!HU000003091T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 091
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 715355 (22) A bejelentés napja: 2004. 02. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040715355 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1597376 A2 2004. 09. 16. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1597376 B1 2007. 12. 19.
(51) Int. Cl.: C12N 15/86 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04078912 PCT/FR 04/00460
(30) Elsõbbségi adatok: 20032421086 2003. 02. 28.
(73) Jogosultak: Institut Pasteur, Paris (FR); Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Paris (FR); Universite Paris 7-Denis Diderot, Paris (FR)
CA
(72) Feltalálók: Naffakh, Nadia, Malakoff (FR); Massin, Pascale, Saint Brieuc (FR); van der Werf, Sylvie, Gif sur Yvette (FR)
(54)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Csirkeeredetû RNS-polimeráz I promoter és alkalmazása
(57) Kivonat
HU 003 091 T2
A találmány tárgyát képezik transzkripciós promoter aktivitású, új polinukleotidok, ilyen polinukleotidot tartalmazó vektorok, valamint azok alkalmazása kívánt szekvenciák transzkripciójára, például sapka nélküli
(„uncapped”) virális RNS elõállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá gazdasejtek, elõnyösen madáreredetû gazdasejtek, amelyek a találmány szerinti polinukleotidot vagy vektort tartalmazzák.
A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 091 T2
A találmány tárgyát képezi transzkripciós promoter aktivitású, új polinukleotid, ilyen polinukleotidot tartalmazó vektorok, valamint azok alkalmazása kívánt szekvenciák transzkripciójára, például sapka nélküli („uncapped”) virális RNS elõállításához. A találmány tárgyát képezik továbbá gazdasejtek, elõnyösen madáreredetû gazdasejtek, amelyek a találmány szerinti polinukleotidot vagy vektort tartalmazzák. Az influenza megelõzése lényegében vakcinázáson alapul, amely erõsen ajánlott. Franciaországban például a vakcinázás költségét teljes egészében fedezi a Nemzeti Betegbiztosítási Pénztár („Caisse National d’Assurance Maladie”) kockázatnak kitett alanyok számára: lényegében a 65 éves vagy annál idõsebb egyének, valamint a krónikus (légzési¹, kardiovaszkuláris¹, vese- vagy anyagcsere¹) betegségben szenvedõk számára. A vakcinázást követõ immunitást felszíni glükoproteinek, közelebbrõl hemagglutinin (HA), továbbá neuraminidáz (NA) ellen irányuló ellenanyagok közvetítik.
5
10
15
20 I. Jelenlegi eljárások: elõállítás embriót tartalmazó tyúktojásban és inaktiválás Az influenza elleni vakcinák három különbözõ vírustörzset tartalmaznak, az egyik A(H3N2), a másik A(H1N1) és a harmadik B típusú. A vakcinázásra alkalmazott törzsek kiválasztását minden évben február közepén újra mérlegelik az elõforduló variánsokról megfigyelt adatok függvényében, és az OMS („Organisation Mondiale de la Santé”, Egészségügyi Világszervezet, WHO) által kibocsátott ajánlás tárgyát képezi a nyugati félteke számára. A jelenleg alkalmazott vakcinák, éppúgy, mint az utolsó mintegy harminc évben, olyan vírust tartalmaznak, amelyet megtermékenyített tyúktojásban szaporítottak, majd inaktiváltak [Manuguerra: Représ sur les infections bronchopulmonaires, 328–342, Szerk.: P. Léophonte & Y. Mouton: PIL (2001)]. Az A típusú vírusok esetében, embrionált tojásban jó szaporodási képességet mutató, a WHO által kijelölt HA és NA variánsokat tartalmazó, reasszortáns vírusokat preparálnak és adnak át az ipari méretû vakcinatermelõknek. Egy adag trivalens vakcina elõállításához egy vagy két megtermékenyített tojással kell számolni. A tisztítást a gyártó társaságok különbözõ eljárással végzik, azonban ugyanazon elvet követik: az allantois folyadékot összegyûjtik, majd a vírust formalinnal vagy b¹propiolaktonnal történõ kezeléssel inaktiválják, mielõtt ultracentrifugálással tisztítják. A vírust esetleg fragmentálják, lipid oldószereket és/vagy detergens oldószereket, például Tween 80 reagenst alkalmazva. A teljes vagy fragmentált vírust vakcinaadagonként és vírustörzsenként a szokásos 15 mg HA dózisra állítják be. Dializálható detergens jelenlétében végzett tisztítási lépés lehetõvé teszi olyan alegységvakcina elõállítását, amely lényegében nem tartalmaz mást, mint a vírusburok („envelope”) glükoproteinjeit (HA és NA). Mivel egész víruson alapuló vakcinák erõsebb reaktogenitást mutatnak, napjainktól elsõsorban fragmentált és alegységvakcinákat forgalmaznak. Az idõtartam, amely adott vakcina elõállításához és európai normáknak
25
30
2
megfelelõ minõségellenõrzéséhez szükséges, körülbelül 6 hónap. Az influenza elleni, inaktivált vírust tartalmazó vakcinákat az injektált egyének jól tolerálják, és csak enyhe fokú nem kívánt hatásokat váltanak ki: helyi reakciókat az injektálás helyén, az injektálást követõen 2 napig tartó, lázzal és fejfájással járó reakciókat. Az influenza elleni vakcinázás csak tojásfehérjékkel, elsõsorban ovalbuminnal szemben ellenjavallt, valamint gyártási maradványokkal és higany-tioláttal szemben megnyilvánuló allergiára korlátozódik. Fejlõdõ magzatra esetleg kifejtett hatására vonatkozó információ hiányában, az influenza elleni vakcinázás terhes nõk esetében a terhesség elsõ trimeszterében nem ajánlott. Inaktivált vírust tartalmazó, adott vakcinának egy rá következõ influenzafertõzés ellen kifejtett protektív hatása nehezen értékelhetõ, mivel a hatásfok szezononként nagyon eltérõ lehet, elsõsorban a cirkuláló vírus és a vakcinában található vírusok közötti antigénbeli rokonság mértékének a függvénye, valamint függ továbbá a vakcinázott személy immunstátusától. Franciaországban, 1979 és 1999 évek között a vakcinával történt javuló lefedettség az influenzához köthetõ halálozások számának csökkenésével társult (1979-ben 20 000 haláleset, 1985-tõl évente 2500 haláleset), ami a vakcinázási politika pozitív hatására utalt, sõt azt igazolta. Másfelõl, számos tanulmány eredménye lehetõvé tette annak becslését, hogy idõs személyek vakcinázása felére csökkenti a vírusos tüdõgyulladást és a kórházi beutalásokat, valamint körülbelül 70%-kal csökkenti a végzetes kimenetelû influenza esetek számát [Large és munkatársai: Annals of Internal Medicine, 123, 518–527 (1995)].
II. Influenza elleni vakcinák fejlõdésének a kilátásai Napjainkban számos kutatási irányt vizsgálnak az alábbi célból: 1) influenzavakcinák által kiváltott válaszok intenzitásának, minõségének és idõtartamának a javítása, valamint specificitásuk növelése; és 2) gyors 40 választ lehetõvé tenni arra az esetre, ha potenciálisan pandémiát okozó, új vírusszubtípus üti fel a fejét. Az alábbiakban élõ vakcinák elõállításával, valamint sejtkultúrákban elõállított vakcinavírusokkal foglalkozó munkákat összegezünk. Az egyéb kutatási irányok között meg 45 kell említeni továbbá adjuvánsok, rekombináns alegységvakcinák és polinukleotid-vakcinák alkalmazását. 35
Élõ vakcinák elõállítása Élõ vírust tartalmazó, influenza elleni vakcina felte50 hetõleg erõsebb és tovább tartó immunitást vált ki, elsõsorban mert az immunitást sejtes közvetítéssel stimulálja, és a lakosság inkább elfogadja, mivel azt az orr nyálkahártyájára adagolják, és nem parenterálisan adják be. Napjainkban két típusú élõ vakcinát kell szá55 mításba venni: attenuált élõ vakcinákat és rekombináns élõ vakcinákat. Attenuált, élõ vírust tartalmazó vakcinák Attenuált törzseket úgy állítanak elõ, hogy cirkuláló 60 vad törzseket olyan, alacsony hõmérséklethez adap2
1
HU 003 091 T2
tált, attenuált donortörzzsel válogatnak össze (reasszortáns vírusok), amelynek genotípusa jól jellemzett, anélkül azonban, hogy a megfigyelt mutációk és a fenotípus közötti összefüggést (attenuálás, adaptálódás alacsony hõmérséklethez, hõre érzékenység) pontosan megállapították volna [Keitel és munkatársai: Textbook of Influenza, 373–390 szerk.: K. G. Nicholson, R. G. Webster & A. J. Hay; Blackwell Science Ltd., Oxford, Anglia (1998)]. Attenuált vakcinák tyúktojásban történõ elõállítása megegyezik a fent ismertetettekkel, azonban az inaktiválás lépése természetesen kimarad. Amerikai laboratóriumok által végzett legújabb klinikai vizsgálatok eredménye szerint, a nazális úton beadott, attenuált törzseket tartalmazó vakcinák ártalmatlannak bizonyultak felnõttekben, idõskorúakban és gyermekekben, egyedüli másodlagos hatásként torokirritáció és orrfolyás fordult elõ a vakcinázást követõ 48 óra során. Erõsebb protektív hatást fejthetnek ki, mint az inaktivált vakcinák, elsõsorban a nyálkahártyán indukált IgA típusú ellenanyagválasz révén, azonban transzmissziós potenciáljukat és reverziójuk lehetõségét még dokumentálni kell. Élõ, attenuált vírusokkal történõ vakcinázás több évtizedes gyakorlat Oroszországban, azonban meggyõzõ, általános következtetések levonása az alkalmazott, egymástól nagyon eltérõ körülmények miatt nem lehetséges. Rekombináns, élõ vírust tartalmazó vakcinák Újabban, reverz genetikai rendszerek influenzavírusokra történõ alkalmazása [Neumann és munkatársai: Virology 287, 243–250 (2201)] lehetõvé tette számításba venni olyan rekombináns vírusok elõállítását, amelyek genomjába a genetikai módosításokat kifejezetten azért vitték be, hogy azokat megfelelõ attenuáltsági és immunogenitásbeli tulajdonságokkal ruházzák fel. Ez a megközelítés fokozott biztonságot jelent (hiányozhatnak olyan típusú kontamináló ágensek, mint például amelyek a vírustörzsek mintavételekor eredetileg jelen lehetnek, valamint az a lehetõség, hogy könnyen minimalizálható és ellenõrizhetõ a vakcinavírus reverziójának a kockázata) és lehetõvé teszi specifikusabban válaszolni különbözõ járványtani szituációkra. A ma létezõ reverz genetikai rendszerek a humán RNS-polimeráz I transzkripciós rendszeren alapulnak. Az RNS-polimeráz I alkalmazása szûk fajspecificitása miatt humán- és fõemlõs-eredetû sejtekre korlátozódik. Alkalmazható rekombináns vakcinavírusok elõállítására sejttenyészetekben, de megtermékenyített tyúktojásban nem. Vakcinavírusok elõállítása sejttenyészetben Influenza-vakcinavírusok megtermékenyített tyúktojásban történõ elõállításának a legfõbb elõnyei: i) a nagyon magas vírushozam; és ii) az emberre nézve patogén ágensekkel való kontamináció alacsony kockázata, amelyet különösen figyelembe kell venni nem inaktivált vírust tartalmazó vakcinák elõállításának a perspektívájából. Vakcinavírusok szérummentes tápközegben tenyésztett sejtekben történõ elõállítását szintén vizsgál-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
ták. Újabban a Baxter cég Vero¹, míg a Solvay cég MDCK-sejtvonalból származtatott sejtbankot hagyott jóvá vakcinavírus elõállítására. Egy MDCK-sejten elõállított és inaktivált vírust tartalmazó vakcina 2001-ben megkapta a forgalomba hozatali engedélyt, azonban még nincs kereskedelmi forgalomban. A jövõben a kereskedelmi forgalomban számos, inaktivált és élõ, megtermékenyített tojásban vagy sejttenyészetben elõállított, influenza elleni vakcinatípus egymás mellett létezésével kell számolni, amelyek közül néhány az egyének bizonyos kategóriájának a vakcinázására javallott, míg más kategóriák vakcinázására kevésbé ajánlható. Pandémia esetén, az elõállítás minden hozzáférhetõ módját, történjen az megtermékenyített tojásban vagy sejttenyészeten, mozgósítani kell. Találmányunk ezekre az igényekre, valamint további olyan igényekre ad választ, amelyek a találmány leírását olvasó szakember számára nyilvánvalók. A találmány tárgyát képezi polinukleotid, ilyen polinukleotidot tartalmazó rekombináns DNS¹ek, valamint alkalmazásuk, elõnyösen vakcinaként alkalmazható sapkanélküli RNS-vírusok elõállítására. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi izolált vagy tisztított polinukleotid, amely az 1. ábrán bemutatott, 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciából vagy annak fragmensébõl állt, és amely transzkripciós promoteraktivitást mutat. A találmány tárgyát képezi továbbá izolált vagy tisztított polinukleotid, amely az 2. ábrán bemutatott, 2. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciából vagy annak fragmensébõl áll, és amely transzkripciós promoteraktivitást mutat. A találmány tárgyát képezi továbbá rekombináns DNS, amely a találmány szerinti bármely polinukleotidot vagy annak fragmensét tartalmazza; a találmány szerinti bármely polinukleotidot vagy rekombináns DNS¹t vagy azok fragmensét tartalmazó vektor; a fenti vektort tartalmazó gazdasejt vagy madáreredetû megtermékenyített tojás. A találmány tárgyát képezi továbbá az alábbiak közül választott, legalább egy alkotórész alkalmazása olyan kívánt szekvencia elõállítására, mint például rekombináns, sapkanélküli RNS-vírus elõállítására: – a találmány szerinti polinukleotid; – a találmány szerinti rekombináns DNS; – a találmány szerinti vektor; – a találmány szerinti gazdasejt; és – a találmány szerinti, madáreredetû megtermékenyített tojás. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás rekombináns, sapkanélküli vírusnak reverz genetikai eljárással történõ elõállítására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) egy vagy több olyan vektor bejuttatását gazdasejtbe vagy madáreredetû, megtermékenyített tojásba, amely vektor vagy vektorok tartalmazzák a találmány szerinti rekombináns DNS¹t és a vírus-RNS transzkripciójához/replikálódásához szükséges proteineket expresszáló DNS¹t;
1
HU 003 091 T2
b) olyan körülmények alkalmazását, amelyek az a) pont szerinti gazdasejtben vagy tojásban lehetõvé teszik rekombináns vírusok expresszálódását; és c) a b) lépésben elõállított vírusok kinyerését. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás rekombináns influenzavírus elõállítására reverz genetikai eljárással, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) legalább egy olyan vektor bejuttatását gazdasejtbe vagy madáreredetû, megtermékenyített tojásba, amely vektor tartalmazza a találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerinti rekombináns DNS¹t, valamint adott influenzavírus PA, PB1, PB2 és NP proteinjeit expresszáló vektorokat; b) olyan körülmények alkalmazását, amelyek az a) pont szerinti gazdasejtben vagy tojásban lehetõvé teszik rekombináns influenzavírusok expresszálódását; és c) a b) lépésben elõállított influenzavírusok kinyerését. Elõnyösen, a csirkeeredetû RNS-polimeráz I promoterének a klónozása lehetõvé teszi olyan reverz genetikai rendszer kifejlesztését, amely adaptálható rekombináns vakcinavírusok megtermékenyített tyúktojásban történõ elõállítására, valamint amely rendszer elõnyösen adaptálható élõ vakcinák elõállítására. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a csirkeeredetû RNS-polimeráz I promotert tartalmazó, csirkeeredetû genomiális DNS AgeI-SacI fragmensének (1. azonosító számú szekvencia) megfelelõ szekvenciát mutatja. A 2. ábra egy további, csirkeeredetû RNS-polimeráz I promotert tartalmazó, csirkeeredetû genomiális DNS fragmens (BsaI-SacI) (2. azonosító számú szekvencia) szekvenciáját mutatja. A 3. ábra az alkalmazott eljárást mutatja, amely szerint a CAT szekvencia transzkripciójának a hatásfokát vizsgáltuk, a C13–18 kozmidból származtatott szekvencia alkalmazásával. A 4. ábra a C13–18 kozmidból származtatott PacI/NotI fragmensbõl származtatott restrikciós fragmensek iteratív vizsgálatának ez eredményét mutatja. Az 5. ábra párhuzamosan végzett szekvenálás és primer extenziós reakciók eredményét ábrázolja, amely az 1. ábra szerinti AgeI/SacI fragmensen belül mutatja a csirkeeredetû polimeráz I transzkripciója kezdetének az elsõdleges helyét. A 6. ábra egy diagram, amely CAT-szintek mérését mutatja olyan sejtek citoplazma-kivonatából, amelyeket influenza pszeudo-RNS¹t kódoló plazmidokkal transzfektáltunk, humáneredetû vagy csirkeeredetû PolI promoterek szabályozása alatt (ng/106 transzfektált sejt, 24 órával a transzfektálást követõen).
5
2
Találmányunk eredetisége olyan polinukleotidszekvencián alapul, amely elõnyösen transzkripciós promoteraktivitást mutat, elsõsorban madáreredetû sejtekben. Ezt a promoterszekvenciát csirkeeredetû RNS polimeráz I promoterszekvenciaként azonosítottuk. A találmány tárgyát képezi továbbá a polinukleotid alkalmazása kívánt szekvenciák elõállítására, mint például rekombináns influenzavírusok reverz genetikai rendszerekkel történõ elõállítására.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
1. Polinukleotid és rekombináns DNS Egy elsõ szempont szerint, a találmány tárgyát képezi izolált vagy tisztított polinukleotid, amely tartalmazza az 1. ábrán bemutatott, 1. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát, vagy a 2. ábrán bemutatott, 2. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát, vagy azok fragmensét. A polinukleotid vagy egyik fragmense transzkripciós promoteraktivitást mutat. Ami a fragmenseket illeti, olyan fragmensek elõnyösek, amelyek az 1. vagy a 2. azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciák legalább 10, 12, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75 vagy 100 egymást követõ nukleotidját tartalmazzák és transzkripciós promoteraktivitást mutatnak. Bár a találmány szerinti polinukleotidot és promotert az jellemzi, hogy elõnyösen madáreredetû sejtekben mutatnak promoteraktivitást, a promoter olyan kapacitást mutat, hogy elõnyösebben baromfifélék, még elõnyösebben csirke sejtjeiben segíti elõ a transzkripciót. Nukleotidszekvencia, nukleinsav, nuklein- vagy nukleinsavszekvencia, polinukleotid és polinukleotidszekvencia kifejezések alatt, amelyeket megkülönböztetés nélkül alkalmazunk a leírásban, nukleotidok pontos, módosított vagy nem módosított láncolatát értjük, amely lehetõvé teszi egy adott polinukleotid fragmensének vagy régiójának a definiálását, és amely lehet duplaszálú vagy egyszálú DNS. Egyaránt idetartoznak DNS-molekulák, RNS-molekulák, mesterséges szekvenciák és azok bármely fragmense. A „származtatott”, „variáns” és „mutált” definíciók értelemszerûen vonatkozhatnak a találmány szerinti polinukleotidokra. Minden olyan polinukleotid, amelyet kémiai úton, enzimatikusan vagy metabolikusan módosítottak, azonban megtartotta a polinukleotid eredeti tulajdonságait, nevezetesen transzkripciós promoteraktivitását madáreredetû sejtekben, a találmány oltalmi körébe tartozik. Nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyát nem természetes kromoszómakörnyezetükben megtalálható, azaz természetes állapotukban létezõ nukleotidszekvenciák képezik. A találmány tárgyát olyan szekvenciák képezik, amelyeket izoláltunk és/vagy tisztítottunk, azaz amelyeket közvetlenül vagy közvetetten, például klónozással, amplifikálással és/vagy kémiai szintetizálással kiemeltünk, és amelyek környezetét legalább részben módosítottuk. Nyilvánvaló, hogy egy polinukleotid, amelyet transzformációval, genetikai manipulációval vagy a rekombinálás bármely eljárásával egy adott organizmusba beviszünk, akkor is „izolált”, amikor az adott organizmusban jelen van.
1
HU 003 091 T2
A találmány szerinti promoterszekvenciák elõnyösen olyan DNS-szekvenciájúak, amelyek 70%-nál nagyobb egyezést mutatnak az 1. és 2. ábrán bemutatott, 1. és 2. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciák bármelyikével. Elõnyösebben, a találmány szerinti promoterszekvenciák olyan DNS-szekvenciájúak, amelyek 80%-nál nagyobb fokú, elõnyösebben 90%-nál nagyobb fokú egyezést mutatnak az 1. és 2. ábrán bemutatott, 1. és 2. azonosító számú szekvenciák szerinti szekvenciák vagy azok fragmensei bármelyikével. A leírásban „százalékos egyezés” alatt olyan százalékos értéket értünk, amely két nukleinsavszekvencia közötti egyezés fokát fejezi ki a szekvencia teljes hosszát tekintve. Amennyiben a kérdéses szekvenciák nem egyforma hosszúságúak, az egyezés százalékos értékét a rövidebb szekvencia teljes hosszára vonatkoztatva fejezzük ki. Hogy az egyezés százalékos értékét kiszámoljuk, a két szekvenciát egymáshoz illesztjük oly módon, hogy az intervallumokat megengedve maximalizáljuk az egyezõ bázisok számát, majd az egyezõ bázisok számát elosztjuk a rövidebbik szekvencia bázisainak teljes számával. Egy következõ szempont szerint, a találmány tárgyát képezi a fentebb definiált polinukleotidot tartalmazó, rekombináns DNS. A rekombináns DNS tartalmazhatja például az 1. ábrán bemutatott, 1. azonosító számú szekvencia szerinti promoterszekvenciát, vagy a 2. ábrán bemutatott, 2. azonosító számú promoterszekvencia szerinti szekvenciát, vagy azok származékát, amelybe klónozószekvenciát inszertáltunk, ami lehetõvé teszi a szekvencia „hordozható” („portable”) promoterként történõ alkalmazását. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rekombináns DNS tartalmaz továbbá átírandó szekvenciát. A leírásban „átírandó szekvencia” vagy „kívánt szekvencia” alatt olyan szekvenciát értünk, amely átírandó RNS-molekulák, például vRNS-molekulák szintézise céljára mátrixszul szolgál. Elõnyösen, az átírandó szekvencia sapkanélküli RNS-vírus cDNS¹e, azaz a transzkripciós termék végei nem tartalmazhatnak kiegészítõ nukleotidokat. Még elõnyösebben, az átírandó szekvencia negatív polaritású RNS-vírus cDNS¹e, például orthomyxovírus vagy paramyxovírus. Példaként, az orthomyxovírus lehet influenzavírus, elõnyösen A típusú influenzavírus, míg a paramyxovírus elõnyösen választható a Rubulavírus nemzetségbõl (elõnyösen mumpszvírus vagy Newcastle-betegség vírusa), a Morbilivírus nemzetségbõl (elõnyösen kanyaróvírus), a Pneumovírus nemzetségbõl (elõnyösen respiratory syncytial vírus) vagy a Metapneumovírus nemzetségbõl. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, a rekombináns az DNS¹t jellemzi, hogy orthomyxovírus-eredetû, például influenza vRNS-eredetû, elõnyösen az influenzavírus 1–8. szegmensei közül választott vRNS¹t expresszál. Az „átírandó szekvencia” vagy a „kívánt szekvencia” szolgálhat továbbá antiszensz RNS elõállítására, azaz amelynek szerkezete célszekvenciával (például negatív polaritású RNS-vírussal) történõ hibridizálás révén biztosítja adott vírus-RNS replikációjának vagy transzk-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
2
ripciójának, vagy a megfelelõ proteintermék expresszálódásának az inhibícióját. A találmány tárgyát képezik továbbá a fent ismertetett rekombináns DNS¹t tartalmazó vektorok. Ezek a vektorok lehetõvé teszik az átírandó szekvencia bejuttatását és ezt követõ expresszálódását adott gazdasejtben. Ilyen vektorokra példák a plazmid expressziós vektorok, vírusvektorok, integratív vektorok és autoszomális vektorok. Legelõnyösebben, a találmány szerinti vektor a pGEM-ChPoII-C15 plazmid. Ezt a plazmidot a pGEM-ChPoII-C15¹E. Coli törzs tartalmazza, amelyet a Budapesti Egyezmény szerint, 1–2976 nyilvántartási szám alatt, 2003. február 24¹én letétbe helyeztük a Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) gyûjteménybe [Institut Pasteur 28, rue du Dr. Roux, 75724 Párizs (Franciaország)]. A pGEM-ChPoIIC15 plazmidot a pGEM52F+ plazmidból (Promega) származtattuk. A pGEM52F+ plazmid NotI helyére bakteriális klór-amfenikol acetil-transzferázt („chloramphénicol acétyle transférase bactérienne”, CAT) kódolószekvenciából származtatott, 524 bp méretû, Eael restrikciós fragmenst klónoztunk. A pGEM5F+ EcoRI helyre a C13–18 kozmidból származtatott AgeI-SacI restrikciós fragmenst klónoztunk, a CAT inszerttõl 5’ irányban. Ez az 1260 bp hosszú fragmens tartalmazza a találmány szerinti, csirkeeredetû RNS-polimeráz I minimális promotert. A találmány tárgyát képezi továbbá olyan transzgenikus madarak elõállítása, amelyek a PolI promoter irányítása alatt olyan RNS-eket expresszálnak, amelyek madarakba patogén mikroorganizmusokkal, elõnyösen madárinfluenza-vírusokkal szembeni rezisztenciát juttatnak be. 2. Madáreredetû sejtek és megtermékenyített tojások Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezik a fent ismertetett vektorral transzformált sejtek. Az így transzformált sejt elõnyösen madáreredetû. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a gazdasejt baromfieredetû, elõnyösebben csirkeeredetû. Nyilvánvaló, hogy a találmány szelleme szerint a sejteket elõnyösen stabil módon transzformáljuk. Lehetséges azonban átmeneti módon transzformált sejtek elõállítása. Egy ezzel összefüggõ szempont szerint, a találmány tárgyát képezik továbbá madáreredetû (elõnyösen csirkeeredetû), „transzfektált” megtermékenyített tojások. Elõnyösen, a találmány szerinti megtermékenyített tojások a fent ismertetett vektorok bármelyikét tartalmazzák. A fent ismertetett vektornak a találmány szerinti gazdasejtbe vagy megtermékenyített tojásba juttatására alkalmazott eljárások sejtek transzfektálásában és tojások keltetésében jártas szakember számára jól ismertek, ezért azt részleteiben nem ismertetjük.
3. Eljárások és az alkalmazás módjai Egy további nézõpont szerint, a találmány tárgyát képezi kívánt szekvenciák, például rekombináns vakci60 navírusok, közelebbrõl rekombináns, sapkanélküli 5
1
HU 003 091 T2
RNS-vírusok elõállítása. Egy további nézõpont szerint, a találmány tárgyát képezi az alábbi alkotórészek legalább egyikének az alkalmazása kívánt szekvencia, például rekombináns, sapkanélküli RNS-vírus elõállítására: – bármely, a találmány szerinti polinukleotid; – bármely, a találmány szerinti rekombináns DNS; – bármely, a találmány szerinti vektor; – bármely, a találmány szerinti gazdasejt; és – bármely, a találmány szerinti madáreredetû, megtermékenyített tojás. Egy ezzel összefüggõ nézõpont szerint, a találmány tárgyát képezi rekombináns, sapkanélküli, rekombináns vírusok elõállítására alkalmas eljárás. Az eljárás rekombináns vírusok reverz genetikai eljárásokkal történõ elõállításának a rendszerén alapul amint azt fentebb ismertettük. Még elõnyösebben, a találmány szerinti eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) egy vagy több vektor bevitelét madáreredetû sejtbe vagy megtermékenyített tojásba, amely vektor vagy vektorok tartalmazzák a találmány szerinti rekombináns DNS¹t, valamint a vírus-RNS transzkripciójához/replikációjához szükséges proteineket (mint például adott influenzavírus PA, PB1, PB2 és NP proteinjeit) expresszáló DNS-eket; b) olyan körülmények alkalmazását, amelyek az a) pont szerinti gazdasejtben vagy tojásban lehetõvé teszik rekombináns influenzavírusok expresszálódását; és c) a b) lépésben elõállított influenzavírusok kinyerését. Nyilvánvaló, hogy az a) lépésben a teljes DNS¹t (a találmány szerinti rekombináns DNS¹t, valamint a vírus-RNS transzkripciójához/replikációjához szükséges proteineket expresszáló DNS¹t) hordozhatja egyetlen vektor, két vektor vagy több. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, a találmány tárgyát képezi továbbá rekombináns influenzavírusok elõállítására alkalmas eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) legalább egy olyan vektor bevitelét madáreredetû sejtbe vagy megtermékenyített csirketojásba, amely vektor elõnyösen influenzavírus vRNS¹t expresszáló, rekombináns DNS¹t tartalmaz, valamint influenzavírus, például elõnyösen A típusú influenzavírus PA, PB1, PB2 és NP proteinjeit expresszáló vektorokat; b) olyan körülmények alkalmazását, amelyek az a) pont szerinti gazdasejtben vagy tojásban lehetõvé teszik rekombináns influenzavírusok expresszálódását; és c) a b) lépésben elõállított influenzavírusok kinyerését. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás c) lépése, amely a rekombináns vírusok kinyerését tartalmazza, történhet közvetlenül a sejtekbõl, a sejtek lízisét követõen, vagy felülúszóból. Megtermékenyített tojás alkalmazása esetén, a szakmában járatos személy számára az így elõállított vírusok kinyerésének módja jól ismert. A találmány további jellemzõit és elõnyeit az alábbi példákkal szemléltetjük.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Példák Az alább következõ példák azt a célt szolgálják, hogy szemléltessék találmány alkalmazásának a kiterjedését, és nem azt, hogy korlátozzák annak oltalmi körét. Bár az alábbiakban ismertetettek mellett más ekvivalens eljárások és termékek alkalmazhatók a találmány teszteléséhez és megvalósításához, az alábbiakban az elõnyös termékeket és eljárásokat ismertetjük. Az reverz genetikai rendszerek, amelyeket rekombináns influenzavírusok klónozott cDNS-bõl történõ elõállítására alkalmaznak, vírus-RNS¹t (vRNS) humáneredetû RNS-polimeráz I promoter irányítása alatt kódoló plazmidok transzfektálásán alapul [Neumann és munkatársai: PNAS 96, 9345–50 (1999); Fodor és munkatársai: J. Virol. 73, 9679–82 (1999); Hoffman és munkatársai: PNAS 97, 6108–13 (2000)]. E promoter alkalmazását az a tény igazolja, hogy a transzkripciós termék végei nem tartalmazhatnak kiegészítõ nukleotidokat (ha mégis így történik, a vRNS nemkódoló 5’ és 3’ végeinél elhelyezkedõ transzkripciós/replikációs szignál nem funkcionál többé). A humáneredetû RNS-polimeráz I promoter alkalmazása a transzkripció nagyon pontos helyen történõ iniciálását, és ezáltal a transzfektált sejtekben szintetizált vRNS 5’ végének a pontosságát biztosítja. Az RNS-polimerázok szûk fajspecificitása miatt azonban [Heix és Grummt: Curr. Olvadáspont Gent. Dev. 5, 652–56 (1995)] ezt a típusú rendszert csak humánvagy fõemlõs-eredetû sejteken lehet alkalmazni. Madáreredetû sejteken alkalmazható reverz genetikai rendszer hozzáférhetõsége azonban megnyitja az utat rekombináns influenzavírusok megtermékenyített tyúktojásban történõ elõállítása elõtt, amely jelenleg az egyedüli jóváhagyott közeg influenzavakcina elõállítására az Egyesült Államokban. Az influenza prevenciójának napjainkban a vakcinázás az egyetlen módja, és bizonyos kockázati kategóriába esõ személyek számára erõsen ajánlott. A vakcina elõállítása vakcinatörzsek megtermékenyített tojásokban történõ szaporításán alapul, és a vakcina összetételének minden egyes új aktualizálásakor olyan reasszortáns vírusokat kell kiválasztani, amelyek hordozzák a cirkuláló törzsek HA és NA szegmenseit, míg a többi szegmenseket olyan donortörzsbõl kell származtatni, amely tojásban való szaporodáshoz adaptálódott. Elõnnyel jár ennek a hosszadalmas és bizonytalan eljárásnak a helyettesítése vírusreasszortánsok elõállításával reverz genetikai eljárás útján, megtermékenyített tojásban történõ elõállításával. Ennek megfelelõen, rekombináns influenzavírusok reverz genetikai eljárásokkal történõ elõállítására alkalmas rendszer perspektívájából, klónoztuk a csirkeeredetû, RNS-polimeráz I promotert. A napjainkig klónozott PolI promoterek nukleotidszekvenciái közötti homológián alapuló, PCR-eljárással történõ klónozás nem volt lehetséges, mivel a PolI transzkripciós rendszerek fajonként erõsen eltérnek. Ennek megfelelõen, a csirkegenom egészét vagy egy részét szûrtük.
1
HU 003 091 T2
1) C13–18 kozmid beszerzése A csirkegenom térképezése arra utalt, hogy a riboszomális RNS¹t kódoló gének (NOR lókusz) a 16¹os kromoszómán helyezkednek el, a hisztokompatibilitás gének lókuszának a szomszédságában [Schmid és munkatársai: Cytogenet. Cell Genet. 90, 169–218 (2000)]. Professzor H. Auffray laboratóriuma, amely a villejuif¹i l’Institut Gustave Roussy intézetben többek között a fõ hisztokompatibilitás-komplexszel foglalkozott, 1988-ban egy rekombináns kozmiddal kapcsolatos adatokat ismertetett (C13–18), amely 30 kb méretû csirkeeredetû genomiális DNS-bõl állt, amely többek között fõ hisztokompatibilitás-géneket, továbbá a NOR lokusz több transzkripciós egységét, és következésképp a PolI promoter legalább egy példányát tartalmazta [Guillemot és munkatársai: EMBO J. 7, 2775–85 (1988)]. Ezt a kozmidot R. Zoorob bocsátotta köszönettel rendelkezésünkre.
5
10
15
2. A C13–18 kozmid „Southern-blot” vizsgálata A C13–18 kozmidot „Southern-blot” eljárással vizsgáltuk, miután egyenként és kombináltan alkalmazott NotI, PacI és SfiI restrikciós enzimekkel emésztettük, és próbaként olyan oligonukleotidokat alkalmaztunk, amelyeket adatbankokban hozzáférhetõ, csirkeeredetû riboszomális RNS részleges szekvenálási adatok alapján választottunk ki: 28S/+/2 oligonukleotid: 5’¹GAGTCAGCCCTCGACACAAGCTTTTG¹3’ (3. azonosító számú szekvencia) 18S/¹/1.5 oligonukleotid: 5’¹CTACTGGCAGGATCAACCAGGT¹3’ (4. azonosító számú szekvencia) 18S/¹/4 oligonukleotid: 5’¹TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC¹3’ (5. azonosító számú szekvencia). Ez a vizsgálat lehetõvé tette a C13–18 kozmid durva restrikciós térképének a rekonstituálását, valamint a 18S és 28S riboszomális RNS-eknek a kozmidon elhelyezkedõ különbözõ restrikciós helyekhez viszonyított pozíciójának a meghatározását. A vizsgálat továbbá olyan, körülbelül 16 kb méretû PacI-NotI fragmens azonosításához vezetett, amely egy gének közötti régió nagyobbik részének felelt meg, és következésképp nagyon valószínûnek tûnt, hogy tartalmazza a PolI promoterszekvencia egy példányát.
20
3. A PacI-NotI restrikciós fragmens klónozása „riporter” vektorba, és transzkripciós promoter jelenlétének a kimutatása a PacI-NotI fragmensen belül Abból a célból, hogy teszteljük a PolI promoterszekvencia jelenlétét a PacI-NotI restrikciós fragmensen belül, a restrikciós fragmenst egy riporterszekvenciától 5’ irányba klónoztuk. Ebbõl a célból, a pCTF kozmidot [Grosveld és munkatársai: Nucleic Acid Res. 10, 6715–32 (1982)], amelyen egyetlen SalI klónozási hely található, úgy módosítottuk, hogy a SalI helyre olyan szintetikus szekvenciát inszertáltunk, amely többszörös klónozási helyeket tartalmazott (StuI-PacI-NotI-PmeI). A C13–18 kozmidból származtatott, 16 kb méretû PacI-NotI fragmenst a módosított pTCF kozmidba kló-
45
25
30
35
40
2
noztuk, az újonnan bejuttatott PacI és NotI helyekre. Két rekombináns pTCF-(PacI-NotI) kozmid klónt szelektáltunk (2.5-öst és 2.7-est). Ezt követõen, baktériumeredetû, klór-amfenikol acetil-transzferáz (CAT) génbõl származtatott, 500 bp méretû EaeI restrikciós fragmenst klónoztunk a pTCF-(PacI-NotI) kozmidok NotI helyére, mindkét orientációban. Négy rekombináns kozmid klónt szelektáltunk: a 2.5.3¹as és 2.7.13¹as (CAT „+” orientációban), valamint a 2.5.4¹es és 2.7.16¹os (CAT „–” orientációban) klónokat. Abból a célból, hogy teszteljük a PolI promoterszekvencia jelenlétét a PacI-NotI restrikciós fragmensben, QT6 vonal sejtjeit (fürj fibroszarkóma) transzfektáltuk pCTF-(PacI-NotI)–CAT(+) és pCTF-(PacI-NotI)–CAT(–) kozmidokkal. Huszonnégy órával a transzfektálást követõen, a sejtekbõl „TriZol” (Gibco-BRL) reagens alkalmazásával kivontuk az RNS¹t, majd DNázzal (RNáz-mentes DNáz, Ambion) kezeltük, hogy elimináljuk az RNS-készítményeket kontamináló kozmidmolekulákat. Az RNS-eket pontonként 5 mg mennyiségben nejlonmembránra (Hybond N+, Amersham) helyeztük, majd 32P izotóppal jelölt, CAT(+) szekvenciának megfelelõ ribopróbával hibridizáltattuk. A 2.5.4¹es és 2.7.16¹os számú, pTCF-(PacI-NotI)CAT(–) kozmiddal transzfektált sejtekbõl elõállított RNS-sek esetében pozitív szignált kaptunk, ami arra utalt, hogy PacI-NotI restrikciós fragmensben transzkripciós promoter van jelen. Ezekben az elsõ vizsgálatokban mindamellett a jel/zaj arány meglehetõsen alacsony volt. A további vizsgálatok során ezt az arányt úgy javítottuk, hogy optimalizáltuk az RNS¹ek DNázzal történõ kezelésének körülményeit (kétszer egy óra idõtartam, 37 °C¹on, 8 egység enzim jelenlétében), valamint a hibridizálás és a membránok mosásának a körülményeit (hibridizálás éjszakán át, 65 °C¹on, 50% formamid, 5×SSC, 5×Denhart és 0,5% SDS összetételû pufferben; kétszer 10 percen át tartó mosás, 65 °C¹on, 0,2×SSC és 0,1% SDS összetételû pufferben). Az eljárást, amelyet ezt követõen ismétlõdõ módon alkalmaztunk arra, hogy a PacI-NotI fragmensbõl származtatott restrikciós fragmensekben transzkripciós promoter jelenlétét vizsgáljuk, a 3. ábra szemlélteti. A kapott eredményeket az alábbiakban részletezzük, és azokat a 4. ábra szemlélteti.
4. Részleges deléciók elõállítása riportervektorba klónozott PacI-NotI restrikciós fragmensekben, valamint transzkripciós promoter jelenlétének a kimutatása egy körülbelül 6 kb méretû, SfiI-NotT fragmensben 50 Abból a célból, hogy pontosabban azonosítsuk a PacI-NotI fragmens promotert tartalmazó régióját, a PacI-NotI fragmens részleges delécióit állítottuk elõ úgy, hogy a 2.7.16¹os számú pCTF-(PacI-No55 tI)–CAT(–) és a 2.7.13¹as számú pCTF-(PacI-NotI)–CAT(+) kozmidokat PacI-SfiI vagy SfiI-NotI (az SfiI hely a PacI-NotI fragmensen belül helyezkedik el) enzimek kombinációjával emésztettük, a végeket E. coli PolI DNS Kleenow alegységek alkalmazásával feltöl60 töttük, és a kapott molekulákat önmagukkal religáltuk. 7
1
HU 003 091 T2
A deletált kozmidokban a transzkripciós promoter jelenlétét a fentebb ismertetett eljárással teszteltük (QT6 sejtek transzfektálása és a transzfektált sejtek RNS-kivonatainak a vizsgálata CAT próbával történõ hibridizálással). A kapott eredmények arra utaltak, hogy azon kozmidokban, amelyek megtartották a PacINotI fragmens SfiI-NotI (körülbelül 6 kb méretû) részét, transzkripciós promoter van jelen. 5. Az SfiI-NotI fragmensbõl származtatott restrikciós fragmensek ismétlõdõ vizsgálata, valamint transzkripciós promoter jelenlétének a kimutatása egy 1200 bp méretû AgeI-SacI fragmensben Ennél a lépésnél, továbbá hogy folytassuk az SfiINotI fragmensbõl származtatott restrikciós fragmensek ugyanazon eljárással történõ vizsgálatát, egy új riportervektort konstruáltunk. Valójában, a vizsgált restrikciós fragmensek ekkor már megfelelõen csökkentett méretûek voltak ahhoz, hogy plazmidba klónozhatók legyenek. Az új riportervektort a pGEM-5-zf+ (Promega) plazmidból állítottuk elõ, amelyben a CAT baktériumeredetû génbõl származtatott, 500 bp méretû EaeI fragmenst (+) orientációban egyedi NotI helyre klónozták. A riportervektorban található CAT szekvenciának csak ezt az orientációját alkalmaztuk, mivel korábbi tapasztalatok arra utaltak, hogy a riporter CAT(+)/ribopróba CAT(–) szekvenciapár specifikusabb és reprodukálhatóbb eredményeket adott, mint a riporter CAT(–)/ribopróba CAT(+) szekvenciapár. Az SfiI-SacI restrikciós fragmenseket (amely gyakorlatilag az SfiI-SacI fragmenst magában foglaló StuISacI fragmens) és az SfiI-NotI fragmensbõl származtatott SacI-NotI fragmenst szubklónoztuk a pGEMCAT(+) (9¹es klón) vektor EcoRV helyére, amely a CAT riporterszekvenciától 5’ irányban helyezkedik el. A fent ismertetett eljárással transzkripciós promoter jelenlétét mutattuk ki egy pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (12¹es klón) plazmidba klónozott, StuI-SacI fragmensben. Létrehoztuk az StuI-SacI fragmens restrikciós térképét, amely a pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (12¹es klón) plazmid SmaI és AgeI restrikciós enzimekkel történõ emésztésén alapult. Két SmaI-SmaI restrikciós fragmenst, egy AgeI-AgeI restrikciós fragmenst és az AgeIAgeI restrikciós fragmensbõl deletált StuI-SacI fragmenst szubklónoztuk a 9¹es számú pGEM-CAT(+) vektorba, az EcoRV helyre. Transzkripciós promoter jelenlétét mutattuk ki az AgeI-AgeI fragmensbõl deletált StuI-SacI fragmensben, abba a plazmidba klónozva, amelyet az egyszerûség kedvéért V12-AgeI (29¹es klón) plazmidnak neveztünk el. A deletált StuI-SacI fragmenst két fragmensre, StuIAgeI és AgeI-SacI fragmensekre vágtuk, amit a 29¹es V12-AgeI plazmidnak részben NcoI+AgeI restrikciós enzimekkel (az Stu-AgeI fragmens esetében), részben AgeI+NotI enzimekkel (AgeI-SacI esetében) történõ emésztéssel értünk el. Mindkét fragmenst pGEM-CAT(+) vektor EcoRV helyére szubklónoztuk. Transzkripciós promoter jelenlétét mutattuk ki az 1200 bp méretû AgeI-
2
SacI fragmensben, a pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (15¹ös klón) plazmidba klónozva.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
6. Az AgeI-SacI fragmens szekvenálása, valamint a transzkripció kezdetének a meghatározása primer extenziós eljárással A pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (15¹ös klón) plazmidba klónozott AgeI-SacI fragmenst szekvenálásnak vetettük alá. A szekvenciát az 1. ábra mutatja (1. azonosító számú szekvencia). Az ettõl a szekvenciától disztálisan található 800 bp egy körülbelül 90 nukleotidból álló, nyolcszor ismétlõdõ szekvenciát tartalmaz, ami jellemzõ a PolI promoterekre: valójában a transzkripció iniciációs helyétõl 5’ irányban található, ismétlõdõ aktiválószekvenciák jelenlétét számos más fajból származó PolI promoter esetében ismertették [Paule M.: „Promoter Structure of Class I Genes”; „Transcription of Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic Polymerase I” szerk.: M. R. Paule; SpringerVerlag és R. G. Landes Company (1998)]. Ennek megfelelõen, a csirkeeredetû PolI transzkripciós promoter pontos iniciációs helyét az AgeI-Sac fragmens 400 proximális bp¹jában kerestük, primer extenziós eljárással. A CAT szekvencia komplementer oligonukleotidját, amelyet a pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (6. azonosító számú szekvencia: 5’¹ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG¹3’) plazmidról írtunk át, 5’ végén 32P izotóppal jelöltünk meg T4 fág polinukleotid-kináz (Biolabs) alkalmazásával, és azt két párhuzamos reakcióban alkalmaztuk: 1) primerként a 15¹ös számú, pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) plazmiddal transzfektált QT6 sejtekbõl kivont CAT-RNS komplementer DNSének extenziójához, reverz transzkriptáz (SuperScript II, Invitrogen) jelenlétében, és 2) primerként a 15¹ös számú pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) plazmid szekvenálásához, „T7 Sequencing Kit” (Pharmacia Biotech) reagenskészlet alkalmazásával. A primer extenziós reakció során egyetlen transzkripciós terméket detektáltunk, ami megerõsíti egy nagyon pontos transzkripciós iniciációs hely létezését. Ezt a helyet egy A¹ban és T¹ben gazdag régióban lokalizáltuk, egyetértésben azokkal az adatokkal, amelyek más fajokból származó PolI promoterekrõl rendelkezésre álltak, körülbelül 200 bp távolságra a primerként alkalmazott oligonukleotidtól. Ezzel párhuzamosan, vizsgáltuk az AgeI-SacI fragmensbõl származtatott restrikciós fragmenseket abból a célból, hogy behatároljuk a minimális promotert (amely más fajok PolI promoterei esetében 250 bp nagyságrendbe esik) (lásd az 5. ábrát). Az AgeI-SacI fragmenst három fragmensre vágtuk (AgeI-BsaI, BsaI-BsaI és BsaISacI fragmensekre), amit a 15¹ös számú pGEM-(AgeISacI)-CAT(+) plazmidnak egyrészt NcoI+BsaI restrikciós enzimekkel (AgeI-BsaI és BsaI-BsaI fragmensek esetében), másrészt BsaI+NotI restrikciós enzimekkel (BsaISacI fragmens esetében) történõ emésztésével értünk el. Mindkét fragmenst pGEM-CAT(+) vektor EcoRV helyére szubklónoztuk. Kizárólag a 16¹os számú pGEM-(BsaISac)-CAT(+) plazmidba klónozott, körülbelül 600 bp méretû (2. ábra) BsaI-SacI fragmens tette lehetõvé a CAT riporterszekvencia transzkripcióját, ami tökéletesen egy-
1
HU 003 091 T2
bevág azzal a ténnyel, hogy a transzkripciós iniciációs helyet a proximális fragmensben lokalizáltuk. Primer extenziós eljárást alkalmazva meghatároztuk a transzkripciós iniciációs hely +1 nukleotidját, egy olyan oligonukleotid alkalmazásával, amely a kezdõrégiótól ötven bázispár távolságban helyezkedik el 5’ irányban (lásd az 5. ábrát). Ezt a 7. azonosító számú szekvencia szerinti oligonukleotidot (5’-GGCCGGTCAACCCTGCTC¹3’) 5’ végén 32P izotóppal jelöltük meg T4 fág polinukleotid-kináz (Biolabs) alkalmazásával, és azt két párhuzamos reakcióban alkalmaztuk: 1) primerként a 15¹ös számú, pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) plazmiddal transzfektált QT6 sejtekbõl kivont CATRNS komplementer DNS-ének extenziójához, reverz transzkriptáz (SuperScript II, Invitrogen) jelenlétében, és 2) primerként a 15¹ös számú pGEM-(AgeI-SacI)CAT(+) plazmid szekvenálásához, „T7 Sequencing Kit” (Pharmacia Biotech) készlet alkalmazásával. Egy fõ transzkripciós terméket detektáltuk, amely olyan iniciációs helynek felelt meg, amely más fajok PolI promotereinek a szekvenciája alapján meghatározott konszenzusszekvencia (alább aláhúzott nukleotidok) jellegzetes nukleotidkörnyezetét mutatta: +1 TTATATGTTCGTC T G T* AGGAGCGAGTGAG*G* ACTCGGCT (8. azonosító számú szekvencia). Megjegyezzük azonban, hogy a primer extenziós vizsgálatban három másik típusú, minor transzkripciós terméket detektáltunk, amelyek a –1, +13 és +14 nukleotidoknál történõ iniciálásnak feleltek meg (fent csillaggal jelölt nukleotidok). CAT riportergén-szekvenciát hordozó, pszeudoinfluenza RNS¹t csirkeeredetû PolI promoter szabályozása alatt expresszálni képes plazmidokat konstruáltunk, Pleschka és munkatársai által humáneredetû PolI promoter alkalmazásával konstruált PolI–CAT¹Rz plazmid modellje szerint [J. Virol. 70, 4188–92 (1996)]: ezek a plazmidok (pPR7–C16–CAT¹Rz és pPR7DC16-CAT¹Rz) tartalmazzák az antiszensz módon klónozott, CAT gént kódoló szekvenciákat, amely szekvenciák szomszédosak humáneredetû, A típusú influenza NS genomiális génszegmensbõl származó, nemkódoló 5’ és 3’ szekvenciákkal; egyrészt a nemkódoló 5’ végnek a csirkeeredetû PolI promoter –1¹es nukleotidjától 3’ irányba történõ pontos elhelyezése,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2
másrészt hepatitis d vírus ribozimszekvenciájának a 3’ nemkódoló végen történõ inszertálása azt a célt szolgálta, hogy biztosítsuk a transzkripciós termék végeinek a pontosságát. A pPR7-C16-CAT¹Rz plazmid tartalmazza a csirkeeredetû PolI promoter –1¹tõl –425¹ig terjedõ nukleotidjait, míg a pPR7-DC16-CAT¹Rz plazmid mindössze a –1¹tõl a –246¹ig terjedõ nukleotidjait tartalmazza (más fajok esetében, a PolI promoter becsült minimális mérete körülbelül 250 nukleotid). A pPolI-CAT¹Rz (humáneredetû PolI promoter), pPR7-C16-CAT¹Rz vagy pPR7-DC16-CAT¹Rz (madáreredetû PolI promoter) plazmidokat QT6 madáreredetû vagy COS¹1 fõemlõs-eredetû sejtekbe transzfektáltuk, influenzavírus-eredetû PB1, PB2 PA és NT proteineket kódoló plazmidokkal egyidejûleg. Ha a transzfektált sejtek expresszálják a helyes pszeudoinfluenza RNSeket a nemkódoló 5’ és 3’ végeknél, és egyidejûleg expresszálják a PB1, PB2, PA és NP proteineket, a pszeudoinfluenza RNS átírható és replikálható, és a transzkripció/replikáció folyamatának a hatékonysága a CAT protein szintjének a transzfektált sejtekben történõ mérésével meghatározható. Ennek megfelelõen, a transzfektált sejtek citoplazma-kivonataiban ELISAeljárással mértük a CAT protein szintjét, 24 órával a transzfektálást követõen. A COS¹1 sejtekben pPolI-CAT¹Rz plazmid jelenlétében mért CAT-szintek 200 ng/106 transzfektált sejt nagyságrendet mutattak, míg QT6 sejtek esetében igen alacsony szintet mértünk (<0,06 ng/106 transzfektált sejt; lásd a 6. ábrát). Ezzel ellentétben, a COS¹1 sejtekben pPR7-C16CAT¹Rz és pPR7-DC16-CAT¹Rz plazmid jelenlétében mért CAT-szintek igen alacsonyak voltak (<0,06ng/106 transzfektált sejt), azonban a QT6 sejtekben 200 és 100 ng/106 nagyságrendet értek el (lásd a 6. ábrát). Az eredmények alapján megállapítható, hogy a pPR7-C16-CAT¹Rz és pPR7-DC16-CAT¹Rz plazmidokba klónozott, csirkeeredetû PolI promoterszekvenciák madáreredetû sejtekbe történõ transzfektálást követõen lehetõvé teszik A típusú influenzavírus replikációs szignálját tartalmazó minireplikonok in vivo transzkripcióját. Megnyílik tehát az út olyan reverz genetikai rendszerek fejlesztése elõtt, amelyek lehetõvé teszik rekombináns influenzavírusok elõállítását sejtkultúrában tenyésztett, madáreredetû sejtekben, vagy közvetlenül megtermékenyített tyúktojásban.
SZEKVENCIALISTA <110> Institut Pasteur Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Universite Paris 7¹ Denis Diderot <120> CSIRKEEREDETÛ RNS-POLIMERÁZ I PROMOTER ÉS ALKALMAZÁSA <130> 103749–1913/SG <150> CA 2 421 086 <151> 2003–02–28 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 3.2 9
HU 003 091 T2
<210> 1 <211> 1261 <212> ADN <213> Gallus gallus <220> <223> Csirkeeredetû RNS-polimeráz¹I promoterének szekvenciája <400> 1
ccggtggtcc gtggcggctg tcgctgctcg tacccgggtc tgccggggcg tcggtcgctc aacggtctac aggtcgctgc gtccggctcg gcggaacggt ctagaggtcg ccccgtccgg aacggcggaa gtcgctgccg ccgctctggc tttgtacctc cggcgcctat agtgaggact cggccgccta cgatcggtcc taaggcggtt c
cggccccgtc gggcacggcg gcggctgcta cggcgggcgc tctcggaaac cgcgccggcg ccggctccga cgtgtcggct gtctctccgc ctacccgggt ctgccgtgtc ctcggtcgct cggtctaccc gggcggcttg tgtggggggg cagttacgtc ggggctagaa cggctccggt gagaggggat ggtcgcttcg ttgcaggcga
cgactcggtc gaacggtcta ggggtcgctg cgtccggctc ggcggaacgg gcggctagag cgggcgccgt cggaaacggc ggcggcggct ccgacgggcg ggctcggaaa ccgcggcggc gggtgctacc cgatccgcgt ggcgctacag gaggtaaacc cgtttttttc agtggcggtg cggcggcggc gtttgtccgt gcagcgaaaa
gcttcgcgga accggctccg ccggggtggc ggtcgctccg tctacccggc gtcgctgccg ccggctcggt ggaacggtct agaggtcgct ccgtccggct cggcggaacg ggctaggggt gactcgcgct ccaggtctac ctccggagct tcggctgccg ggatgcctta agcgggcgct ggcggcggct cgctcctcat aaagccggag
ggtggctgga gcgggccccg tggggcacgg cggaggaggc tccggcgggc tgtcggctcg agctccgcgg acccggctcc gccgtgtcgg cggtctctcc gtctacccgg cgctgccggg ctccgcggcg ccggtttcgg gccagaggcg tcggagccgc tatgttcgtc cgcgagcagg ttctcgggca cccgcagctc aaggcgatca
ggtcgctgcc tccgcctcgg cggaacggtc taggggtcgc cccgtccgcc gaaacggcgg cggcggctag ggcgggcgcc ctcggaaacg gcggcggcgg ctccgacggg gcgtctcgga gcggctagag attgtcttgg tcgctgtaat tgccggtagt tgtaggagcg gttgaccggc tcggttcgtt tgtcctgggc ctagtgcggc
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1261
aaacggcgga ggcggctagg accgactcgc cgtccaggtc cagctccgga acctcggctg ttcggatgcc gtgagcgggc ggcggcggcg cgtcgctcct aaaaaagccg
acggtctacc ggtcgctgcc gctctccgcg tacccggttt gctgccagag ccgtcggagc ttatatgttc gctcgcgagc gctttctcgg catcccgcag gagaaggcga
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660
<210> 2 <211> 674 <212> ADN <213> Gallus gallus <220> <223> Csirkeeredetû RNS-polimeráz¹I promoterének szekvenciája <400> 2
tccgcggcgg cggctccgac ggggcgtctc gcggcggcta cggattgtct gcgtcgctgt cgctgccggt gtctgtagga agggttgacc gcatcggttc ctctgtcctg tcactagtgc
cggctagagg gggccccgtc ggaaacggcg gaggtcgctg tggccgctct aattttgtac agtcggcgcc gcgagtgagg ggccggccgc gttcgatcgg ggctaaggcg ggcc 674
tcgctgccgt cggctcggtc gaacggtcta ccggggcggc ggctgtgggg ctccagttac tatggggcta actcggctcc ctagagaggg tccggtcgct gttttgcagg
gtcggctcgg gctccgcggc cccgggtgct ttgcgatccg gggggcgcta gtcgaggtaa gaacgttttt ggtagtggcg gatcggcggc tcggtttgtc cgagcagcga
<210> 3 <211> 26 <212> ADN <213> Sequence artificielle 10
HU 003 091 T2
<220> <223> Csirke riboszomális RNS-ébõl származó oligonukleotid <400> 3
gagtcagccc tcgacacaag cttttg
26
<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequence artificielle <220> <223> Csirke riboszomális RNS-ébõl származó oligonukleotid <400> 4
ctactggcag gatcaaccag gt
22
<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Sequence artificielle <220> <223> Csirke riboszomális RNS-ébõl származó oligonukleotid <400> 5
tagaggagaa cgcgacctcg agac
24
<210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> Sequence artificielle <220> <223> A pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) plazmidból keletkezõ CAT transzkriptum szekvenciájával komplementer oligonukleotid <400> 6
atgttcttta cgatgcgatt ggg
23
<210> 7 <211> 18 <212> ADN <213> Sequence artificielle <220> <223> Csirkeeredetû RNS-polimeráz¹I promoterébõl származó láncindító <400> 7
ggccggtcaa ccctgctc
18
<210> 8 <211> 38 <212> ADN <213> Sequence artificielle 11
1
HU 003 091 T2
2
<220> <223> Csirkeeredetû RNS-polimeráz¹I promotere iniciációs helyének megfelelõ transzkripciós termékbõl származó oligonukleotid <400> 8
ttatatgttc gtctgtagga gcgagtgagg actcggct
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Izolált vagy tisztított polinukleotid, amely az 1. azonosító számú szekvenciából vagy annak olyan fragmensébõl áll, amely az 1. azonosító számú szekvencia legalább 10 egymást követõ nukleotidját tartalmazza és transzkripciós promoteraktivitást mutat. 2. Izolált vagy tisztított polinukleotid, amely a 2. azonosító számú szekvenciából vagy annak olyan fragmensébõl áll, amely a 2. azonosító számú szekvencia legalább 10 egymást követõ nukleotidját tartalmazza és transzkripciós promoteraktivitást mutat. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy transzkripciós promoteraktivitást mutat madáreredetû sejtekben, elõnyösen baromfieredetû sejtekben, még elõnyösebben csirkeeredetû sejtekben. 4. Rekombináns DNS, amely tartalmazza az 1–3. igénypontok bármelyike szerint definiált polinukleotidok egyikét. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy tartalmaz továbbá egy átírandó szekvenciát. 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az átírandó szekvencia sapkanélküli RNS-vírus cDNS¹e. 7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az átírandó szekvencia negatív polaritású RNS¹t tartalmazó vírus cDNS¹e. 8. A 7. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a negatív polaritású RNS¹t tartalmazó vírus orthomyxovírus vagy paramyxovírus. 9. A 8. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az orthomyxovírus influenzavírus, elõnyösen A típusú influenzavírus. 10. A 9. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy orthomyxovírus, például influenzavírus vRNS¹ét expresszálja és elõnyösen olyan vRNS¹t, amely influenzavírus 1–8¹as vRNS-szegmensei közül választott. 11. A 8. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a paramyxovírus a Rubulavírus nemzetség, mint például a mumpszvírus és a Newcastlebetegség vírusa; a Morbilivírus nemzetség, mint például a kanyaróvírus; a Pneumovírus nemzetség, mint például a respiratory syncytial vírus és a Metapneumovírus nemzetség tagjai közül választott.
38
12. Vektor, amely az 1–3. igénypontok bármelyike 15 szerinti polinukleotidot és/vagy a 4–11. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS¹t tartalmaz. 13. Gazdasejt, amely a 12. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 14. A 13. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jelle20 mezve, hogy madáreredetû. 15. A 14. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy elõnyösen baromfieredetû sejt, még elõnyösebben csirkeeredetû sejt. 16. Madáreredetû, embrionált tojás, amely a 12. 25 igénypont szerinti vektort tartalmaz. 17. Az alábbi alkotórészek legalább egyikének az alkalmazása rekombináns, negatív polaritású RNS¹t tartalmazó vírus elõállítására: – az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti polinuk30 leotid; – a 4–11. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS; – a 12. igénypont szerinti vektor; – a 13–15. igénypontok bármelyike szerinti gazda35 sejt; és – a 16. igénypont szerinti megtermékenyített tojás. 18. Rekombináns influenzavírus reverz genetikai eljárással történõ elõállítására alkalmas eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza: 40 a) a 9. igénypont szerinti rekombináns DNS¹t tartalmazó legalább egy vektor, valamint influenzavírus PA, PB1, PB2 és NP proteinjeit expresszáló vektorok bejuttatása madáreredetû sejtbe vagy madáreredetû, embrionált tojásba; 45 b) az a) pont szerinti sejt vagy tojás olyan körülményekkel történõ érintkeztetése, amelyek lehetõvé teszik a rekombináns influenzavírus expresszálódását; c) a b) pont szerint kapott rekombináns influenzavírus összegyûjtése. 50 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt baromfisejt, elõnyösebben csirkesejt. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az influenzavírus elõnyösen A típusú influenzavírus. 55 21. Rekombináns, sapka nélküli vírus reverz genetikai eljárással történõ elõállítására alkalmas eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza: a) egy vagy több olyan vektor bejuttatása madár60 eredetû sejtbe vagy madáreredetû, embrionált tojásba, 12
1
HU 003 091 T2
amely vektor vagy vektorok tartalmazzák a 4–11. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS¹t, valamint a vírus-RNS transzkripciójához/replikációjához szükséges proteineket expresszáló DNS-eket; b) az a) pont szerinti sejt vagy tojás olyan körülményekkel történõ érintkeztetése, amelyek lehetõvé teszik a rekombináns vírus expresszálódását; és
5
13
2
c) a b) pont szerint kapott rekombináns vírusok összegyûjtése. 22. Az 1. vagy a 2. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy azt a pGEMChPolI-C15¹E. Coli 1305 törzs tartalmazza, és amelyet 2003. február 24¹én letétbe helyeztünk a CNCM gyûjteménybe, 1–2976 nyilvántartási szám alatt.
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
14
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
15
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
16
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
17
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
18
HU 003 091 T2 Int. Cl.: C12N 15/86
19
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest
