!HU000008220T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 220
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: MI20052517 2005. 12. 29.
(73) Jogosult: Lofarma S.p.A., 20143 Milano (IT)
IT
(72) Feltalálók: MISTRELLO, Giovanni, I-20143 Milano (IT); ZANOTTA, Stefania, 20143 Milano (IT); RONCAROLO, Daniela, 20143 Milano (IT); FALAGIANI, Paolo, 20143 Milano (IT) (54)
HU 008 220 T2
A61K 39/36
(21) Magyar ügyszám: E 06 829727 (22) A bejelentés napja: 2006. 12. 19. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060829727 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1973567 A1 2007. 07. 05. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1973567 B1 2010. 02. 17.
(2006.01) C07K 14/415 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07073907 PCT/EP 06/012237
(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
A Betula verrucosa pollenbõl származó fõ allergén hipoallergén variánsai
A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 220 T2
A találmány tárgyát a Bet v 1 fehérje hipoallergén szekvenciavariánsai, az azokat kódoló nukleinsavmolekulák, az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények és azok Betula verrucosa fajba tartozó növények pollenjei által okozott allergiás betegségek profilaxisában és terápiájában történõ alkalmazása képezi. A találmány háttere Az allergiákat az immunrendszer rendellenes mûködése okozza, amely reagál a pollenben, atkákban, hámokban és bizonyos élelmiszerekben található ártalmatlan fehérjékre IgE-osztályba tartozó ellenanyagok termelésével. Újabb adatok arra utalnak, hogy a nyugati országok népességének több mint 10%¹a szenved ezektõl a betegségektõl, amelyek tünetei idõvel rosszabbodhatnak, ami például asztmát okozhat vagy a más allergénekre való szenzitizálódást, ily módon megnehezítve a megfelelõ terápia kiválasztását. A specifikus hiposzenzitizáló immunterápia, ellentétben a gyógyászati terápiával, az allergiás betegségeknek csak etiológiai kezelése, amely képes kedvezõen megváltoztatni azokat az immunológiai paramétereket, amelyeken ezek a betegségek alapulnak. A hiposzenzitizáló immunterápia standardizált extraktumok (vakcinák) emelkedõ dózisainak beadását foglalja magában ugyanabból az anyagból, amely a betegséget okozza (1). Ily módon egyfajta immuntolerancia indukálódik fokozatosan az anyag ellen a páciensben, az allergiás tünetek azt követõ eltûnésével. Azonban a súlyos mellékhatások (2) kiváltásának a kockázata, habár figyelemre méltóan csökken a lassú felszabadulású vakcinák vagy az injekciós útvonal alternatíváin beadott vakcinák alkalmazásával, valójában korlátozta a specifikus hiposzenzitizáló immunterápiák alkalmazását az allergiás betegségek kezelésében. Az elmúlt években a legtöbb figyelmet a hatásos, biztonságosabb vakcinák kifejlesztésére fordították. Közelebbrõl a mutagenizált rekombináns fehérjékbõl, azaz a betegség természetes lefolyásának nemkívánatos mellékhatások nélkül történõ kedvezõ befolyásolására képes hipoallergén variánsokból álló vakcinák kifejlesztése jelentett egy fontos célt (3). A rendszertanilag a Fagales-ként ismert növények (nyír, éger, mogyoró, tölgy, gyertyán) pollenje az allergiás rhinitis és asztma legfontosabb okainak egyike a mérsékelt övi régiókban. A nyírfapollen két fõ allergénje a Bet v 1 (a cDNS¹e deponálva van a GenBank X15877 hozzáférési szám alatt) és Bet v 2 (M65179 hozzáférési szám) rendre 17 és 14 kD molekulatömegû fehérjék (4,5). A nyírfapollenre allergiás páciensek majdnem 95%¹a IgE ellenanyagokat termel a Bet v 1 ellen és ezen páciensek 60%¹a reaktivitást mutat a Bet v 1 ellen önmagában (6). A Bet v 1 a természetben több mint tíz izoformában van jelen, amelyek 84,4% és 99,4% közötti szekvenciaazonosságot mutatnak (7). Ez az allergén a „patogenezis-rokon fehérjék” családjába tartozik, azaz mindenütt jelen lévõ fehérjék, amelyeket növények termel-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
nek környezeti vagy patológiás stressz hatására, amelyek funkciója feltételezett módon kapcsolatos a szteroidtranszporttal (8,9). A Fagales rend más növényeibõl származó pollenekben található allergének l¹es csoportjának nagy szekvenciahomológiája megmagyarázza, hogy a Bet v 1¹re specifikus IgE-vel rendelkezõ páciensek miért mutatnak allergiás tüneteket az ugyanebbe a rendszertani rendbe tartozó eltérõ növények pollenszezonja folyamán (10). A nyírfapollenre való allergia gyakran jár együtt friss gyümölcsök (például cseresznye, alma, körte) vagy zöldségek (például zeller és répa) elfogyasztásával kiváltott mellékhatásokkal. Ennek az az oka, hogy az ilyen élelmiszerek olyan fehérjéket tartalmaznak, amelyekre a Bet v 1¹gyel való nagy szekvenciahomológia jellemzõ, amelyeket felismernek a nyírfa fõ allergénjére termelt specifikus IgE¹k (11). A Bet v 1 allergénnel végzett immunterápia hatásos lehet a nyírfapollen-allergia, valamint a Fagales rendbe tartozó más növények iránti pollinózis, és a Bet v 1¹gyel keresztreagáló allergéneket tartalmazó élelmiszerekre való allergia kezelésében (12). A hiposzenzitizáló immunterápia jótékony hatásaival korreláló faktor a szenzitizáló allergénre specifikus IgG ellenanyagok indukálása. Az ilyen (védõ) ellenanyagok gátolhatják az IgE antigénhez, specifikusan a Bet v 1¹hez való kötõdését, megváltoztatva a molekula háromdimenziós szerkezetét (13, 14). A kisebb allergenitással és változatlan immunogenikus tulajdonságokkal rendelkezõ rekombináns fehérjéket tartalmazó vakcinák kifejlesztése javíthatná az allergiás betegségek terápiáját. A találmány leírása Azt találtuk, hogy a Bet v 1 allergén fehérjeszekvenciájában található egy vagy több aminosav-oldallánc helyettesítése vagy deletálása révén az kevésbé lesz reaktív az IgE ellenanyagokra. Egy elsõ aspektusában a találmány tárgya hipoallergén fehérje, amely a Bet v 1 allergén szekvenciavariánsa, azzal jellemezve, hogy: 1) csökkentett reaktivitást mutat az IgE-kre, összehasonlítva a vad típusú Bet v 1 allergénnel (1. azonosító számú szekvencia); 2) olyan az aminosavszekvenciája, amely: a) legalább 87%-ban, elõnyösen legalább 94%ban, elõnyösebben legalább 97%-ban azonos az 1. azonosító számú szekvenciával; b) az 1. azonosító számú szekvenciával egymás alá rendezve szubsztitúciót vagy deléciót mutat az 1. azonosító számú szekvencia 54. aminosavának megfelelõ Lys oldalláncban. Inkább a szubsztitúciós, mint a deléciós variánsok az elõnyösek, különösen azok, amelyekben a jelzett pozícióban található Lys oldallánc semleges vagy poláros aminosavval van helyettesítve. Elõnyösebben a semleges vagy poláros aminosav az Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, még elõnyösebben az Ala, Thr és Ser által alkotott csoportból van kiválasztva. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a hipoallergén fehérje a 2. azonosító számú szekvenciából áll.
1
HU 008 220 T2
A találmány szerinti Bet v 1 allergén szubsztitúciós és/vagy deléciós variánsok – összehasonlítva a vad típusú megfelelõjükkel – legalább 25%-kal, elõnyösen legalább 50%-kal, elõnyösebben legalább 80%-kal csökkent IgE-reaktivitást mutatnak a Betula verrucosa pollenallergiás páciensek szérumához képest. Teszteltük allergiás páciensek szérumkészletébõl származó, 2. azonosító számú szekvencia szerinti fehérjék IgE-reaktivitását ELISA vizsgálati eljárásban (1. ábra). Összehasonlítva a vad típusú Bet v 1 allergénnel (1. azonosító számú szekvencia), az IgE reaktivitás 56%¹os átlagos csökkenését figyeltük meg a 2. azonosító számú szekvenciával, amikor ezt a fehérjét nyírfapollenre allergiás páciensek szérumkészletének különbözõ hígításaival (1:2-tõl 1:8¹ig) inkubáltuk. Ezeket az eredményeket megerõsítettük ELISA gátlási kísérletekkel, amelyek lehetõvé teszik a különbözõ fehérjékbõl származó homológ epitópok reaktivitásának az értékelését. Ezek az eredmények egyértelmûen arra utalnak, hogy az 1. azonosító számú szekvencia 54. pozíciójában való aminosavszubsztitúció csökkenti a Bet v 1 allergén IgE¹k általi felismerését. Ezenfelül mértük Western-blottal a 2. azonosító számú szekvencia reaktivitását Betula verrucosa pollenre pozitív szérumkészletbõl származó IgE-kre. Ebben az esetben is az IgE-reaktivitás csökkenését figyeltük meg az elemzett szérumokban, amely összehasonlítva a vad típusú Bet v 1¹gyel (1. azonosító számú szekvencia) 88% volt a 2. azonosító számú szekvencia esetében. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya a Bet v 1 15–35, elõnyösebben 15–20 aminosav-oldalláncainak megfelelõ immunológiailag aktív peptid, amely a fent ismertetett szubsztitúciót és/vagy deléciót tartalmazza. A leírás szerinti értelemben az „immunológiailag aktív peptid” olyan peptidet jelöl, amely képes IgE-független immunválasz kiváltására. Találmány szerinti szubsztitúciós és/vagy deléciós variánsokat könnyen elõállíthatunk a Bet v 1 cDNSszekvencia (6. azonosító számú szekvencia) mutagenezisével a szakember számára jól ismert eljárások és módszerek alkalmazásával. A 2. azonosító számú szekvencia szerinti egyetlen szubsztitúciós variánst a 7. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. További megvalósítási módokban a találmány tárgya a találmány szerinti hipoallergén Bet v 1 fehérjét vagy abból származó peptidet kódoló nukleinsavmolekula, és a nukleinsavmolekulát tartalmazó expressziós vektor, amely mûködõképesen kapcsolt a fehérje vagy peptid eukarióta vagy prokarióta sejtekben történõ expresszióját szabályozó genetikai elemekhez; mint például transzkripciós promoterek, enhanszerek, szignálés vezetõszekvenciák vagy más szekvenciák, amelyek részt vesznek a transzkripció szabályozásában. Vektorok példái közé tartoznak plazmidok, vírusok és fágok, de bármilyen más vektort is alkalmazhatunk, amelyet szokásosan alkalmaznak a génsebészetben. A találmány tárgyát képezi továbbá prokarióta vagy eukarióta gazdasejt, amely transzformálva vagy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
transzfektálva van fent ismertetett vektorral. Általában prokarióta sejteket, mint például Escherichia coli vagy Bacillus subtilis, vagy eukarióta sejteket, mint például Saccharomyces cerevisiae alkalmaznak vektorok klónozására és cDNS-expresszáltatásra. Emellett a találmány szerinti hipoallergén variánsokat fúziós fehérjékként is elõállíthatjuk. A csökkentett IgE-reaktivitásuknak köszönhetõen a találmány szerinti Bet v 1 variánsok kényelmesen alkalmazhatók gyógyászati készítmények (például tabletták és kapszulák) elõállítására Betula verrucosapollenre allergiás személyek megelõzõ vagy terápiás kezelésére. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya tehát gyógyászati készítmény, amely találmány szerinti hipoallergén Bet v 1 variáns hatásos mennyiségét tartalmazza, adott esetben kombinálva Betula verrucosa más allergénjeivel és/vagy gyógyászatilag elfogadható hordozókkal és excipiensekkel. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a gyógyászati készítmény allergiás betegségek, beleértve bronchialis asztma, allergiás rhinitis, allergiás dermatitisz és allergiás konjunktivitisz profilaxisára vagy terápiájára alkalmazandó vakcina formájában van. A vakcinázás elmélete és gyakorlata ismert a szakember számára (15, 16). Az alábbi példákban részletesebben is bemutatjuk a találmányt. Hacsak másképpen nem jelezzük, a példákban alkalmazott eljárások a Sambrook, Fritsch és Maniatis, „Molecular cloning. A laboratory manual”, 2. kiadás, Vol. 1–2–3. kötet, kiad.: CSH Lab Press 1989 irodalmi helyen vannak ismertetve. 1. példa – A Bet v 1 allergént kódoló cDNS helyspecifikus mutagenezise A Bet v 1 allergént kódoló cDNS (6. azonosító számú szekvencia) helyspecifikus mutagenezisét a cDNAnek prokarióta vektorba (pBluescript, GenBank h.sz. X52327) történõ klónozásával hajtottuk végre PCRamplifikációval. A PCR-reakcióban láncindítóként alkalmazott oligonukleotidok (táblázat) tartalmazták a megfelelõ szubsztitúciókat. Mindegyik mutagenezishez alkalmaztunk a DNS-szál megfelelõ régiójához kötõdõ komplementer oligonukleotidot (17). Az amplifikálás után a változatlan eredeti templátot szelektíven degradáltuk a DpnI restrikciós enzimmel katalizált enzimatikus emésztéssel. Azután Escherichia coli-sejteket transzformáltunk a mutagenizált molekulákkal. Egyedi bakteriális kolóniákból kapott klónokat megszekvenáltunk Sanger módszere szerint, hogy meghatározzuk a helyes bázismódosításokat, és a nem specifikus mutációk hiányát a cDNS-ben. Táblázat A helyspecifikus mutagenezisre láncindítóként alkalmazott oligonukleotid szekvenciája. A mutáltatott bázisokat félkövér betûkkel jelöljük Oligonukleotid
Szekvencia
Bet v 1 54
cct gga acc att gcg aag atc agc ttt ccc
1
HU 008 220 T2
2. példa – Bet v 1 fehérje és variánsai elõállítása Vad típusú (6. azonosító számú szekvencia) és mutagenizált (7–10. azonosító számú szekvencia) Bet v 1 cDNS-eket – amelyeket hat hisztidint kódoló szekvencia szegélyez – klónoztunk be és expresszáltattunk Escherichia coli-ban szokásos protokollok szerint (18, 19). A sejteket összegyûjtöttük centrifugálással, újra felszuszpendáltuk 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaClpufferben, pH=8, és lizáltuk szonikálással. A rekombináns fehérjéket centrifugálással választottuk el. Az oldhatatlan fehérjeaggregátumot tartalmazó csapadékot felszuszpendáltuk 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M ureában (pH=8) (denaturálópuffer) és kevertettük 60 percen keresztül. A szolubilizált rekombináns fehérjéket centrifugálással elválasztottuk az oldhatatlan törmeléktõl, és megtisztítottuk affinitási kromatográfiával denaturáló körülmények között, nitrilotriecetsavval kapcsolt agarózoszlop alkalmazásával, amely kelálja az allergénhez fuzionáltatott hat hisztidines részlettel kölcsönhatásba lépõ nikkelionokat. A megtisztított fehérjéket újra feltekertük dialízissel 16 órán keresztül 4 °C¹on 0,68% NaCl, 0,275% NaHCO3 oldatban. 3. példa – Allergiás alanyokból származó szérumok jellemzése Szérumokat gyûjtöttünk Betula verrucosa-pollen szezonális allergia és B. verrucosa-allergénekre RAST 4+ specifikus reaktivitás anamnézisû páciensektõl és azután azokat összeöntöttük. Nem allergiás páciensektõl származó szérumkészletet alkalmaztunk negatív kontrollként. 4. példa – Bet v 1 variánsok IgE-kre való reaktivitásának ELISA elemzése szérumkészletben Ugyanolyan mennyiségû wt allergént és mutagenizált variánst (0,5 mg) 50 mM karbonát/bikarbonát pufferben, pH=9,6, adszorbeáltunk polisztirollemezek mérõhelyeire ELISA vizsgálati eljáráshoz, 4 °C¹on történõ 16 órás inkubálással. A mérõhelyeket megmostuk mosóoldattal (60 mM foszfátpuffer, pH=6,5, amely 0,05% Tween-20¹at tartalmaz), és blokkoltuk hígítóoldattal (25% lószérum, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% Tiomerzal 150 mM foszfátpufferben, pH=7,4). RAST 4+ humán szérumok sorozathígításainak (hígítópufferben) 100 ml¹es aliquotjait adtuk az egyes mintákhoz és inkubáltuk 25 °C¹on 2 órán keresztül. Három mosás után peroxidázkonjugált antihumán-IgE szérumot (1:1500 hígítópufferben) adtunk hozzá, majd inkubáltuk 25 °C¹on 1,5 órán keresztül. Három mosás után a kolorimetriás reakciót 100 ml TMB reagens (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) hozzáadásával hívtuk elõ 15 percen keresztül inkubálva 25 °C¹on. A reakciót 100 ml 1 N HCl hozzáadásával állítottuk le, és leolvastuk 450 nm¹en mikrotiterlemez-leolvasó spektrofotométerrel.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
rõhelyeire ELISA vizsgálati eljáráshoz, 4 °C¹on történõ 16 órás inkubálással. A mérõhelyeket megmostuk mosóoldattal (60 mM foszfátpuffer, pH=6,5, amely 0,05% Tween-20¹at tartalmaz), és blokkoltuk hígítóoldattal (25% lószérum, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% Tiomerzal 150 mM foszfátpufferben, pH=7,4). RAST 4+ humán szérumkészlet hígítópufferben készített 1:3 hígításainak 100 ml¹es aliquotjait elõinkibáltuk 25 °C¹on 2 órán keresztül wt allergén és mutagenizált variáns sorozathígításaival. A kapott oldatot a mérõhelyekbe helyeztük és inkubáltuk 4 °C¹on 16 órán keresztül. Három mosás után 0,06 M foszfát pH=6,5, Tween¹20 0,05%, pufferben, peroxidázkonjugált antihumán IgE-szérumot (1:1500 hígítópufferben) adtunk hozzá, majd inkubáltuk 25 °C¹on 1,5 órán keresztül. Három mosás után a kolorimetriás reakciót 100 ml TMB reagens (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) hozzáadásával hívtuk elõ 15 percen keresztül inkubálva 25 °C¹on. A reakciót 100 ml 1 N HCl hozzáadásával állítottuk le, majd spektrofotometriásan leolvastuk 450 nm¹en. A gátlási százalékot a következõképpen számítottuk ki: 100×[(A¹B)/A], ahol A a 450 nm¹es abszorbancia az inhibitor hiányában, míg B az abszorbancia az inhibitor jelenlétében. 6. példa – Bet v 1 variánsok IgE-kre való reaktivitásának Western-blot-elemzése szérumkészletben Ugyanolyan mennyiségû vad típusú allergént és mutagenizált formát (1,5 mg) elektroforetizáltunk poliakrilamidgélen, majd elektroblotoltuk nitrocellulózmembránra, amint Towbin ismerteti (20). A membránt elõször egy órán keresztül inkubáltuk TBST-ben (TBS, 0,05% Tween¹20), amely 5% zsírmentes tejport tartalmazott (telítési puffer) és azután éjszakán keresztül inkubáltuk Betula verrucosára allergiás, 4+ reaktivitású alanyokból származó szérumkészletekkel, meghígítva 1:3 arányban TBST 2% zsírmentes tejpor pufferben. 1 órás inkubálás után a membránt háromszor megmostuk TBST-vel. A membránkötött ellenanyagokat érintkeztettük peroxidázkonjugált antihumán IgE-szérummal és többszöri mosás után detektáltuk a kemilumineszcenciás detektálási rendszerrel, amely luminolt alkalmaz a peroxidáz szubsztrátjaként (ECL, Amersham). Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: Bet v 1 allergén és Bet v 1 hipoallergén variánsok IgE-reaktivitásának ELISA elemzése; 2. ábra: Bet v 1 allergén és variánsai IgE-reaktivitásának Western-blot-elemzése.
Hivatkozások 1. Mailing H. J., (1998) „Immunotherapy as an effective tool in allergy treatment”. Allergy, 53: 461. 2. Toubi E., Kessel A., Blant A., Golan T. D., (1999) „Follow¹up after systemic adverse reactions of immu60 notherapy”. Allergy, 54(6): 617–620. 55
5. példa – ELISA-gátlási vizsgálati eljárás Bet v 1 variánsok wt Bet v 1 szérumkészletekbõl származó IgE-khez való kötésének gátlása 1 mg wt allergént 50 mM karbonát/bikarbonát pufferben, pH=9,6, adszorbeáltunk polisztirollemezek mé-
2
4
1
HU 008 220 T2
3. Akdis C. A., Blaser K., (2000) „Regulation of specific immune response by chemical and structural modifications of allergens”. Int. Arch. Allergy Immmunol., 121(4): 261–269. 4. Breiteneder H., Pettenburger K., Bito A et al. (1989). „The gene coding for the major birch pollen allergén Bet v 1, is highly homologous to a pea disease resistance response gene”. EMBO J, 8: 1935–1938. 5. Valenta R., Duchene M., Pettenburger K., Sillaber C., Valent P., Bettelheim P., Breitenbach M., Rumpold H., Kraft D., Scheiner O. (1991). „Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuals.” Science 253:557–560. 6. Batard T., Didierlaurent A., Chabre H., et al., (2005). „Characterization of wild-type recombinant Bet v la as a candidate vaccine against birch pollen allergy”. Int Arch Allergy Immunol. 136: 239–249. 7. Swoboda I., Jilek A., Ferreira F., Engel E., Hoffinann-Sommergraber K., Scheiner O., Kraft D., Breiteneder H., Pittenauer E., Schmid E., Vicente O., Heberle-Bors E., Ahorn H., Breitenbach M. (1995). „Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning”. JBC. 270 (6): 2607–2613. 8. Swoboda L, Scheiner O., Heberle-Bors E., Vicente O., (1992). „cDNA cloning and characterisation of three genes in the Bet v 1 gene family that encode pathogenesis-related proteins”. Plant Cell Environ. 18: 865–874. 9. Markovic-Housley Z., Degano M., Lamba D., von Roepenack-Lahaye E., Clemens S., Susani M., Ferreira F,, Scheiner O., Breiteneder H. (2003). „Crystal structure of a hypoallergenic isoform of the major birch pollen allergen Bet v 1 and its likely biological function as a plant steroid carrier. J Mol Biol, 325: 123–133. 10. Niederberger V., Pauli G., Gronlund H. et al. (1998). „Recombinant birch pollen allergens (rBet v 1 and rBetv 2) contain most of the IgE epitopes present in birch, alder, hornbeam, hazel, and oak pollen: a quantitative IgE inhibition study with sera from different populations”. J Allergy Clin Immunol. 102: 579–591. 11. Neudecker P, Lehmann K, Nerkamp J, Haase T, Wangorsch A, Fotisch K, Hoffmann S, Rosch P, Vieths S, Scheurer S. (2003). „Mutational epitope analysis of Pru av 1 and Api g 1, the major allergens of cherry (Prunus avium) and celery (Apium graveolens): correlating IgE reactivity with three-dimensional structure”. Biochem J. 376(Pt 1):97–107.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
12. Asero R. (1998). „Effects of birch pollen-specific immunotherapy on apple allergy in birch pollen hypersensitive patients”. Clin Exp Allergy. 28: 1368–1373. 13. Visco V, Dolecek C, Denépoux S, Le Mao J, Guret C, Rousset F, Guinnepain MT, Kraft D, Valenta R, Weyer A, Banchereau J, Lebecque S. (1996). „Human IgG monoclonal antibodies that modulate the binding of specific IgE to birch pollen Bet v 1”. J. Immunol. 157: 956–962. 14. Vrtala S, Ball T, Spitzauer s, Pandjaitan B, Suphioglu C, Knox B, Sperr WR, Valent P, Kraft D, Valenta R. (1998). „Immunization with purified natural and recombinant allergens induces mouse IgG1 antibodies that recognize similar epitopes as human IgE and inhibit the human IgE-allergen interaction and allergen-induced basophil degranulation”. J Immunol 160: 6137. 15. Paul, (1989), „Fundamental Immunology”, Raven press, New York. 16. Cryz, S. J. (1991), „Immunotherapy and Vaccines”, VCH Verlagsgesellschaft. 17. Wang W., Malcolm BA. (2002). „Two-stage polymerase chain reaction protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions, and insertions, using QuikChange site-directed mutagenesis”. Methods Mol Biol.; 182: 37–43. 18. Younghee Kim. (2004). „Cloning and Expression of a Lipase Gene from Rice (Oryza sativa cv. Dongjin)”. Mol. Cells, 18 (1): 40–45. 19. Asturias JA, Ibarrola I, Eseverri JL, Arilla MC, Gonzales-Rioja R, Martinez A. (2004). „PCR-based cloning and immunological characterization of Parietaria judaica pollen profilin”. J Investig Allergol Clin Immunol, 14: 43–48. 20. Towbin J., Staehelin T., Gordon J., (1979). „Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350–4354. A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása 1. azonosító számú szekvencia: <223> Vad típusú Bet v 1 Betula verrucosából 2–5. azonosító számú szekvenciák: <223> Bet v 1 mutáns 6. azonosító számú szekvencia: <223> Vad típusú Bet v 1 – kódolószekvencia 7–10. azonosító számú szekvenciák: <223> Bet v 1 mutáns – kódolószekvencia
Szekvencialista <110> LOFARMA S.P.A. <120> Hypoallergenic variants of the major allergen from Betula verrucosa pollen <130> 7683Meur <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown 5
2
HU 008 220 T2
<220> <223> Wild-type Bet v 1 from Betula verrucosa <400> 1
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys 20 25 30 Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly 35 40 45 Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 50 55 60 Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu 85 90 95 Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val 115 120 125 Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu 130 135 140 Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant <400> 2
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys 20 25 30 Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly 35 40 45 Gly Pro Gly Thr Ile Ala Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 50 55 60 Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu 85 90 95 Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser 100 105 110 6
HU 008 220 T2
Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val 115 120 125 Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu 130 135 140 Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 <210> 3 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant <400> 3
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys 20 25 30 Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly 35 40 45 Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 50 55 60 Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu 85 90 95 Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ala Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val 115 120 125 Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu 130 135 140 Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 <210> 4 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant <400> 4
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys 20 25 30
7
HU 008 220 T2
Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly 35 40 45 Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 50 55 60 Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu 85 90 95 Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Ala Gly Asp His Glu Val 115 120 125 Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu 130 135 140 Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 <210> 5 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant <400> 5
Gly Val Phe Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala 1 5 10 15 Arg Leu Phe Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys 20 25 30 Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly 35 40 45 Gly Pro Gly Thr Ile Ala Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 50 55 60 Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu 85 90 95 Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ala Ile Asn Asn Lys Tyr His Thr Ala Gly Asp His Glu Val 115 120 125 Lys Ala Glu Gln Ile Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu 130 135 140 Arg Ala Val Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn 145 150 155 8
HU 008 220 T2
<210> 6 <211> 480 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Wild-type Bet v 1 – coding sequence <400> 6
ggtgttttca gcctttatcc gttgaaaaca ggcttccctt tacaattaca gagataaaga cataccaaag gagacacttt
attacgaaac ttgatggcga ttgaaggaaa tcaagtacgt gcgtgatcga tagtggcaac gagaccatga tgagggccgt
tgagaccacc taatctcttt tggagggcct gaaggacaga gggcggtccc ccctgatgga ggtgaaggca tgagagctac
tctgttatcc ccaaaggttg ggaaccatta gttgatgagg ataggcgaca ggttccatct gagcagatta ctcttggcac
cagcagctcg caccccaagc agaagatcag tggaccacac cattggagaa tgaagatcaa aggcaagtaa actccgatgc
actgttcaag cattagcagt ctttcccgaa aaacttcaaa gatctccaac caacaagtac agaaatggga ctacaactaa
60 120 180 240 300 360 420 480
tctgttatcc ccaaaggttg ggaaccattg gttgatgagg ataggcgaca ggttccatct gagcagatta ctcttggcac
cagcagctcg caccccaagc cgaagatcag tggaccacac cattggagaa tgaagatcaa aggcaagtaa actccgatgc
actgttcaag cattagcagt ctttcccgaa aaacttcaaa gatctccaac caacaagtac agaaatggga ctacaactaa
60 120 180 240 300 360 420 480
tctgttatcc ccaaaggttg ggaaccatta gttgatgagg ataggcgaca ggttccatct gagcagatta ctcttggcac
cagcagctcg caccccaagc agaagatcag tggaccacac cattggagaa tggcgatcaa aggcaagtaa actccgatgc
actgttcaag cattagcagt ctttcccgaa aaacttcaaa gatctccaac caacaagtac agaaatggga ctacaactaa
60 120 180 240 300 360 420 480
tctgttatcc ccaaaggttg ggaaccatta gttgatgagg ataggcgaca
cagcagctcg caccccaagc agaagatcag tggaccacac cattggagaa
actgttcaag cattagcagt ctttcccgaa aaacttcaaa gatctccaac
60 120 180 240 300
<210> 7 <211> 480 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant – coding sequence <400> 7
ggtgttttca gcctttatcc gttgaaaaca ggcttccctt tacaattaca gagataaaga cataccaaag gagacacttt
attacgaaac ttgatggcga ttgaaggaaa tcaagtacgt gcgtgatcga tagtggcaac gagaccatga tgagggccgt
tgagaccacc taatctcttt tggagggcct gaaggacaga gggcggtccc ccctgatgga ggtgaaggca tgagagctac
<210> 8 <211> 480 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant – coding sequence <400> 8
ggtgttttca gcctttatcc gttgaaaaca ggcttccctt tacaattaca gagataaaga cataccaaag gagacacttt
attacgaaac ttgatggcga ttgaaggaaa tcaagtacgt gcgtgatcga tagtggcaac gagaccatga tgagggccgt
tgagaccacc taatctcttt tggagggcct gaaggacaga gggcggtccc ccctgatgga ggtgaaggca tgagagctac
<210> 9 <211> 480 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant – coding sequence <400> 9
ggtgttttca gcctttatcc gttgaaaaca ggcttccctt tacaattaca
attacgaaac ttgatggcga ttgaaggaaa tcaagtacgt gcgtgatcga
tgagaccacc taatctcttt tggagggcct gaaggacaga gggcggtccc
9
1
HU 008 220 T2
2
gagataaaga tagtggcaac ccctgatgga ggttccatct tgaagatcaa caacaagtac cataccgcag gagaccatga ggtgaaggca gagcagatta aggcaagtaa agaaatggga gagacacttt tgagggccgt tgagagctac ctcttggcac actccgatgc ctacaactaa
360 420 480
<210> 10 <211> 480 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bet v 1 mutant – coding sequence <400> 10
ggtgttttca gcctttatcc gttgaaaaca ggcttccctt tacaattaca gagataaaga cataccgcag gagacacttt
attacgaaac ttgatggcga ttgaaggaaa tcaagtacgt gcgtgatcga tagtggcaac gagaccatga tgagggccgt
tgagaccacc taatctcttt tggagggcct gaaggacaga gggcggtccc ccctgatgga ggtgaaggca tgagagctac
tctgttatcc ccaaaggttg ggaaccattg gttgatgagg ataggcgaca ggttccatct gagcagatta ctcttggcac
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Fehérje, amely a Betula verrucosa pollen fõ allergénjének (Bet v 1) hipoallergén variánsa, és amelyet az jellemez, hogy: a) csökkent reaktivitást mutat IgE¹k iránt, összehasonlítva a vad típusú Bet v 1¹gyel (1. azonosító számú szekvencia, SEQ ID NO:1); és b) aminosavszekvenciája i) legalább 87%-ban, elõnyösen legalább 94%ban, elõnyösebben legalább 97%-ban azonos az 1. azonosító számú szekvenciával; ii) az 1. azonosító számú szekvenciával egymás alá rendezve szubsztitúciót vagy deléciót mutat az 1. azonosító számú szekvencia 54. aminosavának megfelelõ Lys oldalláncban. 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, ahol a Lys oldallánc semleges vagy poláros aminosav-oldallánccal van szubsztituálva. 3. A 2. igénypont szerinti fehérje, ahol a semleges vagy poláros aminosav az Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser közül van kiválasztva. 4. A 3. igénypont szerinti fehérje, ahol az aminosav Ala, Ser vagy Thr. 5. Az 1. igénypont szerinti fehérje, amelynek az aminosavszekvenciája a 2. azonosító szám szerinti (SEQ ID NO:2). 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje immunológiailag aktív peptidfragmense, amely
25
30
35
40
45
50
10
cagcagctcg caccccaagc cgaagatcag tggaccacac cattggagaa tggcgatcaa aggcaagtaa actccgatgc
actgttcaag cattagcagt ctttcccgaa aaacttcaaa gatctccaac caacaagtac agaaatggga ctacaactaa
60 120 180 240 300 360 420 480
15–35 aminosavat tartalmaz és hordozza a fent definiált Lys szubsztitúciót és/vagy deléciót. 7. A 6. igénypont szerinti peptid, amely 15–20 aminosavat tartalmaz. 8. Nukleinsavmolekula, amely 1–5. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy 6. vagy 7. igénypont szerinti peptidet kódol. 9. A 8. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amelynek szekvenciája a 7. azonosító szám szerinti (SEQ ID NO:7). 10. Vektor, amely 8. vagy 9. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz. 11. Gazdasejt, amely 10. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 12. Gyógyászati készítmény, amely 1–5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje vagy 6. vagy 7. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozókkal és excipiensekkel együtt. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, amely vakcina formájú. 14. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje vagy a 6. vagy 7. igénypont szerinti peptid alkalmazása allergiás betegségek profilaktikus vagy terápiás kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállítására. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, bronchialis asztma, rhinitis, konjunktivitisz és atopiás dermatitisz kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállítására.
HU 008 220 T2 Int. Cl.: A61K 39/36
11
HU 008 220 T2 Int. Cl.: A61K 39/36
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
