ra (hFSH¹ra) vonatkozik. Az FSH a humán glikoprotein alfa alegységbõl és a humán FSH béta alegységbõl álló dimer. A humán glikoprotein alfa alegység szekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencia tartalmazza, a humán FSH béta alegység proteinszekvenciáját pedig a 2. azonosító számú szekvencia tartalmazza. A „rekombináns” kifejezés rekombináns DNS-technológiával (például WO 85/01958) elõállított FSH-készítményekre vonatkozik. FSH rekombináns technológiával történõ expresszálására szolgáló eljárásra példa eukarióta sejtek FSH egy alfa és béta alegységét kódoló DNS-szekvenciákkal történõ transzfektálása, függetlenül attól, hogy azokat egy vektor tartalmazza, vagy két vektor, ahol mindegyik alegységnek külön promotere van (lásd például az EP 0 211 894 és EP 0 487 512 számú európai szabadalmi iratokat). Az FSH¹t kódoló DNS lehet cDNS, vagy tartalmazhat intronokat. Az FSH rekombináns technológiával történõ elõállítására egy további példa az FSH egyik vagy mindkét alegységét kódoló endogén szekvenciákkal mûködõképes kapcsolat-
1
HU 004 110 T2
ban lévõ heterológ szabályozószegmens homológ rekombináció segítségével történõ inszertálása (lásd EP 0 505 500 számú európai szabadalmi irat; Applied Research Systems ARS Holding NV). A kitanítás részét képezik továbbá az olyan eljárások, mint a WO 99/57263 számú nemzetközi közzétételi iratban (Transkaryotic Therapies) közzétett, ahol az egyik alegységet heterológ módon sejtbe inszertálják, a másik alegységet pedig genomi szekvenciáknak egy heterológ szabályozószekvencia homológ rekombinációval történõ inszertálásának eredményeként bekövetkezõ aktiválásával expresszálják. A találmány szerinti eljárás alkalmas bármely itt említett vagy egyéb eljárással expresszált FSH tisztítására. A „rekombináns sejt” kifejezés heterológ DNS-nek a fentebb említett genetikai manipuláló módszerek bármelyikével végzett inszertálásával elõállított sejtre utal. Az FSH elõnyösen rekombináns módon, az FSH humán glikoprotein alfa alegységét és béta alegységét kódoló DNS¹t tartalmazó vektorral vagy vektorokkal transzfektált kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben állítható elõ. Az alfa és béta alegységeket kódoló DNS¹t ugyanaz a vektor vagy különbözõ vektorok tartalmazhatják. Az „FSH-variáns” kifejezés alatt aminosavszekvenciájukban, glikozilációs mintázatukban vagy alegységek közötti kötéseikben a humán FSH-tól eltérõ, de FSH-aktivitással rendelkezõ molekulákat értünk. Ilyenek például a CTP-FSH, egy hosszú hatástartamú módosított rekombináns FSH, ami vad típusú a alegységbõl és egy hibrid b alegységbõl áll, amelyben a hCG karboxiterminális peptidjét az FSH b alegység C¹terminálisával fuzionáltatták (lásd LaPolt és munkatársai: Endocrinology; 1992, 131, 2514–2520; vagy Klein és munkatársai: Development and characterisation of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50–56). Ilyen továbbá az egyláncú CTP-FSH, egy egyláncú molekula, amely a következõ szekvenciákat tartalmazza (az N¹terminálistól a C¹terminális felé haladva):
5
10
15
20
25
30
35
40 bFSH
bhCG-CTP(113–145)
aFSH
Ahol a bFSH az FSH b alegységét jelöli, a bhCGCTP(113–145) a hCG karboxiterminális peptidjét jelöli, az aFSH pedig az FSH a alegységét jelöli, lásd Klein és munkatársai [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chroionic gonadotrophin carboxyterminalpeptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248–1255]. További FSH-variánsok például az a és/vagy b alegységben további glikozilációs helyeket inkorporált FSH-molekulák, lásd például a WO 01/58493 számú nemzetközi közzétételi iratot (Maxygen), valamint az alegységek közötti S–S kötéseket tartalmazó FSH-molekulák, lásd például a WO98/58957 számú nemzetközi közzétételi iratot. További FSH-változatok például az FSH-ból és hCGbõl vagy LH¹ból származó szekvenciákat tartalmazó kiméra molekulák, lásd például a WO 91/16922 vagy WO 92/22568 számú nemzetközi közzétételi iratokat.
45
50
55
60 8
2
Az FSH-variánsok közé tartoznak a béta alegység karboxiterminális deléciói, amelyek rövidebbek a 2. azonosító számú szekvencián megadott teljes hosszúságú érett proteinnél. A humán béta alegység karboxiterminális delécióit a 3–5. azonosító számú szekvenciák tartalmazzák. A béta lánc karboxiterminális variánsai ismert alfa alegységgel komplexet képezve FSHvariáns heterodimert alakítanak ki. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az FSH elõállítása CHO sejtekben, rekombináns úton, szérumot tartalmazó vagy szérummentes tápközegben állítják elõ. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti eljárással elõállított tisztított FSH szubkután beadásra alkalmas, ennek köszönhetõen a páciens saját magát kezelheti vele. A „nyers rekombináns FSH” kifejezés az FSH¹t expresszáló sejtek tápközegének felülúszójára utal, mielõtt az bármely kromatográfiás lépésen esett volna át. Ez a kifejezés a felülúszó nyers (sejtek közül kinyert) formáját, valamint a koncentrált és/vagy filtrált és/vagy ultrafiltrált felülúszót egyaránt magában foglalja. Az FSH-aktivitással összefüggésben a „biológiai aktivitás” kifejezés egy FSH-kiszerelés FSH-hoz kapcsolódó biológiai válaszreakciót kiváltó képességére utal, ilyenek például a petefészek-tömegnövekedés a Steelman–Pohley vizsgálati eljárásban [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chroionic gonadotropin; Endocrinology; 1953, 53, 604–616], vagy nõpáciensben a tüszõnövekedés. A nõpáciensben bekövetkezõ tüszõnövekedés például ultrahangos vizsgálattal értékelhetõ, az alapján, hogy a stimuláció 8. napján hány tüszõ rendelkezik 16 mm¹es vagy a körüli átlagos átmérõvel. A biológiai aktivitás egy elfogatott FSH-standarddal összehasonlítva értékelhetõ. Egy FSH-készítmény LH¹tartalma például LH¹specifikus immunvizsgálati eljárás, például Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finnország) alkalmazásával állapítható meg. Az FSH-val kapcsolatban a „specifikus aktivitás” kifejezés a készítmény elismert biológiai vizsgálati eljárással, például Steelman–Pohley biológiai vizsgálati eljárással megállapított és NE¹ben kifejezett biológiai aktivitását jelenti, osztva a protein mennyiségével, amelyet a teljes proteintartalom meghatározására szolgáló vizsgálati eljárással határoznak meg, ilyen például a Lowry vizsgálati eljárás [O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr és R. J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Dulley és P. A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136], a Bradford vizsgálati eljárás [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248], vagy 280 nm¹en mért abszorbancia. A találmány szerinti eljárással nyert FSH elõnyösen 8000 NE/mg-nál nagyobb, elõnyösebben 9000 NE/mgnál nagyobb, még elõnyösebben 10 000 NE/mg-nál nagyobb, még elõnyösebben 14 000 NE/mg¹os vagy a körüli biológiai aktivitással rendelkezik, ahol a biológiai
1
HU 004 110 T2
aktivitás megállapítására Steelman–Pohley biológiai vizsgálati eljárást, a proteintartalom meghatározására SE¹HPLC¹t alkalmaznak. Az FSH-minták tisztasága a folyamat különbözõ lépéseiben például az alábbiakban felsorolt eljárásokkal ellenõrizhetõ. r-hFSH mennyiségi meghatározás/szabad alfa alegység/tisztaság/oxidált alakok: RP¹HPLC A fentiekben említettek szerint az FSH a és b alegységekbõl felépülõ heterodimer glikoprotein. Az alegységek bizonyos mértékû disszociációja elõfordulhat, ez a mintában lévõ szabad a alegység mennyiségének meghatározásával monitorozható. Emellett az FSH-alegységek oxidálódhatnak is. Az oxidálódott szennyezõ anyagok mennyiségének megállapítására RP¹HPLC vehetõ igénybe, a szabad alegységek meghatározására SDS-PAGE alkalmazható.
2
1. példa (vonatkozó ábra az 1. ábra) (1) lépés: Színezékaffinitás-kromatográfia Blue Sepharose-on A tisztítási folyamat kiindulóanyagaként szolgáló 5 FSH¹t rekombináns FSH¹t, vagyis szérumot tartalmazó vagy szérummentes sejttenyészetben tartott CHO sejtekben rekombináns úton elõállított FSH¹t tartalmazó sejttenyészet-felülúszóból állítottuk elõ. A színezékaffinitás-kromatográfiás oszlopot (Blue Sepharose FF 10 gyantát) elõször alacsony vezetõképességû, 8,5 pH¹értékû, L¹metionint tartalmazó pufferrel ekvilibráltuk. Az FSH¹t tartalmazó folyadékot ezután közvetlenül a gyantára juttattuk. A feltöltés után a nem kötõdött anyagot ekvilibrálópuffer alkalmazásával kimostuk. Az FSH¹t vé15 gül az oszlop NaCl¹ot és L¹metionint tartalmazó, 7,0 pH¹értékû nátrium-foszfát-pufferrel történõ átöblítésével eluáltuk. Az elúciós terméket közvetlenül a következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést 2–8 °C¹on végeztük. (2) lépés: Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) Toyopearl Butyl 650M oszlopon Az (1) lépésbõl származó Blue Sepharose FF eluátumot 7,0 pH¹értékû, ammónium-szulfátot és L¹metio25 nint tartalmazó nátrium-foszfát-pufferrel ekvilibrált Toyopearl Butyl 650M oszlopra töltöttük. A nem kötõdött anyagot ekvilibrálópuffer alkalmazásával kimostuk. Az FSH¹t csökkentett ammónium-szulfát-koncentrációjú ekvilibrálópufferrel eluáltuk. Az elúciós terméket a 30 következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést szobahõmérsékleten végeztük. 20
r-hFSH mennyiségi meghatározás: immunvizsgálati eljárás Egy minta FSH-tartalma FSH-specifikus immunvizsgálati eljárással, például DELFIA FSH immunvizsgálati eljárással határozható meg. Összprotein: Bradford vizsgálati eljárás, Lowry vizsgálati eljárás, 280 nm¹en mért abszorbancia Mint bármely proteinkészítmény esetében, az összes proteintartalom például Bradford vizsgálati eljárás, Lowry vizsgálati eljárás vagy 280 nm¹en mért abszorbancia meghatározásával állapítható meg. Izoalakmintázat: IEF Amint azt a fentiekben említettük, az FSH mindkét alegységén különbözõ pozíciókban több oligoszacharidláncot tartalmazó glikoprotein. Az oligoszacharidláncok különbözõ mértékben ágazódhatnak el, és sziálsavgyökök is boríthatják õket. A sziálsavgyökök (semleges pH¹értéken) negatív töltésûek. Az eltérõ fedettség heterogenitáshoz vezet, ami különbözõ izoelektromos ponttal (pI) rendelkezõ molekulák keverékét eredményezi. Ennek mértéke töltés szerinti elválasztáson alapuló technikával, például izoelektromos fokuszálással (IEF) határozható meg. Gazdasejtprotein (HCP) A gazdasejtekbõl származó fehérje meghatározására ELISA vizsgálati eljárás vehetõ igénybe. Például ellenanyagok termelhetõk FSH gén nélküli gazdasejtek tenyészete („áltenyészet”) ellen. Példák Az alábbiakban két példán keresztül mutatjuk be a találmány szerinti megoldást. Az említett két példát illusztráló folyamatábrák az 1. és 2. ábrán láthatók. A folyamat eredményeként kapott tisztított r¹hFSH¹t „ömlesztett r¹hFSH-nak” („bulk”) nevezzük.
35
40
45
50
(3) lépés: Reverz fázisú kromatográfia Source 30 RPC-n A (2) lépésbõl származó HIC eluátumot elõször IPA (izopropanol) hozzáadásával kondicionáltuk. Egy Source 30RCP oszlopot 7,6 pH¹értékû, L¹metionint és a kondicionált feltöltendõ anyagéval megegyezõ koncentrációjú 2¹propanolt tartalmazó ammónium-acetát-pufferrel ekvilibráltunk. A nem kötõdött anyag ekvilibrálópufferrel történt kimosását követõen a gyantát 7,6 pH¹értékû, L¹metionint és megnövelt koncentrációjú 2¹propanolt tartalmazó ammónium-acetát-pufferrel mostuk. Az FSH¹t végül a 2¹propanol koncentrációjának további emelésével eluáltuk. Az elúciós terméket végezetül keverés közben L¹metionint tartalmazó vízzel hígítottuk. A hígított eluátumot a következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést szobahõmérsékleten végeztük. A fenti folyamatot követve 40 000¹es tisztítási faktor érhetõ el [tisztítási faktor: a tisztított mintabeli FSH tisztaságának és a kiindulóanyagbeli FSH (nyers FSH) tisztaságának hányadosa].
2. példa (vonatkozó ábra a 2. ábra) (–1) lépés: A koncentrált r¹hFSH ultrafiltrációja/diafiltrációja Az összes mûveletet hûtés mellett (2–8 °C¹on) végeztük. A tisztítás kiindulóanyagaként szolgáló nyers FSH¹t rekombináns FSH¹t tartalmazó sejttenyészet-fe60 lülúszókból nyertük. 55
9
1
HU 004 110 T2
Derítés A nyers FSH¹t 0,5 mm mélységû (például Pall Profile II, vagy azzal egyenértékû) filterrel szûrtük. Ultrafiltráció A derített nyersanyagot elõször 10KD poliéterszulfon membrán alkalmazásával ultrafiltráltuk. A koncentrált visszamaradt anyagot ezt követõen elõször legalább 5 diatérfogat 8,5 pH¹értékû, antioxidánsként L¹metionint tartalmazó borátpufferrel szemben diafiltráltuk. A diafiltráció elõrehaladását a visszamaradt anyag vezetõképességének és pH¹értékének monitorozásával követtük nyomon. A visszamaradt anyagot a rendszer leengedése elõtt tovább koncentráltuk. Az ultrafiltrációs egységet végezetül diafiltrációs pufferrel mostuk, és a mosófolyadékot a kinyert visszamaradt anyaghoz kevertük. A kapott anyagot a következõ lépéshez vittük. Filtráció A koncentrált terméket 0,2 mm¹es poliéterszulfon filterrel (vagy azzal egyenértékû filterrel) szûrtük. (0) lépés: Anioncserélõ (kromatográfia) Q Sepharose FF¹en A szûrt anyagot mindezek után 8,5¹es pH¹értékû, L¹metionint tartalmazó nátrium-borát-pufferrel ekvilibrált erõs anioncserélõ gyantára (Q Sepharose FF¹re) vittük. A feltöltés után a nem kötõdött anyag teljes mennyiségének eltávolítása érdekében az oszlopot ekvilibrálópufferrel öblítettük át. Az oszlopot ezután (a vezetõképesség fokozása érdekében) NaCl¹ot (és antioxidánsként) L¹metionint tartalmazó 8,5¹es pH¹értékû nátrium-borát-pufferrel eluáltuk. A begyûjtött elúciós folyadékot a színezékaffinitás-kromatográfiához vittük. (1) lépés: Színezékaffinitás-kromatográfia Blue Sepharose-on A színezékaffinitás-kromatográfiás oszlopot (Blue Sepharose FF gyantát) elõször a Q Sepharose FF lépésben alkalmazott elúciós pufferrel ekvilibráltuk. A megkötött eluátumot ezután közvetlenül a gyantára vittük. A feltöltés után a nem kötõdött anyagot ekvilibrálópufferrel kimostuk. Végezetül az FSH¹t az oszlop 7,0 pH¹értékû, NaCl¹ot és L¹metionint tartalmazó nátrium-foszfát-pufferrel történt átöblítésével eluáltuk. A kinyert eluátumot közvetlenül a következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést 2–8 °C¹on végeztük. (2) lépés: Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia Toyopearl Butyl 650M-en A Blue Sepharose FF eluátumot 7,0 pH¹értékû, ammónium-szulfátot és L¹metionint tartalmazó nátrium-
5
2
foszfát-pufferrel ekvilibrált Toyopearl Butyl 650M oszlopra töltöttük. A nem kötõdött anyagot ekvilibrálópuffer alkalmazásával kimostuk. Az FSH¹t csökkentett ammónium-szulfát-koncentrációjú ekvilibrálópufferrel eluáltuk. Az elúciós terméket a következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést szobahõmérsékleten végeztük.
(3) lépés: Reverz fázisú kromatográfia Source 30 RPC-n A (2) lépésbõl származó HIC eluátumot elõször 10 IPA (izopropanol) hozzáadásával kondicionáltuk. Egy Source 30RCP oszlopot 7,6 pH¹értékû, L¹metionint és a kondicionált feltöltendõ anyagéval megegyezõ koncentrációjú 2¹propanolt tartalmazó ammónium-acetát15 pufferrel ekvilibráltunk. A nem kötõdött anyag ekvilibrálópufferrel történt kimosását követõen a gyantát 7,6 pH¹értékû, L¹metionint és megnövelt koncentrációjú 2¹propanolt tartalmazó ammónium-acetát-pufferrel mostuk. Az FSH¹t végül a 2¹propanol koncentrá20 ciójának további emelésével eluáltuk. Az elúciós terméket végezetül keverés közben L¹metionint tartalmazó vízzel hígítottuk. A hígított eluátumot a következõ lépéshez vittük. Ezt a lépést szobahõmérsékleten végeztük. 25 (4) lépés: Anioncserélõ kromatográfia Fractogel EMD TMAE hicap gyantán Egy Fractogel EMD TMAE hicap oszlopot L¹metionint tartalmazó, 8,5¹es pH¹értékû nátrium-borát-puffer30 rel ekvilibráltunk. A (3. lépés szerinti) RPC során nyert hígított anyagot az oszlopra töltöttük. A meg nem kötött anyagot ekvilibrálópufferrel öblítettük ki. Az FSH¹t a sókoncentráció lineáris emelésével eluáltuk az oszlopról. Ezt a lépést 2–8 °C¹on végeztük. 35 (4’) lépés: Nanofiltráció A (4. lépésbõl származó) Fractogel EMD TMAE eluátumot közvetlenül 20 nm¹es nanofiltrációs eszközre vittük, ahol 3 bar nyomáson, nitrogén alatt nanofilt40 ráltuk. A filtrátumot a következõ lépéshez vittük. Ezt a mûveletet 2–8 °C¹on végeztük. (5) lépés: Bulk ultrafiltráció A nanofiltrált FSH-anyagot 5KD poliéterszulfon 45 membránon végzett érintõáramlásos filtrációval („tangential flow filtration”) koncentráltuk. Amikor a visszamaradt anyag mennyisége elérte az eredeti térfogat kb. felét, az anyagot WFI-vel szembeni diafiltrációval pufferkicseréltük. 50 A minták tisztasága A tisztítási lépéseket követõen az FSH-minták tisztaságát a következõk szerint határoztuk meg:
Tisztítási lépés
Tisztaság
(–1) lépés: Ultrafiltráció/diafiltráció
19% FSH – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – totál protein tartalom meghatározás Bradford vizsgálati eljárással
10
1
HU 004 110 T2
2
Táblázat (folytatás) Tisztítási lépés
Tisztaság
(0) lépés: Anioncserélõ kromatográfia Q Sepharose FF oszlopon
44% FSH – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel
(1) lépés: Színezékaffinitás-kromatográfia Blue Sepharose oszlopon
68% FSH – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – totál protein tartalom meghatározás 280 nm¹en mért abszorbanciával vagy kb. 420 000 ppm HCP – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – gazdasejt protein tartalom meghatározás ELISA-val
(2) lépés: Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia Toyopearl Buryl 650M oszlopon
szennyezõdés mennyisége: 3400 ppm – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – gazdasejt protein tartalom meghatározás ELISA-val
(3) lépés: Reverz fázisú kromatográfia Source 30 RPC oszlopon
szennyezõdés mennyisége: 170 ppm – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – gazdasejt protein tartalom meghatározás ELISA-val
(4) lépés: Anioncserélõ kromatográfia Fractogel EMD TMAE hicap gyantán
szennyezõdés mennyisége: <80 ppm – FSH tartalom meghatározás RP¹HPLC-vel – gazdasejt protein tartalom meghatározás ELISA-val
A minták biológiai aktivitása A tisztított r¹hFSH biológiai aktivitását a Steelman–Pohley-féle petefészek-tömegnövekedési eljárással határoztuk meg. A specifikus aktivitást a biológiai aktivitás és a fentiekben ismertetett SE¹HPLC eljárással megállapított FSH-tartalom hányadosaként számítottuk ki. A végsõ bulk specifikus aktivitása jellemzõen 10 000 és 17 000 NE/mg közötti. A 2. példában ismertetett eljárást követve kapott két végsõ bulk FSH¹ra vonatkozó, jellemzõ példaként említett értékeket az 1. táblázat tartalmazza. 2. táblázat A találmány szerinti „bulk” tisztított rhFSH specifikus aktivitása Analízis
1. minta
2. minta
Proteinkoncentráció SE¹HPLC-vel (mg/ml)
0,61
0,54
Specifikus aktivitás (biológiai aktivitás/SE-HPLC)
25
30
35
40
12 600 NE/mg 14 600 NE/mg
45
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás rekombináns FSH vagy FSH-variáns tisztítására, amely szerint FSH¹t tartalmazó folyadékot tetszõleges sorrendben (1) színezékaffinitás-kromatográfiának; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiának; és (3) reverz fázisú kromatográfiának vetünk alá. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az (1) lépés szerinti színezékaffinitás-kromatográfia elvégzésére immobilizált Cibacron Blue F3G-A¹t tartalmazó gyantán kerül sor.
50
55
60 11
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az (1) lépés szerinti színezékaffinitás-kromatográfiára alkalmazott gyanta Blue Sepharose FF. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az (1) lépés szerinti színezékaffinitás-kromatográfia elvégzésére eluálószerként pontosan vagy körülbelül 6,5 és 11,5 közötti pH¹értékû nátrium-foszfát-puffer alkalmazásával kerül sor. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (2) lépés szerinti hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) elvégzésére Toyapearl Butyl 650M, vagy hasonló jellemzõkkel bíró gyanta alkalmazásával kerül sor. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (2) lépés szerinti hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) elvégzésére eluálószerként nátriumfoszfát/ammónium-szulfát alkalmazásával kerül sor. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (3) lépés szerinti reverz fázisú kromatográfiás lépés elvégzésére gyantaként Source 30 RPC alkalmazásával kerül sor. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (3) lépés szerinti reverz fázisú kromatográfiás lépés elvégzésére eluálószerként ammónium-acetát 2¹propanollal együtt történõ alkalmazásával kerül sor. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, mely eljárás lépéseinek elvégzésére a következõ sorrendben kerül sor: (1) színezékaffinitás-kromatográfia; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia; majd (3) reverz fázisú kromatográfia. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely tartalmaz egy anioncserélõ kromatográfiás (0) lépést is. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol az anioncserélõ kromatográfiás lépés elvégzésére az (1), (2) és (3) lépések elõtt kerül sor.
1
HU 004 110 T2
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, mely eljárás lépéseinek elvégzésére a következõ sorrendben kerül sor: (0) anioncserélõ kromatográfia; (1) színezékaffinitás-kromatográfia; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia; és (3) reverz fázisú kromatográfia. 13. A 10., 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a (0) lépés szerinti anioncserélõ kromatográfia elvégzésére Q Sepharose FF gyanta vagy Fractogel EMD TMAE HiCap gyanta alkalmazásával kerül sor. 14. A 10–13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (0) lépés szerinti ioncserélõ kromatográfia elvégzésére eluálószerként borátpuffer alkalmazásával kerül sor. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az alkalmazott borátpuffer pH¹ja pontosan vagy körülbelül 8,5. 16. A 10–15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely tartalmaz továbbá egy második anioncserélõ kromatográfiás (4) lépést is. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a (4) lépés szerinti második anioncserélõ kromatográfiás lépés elvégzésére az (1), (2) és (3) lépéseket követõen kerül sor. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, mely eljárás lépéseinek elvégzésére a következõ sorrendben kerül sor: (0) anioncserélõ kromatográfia; (1) színezékaffinitás-kromatográfia; (2) hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia; (3) reverz fázisú kromatográfia; és (4) anioncserélõ kromatográfia. 19. A 16–18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (4) lépés szerinti második anioncserélõ kromatográfiás lépés elvégzésére Fractogel EMD TMAE HiCap gyanta vagy Q Sepharose FF gyanta alkalmazásával kerül sor. 20. A 16–19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (4) lépés szerinti második anioncserélõ kro-
5
10
15
20
25
30
35
40
12
2
matográfiás lépés elvégzésére borátpuffer és növekvõ NaCl-koncentráció-gradiens alkalmazásával kerül sor. 21. A 16–20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a (4) lépés szerinti, második anioncserélõ kromatográfiás lépés elvégzését követõen egy nanofiltrációs (4’) lépésre is sor kerül. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, amely a (4’) nanofiltrációs lépést követõen egy (5) ultrafiltrációs lépést tartalmaz. 23. Az 1–22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott eluálószerek és/vagy pufferek bármelyike antioxidánst, különösen L¹metionint tartalmazhat. 24. Eljárás humán rekombináns FSH tisztítására, amelynek lépéseiben az FSH¹t a következõknek vetik alá: (–1) ultrafiltráció; (0) anioncserélõ kromatográfia Q Sepharose FF oszlopon, eluálószerként pontosan vagy körülbelül 8,5¹es pH¹jú borát/NaCl, L¹metionin alkalmazásával; (1) a (0) lépés szerinti eluátum színezékaffinitáskromatográfiája, Blue Sepharose FF és eluálószerként pontosan vagy körülbelül 7¹es pH¹jú foszfát, NaCl, L¹metionin alkalmazásával; (2) az (1) lépés szerinti eluátum hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiája, Toyopearl Butyl 650M és eluálószerként pontosan vagy körülbelül 7¹es pH¹jú foszfát, ammónium-szulfát, L¹metionin alkalmazásával; (3) a (2) lépés szerinti eluátum reverz fázisú kromatográfiája, Source 30 RPC és eluálószerként pontosan vagy körülbelül 7,6¹es pH¹jú ammóniumacetát, L¹metionin, 2¹propanol alkalmazásával; (4) a (3) lépés szerinti eluátum anioncserélõ kromatográfiája Fractogel EMD TMAE hicap gyanta és pontosan vagy körülbelül 8,5¹es pH¹jú borát, L¹metionin és NaCl alkalmazásával; (4’) a (4) lépés szerinti eluátum nanofiltrációja; és (5) a (4’) lépés szerinti permeátum ultrafiltrációja.
HU 004 110 T2 Int. Cl.: C07K 14/59
13
HU 004 110 T2 Int. Cl.: C07K 14/59
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest