!HU000004766T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 766
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 38/06
(21) Magyar ügyszám: E 05 729655 (22) A bejelentés napja: 2005. 04. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050729655 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1755634 A1 2005. 10. 20. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1755634 B1 2008. 10. 08.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20040821256 2004. 04. 08.
(73) Jogosult: Biotempt B. V., 7958 NZ Koekange (NL)
US
(72) Feltalálók: KHAN, Nisar, Ahmed, 3039 JL Rotterdam (NL); BENNER, Robbert, NL-2992 SH Barendrecht (NL) (54)
(2006.01) A61K 38/08 (2006.01) A61K 38/07 (2006.01) A61P 13/12 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05097163 PCT/EP 05/003707
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
A vér megemelkedett karbamidkoncentrációját csökkentõ oligopeptidek
(57) Kivonat
HU 004 766 T2
A találmány tárgyát képezi eljárás a karbamidkoncentráció valamely alany szérumában való csökkentésére. Az ilyen eljárás során az alanynak (pl. egy emlõsnek, így például egy embernek) beadnak egy készítményt, amely olyan aktivitással rendelkezõ oligopeptidet (vagy oligopeptideket) tartalmaz, amely csökkenti az alany
szérumában a karbamid koncentrációját – ahogy az egérben végzett reperfúziós teszttel meghatározható –, és ahol az oligopeptid QGV vagy MTRV (1. azonosító számú szekvencia) [pl. AQGV (2. azonosító számú szekvencia) vagy MTRV (1. azonosító számú szekvencia)] szekvenciát tartalmaz.
A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 766 T2
Mûszaki szakterület A találmány általánosságban a biotechnológia tárgykörébe tartozik, közelebbrõl pedig a találmány tárgyát képezik immunszabályozó aktivitással rendelkezõ készítmények, amely vegyületek közé tartoznak a humán korion-gonadotropinból (hCG) származó egyes különleges oligopeptidek. A technika állása Az 5,380,668 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (Herron, 1995. január 10.), amely e hivatkozás révén teljes egészében a kitanítás részét képezi, többek között különféle olyan vegyületeket ismertet, amelyek a hCG antigénkötõ aktivitásával rendelkeznek. Az ott ismertetett oligopeptideket általánosságban diagnosztikai eljárásokban való alkalmazás céljára tárják fel. Gallo és mtsai. több szabadalmukban és szabadalmi bejelentésükben [pl. 5 677 275 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (megfelel a WO 96/04008 A1 számú nemzetközi közzétételi iratnak); 5 877 148 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (megfelel a WO 96/04008 A1 számú nemzetközi közzétételi iratnak); WO 97/49721 A1 számú nemzetközi közzétételi irat; 6 319 504 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (megfelel a WO 97/49373 számú nemzetközi közzétételi iratnak); 2003/0049273 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (megfelel a WO 97/49373 számú nemzetközi közzétételi iratnak); 5 968 513 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (WO 97/49418), 5 997 871 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (megfelel a WO 97/49432 számú nemzetközi közzétételi iratnak); 6 620 416 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; 6 596 688 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; WO 01/11048 A2 számú nemzetközi közzétételi irat; WO 01/10907 A2 számú nemzetközi közzétételi irat; és 6 583 109 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom] ismertetnek különféle oligopeptideket és többek között az alábbi területeken történõ alkalmazásukat: „HIV-fertõzés gátlása”, „HIV-fertõzés kezelése vagy megelõzése”, „rák kezelése vagy megelõzése”, „a szervezet sejttömegcsökkenésével jellemezhetõ állapotok kezelése vagy megelõzése”, „kóros érképzõdéssel járó állapotok kezelése vagy megelõzése”, „vérképzõszervi mûködési hiány kezelése vagy megelõzése”, „ex vivo génterápia”, „vérsejtek in vitro szaporítása” és/vagy „vérsejtek alanyoknak történõ beadása”.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 A találmány feltárása Ahogy azt a WO 03/029292 A2 számú PCT nemzetközi közzétételi iratban (közzététel dátuma: 2003. április 10.), a WO 01/72831 A2 számú PCT nemzetközi közzétételi iratban (közzététel dátuma: 2001. október 4.), valamint a 20020064501 A1 (közzététel dátuma: 2002. május 11.), a 20030119720 A1 (közzététel dátuma: 2003. június 26.), a 20030113733 A1 (közzététel dátuma: 2003. június 18.) és a 20030166446 A1 (közzététel dátuma: 2003. szeptember 4.) számú amerikai
2
egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben – amelyek e hivatkozás révén teljes egészükben a kitanítás részét képezik – közöltük, az itt ismertetett oligopeptidek némelyikét tartalmazó készítmények olyan immunszabályozó aktivitással rendelkeznek, amelyek például a vérmérgezés, valamint más betegségek és állapotok kezelésében hasznosak. A találmány tárgyát képezi eljárás az karbamid-nitrogén vérbeli (BUN) koncentrációjának (a leírásban másként „karbamidkoncentráció”) valamely alany szérumában való csökkentésére. Az ilyen eljárás során az alanynak (pl. valamely emlõsnek, így például egy embernek) beadunk egy készítményt, amely olyan aktivitással rendelkezõ oligopeptidet (vagy oligopeptideket) tartalmaz, ami csökkenti az alany szérumában az karbamid koncentrációját – ahogy az egérben végzett reperfúziós teszttel meghatározható –, és ahol az oligopeptid AQGV (2. azonosító számú szekvencia) vagy MTRV (1. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú. Olyan esetben, ha a készítmény kizárólag az AQGV (1. azonosító számú szekvencia) oligopeptidet tartalmazza, a készítmény orálisan (szájon át) is beadható. Az oligopeptid elõnyösen szintetikus eredetû (pl. Merrifield-szintézissel készül). Ha a készítményt parenterálisan adják be az alanynak, a készítmény tipikusan lényegében oligopeptidbõl és PBS-bõl áll (pl. az alany testtömegéhez viszonyítva körülbelül 0,25 mg/kg és 10 mg/kg mennyiségben). Úgy véljük, hogy a találmány olyan esetekben alkalmazható, amikor az alany például akut veseelégtelenségen esik át, különösen amikor az alanynál tartós oliguria jelentkezik, és az alany testtömegéhez viszonyítva az óránkénti vizelettermelés nem több, mint 0,5 ml, és/vagy az alany szérum káliumszintje literenként több mint 6,5 mmol. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány tárgyát képezi olyan tisztított, szintetikus vagy izolált peptid vagy sójának beadása, amely AQGV-bõl (2. azonosító számú szekvencia) áll. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti készítmény alkalmazása valamely betegség, így például akut veseelégtelenség kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény vagy gyógyszer elõállítására. Az ábra rövid ismertetése Az 1. ábra a példák eredményeit mutatja; az A¹, B¹, C¹, D¹, E¹, F¹peptidekkel történõ kezelés után vagy kezelés nélkül (kontroll), különbözõ idõpontokban kapott BUN (karbamid) értékek kerültek feltüntetésre.
A találmány részletes ismertetése A leírás szerinti értelemben a „tisztított, szintetikus vagy izolált” peptid természetes vagy biotechnológiai 55 forrásból tisztított, vagy még elõnyösebben, a leírásban ismertetettek szerint szintetizált. A leírás szerinti értelemben a „készítmény” olyan kémiai vegyületet jelent, ami az oligopeptidet tartalmazza, vagy abból áll. Az oligopeptid elõnyösen a ké60 szítményhez való hozzáadása elõtt kerül izolálásra. 2
1
HU 004 766 T2
A találmány egyik megvalósítási módjában korábban ismertetett elõnyös vegyület lehet például NT A Q G V CT, ahol az N¹terminálison lévõ NT az alábbi csoportból kerül kiválasztása: H–, CH3–, valamely acilcsoport vagy valamely általános védõcsoport; és a C¹terminálison lévõ CT az alábbi csoportból kerül kiválasztásra: kisméretû (pl. 1–5 aminosav hosszúságú) peptidek, –OH, –OR1, –NH2, –NHR1, –NR1 R2, vagy –N(CH2)1–6 NR1 R2, ahol R1 és R2 – ha jelen vannak – egymástól függetlenül az alábbiak közül kerülnek kiválasztásra: H, alkil, aril, ar(alkil), és ahol R1 és R2 ciklikusan egymáshoz lehetnek kapcsolva. A leírás szerinti értelemben az „alkil” elõnyösen olyan telített, elágazó láncú vagy egyenes láncú szénhidrogént jelent, amely egytõl hatig terjedõ számú szénatomot tartalmaz, pl. metilt, etilt vagy izopentilt. A leírás szerinti értelemben az „aril” olyan aromás szénhidrogén-csoportot jelent, amely elõnyösen 6¹tól 10¹ig terjedõ számú szénatomból áll, így például fenilt vagy naftilt. A leírás szerinti értelemben az „(ar)alkil” olyan (alifás és aromás részleteket is tartalmazó) aréncsoportot jelent, amely elõnyösen 7¹tõl 13¹ig terjedõ számú szénatomból áll, így például etil-benzilt, n¹propil-benzilt vagy izobutil-benzilt. A leírás szerinti értelemben az „oligopeptid” olyan peptideket jelent, amelyek 3¹tól 12¹ig terjedõ számú, peptidkötéssel egymáshoz kapcsolt aminosavból állnak. Az oligopeptidekkel egyenértékûnek számítanak az olyan vegyületek, amelyeknek valamely oligopeptidben alkalmazott konkrét aminosavakkal azonos vagy egyenértékû oldalláncai vannak, és ugyanabban a sorrendben vannak elrendezve, mint a peptidekben, de nem peptidkötések kapcsolják össze õket, hanem pl. izoszterikus kötések, mint amilyen például a ketoizosztér, a hidroxi-izosztér, a diketo-izosztér vagy a keto-difluoro-metilén-izosztér. A „készítmény” magában foglalja továbbá például az oligopeptid egy elfogadható sóját vagy valamely jelölt oligopeptidet is. A leírás szerinti értelemben az „elfogadható só” olyan sókat jelent, amelyek megtartják az oligopeptid vagy azzal egyenértékû vegyület kívánt aktivitását, de elõnyösen nem befolyásolják károsan az oligopeptid vagy ama rendszer egy másik komponensének aktivitását, amelyben az oligopeptid alkalmazásra kerül. Ilyen sók például a szervetlen savakkal, például sósavval, szénsavval, kénsavval, foszforsavval, salétromsavval és hasonlókkal képzett savaddíciós sók. A sók elõállíthatók emellett szerves savakkal is, így például ecetsavval, oxálsavval, borkõsavval, borostyánkõsavval, malinsavval, fumársavval, glükonsavval, citromsavval, almasavval, aszkorbinsavval, benzoesavval, csersavval, pamoesavval, alginsavval, poliglutaminsavval és hasonlókkal. A sók elõállíthatók polivalens fémkationokkal, így például cinkkel, kalciummal, bizmuttal, báriummal, magnéziummal, alumíniummal, rézzel, kobalttal, nikkellel és hasonlókkal, vagy N,N’-dibenzil-etilén-diaminnal vagy etilén-diaminnal képzett szerves kationokkal, vagy ezek kombinációval (pl. cinktannát¹só) is.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
A találmány tárgyát képezi továbbá valamely oligopeptid tartós oliguria kezelésére vagy akut veseelégtelenség „tabe” kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállításban történõ alkalmazása, amely oligopeptid aktivitása csökkenti az alany szérumában a karbamid koncentrációját – ahogy az egérben végzett reperfúziós teszttel meghatározható –, és ahol az oligopeptid AQGV (2. azonosító számú szekvencia) vagy MTRV (1. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú. A gyógyászati készítmény elõállításában alkalmazandó oligopeptid elõnyösen AQGV-bõl (2. azonosító számú szekvencia) áll. Az ilyen gyógyászati készítmények beadhatók az alanynak parenterálisan vagy orálisan (szájon át) is. Az ilyen gyógyászati készítmények lényegében oligopeptidbõl és PBS-bõl állhat. Az oligopeptid elõnyösen szintetikus eredetû. A megfelelõ kezelés során például intravénásan adjuk be a gyógyászati készítményekben lévõ oligopeptidet az alany testtömegéhez viszonyítva körülbelül 0,25 mg/kg és körülbelül 10 mg/kg közötti mennyiségben. Hasznos lehet, ha a gyógyászati készítmények lényegében egytõl háromig terjedõ számú különbözõ oligopeptidbõl állnak. Az ilyen kezelés különösen akkor elõnyös, ha az alany például akut veseelégtelenségen esik át, például amikor az alany veséi az alany testtömegéhez viszonyítva óránkénti nem termelnek többet 0,5 ml vizeletnél, és/vagy az alany szérum literenkénti káliumszintje több mint 6,5 mmol. Az így kifejlesztett kémiai entitás in vivo, szisztémás úton, topikusan vagy lokálisan is beadható vagy bevihetõ. A peptid vagy módosulata vagy származéka beadható mint olyan, vagy olyan gyógyszerészetileg elfogadható sav- vagy lúgaddíciós só formájában, amely valamely szervetlen savval (például sósavval, brómsavval, perklórsavval, salétromsavval, tiociánsavval, kénsavval vagy foszforsavval), vagy szerves savval (például hangyasavval, ecetsavval, propionsavval, glikolsavval, tejsavval, piroszõlõsavval, oxálsavval, malonsavval, borostyánkõsavval, maleinsavval vagy fumársavval) reagálva képzõdik, vagy valamely szervetlen bázissal (például nátrium-hidroxiddal, ammónium-hidroxiddal, kálium-hidroxiddal) vagy valamely szerves bázissal (például mono¹, di¹, trialkil- és arilaminokkal vagy szubsztituált etanol-aminokkal) reagálva képzõdik. Valamely kiválasztott peptid és a származék entitások bármelyike cukrokhoz, lipidekhez, más polipeptidekhez, nukleinsavakhoz vagy PNA-hoz is konjugálható, és konjugátum formájában mûködhet in situ, vagy lokálisan szabadulhat fel, miután elért valamely célszövetet vagy célszervet. Az általános képlet szerinti vegyületek az ilyen vegyületeknél megszokott módon állíthatók elõ. E célra, megfelelõ N¹alfa-védettséggel (és ha reaktív oldalláncok vannak jelen, akkor oldallánc-védettséggel is) rendelkezõ aminosavszármazékokat vagy peptideket aktiválunk, majd oldatban vagy szilárd hordozón megfelelõ karboxil-védettséggel rendelkezõ aminosav- vagy peptidszármazékokhoz kapcsoljuk õket. Az alfa-amino funkciós csoportok levédése általában uretán funkciós
1
HU 004 766 T2
csoportokkal, így például savlabilis tercier butil-oxi-karbonsav („Boc”) csoporttal, benzil-karbonil („Z”) csoporttal vagy szubsztituált analógokkal, vagy a lúglabilis 9¹fluorenil-metil-oxi-karbonil („Fmoc”) csoporttal történik. A Z¹csoport katalitikus hidrogénezéssel is eltávolítható. További megfelelõ védõcsoportok az Nps, a Bmv, a Bpoc, az Aloc, az MSC stb. Az amino-védõcsoportokról jó összefoglalást nyújt a „The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology” 3. kötete [szerk.: E. Gross és J. Meienhofer (Academic Press, New York, 1981)]. A karboxicsoportok levédése történhet észterképzéssel, például lúglabilis észterekkel, így például metillel vagy etillel, savlabilis észterekkel, így például terc-butillal vagy szubsztituált benzil-észterekkel vagy hidrogenolitikusan. Az oldalláncok, így például a lizin, valamint a glutaminsav vagy az aszparaginsav funkciós csoportjainak levédése is történhet a fent említett csoportokkal. A tiolcsoport levédése, és bár nem mindig szükséges, a guanidino¹, alkohol- és imidazolcsoportok levédése sokféle reagens alkalmazásával történhet, így például azokkal, amelyeket a „The Peptides, Analaysis, Synthesis, Biology” (uott.) vagy a Pure and Applied Chemistry, 59(3), 331–344 (1987) ismertet. A megfelelõen védett aminosavak vagy peptidek karboxicsoportjának aktiválása történhet azidos, kevert anhidrides, aktív észteres vagy karbodiimides eljárással, és különösen katalitikus vagy racemizációt gátló vegyületekkel, például 1¹N¹N-hidroxi-benzo-triazollal, N¹hidroxi-szukcinimiddel, 3¹hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzo-triazinnal, vagy N¹hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboxiimiddel. Ezenkívül foszforalapú savak anhidridjei is alkalmazhatók. Ld. pl. „The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology”, supra, és Pure and Applied Chemistry, 59(3), 331–344 (1987). A vegyületeket ezenkívül a Merrifield-féle szilárd fázisú eljárással is elõ lehet állítani. Különféle szilárd hordozók és stratégiák ismertek, lásd pl. Bárány és Merrifield [in: „The Peptides, Analysis. Synthesis, Biology, 2. kötet, szerk. E. Gross és J. Meienhofer (Acad. Press, New York, 1980)], Kneib-Cordonier és Mullen, Int. J. Peptide Protein Res. 30, 705–739 (1987) és Fields és Noble, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161–124 (1990). Az olyan vegyületek szintézise, ahol a peptidkötést egy izosztér kötés helyettesíti, általánosságban történhet az elõzõekben ismertetett védõcsoportok alkalmazásával vagy aktiválási procedúrákkal. A módosított izosztérek kötések szintézisére szolgáló procedúrákat – pl. a –CH2–NH– izosztér kötésre vagy a –CO–CH2– izosztér kötésre – a szakirodalom ismerteti. A védõcsoportok eltávolítása és szilárd fázisú peptidszintézis esetén a szilárd hordozóról való lehasítás az adott védõcsoportok és a szilárd hordozóhoz rögzítõ kapcsoló jellegétõl függõen különféle módokon történhet. A védelem eltávolítása savas körülmények között és gyökfogók jelenlétében történik. Ld. pl. a „Peptides, Analysis, Synthesis, Biology” címû sorozat (supra) 3., 5. és 9. kötetét. További lehetõség enzimeket alkalmazni az ilyen vegyületek szintézise során; összefoglalóként lásd H. D. Jakubke (in: „The Peptides, Analysis, Synthesis,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
Biology”, 9. kötet, szerk.: S. Udenfriend és J. Meienhofer (Academic Press, New York, 1987)]. Bár esetleg gazdasági szempontból nemkívánatos, a találmány szerinti oligopeptidek rekombináns DNSeljárásokkal is elõállíthatók. Az ilyen eljárások során elõállítjuk a kívánt oligopeptidet, mégpedig úgy, hogy expresszáltatjuk azt a rekombináns polinukleotidszekvenciát, ami valamely megfelelõ mikroorganizmusban, mint gazdában egyet vagy többet kódol a kérdéses oligopeptidek közül. Az eljárás általában úgy történik, hogy egy klónozóvektorba (pl. valamely gazdasejtben replikálódni képes plazmidba, fág-DNS¹be vagy más DNS-szekvenciába) bejuttatunk egy olyan DNS-szekvenciát, ami az adott oligopeptidet vagy oligopeptideket kódolja, majd megfelelõ eukarióta vagy prokarióta gazdasejtbe visszük be a klónozóvektort és végül kultúrázzuk az így transzformált gazdasejtet. Ha eukarióta gazdasejtet használunk, a vegyület valamely glikoprotein részletet is tartalmazhat. Valamely származék vagy analóg is elõállítható például úgy, hogy valamely L¹aminosavat D¹aminosavval helyettesítünk. Ez a szubsztitúció, amely a természetben elõ nem forduló peptidet eredményez, javíthatja az aminosavszekvencia valamely tulajdonságát. Hasznos lehet például elõállítani az összes D¹aminosavat ismert aktivitású, retro-inverz formájú peptidszekvenciáját, ami lehetõvé teszi az aktivitás megõrzését és a féléletidõ-értékek növekedését. Egy eredeti aminosavszekvencia nagyszámú pozicionális változatának elõállításával és konkrét aktivitásra való szûrésével ilyen D¹aminosavakat tartalmazó, javított peptidszármazékok tervezhetõk további javított jellemzõkkel. Technikában jártas szakember képes arra, hogy valamely aminosavszekvenciával analóg vegyületeket állítson elõ. Ez történhet például valamely peptidkönyvtár szûrésével. Az ilyen analóg a szekvenciával – jellegében és nem feltétlenül mértékében – lényegében azonos funkcionális jellemzõkkel bír. A peptidek vagy analógok emellett lehetnek cirkularizáltak is – például úgy, hogy (terminális) ciszteinekkel látjuk el õket –, vagy dimerizáltak vagy multimerizáltak – például úgy, hogy lizinhez vagy ciszteinhez vagy olyan más oldalláncokat tartalmazó vegyületekhez kapcsoljuk õket, amelyek lehetõvé teszik az összekapcsolódást vagy multimerizálódást –, vagy lehetnek tandem vagy ismétlõdõ konfigurációban, konjugáltan vagy más módon technikában ismert hordozókhoz kötötten is, hacsak egy labilis kötéssel is, ami lehetõvé teszi a disszociációt. Az oligopeptidek fent ismertetett szintetikus változatai és a bomlástermékek funkcionális analógjai vagy származékai a BUN-koncentrációjának csökkentésére és betegség kezelésére szolgáló eljárásokban történõ alkalmazásra a találmány tárgyát képezik. A leírás szerinti értelemben a „gyógyászati készítmény” magában foglalja mind a találmány szerinti aktív készítményt önmagában, mind pedig olyan készítményt, amely a találmány szerinti készítményt valamely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval, hígí-
1
HU 004 766 T2
tószerrel vagy excipienssel együtt tartalmazza. A részletes leírásban ismertetett valamely oligopeptid elfogadható hígítószerei például a fiziológiás sóoldatok vagy a sós foszfátpufferoldatok. A találmány egy megvalósítási módjában valamely állatnak vagy embernek hatásos koncentrációban, például intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális úton beadunk egy szignálmolekulát. A beadás egy másik módja során a szervek vagy szövetek – in vivo vagy ex vivo – perfundáltatásra kerülnek egy olyan perfúziós folyadékkal, ami valamely találmány szerinti szignálmolekulát tartalmaz. A beadás történhet egyetlen dózisban, különféle dózisok nem folytonos sorozatában vagy annyi ideig folyamatosan, ami elegendõ a génexpresszió érdemi modulálásához. Folyamatos adagolás esetén az adagolás idõtartama számos olyan tényezõtõl függõen változhat, amelyeket technikában jártas szakember könnyedén értékelni tud. Az aktív molekula beadási dózisa meglehetõsen széles tartományban változtatható. Valamely beadható aktív molekula koncentrációját alulról a hatásosság korlátozza, felülrõl pedig a vegyület oldhatósága. Adott beteg számára az optimális dózist vagy dózisokat a bevont orvosnak vagy egészségügyi specialistának kell, illetve lehet meghatározni. Az aktív molekula beadható közvetlenül valamely megfelelõ hordozóban, így például sós foszfátpufferoldatban (PBS) vagy alkoholban vagy DMSO-ban elkészített oldatokban. A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint azonban az aktív molekulát valamely készítmény-bejuttató rendszer alkalmazásával egyetlen dózis bejuttatásával kell beadni. A megfelelõ készítmény-bejuttató rendszerek gyógyszerészetileg inaktívak vagy legalább tolerálhatók. Elõnyösen nem lehetnek immunogének és nem okozhatnak gyulladásos reakciókat sem, és lehetõvé kell tenniük az aktív molekula felszabadulását, hogy ezáltal a kívánt ideig fenntartsák a hatásos szintet. A technikában alternatívák is ismertek, amelyek megfelelnek a tartós felszabadulás céljára és amelyek a találmány oltalmi körébe tartozónak számítanak. A megfelelõ bejuttatóeszközök közé tartoznak többek között az alábbiak: mikrokapszulák vagy mikrogömbök, liposzómák és más lipidalapú felszabadító rendszerek; viszkózus insztillátumok; felszívódó és/vagy biológiailag lebontható mechanikai gátak és implantátumok; és polimeres bejuttatóanyagok, így például polietilén-oxid/polipropilén-oxid blokk-kopolimerek, poliészterek, keresztkötött polivinil-alkoholok, polianhidridek, polimetakrilát és polimetakrilamid hidrogélek, anionos szénhidrát polimerek stb. A bejuttatórendszerek a technikában jól ismertek. Az aktív molekula felszabadulását megvalósító egyik formula olyan, injekciózható mikrokapszulákat vagy mikrogömböket tartalmaz, amelyek valamely biológiailag lebontható polimerbõl, például poli(dl-laktid)ból, poli(dl-laktid-koglikozid)-ból, polikaprolaktonból, poliglikolidból, politejsav-koglokolidból, poli(hidroxi-vajsav)-ból, poliészterekbõl vagy poliacetálokból készülnek. A körülbelül 50 és körülbelül 500 mikrométer közötti átmérõjû mikrokapszulákat vagy mikrogömböket
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
2
tartalmazó injekciózható rendszerek további elõnyöket kínálnak más bejuttató rendszerekkel szemben. Például általában kevesebb aktív molekulát alkalmaznak és kisegítõ egészségügyi dolgozó is beadhatja. Az ilyen rendszerek emellett a mikrokapszulák vagy mikrogömbök méretének, valamint a készítménnyel való feltöltésnek és a beadott dózisnak a megfelelõ megválasztása révén inherens rugalmassággal rendelkeznek a különféle készítmények felszabadulási idõtartamának és sebességének megtervezése tekintetében. Emellett gamma-besugárzással is sikeresen sterilizálhatók. A mikrokapszulák és mikrogömbök megtervezése, elõállítása és alkalmazása technikában jártas szakember számára nem jelent nehézséget, és e pontok tekintetében részletes információ a szakirodalomban található. A biológiailag lebontható polimerek (úgy például laktid, glokolid és kaprolakton polimerek) mikrokapszuláktól és mikrogömböktõl eltérõ formulákban, így pl. az aktív molekulát tartalmazó, fenti polimerekbõl elõre elkészített filmeken és fújandó filmeken is alkalmazhatók a találmány szerint. Az aktív molekulát tartalmazó rostok vagy filamentumok is a találmány tárgykörébe tartozónak számítanak. A találmány szerinti altív molekula egyetlen dózisos bejuttatására egy további igen megfelelõ formula liposzómákat foglal magában. A célzott készítmény-bejuttatáshoz és a hosszabb tartózkodási idõ eléréséhez jól ismert módszer az aktív molekula liposzómákba vagy soklemezes vezikulumokba történõ bekapszulázása. A készítménnyel feltöltött liposzómák elõállítása és alkalmazása technikában jártas szakember számára nem jelent nehézséget és a szakirodalomban jól dokumentált. Valamely találmány szerinti aktív molekula egyetlen dózisos bejuttatásához további megfelelõ megközelítés a viszkózus insztillátumok (csepegtetéses termék) alkalmazása. Ennél a módszernél nagy molekulatömegû hordozókat alkalmazunk az aktív molekulával összekeverve, ami nagy viszkozitású oldatot kialakító szerkezetet hoz létre. A megfelelõ nagy molekulatömegû hordozók közé tartoznak többek között az alábbiak: dextránok és ciklodextránok; hidrogélek; (keresztkötött) viszkózus anyagok, ezen belül (keresztkötött) viszkoelasztikumok; karboxi-metil-cellulóz; hialuronsav; és kondroitin-szulfát. A készítménnyel feltöltött viszkózus insztillátumok elõállítása technikában jártas szakember számára jól ismert. Egy még további megközelítés szerint az aktív molekula beadható felszívódó mechanikai gátakkal, így például oxidált, regenerált cellulózzal kombináltan is. Az aktív molekula kovalensen vagy nem kovalensen (pl. ionosan) kapcsolódhat a hordozóhoz, vagy lehet egyszerûen abban diszpergálva is. A találmányt a továbbiakban szemléltetõ jellegû példák segítségével világítjuk meg.
Példák Egy kettõs vak állatkísérletben hat oligopeptidnél 60 [azaz A: {LAGV (4. azonosító számú szekvencia)}. B: 5
1
HU 004 766 T2
{AQGV (2. azonosító számú szekvencia)}, C: {LAG}, D: {AQG}, E: {MTR}, és F: {MTRV (1. azonosító számú szekvencia)}] – amelyek közül az A¹, C¹, D¹ és E¹peptid nem képezi a találmány tárgyát – teszteltünk és hasonlítottunk össze PBS-sel (kontroll) a peptidek azon relatív képességét, hogy elõsegítik¹e a felépülést egérben végzett veseischaemia reperfúziós tesztben. A teszt során érzéstelenítettük az egereket, majd mindegyikbõl eltávolítottuk az egyik vesét. A másik vesét 25 percre elkötöttük, majd hagytuk, hogy megemelkedjen a szérum karbamidszintje. Az elkötés elõtt és után is harminc (30) különbözõ egérnek külön-külön beadtuk a peptideket (5 mg oligopeptid/testtömeg¹kg, intravénás beadás), amelyet követõen minden oligopeptidnél meghatároztuk az egerek halálozási arányát, valamint
2
a két óra, 24 óra és 72 óra után meghatároztuk a BUNkoncentrációkat. Az eredményeket az 1. ábrán, illetve az alábbiakban mutatjuk be. Inhalálásos érzéstelenítés mellett artériájával és 5 vénájával együtt izoláltuk a bal vesét és mikroérfogóval 25 percre elzártuk. A beavatkozás során az állatokat fûtõsávra helyeztük, hogy testhõmérsékletüket 37 °C¹on tartsuk. A fogó behelyezése elõtt öt perccel, valamint a fogó eltávolítása után 5 perccel intravéná10 san, 0,1 ml steril sóoldatban feloldva 5 mg/kg peptidet adtunk be. A bal vese reperfúziója után a jobb vesét eltávolítottuk. A vesemûködést úgy vizsgáltuk, hogy a fogó felhelyezése elõtt, majd a reperfúzió után 2, 24 és 72 órával megmértük a vérben lévõ karbamid-nitro15 gént.
Eredmények Halálozási arány 72 órával a reperfúzió után. PBS
A (LAGV)
B (AQGV)
C (LAG)
D (AQG)
E (MTR)
F (MTRV)
6/10
6/10
0/10
4/10
4/10
4/10
2/10
*P<(vs PBS)
NS
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
*2×2 Khí-négyzet teszt, df=1
Az A¹peptid volt az elsõ peptid, amit a veseischaemiás reperfúziós tesztben beadtunk. A kísérletet végsõ munkatársak az A¹peptiddel való munka folyamán tanulási folyamaton mentek keresztül. A peptid véna cava inferiorba történõ beadása során egyes állatoknál mérsékelt vérveszteség jelentkezett az injekció helyén, míg más állatoknál nem merült fel ilyen. Az állatokat vigyázatlanságból ivóvíz biztosítása nélkül helyezték vissza a ketrecekbe a beavatkozást követõ elsõ éjszakára. Ugyancsak tévedésbõl a 72 óránál leölni tervezett állatokat a reperfúzió után 48 órával ölték le. A B¹, C¹, D¹, E¹ és F¹peptidekkel végzett kísérletek során a fenti problémák egyike sem merült fel. Összességében úgy találtuk, hogy az A¹peptiddel kapott eredmények nem lehetnek megbízhatóak, és hogy az A¹peptidet újra kell tesztelni.
Ahogy az látható, az MTRV (1. azonosító számú szekvencia) és különösen az AQGV (2. azonosító számú szekvencia) oligopeptid sokkal jobban teljesített a 30 túlélés tekintetében is (a PBS¹es kontrollcsoporttal összehasonlítva jelentõs mértékben csökkent a halálozási arány) és a BUN-koncentrációt is jobban csökkentette, mint a kontrollcsoport (PBS) vagy az egyéb oligopeptidekkel kezelt csoport, vagyis több egér élt túl és a 35 szérum karbamidszintje is jóval alacsonyabb volt, mint a másik csoportokban. A LAG, AQG és MTR oligopeptid azonban, bár nem voltak hatással a BUN-koncentrációra, a PBS¹es kontrollal összehasonlítva jelentõsen csökkentették a halálozási arányt. 40
SZEKVENCIALISTA <110> Khan, Nisar A Benner, Robbert <120> Compositions Capable of Reducing Elevated Blood Urea Concentration <130> 3077–6420PC <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence
6
1
HU 004 766 T2
2
<220> <223> Szintetizált peptid <400> 1
Met Thr Arg Val 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Szintetizált peptid <400> 2
Ala Gln Gly Val 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Szintetizált peptid <400> 3
Leu Gln Gly Val 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Szintetizált peptid <400> 4
Leu Ala Gly Val 1
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. MTRV (1. azonosító számú szekvencia) vagy AQGV (2. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú oligopeptid, vagy ezek bármelyikének elfogadható sója alkalmazása tartós oliguria kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 2. MTRV (1. azonosító számú szekvencia) vagy AQGV (2. azonosító számú szekvencia) szekvenciájú
oligopeptid, vagy ezek bármelyikének elfogadható sója alkalmazása akut veseelégtelenség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 55 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oligopeptid AQGV-bõl (2. azonosító számú szekvencia) áll. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer alanynak parenterálisan történõ 60 beadásra formulázott. 7
1
HU 004 766 T2
5. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer alanynak orálisan történõ beadásra formulázott. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer lényegében oligopeptidbõl és PBS-bõl áll. 7. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az oligopeptid szintetikus eredetû. 8. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az oligopeptid intravénás beadásra szolgál az alany testtömegéhez viszonyítva körülbelül
2
0,25 mg/kg körülbelül 10 mg/kg közötti mennyiségben. 9. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a tartós oliguriát vagy akut veseelégtelen5 séget az jellemzi, hogy a szérum káliumszintje 6,5 mmol/l feletti. 10. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a tartós oliguriát vagy akut veseelégtelenséget az jellemzi, hogy az óránkénti vizelettermelés 10 nem haladja meg a 0,5 ml/kg¹ot egy alany testtömegéhez viszonyítva.
8
HU 004 766 T2 Int. Cl.: A61K 38/06
9
HU 004 766 T2 Int. Cl.: A61K 38/06
10
HU 004 766 T2 Int. Cl.: A61K 38/06
11
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
