!HU000008411T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 411
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 38/48
(21) Magyar ügyszám: E 03 796295 (22) A bejelentés napja: 2003. 08. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030796295 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1539226 A2 2004. 04. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1539226 B1 2010. 02. 10.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 402228 P 2002. 08. 09.
(73) Jogosultak: NORTH CAROLINA STATE UNIVERSITY, Raleigh, NC 27695-8210 (US); Bioresource International, Inc., Raleigh, NC 27606 (US)
US
(72) Feltaláló: SHIH, Jason, C.H., Cary, NC 27511 (US)
(2006.01) A23K 1/16 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04034776 PCT/US 03/024745
(74) Képviselõ: Kmethy Boglárka, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
HU 008 411 T2
(54)
Eljárás és készítmények hús típusú baromfi növekedésének megjavítására
A leírás terjedelme 14 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 411 T2
Keresztutalás rokon bejelentésekre Ez a bejelentés a 60/402 228 sorszámú, 2002. augusztus 9¹én benyújtott ideiglenes USA-beli bejelentés elsõbbségét igényli; e bejelentés tartalmát teljes egészében hivatkozásként iktatjuk be. Közlés szövetségi támogatásról Az erre a találmányra irányuló kutatást részben támogatja az Egyesült Államok Mezõgazdasági Minisztériumának 2002–33610–11850 számú kisvállalkozási innovációs kutatási ösztöndíja. A kormánynak bizonyos jogai vannak ebben a találmányban. A találmány területe A jelen találmány olyan kifejletlen és fejlõdõ állatok növekedési teljesítményét javító eljárásokra vonatkozik, amelyek állati tápot és állati tápkiegészítõket kapnak ugyanannak az eléréséhez. A találmány háttere A rántani való csirke (a továbbiakban brojlercsirke) indító étrendje jelentõs mennyiségû nyers proteint tartalmaz. A nyers protein legnagyobb részét hagyományos élelmiszer-alkotórészekbõl, így szójalisztbõl kapják. A szójalisztben (48% nyers proteintartalommal) jelen levõ nyers protein közelítõleg 90%¹a nagymértékben emészthetõ a baromfi számára [Országos Kutatási Tanács (1994), „Nutrient requirements in poultry” (A baromfi tápanyag-követelményei), 9. javított kiadás, National Academy Press, Washington, DC]. Bár a hagyományos kukorica-szójaliszt alapú brojlercsirke kezdõ étrendeket könnyen emészthetõnek tartják, azok gyakran tartalmaznak különbözõ komplex proteineket, amelyeket a fiatal csirke nem könnyen tud megemészteni annak következtében, hogy életének korai szakaszaiban hiányzanak a szükséges veleszületett enzimek [Uni et al., Poultry Sci. 78, 215–222 (1999)]. Javasolták proteázok beiktatását a brojlercsirkék étrendjébe, azonban proteáznak a szemesgabona-alapú étrendhez való hozzáadásával kapcsolatos korai munka nem eredményezett semmiféle javulást a madárteljesítményben [Jensen et al., Poultry Sci. 36, 919–921 (1957)]. Újabban némi javulást értek el a növekedési teljesítményben a baromfiétrendeknek enzimekkel, így proteázokkal és amilázokkal való kiegészítése révén [Creenwood et al., Poultry Sci. 81 (Suppl. 1): 25; Burrows et al., Poultry Sci. 81 (Suppl. 1): 29; Short et al., Poultry Sci. 81 (Suppl. 1): 136]. Kukorica-szója brojlercsirke kezdõ tápszer kiegészítése szilanáz, proteáz és amiláz keverékét tartalmazó enzimkészítménnyel a testsúlynövekedés javulását eredményezte a 14 napos kortól a 42 napos korig, anélkül azonban, hogy jelentõs hatások mutatkoztak volna a táplálékátalakítási arányban [Greenwood et al., supra (2002)]. Kereskedelmi szójaalapú kacsatápszerek kiegészítése ugyanezzel az enzimkeverékkel azt eredményezte, hogy javult a testsúlynövekedés és a táplálékátalakítási arány [Burrows et al., supra (2002)]. A baromfitápszer tartalmaz továbbá komplex táplálkozásellenes és/vagy emészthetetlen vegyületeket. E
5
10
15
20
25
30
35
40
2
vegyületek közül egyesek, így a nem keményítõ poliszacharidok vizet viszkózus masszává abszorbeálnak a gyomorfolyadékon belül, amelybõl nem könnyen abszorbeálódnak a tápanyagok [Odetallah, 2000; Odetallah et al., supra (2002)]. A gyomorfolyadék viszkozitásának növekedésével párhuzamosan csökken az emésztõenzimek és tápanyagok diffúziósebessége, ami gátolja a tápanyagnak a bélsejtek általi abszorpcióját. A zsírmicella-képzõdés és ¹abszorpció szintén csökken a gyomorfolyadék viszkozitásának növekedésével, ami rontja sok zsíroldható vegyület abszorpcióját, ideértve a zsíroldható vitaminokat, pigmenteket és lipideket [Ferket és Veldkamp (1999) In: Proceedings of the 1998 World Poultry Science Association, 43–52. oldal]. Ezért az endolitikus enzimaktivitással elõmozdított viszkozitáscsökkenés szerepet játszhat abban a javulásban, amelyet nagy viszkozitású gabonafélékkel táplált fiatal csirkéknél láthatunk, és úgy tûnik, hogy különbözõ enzimek viszonylagos hatékonysága összefüggésben lehet viszkozitáscsökkentõ képességükkel [Rotter et al., J. Sci. Food Agric. 50, 19–27 (1990)]. A PWD¹1 keratináz egy olyan enzim, amelyet Bacillus licheniformis PWD¹1 növekedési közegébõl tisztítással különítettek el [Williams et al., Appl. Environ. Microbiol. 56, 1509–1515 (1990); Lin et al., Appl. Environ. Microbiol. 58, 3271–3275 (1992)]. A PWD¹1 keratináz a proteinszubsztrátumok, így kazein, kollagén, elasztin és keratin széles körét hidrolizálja [Shih (2001) In: Proceedings International Conference of Agricultural Science and Technology, Beijing, China, 244–247. oldalak (1992)]. A PWD¹1 keratinázt felhasználták arra, hogy hidrolizált toll-lisztet adjon azáltal, hogy kereskedelmi toll-lisztet egy éjjelen át sejtmentes keratinázzal inkubálnak [Carter (1998) Bacterial Keratinase: Assay development and nutritional application. Ph. D. Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC]. Lásd még: 4 908 220 számú, 5 186 961 számú és 5 063 161 számú USA-beli szabadalmak Shih et al. nevére. A fentebb mondottak ellenére fennáll az igény további olyan eljárások iránt, amelyek javítják brojlercsirkék növekedési teljesítményét és az azt elõidézõ állati tápkiegészítõk hatékonyságát.
A találmány összefoglalása A jelen találmány olyan eljárásokat és készítményeket szolgáltat, amelyek javítják az állati tápszert kapó fejletlen és fejlõdõ állatok növekedési teljesítményét. A találmány egy szempontja hús típusú baromfi nö50 vesztési módszerére vonatkozik, amely abban áll, hogy az említett hús típusú baromfit baromfitápszerként kukorica-szójaliszt tápszerrel tápláljuk, ahol az említett baromfi étrendje nem tartalmaz 1 súly%-nál több kera55 tint, továbbá az említett tápszer keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatékonyan javítja az említett hús típusú baromfi súlygyarapodását. A találmány egy másik szempontja arra vonatkozik, hogy egy kukorica-szójaliszt táplálékot arra használunk 60 fel, hogy kiegészítjük vele hús típusú baromfi étrendjét, 45
2
1
HU 008 411 T2
ahol az említett felhasználás abból áll, hogy az említett táplálékot baromfi étrendjébe adagoljuk, ahol az említett étrend továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos az említett hús típusú baromfi súlynövekedésének a fokozásában, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. A találmány egy további szempontja arra vonatkozik, hogy egy kukorica-szójaliszt táplálékot arra használunk fel, hogy megjavítjuk hús típusú baromfiaknál egy állati táplálék tápszer-hasznosítási hatékonyságát, ahol az említett felhasználás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként adagoljuk, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatékony az említett hús típusú baromfiaknál egy állati táplálék tápszer-hasznosítási hatékonyságának megjavításában, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. A jelen találmány egy további szempontja arra vonatkozik, hogy felhasználunk egy kukorica-szójaliszt táplálékot egy állati táplálék emészthetõségének a javítására hús típusú baromfiaknál, ahol az említett felhasználás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként alkalmazzuk, ahol az említett táplálék még keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatékonyan növeli egy állati táplálék emészthetõségét az említett hús típusú baromfiaknál, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. A találmány egy másik szempontja arra vonatkozik, hogy kukorica-szójaliszt táplálékot felhasználunk hús típusú baromfi halálozási arányának a csökkentésére, ahol az említett felhasználás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként adagoljuk, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatékonyan csökkenti az említett hús típusú baromfi halálozási arányát, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. A találmány egy további szempontja olyan állati táplálékra vonatkozik, amely lényegileg szójalisztbõl, kukoricalisztbõl és keratinázból áll, ahol az említett állati táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. A találmány részletes leírása A fentebb mondottakat és a találmány egyéb szempontjait most részletesen leírjuk az itt ismertetett egyéb megvalósítási módokkal együtt. Figyelembe kell venni, hogy a találmányt különbözõ formákban lehet megvalósítani, és nem szabad az itt ismertetett megvalósítási módokra korlátozottan érteni. Ehelyett ezeket a megvalósítási módokat úgy közöljük, hogy ez a kinyilvánítás alapos és teljes legyen, és a szakemberek számára meg fogja teljes mértékben adni a találmány oltalmi körét. A találmány leírásában használt terminológia azt a célt szolgálja, hogy csupán a sajátos megvalósítási módokat írjuk le, és ezzel nem szándékozunk a találmányt korlátozni. A találmány leírásában és az ahhoz csatolt igénypontokban használt egyes számú „egy” és az „a” vagy „az” névelõk a többes számot is magukban foglalhatják, hacsak a szövegösszefüggésbõl nem világlik ki ennek az ellenkezõje.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Ha másképp nem határozzuk meg, az összes mûszaki és tudományos kifejezést olyan értelemben használjuk, miként azt az a szakember értelmezi, aki a találmány területén dolgozik. Az összes publikáció, amerikai szabadalmi bejelentés, amerikai szabadalom és itt idézett egyéb hivatkozások teljes terjedelmükben a leíráshoz tartoznak. Miként itt használjuk, a „hús típusú baromfi” kifejezés bármilyen szárnyas fajra vonatkozik, amelyet húsfogyasztás céljából tenyésztenek vagy használnak, miként ezt egy szakember érti. Az ilyen szárnyas fajok példái magukban foglalják a csirkéket, pulykákat, kacsákat, libákat, fürjeket, fácánokat, struccféléket és hasonlókat, de nincsenek azokra korlátozva. Miként itt használjuk, a „fejletlen madár” kifejezés a szárnyas fajnak egy olyan tagjára vonatkozik, amely nélkülözi a teljes növekedést, differenciálódást vagy kifejlõdést. Az ilyen tagok rendelkezhetnek azzal a képességgel, hogy a végleges érett formát vagy állapotot érjék el. Egy fejletlen madár kb. 1 napostól kb. 50 napos korú lehet, elõnyösen kb. 1 napostól kb. 25 napos korú lehet, és még elõnyösebben kb. 1 napostól kb. 5 naposig terjedõ korú lehet, vagy olyan testsúlyú lehet, amely összehasonlítható az ilyen határok közötti madarak súlyával. Miként itt használjuk, a „fejlõdõ madár” kifejezés a szárnyas faj olyan tagjára vonatkozik, amely idõsebb vagy nagyobb súlyú, mint egy kifejletlen madár. Miként itt használjuk, a „kifejlett madár” kifejezés a szárnyas faj egy olyan tagjára vonatkozik, amely idõsebb vagy nagyobb súlyú, mint egy fejlõdõ madár. Miként itt használjuk, a „brojlercsirke” kifejezés olyan kifejletlen csirkére vonatkozik, amelyet húsfogyasztás céljából tenyésztünk vagy végül felhasználunk. Miként itt használjuk, a „baromfiétrend” kifejezés olyan étrendre vonatkozik, amelyet a szárnyas faj egy tagjának adagolunk annak érdekében, hogy elõmozdítsuk és fenntartsuk a madár növekedését. Egy baromfiétrend protein¹, vitamin¹, ásványianyag- és energiaforrásokat tartalmazhat, így zsírt, szénhidrátokat és további proteint, antibiotikumokat és egyéb olyan anyagokat vagy vegyületeket, amelyekrõl ismert, hogy hozzáadhatók állati eledelekhez, különösen baromfieledelekhez. A baromfiétrend magában foglalja, de nem korlátozódik a kezdeti étrendre, a növekedés típusú étrendre és a befejezõ típusú étrendre. Az „indító étrend” olyan étrendre vonatkozik, amely adagolható egy állatnak, kezdve annak születésétõl vagy kikelésétõl a kívánt korig és/vagy a kapott súlyig. Egy „növelõ típusú” étrend olyan étrendre vonatkozik, amelyet egy állatnak a kiindulási-növekedési fázis befejezõdéséig lehet adni. A „befejezõ típusú étrend” olyan étrendre vonatkozik, amelyet egy állatnak a fejlõdési idõszak alatt a leölés idõpontjáig lehet adagolni. Miként itt használjuk, a „növekedés” vagy „növekedésteljesítmény” kifejezések a súly- és/vagy a méretnövekedésre (például magasság, szélesség, átmérõ, körtérfogat stb. növekedésére) vonatkoznak azon a nö-
1
HU 008 411 T2
vekedésen túl, amely egyébként bekövetkezne a jelen találmány szerinti módszerek és/vagy adagolás alkalmazása nélkül. A növekedés vonatkozhat a teljes állat vagy egy sajátos szövet (például izomszövet általában vagy sajátos izom) tömegének (például súlyának vagy méretének) a növekedésére. Másként a növekedés jelölhet relatív növekedést egy szövet tömegében egy másik szövet növekedéséhez viszonyítva, különösen izomszövet-növekedést más szövetek (például adipózszövet) növekedéséhez viszonyítva. A növekedés továbbá vonatkozik a táplálkozási állapotra és a betegségekkel szembeni ellenállásra, ahol a táplálkozási állapot és/vagy a betegséggel szembeni ellenállás növekedésének javulása is jelzi a megjavult növekedési teljesítményt. Az elõzõkre tekintettel a jelen találmány szerinti megvalósítási alakok vonatkoznak hús típusú baromfi tenyésztési módszereire, amely abban áll, hogy hús típusú baromfit állati táplálék baromfiétrendjével táplálunk, ahol a táplálék tartalmaz továbbá keratinázt, amelyet hozzáadunk a baromfiétrendhez olyan mennyiségben, amely hatékonyan elõmozdítja a hús típusú baromfi súlynövekedését. A baromfiétrend olyan állati táplálék lehet, amely magában foglal proteinforrásokat, például szójalisztet, hallisztet, vérlisztet, baromfi-melléktermékeket (õrölt baromfibelsõséget), húslisztet, gabonalisztet, repcemagot, repceolajat és azok kombinációit. Az állati táplálék továbbá magában foglal szénhidrátokat, például kukoricát, zabot, árpát, cirokot vagy ezeknek a kombinációit, amelyeket lisztté lehet õrölni állati táplálékban való felhasználáshoz. Továbbá az állati eledel tartalmazhat vitaminokat, ásványokat, zsírt, antibiotikumokat és egyéb szükséges vagy kívánt anyagokat vagy vegyületeket. Az állati táplálék baromfiétrend nem korlátozó példáiként megemlítjük a gabonaalapú táplálékokat, ideértve a gabonaféléket, így az árpát, kukoricát, szóját, búzát, búza és rozs keresztezése útján létrehozott gabonafélét és rizst. A kukoricaszója, búza-szója és búza-kukorica-szója, továbbá a cirok-szója és a kukorica-cirok-szója egyéb nem korlátozó példái a jelen találmány szerinti megfelelõ állati eledeleknek. Amikor a baromfiétrend kukorica-szójaliszt keveréke, a kukorica-szójaliszt táplálék kb. 60 súly%-tól kb. 70 súly%¹ig terjedõ mennyiségû kukoricát és 20 súly%-tól kb. 30 súly%¹ig terjedõ mennyiségû szóját tartalmaz. A baromfiétrendet továbbá osztályozhatjuk mint indító étrendet, növelõ típusú étrendet vagy befejezõ típusú étrendet. Az állati táplálék összetétele attól a fajtól függ, amelynek számára a táplálékot szánjuk, az állat korától és/vagy súlyától és a táplálás idõtartamától, és azt a szakemberek könnyen meg tudják határozni. A jelen találmány megvalósítási módjai szerint a hús típusú baromfi tenyésztési módszerei nem igénylik, hogy egyidejûleg biztosítsunk sajátos keratintartalmú szubsztrátumot a keratinázzal együtt. Például a jelen találmány szerinti megvalósítási módok esetén a keratináz közvetlenül pótolhat egy baromfiétrendet táplálékadalékként, ellentétben a hidrolizált toll-liszt elõállítással, amit Carter írt le 1998-ban.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
A jelen találmány szerinti alkalmazásra alkalmas keratinázt Bacillus licheniformis PWD¹1 törzsébõl kapjuk, amit leírtak a 4 908 220 és 4 959 311 számú USAbeli szabadalmi leírásokban (az itt idézett összes szabadalmi bejelentés kinyilvánítása hivatkozásként van a jelen leírásba beiktatva). Ezt a baktériumot az American Type Culture Collectionnél (ATCC) deponálták Rockville-ben, MD, USA, az 1988. március 23¹i Budapesti Szerzõdés szerint, és a letett törzs az ATCC 53757 letéti számot kapta. A jelen találmány szerint felhasználható egyéb keratinázok különbözõ baktériumforrásokból nyerhetõk, amilyen a Streptomyces fradiae. Lásd általánosságban a 2 988 487 számú USA-beli szabadalmi leírást, amelyet Nickerson kapott; lásd még: Goktan, D., „Decomposition Rates of Keratinous Material Used by Certain Microorganisms” (Bizonyos mikroorganizmusok által felhasznált keratinszerû anyagok lebomlási sebességei) (Abstract No. 207369b), Microbial Biochem. 101, 333 (1984); Daniels, G.; „The Digestion of Human Hair Keratin by Microsporum Canis” (A humán hajkeratin emésztése Mikrosporum canis által), J. Gen. Microbiol. 8, 289 (1953); Koh, W. et al., „Keratinolytic Enzymes from Aspergillus flavus and Aspergillus niger” (Keratinolitikus enzimek Aspergillus flavusból és Aspergillus nigerbõl), Bacillus. Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959); Molyneaux, G. S., „The Digestion of Wool by a Keratinolytic Bacillus” (Gyapjú emésztése keratinolitikus bacillus által), Aust. J. Biol. Sci. 274 (1959); Noval, J. és Nickerson, W., „Decomposition of Native Keratin by Streptomyces fradiae” (Natív keratin lebontása Streptomyces fradiae által), J. Bacteriol. 77, 251 (1959); Kapica, L. és Blank, F., „Growth of Candida parapsilosis with Keratin as Sole Source of Nitrogen” (Candida parapsilosis növekedése keratinnal mint egyetlen nitrogénforrással), Dermatologica 117, 433 (1958); Kapica, L. és Blank, F., „Growth of Albicans on Keratin as Sole Source of Nitrogen” (Albicans növekedése keratinon mint egyetlen nitrogénforráson), Dermatologica 115, 81 (1957). A jelen találmány megvalósításához a keratinázt úgy nyerhetjük, hogy keratinázt kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmazó gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek lehetõvé teszik a kódolt keratináz expresszálását, leszûrjük a közeget a sejtek eltávolítása céljából, majd a visszamaradó felülúszót összegyûjtjük és betöményítjük ultraszûréssel a keratináz kinyerése céljából. Bár itt B. licheniformis törzseket ismertetünk példaként, úgy gondoljuk, hogy egyéb olyan eukarióta és prokarióta mikrobák, amelyek keratinázt kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmaznak, szintén hasznosak lehetnek a jelen találmány szerinti állati táplálékkiegészítõ elõállításában. Keratinázt kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmazó eukarióta és prokarióta mikrobák lehetnek olyanok, amelyek természetesen termelik az enzimet, valamint olyan törzsek, amelyeket genetikusan módosítottak keratináz expresszálására. Általában egy protein rekombináns termelése megkívánhatja olyan nukleinsavszekvenciák beiktatását, amelyek egy rekombináns expressziós vektorba kódolják az említett
1
HU 008 411 T2
proteint olyan alakban, amely alkalmas a protein expresszálására egy gazdasejtben. Az expresszálás megfelelõ formája lehetõvé teszi, hogy a rekombináns expressziós vektor egy vagy több olyan szabályozószekvenciát tartalmazzon, amely mûködõképes állapotban van kapcsolva a keratináz proteint kódoló nukleinsavakhoz olyan módon, amely lehetõvé teszi nukleinsavak mRNS¹re való átírását és az mRNS-nek a proteinre való transzlációját. A szabályozószekvenciák magukban foglalhatnak promotereket, fokozókat és egyéb expressziót szabályozó elemeket (például poliadenilezõ jeleket). Az ilyen szabályozószekvenciák ismertek a szakemberek számára, és le vannak írva Goeddel D. D. kiadásában a Gene Expression Technology (Génexpressziós technológia) címû könyvben, Academic Press, San Diego, CA (1991). Figyelembe kell venni, hogy az expressziós vektor kialakítása olyan tényezõktõl függhet, mint a transzfektálandó gazdasejt kiválasztása és/vagy a szükséges expresszió szintje. A gazdasejtbe bevihetünk olyan nukleinsavszekvenciákat vagy expressziós vektorokat, amelyek keratináz proteint kódoló nukleinsavszekvenciákat foglalnak magukban; ez a gazdasejt lehet eukarióta vagy prokarióta eredetû, és a bevitelt végezhetjük sejtek átalakítására szolgáló szokásos módszerekkel. A gazdasejtek átalakítására szolgáló szokásos módszerek megtalálhatók Sambrook et al. alábbi könyvében: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv), 3. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000), és egyéb laboratóriumi kézikönyvekben. A keratináz proteint kódoló nukleinsavszekvenciával transzformált gazdasejtek száma legalább részben a felhasznált rekombináns expressziós vektor típusától és az alkalmazott transzformációs technika típusától függ. A nukleinsavakat egy keratináz protein ideiglenes vagy – jellegzetesebben – hosszú távú expressziójára iktathatjuk be egy gazdasejtbe, ahol a nukleinsavszekvencia stabilan integrálódik a gazdasejt genomjába, vagy stabil episzómaként marad a gazdasejtben. Elõállítása után egy keratináz proteint szekretált polipeptidként nyerhetünk ki egy tápközegbõl, bár kinyerhetõ a gazdasejtlizátumokból is, amikor szekréciós jel nélkül közvetlenül expresszáljuk. Eukarióta mikrobákat, így élesztõkultúrákat transzformálhatunk keratinázt kódoló nukleinsavszekvenciákat hordozó vektorokkal. Lásd például a 4 745 057 számú USA-beli szabadalmi leírást. A Saccharomyces cerevisiae a legáltalánosabban használt az alacsonyabb eukarióta gazda-mikroorganizmusok között, bár számos egyéb törzs is általánosan hozzáférhetõ. Az élesztõvektorok tartalmazhatnak egy 2 mikronos élesztõplazmidból származó replikációs forrást vagy egy autonóm replikációs szekvenciát (ARS), egy promotert, egy DNS¹t kódoló keratinázt – amilyet például az 5 712 147 számú USA-beli szabadalmi leírás ismertet –, poliadenilezésre szolgáló szekvenciákat és transzkripciós végzõdést és egy szelekciós gént. Egy példaként említett plazmid az YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Élesz-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
tõvektorokban megfelelõ támogatószekvenciák lehetnek a metallotionein promoterei, a 3¹foszfoglicerát-kináz [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] vagy egyéb glikolitikus enzimek [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)]. Az élesztõexpresszálásban történõ felhasználásra szolgáló megfelelõ vektorok és promoterek vannak továbbá leírva a 73 657 számú európai szabadalmi bejelentésben. Továbbá gombatörzsek, így a Trichoderma-törzsek (például T. longibrachiatum, T. reesei vagy T. viride) különösen hasznosak a szekretált enzimek expresszálásában. Keratináz elõállítására felhasználható prokarióta gazdasejtek lehetnek Gram-negatív vagy Gram-pozitív organizmusok, pl. Escherichia coli (E. coli) vagy Bacilli. A gazdasejtek példáiként említjük az E. coli W3110¹et (ATCC 27 325), az E. coli B¹t, az E. coli X1776¹ot (ATCC 31 537), az E. coli 294-et (ATCC 31 446). A megfelelõ prokarióta és mikrobiális vektorok széles köre áll rendelkezésre. Az E. coli jellegzetesen transzformálható pBR322 használatával. A legáltalánosabban használt promoterek rekombináns mikrobiális expressziós vektorokban a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz-promoter rendszerek [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], egy triptofán (trp) promoterrendszer [Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); 36 776 számú európai közrebocsátási irat] és a tac promoter [De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 (1983)]. A promoter és Shine–Delgarno-szekvencia (prokarióta gazdaexpresszióhoz) operábilisan van kapcsolva a keratinázt kódoló DNS-hez, vagyis úgy vannak pozicionálva, hogy segítsék a keratináz messenger RNS transzkripcióját a DNS-rõl. Egy Bacillus-fajt elõnyösen használunk egy keratináz elõállításában. A Bacillus rekombináns expressziós vektorai jól ismertek a szakemberek számára. A Bacillus-törzsek lehetnek B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. circulans, B. coagulans, B. firmus, B. lautus, B. lentus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. subtilis és B. thuringiensis. Egy elõnyös kiviteli alak szerint B. licheniformis törzseket használunk. Bizonyos kiviteli alakok esetén B. licheniformis T399D vagy PWD¹1 törzseket használunk. Miként itt lehetõvé tesszük, egy keratináz enzimet úgy állíthatunk elõ, hogy egy fentebb leírt gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztünk, amelyek lehetõvé teszik a kódolt keratináz expresszióját, és összegyûjtjük az expresszált keratinázt. A gazdasejtet olyan körülmények között tenyészthetjük, amelyek mellett a sejt növekszik, és azután olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek a kódolt keratináz expresszióját okozzák, vagy pedig ugyanakkor azt is elõidézhetjük, hogy a sejtek növekedjenek, és expresszálják a kódolt keratinázt. Az ilyen körülmények jól ismertek a szakemberek számára, és változhatnak a gazdasejttel és a kívánt enzim expressziós szintjének mértékével. Egyes megvalósítási módok esetén a transzformált gazdasejtek tenyésztésére használt közeg bármilyen közeg lehet, amely alkalmas keratináz elõállítására.
1
HU 008 411 T2
A keratinázt szokásos technikával nyerjük ki a közegbõl, ideértve a sejtek centrifugálással vagy szûréssel történõ elkülönítését a közegtõl, és a proteinek koncentrálását a felülúszóban vagy a szûrletben ultraszûréssel vagy bepárlással, amit liofilizálással végzett szárítás vagy permetezve szárítás követ. Egy másik megvalósítási mód szerint a tenyészközeg felülúszóját permetezve száríthatjuk, vagy liofilizálhatjuk elkülönítés után, betöményítés nélkül. A keratináznak olyan mennyiségben kell jelen lennie, amely elegendõ a kívánt hatás eléréséhez, de a keratináz mennyiségének felsõ határát úgy lehet meghatározni, hogy elérjük a szándékolt hatást. Egyes kiviteli alakok esetén az állati táplálék kb. 0,01 súly%-tól kb. 20 súly% Bacillus licheniformis PWD¹1 keratinázt tartalmaz. Továbbá a jelen találmány megvalósításában használt keratinázok nyers formában vagy tiszta formában lehetnek. A nyers formájú keratinázokat úgy lehet például elõállítani, hogy a baktériumsejteket, amelyek a keratinázt termelik, elkülönítjük folyékony tápközegüktõl, ahol a folyékony tápközeg nyers keratinázt tartalmaz. Egy másik megvalósítási mód szerint a sejteket lizálhatjuk (kémiailag vagy fizikailag) egy folyékony tápközegben, és így nyers, sejtmentes extraktumot állítunk elõ. Az ilyen extraktum készítésének egyéb módszerei nyilvánvalók lesznek a szakemberek számára. A nyers keratináz beiktatható a táplálékba azzal kompatibilis bármilyen alakban, így vizes formában vagy liofilizált formában. Egyes kiviteli alakok esetén a nyers keratináz liofilizált alakban van. Tiszta (vagy lényegileg tiszta) keratinázt úgy kaphatunk, hogy a fentebb leírt nyers keratinázt különálló alkotórészeire különítjük el ismert módszerekkel. Lásd általában W. Jakoby, Ed., „Enzyme purification and Related Techniques, Methods in Enzymology” (Enzimtisztítás és rokon technikák, módszerek az enzimológiában), 22. kötet (1971) és 104. kötet C rész (1984), Academic Press, NY. A szakemberek számára számos megfelelõ elkülönítési eljárás, így az oszlopkromatografálás ismert. A különálló alkotó proteineket rostálni lehet abból a szempontból, hogy mennyire képesek elbontani keratinszerû anyagot, és az az alkotórész képezi a keratinázt, amely a legjobban lebontja a keratinszerû anyagot. Miként a nyers keratináz, úgy a tiszta keratináz is felhasználható bármilyen megfelelõ formában, ideértve a vizes alakot és a liofilizált alakot. A jelen találmány megvalósítási módjai vonatkoznak továbbá olyan módszerekre, amelyek javítják hús típusú baromfiaknál egy állati eledel táplálék felhasználásának a hatékonyságát, ahol hús típusú baromfit állati táplálék baromfiétrenddel táplálunk, ahol a táplálék továbbá keratinázt is tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos a hús típusú baromfi számára adagolt állati táplálék felhasználási hatékonyságának növelésére. Az állati táplálék magában foglalhatja a fentebb leírt állati táplálékokat, és sajátos megvalósítási formák esetén kukorica-szójaliszt lehet. A keratináz tartalmazhat fentebb leírt keratinázokat, ideértve a korlátozás szándéka nélkül a Bacillus licheniformis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
PWD¹1 keratinázt. Miként fentebb leírtuk, a keratináz lehet nyers extraktum vagy tiszta formájú enzim. A táplálékfelhasználás hatékonyságának javítása a táplálékátalakítási arány (Feed Conversion Ratio, FCR) csökkentésére vonatkozik, ahhoz viszonyítva, amit egyébként kapnánk a jelen találmány szerinti készítmények adagolása vagy módszerek alkalmazása nélkül. Az FCR az elfogyasztott táplálék mennyiségének az állat súlygyarapodásához viszonyított aránya. A jelen találmány egy megvalósítási módja esetén megnöveljük a gyomor- és bélrendszerben bekövetkezõ tápanyag-abszorpciót anélkül, hogy egyidejûleg növelnénk a bélben az energiafogyasztást. A jelen találmány egy másik megvalósítási módja esetén a táplálékhasznosítás hatásfokának javítása úgy történhet, hogy megnöveljük az állati táplálék emészthetõségét. A jelen találmány egy másik megvalósítási módja esetén a táplálékhasznosítás hatásfokának megjavítása úgy történhet, hogy csökkentjük az állati táplálék viszkozitását. Sajátos megvalósítási módok esetén a jelen találmány olyan módszerekre vonatkozik, amelyek növelik egy hús típusú baromfiban az állati táplálék emészthetõségét, ahol a hús típusú baromfival olyan állati táplálék baromfiétrendet alkalmazunk, ahol a táplálék tartalmaz továbbá Bacillus licheniformis PWD¹1 keratinázt olyan mennyiségben, amely hatásos egy hús típusú baromfiban egy állati táplálék emészthetõségének a növelésére. Az állati táplálék a fentebb leírt állati eledeleket tartalmazhatja, és sajátos megvalósítási módok esetén kukorica-szójaliszt lehet. A keratináz fentebb leírt keratinázokat tartalmazhat, ideértve a korlátozás szándéka nélkül a Bacillus licheniformis PWD¹1 keratinázt. Miként fentebb leírtuk, a keratináz lehet nyers kivonat vagy tiszta alakú enzim. Egy állati táplálék emészthetõségének a megnövelése arra vonatkozik, hogy megnöveljük az állati bélbõl abszorbeált tápanyagok elérhetõségét anélkül, hogy egyidejûleg növelnénk a táplálékbevitelt vagy a táplálékfogyasztást. A jelen találmány egyes megvalósítási módjai esetén az állat ételében vagy a megemésztett táplálékban jelen levõ anyagok viszkozitása csökken. Más megvalósítási módok esetén csökken azoknak a tápanyagoknak a megtartása, amelyek az állat számára táplálkozási szempontból értéktelenek. Más megvalósítási módok esetén a találmány olyan eljárásokra vonatkozik, amelyekkel csökkenteni lehet hús típusú baromfi halandóságát, amely abban áll, hogy hús típusú baromfinak állati táplálék baromfiétrendet adagolunk, ahol a táplálék tartalmaz továbbá egy keratinázt olyan mennyiségben, amely hatékonyan csökkenti hús típusú baromfi, például fejletlen madarak és különösebben brojlercsirkék halandóságát. Az állati eledel magában foglalhat fentebb leírt állati eledeleket, és sajátos megvalósítási módok esetén kukorica-szójaliszt lehet. A keratináz magában foglalhat fentebb leírt keratinázokat, ideértve a korlátozás szándéka nélkül a Bacillus licheniformis PWD¹1 keratinázt. Miként fentebb leírtuk, a keratináz lehet nyers kivonat vagy tiszta alakú enzim. A halandóság csökkentése arra vonatkozik, hogy növeljük az életbenmaradási képességet
1
HU 008 411 T2
vagy csökkentjük a halálozási arányt az állatokban születés vagy kikelés után ahhoz viszonyítva, ami egyébként következne be a jelen találmány szerinti módszerek alkalmazása vagy készítmények adagolása nélkül. A halandóságot bármilyen ok elõidézheti, különösen stressz, fejlõdésben visszamaradás, „kiéltetés” és betegség. Egyes megvalósítási módok esetén a jelen találmány csökkenti a halandóságot fejletlen madarakban. Más megvalósítások esetén a madarak kb. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21‚ 22, 23, 24, 25, 26, 27, 25, 29, 31, 32, 33, 34 vagy 35 napos korúak, elõnyösen kb. 1 napostól kb. 21 naposig terjedõ korúak, és még elõnyösebben kb. 1 napostól kb. 5 naposig terjedõ korúak. Elõnyös megvalósítás esetén a jelen találmány olyan állati táplálékra vonatkozik, amely fõ komponensekként proteint, szénhidrátot és keratinázt tartalmaz. A keratináz egy fõ komponens, amely kiegészíti az állati táplálékot. Az állati táplálék tartalmazhatja a fentebb leírt állati táplálékokat, és sajátos megvalósítási módok esetén kukorica-szójaliszt lehet. A keratináz tartalmazhat fentebb leírt keratinázokat, de – arra nem korlátozva – Bacillus licheniformis PWD-1¹et. Miként fentebb leírtuk, a keratináz lehet nyers kivonat vagy tiszta alapú enzim. A jelen találmány által szolgáltatott állati tápanyagkiegészítést közvetlenül hozzá lehet keverni az állati táplálékhoz, így az árpát tartalmazóhoz a végsõ táplálék elõállítása céljából. Egy másik megvalósítási mód szerint az állati táplálékkiegészítõt össze lehet keverni egy vagy több egyéb állati táplálékkiegészítõvel, így vitaminnal mint állati táplálékkiegészítõvel, ásványi állati táplálékkiegészítõvel és aminosav állati táplálékkiegészítõvel. Az így kapott állati táplálékkiegészítõ, amely számos különbözõ típusú komponenst tartalmaz, ezután megfelelõ mennyiségben hozzákeverhetõ az állati táplálékhoz. A jelen találmány szerinti állati táplálék keratinázt tartalmaz legalább olyan mennyiségben, amely elegendõ a szándékolt hatás eléréséhez, ahol a keratináz mennyiségének felsõ határát meg lehet határozni a szándékolt hatás elérése alapján. A szándékolt hatások lehetnek a korlátozás szándéka nélkül az állati növekedés fokozása, így a súlynövekedés, a táplálékhasznosítás hatásfokának javítása, a táplálék emészthetõségének növelése és a halandóság csökkentése. Az állati táplálékhoz adott állati táplálékkiegészítõ tartalmazhat 100 súly%¹ig terjedõ mennyiségû keratinázt. A kiegészítõt tartalmazó állati eledel kb. 0,01 súly%-tól kb. 5 súly%¹ig terjedõ mennyiségû keratinázt tartalmaz. Egyes megvalósítási módok esetén a keratináz Bacillus licheniformis PWD¹1 keratináz. Bármilyen állat alávethetõ a jelen találmánynak, ideértve a teheneket, juhokat, disznókat, macskákat, kutyákat, menyéteket és szárnyasokat, azonban a jelen találmányt elõnyösen alkalmazzuk egygyomrú állatoknál. A megfelelõ alanyok bármilyen korúak lehetnek, ideértve a koraszülött állatokat, a fejlõdõ állatokat és a kifejlett állatokat. Egyes megvalósítási módok esetén a megfelelõ alany lehet egy szárnyas, elõnyösen egy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
csirke, még elõnyösebben egy brojlercsirke. Más megvalósítási módok esetén a megfelelõ alany lehet egy csirke. Még további megvalósítási módok esetén a megfelelõ alany egy fejletlen, fejlõdõ vagy érett madár lehet. Egyéb megvalósítási módok esetén a megfelelõ alany egy olyan csirke lehet, amely 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 vagy 65 napos korú lehet, vagy ezeknek a számoknak a tartományán belül bármilyen korú lehet. Így a jelen találmány különbözõ táplálékok változatát szolgáltatja, ideértve a kis háziállatok táplálékát, a csirketáplálékot és a disznótáplálékot. A jelen találmány szerinti állati táplálékkiegészítõ azt is lehetõvé teheti, hogy szokásos állati táplálékot módosítsunk olyan módon, hogy csökkentjük annak az energia- és/vagy protein- és/vagy aminosavtartalmát, egyidejûleg azonos táplálkozási szinten tartva az állat számára hozzáférhetõ energiát, proteint és aminosavakat. Ennek következtében csökkenteni lehet a költséges energia- és proteinadalékokat, amelyek jellegzetesen benne vannak az állati táplálékban a szokásos táplálékokhoz viszonyítva. A következõ példákat annak érdekében nyújtjuk, hogy szemléltessük a jelen találmányt, és azokat nem lehet korlátozó értelmûnek tekinteni. 1. példa Keratináz elõállítása rekombináns B. licheniformis PWD¹1 törzsbõl Arányosan megnövelt fermentációs stratégiát terveztünk keratináz elõállítására, vad típusú B. licheniformis PWD¹1 törzset használva. Lombiktenyészet LB közegben. Lombiktenyésztést folytattunk Luria–Bertani (LB) közegben, amelyet a gyártó elõírása szerint készítettünk, és amely 1,0 L desztillált vizet, 15 g BACTO® agart, 10 g NaCl¹ot, 10 g BACTO® triptont és 5,0 g élesztõkivonatot tartalmazott. Egy glicerines pálcáról B. licheniformis PWD¹1 törzset vittünk fel egy LB lemezre, és ott növesztettük 50 °C¹on 8–12 órán át. Ezután egyetlen B. licheniformis PWD¹1 törzskolóniát vittünk be az LB lemezrõl egy lombikba, amely 500 ml LB közeget tartalmazott, és a kolóniát 50 °C¹on 6 órán át növesztettük. Magtenyészetek. B. licheniformis PWD¹1 törzs magtenyésztését végeztük olyan közegben, amely 0,7 g/L KH 2 PO 4 ¹ot, 1,4 g/L K 2 HPO 4 ¹ot, 0,1 g/L MgSO4·7H2O¹t, 10 g/L zsírtalanított szójalisztet és 0,1 g/L habzásgátló anyagot tartalmazott. A magtenyészet kezdeti pH¹ját 1 M HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,0¹re állítottuk be. Az 500 ml¹es lombik tenyészetét átvittük egy elsõ fokozatú magfermentorba, amely kb. 10 L¹tõl 20 L¹ig terjedõ térfogatú volt, és a magtenyészet közegét tartalmazta, és a tenyésztést 50 °C¹on 8–12 órán át végeztük, amíg el nem értük a 2,5%-tól 5%¹ig terjedõ inokulumméretet. Az elsõ fokozatú magtenyészetet ezután átvittük egy második fokozatú, 100 L¹es, 250 L¹es
1
HU 008 411 T2
vagy 800 L¹es magfermentorba, és abban 50 °C¹on 8 órán át növesztettük, majd 37 °C¹ra lehûtöttük. A magtenyészet esetén a sejtsûrûség a tenyésztési eljárásnak kb. 8 vagy 10 órája alatt elérte legalább a 3×108 CFU/mL értéket. Termelési közegek. A B. licheniformis PWD¹1 törzs esetén használt termelési tenyészközeg 0,7 g/L KH2PO4¹ot, 1,4 g/L K2HPO4¹ot, 0,1 g/L MgSO4·7H2O¹t, 10 g/L zsírtalanított szójalisztet és 0,1 g/L habzásgátló anyagot tartalmazott. A termelõtenyészet kezdeti pH¹ját 1 M HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,0¹re állítottuk be. A magtenyészet második szakaszát átvittük egy olyan termelõfermentorba, amely a termelõ tenyészközeget a végsõ szakaszú tenyésztéshez tartalmazta. A végsõ szakaszú tenyésztést 50 °C¹on hajtottuk végre 8 óra alatt, a betakarítás elõtt kb. 24–30 óra végsõ tenyésztési idõt érve el. A fenti tenyésztési lépések alatt a tenyészközeg kezdeti pH¹ját 7,0¹re állítottuk be, de a tenyésztési eljárás alatt nem ellenõriztük a pH¹t. A feloldott oxigén optimális szintje kb. 20% volt B. licheniformis PWD¹1 törzs esetén. Az inokulum mérete kb. 2,5–5% volt, és az inokulum kora kb. 8–12 óra volt. A termelõtenyészetben a sejtsûrûség a tenyésztési eljárás kb. 20. vagy 24. órájában 1,2×109 CFU/mL értéket ért el. Az azokazeinpróbával mért csúcs-enzimaktivitás 35–40 A450 per mL értéket ért el a tenyésztési eljárás kb. 24–30. órájában. A termelõ tenyészközeg pH¹értéke 7,0-rõl 8,3¹re változott, de az enzimaktivitás és a termelékenység magas szinteken maradt, ami azt jelezte, hogy nem volt szükség a pH ellenõrzésére. Kinyerés és további feldolgozás. A termelõtenyészetben az enzimaktivitást ellenõriztük a kinyerés elõtt. A termékek felülúszóját centrifugálással elkülönítettük a sejttömegtõl, majd ultraszûréssel vagy bepárlással betöményítettük. A betöményített folyékony enzimet ezután permetezve szárítottuk. Egy másik módszer szerint a termékek felülúszóját a sejttömegtõl való elkülönítés után közvetlenül permetezve szárítottuk, betöményítés nélkül. Enzimhozam és enzimaktivitás. 100 L termelõtenyészetben az azokazeinpróbával a kinyerés elõtt mért enzimaktivitás 3000–3500 U/mL volt, és a sejtszám 1,3×109 CFU/mL volt. A 100 L termelõtenyészet teljes száraz súlya 9,12 g/L volt, ideértve a 2,15 g/L oldhatatlan száraz súlyt és a 6,88 g/L oldható száraz súlyt. A nyers enzimhozam kb. 1,75–2,0 g/L volt. A nyers enzimet úgy állítottuk elõ, hogy a fermentációs felülúszót Pellicon-szûréssel betöményítettük 5 kDa molekulasúlyvégpontra, és azután fagyasztva szárítottuk. A nyers száraz enzim enzimaktivitása kb. 1 000 000 U/g¹tól kb. 1 400 000 U/g¹ig terjedt azokazeinpróbával mérve. A nyers enzim teljes proteintartalma kb. 30–36% volt, ami közelítõleg 14–20% tiszta keratinázból állt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 2. példa Keratináz elõállítása rekombináns B. licheniformis T399D törzsbõl Fermentációs növelõ stratégiát dolgoztunk ki keratináz elõállítására, rekombináns Bacillus licheniformis
60 8
2
T399D törzset (a továbbiakban „Bacillus licheniformis T1 törzs”) használva. Lombiktenyésztés LB közegben. Lombiktenyésztést hajtottunk végre LB közegben, amelyet a gyártó elõírása szerint készítettünk el, és amely 1,0 L desztillált vizet, 15 g BACTO® agart, 10 g NaCl¹ot, 10 g BACTO® triptont és 5,0 g élesztõkivonatot tartalmazott. B. licheniformis T1 törzset vittünk fel egy glicerinpálcáról LB lemezekre, és 18 órán át 37 °C¹on növesztettük a törzset. Ezután egyetlen B. licheniformis T1 törzskolóniát vittünk át az LB lemezrõl egy olyan lombikba, amely 500 mL LB közeget tartalmazott, és 6 órán át 37 °C¹on tenyésztettük. A sejtnövekedést úgy ellenõriztük, hogy 660 nm¹en mértük az optikai sûrûséget (Beckman DU sorozatú 660¹as spektrofotométer, Fullerton, CA). 6 órányi tenyésztés után az OD660 mért értéke 1,0 fölött volt. Magtenyészetek. A B. licheniformis T1 törzs tenyészeteit 0,7 g/L KH2PO4¹ot, 1,4 g/L K2HPO4¹ot, 0,1 g/L MgSO4·7H2O¹t, 10 g/L zsírtalanított szójalisztet és 0,1 g/L habzásgátló anyagot tartalmazó közegben tenyésztettük. A magtenyészet kezdeti pH¹ját 1 M HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,0¹re állítottuk be. Az 500 mL lombiktenyészetet átvittük egy kb. 10 L–20 L térfogatú magfermentorba, amely a magtenyészet közegét tartalmazta, és abban 37 °C¹on 8 órán át tenyésztettük, hogy elérjük a 2,5–5%¹ig terjedõ inokulumméretet. Az elsõ szakaszos magtenyészetet ezután átvittük egy 100 L, 250 L vagy 800 L térfogatú második szakaszos magfermentorba, és abban 37 °C¹on 8 órán át tenyésztettük. Termelõközegek. A B. licheniformis T1 törzshöz használt termelõ tenyészközeg 0,7 g/L KH2PO4¹ot, 1,4 g/L K2HPO4¹ot, 0,1 g/L MgSO4·7H2O¹t, 13 g/L zsírtalanított szójalisztet, 40 g/L keményítõt, 13 g/L toll-lisztet és 0,1 g/L habzásgátló anyagot tartalmazott. A termelõtenyészet kezdeti pH¹ját 1 M HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,0¹re állítottuk be. A második szakaszos magkultúrát átvittük egy olyan termelõfermentorba, amely a végsõ szakaszos tenyésztésre szolgáló termelõ tenyészközeget tartalmazta. A végsõ szakaszos tenyésztést 37 °C¹on 48 órán át hajtottuk végre a kinyerés elõtt. A fentebbi tenyésztõlépések alatt a tenyészközeg kezdeti pH¹ját 7,0¹re állítottuk be, de nem gondoskodtunk a pH ellenõrzésérõl. Az oldott oxigén optimális szintje B. licheniformis T1 törzs esetén kb. 30% volt. Az inokulum mérete kb. 2,5–5%, és az inokulum kora kb. 12 óra volt. Kinyerés és további feldolgozás. A termelõtenyészetben az enzimaktivitást ellenõriztük a kinyerés elõtt. A tenyészet felülúszóját elkülönítettük centrifugálással a sejttömegtõl, majd ultraszûréssel vagy bepárlással betöményítettük. A betöményített folyékony enzimet ezután permetezve szárítottuk. Egy másik módszer szerint a tenyészet felülúszóját közvetlenül permetezve szárítottuk a sejttömegtõl való elkülönítés után, betöményítés nélkül. Enzimhozam és enzimaktivitás. 100 L termelõtenyészet esetén a kinyerés elõtt azokazeinpróbával
1
HU 008 411 T2
mért enzimaktivitás 30 000–35 000 U/mL és a sejtszám 6×109 CFU/mL volt. A 100 L termelõtenyészet teljes száraz súlya 40 g/L volt, ebben 15 g/L oldhatatlan száraz súllyal és 25 g/L oldható száraz súllyal. A közvetlenül szárított tenyészet-felülúszóból a nyers enzimhozam 20 g/L volt, míg a nyers enzimhozam egy olyan tenyészetkoncentrátumból, amelyet Pellicon-szûréssel kaptunk 10 kDa végsõ molekulasúllyal, 16 g/L volt. A nyers száraz enzim enzimaktivitása nagyobb volt 1 000 000 U/g¹nál, amit azokazeinpróbával mértünk. 3. példa Baromfitáp keratinázzal való kiegészítésének anyagai és módszerei Madarak és elhelyezés. Három kísérletet végeztünk. Mindegyik kísérletben 192 egynapos brojlercsirkét bemértünk és véletlenszerûen osztottunk szét 24 kalitkába teljesen véletlenszerû mintázattal, két Alternate Design baromfitelepre (Wilveco, Billerica, MA). A madarakat lemértük, szárnyukat lekötöttük, és alávetettük õket a kísérleti kezelésnek ötnapos (elsõ és második kísérlet) vagy egynapos (harmadik kísérlet) ko-
2
rukban. Minden egyes kísérletet ketrecenként nyolc madárral ötször megismételtünk, kivéve az ellenõrzõ kezelést, amelyet ketrecenként nyolc madárral négyszer ismételtünk meg. A madarakat ellenõrzött hõmér5 sékletû szellõztetett és megvilágított (24 óra/nap) helyiségekben helyeztük el. A kísérleti idõszak alatt a madarakat ad libitum tápláltuk tálcás etetõkbõl, és vizet itatókból kaptak. A PWD¹1 keratináz enzim. A PWD¹1 keratináz en10 zimet 150 L¹es fermentorban állítottuk elõ, szokásos módszereket használva [Wang és Shih, J. Indust. Microb. Biotech. 22, 608–616 (1998)]. Röviden, Bacillus licheniformis PWD-1¹et [Williams et al., (1990) supra] tenyésztettünk fermentorban 50 °C¹on 48 órán át. 15 A sejtmentes közeget membránultraszûréssel betöményítettük és fagyasztva szárítással szárítottuk. Rendes körülmények között a nyers enzim hozama 2,0 g/L volt. A nyers keratináz aktivitása 300 000 U/g volt azokeratin hidrolízisével mérve [(Lin et al. (1992) 20 supra]. Étrendi kezelések. Az összes étrendet a legolcsóbb lineáris programozószoftver használatával dolgoztuk ki, és az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat Alkotórész
Diétás kezelés Magas protein1
Kontroll2
Alacsony protein
Kukorica
49,60
59,00
49,00
Szójaliszt, 48% CP
41,44
32,00
26,60
Mészkõ
1,32
1,40
1,32
Dikalcium-foszfát
1,75
1,70
1,82
Baromfizsír
5,34
5,00
4,20
DL-Metionin
0,15
0,16
0,13
Só
0,40
0,50
0,42
Kolin-klorid
0,10
0,10
0,08
Ásványok3
(TM¹90)
0,12
0,12
0,10
Vitaminok4
(NCSU¹90)
0,07
0,07
0,06
Szelénpremix5
0,07
0,07
0,06
Nátrium-hidrogén-karbonát
0,10
0,10
0,08
Kukoricakeményítõ
0
0
16,60
100,46
100,22
100,47
Összesen (kg)
Elemzés6
Nyers protein, %
25,00
% NRC
108,70
Elemzés
% NRC
Elemzés
% NRC
20,23
88,00
16,80
72,90
ME, kcal/kg
3,050
95,31
3,201
100,00
3,257
101,80
Met+Cys, %
0,933
103,67
0,85
99,00
0,70
77,90
Lizin, %
1,437
130,60
1,17
106,30
0,97
88,10
Kalcium, %
1,00
100,00
1,03
103,30
1,01
100,10
9
1
HU 008 411 T2
2
1. táblázat (folytatás) Alkotórész
Diétás kezelés Magas protein1
d
0,45
Kontroll2
100,00
0,45
100,70
Alacsony protein
0,45
100,70
Foszfát, % 1
A madaraknak ad libitum adva életük elsõ 5 napján csupán a harmadik kísérletben. A madaraknak ad libitum adva életük elsõ 5 napján csak az elsõ és a második kísérletben. Az összes kísérletben az ellenõrzõ kezelés alatt álló madarak életük elsõ 5 napja után is ugyanezt az étrendet kapták, míg a többi madarat megfelelõ kezeléseknek vetettük alá. 3 Az ásványi premixet az Eastern Minerals, Inc.¹tól (Henderson, NC) kaptuk, és ezek a következõ elemeket adták (per kg étrend): 120 mg Zn ZnSO4-ból; 120 mg Mn MnSO4-ból; 80 mg Fe FeSO4·C5H2O-ból; 10 mg Cu CuSO4-ból; 2,5 mg I CaIO4-ból és 1 mg Co CoSO4-ból. 4 A vitaminpremixet a Roche-tól (Nutley, NJ) kaptuk, és az a következõket szolgáltatta (per kg étrend): 13,200 IU A¹vitamin; 4,000 ICU D¹vitamin; 66 IU E¹vitamin; 39,6 Fg B12-vitamin; 13,2 mg riboflavin; 110 mg niacin; 22 mg d¹pantotenát; 0,4 mg K¹vitamin; 2,2 mg folsav; 4,0 mg tiamin; 7,9 mg piridoxin; 0,253 mg biotin; 100 mg etoxikvin. 5 A szelénpremix 0,2 mg Se/kg étrendet adott Na SeO -ként. 2 3 6 Számított elemzés. 2
Az összes táplálék a kísérletek alatt végig összezúzott alakban volt, a madarak egynapos korukban alapétrendet kaptak, és ezt követõen áttértünk a megfelelõ ötnapos kísérleti étrendekre. Az elsõ kísérletben az elsõ öt napon át adott alapdiéta az Országos Kutatási Tanács (National Research Council, NRC) ajánlásainak mintegy 93%¹át tartalmazta nyers proteinben [(1994) supra], 100%¹ot nyújtott az esszenciális aminosavakból, valamint kalcium- és foszfortartalomból. A második és harmadik kísérletben az elsõ 5 napon át adott alapdiéta az NRC-ajánlások mintegy 95%¹át nyújtotta [(1994) supra] energiából és 100%¹ot kalciumból és foszforból, de 105% nyers proteintartalmat adott. Ezt követõen a brojlercsirkék egy ketrecét az ötféle étrendkezelés egyikének vetettük alá minden egyes kísérlet végéig (21 nap az elsõ és a harmadik kísérletben, 26 nap a második kísérletben). Az étrendi kísérlet az elsõ és a második kísérletben a következõ volt: 1) kiegészítetlen kontrollétrend (C, 21,39% nyers protein); 2) alacsony proteintartalmú étrend (LP, 18% nyers protein); 3) alacsony proteintartalmú étrend kiegészítve 0,05 súly/súly% enzimkészítménnyel (LP+0,05E); 4) alacsony proteintartalmú étrend kiegészítve 0,10 súly/súly% enzimkészítménnyel (LP+0,10E); és 5) alacsony proteintartalmú étrend kiegészítve 0,15 súly/súly% enzimkészítménnyel (LP+0,15E). Az elsõ kísérletben a kontrollétrend ugyanaz az alapétrend volt, amelyet a madaraknak életük elsõ 5 napján adagoltunk. A madarak az elsõ kísérletben továbbra is ugyanazt az étrendet kapták 5 nap eltelte után, míg a kísérlet fennmaradó részében áttértünk az 5 napos kísérleti étrendre. A harmadik kísérletben az étrendi kezelések a következõk voltak: 1) kiegészített kontrollétrend (C, 21,39% nyers protein); 2) kontrollétrend kiegészítve 0,10 súly/súly% enzimkészítménnyel (C+0,10E); 3) alacsony proteintartalmú étrend (LP, 18% nyers protein); 4) alacsony proteintartalmú étrend kiegészítve 0,10 súly/súly% enzimkészít-
25
30
35
40
45
50
55
60 10
ménnyel (LP+0,10E); és 5) ugyanaz a kezelés, mint a kettes számú, azonban a madaraknak nem 5 napos koruktól kezdve, hanem egynapos koruktól kezdve adagolva. Az enzimadagot feloldottuk 0,10 N nátrium-karbonát-oldatban 1 gramm enzim/10 ml oldat arányban az étrend alkalmazása elõtt. Ezután az enzimoldatot a táplálék tetejére permeteztük 10 ml enzimkészítmény/kg étrend arányban, permetezõpalackot alkalmazva, és összekevertük egy kis tányérkeverõt használva (The Hobart Manufacturing Company, Troy, OH). A digesztumok viszkozitása. Minden egyes kísérlet végén ketrecenként az összes madarat, kivéve kettõt, fájdalommentesen megöltünk CO2-gáz használatával. A ketrecenként megmaradó két madarat megtartottuk a következõ napra. A következõ napon az adagolókat korán eltávolítottuk a ketrecekbõl, és így egy 2 órás idõszakot biztosítottunk, amikor a madarak nem jutottak táplálékhoz. 2 óra eltelte után a madarakat ismét hagytuk ad libitum táplálékhoz jutni. Egy órával késõbb a madarakat eltávolítottuk, kettõt egy idõben, és ezután fájdalommentesen megöltük õket CO2-gáz használatával. A boncolást közvetlenül az eutanázia után hajtottuk végre, és az éhbél (jejunum) tartalmát 1 ml¹es Eppendorf-csövekbe ürítettük. Madaranként két mintát kaptunk. A csöveket azonnal centrifugáltuk 12 000×gvel 5 percen át, majd azonnal jégre helyeztük a viszkozitás méréséig, kereskedelmi típusú viszkozimétert (Brookfield Digital Viscometer, Model DV–II Version 2,0, Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Stoughton, MA) használva. A viszkozitásmérést olyan körülmények között végeztük, hogy elkerüljük az oldatban a baktériumok növekedését. Az adatok elemzése. A testsúlyokat és az étrendfogyasztást 5 naponként jegyeztük fel, kiindulva az egynapos kornál, minden egyes kísérlet végéig. Kiszámoltuk az étrendkonverziós arányt (étrend és súlynyereség hányadosa), kiigazítva a mortalitással és a kiselej-
1
HU 008 411 T2
tezett állatokkal. A halandóságot naponként feljegyeztük. Minden egyes kísérletben külön elemeztük a testsúlyt, a táplálékfogyasztást, a táplálékkonverziós hányadost és a viszkozitásértékeket, az SAS szoftver [SAS Institute (1996) SAS/STAT User’s Guide: Statistics. Release 6,11. SAS Institute, Inc., Cary, NC] általános lineáris modell eljárásának egyirányú analízisét használva. A százalékos értékeket ANOVA-nak vetettük alá arcsin négyzetgyökös százalékos transzformáció után. A középértékeket elkülönítettük, a legkisebb jelentõs különbséget használva. A szignifikanciakimutatásokat P£0,05¹ra alapoztuk. 4. példa A baromfitáplálék kiegészítése keratinázzal: 1. kísérlet A 2. táblázatban a végsõ testsúlyt, a kumulatív táplálékfogyasztást és a táplálékkonverziós hányadosokat mutatjuk be. 2. táblázat Kezelés
Testsúly (g)
Táplálékfogyasztás (g)
Táplálékkonverziós arány
709±16
901a±26
1,56±0,05
Alacsony proteintartalom (LP)
668±14
835ab±23
1,57±0,04
LP+0,05E
691±14
860ab±23
1,56±0,04
LP+0,10E
700±14
847ab±23
1,51±0,04
677±14
826b±23
1,54±0,04
Kontroll (C)
LP+0,15E
2
Az egész kísérletben csupán egyetlen elhullott madár volt. Ennek a halott madárnak a súlyát és a tetemét beszámítottuk a táplálékkonverziós arányba, amit a 2. táblázatban mutatunk be. Az étrend enzimes kiegészí5 tése jelentéktelen hatást gyakorolt a táplálékkonverziós arányra. Kumulatív alapon az alacsony proteintartalom+0,10% enzimes kezelés eredményezte a legalacsonyabb táplálékkonverziós arányt (1,51 vs. 1,57 az alacsony proteintartalom esetén+0,10% enzim vs. ala10 csony proteintartalom, P>0,05). Az elsõ kísérlet eredményei egy irányzatot tártak fel az enzimes kezelésre adott válaszban. Annak érdekében, hogy tovább elemezzük az enzim kedvezõ hatását hosszabb idõn keresztül, egy második kísérletet 15 folytattunk le, a madarakat 5 további napon keresztül tenyésztve (26 napos korukig). 5. példa A baromfitáplálék kiegészítése keratinázzal: 2. kísérlet 20 Ez a kísérlet az 1. kísérlet ismétlése volt, azzal az eltéréssel, hogy a madarakat 5 további napon át tenyésztettük (26 napos korukig). A végsõ testsúlyt, a kumulatív táplálékfogyasztást és a táplálékkonverziós 25 arányt a 3. táblázatban mutatjuk be. 3. táblázat Testsúly (g)
Táplálékfogyasztás (g)
Táplálékkonverziós arány
Kontroll (C)
1089a±15
1717c±16
1,83a±0,04
Alacsony proteintartalom (LP)
964c±13
1734b±14
2,14c±0,04
LP+0,05E
1019b±13
1796a±14 2,08bc±0,04
LP+0,10E
1025b±13
1764ab±14 2,02b±0,04
LP+0,15E
1032b±13
1794a±14 2,04bc±0,04
Kezelés
ab Egy oszlopon belül az eltérõ felsõ indexû átlagok jelentõsen különböznek (P<0,05) az SAS szoftver [SAS Institute (1996) supra] legkisebb négyzetes átlagok funkciója szerint. 1 Az értékek ketrecenként nyolc brojlercsirke esetén négy vagy öt ketrec átlagát képviselik. Az értékek átlag±standard átlaghibát képviselnek. 2 E=enzim.
Az enzimes kezelések általában P>0,05 valószínûségi értékkel javították a testsúlyt. Az alacsony proteintartalom+0,10% enzimes kezelés magasabb testsúlyt adott, mint az alacsony proteintartalmú kezelés (700 vs. 668 gramm alacsony proteintartalom esetén+0,10% enzim vs. alacsony proteintartalom, P=0,08). Az alacsony proteintartalom+0,10% enzimtartalom eredményezte a legmagasabb testsúlyt az enzimes kezelések közül, és nem tért el a kontrollkezeléstõl (700 vs. 709 gramm alacsony proteintartalom esetén+0,10% enzim vs. kontroll). Nem volt jelentõs különbség a táplálékfogyasztásban a kezelések között, kivéve az alacsony proteintartalom+0,15% enzim, illetve a kontrollkezelés között (826 vs. 901 gramm alacsony proteintartalom+0,15% enzim vs. kontroll, P<0,05). Nem voltak lényeges különbségek a táplálékfogyasztásban az enzimmel kezelt csoportok között.
30
35
40
45
a, b, c
Egy oszlopon belül az eltérõ felsõ indexû átlagok jelentõsen különböznek, (P<0,05) az SAS szoftver [SAS Institute (1996) supra] legkisebb négyzetes átlagok funkciója szerint. 1 Az értékek ketrecenként nyolc brojlercsirke esetén négy vagy öt ketrec átlagát képviselik. Az értékek átlag±átlagos standard hibát képviselnek. 2 E=enzim.
Javulás mutatkozott a testsúlyban (P<0,05), amikor az alacsony proteintartalmú étrendet kiegészítettük az 50 enzim mindhárom szintjén a madarak 26 napos korában. Az alacsony proteintartalom+0,10% enzimes kezelés és az alacsony proteintartalom+0,15% enzimes kezelés adta a legmagasabb testsúlynövekedést (1,032 és 1,025 vs. 964 gramm az alacsony proteintar55 talom esetén+0,15% enzim, illetve alacsony proteintartalom+0,10 vs. alacsony proteintartalom, P<0,05). Az összes enzimes kezelés azonban alacsonyabb (P<0,05) testsúlyt adott, mint a kontrollkezelés (1,032, 1,025 és 1,016 vs. 1,089 gramm alacsony proteintarta60 lom esetén+0,15% enzim, alacsony proteintarta11
1
HU 008 411 T2
lom+0,10% enzim, illetve az alacsony proteintartalom+0,05% enzim vs. kontroll). Az alacsony proteintartalmú étrendet kapó összes madár több táplálékot fogyasztott, mint a kontrollcsoport (P<0,05). Az enzimes kezelésû csoport is több táplálékot fogyasztott, mint az alacsony proteintartalmú étrendet fogyasztó madarak (P<0,05; 2. táblázat). Nem voltak jelentõs különbségek a táplálékfogyasztásban az enzimkezelések között. A 0,05%¹os és 0,15%¹os szintû enzimkiegészítés számszerûleg jobb táplálékkonverziós arányokat adott, mint az alacsony proteinszintû kezelés, míg az alacsony proteintartalom+0,10% enzimes kezelés jelentõsen (P<0,05) jobb táplálékkonverziós arányt mutatott, mint az alacsony proteinkezelés (2,02 vs. 2,14 alacsony proteintartalom esetén+0,10% enzim vs. alacsony proteintartalom). Ebben a kísérletben az alacsony proteintartalmú étrend kiegészítése enzimmel nem javította a csirkék teljesítményét olyan szintre, amely ekvivalens lett volna a kontrolltápszer esetén kapottal. Az alacsony proteintartalmú étrend kiegészítése 0,10 súly/súly% enzimmel azonban javította (P<0,05) a csirkék teljesítményét azzal szemben, amit az alacsony proteintartalmú étrenddel kaptunk. Mind az 1. kísérlet, mind a 2. kísérlet madarai a kikelésük utáni 5 elsõ napon a kontrollétrendet kapták, mielõtt a kezelõ étrendeknek vetettük volna alá õket. Bár a kontrollétrend megfelelõ energiát, kalciumot és foszfort, valamint esszenciális aminosavat szolgáltatott, az NRC [(1994) supra] nyers proteinajánlásnak csupán a 93%¹át adta, ami marginálisan tette megfelelõvé és érzékennyé proteázkiegészítésre. 6. példa A baromfitáplálék kiegészítése keratinázzal: 3. kísérlet A 3. kísérletben a madarak magas proteintartalmú elõindító étrendet kaptak, ami a 105%¹át szolgáltatta a nyers protein NRC [(1994) supra] ajánlásnak, és kismértékben volt magasabb, mint az összes táplálékkal kapcsolatos követelmény, kivéve az energiát (95% NRC-ajánlások; 1. táblázat). A 3. kísérletet annak érdekében folytattuk le, hogy meghatározzuk, vajon az enzim továbbra is kifejt¹e hatást azt követõen is, hogy a csirkék kellõ mennyiségû táplálékot kaptak. Ebben a kísérletben csupán egyetlen enzimszintet (0,10 súly/súly%) használtunk. Bevezettünk azonban két új kezelést, hogy kipróbáljuk, vajon az enzim képes¹e hatást gyakorolni marginálisan megfelelõ induló brojlercsirkeétrendek kiegészítésére. A két új kezelés abban állt, hogy ugyanazt az ellenõrzõ étrendet (21,39% nyers protein) egészítettük ki, mint amelyet az 1. és 2. kísérletben használtunk 0,10 súly/súly% enzimmel, és a kevert táplálékot vagy ötnapos korukban (2. kezelés), vagy pedig egynapos korukban (5. kezelés) vezettük be. Ez tájékoztatást szolgáltatott arra nézve, hogy az egynapos korban alkalmazott enzimkiegészítés nyújt¹e bármilyen további teljesítményjavulást. A végleges testsúlyt, az összesített táplálékfogyasztást és a táplálékkonverziós arányt a 4. táblázatban mutatjuk be.
2
4. táblázat Testsúly (g)
Táplálékfogyasztás (g)
Táplálékkonverziós arány
Kontroll (C)
695b±14
974b±18
1,49ab±0,03
C+0,10E
767a±13
1046a±16
1,45a±0,03
Alacsony proteintartalom (LP)
651c±13
1043a±16
1,71c±0,03
679abc±13
978b±16
1,53b±0,03
764a±13
1022ab±16
1,42a±0,03
Kezelés
5
10
LP+0,10%E C-on+0,10%E3 a, b, c
Egy oszlopon belül az eltérõ felsõ indexû átlagok jelentõ-
15 sen különböznek (P<0,05) az SAS szoftver [SAS Institute (1996) supra] legkisebb négyzetes átlagok funkciója szerint. Az értékek ketrecenként nyolc brojlercsirke esetén négy vagy öt ketrec átlagát képviselik. Az értékek átlag±standard átlaghibát képviselnek. 2 E=enzim. 3 Az enzimet a kezelés elsõ napján adagoltuk, az összes többit a madarak ötnapos korában adagoltuk. 1
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
Bár a 2. táblázatban, a 3. táblázatban és a 4. táblázatban szereplõ adatok csupán a madarak végsõ testsúlyának adatait mutatják a különbözõ kísérletekben, a madarak súlyát minden 5. napon mértük mindegyik kísérletben. E kísérletnél az ötnapos intervallumokban kapott számokra tekintve világos, hogy az alacsony proteintartalmú étrendet az enzimmel kiegészítve a 3. kísérletben a testsúlynövekedésre hasonló hatást tapasztaltunk, mint az 1. és a 2. kísérletben. Amikor az alacsony proteintartalmú étrendet az enzimmel kiegészítettük, megnõtt a madarak 21 napos testsúlya, de P<0,05 esetén a hatást nem lehetett kimutatni (679 vs. 651 gramm alacsony proteintartalom esetén+0,10% enzim vs. alacsony proteintartalom, P>0,05). Amikor azonban a kontrollétrendet az enzimmel kiegészítettük (kontroll+0,10% enzimkészítmény, 2. és 5. kezelés), azt tapasztaltuk, hogy a testsúly magasabb volt, mint a kontrollkezelés esetén (767 és 764 vs. 695 gramm a 2. és 5. kezelés esetén vs. kontroll, P<0,05). Nem várt módon a kontrollétrend kiegészítése az enzimmel jelentõsen magasabb testsúlynövekedést mutatott, mint amikor az alacsony proteintartalmú étrendet kiegészítettük az enzimmel, függetlenül attól, hogy az enzimet az egynapos vagy az ötnapos korban adtuk (4. táblázat). Ez annak lehetett tulajdonítható, hogy a kontrollétrend, illetve az alacsony proteintartalmú étrend magasabb proteintartalmú és/vagy aminosavtartalmú volt. A keratináz egy széles spektrumú proteáz enzim, amely megtámad különbözõ forrású proteineket, és kisebb polipeptidkomponensekre töri szét azokat. Ezeket a polipeptideket a belekben levõ emésztõenzimek könnyebben bontják le. Az étrend (ebben az esetben a kontrollétrend) magasabb proteinés/vagy aminosavtartalma magasabb szubsztrátumtartalmat jelent az enzim számára, amely több proteinkomponens szabaddá tételén dolgozik, és azokat könnyebben elérhetõvé teszi a fiatal csirke számára, ami viszont magasabb testsúlynövekedésben tükrözõdik.
1
HU 008 411 T2
7. példa A baromfitáplálék kiegészítése keratinázzal: a digesztumok viszkozitása 22 napos (1. és 2. kísérlet) és 27 napos (3. kísérlet) brojlercsirkék éhbéltartalmainak viszkozitásértékeit (mPa·s) mindhárom kísérletbõl az 5. táblázatban mutatjuk be.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
5
5. táblázat 10 Kezelés
1. kísérlet
2. kísérlet
3. kísérlet
3,65b±0,42
2,31b±0,15
2,55ab±0,17
C+0,10E
–
–
2,18b±0,15
C+0,10E3
–
–
1,99b±0,15
3,59b±0,38
2,36ab±0,14
2,97a±0,15
Kontroll (C)
Alacsony proteintartalom (LP) LP+0,05E
2,98ab ±0,38 2,78a±0,14
LP+0,10E
2,88ab±0,38
2,21bc±0,14
2,20b±0,15
LP+0,15E
2,27a±0,38
1,98c±0,14
–
15
–
20
a, b, c
Egy oszlopon belül az eltérõ felsõ indexû átlagok jelentõsen különböznek (P<0,05) az SAS szoftver [SAS Institute (1996) supra] legkisebb négyzetes átlagok funkciója szerint. 1 Az értékek négy vagy öt ketrec (16–20 szám) átlagát képviselik. Az értékek átlag±standard átlaghibát képviselnek. 2 E=enzim. 3 Az enzimet ebben a kezelésben egynapos korban adtuk hozzá. Az összes többit a madarak ötnapos korában adagoltuk.
Az összes kísérletben mind az alacsony proteintartalmú étrendeknek, mind a kontrollétrendeknek a kiegészítése keratinázzal csökkentette az éhbéltartalmak viszkozitását. A csökkenés egyenesen arányos volt az enzimkiegészítés szintjével. Az alacsony proteintartalmú étrend kiegészítése 0,15% enzimmel (alacsony proteintartalom+0,15% enzim) csökkentette az 1. és a 2. kísérletben az éhbéltartalmak viszkozitását (2,27 és 1,98 mPa·s vs. 3,59 és 2,36 mPa·s alacsony proteintartalom+0,15% enzim vs. alacsony proteintartalom az 1. és 2. kísérletben, P<0,05). Az alacsony proteintartalom+0,15% enzimmel végzett kezelésnek is alacsonyabb éhbélviszkozitás volt az eredménye, összehasonlítva a kontrollkezeléssel (2,27 és 1,98 mPa·s vs. 3,65 és 2,31 mPa·s az alacsony proteintartalom esetén+0,15% enzim vs. kontroll az 1. és 2. kísérletben, P<0,05). Ha kiegészítettük a kontrollétrendet ötnapos korban keratinázzal, az éhbél viszkozitása is csökkent (2,18 mPa·s vs. 2,55 mPa·s a kontroll+0,10% enzim [3. kísérlet, 2. kezelés] vs. kontroll, P>0,05). A csökkenés azonban csak akkor volt jelentõs, amikor az étrendet egynapos korban indulva kiegészítettük az enzimmel (1,99 mPa·s vs. 2,55 mPa·s a kontroll esetén+0,10% enzim [3. kísérlet, 5. kezelés] vs. kontroll, P<0,05). Az elõzõ példák a jelen találmányt szemléltetik, de nem foghatók fel az oltalmi kör korlátozásaként. A találmányt a következõ igénypontokkal írjuk le, ahol az igénypontok ekvivalenseit is az oltalmi körbe tartozónak tekintjük.
2
25
30
35
40
45
50
55
60 13
1. Eljárás hús típusú baromfi tenyésztésére, amely abban áll, hogy az említett hús típusú baromfit kukorica-szójaliszttel mint baromfiétrenddel etetjük, ahol az említett baromfiétrend 1 súly%-nál kevesebb keratint tartalmaz, az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos az említett hús típusú baromfi súlygyarapodásának fokozásában. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a keratináz Bacillus licheniformis PWD¹1 keratináz. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a hús típusú baromfi fejletlen madár. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a hús típusú baromfi csirke, pulyka vagy kacsa. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a hús típusú baromfi csirke. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a csirke 1 napostól 65 napos korú. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a csirke 1 napostól 21 napos korú. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a csirke 1 napostól 7 napos korú. 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a csirke brojlercsirke. 10. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a baromfitáplálék egy indító étrend. 11. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a baromfiétrend növelõ típusú étrend. 12. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a baromfiétrend befejezõ típusú étrend. 13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a kukorica-szójaliszt táplálék 60–70 súly% kukoricát tartalmaz. 14. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a kukorica-szójaliszt táplálék 20–30 súly% szójababot tartalmaz. 15. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a kukorica-szójaliszt táplálék továbbá 0,01–0,20 súly% Bacillus licheniformis PWD¹1 keratinázt tartalmaz. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a Bacillus licheniformis PWD¹1 keratináz nyers extraktum vagy tiszta enzim. 17. Kukorica-szójaliszt táplálék alkalmazása hús típusú baromfi étrendjének kiegészítésére, ahol az említett alkalmazás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként etetjük, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatékonyan növeli a súlygyarapodást az említett hús típusú baromfiban, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. 18. Kukorica-szójaliszt táplálék alkalmazása egy állati táplálék táplálékhasznosítási hatékonyságának javítására hús típusú baromfiban, ahol az említett alkalmazás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként etetjük, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos egy állati táplálék táplálékhasznosítási hatékonyságának a javítására az említett hús típusú baromfiban,
1
HU 008 411 T2
ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. 19. Kukorica-szójaliszt alkalmazása állati táplálék emészthetõségének növelésére hús típusú baromfiban, ahol az említett alkalmazás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként etetjük, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos egy állati táplálék emészthetõségének növelésére az említett hús típusú baromfiban, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. 20. Kukorica-szójaliszt táplálék alkalmazása a halandóság csökkentésére hús típusú baromfiban, ahol az említett alkalmazás abban áll, hogy az említett táplálékot baromfiétrendként etetjük, ahol az említett táplálék továbbá keratinázt tartalmaz olyan mennyiségben, amely hatásos az említett hús típusú baromfi halandóságának csökkentésére, ahol az említett táplálék nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. 21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hús típusú baromfi fejletlen madár. 22. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hús típusú baromfi brojlercsirke.
2
23. A 17–22. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a keratináz Bacillus licheniformis PWD¹1 keratináz. 24. Állati táplálék, amely lényegileg szójaliszt5 bõl, kukoricalisztbõl és keratinázból áll, ahol az említett állati tápszer nem tartalmaz 1 súly%-nál több keratint. 25. A 24. igénypont szerinti állati táplálék, ahol az állati táplálék lényegileg legalább 0,01 súly% keratináz10 ból áll. 26. A 24. igénypont szerinti állati táplálék, ahol a keratináz nyers extraktum vagy tiszta enzim. 27. A 24. igénypont szerinti állati táplálék, ahol a keratináz Bacillus licheniformis PWD¹1 keratináz. 28. A 27. igénypont szerinti állati táplálék, ahol az 15 állati táplálékot indító étrendhez adjuk. 29. A 28. igénypont szerinti állati táplálék, ahol az indító étrend kukorica-szójaliszt indító étrend. 30. A 27. igénypont szerinti állati táplálék, ahol az 20 állati táplálék növelõ típusú étrend. 31. A 27. igénypont szerinti állati táplálék, ahol az állati táplálék befejezõ típusú étrend.
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
