(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA. (54) Olaj a vízben típusú emulziót tartalmazó vakcinakészítmények

!HU000003686T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 003 686

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/39

(21) Magyar ügyszám: E 04 779201 (22) A bejelentés napja: 2004. 07. 26. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040779201 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1651265 A2 2005. 02. 03. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1651265 B1 2008. 04. 23.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 20030490345P 2003. 07. 24.

(73) Jogosult: Merial Limited, Duluth, Georgia (US)

US

(72) Feltalálók: Parisot, Alexis Guy Andre, Lyon (FR); Des Gouilles-Blechet, Stephanie Marie-catherine, Lyon (FR); Nordgren, Robert M., Athens (US); Charreyre, Catherine, Saint-Laurent de Mure (FR) (54)

(2006.01) A61K 39/02 (2006.01) A61K 39/102 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05009462 PCT/US 04/024027

(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

„Olaj a vízben” típusú emulziót tartalmazó vakcinakészítmények

(57) Kivonat

HU 003 686 T2

Új „olaj a vízben” (O/V) emulziót tárnak fel, amely baktérium- vagy vírusszuszpenziók (különösen a koncentrált és tisztítatlan vagy enyhén tisztított szuszpenziók) jelenlétében megnövelt stabilitású. A találmány szerinti emulzió olyan gyógyászati készítmény célba juttatására alkalmas hordozóként funkcionálhat, amely legalább egy immunogént (Közelebbrõl a következõket magában foglaló csoportból kiválasztott immunogént: inaktivált patogén, legyengített patogén, alegység, rekombináns expressziós vektor, plazmid vagy ezek kombinációi) tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módja

értelmében injektálható „olaj a vízben” (O/V) emulziót tárnak fel, amely a következõket tartalmazza: (1) immunogént tartalmazó, mely immunogén a következõket tartalmazó csoportból van kiválasztva: inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae baktérium, inaktivált 2¹es típusú sertés cirkovírus (PCV¹2) vagy ezek kombinációi; (2) ásványi olaj; (3) nemionos lipofil felületaktív anyag; (4) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely kis HLB-értékû (általában 11 és 13 közötti HLB-érték), és amely a szorbitán etoxilált zsírsav-diésztereit tartalmazza.

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 003 686 T2

A találmány tárgyköre Jelen találmány tárgyát „olaj a vízben” típusú emulziók és azok adjuvánsként történõ alkalmazása képezi. Szintén a találmány tárgyához tartoznak a találmány szerinti „olaj a vízben” emulziókat tartalmazó gyógyászati, immunológiai és vakcinakészítmények. A technika állása Az adjuvánsok vakcinákban történõ alkalmazása széles körben ismert. Az adjuváns olyan vegyület, amely vakcinaantigénnel kombinálva erõteljesebb immunreakciót idéz elõ, mint az önmagában alkalmazott vakcinaantigén. Az antigénimmunogenitást elõsegítõ stratégiák közé tartoznak a vakcinaantigéneket szemcsésítõ eljárások, a vakcinaantigéneket polimerizáló vagy emulgeáló módszerek, a vakcinaantigéneket betokozó eljárások, a gazda saját citokinreakcióit fokozó módszerek, valamint a vakcinaantigéneket antigénprezentáló sejtekhez célba juttató eljárások [Nossal, (1999), In: Fundamental Immunology, szerk.: Paul, Lippincott-Raven Publishers, Philapelphia, Pa; Vogel és Powell (1995), In: Vaccine Design. „The Subunit and Adjuvant Approach”, szerk.: Powell és Newman, Plenum Press, Ny, N. Y. 141. oldal]. Az adjuvánsoknak a vakcinaantigének immunogenitása javításában betöltött kulcsfontosságú szerepe miatt az adjuvánsokat a vakcinák elõállítása során gyakorlatilag minden esetben alkalmazzák [Nossal, (1999), lásd fentebb; Vogel és Powell (1995), lásd fentebb; valamint a WO 97/18837 számú PCT közzétételi irat]. A szakirodalomból jól ismert, hagyományos adjuvánsok természetüket tekintve eltérõek. Ezek az adjuvánsok, például lehetnek vízben oldhatatlan szervetlen sók, liposzómák, micellák vagy emulziók, mint például a Freund-féle adjuváns. További adjuvánsok leírását illetõen lásd Vogel és Powell (1995, lásd fentebb). Bár az adjuvánsoknak nincs egyetlen közös hatásmechanizmusuk, alapvetõ tulajdonságuk azon képességük, hogy jelentõs mértékben fokozzák a vakcinaantigénre adott immunreakciót (az önmagában alkalmazott vakcinaantigén által indukált reakcióhoz viszonyítva; Nossal, (1999), lásd fentebb; Vogel és Powell (1995), lásd fentebb]. E tekintetben bizonyos adjuvánsok hatékonyabbak a humorális immunreakciók erõsítésében, míg más adjuvánsok a sejtközvetítette immunreakciók fokozásában hatékonyabbak [Vogel és Powell (1995), lásd fentebb], megint más adjuvánsok a vakcinaantigének elleni humorális és sejtközvetítette immunreakciókat egyaránt fokozzák [Vogel és Powell (1995), lásd fentebb]. A vakcinák elõállítása során alkalmazott emulziók általában olaj, vizes oldat és felületaktív anyagok elegyébõl állnak. Néhány emulzió lipofil felületaktív anyagot (például Span 80®) és hidrofil felületaktív anyagot (például Tween 80®) tartalmaz. Ezek az emulziók tartalmazhatnak olyan vegyületeket is (például lecitint vagy szaponint), amelyekrõl ismeretes, hogy ionos felületaktív tulajdonságokkal bírnak. Mindazonáltal a vakcinaadjuvánsokként alkalmazott emulziók esetében – különösen tárolás vagy szál-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

lítás során – stabilitási problémák figyelhetõk meg. Ez különösen érvényes olyan esetekben, ha a készítmények koncentrált immunogéneket, elsõsorban nem tisztított, koncentrált immunogéneket tartalmaznak. Jellemzõen ez az inaktivált (elölt) vakcinákban alkalmazott adjuvánsok esetében van így. Ez a probléma még jelentõsebb a multivalens vakcinakészítmények esetében, mivel az immunogének azonos térfogatú diluensben még nagyobb mértékben vannak koncentrálva. Az adjuvánsok alkalmazásával összefüggésben jelentkezõ további probléma a káros hatások (például toxicitás vagy az injektálás helyén fellépõ helyi gyulladás) kialakulásának kockázatához köthetõ. Például az injektálást követõen helyi gyulladásos reakció és/vagy granulomák jelentkezhetnek. Az ilyen káros reakciók csökkentése érdekében az emulzióban csökkenthetõ a felületaktív anyagok és egyéb komponensek mennyisége, azonban ez a vakcinakészítmény stabilitásának romlásához vezethet. Ilyenformán új adjuvánsokra és ilyen adjuvánsokat tartalmazó vakcinakészítményekre van szükség, amelyek fokozott biztonságúak és stabilitásúak. Az FR 1 562 758 számú iratban injektálható antigénhatású vakcinakészítményt tárnak fel, amely egy clostridium fajból származó vizes antigénhatású anyagot, ásványi olajat, lipofil emulgeálószert és hidrofil emulgeálószert tartalmaz. Lee és munkatársai [J. of Pharmacy and Pharmacology 54, 43–49 (2002)] clonixint, ricinusolajat, Tween 20¹at és Tween 85¹öt tartalmazó mikroemulziót írtak le. A találmány összefoglalása A találmány elsõ megvalósítási módja értelmében új „olaj a vízben” (O/V) emulziót tárunk fel, amely baktérium- vagy vírusszuszpenziók (különösen a koncentrált és tisztítatlan vagy enyhén tisztított szuszpenziók) jelenlétében megnövelt stabilitású. A találmány egy másik megvalósítási módja értelmében stabil, biztonságos és könnyen adagolható (elõnyösen injektálható) „olaj a vízben” emulziót tárunk fel, amely legalább egy aktív komponenst (elõnyösen egy immunogént) tartalmazó gyógyászati készítmény célba juttatására alkalmas hordozóként funkcionál. A találmány egy további megvalósítási módja értelmében stabil, biztonságos és immunogén készítményt vagy vakcinát tárunk fel, amely „olaj a vízben” emulziót tartalmaz. A találmány egy következõ megvalósítási módja értelmében eljárást tárunk fel vakcinakészítmény elõállítására a találmány szerinti adjuváns alkalmazásával; feltárjuk továbbá az így létrehozott vakcinakészítményt, valamint annak alkalmazási eljárásait. A találmány egy további megvalósítási módja értelmében feltárunk egy reagenskészletet, amely egy elsõ fiolában immunogént vagy más gyógyászati terméket, egy második fiolában pedig egy találmány szerint elõállított adjuvánst tartalmaz, mely adjuváns felhasználás elõtt az immunogénnel vagy más vakcinatermékkel elegyítendõ.

1

HU 003 686 T2

A találmány értelmében feltárunk egy injektálható „olaj a vízben” (O/V) emulziót, amely a következõ komponenseket tartalmazza: (1) immunogént tartalmazó vizes oldat; (2) ásványi olaj; (3) nemionos lipofil felületaktív anyag; és (4) nemionos, kis HLB-értékû, hidrofil felületaktív anyag, amely a szorbitán etoxilált zsírsav-diésztereit tartalmazza (általában 11 és 13 közötti HLB-érték). A találmány egy következõ elõnyös megvalósítási módja szerint injektálható „olaj a vízben” (O/V) emulziót tárunk fel, amely a következõ komponenseket tartalmazza: (1) immunogént tartalmazó vizes oldat; (2) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB) értékkel bír, mely HLBérték 13¹nál nagyobb és 40¹nél kisebb, Közelebbrõl HLB³13,5, elõnyösen HLB³14; (3) ásványi olaj; (4) nemionos lipofil felületaktív anyag; (5) nemionos, kis HLB-értékû, hidrofil felületaktív anyag (általában körülbelül 9 és körülbelül 13 közötti HLB-érték). A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint feltárunk egy vakcinakészítményt, amely olyan új emulziót foglal magában, amely vakcinált egyedben immunológiai reakció kiváltására alkalmas legalább egy immunogént tartalmaz. Ezen túlmenõen, olyan készítményeket tárunk fel, amelyekben az emulzió az immunogén által indukált immunreakciót fokozó (Közelebbrõl celluláris reakciót, humorális reakciót vagy mindkettõt fokozó) adjuvánsként funkcionál. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja értelmében eljárást tárunk fel vakcinakészítmény elõállítására, amely egy immunogén – elõnyösen liofilizált állapotú vagy vizes oldatban lévõ immunogén – jelen találmány szerinti adjuvánssal történõ elegyítését foglalja magában. Az immunogén a következõkbõl álló csoportból választható ki: inaktivált patogének, legyengített patogének, alegység antigének, rekombináns expressziós vektorok (ideértve a plazmidokat) és hasonlók. A patogén lehet baktérium¹, vírus¹, protozoavagy gombaeredetû, illetve az immunogén antitoxint képezhet. A találmány egy következõ elõnyös megvalósítási módja szerint eljárást tárunk fel patogén elleni immunreakció vakcinált egyedben történõ indukálására, amely jelen találmány szerinti vakcinakészítmény vakcinált egyednek történõ adagolását foglalja magában. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja értelmében reagenskészleteket tárunk fel, amelyek legalább két fiolát tartalmaznak, és egy elsõ fiolában egy immunogént, elõnyösen liofilizált állapotú vagy vizes közegben oldott immunogént, egy második fiolában pedig egy találmány szerinti adjuvánst vagy emulziót tartalmaznak. Megjegyezzük, hogy a leírásban, és különösen az igénypontokban, a „tartalmaz”, „általa tartalmazott”, „tartalmazó” és hasonló kifejezéseket az egyesült államokbeli szabadalmi törvény által nekik tulajdonított je-

2

lentésükben is használhatjuk, például „magában foglal”, „benne foglalt”, „magában foglaló” stb. értelemben; és az olyan kifejezések, mint a „lényegében valamikbõl álló” és „lényegében valamikbõl áll”, az egyesült álla5 mokbeli szabadalmi törvény által nekik tulajdonított jelentéssel bírnak, például megengedik olyan elemek bennfoglalását is, amelyek nincsenek kifejezetten megadva, de kizárják az olyan elemeket, amelyek a technika állása szerint ismertek vagy amelyek hátrányosan 10 befolyásolnák a találmány valamely lényegi vagy újdonságot biztosító tulajdonságát. A találmány fentebb felsorolt és egyéb megvalósítási módjait a találmány következõkben bemutatásra kerülõ részletes leírásában ismertetjük részletesen. 15 Az ábrák rövid leírása A leírás további részében megadjuk a találmány szerinti megoldás teljes és szakember számára gyakorlati kivitelezést lehetõvé tevõ részletes leírását, ide20 értve a mellékelt ábrákat is, amelyeken: az 1. ábrán a 3. példában leírtak szerint végzett vakcinálás után 28 nappal megfertõzött malacok tüdõelváltozási pontszámait mutatjuk be. A középértéket „+” jelzi, az alsó kvartilist és a felsõ kvartilist keret25 tel jelöljük, a statisztikai mediánt a kereten belüli vízszintes vonal jelzi, míg a minimumtól maximumig terjedõ tartományt függõleges vonal reprezentálja. A 2. ábrán a 4. példában leírtak szerint végzett 30 vakcinálás után 10 nappal megfertõzött malacok tüdõelváltozási pontszámait mutatjuk be. A középértéket „+” jelzi, az alsó kvartilist és a felsõ kvartilist kerettel jelöljük, a statisztikai mediánt a kere35 ten belüli vízszintes vonal jelzi, míg a minimumtól maximumig terjedõ tartományt függõleges vonal reprezentálja. A 3. ábrán klinikai betegség kísérleti fertõzés („challange”) utáni, klinikai pontszámok 40 alapján kifejezett progresszióját ábrázoló grafikon látható. A 4. ábrán állattartó-telepi hatékonysági kísérlet eredményeit mutatjuk be, melynek során a – jelen találmány szerint elõállított 45 PCV¹2 vakcinakészítménnyel ellés elõtt egy alkalommal vakcinált kocáktól született – malacok (n=889) PMWS-szindróma („Post-weaning Multisystem Wasting Syndrome”: választott malacok cir50 kovírus okozta sorvadása) okozta mortalitása szignifikáns (75%¹os) csökkenést mutatott a nem vakcinált kocáktól született kontroll malacokéhoz (n=713) képest. 55 A találmány részletes leírása A jelen találmány egyéb célkitûzéseit, sajátosságait és szempontjait a következõ részletes leírásban ismer60 tetjük, illetve annak alapján lesznek érthetõk. Szakem3

1

HU 003 686 T2

ber számára világos, hogy a jelen leírás csupán példaként szolgáló megvalósítási módok ismertetésére szorítkozik, amellyel nem szándékozzuk korlátozni a jelen találmány tágabb értelmezését, amely tágabb értelmezés a megvalósítási módok példaként történõ értelmezés módja alapján válik világossá. Amint az szakember számára nyilvánvaló, a jelen találmányban különbözõ módosítások és változtatások hajthatók végre anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolat lényegétõl. Például valamely megvalósítási mód részeként szemléltetett vagy leírt sajátságok egy másik megvalósítási módban is felhasználhatók, ami egy újabb megvalósítási módot eredményez. Szándékunk szerint az ilyen módosítások és változtatások a jelen találmány – csatolt szabadalmi igénypontok és ekvivalenseik által meghatározott – oltalmi körén belülieknek tekintendõk. A következõkben összefoglalunk néhány, a leírásban, a példákban és a csatolt igénypontokban alkalmazott kifejezést. Ahogy itt használjuk, az „állat” kifejezés jelentése valamennyi gerinces állatra kiterjed, ideértve az embereket is. E kifejezés jelentése kiterjed egy adott állat valamennyi fejlõdési stádiumára, ideértve az embrionális és magzati stádiumot is. Közelebbrõl a „gerinces állat” kifejezés, többek között, emberekre, kutyafélékre (például kutyákra), macskafélékre (például macskákra), lófélékre (például lovakra), szarvasmarhafélékre (például szarvasmarhákra), sertésfélékre (például sertésekre), valamint madarakra vonatkozik. Ahogy itt használjuk, a „madarak” kifejezés magában foglalja a madarak rendszertani osztályába tartozó valamennyi fajt vagy alfajt, mint például többek között, a csirkéket (tenyész- és broilercsirkéket, illetve tojókat), pulykákat, kacsákat, ludakat, fürjeket, fácánokat, papagájokat, pintyeket, sólymokat, varjakat és futómadarakat (például strucc, emu és kazuár). Ahogy itt használjuk, a „sertés” vagy „malac” kifejezésen sertésfélét értünk, míg a „koca” kifejezés reproduktív korú és képességû nõstény sertést jelent. Ahogy itt használjuk, a „virulens” kifejezésen olyan izolátumot értünk, amely megtartja gazdaállatot megfertõzõ képességét. Ahogy itt használjuk, az „inaktivált vakcina” kifejezés olyan vakcinakészítményre vonatkozik, amely replikációra vagy szaporodásra már nem képes fertõzõ organizmust vagy patogént tartalmaz. A patogén baktérium¹, vírus¹, protozoa- vagy gombaeredetû lehet. Az inaktiválás különféle eljárásokkal hajtható végre, ideértve például a fagyasztás-felolvasztást, kémiai kezelést (például thimerosallal vagy formalinnal végzett kezelés), ultrahangozást, sugárkezelést, hõkezelést és minden olyan egyéb szokásos módszert, amely – az organizmus immunogenitásának fenntartása mellett – alkalmas az organizmus replikációjának vagy szaporodásának gátlására. Ahogy itt használjuk, az „immunogenitás” kifejezés egy gazdaállatban antigén vagy antigének elleni immunreakció kialakításának képességét jelenti. Az ilyen immunreakció képezi alapját egy specifikus fertõzõ organizmus ellen vakcina által kiváltott védõhatású immunitásnak.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

Ahogy itt használjuk, az „immunreakció” kifejezés egy állatban kiváltott reakcióra vonatkozik. Az immunreakció lehet celluláris immunitás (CMI), humorális immunitás vagy mindkettõt magában foglalhatja. A találmány értelmében e fogalomhoz tartozónak tekintjük az immunrendszer csak egy részére korlátozódó reakciót is. Például a találmány szerinti vakcinakészítmény specifikusan fokozott mértékû gamma-interferonos reakciót indukálhat. Ahogy itt használjuk, az „antigén” vagy „immunogén” kifejezés olyan anyagra vonatkozik, amely egy gazdaállatban specifikus immunreakciót indukál. Az antigén a következõket foglalhatja magában: elölt, legyengített vagy élõ teljes organizmus; egy organizmus alegysége vagy részlete; immunogén tulajdonságokkal bíró inszertet tartalmazó rekombináns vektor; gazdaállatnak történõ prezentálást követõen immunreakció indukálására képes DNS-darab vagy ¹fragmens; protein, polipeptid, peptid, epitóp, haptén vagy ezek bármely kombinációja. Más módon, az immunogén vagy antigén toxin vagy antitoxin is lehet. Ahogy itt használjuk, a „multivalens” kifejezés egynél több antigént tartalmazó vakcinára vonatkozik, mely antigének származhatnak ugyanazon fajból (úgymond a Mycoplasma hyopneumoniae különbözõ izolátumai) vagy különbözõ fajokból (úgymond Pasteurella hemolytica és Pasteurella multocida izolátumai), továbbá e kifejezés vonatkozik azon vakcinákra is, amelyek különbözõ genusokból származó antigének kombinációját tartalmazzák (például Pasteurella multocidából, Salmonellából, Escherichia coliból, Haemophilus somnusból és Clostridiumból származó antigéneket tartalmazó vakcina). Ahogy itt használjuk, a vakcina kifejezés olyan anyagot jelent, amely egy vakcinához annak immunogenitása fokozása céljából kerül hozzáadásra. Bizonyos adjuvánsok az immunreakciókat úgy erõsítik, hogy az antigént lassan szabadítják fel, míg más adjuvánsok saját maguk erõteljesen immunogének, és hatásukat szinergikus módon fejtik ki. Az ismert vakcinaadjuvánsok közé tartoznak, többek között, az olajos és vizes emulziók (például komplett Freund-féle adjuváns és inkomplett Freund-féle adjuváns), Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, alumíniumhidroxid, glükán, dextrán-szulfát, vas-oxid, nátrium-alginát, Bacto-adjuváns, bizonyos szintetikus polimerek, úgymint poliaminosavak és aminosavak kopolimerei, szaponin, „REGRESSIN” (Vetrepharm, Athens, Ga.), „AVRIDINE” (N,N-dioktadecil¹N’,N’-bisz(2¹hidroxi-etil)propándiamin), paraffinolaj, muramil-dipeptid és hasonlók. Ahogy itt használjuk, a „gyógyászati szempontból elfogadható hordozó” és „gyógyászati szempontból elfogadható vivõanyag” kifejezések egymással felcserélhetõk, és olyan folyékony, vakcinaantigénekhez alkalmas vivõanyagokra vonatkoznak, amelyek az gazdaszervezetbe káros hatások kiváltása nélkül injektálhatók. A szakirodalomból ismert gyógyászati szempontból elfogadható hordozók közé tartoznak, többek között, a következõk: steril víz, sóoldat, glükóz, dextróz

1

HU 003 686 T2

és pufferelt oldatok. A hordozók tartalmazhatnak kiegészítõ anyagokat is, mint például többek között, diluenseket, stabilizálószereket (úgymond cukrokat és aminosavakat, tartósítószereket, nedvesítõanyagokat, emulgeálószereket, puffereket, viszkozitást növelõ adalék anyagokat, színezékeket és hasonlókat. Ahogy itt használjuk, a „vakcinakészítmény” kifejezés gyógyászati szempontból elfogadható hordozóban legalább egy antigént vagy immunogént tartalmazó készítményre vonatkozik, amely gazdaszervezetben immunreakció indukálására alkalmas. A vakcinakészítmények gyógyászatban vagy állatgyógyászatban jártas szakember számára jól ismert dózisokban és technikákkal adagolhatók, olyan tényezõk figyelembevételével, mint a befogadó állat életkora, neme, testtömege, faja és állapota, valamint az adagolás módja. Az adagolás módja lehet perkután, történhet nyálkahártyán keresztül (például orálisan, nazálisan, análisan vagy vaginálisan) vagy parenterálisan (intradermálisan, intramuszkulárisan, szubkután, intravénásan vagy intraperitoneálisan). A vakcinakészítmények adagolhatók önmagukban vagy alkalmazhatók egyéb kezelésekkel vagy terápiákkal egyidejûleg vagy egymást követõen. A készítményforma lehet szuszpenzió, szirup vagy elixír, továbbá parenterális, szubkután, intradermális, intramuszkuláris vagy intravénás adagoláshoz való (például injektálható) készítmények, mint például steril szuszpenziók vagy emulziók. A vakcinakészítmény spray formájában vagy ételbe és/vagy ivóvízbe keverve, illetve megfelelõ hordozóval, diluenssel vagy segédanyaggal (például steril vízzel, fiziológiás sóoldattal, glükózzal vagy hasonlókkal) elegyítve is adagolható. A készítmények – az adagolás módjától és az adott készítménytõl függõen – tartalmazhatnak kiegészítõ anyagokat, mint például nedvesítõ- vagy emulgeálószereket, puffereket, adjuvánsokat, gélesítõ vagy viszkozitást növelõ adalék anyagokat, tartósítószereket, ízesítõanyagokat, színezékeket és hasonlókat. Az alkalmas készítmények el nem várható mértékû kísérleti munka elvégzése nélküli elõállításához standard gyógyszerészeti leírások (mint például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 1990) vehetõk igénybe. A találmány értelmében új „olaj a vízben” (O/V) adjuvánst vagy emulziót tárunk fel, amely a következõket tartalmazza: (1) vizes oldat, amely gazdaszervezetben immunreakció indukálására képes vakcinaantigént vagy immunogént tartalmaz; (2) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB) értékkel bír, mely HLBérték 13¹nál nagyobb és 40¹nél kisebb (HLB>13; Közelebbrõl HLB³13,5, elõnyösen HLB³14); (3) ásványi olaj; (4) nemionos lipofil felületaktív anyag; (5) nemionos, kis HLB-értékû, hidrofil felületaktív anyag (általában körülbelül 9 és körülbelül 13 közötti HLB-értékkel). A jelen találmány szerint elõállított emulziók legalább három felületaktív anyag kombinációján alapulnak, melyek a felületaktív anyagok három különbözõ

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

csoportjának tagjai közül lettek kiválasztva, oly módon, hogy az egyes csoportokba tartozók közül egy vagy több felületaktív anyag is alkalmazható. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint az emulzióban (jelen leírásban ez a már valamennyi komponensét tartalmazó kész emulziót jelenti, hacsak másképpen nem jelezzük) a nemionos hidrofil felületaktív anyag (5) koncentrációja – az emulzió térfogatára vonatkoztatott vegyes%-ban (m/V%) kifejezve – 1%¹tól 8%¹ig, Közelebbrõl 1,5%-tól 6%¹ig, elõnyösen 2%¹tól 5%¹ig, még elõnyösebben 2,5%-tól 4%¹ig terjed. A felületaktív anyagok e csoportja kis (9 és 13 közötti) HLB-értékû, nemionos, hidrofil felületaktív anyagokat foglal magában. E csoportba tartoznak, többek között, a következõk: a szorbitán etoxilált zsírsav-monoésztere (Közelebbrõl 5 etoxilcsoporttal, mint például az etoxilált szorbitán-monooleát, például Tween 81®), a szorbitán etoxilált zsírsav-diészterei, a szorbitán etoxilált zsírsav-triészterei (Közelebbrõl 20 etoxilcsoporttal, mint például az etoxilált szorbitán-trioleát, például Tween 85®), etoxilált szorbitán-trisztearát, például Tween 65 ® , etoxilált zsíralkoholok (közelebbrõl 5–10 etoxilcsoporttal, mint például Brij 76®, Brij 56®, Brij 96®), etoxilált zsírsavak (közelebbrõl 5–10 etoxilcsoporttal, mint például a Simulsol 2599®, Myrj 45®), etoxilált ricinusolaj (közelebbrõl 25–35 etoxilcsoporttal, mint például az Arlatone 650®, Arlatone G®) és ezek kombinációi. A szorbitán etoxilált zsírsav-diésztereit és a szorbitán etoxilált zsírsav-triésztereit, illetve ezek kombinációit részesítjük elõnyben. A zsírsavat elõnyösen a következõkbõl álló csoportból választjuk ki: olajsav, palmitinsav, sztearinsav, izosztearinsav, laurinsav és ezek kombinációi. A szorbitán elõnyös etoxilált zsírsav-triészterei közé tartozik az etoxilált szorbitán-trioleát (például Tween 85®) vagy az etoxilált szorbitán-trisztearát (például Tween 65®). Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a nemionos hidrofil felületaktív anyag (2) koncentrációja – az emulzió térfogatára vonatkoztatott vegyes (m/V)%-ban kifejezve – általában 0,1%-tól 1,5%¹ig, közelebbrõl 0,2%-tól 1,4%¹ig, elõnyösen 0,3%-tól 1,3%¹ig, még elõnyösebben 0,4%-tól 1,2%¹ig terjed. A felületaktív anyagok e második csoportja nemionos hidrofil felületaktív anyagokat foglal magában, melyek nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB) értékûek (HLB>13; közelebbrõl HLB³13,5, elõnyösen HLB³14). E csoportba a következõk tartoznak: a szorbitán etoxilált zsírsav-monoészterei (közelebbrõl 20 etoxilcsoporttal), mint például az etoxilált szorbitán-monolaurát (például Tween 20®), etoxilált szorbitán-monopalmitát (például Tween 40®), etoxilált szorbitán-monosztearát (például Tween 60®), etoxilált szorbitán-monooleát (például Tween 80®); etoxilált zsíralkoholok (közelebbrõl 15–30 etoxilcsoporttal), például Brij 78®, Brij 98®, Brij 721®; etoxilált zsírsavak (közelebbrõl 15–30 etoxilcsoporttal), például Myrj 49®, Myrj 51®, Myrj 52®, Myrj 53®); nemionos blokk-kopolimerek, például polioxi-etilén/polioxi-propilén kopolimer (POE-POP), mint például a Lutrol F127® és Lutrol F68®, és ezek kombinációi.

1

HU 003 686 T2

A nemionos blokk-kompolimerek koncentrációja kisebb lehet, közelebbrõl 0,1% és 0,5% közötti, elõnyösebben 0,2% és 0,4% közötti [az emulzió térfogatára vonatkoztatott vegyes (m/V)%-ban kifejezve]. Az elõnyös felületaktív anyagok (2) közé tartoznak a szorbitán etoxilált zsírsav-monoészterei, mint például a fentebb leírtak. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a nemionos lipofil felületaktív anyag (4) koncentrációja – az emulzió térfogatára vonatkoztatott vegyes (m/V)%-ban kifejezve – 0,1%-tól 2,5%¹ig, közelebbrõl 0,2%-tól 2%¹ig, elõnyösen 0,2%-tól 1,5%¹ig, még elõnyösebben 0,2%-tól 1,2%¹ig terjedhet. A felületaktív anyagok e csoportja a következõket foglalja magában: a szorbitán zsírsav-észterei, mint például a szorbitán-monolaurát (például Span 20®), szorbitán-monopalmitát (például Span 40®), szorbitánmonosztearát (például Span 60®), szorbitán-trisztearát (például Span 65 ®), szorbitán-monooleát (például Span 80®), szorbitán-trioleát (például Span 85®), szorbitán-monoizosztearát (például Arlacel 987®), szorbitán-izosztearát (például Crill®); a mannid zsírsav-észterei (például Montanide 80®), mannid-monooleát (például Arlacel A®), mannid-dioleát, mannid-trioleát, mannid-tetraoleát; a mannid etoxilált zsírsav-észterei (2, 3 vagy 4 etoxilcsoporttal), mint például Montanide 888®, Montanide 103®, etoxilált mannid-monooleát, etoxilált mannid-dioleát, etoxilált mannid-trioleát, etoxilált mannid-tetraoleát; valamint a fentiek kombinációi. A zsírsavat elõnyösen a következõkbõl álló csoportból választjuk ki: olajsav, palmitinsav, sztearinsav, izosztearinsav, laurinsav és ezek kombinációi. Az elõnyös felületaktív anyagok (4) közé tartoznak a szorbitán zsírsav-észterei, közelebbrõl azok, amelyeket fentebb ismertettünk, illetve ezek kombinációi. A találmány szerinti felületaktív anyagok állati vagy növényi eredetû zsírsavakat egyaránt tartalmazhatnak. Az egyik eredetû zsírsav másik eredetûvel történõ helyettesítése (például állati eredetû Tween 80® helyett növényi Tween 80® alkalmazása) egyszerûen, az emulzió összetételének csekély változtatásával végrehajtható. A találmány szerinti emulzió összes felületaktívanyag-tartalma – az emulzió térfogatára vonatkoztatott m/V%-ban kifejezve – 1,2%-tól 10%¹ig, közelebbrõl 2%¹tól 8%¹ig, elõnyösen 3%¹tól 7%¹ig, még elõnyösebben 4%¹tól 6%¹ig terjedhet. A találmány szerinti emulziónak általában lehet fázisinverziós hõmérséklete (PIT), amely ³33 °C, közelebbrõl 33 °C¹tól 65 °C¹ig, még Közelebbrõl 36 °C¹tól 60 °C¹ig, elõnyösen 37 °C¹tól 55 °C¹ig, még elõnyösebben 38 °C¹tól 50 °C¹ig terjed. A PIT az a hõmérséklet, amelynél egy „víz az olajban” típusú emulzió „olaj a vízben” típusú emulzióvá változik vagy felbomlik (két külön fázissá válik szét). A PIT-érték különbözõ módszerekkel mérhetõ, például vizuális megjelenés alapján (lásd például a 2. példát) vagy vezetõképesség alapján. Az emulziót PIT-értéke alatti hõmérsékletû (például körülbelül 25 °C¹os) vízfürdõbe helyezzük, a hõmérsékletet fokozatosan növel-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

jük, majd egy kontrollemulzióhoz viszonyítva megfigyeljük az emulzió vizuális megjelenését, nevezetesen a fluiditását, viszkozitását, a két fázis elkülönülését, valamint a felületi megjelenésnek az olajos fázis felszínre történõ vándorlása következtében bekövetkezõ változását. Az a hõmérséklet az emulzió PIT-értéke, amelynél a vizuális megjelenés változását észleltük. Más lehetõség szerint, a PIT¹t a vezetõképesség körülbelül 5–8 millisiemens/centiméterrõl (mS/cm; „olaj a vízben” emulzió) körülbelül 0 mS/cm¹re („víz az olajban” emulzió) történõ gyors átmenete alapján határozzuk meg, melyet az emulzióban (felszíne közelében) elhelyezett szondával mérünk. Az a hõmérséklet az emulzió PITértéke, amelynél az átmenetet észleltük. Szakember számára nem okoz gondot a felületaktív anyagok és olajok találmány szerinti emulziók – és különösen a fentebb megadott PIT-tartományokon belüli PIT-értékekkel bíró emulziók – elõállítását eredményezõ kombinációinak meghatározása (ideértve azok megfelelõ koncentrációit is). A jelen találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a fentebb leírt emulziók nem tartalmaznak ionos felületaktív anyagot vagy egyéb olyan vegyületet, amelyrõl ismeretes lenne, hogy ionos felületaktív tulajdonságokkal bír (például lecitin vagy szaponin). A találmány szerinti emulziók olajtartalma általában – az emulzió térfogatára vonatkoztatott térfogatszázalékban (V/V%) kifejezve – 3%¹tól 55%¹ig terjedhet, közelebbrõl 5%¹tól 50%¹ig, elõnyösen 10%-tól 40%¹ig, még elõnyösebben 20%-tól 40%¹ig terjedhet. Definíció szerint, a leírásban megadott értéktartományok, hacsak másképpen nem jelezzük, minden esetben magukban foglalják a tartomány határértékeit is. Olajként alkalmazható ásványi olaj például többek között, paraffinolaj, mint például izoparaffinolaj és/vagy nafténbázisú olaj, szkvalén, prisztán, poliizobuténolaj, hidrogénezett poliizobuténolaj, polidecénolaj, poliizoprénolaj, poliizopropénolaj és hasonlók. A jelen találmány szempontjából elõnyös ásványi olaj lineáris vagy elágazó szénláncú olaj lehet, amely 15¹nél több, elõnyösen 15–32 szénatomot tartalmaz, és aromás vegyületektõl mentes. Az ilyen olajok példái közé tartoznak a „MARCOL 52®” és „MARCOL 82®” néven forgalmazott olajok (az Esso, Franciaország termékei), valamint a „DRAKEOL 6VR®” néven forgalmazott olaj (a Penreco, USA terméke). Az olaj olajok elegye is lehet, amely legalább két, fentebb leírtak közül kiválasztott olaj tetszõleges arányú elegyébõl állhat. Az olajok elegye tartalmazhat továbbá legalább egy fentebb leírtak közül kiválasztott olajat, valamint legalább egy növényi olajat, mely utóbbi az olajos fázis körülbelül 0,1 V/V%-tól körülbelül 33 V/V%¹ig terjedõ hányadát, elõnyösen körülbelül 10 V/V%-tól körülbelül 25 V/V%¹ig terjedõ hányadát teszi ki. Az ilyen növényi olajok telítetlen olajok és nagy az olajsav-tartalmuk, amely biológiailag lebontható és tárolási hõmérsékleten (körülbelül +4 °C¹on) elõnyösen folyékony vagy legalább olyan emulziók létrehozását teszi lehetõvé, amelyek ezen a hõmérsékleten folyékonyak. A növényi olaj, például földimogyoró-olaj, dióolaj,

1

HU 003 686 T2

napraforgóolaj, pórsáfrányolaj, szójaolaj, onagerolaj és hasonló lehet. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a (2) és (5) hidrofil felületaktív anyag elõnyösen olyan felületaktív anyagokból állhat, amelyek a molekulák ugyanazon hidrofil részét tartalmazzák. Például a szorbitán etoxilált zsírsav-észterei a (2) és (5) hidrofil felületaktív anyag esetében egyaránt felhasználhatók. Például ha a kis HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyagként Tween 85®¹öt választunk ki, a nagy HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyag elõnyösen etoxilált szorbitánnal kialakított hidrofil részt tartalmaz (például Tween 80®). Általánosságban, a jelen találmány olyan vizes oldat alkalmazására vonatkozik, amely megfelelõ, állatgyógyászatilag vagy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót, segédanyagot vagy diluenst (mint például többek között, a steril vizet, fiziológiás sóoldatot, glükózt, puffert és hasonlókat) tartalmaz. A hordozó, segédanyag vagy diluens példáiként említhetõk még a poliolok, glucidok vagy pH¹pufferelõ anyagok. Ezen túlmenõen, a hordozó, segédanyag vagy diluens tartalmazhat aminosavakat, peptideket, antioxidánsokat, valamint baktericid vagy bakteriosztatikus vegyületeket is. A vizes oldatot olyan mennyiségben adjuk hozzá az olajhoz és a felületaktív anyaghoz, hogy a találmány szerinti emulzió térfogatát 100%¹ra egészítsük ki. Egy emulzió hidrofil-lipofil egyensúlya (HLB) lehetõvé teszi a felületaktív anyag hidrofil vagy lipofil hatásának értékelését. Egy amfifil molekula HLB-értéke általában a következõk szerint kerül kiszámításra:

5

10

15

20

25

30

(20×hidrofil rész tömege) HLB=–––––––––––––––––––––– (amfifil molekula tömege) A HLB-értéke 0¹tól (amely a legtöbb lipofil molekulára jellemzõ) 20¹ig terjedhet (mely utóbbi a legtöbb hidrofil molekulára jellemzõ). A felületaktív anyag kémiai összetételétõl (nevezetesen, például etoxilcsoportok vagy alkén-oxidok hozzáadásától) függõen ezek az értékek változhatnak, és a HLB-érték tartománya növekedhet (például a Lutrol F68® HLB-értéke 29). Felületaktív anyagok elegye esetén az elegy HLB-értéke az egyes felületaktív anyagok HLB-értékeinek – tömegarányukkal súlyozott – összege: („X” HLB-értékeׄX” tömege)+ („Y” HLB-értékeׄY” tömege) HLB= ––––––––––––––––––––––––– („X” tömege+„Y” tömege) ahol: „X”=X felületaktív anyag; „Y”=Y felületaktív anyag. A találmány szerint elõállított emulzió egyik megvalósítási módja szerint az emulzió végsõ HLB-értéke körülbelül 9¹tõl körülbelül 12¹ig, elõnyösen körülbelül 9,5tõl körülbelül 11,5¹ig, még elõnyösebben körülbelül 10¹tõl körülbelül 11,5¹ig terjed. A találmány értelmében feltárunk egy emulziót, amely a következõ komponenseket tartalmazza: paraffinolaj (közelebbrõl az emulzió térfogatára vonatkoztatott V/V%-ként kifejezve, körülbelül 10%-tól körülbelül 40%¹ig, elõnyösen körülbelül 20%-tól körülbelül 40%¹ig

35

40

45

50

55

60 7

2

terjedõ koncentrációban); szorbitán zsírsav-monoészter (nemionos lipofil felületaktív anyagként), szorbitán etoxilált zsírsav triésztere (kis HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyagként); és szorbitán etoxilált zsírsav-monoésztere (nagy HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyag). Közelebbrõl a szorbitán zsírsav-monoészter egy szorbitán-monooleát (közelebbrõl az emulzió térfogatára vonatkoztatott m/V%-ként kifejezve 0,2%-tól 1,5%¹ig, elõnyösen 0,2%-tól 1,2%¹ig terjedõ koncentrációban); a szorbitán etoxilált zsírsav-triésztere a szorbitán etoxilált trioleátja (közelebbrõl 2 m/V%-tól 5 m/V%¹ig, elõnyösen 2,5 m/V%-tól 4 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban); és a szorbitán etoxilált zsírsav-monoésztere egy etoxilált szorbitánmonooleát (közelebbrõl 0,3 m/V%-tól 1,3 m/V%¹ig, elõnyösen 0,4 m/V%-tól 1,2 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban). Például az emulzió a fenti komponenseket a következõ – emulzió térfogatára vonatkoztatott – koncentrációkban tartalmazza: paraffinolaj: körülbelül 29,3 m/V%, szorbitán-monooleát: 0,6 m/V%, szorbitán etoxilált trioleátja: 3,4 m/V%, etoxilált szorbitán-monooleát: 0,75 m/V%. A találmány egy második megvalósítási módja értelmében az emulzió paraffinolajat (közelebbrõl 10 V/V%-tól 40 V/V%¹ig, elõnyösen 20 V/V%-tól 40 V/V%¹ig terjedõ koncentrációban); szorbitán zsírsav-monoésztert (nemionos lipofil felületaktív anyagként); szorbitán etoxilált zsírsav-triészterét (kis HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyagként); és nemionos blokk-kopolimert (nagy HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyagként) tartalmaz. Közelebbrõl a szorbitán zsírsav-monoészter egy szorbitán-monooleát (közelebbrõl 0,2 m/V%-tól 1,5 m/V%¹ig, elõnyösen 0,2 m/V%-tól 1,2 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban); a szorbitán etoxilált zsírsav-triésztere a szorbitán etoxilált trioleátja (közelebbrõl 2 m/V%-tól 5 m/V%¹ig, elõnyösen 2,5 m/V%-tól 4 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban); és a nemionos blokk-kopolimer egy polioxi-etilén/polioxi-propilén polimer (POE-POP), közelebbrõl 0,1 m/V%tól 0,5 m/V%¹ig, elõnyösen 0,2 m/V%-tól 0,4 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban. Például az emulzió körülbelül 29,3 m/V% paraffinolajat, 0,6 m/V% szorbitán-monooleátot, 3,4 m/V% etoxilált szorbitán-trioleátot és 0,25 m/V% etoxilált szorbitán-monooleátot tartalmaz. Feltárunk egy injektálható „olaj a vízben” (O/V) emulziót, amely a következõ komponenseket tartalmazza: (1) vizes oldat, amely aktív komponenst, mint például drogot vagy immunogént, elõnyösen immunogént tartalmaz; (2) ásványi olaj; (3) nemionos lipofil felületaktív anyag; és (4) nemionos, kis HLB-értékû, hidrofil felületaktív anyag, amely szorbitán etoxilált zsírsav-diészterét tartalmazza (amelynek HLB-értéke 11 és 13 közötti lehet). Az e megvalósítási mód szerinti emulzió szorbitán etoxilált zsírsav-diésztereit tartalmazza, amelyek legfeljebb 20 etoxilcsoportot tartalmazhatnak. A zsírsavak állati vagy növényi eredetûek lehetnek, és a követke-

1

HU 003 686 T2

zõkbõl álló csoportból választhatók ki: olajsav, palmitinsav, sztearinsav, izosztearinsav, laurinsav és ezek kombinációi. Az egyik megvalósítási módban az etoxilált zsírsav elõnyösen olajsav. A többi komponensre, valamint az emulzió általános tulajdonságaira (mint például a PIT) a fentebb leírtakkal azonos jellemzõk érvényesek. A (4) felületaktív anyag elõnyösen szorbitán etoxilált zsírsav-észtereit tartalmazza, mint például etoxilált szorbitán-dioleátot, etoxilált szorbitán-disztearátot vagy etoxilált szorbitán-diizosztearátot, etoxilált szorbitán-dipalmitátot, etoxilált szorbitán-dilaurátot és ezek kombinációit. Az emulzióhoz, adott esetben, koadjuvánsként egyéb vegyületek is adhatók, melyek példái közé tartoznak, többek között, a következõk: alum; CpG-oligonukleotidok (ODN), közelebbrõl ODN 2006, 2007, 2059 vagy 2135 [Ponarollo, R. A. és munkatársai: Vet. Immunol. Immunopath. 84, 43–59 (2002); Wernette, C. M. és munkatársai: Vet. Immunol. Immunopath. 84, 223–236 (2002); Mutwiri, G. és munkatársai: Immunol. Immunopath. 91, 89–103 (2003)]; poliA-poliU [„Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach”, szerk.: Michael F. Powell és Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology 6, 03]; dimetil-dioktadecil-ammóniumbromid (DDA) [„Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach”, szerk.: Michael F. Powell és Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology 6, 157]; N,Ndioktadecil¹N’,N’-bisz(2¹hidroxi-etil)-propándiamin (például Avridin®, lásd. a fentebb idézett mû 148. oldalán), karbomer, kitozán (lásd például az 5 980 912 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). A találmány értelmében feltárunk továbbá egy eljárást vakcinakészítmény vagy immunológiai készítmény elõállítására, amely legalább egy antigént vagy immunogént és egy adjuvánst vagy találmány szerint elõállított emulziót tartalmaz. Az immunogén az emulzió elkészítése során adható hozzá, vagy egy alternatív lehetõség szerint – az immunogén késõbb (például közvetlenül a felhasználás elõtt) adható az emulzióhoz. Az elsõként elõállított emulzióban a felhasznált vizes oldat teljes mennyisége jelen lehet. Más módon, a vizes oldatnak csak egy részét használjuk fel az emulzió kialakítására, majd a vizes oldat maradékát az immunogén hozzáadását követõen adjuk az emulzióhoz. Az immunogén vagy antigén liofilizált alakban vagy más alkalmas szilárd alakban lehet jelen, majd az emulzióval elegyíthetõ, vagy más lehetõség szerint, az antigén oldatban – közelebbrõl vizes oldatban – lehet jelen, és ezt az oldatot elegyítjük az emulzióval. A felületaktív anyagokat – oldhatóságuktól függõen – elõnyösen az olajos vagy a vizes oldathoz adjuk. Például a nemionos lipofil felületaktív anyagokat a találmány szerinti olajhoz, míg a nagy HLB-értékû, nemionos hidrofil felületaktív anyagokat a vizes oldathoz adjuk. Az emulgeálást szakember számára jól ismert, hagyományos eljárások szerint végezhetjük. Például a találmány egyik megvalósítási módja szerint az emulziót az emulzió PIT-értékénél kisebb hõmérsékleten, köze-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

lebbrõl szobahõmérsékleten, például körülbelül 25 °C¹on készíthetjük el. A vizes fázist és az olajos fázist mechanikai keveréssel, például nagy nyíróerõ létrehozására képes rotor-sztátor egységgel felszerelt turbina alkalmazásával elegyítjük. A keverést elõnyösen kis rotációs sebességgel kezdjük és – általában a vizes oldat olajhoz történõ – fokozatos hozzáadása függvényében lassan növeljük. A vizes oldatot elõnyösen fokozatosan adjuk az olajhoz. Az olaj/vizes oldat arányt „víz az olajban” (V/O) emulzió létrehozásához adaptáljuk, például körülbelül 50 V/V%-tól körülbelül 55 V/V%¹ig terjedõ olajkoncentrációval. A keverés leállítását követõen az emulzió fokozatosan O/V emulzióvá alakul (fázisinverzió). Az inverzió után, ha szükséges, az emulziót vizes oldat hozzáadásával olyan mértékben hígítjuk, hogy a végsõ emulzióban az olaj kívánt koncentrációját kapjuk. Az emulzió körülbelül 5 °C¹on tárolható. Egy másik megvalósítási mód szerint az emulziót az emulzió PIT-értékénél nagyobb hõmérsékleten állíthatjuk elõ. Elsõ lépésként a vizes fázist és az olajos fázist az emulzió PIT-értékénél nagyobb hõmérsékleten elegyítjük. A vizes oldatot elõnyösen fokozatosan adagoljuk az olajhoz. Az olaj/vizes oldat arányt úgy választhatjuk meg, hogy „víz az olajban” (V/O) típusú emulziót kapjunk (például körülbelül 40 V/V%-tól körülbelül 55 V/V%¹ig terjedõ olajkoncentrációval). Az emulgeálást kis nyíróerõt alkalmazó vagy nyíróerõ nélküli keveréssel – például statikus keverõvel vagy propeller vagy turbina keverõvel nagyon kis rotációs sebességgel. A kapott emulzió „víz az olajban” (V/O) típusú emulzió. Egy második lépésben az emulziót fokozatosan PIT-értéke alá hûtjük. Ennek során az emulzió O/V emulzióvá alakul át (fázisinverzió). Az inverziót követõen, ha szükséges, az emulziót vizes oldat hozzáadásával olyan mértékben hígítjuk, hogy a végsõ emulzióban az olaj kívánt koncentrációját kapjuk. Az emulzió körülbelül 5 °C¹on tárolható. Az emulzióban lévõ cseppek mérete körülbelül 100 nm¹tõl körülbelül 500 nm¹ig terjedhet. Az emulzió, például vakcinakészítmény vagy gyógyászati készítmény elõállítása során adjuvánsként alkalmazható. Az emulzió oldószerként is alkalmazható szárított termék feloldására, különösen olyan liofilizált termékhez, amely, például legyengített mikroorganizmusokat vagy élõ rekombináns vírusokat tartalmaz. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint a vizes oldat egy részletével preemulziót állítunk elõ. Ezt késõbb egy aktív komponens (például egy hatóanyag vagy immunogén, elõnyösen immunogén) szuszpenziójának hozzáadásával hígítjuk, hogy a végterméket kapjuk. Más lehetõség szerint, a preemulziót vizes oldattal hígíthatjuk és szárított termék (például liofilizált termék) feloldására alkalmazhatjuk. A találmány szerint alkalmazható immunogén vagy antigén a következõkbõl álló csoportból választható ki: inaktivált patogének, legyengített patogének, immunogén alegységek (például proteinek, polipeptidek, peptidek, epitópok, haptének) vagy rekombináns expressziós vektorok, ideértve az immunogén inszerteket

1

HU 003 686 T2

tartalmazó plazmidokat. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az immunogén inaktivált vagy elölt mikroorganizmus. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a vakcinakészítmény madárpatogének csoportjából választható ki, például többek között, a következõk közül: Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, fertõzõ bronchitis vírus (IBV), Newcastle-betegség vírus (NDV), „eggdrop” szindróma vírus (EDS), fertõzõ bursitis vírus (IBDV), madárinfluenza vírus és hasonlók, valamint ezek kombinációi. Más lehetõség szerint, a vakcinakészítmény macskafélék patogénjei közül kiválasztott immunogént tartalmaz, melyek példái közé tartoznak, többek között, a következõk: macska herpeszvírus (FHV), macska calicivírus (FCV), macska leukózisvírus (FeLV), macska immundeficienciavírus (FIV), rabiesvírus és hasonlók, valamint ezek kombinációi. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vakcinakészítmény kutyapatogének közül kiválasztott immunogént tartalmaz, melyek példái közé tartoznak, többek között, a következõk: rabiesvírus, kutya herpeszvírus (CHV), kutya parvovírus (CPV), kutya coronavírus, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A találmány egy következõ megvalósítási módja szerint a készítmény lovak patogénjei közül kiválasztott immunogént tartalmaz, mint például ló herpeszvírust (1. vagy 4. típus), ló influenzavírust, tetanust, nyugatnílusi vírus (West Nile Virus) és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a készítmény szarvasmarhák patogénjei közül kiválasztott immunogént tartalmaz, melyek példái a következõk: rabiesvírus, szarvasmarha rotavírus, szarvasmarha parainfluenza¹3 vírus (bPIV¹3), szarvasmarha coronavírus, szarvasmarha vírusos hasmenés vírus (BVDV), száj- és körömfájás vírus (FMDV), szarvasmarha légzõrendszeri szincitiumképzõ vírus (BRSV), fertõzõ szarvasmarha rhinotracheitisvírus (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a készítmény sertés patogénjei közül kiválasztott immunogént tartalmaz, melyek példái közé tartoznak, többek között, a következõk: sertés influenzavírus (SIV), sertés cirkovírus 2¹es típus (PCV¹2), sertések reproduktív és légzõszervi tünetegyütteséért (PRRS) felelõs vírus, pseudorabiesvírus (PRV), sertés parvovírus (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, és hasonlók, valamint ezek kombinációi. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja értelmében vakcinakészítményt tárunk fel, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozóban legalább egy immunogént és egy emulziót tartalmaz. Az immunogének (amelyek vírusok, baktériumok, gombák és hasonlók lehetnek) in vitro tenyésztési eljárásokkal,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

megfelelõ tenyésztõ tápközeg és gazdasejtvonalak, valamint szakember számára jól ismert, szokásos módszerek alkalmazásával állíthatók elõ. Például a PRRS-vírus megfelelõ sejtvonalban, például MA¹104sejtvonalban tenyészthetõ (lásd többek között, az 5 587 164; 5 866 401; 5 840 563; és 6 251 404 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Hasonló módon, a PCV¹2 PK¹15-sejtvonalban (lásd a 6 391 314 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást); a SIV tojásokon (6 048 537 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); és a Mycoplasma hyopneumoniae megfelelõ tenyésztõ tápközegben [5 968 525 és 5 338 543 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Ross, R. F. és munkatársai: Am. J. Vet. Res. 45, 1899–1905 (1984)] tenyészthetõ. A patogént – annak érdekében, hogy inaktivált immunológiai vagy vakcinakészítményt nyerjünk – betakarítást követõen elõnyösen inaktiváljuk, és, adott esetben, derítésnek vetjük alá, amelyet kémiai kezeléssel [például formalin vagy formaldehid, béta-propiolakton, biner etilénimin (BEI), thimerosal és hasonlók alkalmazásával] és/vagy fizikai kezeléssel (például hõkezeléssel vagy ultrahangkezeléssel) hajtunk végre. Az inaktiválási eljárások szakember számára jól ismertek. Például a PRRS-vírus béta-propiolaktonos kezeléssel [Plana-Duran és munkatársai: Vet. Microbiol. 55, 361–370 (1997)] vagy BEI-kezeléssel (5 587 164 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) inaktiválható. A PCV¹2 vírus inaktiválása etilénimines kezeléssel vagy béta-propiolaktonos kezeléssel hajtható végre (6 391 314 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A sertés influenzavírus detergens (például Triton) vagy formaldehid alkalmazásával végzett kezeléssel inaktiválható (6 048 537 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A Mycoplasma hyopneumoniae baktérium formaldehides kezeléssel (Ross, R. F., lásd fentebb), etiléniminnel vagy BEI-vel végzett kezeléssel vagy thimerosalkezeléssel (5 968 525 és 5 338 543 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) inaktiválható. Az inaktivált patogén szokásos töményítési technikák (közelebbrõl ultraszûrés) alkalmazásával töményíthetõ és/vagy szokásos tisztítási módszerekkel (közelebbrõl kromatográfiás technikákkal, például többek között, gélszûréssel, szacharózgradiens alkalmazásával végzett ultracentrifugálással vagy szelektív precipitációval – különösen polietilénglikol (PEG) jelenlétében – tisztítható. A találmány szerinti vakcinakészítményekben alkalmazható immunogének expressziós vektorok is lehetnek. Az ilyen vektorok közé tartoznak, többek között, az in vitro rekombináns expressziós vektorok, például polinukleotid vektor vagy plazmid [EP–A2–1001025 számú irat; Chaudhuri, P.: Res. Vet. Sci. 70, 255–6 (2001)]; vírusvektorok, például többek között: adenovírusvektorok, himlõvírusvektorok, például madárhimlõ (5 174 993; 5 505 941 és 5 766 599 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vagy kanárihimlõ-vírus vektorok (5 756 103 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); valamint bakteriális vektorok (Escherichia coli vagy Salmonella sp.).

1

HU 003 686 T2

A találmány tárgyához tartozik továbbá multivalens immunológiai készítmények vagy kombinált vakcinakészítmények elõállítása. Például a találmány szerint elõállított, találmány szerinti kombinált szarvasmarha bakterinben alkalmazható antigének közé tartoznak, többek között, a következõk: Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., különösen a P. multocida és P. haemolytica, Haemophilus sp., különösen a H. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli és hasonlók. A jelen találmány értelmében feltárunk továbbá eljárásokat immunreakció gazdában, például állatban történõ indukálására, mely eljárások találmány szerinti immunológiai készítmény vagy vakcinakészítmény gazdának történõ adagolását foglalják magukban. Az így kiváltott immunreakciók elsõsorban antitestes és/vagy sejtes immunreakciók, közelebbrõl gamma-interferonos reakció. Közelebbrõl a jelen találmány értelmében eljárásokat tárunk fel állat immunizálására patogén organizmus (például vírus, baktérium, gomba vagy egysejtû parazita) fertõzése ellen vagy a fertõzés által okozott tünetek megelõzése vagy csökkentése céljából. A jelen találmány szerinti eljárás gerinces állatok esetében hasznos, melyek példáiként említhetõk, többek között, a következõk: emberek, kutyafélék (például kutyák), macskafélék (például macskák), lófélék (például lovak), szarvasmarhafélék (például szarvasmarha) és sertésfélék (például sertések), valamint madarak, ideértve, többek között, a csirkéket, pulykákat, kacsákat, ludakat, fürjeket, fácánokat, papagájokat, pintyeket, sólymokat, varjakat és futómadarakat (például strucc, emu, kazuár és hasonlók). A találmány egy különösen elõnyös szempontjának megfelelõen ezek az eljárások vemhes nõstények – találmány szerinti vakcinakészítmény adagolásával ellést megelõzõen – végzett vakcinálását foglalják magukban. Ezen eljárások magukban foglalják továbbá védõhatású antitestek vakcinálási protokoll által kiváltott indukálását, valamint e védõhatású antitestek vakcinált vemhes nõstényekbõl utódaikba történõ átjutását. Az ilyen anyai antitestek átjutása késõbb megvédi az utódokat a betegségtõl. A jelen találmány szerinti elõállított vakcinakészítmény dózisa a vakcinálni kívánt állat fajától, fajtájától, életkorától, méretétõl, vakcinálási történetétõl és egészségi állapotától függ. A hatásos dózist befolyásolják egyéb faktorok is, mint például az antigén koncentrációja, további vakcinakomponensek, valamint az adagolás módja (azaz szubkután, intradermális, orális, intramuszkuláris vagy intravénás adagolás). A vakcina beadandó dózisa a vakcina antigénkoncentrációja, az adagolás módja és a vakcinálni kívánt állat életkora és állapota alapján könnyen meghatározható. Az antigén valamennyi tétele külön-külön kalibrálható. Más lehetõség szerint a jelen találmány szerinti vakcinakészítmény hatásos dózisának meghatározására – felesleges kísérleti munka nélkül – különbözõ dózisok szisztematikus immunogenitási vizsgálatai, illetve LD50-tesztjei és egyéb szkrínelési eljárások alkalmazhatók. A ké-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

sõbb bemutatásra kerülõ példák alapján könnyen érthetõ lesz, hogy az általunk feltárt vakcinakészítmény alkalmazása során mely közelítõ dózisok és közelítõ térfogatok lehetnek megfelelõek. Kulcsfontosságú, hogy a dózis legalább részleges védõhatást biztosítson a természetes fertõzéssel szemben, amit az ilyen fertõzéssel összefüggõ mortalitás és morbiditás csökkenése bizonyít. A megfelelõ térfogat szakember számára hasonló egyszerûséggel meghatározható. Például madárfajoknál a dózistérfogat körülbelül 0,1 ml¹tõl körülbelül 0,5 ml¹ig, elõnyösen körülbelül 0,3 ml¹tõl körülbelül 0,5 ml¹ig terjedhet. Macska¹, kutya- és lófajok esetében a dózistérfogat körülbelül 0,2 ml¹tõl körülbelül 3,0 ml¹ig, elõnyösen körülbelül 0,3 ml¹tõl körülbelül 2,0 ml¹ig, még elõnyösebben körülbelül 0,5 ml¹tõl körülbelül 1,0 ml¹ig terjedhet. Szarvasmarha- és sertésfajok esetében a dózistérfogat körülbelül 0,2 ml¹tõl körülbelül 5,0 ml¹ig, elõnyösen körülbelül 0,3 ml¹tõl körülbelül 3,0 ml¹ig, még elõnyösebben körülbelül 0,5 ml¹tõl körülbelül 2,0 ml¹ig terjedhet. A kezdeti immunreakció fokozása céljából, vagy ha az utolsó dózis beadása után hosszabb idõ telt el, szabályos idõközönként megismételt vakcinálások lehetnek elõnyösek. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a vakcinakészítményt parenterális (vagyis szubkután, intradermális vagy intramuszkuláris) injekcióként adjuk be. A készítmény egy dózisban vagy – alternatív megvalósítási módokban – megismételt dózisokban adagolható, utóbbi esetben körülbelül 2–5 dózisban, melyek körülbelül 2–6 hetenként, elõnyösen körülbelül 2–5 hetenként adhatók be. Mindazonáltal, szakember számára nem okoz gondot annak felismerése, hogy a dózisok száma és az egyes vakcinálások közötti idõtartam számos tényezõtõl függ, így például többek között, a vakcinált állat életkorától, az állat állapotától, az immunizálás módjától, a dózisonkénti antigénmennyiségtõl és hasonlóktól. Kezdõ vakcinálás esetén a vakcinálások közötti idõ általában egy hétnél hosszabb, elõnyösen körülbelül 2–5 hét, míg a korábban már vakcinált állatok esetében a vemhesség elõtt vagy annak ideje alatt körülbelül évenként emlékeztetõ vakcinálás végezhetõ. A jelen találmány tárgyához tartozik továbbá egy vakcinakészítmény tû nélküli injektálókészülékkel [például Pigjet®, Avijet®, Dermojet® vagy Biojector® (Bioject, Oregon, USA)] történõ adagolása. Szakember számára nem okoz gondot az injektálókészülék specifikációinak – a vakcinálni kívánt állat fajához, életkorához és testtömegéhez megfelelõ – beállítása. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az eljárás a találmány szerinti emulzióval kialakított vakcinakészítmény egyszeri beadását foglalja magában. Például az egyik megvalósítási mód szerint a vakcinakészítmény inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae vakcina, míg egy alternatív megvalósítási mód értelmében a vakcina inaktivált PCV2 víruskészítményt tartalmaz. Egydózisú adagolási sémában egyéb immunológiai készítmények is alkalmazhatók, ideértve, többek között, az inaktivált PRRS-vírust és a SIV¹et. Közelebbrõl a Mycoplasma hyopneumoniae vakcinakészít-

1

HU 003 686 T2

mény alkalmazása esetén az egyetlen dózist a sertés születése és levágása közötti idõben, közelebbrõl körülbelül 3 napos és körülbelül 56 napos életkor között, elõnyösen körülbelül 10 napos és körülbelül 35 napos életkor között, még elõnyösebben körülbelül 15 napos és körülbelül 30 napos életkor között adagolható. A vakcina már létezõ antitestek jelenlétében is adagolható. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás gazda, például állat kezelésére, amely találmány szerint elõállított gyógyászati készítmény gazdának történõ adagolását foglalja magában, mely gyógyászati készítmény tartalmaz legalább egy immunogént, amely a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: proteinek vagy peptidek, antitestek, allergének, CpG ODN, növekedési faktorok, citokinek és antitestek, közelebbrõl CpG ODN vagy citokinek. Ezek a gyógyászati készítmények felhasználhatók egy állat (mint például csirke, sertés vagy szarvasmarha) növekedési teljesítményének javítására. A találmány tárgyához tartozik továbbá egy reagenskészlet, amely egy alkotórészt (például immunogént vagy gyógyászati készítményt) tartalmazó elsõ fiolát és egy találmány szerint elõállított emulziót tartalmazó második fiolát foglal magában. Az immunogén liofilizált, szárított vagy vizes oldat alakú lehet. A találmányt a továbbiakban a következõ, nem korlátozó jellegû példák bemutatásán keresztül szemléltetjük.

5

10

15

20

25

30 1. példa: Emulzió-elõállítási eljárás Az emulziót a következõk szerint, két lépésben állítjuk elõ: Elsõ lépés: A készítmények elõállítására nagy nyíróerejû rotor-sztátor rendszerû Silverson emulgeálókészüléket (10 mm¹es aprítófejjel ellátott L4RT-típus) alkalmaztunk. Emulzió készítéséhez egy térfogatnyi 1. vizes fázissal 25 °C¹on egy térfogatnyi olajos fázist emulgeáltunk. A vizes fázist percenkénti 5000¹es fordulatszámmal végzett keverés közben, egy perc alatt adtuk az olajos fázishoz. A rotációs sebességet a térfogat növelésével párhuzamosan, fokozatosan növeltük (1 perc alatt 8300¹as percenkénti fordulatszámra. E lépés során az emulzió „víz az olajban” emulzió volt. A TS6-emulzió fázisösszetétele a következõ volt: Olajos fázis (120 ml) – szorbitán-monooleát (Span 80®) 1,8 m/V% – szorbitán-trioleát (20 OE) (Tween 85®) 10,2 m/V% – paraffinolaj (Marcol 82®) 88,m/V% 1. vizes fázis (120 ml) – szorbitán-monooleát (20 OE) (Tween 80®) 20 m/V%¹os oldata 11,25 m/V% – 0,02M izotóniás dinátriumés monokálium-foszfát-puffer (pH=7,8) 85,75 V/V% – nátrium-merkurotiolát (Thiomersal®) 1%¹os vizes oldat 1,5 V/V% A szorbitán-monooleátot (Span80®) és a szorbitántrioleátot (20 OE) (Tween85®) az olajos fázisba foglaltuk. A szorbitán-monooleát (20 OE) (Tween 80®) paraffinolajban nem volt elegyíthetõ. A vakcináéval azonos

35

40

45

50

55

60 11

2

pufferben (például 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-puffer, pH=7,8) 20 m/V%¹os Tween 80® oldatot készítettünk. A nátrium-merkurotiolát tartósítószerként funkcionál, az emulzió szempontjából nem kulcsfontosságú. A keverés leállítása után az emulzió „olaj a vízben” emulzióvá alakult át. Az emulziót legalább 4 órára 5 °C¹os hûtõkamrába helyeztük. Ebben a stádiumban az emulzió 50% olajos fázist tartalmazó preemulzió volt. Második lépés: A 2. vizes fázist 120 ml 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-pufferrel (pH=7,8), immunogének jelenlétében készítettük (immunogénként inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae immunogén vagy PCV¹2 immunogén alkalmazásával, lásd lentebb). Az 1. lépésben elõállított preemulziót körülbelül 5 °C¹ra hûtöttük, ugyanezen a hõmérsékleten a 2. vizes fázis körülbelül fele térfogatának hozzáadásával hígítottuk, majd mágneskeverõvel egy percig kevertük. A TS6-emulzióban a felületaktív anyag végkoncentrációja 4,75 m/V% volt. Az itt leírtak szerint elõállított TS6-vakcinák 5 °C¹on legalább egy évig stabilak. Ugyanezen elõállítási eljárás alkalmazásával egyéb emulziók is létrehozhatók, a következõk szerint: TS7-emulzió A TS7-emulzió 33% olajos fázist tartalmazó O/V emulzió. Az olajos fázis (120 ml) 88 V/V% Marcol 82®¹t, 1,8 m/V% Span 80®¹at és 10,2 m/V% Tween 85®¹t tartalmaz. Az 1. vizes fázis (120 ml) 97,75 V/V% 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-puffert (pH=7,8), 1,5 V/V% Thiomersal®¹t (1%¹os vizes oldat) és 0,75 m/V% Lutrol F127®¹t tartalmaz. A 2. vizes fázist a 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokáliumfoszfát-pufferrel (pH=7,8) állítottuk elõ, amely, adott esetben, immunogéneket tartalmaz. A TS7-emulzióban a felületaktív anyag végkoncentrációja 4,25 m/V%. TS8-emulzió A TS8-emulzió 50% olajos fázist tartalmazó O/V emulzió. Az olajos fázis (160 ml) 92 V/V% Marcol 82®¹t, 1,8 m/V% Span 85®¹öt és 6,2 m/V% Brij 96®¹ot tartalmaz. Az 1. vizes fázis (160 ml) 98,5 V/V% 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-puffert (pH=7,8), 1,0 V/V% Thiomersal®¹t (1%¹os vizes oldat) és 0,5 m/V% Lutrol F127®¹t – adott esetben immunogénekkel együtt – tartalmaz. A TS8-emulzióban a felületaktív anyag végkoncentrációja 4,25 m/V%. TS9-emulzió A TS9-emulzió 10% olajos fázist tartalmazó O/V emulzió. Az olajos fázis (120 ml) 60 V/V% Marcol 82®¹t, 17,2 m/V% Span 40®¹et és 22,8 m/V% Arlatone 650®¹et tartalmaz. Az 1. vizes fázis (120 ml) 97,5 V/V% 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-puffert (pH=7,8) és 2,5 m/V% Tween 20®¹at tartalmaz. A 2. vizes fázist 400 ml 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-pufferrel (pH=7,8) állítottuk elõ, amely adott esetben immunogéneket tartalmaz. A preemulzió 100 ml¹ét a 400 ml térfogatú 2. vizes fázissal hígítottuk, miáltal a TS9-emulziót kaptuk. A TS7-emulzióban a felületaktív anyag végkoncentrációja 4,25 m/V%.

1

HU 003 686 T2

2. példa: Emulzió fázisinverziós hõmérsékletének meghatározása A TS6-emulzió 10 ml¹ét körülbelül 25 °C¹os vízfürdõben üvegcsõbe helyeztük. A TS6-emulzió fehér, homogén emulzió volt. A vízfürdõ hõmérsékletét fokozatosan növeltük. Az emulzióban bekövetkezõ változásokat vizuálisan követtük nyomon (az emulzió a sárgásbarna olajos fázis felszínre vándorlása következtében két elkülönült fázisra vált szét). Ez a változás az emulzió szétesésére jellemzõ jelenség. Az a hõmérséklet, amelynél e változás megfigyelhetõ, az emulzió PIT-értéke. A TS6-emulzió PIT-értéke 40–45 °C, míg a TS7emulzióé 44–49 °C. 3. példa: Mycoplasma hyopneumoniae vakcinakészítmény és kísérleti fertõzés („challange”) Anyagok és módszerek: Az 1. példában leírtak szerint elõállított TS6-emulziót és inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae BQ14-törzset [Kobisch, M. és munkatársai: Ann. Inst. Pasteur Immunol. 138, 693–705 (1987)] – a vakcina térfogatára vonatkoztatva 8,7 log10 CCU/ml (CCU: „color changing unit”, vagyis színváltoztató egység) koncentrációban – tartalmazó vakcinakészítményt állítottunk elõ. Huszonkét (22), háromhetes – anyai antitesteket hordozó {Mycoplasma hyopneumoniaere szeropozitív kocáktól született) malacot véletlenszerûen két csoportra osztottunk szét. Az egyik, tíz (10) malacból álló csoportot a 0. napon intramuszkuláris injekcióval a vakcinakészítmény 2 ml¹ével vakcináltunk, míg a kontrollcsoportot, amely tizenkét (12) malacból állt, nem vakcináltuk. A kísérlet folyamán elõre kiválasztott idõközönként (a 0., 27., 42. és 56. napon) mindkét csoportba tartozó malacoktól orrkeneteket vettünk, és ELISA-analízissel meghatároztuk a szekréciós anti-BQ14 antitesteket. A 27. napon a malacoktól vért vettünk, és a perifériás vér IFNg-szintjének meghatározása céljából perifériás vér mononukleáris (PBMN) sejteket gyûjtöttünk. A 28. napon a malacokat intranazálisan, hozzávetõleg 6,6 log10 CCU/ml Mycoplasma hyopneumoniae Mp88ctörzset tartalmazó oldattal fertõztük meg (mindkét orrnyílásba hozzávetõleg 5 ml oldatot adagolva). Az

5

2

Mp88c-törzset Dániában egy beteg sertésbõl izolálták és tenyésztették [leírást lásd Kobisch és Friis: Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569–1605 (1996)]. A mesterséges fertõzést 24 óra elteltével megismételtük. Ezután a sertéseket leöltük és tüdejüket kimetszettük. A hét tüdõlebenyen lévõ elváltozások – teljes lebenyfelületre vonatkoztatott – felszíni területének meghatározásával tüdõ pontszámokat állapítottunk meg. A pontszámokat a következõk szerint határoztuk meg:

10 Tüdõelváltozás tüdõlebenyre vonatkoztatott felszíne

Pontszám

0%

0

15

1–25%

1

26–50%

2

51–75%

3

>75%

4

20

Az összpontszámot a tüdõ összes lebenyére kapott pontszámok összeadásával számoltuk ki (egy állatra maximálisan 28 pont). Eredmények: A TS6-vakcinakészítménnyel vakcinált sertések erõteljes celluláris reakciót mutattak, és egy lé25 nyegesen nagyobb volt, mint a kontrollcsoport, amit az 5×105 perifériás vér mononukleáris (PBMN) sejtre meghatározott IFNg-szekretáló foltok száma bizonyít. A vakcinált csoportba tartozó sertésekre átlagosan 139 foltot regisztráltunk (szórás=25), míg a nem vakcinált kontroll30 csoportba tartozó sertéseknél 11¹et (szórás=5). Csoport

35

Foltok száma 5×105 PBMN-sejtre

TS6-vakcinakészítmény

139 (25)

Kezelés nélküli kontroll

11 (5)

A szekréciós anti-BQ14 antitestek vakcinált és kontroll sertésekben kimutatott szintjét a következõ táblázatban foglaljuk össze. Az eredmények azt mutat40 ják, hogy a vakcinált sertések szekréciós antitestszintje lényegesen nagyobb volt, mint a kezelés nélküli kontrollcsoportba tartozóké:

Szekréciós anti-BQ14 antitestek [optikai denzitás (OD) értékek] Csoportok

0. nap (vakcinálás elõtt)

27. nap (megfertõzési teszt elõtt)

42. nap (megfertõzési teszt után 14 nappal)

56. nap (megfertõzési teszt után 28 nappal)

TS6

0,026±0,001

0,033±0,002

0,201±0,089

0,264±0,043

Kontrollok

0,030±0,001

0,031±0,001

0,107±0,028

0,075±0,011

Hivatkozással az 1. ábrára, a TS6-vakcinakészítménnyel vakcinált állatok átlagos tüdõpontszáma 2,1±1,9 (átlag ±szórás), míg a kezelés nélküli kontroll állatok átlagos tüdõpontszáma 7,8±4,1 volt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vakcinakészítménnyel vakcinált sertések tüdõelváltozásai a nem vakcinált kontrollsertésekhez viszonyítva jelentõs mértékben csökkentek.

4. példa: A heterológ Mycoplasma hyopneumoniae törzzsel végzett kísérleti fertõzés elleni védettség 55 idõtartama Anyagok és módszerek: Harmincnyolc (38), három hetes – anyai antitesteket hordozó {Mycoplasma hyopneumoniaere szeropozitív kocáktól született) – malacot véletlenszerûen három csoportba osztottunk szét, a 60 következõk szerint. 12

1

HU 003 686 T2

Az 1. csoportot (12 malac) a kísérlet 0. napján a 3. példában leírt vakcinakészítmény 2 ml¹ével intramuszkulárisan vakcináltuk. A 2. csoportot (12 malac) a kísérlet 0. napján kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae vakcina 2 ml¹ével intramuszkulárisan vakcináltuk. A 3. csoportot (14 malac) vakcinálás nélküli kontrollként alkalmaztuk. A vakcinálás után 20 nappal valamennyi malacot intranazálisan, hozzávetõleg 6,6 log10 CCU/ml Mycoplasma hyopneumoniae Mp88c „challange”-törzset tartalmazó oldattal fertõztük meg (mindkét orrnyílásba hozzávetõleg 5 ml oldatot adagolva, lásd fentebb). A kísérleti fertõzést 24 órával késõbb megismételtük. Valamennyi csoportból vért vettünk, és az IFNg-szintek meghatározásához perifériás vér mononukleáris (PBMN) sejteket izoláltunk (lásd fentebb). Az anti-BQ14 IgA és IgG1 szérum antitesteket mindhárom csoport esetében a 138. napon határoztuk meg. Boncolás után a 3. példában leírtak szerint tüdõpontszámokat (átlag ±szórás) állapítottunk meg. Eredmények: Hivatkozással a 2. ábrára, az 1. csoportba tartozó, TS6-vakcinakészítménnyel vakcinált malacok átlagos tüdõpontszáma 0,4±0,9 volt, amely statisztikailag szignifikáns csökkenést jelent a kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ vakcinával vakcinált malacok tüdõpontszámaihoz (4,0±5,1), illetve a nem vakcinált kontrollmalacok tüdõpontszámaihoz (6,1±5,8) viszonyítva. Az egyes csoportokból a 138. napon gyûjtött, keringésben lévõ anti-BQ14 IgA és IgG1 szérum antitestek átlagos eredményeit (±szórás) a következõ táblázatban foglaljuk össze: Csoportok

Anti-BQ14 IgG (titer)

Anti-BQ14 IgA

TS6-vakcina

4,38±0,14

0,56±0,06

Kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ vakcina

3,09±0,11

0,09±0,01

Kontroll

2,73±0,08

Csoportok

28. nap

138. nap

152. nap

81±20

9±2

28±7

Kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ vakcina

5±2

3±1

6±1

Kontroll

6±3

2±2

11±8*

TS6-vakcina

5

* A rendellenesen sok foltot (109) mutató malac eredményei-

10 nek kihagyásával a kontrollcsoport átlaga 4±1-nek adódik. A várakozásnak megfelelõen, inaktivált vakcina alkalmazása esetén a vakcinálás után 138 nappal detektálható, anti-BQ14 IFNg¹t szekretáló T¹sejtek gyakori15 sága sokkal kisebb volt, mint a 28. napon. Érdekes módon, a TS6-tal vakcinált sertések többsége a 138. napon is pozitívnak bizonyult, ami arra utal, hogy e csoportban megmaradt a celluláris reakció. A 152. napon (azaz a kísérleti fertõzés után 13 nappal) a keringés20 ben lévõ, anti-BQ14 IFNg¹t szekretáló T¹sejtek gyakorisága a három csoportban nagyon eltérõ volt. A TS6-tal vakcinált csoportban – a másik két csoporttól eltérõen – nagyon magas szintû celluláris reakció alakult ki. Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a kísérleti 25 fertõzés hatékonyan hívja elõ a TS6-vakcina által indukált immunmemóriát.

30

35

40 0,09±0,01

A következõ táblázatban a perifériás vérben lévõ, gamma-interferont (IFNg) szekretáló 5×105 perifériás vér mononukleáris (PBMN) sejtre jutó foltszám átlagos eredményeit (±szórás) foglaljuk össze:

2

45

5. példa: Az adjuvánsként TS6-emulziót tartalmazó PCV-2-vakcina egy dózisának beadását követõen kapott szerológiai eredmények Anyagok és módszerek: Tíz, 2–3 hónapos, specifikus patogénektõl mentes (SPF) malacot véletlenszerûen két csoportba osztottunk szét. Az egyik, öt malacból álló csoportot a kísérlet 0. napján – inaktivált PCV2¹t (imp1010-törzs) 6,8 log10 CCID50/dózis mennyiségben tartalmazó – 2 ml vakcinával intramuszkulárisan vakcináltuk. A kontrollcsoportot (amely szintén öt malacból állt) nem vakcináltuk. A vakcinálás után – a PCV¹2 ORF2 antitestek titerének ELISA-analízissel történõ meghatározása céljából a vakcinálás napján (0. nap), illetve a vakcinálás után 7, 14, 21 és 28 nappal vérmintákat vettünk. Eredmények: Ahogy a következõ táblázatban látható, a vakcinálás után 7–40 nappal valamennyi vakcinált állatban jelentõs nagyságú anti-PCV¹2 ORF2 antitestreakció volt kimutatható.

Csoportok

ELISA (log10)

0. nap

7. nap

14. nap

21. nap

28. nap

Vakcinált

Átlag

1,00

2,53

3,50

3,45

3,88

Szórás

0,00

0,89

0,79

0,84

0,37

Átlag

1,00

1,00

1,00

1,00

1,27

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,00

1,24

Kontroll

6. példa: Adjuvánsként TS6-emulziót tartalmazó PCV-2-vakcina által elõidézett védettség mesterséges fertõzéssel szemben Anyagok és módszerek: Tizenhat (16), 4–5 napos SPF-malacot véletlenszerûen két csoportba osztottunk,

a következõk szerint: az egyik, nyolc malacból álló csoportot két alkalommal (a 0. és 21. napon) inaktivált PCV2¹t (imp1010-törzs) 7,55 log10 CCID50/dózis mennyiségben tartalmazó – 2 ml vakcinával intramuszkuláris injek60 tálással vakcináltuk, míg a kontrollcsoportot (amely szin13

1

HU 003 686 T2

tén nyolc malacból állt) nem vakcináltuk. A 35. napon valamennyi malacot PCV¹2 Imp1011–48285-törzzsel (amely az ECACC-nél V98011608 nyilvántartási számon lett letétbe helyezve) fertõztük meg (körülbelül 5,5 log10 CCID50/ml), oly módon, hogy a malacok Pontszám

5

2

mindkét orrnyílásába hozzávetõleg 5 ml¹t adagoltunk. Valamennyi malac esetében ELISA-analízist és szeroneutralizációs (SN) vizsgálatokat végeztünk, illetve klinikai pontszámokat határoztunk meg, a következõk szerint:

0

1

2

Legyengülés

nincs

mérsékelt

nagyfokú

Légzési zavar

nincs

mérsékelt

nagyfokú

rózsaszín

fehér

sárga

Köhögés

nincs

van

Étvágytalanság

nincs

van

Hányás

nincs

van

Vérszegénység (bõrszín)

Végbélhõmérséklet

t<40 °C

39,9
t>40,9 °C

Az „n”-edik héten elért testsúlygyarapodás nagyobb, mint az „n–1”-edik héten

Igen

Nem, de >100 g/nap

Nem, de <101 g/nap

Elhullás

Nincs

Van*

* Elhullás esetén az elõzõ napnak megfelelõ pontszámot alkalmazzuk.

Boncolást követõen elváltozási pontszámot számítottunk, a következõk szerint: Pontszám

0

1

2

Testalkat

Normál

Sovány

Nagyon sovány

A vágott test megjelenése

Normál

Fehér

Sárga

Nyálkahártya

Normál

Fehér

Sárga

3

Csenevész

Bõr alatti kötõszövet

Normál

Fényes

Sárga

Felszíni nyirokcsomók

Normál

1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

>1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

Mellüreg gennyesedés

Nincs

Fényes mellüreg

Látható jelenlét

Szív

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Tüdõ

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Pleura

Nincs elváltozás

Kis elváltozások

Nagy elváltozások

Mediastinalis nyirokcsomók

Normál

1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

>1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

Hasüreg

Normál

Fényes

Látható hasûri folyadék

Peritoneum

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Gyomor

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Vékonybél

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Bél

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Bélfodri nyirokcsomók

Normál

1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

>1 zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

>1 nagyon zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

Peyer-plakkok

Nem láthatók

Csak egy bélszakaszban láthatók

Több bélszakaszban láthatók

Több bélszakaszban láthatók és nagyon jelentõsek

Máj

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Vese

Nincs elváltozás

Van elváltozás

Húgyhólyag

Nincs elváltozás

Van elváltozás

14

>1 nagyon zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

>1 nagyon zsíros és/vagy fehér és/vagy vértolulásos

Fekély

1

HU 003 686 T2

Eredmények: A 30. és 63. napon kapott szerológiai eredmények (ELISA és szérum neutralizáló antitest titere) azt mutatják, hogy a vakcinált malacokra nagyobb szintek jellemzõek, mint a kezelés nélküli kontrollokra. A következõ táblázatban összefoglaljuk a székletkenetekbõl és mediastinalis nyirokcsomókból származó PCV¹2 vírusizolálási eredményeket, valamint a vakcinált és kontrollcsoportra megállapított klinikai és elváltozási pontszámokat.

5

10 Csoportok

Vakcinált

Kontroll

Szerológia ELISA a 30. napon (log10)

4,1±0,70

2,8±0,50

Szerológia ELISA a 63. napon (log10)

5,2±0,28

3,4±0,67

Szerológia SN a 30. napon (log10)

3,4±0,25

1,6±0,23

Szerológia SN a 63. napon (log10)

3,7±0,31

2,2±0,53

PCV¹2 székletben (pozitív eredmények %¹a)

40

61

PCV¹2 mediastinalis nyirokcsomókban (pozitív eredmények %¹a)

25

100

Klinikai pontszám

14

Elváltozási pontszám

15

20

25

9,8

31 18,8

7. példa: TS6-adjuvánst tartalmazó inaktivált PCV2-vakcinával végzett egydózisos vakcinálás utáni nem laboratóriumi hatékonysági eredmények Vakcinakészítmény: A TS6-adjuvánst az 1. példában leírtak szerint állítottuk elõ. A PCV-2-vírust PK/15sejteken növesztettük, és a vírusszaporítást a 6 517 843 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Ellis és munkatársai) leírtak szerint végeztük. Röviden összefoglalva: a vírustenyésztés végén a megfertõzött sejteket betakarítottuk, feltártuk és a betakarított vírusokat szokványos módszerrel inaktiváltuk. Például az inaktiválás a következõ módokon hajtható végre: 0,1% etiléniminnel +37 °C¹on 18 óra hosszat; 0,5% béta-propiolaktonnal +28 °C¹on 24 óra hosszat; vagy 0,2% és 0,1% béta-propiolaktonnal +4 °C¹on 24 óra hosszat. Ha az inaktiválás elõtti vírustiter nem volt megfelelõ, a vírusszuszpenziót 150–300 kD¹os vágási („cut-off”) értékû membrán alkalmazásával végzett ultraszûréssel betöményítettük. Az inaktivált vírusszuszpenziót a vakcina összeállítása elõtt +5 °C¹on tároltuk. A vakcina antigéntartalmát 2,1 log10 antigénegység/dózis értékre állítottuk be. E tartalom alapján a vakcina aktivitását – amelyet a végtermékben lévõ aktív komponens ELISA-eljárással végzett mennyiségi meghatározása során határoztunk meg – önkényesen minimálisan 100 ELISA-egység/dózis értékre állítottuk be. Vakcinálási protokoll: A vakcinakészítmény nem laboratóriumi körülmények között megfigyelhetõ hatékonyságának tesztelése céljából egy olyan állattartó telepet választottunk ki, ahol a választott malacok cirkovírus okozta sorvadási (CMWS) szindrómájának PCV-

2

2-fertõzés miatt bekövetkezett endemikus kitörése jelentkezett. A kocákat két csoportba osztottuk szét: az elsõ csoportba tartozókat az ellés elõtt két–három héttel TS6-adjuvánst tartalmazó inaktivált PCV-2-vakcinával vakcináltuk (intramuszkuláris injektálással, 2 ml¹es dózis). A másik csoportot nem vakcináltuk; ez szolgált kontrollként. A kocákat elletését követõen a vakcinált kocáktól született malacok (n=889) és a kontrollkocáktól született malacok (n=713) mortalitását vágásérettségük eléréséig követtük nyomon. Eredmények: A 4. ábrán a malacok között vágásérettségig elõforduló PMWS-esetek százalékos arányát ábrázoló grafikont mutatunk be. Ahogy az a grafikonon látható, a vakcinált kocáktól született malacoknál a PMWS-esetek száma 75%¹os csökkenést mutatott a nem vakcinált kontrollcsoportból származó malacoknál elõforduló esetszámhoz képest. Ezek az eredmények a PCV-2-fertõzéssel összefüggõ klinikai betegség jelentõs mértékû csökkenését mutatják, és bizonyítják a kocák – TS6-adjuvánst tartalmazó inaktivált PCV2-vakcinával ellés elõtt nem sokkal történõ – vakcinálásának megvalósíthatóságát a malacok PCV2-fertõzéssel összefüggõ mortalitásának és morbiditisának megelõzése céljából. Ezek az eredmények bizonyítják továbbá, hogy tényleges állattartó telepi nem laboratóriumi körülmények között a jelen találmány szerinti vakcinakészítmény mindössze egy dózisának alkalmazásával a malacok körében a PMWS-szindróma jelentõs mérséklõdése érhetõ el.

30 8. példa: LF2-emulzió Az 1. példában leírt eljárás alkalmazásával 10% olajos fázist tartalmazó „olaj a vízben” (O/V) emulziót állítottunk elõ, melyet LF2-nek neveztünk el. Az olajos 35 fázis (100 ml) 88 V/V% Mercol 82 ® ¹t, 1,8 m/V% Span80®¹at és 10,2 m/V% Tween 85®¹öt tartalmazott. Az 1. vizes fázis (100 ml) 88,5 V/V% arányban 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfát-puffert (pH=7,8) és 11,5 m/V% arányban 20 m/V% koncentrá40 ciójú Tween80®-oldatot tartalmazott. A 2. vizes fázist (400 ml) az – adott esetben immunogéneket tartalmazó – 0,02 M izotóniás dinátrium- és monokálium-foszfátpufferrel (pH=7,8) állítottuk össze. A preemulzió 100 ml¹ét 400 ml 2. vizes fázissal hígítva az LF2-emul45 ziót kaptuk. Az LF2-emulzióban a felületaktív anyag végkoncentrációja 1,43 m/V% volt. Az LF2-emulzió PIT-értéke >45 °C volt (vezetõképesség alapján meghatározva). 9. példa: Adjuvánsként LF2-emulziót tartalmazó sertésinfluenza vakcina adagolása után végzett szerológiai analízis Anyagok és módszerek: Tizenöt (15), körülbelül 10 hetes malacot véletlenszerûen három csoportba osz55 tottunk szét. Az elsõ (vakcinált) csoportba 5 malac tartozott, melyeket két alkalommal (a 0. és 28. napon) intramuszkuláris injekcióval 2 ml rekombináns sertésinfluenza vakcinával (7,7 log10 CCID50/dózis) vakcináltunk. Ez a rekombináns expressziós vektor vakcina kanárihimlõ 60 vektort tartalmaz, amely a H1N1 sertés influenzavírus 50

15

1

HU 003 686 T2

nukleoproteinjét (NP) és hemagglutininjét (HA) kódolja és expresszálja. A második csoportba tartozó 5 malacot intramuszkuláris injekcióval két alkalommal (a 0. és 28. napon) 2 ml rekombináns sertésinfluenza vakcinával (7,7 log10 CCID50/dózis) vakcináltuk, amely adjuvánsként LF2-emulziót tartalmazott (LF2-vakcinált csoport). Öt malacot vakcinálás nélkül hagytunk (kontrollcsoport). A 0. napon és a vakcinálás utáni 14., 28., 42. és 56. napon vérmintákat vettünk, hogy meghatározzuk a hemagglutinizáció-gátlási (HI) titereket.

2

Eredmények: Ahogy a következõ táblázatban látható, a vakcinálás utáni 42–56. napokon valamennyi vakcina jelentõs sertésinfluenza elleni antitestreakciót eredményezett a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva 5 (ANOVA, p<0,0001). Mindazonáltal, az LF2-adjuvánst tartalmazó vakcinával kezelt sertésekben a vakcinálás utáni 42–56. napokon az antitestreakció jelentõs mértékû fokozódását figyeltük meg az adjuvánst nem tartalmazó rekombináns vakcinával kezelt sertésekhez vi10 szonyítva (ANOVA, p<0,0001).

Csoportok

HI (log10)

0. nap

14. nap

28. nap

42. nap

56. nap

Vakcinált

Átlag

0,9

0,9

0,9

1,2

1,2

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,37

0,21

LF2-vakcinált

Átlag

0,9

0,9

0,9

2,04

1,92

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,33

0,16

Átlag

0,9

0,9

0,9

0,9

0,9

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

Kontrollok

Ahogy a fenti eredmények is bizonyítják, az LF2emulzió adjuváns hatásának köszönhetõen a vakcina a sertés influenzavírus ellen nagyobb antitestreakciót indukál, mint az adjuváns nélküli vakcina. 10. példa: Adjuvánsként LF2-emulziót tartalmazó Mannheimia haemolytica vakcina által indukált védettség Anyagok és módszerek: Húsz (20) öt hónapos borjút (melyek a Mannheimia haemolytica leukotoxin antitestre negatívak vagy alacsony antitest-titerûek voltak) véletlenszerûen két, egyenként 10 borjúból álló csoportba soroltunk. A fenti 8. példában leírtak szerint LF2-emulziót állítottunk elõ, és olyan vakcinát készítettünk, amely vakcinadózisonként hozzávetõleg 60–70 ELISA-egység inaktivált Mannheimia haemolyticát (A1-törzs) tartalmazott (ami körülbelül 0,34–1,1 ml nyers, betöményítetlen baktériumtenyészetnek felel

25

30

35

40

meg), adjuvánsként pedig az LF2-emulziót tartalmazta. Az egyik, tíz borjúból álló csoportot a 0. napon, szubkután injektálással az LF2-vakcinakészítmény 2 ml¹ével vakcináltuk, míg a szintén 10 borjúból álló kontrollcsoportot nem vakcináltuk. A vakcinálás napjától (0. nap) a kísérleti fertõzés napjáig (20. nap) valamennyi vakcinált borjút rendszeresen megvizsgáltunk a vakcinálással szembeni általános és helyi reakciókra. A klinikai vizsgálat a szisztémás reakciók értékelését (úgymint tompultság, étvágytalanság, polypnea, nyáladzás, remegés), a végbélhõmérséklet regisztrálását és az injektálás helyén elõforduló lokális reakciók mérését foglalta magában. A vakcinálásra egyik borjú sem mutatott szisztémás reakciót. A következõ táblázatban összefoglalt végbélhõmérsékletek (°C ±szórás) tanúsága szerint a vakcinált csoportban enyhe hõemelkedés volt tapasztalható, melynek csúcsértéke a vakcinálás után 24 órával jelentkezett.

0. nap

0. nap+ 4 óra

1. nap

2. nap

3. nap

7. nap

14. nap

20. nap

Vakcinált

39,3±0,3

39,6±0,4

39,5±0,3

39,2±0,3

39,0±0,2

39,0±0,2

39,1±0,3

38,7±0,3

Kontroll

39,3±0,2

39,3±0,2

39,1±0,2

39,1±0,2

38,9±0,2

39,0±0,2

38,9±0,1

38,7±0,3

A vakcinált borjakban a lokális reakciók (melyeket felszíni kiterjedésük területeként cm2-ben mértünk (átlag ±szórás) erõteljes lokális reakciót mutattak, amely valamennyi vakcinált állatban a vakcinálás után hozzá-

Vakcinált

vetõleg 24–48 órával jelentkezett, majd gyorsan csök50 kenni kezdett (a 14. napra hozzávetõleg 3 cm2¹re). Ezek a reakciók a 20. napra csaknem eltûntek. A reakciókat a következõk szerint foglaljuk össze:

0. nap

0. nap+ 4 óra

1. nap

2. nap

3. nap

7. nap

14. nap

20. nap

0,9±0,4

9,2±12,4

71,3±25,8

72,5±29,3

56,9±18,0

15,9±8,0

2,6±2,6

2,0±1,2

Az állatoktól különbözõ idõpontokban (a 0., 7., 14., 20. és 28. napon) vérmintákat vettünk, és ELISA-analí-

zissel meghatároztuk a Mannheimia haemolytica 60 A1 leukotoxin elleni antitestek szintjét (titer log10 OD5016

1

HU 003 686 T2

2

zió, miközben a 0. naptól a 20. napig valamennyi kontrollborjú negatív maradt. Az ELISA-eredményeket a következõ táblázatban foglaljuk össze:

értékként meghatározva). Az eredmények azt mutatták, hogy a vakcinálás elõtt valamennyi borjú negatív volt. Egyetlen vakcinálás után, a 20. napra tíz vakcinált egyed közül nyolcnál volt megfigyelhetõ szerokonver-

Csoportok

ELISA (log10)

0. nap

7. nap

14. nap

21. nap

Vakcinált

Átlag

<0,78

1,11

1,70

1,86

4,00

Kontroll

28. nap

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,84

0,26

Átlag

<0,78

<0,78

<0,78

<0,78

1,39

Szórás

0,00

0,00

0,00

0,00

1,00

Kísérleti fertõzési protokoll: A 20. napon valamennyi borjút intratracheálisan adagolt 30 ml „challange”-oldattal fertõztük meg, amely 9,2 log10 CFU/ml (kolóniaképzõ egység/ml) Mannheimia haemolytica A1¹törzset tartalmazott. A kísérleti fertõzést 24 óra elteltével megismételtük. A kísérleti fertõzés napjától a kísérletsorozat végéig valamennyi borjút naponta általános klinikai tünetek (ideértve a légzési distresst) meg-

jelenésére vizsgáltuk. Az ellenõrzés alá vont tünetek a 15 következõk voltak: általános állapot, étvágytalanság, végbélhõmérséklet, orrfolyás, köhögés, légzésszám és nehézlégzés. Az összklinikai pontszámot a következõ képlet szerint, a táblázatban megadott részpontszámok alapján 20 számítottuk ki. Összklinikai pontszám=S(részpontszám×együttható)/14

0

1

2

Együttható

Általános állapot

Normál

Legyengült

Kimerült

x2

Táplálkozás

Normál

Csökkent

Étvágytalanság

x3

Köhögés

Nincs

Erõs, ritka

Gyenge, gyakori

x1

Orrfolyás

Nincs

Savós

Nyákos-gennyes

x2

Légzésszám

<35/perc

35–50/perc

>50/perc

x3

Végbélhõmérséklet

<39,5 °C

39,5–40,5 °C

>40,5 °C

x3

Elpusztult állatok esetében a maximális egyéni napi klinikai pontszámot (2) alkalmaztuk. Mindegyik borjúra meghatároztuk a tüdõelváltozási pontszámokat is (százalékértékben kifejezve), melynek során a következõ képletet alkalmaztuk: Tüdõelváltozási pontszám=S(egy lebenyen lévõ elváltozás felülete/teljes lebeny felülete×100×LRM) ahol LRM jelentése: relatív tüdõtömeg, melynek értéke: 0,11 a jobb cranialis lebenyre és a jobb medialis cranialis lebenyre; 0,07 a jobb medialis caudalis lebenyre; 0,35 a jobb caudalis lebenyre;

Vakcinált Kontroll

0,05 a bal cranialis lebenyre; 0,06 a bal medialis lebenyre; 0,32 a bal caudalis lebenyre; és 0,04 a járulékos lebenyre. A kísérleti fertõzés eredményei: Az egyes csoportokra megállapított összklinikai pontszámok (lásd a kö40 vetkezõ táblázatot) azt mutatták, hogy a vakcinált csoportban az összklinikai pontszámok szignifikáns csökkenése tapasztalható a kezelés nélküli kontrollokhoz képest (p=0,046, ANOVA). 35

45

20. nap

21. nap

22. nap

23. nap

24. nap

25. nap

26. nap

27. nap

Összesített pontszám

Átlag

0,0

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

0,5

4,0

Szórás

0,1

0,4

0,5

0,6

0,8

0,8

0,8

0,8

4,5

Átlag

0,1

0,9

1,1

1,0

1,1

1,2

1,2

1,3

8,0

Szórás

0,1

0,5

0,6

0,8

0,9

0,8

0,8

0,7

4,5

A kísérleti fertõzésbe belepusztult állatok mindegyikének tüdeje 60%-ban vagy még nagyobb arányban volt érintett. A vakcinált állatokban statisztikai tendencia (p=0,08) érvényesült arra vonatkozóan, hogy e cso-

portban kevesebb tüdõelváltozás volt, mint a kontrollcsoportban. A vakcinált csoportban azon állatok száma, amelyek tüdeje 1/3¹nál nagyobb arányban volt 60 érintett, 2/10 volt (20%), míg ez a kontrollállatoknál 17

1

HU 003 686 T2

7/10 (70%) volt. A vakcinált csoportban azon állatok száma, amelyek tüdeje 1/3¹nál nagyobb arányban volt érintett, szignifikánsan kisebb volt (p=0,03; Fischer-féle egzakt teszt, egyirányú). A tüdõelváltozási pontszámok eredményeit a következõ táblázatban foglaljuk össze:

Tüdõelváltozások egyedi százaléka a vakcinált állatokban

74,8*

64,5*

10,6

7,0

10,1

78,6*

10,5 66,4* 6,2 6,9

Tüdõelváltozások egyedi százaléka a kontrollállatokban

60,9 48,2 0,8

25,4

59,5*

25,2±25,5

10

44,7

32,9

8,0 Átlag ±szórás

63,1*

5

15

32,9 Átlag ±szórás

46,0±25,5

20

* a kísérleti fertõzésbe belepusztult állatok

Az összklinikai pontszámok és a tüdõelváltozások százaléka között rendkívül szignifikáns (p<0,001) és erõs korreláció (R2=0,86) volt megfigyelhetõ. Bár a vakcinálást követõen valamennyi vakcinált állatra enyhe hõemelkedés volt jellemzõ, a vakcinálásra egyéb általános reakció nem volt megfigyelhetõ. A vakcinálás után erõteljes helyi reakciókat észleltünk, de ezek gyorsan elfogadható méretûre csökkentek és boncoláskor jelentõs elváltozások voltak megfigyelhetõk. Ezek az eredmények igazolják az adjuvánsként LF2-emulziót tartalmazó vakcina biztonságosságát. E kísérlet eredményei, melyek azt mutatják, hogy a vakcinált állatokban az átlagos klinikai pontszámok és a tüdõelváltozási pontszámok jelentõs mértékben csökkentek a kontrollállatokéhoz viszonyítva, azt igazolják, hogy az adjuvánsként LF2-emulziót tartalmazó Mannheimia haemolytica vakcina egyetlen injekciója megvédi a natív borjakat egy kísérleti Mannheimia haemolytica fertõzéstõl.

25

30

35

40

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 45 1. Vakcinakészítmény, amely injektálható „olaj a vízben” (O/V) emulziót tartalmaz, mely a következõket foglalja magában: (i) vizes oldat, amely legalább egy immunogént tartalmaz; (ii) ásványi olaj; (iii) nemionos lipofil felületaktív anyag; (iv) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB-) értékkel bír, melynek értéke 13¹nál nagyobb és 40¹nél kisebb; (v) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely kis hidrofil-lipofil egyensúly (HLB-) értékkel bír, melynek értéke 9 és 13 közötti. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a nagy HLB-értékû nemionos hidrofil felületaktív anyag

50

55

60 18

2

az emulzió térfogatára vonatkoztatva 0,1–1,5 m/V% (vegyes%) koncentrációban van jelen. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, amelyben a felületaktív anyagok százalékos aránya 4 m/V%-tól 6 m/V%¹ig terjed. 4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a kis HLB-értékû nemionos hidrofil felületaktív anyag az emulzió térfogatára vonatkoztatva 1 m/V%-tól 8 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban van jelen. 5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a nemionos lipofil felületaktív anyag az emulzió térfogatára vonatkoztatva 0,1 m/V%-tól 2,5 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban van jelen. 6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben az ásványi olaj 20–40 V/V% (térfogat%) koncentrációban van jelen. 7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az emulzió fázisinverziós hõmérséklete (PIT) 33 °C és 66 °C közötti érték. 8. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a kis HLB-értékû nemionos hidrofil felületaktív anyag a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: szorbitán etoxilált zsírsav-triészterei, szorbitán etoxilált zsírsavdiészterei, szorbitán etoxilált zsírsav-monoészterei, etoxilált zsíralkoholok, etoxilált zsírsavak, etoxilált ricinusolaj és ezek kombinációi. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, ahol az etoxilált zsírsav-észter a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: oleát, palmitát, sztearát, izosztearát, laurát és ezek kombinációi. 10. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a nemionos lipofil felületaktív anyag a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: szorbitán zsírszav-észterei, mannid zsírsav-észterei, mannid dietoxilált zsírsavészterei, mannid trietoxilált zsírsav-észterei, mannid tetraetoxilált zsírsav-észterei és ezek kombinációi. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, ahol a zsírsav-észter a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: oleát, palmitát, sztearát, izosztearát, laurát és ezek kombinációi. 12. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a nagy HLB-értékû nemionos hidrofil felületaktív anyag a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: szorbitán etoxilált zsírsav-monoészterei, etoxilált zsíralkoholok, etoxilált zsírsavak, nemionos blokk-kopolimer és ezek kombinációi. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, ahol a szorbitán etoxilált monoésztere a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: etoxilált szorbitán-monolaurát, etoxilált szorbitán-monopalmitát, etoxilált szorbitán-monosztearát, etoxilált szorbitán-monooleát és ezek kombinációi. 14. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az ásványi olaj a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: paraffinolaj, szkvalán, prisztán, poliizobuténolaj, hidrogénezett poliizobuténolaj, polidecénolaj, poliizoprénolaj, poliizopropénolaj és ezek kombinációi. 15. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely paraffinolajat, nemionos lipofil felületaktív anyagként szorbitán-zsírsav-monoésztert, kis HLB-értékû nemio-

1

HU 003 686 T2

nos hidrofil felületaktív anyagként szorbitán etoxilált zsírsav-triészterét, és nagy HLB-értékû nemionos hidrofil felületaktív anyagként nemionos blokk-kopolimert tartalmaz. 16. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben a szorbitán-zsírsav-monoészter szorbitán-monooleát, a szorbitán etoxilált zsírsav-triésztere a szorbitán etoxilált trioleátja, és a nemionos blokk-kopolimer polioxietilén/polioxi-propilén polimer (POE-POP). 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, amelyben a paraffinolaj 10 V/V%-tól 40 V/V%¹ig terjedõ koncentrációban, a szorbitán-monooleát 0,2 m/V%-tól 1,5 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban, a szorbitán etoxilált trioleátja 2 m/V%-tól 5 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban, és a POE-POP 0,1 m/V%-tól 0,5 m/V%¹ig terjedõ koncentrációban van jelen. 18. A 16. igénypont szerinti készítmény, amelyben a paraffinolaj 29,3 V/V% koncentrációban, a szorbitánmonooleát 0,6 m/V% koncentrációban, a szorbitán etoxilált trioleátja 3,4 m/V% koncentrációban, és a POEPOP 0,25 m/V% koncentrációban van jelen. 19. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunogén a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: inaktivált patogén, legyengített patogén, immunogén alegység, rekombináns expressziós vektor és plazmid vagy ezek kombinációi. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, ahol a patogén a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: vírus, baktérium, gomba, protozoa parazita vagy ezek kombinációi. 21. A 19. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunogén egy inaktivált vírus. 22. A 21. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunogén inaktivált 2¹es típusú sertés cirkovírus (PCV¹2). 23. A 19. igénypont szerinti készítmény, ahol az immunogén inaktivált Mycoplasma hyopneumoniae baktérium. 24. A 19. igénypont szerinti készítmény vakcinaként történõ alkalmazásra, mely vakcina állatban patogén elleni immunológiai reakció indukálására szolgál. 25. A 19. igénypont szerinti készítmény alkalmazása gyógyszer elõállítására, mely gyógyszer állatban patogén elleni immunológiai reakció indukálására szolgál. 26. A 24. igénypont szerinti készítmény vagy a 25. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunogén a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: inakti-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

19

2

vált Mycoplasma hyopneumoniae baktérium, inaktivált 2¹es típusú sertés cirkovírus (PCV¹2) vagy ezek kombinációi. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vakcinakészítmény alkalmas egyszeri adagolási sémához. 28. A 25–27. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az állat a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: szarvasmarhák, sertések, lovak, kutyák, macskák, csirkék, kacsák és pulykák. 29. A 25–28. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az adagolás intramuszkuláris (IM), intradermális (ID) vagy szubkután (SC) injektálás. 30. A 25–29. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az adagolás tû nélküli injektálókészülékkel kerül végrehajtásra. 31. A 24. igénypont szerinti készítmény vagy a 25–30. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az immunogén a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: sertés influenzavírus vagy inaktivált Mannheimia haemolytica. 32. Reagenskészlet, amely egy elsõ edényben immunogént és egy második edényben emulziót tartalmaz, ahol az említett emulzió a következõket foglalja magában: (i) ásványi olaj; (ii) nemionos lipofil felületaktív anyag; (iii) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB-) értékkel bír, melynek értéke 13¹nál nagyobb és 40¹nél kisebb; és (iv) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely kis hidrofil-lipofil egyensúly (HLB-) értékkel bír, melynek értéke 9 és 13 közötti. 33. A 32. igénypont szerinti reagenskészlet, amelyben az immunogén liofilizált alakban vagy vizes közegben készített oldatban van. 34. Eljárás legalább egy immunogént és emulziót tartalmazó vakcinakészítmény elõállítására, ahol az emulzió a következõ komponenseket foglalja magában: (i) ásványi olaj; (ii) nemionos lipofil felületaktív anyag; (iii) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely nagy hidrofil-lipofil egyensúly (HLB)-értékkel bír, melynek értéke 13¹nál nagyobb és 40¹nél kisebb; és (iv) nemionos hidrofil felületaktív anyag, amely kis hidrofillipofil egyensúly (HLB)-értékkel bír, melynek értéke 9 és 13 közötti; és ahol az említett legalább egy immunogént az emulzió kialakítása során foglaljuk az emulzióba vagy az emulzióhoz adjuk hozzá.

HU 003 686 T2 Int. Cl.: A61K 39/39

20

HU 003 686 T2 Int. Cl.: A61K 39/39

21

HU 003 686 T2 Int. Cl.: A61K 39/39

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest