!HU000006499T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 006 499
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 786256 (22) A bejelentés napja: 2004. 08. 04. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040786256 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1651668 A2 2005. 02. 17. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1651668 B1 2009. 07. 15.
(51) Int. Cl.: C07K 14/47 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05014638 PCT/FR 04/002081
(30) Elsõbbségi adatok: 0309697 2003. 08. 06.
(73) Jogosultak: Les Laboratoires Servier, 92415 Courbevoie Cedex (FR); Hybrigenics, 75014 Paris (FR)
FR
(72) Feltalálók: GENESTE, Olivier, F-92500 Rueil-Malmaison (FR); HICKMAN, John, F-75017 Paris (FR); BENNETT, Richard, F-75015 Paris (FR); RAIN, Jean-Christophe, F-95120 Ermont (FR)
HU 006 499 T2
(54)
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
BCL-2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel kölcsönható új peptid
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 006 499 T2
A találmány tárgyát képezi új peptid, amely kölcsönhatást mutat a Bcl¹XL és/vagy BcI¹2 és/vagy Bcl¹W proteinekkel, valamint szûrési eljárások, amelyek lehetõvé teszik ezen kölcsönhatást módosító molekulák azonosítását. A biológiai folyamatok többségében protein-protein kölcsönhatások vesznek részt. A proteomika egyik célkitûzése az ilyen kölcsönhatások feltérképezése. Mivel részt vesznek a szignáltranszdukciós mechanizmusok többségében, az ilyen kölcsönhatások a gyógyszerfejlesztések elsõdleges célpontjai. Számos eljárás létezik, amely lehetõvé teszi protein-protein kölcsönhatások azonosítását. A legelterjedtebbek egyike a kettõs hibrid rendszer, amelyet eredetileg Fields és munkatársai fejlesztettek ki és ismertettek (US 5 283 173; US 5 468 614; és 5 667 973 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások). Ez a rendszer alapvetõen két rekombináns protein közötti in vitro tesztbõl áll. Az egyik protein, amelyet „csali” proteinnek nevezünk, DNS-kötõ doménhoz („DNA binding domain”, BD) fuzionált kiméra protein, amely képes 5’¹irányban riportergén fölé kötõdni. A szokásosan alkalmazott kötõdoménok a Gal4 vagy E. coli LexA riportergének kötõdoménjai. A második protein szintén kiméra protein, közismert néven „zsákmány” protein, amely aktivációs domént („activation domain”, AD) tartalmaz, és amely általában Gal4 eredetû. Az ilyen hagyományos eljárásoknak azonban megvannak a korlátai. Jól ismert például, hogy az ilyen szûrõeljárások téves pozitív és téves negatív eredményekhez vezethetnek, és hogy a kapott eredmények biokémiai megerõsítést igényelnek. Téves pozitív és téves negatív eredményeket minimalizálni képes, hatékonyabb eljárást ismertet a WO9942612 számú nemzetközi közzétételi irat, amely eljárás szerint „csali” és „zsákmány” proteineket tartalmazó, haploid rekombináns pékélesztõt alkalmaznak. Ez a rendszer sokkal nagyobb számú „zsákmány” detektálását teszi lehetõvé egyetlen „csali” alkalmazásával, precízebb, reprodukálhatóbb és érzékenyebb módon, mint az ezen a területen alkalmazott más, hagyományos eljárások. Az apoptózis a sejthalál egy folyamata, amely többsejtûekben kulcsszerepet tölt be. Valójában a sejthalál két formája létezik, a nekrózis és az apoptózis. Nekrózist szöveti sérüléskor találunk: a sejtek felpuffadnak, ez a sejttartalom kiszabadulásához, majd a sejt líziséhez vezet, ami a környezõ szövetek gyulladását okozza. Ezzel szemben az apoptózis programozott és szabályozott élettani folyamat, amelynek a jelentõségét nem szabad lebecsülni, mivel naponta körülbelül 109 sejtünk pusztul el e mechanizmus révén. Számos kórkép kapcsolható sejtek szaporodása, túlélése és halála közötti egyensúly szabályozásának a felborulásához. Ilyenek például az autoimmun betegségek, bizonyos neurológiai betegségek és a rákok. Adott sejt életben tartásához vagy halálának programozásához proteinek legalább tíz különbözõ család-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
jára van szükség, amelyek közül a Bcl¹2 család fõszerepet játszik. Ez a család legalább húsz proteint tartalmaz, amelyek közül a Bcl-2, Bcl¹XL és BclW proteinek antiapoptotikus proteinek, amelyek a sejt túlélésének kedveznek, szemben a Bax, Bak és Bid proteinekkel, amelyek proapoptotikus tulajdonságúak. Az apoptózis során úgy tûnik, hogy a Bcl¹2 család tagjai úgy módosítják kölcsönhatásukat partnereikkel, hogy visszafordíthatatlan változásokat indukálnak a sejtben, amelyek sejthalálhoz vezetnek. Ennek megfelelõen igény mutatkozik olyan molekulák azonosítására, amelyek képesek ezeket a kölcsönhatásokat módosítani, apoptózis szabályozatlanságával összefüggõ kórképek, például autoimmun betegségek, bizonyos neurodegeneratív betegségek és rákok esetében hatékony, valós gyógyszerjelöltek elõállítása érdekében. Új peptidet azonosítottunk, amely kölcsönhatást mutat a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, közelebbrõl a Bcl-2, Bcl¹XL és Bcl¹W proteinekkel. Ez a 22 aminosavat tartalmazó peptid pontosan megfelel a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, közelebbrõl a Bcl-2, Bcl¹XL és Bcl¹W proteinekkel kölcsönhatást mutató doménnak, és „BH3” motívumra jellemzõ szerkezet kritériumait mutatja, amely homo- vagy heterodimerek kialakulását lehetõvé tevõ kölcsönhatási domén. A peptidet kis mérete ideális jelöltté teszi olyan teszt kidolgozására, amely lehetõvé teszi a fenti proteinek közötti kölcsönhatás módosítására képes molekulák nagy hatékonyságú szûrését. A szakirodalom protein-protein kölcsönhatások modulátorainak szûrésére számos tesztet ismertet, azonban érzékenység és nagy teljesítõképességû („high throughput”) formátumban történõ kivitelezhetõség tekintetében ezek gyakran korlátozottan alkalmazhatók. A szokásosan alkalmazott eljárások összetett (komplex) eszközök alkalmazását igénylik (fúziós proteinek, rekombináns proteinek közötti kölcsönhatások…), amelyek nem kompatibilisek nagy teljesítõképességû szûréssel. Gyakran járnak erõs háttérzajjal, és kvantitatív szempontból kevéssé megbízhatók: szûk leolvasóablakot biztosítanak, és nem teszik lehetõvé a vizsgált molekulák optimális szûrését. Ezzel szemben kidolgoztunk egy nagy hatékonyságú szûrõvizsgálatot, amely fluoreszcenciapolarizáción alapul [Owicki J. C. és munkatársai: Journal of Biomolecular Screening 5, 297–306 (2000)]. Ez az eljárás lehetõvé teszi például fluoroforral jelölt ligandum és receptor közötti kölcsönhatás mérését. Az eljárás elve tartalmazza a receptorához kötõdött ligandum által kibocsátott fluoreszcenciapolarizáció emelkedésének a mérését, összehasonlítva a szabad ligandum által kibocsátottal. A szabad ligandum fluoreszcenciapolarizációja molekulatömegétõl függ, és emelkedik, ha a ligandum molekulatömege növekszik. Ennek megfelelõen, amennyiben a tesztet nagy molekulatömegû ligandummal végezzük, amely erõs fluoreszcenciapolarizációt mutat, nehéz megbízhatóan értékelni a szabad és kötõdött ligandum fluoreszcenciapolarizációja kö-
1
HU 006 499 T2
zötti eltérést. Ezzel szemben csökkentett méretû ligandum alkalmazása lehetõvé teszi az eltérés hangsúlyozását, és következésképpen a vizsgálat pontosságának a növelését. Ennek megfelelõen lehetõvé válik adott molekula valóságos aktivitásának a jobb értékelése és nagy teljesítõképességû szûrések végzése. Közelebbrõl, a leírásban ismertetünk egy, a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó peptidet, valamint ismertetjük annak funkcionális variánsait. A leírásban „funkcionális variánsok” kifejezés alatt a SEQ ID NO 1 szerinti peptid minden fragmensét és pontmutánsát értjük, amelyek a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, közelebbrõl a Bcl¹2 és/vagy Bcl¹XL és/vagy Bcl¹W proteinekkel képesek kölcsönhatásba lépni. Ezt a peptidet kettõs hibrid eljárással azonosítottuk, ahol a Bcl¹XL, Bcl¹W és Bcl¹2 proteineket „csaliként” alkalmaztuk. Három humán cDNS-bankot szûrtünk (placenta, agy és CEMC7 sejtvonal), és ez lehetõvé tette a HC21ORF80 szekvencia (nyilvántartási száma: NM_015227) részleges szekvenciáinak megfelelõ „zsákmány” fragmensek azonosítását. Ezt követõen kettõs hibrid eljárással kísérletesen meghatároztuk, hogy a szekvencia egyik fragmense szükséges és elégséges ahhoz, hogy kölcsönhatást mutasson a Bcl¹XL és/vagy Bcl¹2 és/vagy Bcl¹W proteinekkel, és megfelel a SEQ ID NO 1 szerinti, 22 aminosavat tartalmazó fragmensnek. A Bcl-2, Bcl¹W és Bcl¹XL proteinekkel való kölcsönhatást biokémiai eljárásokkal igazoltuk (koimmunprecipitálás, „GST pull-down”), és a peptid biológiai aktivitását sejtekbe történõ transzfektálással és/vagy mikroinjektálással erõsítettük meg, ahol kimutattuk, hogy apoptózist indukál. A leírásban ismertetünk továbbá a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciából, valamint a fentebb ismertetett funkcionális variánsokból kikövetkeztetett nukleinsavszekvenciákat. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi a SEQ ID NO 1 szerinti peptidet kódoló SEQ ID NO 2 szerinti nukleinsavszekvencia. A leírásban „nukleinsavszekvencia” kifejezés alatt természetes közegébõl izolált nukleinsavszekvenciát értünk. Közelebbrõl, izolált szekvenciákat jelent, amelyeket amplifikáltak és/vagy tisztítottak, és adott esetben molekuláris biológiai eljárással módosítottak. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns vektor. A leírásban „vektor” kifejezés alatt minden olyan típusú vektort értünk, amely lehetõvé teszi nukleinsavszekvencia gazdasejtbe történõ bejuttatását, és ott polipeptid expresszálását. A találmány szerinti rekombináns vektort jellemzi, hogy tartalmazza a találmány szerinti peptidek, közelebbrõl a SEQ ID NO 1 szerinti peptidek expresszálásához szükséges DNS-szekvenciákat. Ilyen vektorok lehetnek például bakteriális plazmidokból származtatott vektorok, bakteriofágok, élesztõk plazmidjai és kromoszómái, vírusok és mások.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
A találmány tárgyát képezik továbbá rekombináns vektorokkal transzformált gazdasejtek. Ezek a sejtek elõnyösen baktériumok vagy eukarióta sejtek. Lehetnek például Escherichia coli baktériumok, élesztõk, rovarsejtek vagy emlõssejtek. A találmány tárgyát képezi továbbá olyan ágensek szûrésére alkalmas eljárás, amely ágensek modulálni képesek a találmány szerinti peptideknek, közelebbrõl a SEQ ID NO 1 szerinti peptidnek a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, közelebbrõl a Bcl-2, Bcl¹W és Bcl¹XL proteinekkel való kölcsönhatását. A kölcsönhatásokat moduláló ágensek elõnyösen kémiai úton kerülnek szintetizálásra, vagy termékbankokból származnak. A találmány szerinti szûrési eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, találmány szerinti peptid elõállítását; b) inkubálást a vizsgálni kívánt vegyülettel; c) antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadását; és d) a fluoreszcenciapolarizáció mérését. A találmány tárgyát képezi közelebbrõl a peptid és adott antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatást gátolni képes molekulák szûrésére alkalmas eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, találmány szerinti peptid elõállítását; b) inkubálást a vizsgálni kívánt vegyülettel vagy anélkül; c) antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadását; d) a fluoreszcenciapolarizáció mérését a vizsgálni kívánt vegyülettel és anélkül; e) olyan molekulák szelektálását, amelyek esetében a vizsgálni kívánt vegyület jelenlétében megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása szignifikáns mértékben kisebb, mint a vizsgálni kívánt vegyület nélkül megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása. A találmány tárgyát képezi közelebbrõl a peptid és adott antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatást fokozni képes molekulák szûrésére alkalmas eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, találmány szerinti peptid elõállítása; b) inkubálás a vizsgálni kívánt vegyülettel vagy anélkül; c) antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadása; d) a fluoreszcenciapolarizáció mérése a vizsgálni kívánt vegyülettel és anélkül; e) olyan molekulák szelektálása, amelyek esetében a vizsgálni kívánt vegyület jelenlétében megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása szignifikáns mértékben nagyobb, mint a vizsgálni kívánt vegyület nélkül megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása. A fent ismertetett eljárások egyik elõnyös megvalósítási módja szerint a fluoreszcens jelölés lehet például
1
HU 006 499 T2
Oregon Green, Bodipy vagy fluoreszcein, vagy elõnyösebben fluoreszcein. A szûrési eljárásban alkalmazott, találmány szerinti peptid elõnyösen a SEQ ID NO 1 szerinti peptid. Elõnyösen a találmány szerinti eljárást a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, közelebbrõl a Bcl-2, Bcl¹W és Bcl¹XL proteinekkel végezzük. Következésképp, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti peptidek alkalmazása autoimmun betegségek, bizonyos neurológiai betegségek és rákok kezelésére alkalmas molekuláknak a találmány szerinti eljárásokkal történõ szûrése. Az ábrák ismertetése 1. ábra: „GST pull-down” GST-Bcl-XL+TBid kötõdés kompetitív gátlása a SEQ ID NO 1 szerinti peptiddel. 2. ábra: A SEQ ID NO 1 szerinti peptid Bcl¹XL iránt mutatott Kd értékének a meghatározása. 3. ábra: A SEQ ID NO 1 szerinti peptid Bcl¹W iránt mutatott Kd értékének a meghatározása. Az alábbi példák a korlátozás minden szándéka nélkül illusztrálják a találmányt.
2
át. Az egymással kölcsönhatásra képes „csalit” és „zsákmányt” tartalmazó, konjugált élesztõk szelektálását DO¹Leu-Trp-His közegben végeztük: a leucin és a triptofán hiánya lehetõvé tette olyan szelekciós nyomás 5 fenntartását, amely kizárólag a mindkét típusú plazmidot („csali”/„zsákmány”) tartalmazó élesztõk szaporodását tette lehetõvé; a hisztidin hiánya a közegben olyan konjugált élesztõk szelektálását tette lehetõvé, amelyek egymással kölcsönhatásra képes „csali” plazmidot és 10 „zsákmány” plazmidot tartalmaztak: ez a kölcsönhatás lehetõvé tette a hisztidin bioszintézisében szerepet játszó egyik enzimet kódoló HIS3 gén aktiválását.
1) „Csalik” és „zsákmányok” elõállítása a) Az alkalmazott „csalik” az alábbiak voltak: – C¹terminális végérõl deletált Bcl¹XL (1–209), LexA DNS-kötõ doménhoz fuzionáltatva, – C¹terminális végérõl deletált Bcl¹2 (1–211), LexA DNS-kötõdoménhoz fuzionáltatva. A „csalikat” Saccharomyces cerevisiae (CG1945 vagy L40DGal4) törzsekben expresszáltattuk, amelyeket 30 °C¹on, triptofántól mentes, szintetikus tápközegben (DO-Trp) elõtenyésztettünk 0,1–0,5 közötti OD600 nm értékig. Az elõtenyészet hígításának 50 ml¹ét (OD600 nm=0,006) inkubáltuk éjszakán át, 30 °C¹on. b) Gal4 transzkripciót aktiváló doménjához fuzionált cDNS-bankot expresszáló plazmidokat tartalmazó élesztõk gyûjteményét állítottuk elõ transzformálással, leucintól mentes tápközegen végzett szelektálást követõen. Ezeket az élesztõket adagokra osztottuk és –80 °C¹on tároltuk.
3) Pozitív klónok azonosítása A 2) lépés szerint szelektált egyik élesztõtelep „zsákmány” fragmenseit PCR-eljárással amplifikáltuk a telep nyers lizátumából, a „zsákmány” vektor alábbi, specifikus primerjei alkalmazásával: ABS1 5’¹GCTTTGGAATCACTACAGG¹3’ (SEQ ID 20 NO 3), ABS2 5’¹CACGATGCACGTTGAAGTG¹3’ (SEQ ID NO 4). A PCR-termékeket ezt követõen szekvenáltuk, és a kapott szekvenciákat adatbankokkal történõ összeha25 sonlítással azonosítottuk. A kapott pozitív klónok közül a körülbelül 300 aminosavat tartalmazó fragmensek voltak azonosíthatók a HC21ORF80 szekvencia (nyilvántartási száma: NM:015227) részleges szekvenciájaként. 30 4) A SEQ ID NO 1 szerinti peptid azonosítása A HC21ORF80 szekvencia kisebb fragmensein végzett, fentebb ismertetett 1), 2) és 3) lépések szerinti kettõs hibrid kísérletek lehetõvé tették egy 22 amino35 savból álló, kis peptid azonosítását, mely szükséges és elégséges ahhoz, hogy kölcsönhatást kapjunk a Bcl¹XL és/vagy Bcl¹W és/vagy Bcl¹2 proteinekkel: Asp-ThrArg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-GluVal-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg (SEQ ID NO 1). 40 2. példa: Az 1. példa szerinti peptid és a Bcl¹W és/vagy Bcl¹XL és/vagy Bcl¹2 proteinek közötti kölcsönhatás validálása 1) GST„pull-down” Az 1. példában kapott peptid, valamint a Bcl¹W 45 és/vagy Bcl¹XL és/vagy Bcl¹2 proteinek közötti kölcsönhatást oly módon validáltuk, hogy mértük egy „BH3” motívumú Bid protein, valamint a GST-Bcl¹XL, GST-Bcl¹W vagy GST-Bcl¹2 fúziós proteinek közötti 50 kölcsönhatás eltolódását.
2) Konjugálás A konjugálásnál a „csali”/„zsákmány” arány alkalmazott értéke 2 volt. Az 1a) lépésben kapott „élesztõ-csali” sejtek 50 OD600 nm egységnek megfelelõ mennyiségét elegyítettük az 1b) lépésben kapott „élesztõ-zsákmány” sejtekkel. Centrifugálást követõen az üledéket YPGlu közegben reszuszpendáltuk, YPGlu tenyésztõlemezekre szélesztettük, és 30 °C¹on inkubáltuk 4 óra 30 percen
a) Radioaktív jelölésû Bid protein szintézise A jelölt proteint TNT Quick Master (Promega) készlet alkalmazásával állítottuk elõ. Negyven ml TNT-ele55 gyet inkubáltunk 90 percen át, 30 °C¹on (20 mCi aktivitásnak megfelelõ) 35S-metioninnal (Amersham), Bid proteint kódoló plazmid-DNS 1 mg mennyiségével és annyi vízzel, ami a térfogatot 50 ml¹re egészítette ki. A radioaktív proteintermék fmol/ml értékét a protein60 ben jelen levõ metioninok számából számítottuk ki.
1. példa: A SEQ ID NO 1 szerinti peptid azonosítása Három humán eredetû cDNS-bankot szûrtünk (placenta, agy és CEMC7 sejtvonal) kettõs hibrid eljárással (Fields és mtsai.), élesztõn végzett konjugációs protokoll szerint [Legrain és munkatársai: Nature genetics 16, 277–282 (1997)].
15
4
1
HU 006 499 T2
b) GST „pull-down” Négy fmol radioaktív Bid proteint inkubáltunk 4 °C¹on, 3 órán át, 3 mg glutation-S-transzferáz-Bcl¹XL (GST-Bcl¹XL) fúziós proteinnel vagy glutation-S-transzferáz-Bcl¹2 (GST-Bcl¹2) fúziós proteinnel vagy glutationS-transzferáz-Bcl¹W (GST-Bcl¹W) fúziós proteinnel, vagy GST-vel önmagában, 300 ml kötõpufferben (142 mmol/l KCl, 5 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l HEPESpuffer, 0,5 mmol/l DTT, 1 mmol/l EDTA, proteáz gátlók, pH=7,4), amely 0,4% Triton X100 reagenst tartalmazott. „Glutation sepharose 4 fast flow” (Amersham) gyöngyöket mostunk háromszor kötõpufferben, és ebben a pufferben vettük fel úgy, hogy 50%¹os oldatot kapjunk. Minden mintához 20 ml¹t adtunk hozzá, majd rotálás mellett, 1 órán át, 4 °C¹on inkubáltuk. Ezt követõen a gyöngyöket háromszor mostuk kötõpufferben, majd 25 ml 2×SDS, Laemmli-puffert (Sigma) adtunk hozzájuk. A mintákat 5 percre 95 °C¹ra helyeztük, majd 12%¹os Tris-Glicin gélre (Invitrogen) vittük fel. Elektroforézist követõen a gélt ismét inkubáltuk 30 percen át szárítópufferben (Invitrogen), majd 150 percen át, 70 °C¹on szárítottuk. A radioaktív proteineket Kodak BioMax MS¹I filmre (Sigma) történõ exponálással tettük láthatóvá. Abból a célból, hogy kompetíciós tesztet végezzünk a vizsgálandó peptiddel, ez utóbbit 5–20 mmol/l koncentrációban adtuk a kiindulási oldathoz. c) Eredmények Amikor az 1. példában kapott peptidet a kiindulási oldathoz adjuk, a Bid protein autoradiográfiás szignálja eltûnik. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az 1. példában kapott peptid gátolja a Bcl¹W és Bid, Bcl¹XL és Bid és Bcl¹2 és Bid közötti kölcsönhatást. Példaként a Bcl¹XL és Bid között kapott eredményt mutatja az 1. ábra. 2) Fluoreszcenciapolarizáció: az 1. példában kapott peptid és antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatás Kd értékének meghatározása Az 1. példában kapott, N¹terminális végén fluoreszceinnel jelölt peptid 15 nmol/l oldatát elegyítettük 1 nmol/l¹tõl 5 mmol/l¹ig változó koncentrációjú GSTBcl¹W fúziós proteint tartalmazó oldattal, 20 mmol/l
2
Na2HPO4 pH=7,4, 1 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl, 0,05% pluronsav F¹68 összetételû pufferben. Ezt követõen mértük a fluoreszcenciapolarizációt En Vision (Packard Perkin–Elmer) készülékkel. A kapott eredményeket a 2. és 3. ábrán foglaltuk 5 össze. Eredmények: Amikor az 1. példában kapott peptidet együtt inkubáljuk a Bcl¹XL és Bcl¹W proteineket tartalmazó fúziós proteinekkel, a fluoreszcenciapolarizá10 ció jelentõs emelkedését figyeltük meg, tanúsítva, hogy kötõdik ezekhez a proteinekhez. A Bcl¹XL protein esetében kapott K d érték 2,15×10–7 M (2. ábra), míg Bcl¹W esetében 4,11×10–7 M volt (3. ábra). 15 3. példa: A Bcl¹W és/vagy Bcl¹XL és/vagy Bcl¹2 proteinek, valamint az 1. példában kapott peptid közötti kölcsönhatás gátlására képes molekulák szûrési tesztje A vizsgálni kívánt termékeket 384 vályulatú leme20 zekre (Corning Flat Bottom) osztottuk szét, 10 mg/ml végsõ koncentrációban. Egy vályulatot azonos térfogatú pufferrel vagy oldószerrel töltöttünk fel vizsgálandó vegyület nélkül, amely kontrollként szolgált. Az 1. pél25 dában kapott, fluoreszceinnel jelölt peptidet adtunk a vályulatokhoz úgy, hogy 15 nmol/l végsõ koncentrációt kapjunk. Ezt követõen GST-Bcl¹XL, GST-Bcl¹W vagy GST-Bcl¹2 fúziós proteineket mértünk be úgy, hogy 500 nmol/l (Bcl¹XL és Bcl¹2) és 1 mmol/l (Bcl¹W) végsõ 30 koncentrációt érjünk el, 20 mmol/l Na2HPO4 pH=7,4, 1 mmol/l EDTA, 50 mmol/l NaCl, 0,05% pluronsav F¹68 összetételû pufferben. Ezt követõen mértük a fluoreszcenciapolarizációt En Vision (Packard PerkinElmer) készüléken. A vizsgálandó vegyület nélkül észlelt fluoreszcen35 ciapolarizációt (negatív kontroll) összehasonlítva a vizsgálandó vegyülettel végzett vizsgálatéval, a fluoreszcenciapolarizáció jelentõs csökkenése az adott molekula gátló aktivitására enged következtetni. Ezzel 40 szemben a fluoreszcenciapolarizációnak a vizsgálandó termékkel végzett vizsgálatban a kontrollhoz viszonyítva észlelt fokozódása a molekula aktiváló aktivitására enged következtetni.
Szekvencialista <110> LES LABORATORIES SERVIER HYBRIGENICS <120> Nouveau peptide interagissant avec les protéines antiapoptotiques de la famille Bcl¹2 <130> Peptide¹1 <150> FR 03.09697 <151> 2003–08–06 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 5
1
HU 006 499 T2
2
<211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Asp Thr Arg Arg Ser Met Val Phe Ala Arg His Leu Arg Glu Val Gly Asp Glu Phe Arg Ser Arg 1 5 10 15 20 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2
gatacccgtc gcagcatggt gtttgccagg cacctgcggg aggtgggaga cgagttcagg agcaga 60 66 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <400> 3
gctttggaat cactacagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <400> 4
cacgatgcac gttgaagtg 19
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Peptid, amely kölcsönhatást mutat a Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus proteinekkel, és amely peptid tartalmazza a SEQ 1D NO 1 szerinti szekvenciát: Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-HisLeu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely kölcsönhatást mutat a Bcl-2, Bcl¹XL és/vagy Bcl¹W antiapoptotikus proteinekkel. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy megfelel a SEQ 1D NO 1 szerinti peptid fragmensének vagy pontmutánsának. 4. Az 1. igénypont szerinti peptidet kódoló nukleinsavszekvencia, amely tartalmazza a SEQ ID NO 2 szerinti szekvenciát: 5 ’ - G A T A C C C G T C G C A G C A T G G T G T T T GCCAGGCACCTGCGGGAGGTGGGAGACGAGTTCA GGAGCAGA¹3’.
45
50
55
60
6
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti aminosavszekvencia genetikai kódja alapján kikövetkeztetett nukleinsavszekvencia. 6. A 3. igénypont szerinti aminosavszekvencia genetikai kódja alapján kikövetkeztetett nukleinsavszekvencia. 7. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy 4–6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor plazmid, amely tartalmazza a peptidnek gazdasejtben történõ expresszálásához szükséges szekvenciákat. 9. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy a 8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektorral lett transzformálva. 10. Eljárás olyan molekulák azonosítására, amelyek modulálni képesek az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid és Bcl¹2 családba tartozó
1
HU 006 499 T2
antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatást, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid elõállítását; b) inkubálást a vizsgálni kívánt vegyülettel; c) Bcl¹2 családba tartozó, antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadását; és d) a fluoreszcenciapolarizáció mérését. 11. Eljárás olyan molekulák azonosítására, amelyek gátolni képesek az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid és Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatást, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid elõállítását; b) inkubálást a vizsgálni kívánt vegyülettel vagy anélkül; c) Bcl¹2 családba tartozó, antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadását; és d) a fluoreszcenciapolarizáció mérését; e) olyan molekulák szelektálását, amelyek esetében a fluoreszcenciapolarizációnak a vizsgálni kívánt vegyület jelenlétében megfigyelt fokozódása szignifikáns mértékben kisebb, mint a fluoreszcenciapolarizációnak a vizsgálni kívánt vegyület nélkül megfigyelt fokozódása. 12. Eljárás olyan molekulák azonosítására, amelyek fokozni képesek az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid és Bcl¹2 családba tartozó antiapoptotikus protein közötti kölcsönhatást, azzal jellemezve, hogy az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a) fluoreszcens markerrel jelölt, az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid elõállítását;
5
10
15
20
25
30
35
7
2
b) inkubálást a vizsgálni kívánt vegyülettel vagy anélkül; c) Bcl¹2 családba tartozó, antiapoptotikus proteint tartalmazó fúziós protein hozzáadását; és d) a fluoreszcenciapolarizáció mérését. e) olyan molekulák szelektálását, amelyek esetében a vizsgálni kívánt vegyület jelenlétében megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása szignifikáns mértékben nagyobb, mint a vizsgálni kívánt vegyület nélkül megfigyelt fluoreszcenciapolarizáció fokozódása. 13. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az antiapoptotikus protein Bcl¹2. 14. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az antiapoptotikus protein Bcl¹XL. 15. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az antiapoptotikus protein Bcl¹W. 16. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott peptidet a SEQ ID NO 1 szekvencia szerinti szekvencia jellemzi. 17. A 10–12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az alkalmazott fluoreszcens marker fluoreszcein. 18. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid alkalmazása apoptózist moduláló molekuláknak a 10–17. igénypontok bármelyike szerinti eljárással történõ azonosítására. 19. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid alkalmazása apoptózis deregulációjával járó kórképek kezelésére alkalmas molekuláknak a 10–17. igénypontok bármelyike szerinti eljárással történõ azonosítására. 20. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti peptid alkalmazása autoimmun betegségek, egyes neurológiai betegségek és rákok kezelésére alkalmas molekuláknak a 10–17. igénypontok bármelyike szerinti eljárással történõ azonosítására.
HU 006 499 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
8
HU 006 499 T2 Int. Cl.: C07K 14/47
9
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
