!HU000007737T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 737
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0350886 2003. 11. 21.
(73) Jogosult: FLAMEL TECHNOLOGIES, 69200 Vénissieux (FR)
FR
(72) Feltalálók: POULIQUEN, Gauthier, F-69007 Lyon (FR); MEYRUEIX, Rémi, F-69009 Lyon (FR); SOULA, Olivier, F-69330 Meyzieu (FR) (54)
HU 007 737 T2
A61K 38/21
(21) Magyar ügyszám: E 04 805848 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 19. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040805848 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1689426 A1 2005. 06. 09. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1689426 B1 2009. 12. 30.
(2006.01) A61K 9/10 (2006.01) A61K 47/36 (2006.01) A61K 47/42 (2006.01) A61K 9/14 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05051417 PCT/FR 04/050605
(74) Képviselõ: Kerény Judit, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Gyógyászati készítmények interferonok prolongált felszabadítására, és ezek gyógyászati alkalmazásai
A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 737 T2
A jelen találmány tárgya stabil, fluid vizes kolloid szuszpenziókon alapuló új gyógyászati készítmények protein hatóanyagok, azaz interferonok (IFN) prolongált felszabadítására, és ezen készítmények gyógyászati felhasználása. Ezek az aktív gyógyászati készítmények mind a humán, mind az állatgyógyászatban jelentõsek. Az interferonok a citokin családhoz tartozó glikoproteinek. Ezek olyan biológiai mediátorok, amelyek membránreceptorokhoz kötõdnek, és pleiotropikus celluláris reakciót váltanak ki. Ez antivirális, burjánzásgátló és immunomodulátor hatást eredményez. Az interferonok elismertek, mint hatékony tumorellenes vagy rákellenes szerek is. Az interferonok itt az interferon valamennyi formáját jelentik, pl. az alfa¹, béta- vagy gamma-interferont. Az IFN¹t géntechnológiai módszerekkel lehet elõállítani. A prolongált felszabadulású IFN¹t tartalmazó gyógyászati készítményekkel szembeni követelmény az, hogy biztosítsuk, amennyire a lehetõségek engedik, hogy a páciens plazma-IFN-koncentrációja megközelítse az egészséges embernél megfigyelt értéket. Ezt a célt az IFN plazmában levõ rövid élettartama veszélyezteti; ez szükségessé teszi, hogy az IFN¹t ismételten injektáljuk be, és ez igen korlátozó. A gyógyászati fehérje plazmakoncentrációja ezután egy „fûrészfog” profillal rendelkezik, amelyet nagy koncentrációjú csúcsok és alacsony koncentrációjú minimumok jellemeznek. Az alapkoncentrációnál az egészséges egyedben lényegesen nagyobb koncentrációjú csúcsok kifejezetten károsan hatnak az IFN nagy toxicitása miatt. Ezenkívül a koncentrációminimumok viszont azon koncentráció alatt vannak, ami ahhoz szükséges, hogy gyógyhatást fejtsen ki, tehát a páciens nem kap elég gyógyszert, és súlyos, hosszú távú mellékhatásoktól szenved. Tehát ahhoz, hogy biztosítva legyen, hogy a páciens plazmabeli interferonkoncentrációja megközelítse az ideális értéket a kezelésnél, a szóban forgó gyógyászati készítménynek lehetõvé kell tenni a gyógyfehérje prolongált felszabadulását, hogy korlátozza idõben a plazmakoncentráció változásait. Ezenkívül az aktív készítménynek elõnyösen a következõ jellemzõkkel kell rendelkeznie a szakirodalom szerint: 1 – egy vagy több aktív és nem denaturált (nem módosított) interferon prolongált felszabadulása úgy, hogy a plazmakoncentrációt a terápiás szinten lehessen tartani, 2 – folyékony forma, amely elég fluid ahhoz, hogy könnyen injektálható legyen és sterilizálható legyen £0,2 mikron pórusú szûrõkön történõ szûréssel, 3 – stabil folyékony forma, 4 – biokompatibilitás és biodegradálhatóság, 5 – atoxicitás, 6 – nem immunogén jelleg, 7 – kiváló helyi tolerancia. Az irodalomban már több megközelítést javasoltak abból a célból, hogy ezeket a célokat elérjék.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
Az elsõ megközelítés szerint egy természetes gyógyproteint módosítanak egy vagy több polimerlánc kovalens graftolásával (ojtásával) vagy egy protein, pl. humán szérumalbumin (HSA) kovalens graftolásával. Az ily módon módosított fehérjének receptorai irányában kicsi az affinitása, és felezési ideje az általános keringésben jelentõsen megnõ. A koncentráció változásának amplitúdója a plazmaprotein-koncentráció csúcsok és völgyek között ezáltal lényegesen csökken. Az elsõ megközelítés illusztrációjaként kiemeljük, hogy egy 12 kD molekulatömegû polietilénglikol (PEG) lánc graftolásával kémiailag módosított interferon-alfa 2b¹t a Shering Plough VIRAFÉRON® PEG néven forgalmaz. Ennek a kémiai módosításnak a hatására megnõ a páciensben a felezési idõ 6,8 óráról 33 órára. Ugyanakkor a módosított fehérje bioaktivitása lényegesen csökken. Ezenkívül egy fehérje irreverzíbilis módosítása, amely már többé nem humán fehérje, toxicitáshoz és immunogenitásproblémákhoz vezethet hosszú távon. Egy második megközelítés szerint javasolták, hogy a hatás idõtartamát meg lehet növelni legalább egy polimert és egy hatóanyagot tartalmazó készítmények alkalmazásával, amelyek szobahõmérsékleten és atmoszferikus nyomáson folyékonyak, és injektálhatók, és az injekció után viszkózusabbá válnak, például a pH és/vagy a hõmérséklet változásának a hatására. Tehát ily módon az US–B–6 143 314 számú dokumentum leír egy szerves polimer oldatot AP szabályozott felszabadulására, amely az injekció után szilárd implantátumot képez. Ez az oldat a következõket tartalmazza: (A) 10–80 tömeg% bázikus termoplasztikus polimer, amely biokompatibilis, biodegradálható és vízben vagy fiziológiai folyadékokban (például politejsavban és/vagy poliglikol-polimerben) oldhatatlan; (B) szerves oldószer, pl. N¹metil-pirrolidon, amely fiziológiai folyadékokban diszpergálódik; (C) hatóanyag (AP); (D) végül 1–50 tömeg% szabályozott felszabadulású szer, amely politejsav-glikol/polietilénglikol típusú blokk-kopolimerbõl áll. Injektálás után a (B) diszpergálódik, vagy a fiziológiai folyadékokban szétoszlik. Az (A) implantátumot képez, amely kapszulába zárja (C)¹t, amely nem kötõdik kovalensen se (A)-hoz, se (D)-hez, és így in vivo lassan szabadul fel. Ennek a módszernek a fõ hátránya a (B) szerves oldószer alkalmazása, amely potenciálisan denaturáló az AP¹re (C) (pl. gyógyfehérjékre), és a páciensre nézve toxikus. Ezenkívül az (A) polimer in vivo hidrolízise egy olyan savat generál, amely a lokális toleranciában problémákat okozhat. A WO–A–99/18142 és WO–A–00/18821 sz. PCT bejelentések olyan vizes polimer oldatokra vonatkoznak, amelyek az AP¹t oldott vagy kolloid formában tartalmazzák, és amelyek meleg vérû állatoknak különösen injekció útján adagolhatók, és így egy géles AP (pl. inzulin) üledéket képeznek in vivo, mert a fiziológiás hõmérséklet gélesedési pontjuk feletti. Az ily módon képzõdött gél prolongált módon szabadít fel AP¹t. Ilyen
1
HU 007 737 T2
konkrét biodegradálható polimerek az ABA vagy BAB triblokkok, ahol A jelentése politejsav-glikol kopolimer (PLAGA) vagy politejsav polimer (PLA), és B jelentése polietilénglikol. Az ilyen háromblokkos polimerek folyadék/gél transzformációs hõmérsékletei például 36, 34, 30 és 26 °C. Az US–B–6 143 314 számú dokumentum szerinti (A) polimerekhez hasonlóan az ilyen ABA vagy BAB háromblokkos polimerek in vivo hidrolízise olyan savakat eredményez, amelyeknek nem szükségszerûen megfelelõ a lokális toleranciája. A WO–A–98/11874 számú PCT bejelentés olyan gyógyászati készítményeket ír le, amelyek lipofil hatóanyagot, egy gélezõ polimert (Gelrite®=dezacetilezett gellángumi vagy etil-hidroxi-cellulóz) és egy felületaktív anyagot tartalmaznak. A polimer/felületaktív kölcsönhatás, és talán csak az elektrolitok, pl. a Ca++-ionok jelenléte egy fiziológiás koncentrációban, a Gelrite® polimer esetében, polimer/felületaktív anyag aggregátumból álló gél képzéséhez vezet, amelyhez a lipofil hatóanyag nem kovalensen kötõdik. Ez a készítmény a célszervbe történõ lokális adagolásra alkalmas (pl. szembe). Az aggregátum/hatóanyag asszociáció, amely in situ keletkezik, lehetõvé teszi a célszervben a hatóanyag lassú felszabadulását. Egy harmadik megközelítés abból a célból, hogy a protein idõtartamát meg lehessen hosszabbítani, miközben megõrizzük a bioaktivitását, nem denaturált terápiás protein alkalmazása, és ennek biokompatibilis polimereken alapuló mikrogömbökbe vagy implantátumokba történõ beépítése. Ezt a megközelítést például az US–B–6 500 448 számú szabadalommal és az US–A–2003/0133980 számú USA szabadalmi bejelentéssel illusztráljuk, ezek egy készítményt írnak le a humán növekedési hormon (hGH) prolongált felszabadulására, ahol a hormonális proteint elõször fémmel történõ komplexképzéssel stabilizálják, majd biokompatibilis polimer mátrixban diszpergálják. A biokompatibilis polimer például egy polilaktid, poliglikolid vagy egy polilaktid-glikolid kopolimer. A készítményt például mikrogömbök szuszpenziójának formájában, nátriumkarboxi-metil-cellulóz oldatban állítják elõ. Ennek a megoldásnak több hátránya van. Elõször is, a mikrogömbgyártási folyamat során a fehérjét potenciálisan denaturáló szerves oldószerekkel hozzák érintkezésbe. Ezenkívül a mikrogömbök nagyok (1–100 mikron méretûek), ami korlátozó jellegû az injekció szempontjából, és a szûrõkön történõ sterilizálás könnyûsége szempontjából. Végül, lokális toleranciaproblémák léphetnek fel, ha a polimer in situ hidrolizálódik. Egy negyedik megoldás szerint a gyógyászati fehérjék (különösen az interleukinok) prolongált felszabadulási formáit fejlesztették ki, amelyek proteinekkel töltött nanorészecskék folyékony szuszpenziójából állnak. Az utóbbi lehetõvé tette, hogy alacsony viszkozitású folyékony készítményben adagolják a természetes proteint. Az FR–B–2 732 218 számú szabadalom hatóanyagok szállítására alkalmas részecskéket ír le, melyek poliaminosav(ak)on alapuló típusúak, és amelyeknek a mérete kisebb, mint 200 mm, és amelyeknél a poliami-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
nosav alkotórészek legalább két típusú ismétlõdõ AAN és AAI aminosavat tartalmaznak, ahol az AAN típus hidrofób semleges aminosavnak, és az AAI típus ionizálható oldalláncot tartalmazó aminosavnak felel meg. Ez a szabadalom speciálisan kolloid szuszpenziókat ír le, amelyek polimer és haemoglobin, citokróm C, ovalbumin asszociációjával képzett nanorészecskéket tartalmaznak. Ezeket a szuszpenziókat úgy állítják elõ, hogy 100 vagy 200 mg poli Leu/Glu¹t és 10 mg citokróm C¹t 100 ml pufferoldatban összekevernek pH=7,2 értéken. Az FR–B–2 822 834 számú szabadalmi leírás szubmikronikus kolloid szuszpenziót ír le, amelyet különösen a hatóanyagok szállítására (AP) lehet használni, ezek a részecskék individualizált, szupramolekuláris elrendezésûek, és alapjuk legalább egy amfifil kopolimer, amely tartalmaz legalább egy polialkilénglikol (PAG) típusú, elõnyösen polietilénglikol (PEG) típusú hidrofil polimer blokkot; és legalább egy, a¹peptid láncokat tartalmazó amfifil kopoliaminosavat (PPA). Ez a szabadalom speciálisan olyan kolloid szuszpenziót ír le, amelyet úgy állítanak elõ, hogy összekevernek 10 mg amfifil kopolimert 1 ml, 1,4 mg/ml inzulinoldattal pH=7,4 értéken. Az FR–B–2 838 964 számú szabadalmi leírás szubmikron részecskék kolloid szuszpenzióját írja le, amely a hatóanyag (AP) szállítására alkalmazható különösen, és ezek a részecskék individualizált szupramolekuláris elrendezésûek, amelyeknek az alapja egy amfifil kopolimer, amely a¹peptid láncokat tartalmazó, legalább egy hidrofil lineáris poliaminsav (PAA) blokkot tartalmaz, továbbá tartalmaz hidrofil aminosavakat (AAI), amelyek ezt a PAA blokkot képezik, és ezek azonosak vagy eltérnek egymástól, továbbá tartalmaz legalább egy blokk, legalább egy hidrofób polimert, amely a¹hidroxi-karbonsav polimerbõl (HCAP) készül, és amelyet spontán állítanak elõ felületaktív anyag hiányában úgy, hogy összekeverik az amfifil kopolimert és egy olyan folyadékot, amely nem oldja az AAI¹t. Ez a szabadalom konkrétan olyan kolloid szuszpenziót ír le, amelyet inzulinoldat és nanorészecskék összekeverésével állítanak elõ, amelyet 10 mg/ml¹re koncentrálnak pH=7,4 értéken. Egy elsõ prolongált felszabadulási módszer szerint a prolongált felszabadulású nanorészecskéjû szuszpenzió liposzómák szuszpenziójából áll, amelyben kapszulázva található a nem módosított természetes protein. Injektálás után a fehérje fokozatosan felszabadul a liposzómákban, meghosszabbítva azt az idõt, amely során a fehérje az általános keringésben jelen van. Így például a Cancer Res. 43, 546. o., 193, Frossen és társai irodalomban leírják az antineoplasztikus szerek liposzómákba történõ kapszulázását a gyógyhatás fokozására. Azonban ezek a szerek túl gyorsan szabadulnak fel ahhoz, hogy igazi prolongált felszabadulást eredményezzenek. Az US–B–5 399 331 sz. USA szabadalmi leírásban a Liposome Company, Inc. javasolja, hogy az interferon 2 in vitro felszabadulási idejét javítsák oly módon, hogy liposzómához ojtsák kovalensen, és így ez a módszer ugyanolyan hátrá-
1
HU 007 737 T2
nyokkal rendelkezik, mint a fent említett elsõ „módosított fehérje”. A liposzómák stabilitási hiányának megoldására, miközben ugyanakkor megtartják az alacsony viszkozitású folyékony nanonrészecskéjû készítmény elõnyeit, a Flamel Technologies egy második prolongált felszabadulási módszert javasolt, amelyben a gyógyfehérje vízoldékony polimer nanorészecskékkel kapcsolódik össze, azaz „hidrofób módon van módosítva”, azaz a hidrofób csoportok ojtásával történik a módosítás. Ezt a polimert különösen poliaminosavakból (poliglutamátokból vagy poliaszpartátokból) választják ki, amelyek hidrofób graftokat hordoznak. Ezen hidrofób-módosított polimerek említésre méltó elõnyeihez tartozik az, hogy spontán összeállnak vízben, és így nanorészecskéket képeznek. Ezen rendszerek további elõnye, hogy a gyógyfehérjék vagy peptidek spontán kapcsolódnak össze a hidrofób-módosított polimerek nanorészecskéivel, és ez az összekapcsolódás nem kovalens, és anélkül megy végbe, hogy egy felületaktív anyaghoz vagy egy potenciálisan denaturáló transzformálási eljáráshoz folyamodna segítségért. Itt nem megy végbe a protein mikrogömbbe történõ kapszulába zárása, ahogy az az US–B–6 500 448 sz. USA szabadalmi leírásban és az US–A–2003/0133980 sz szabadalmi bejelentésben szerepel. Ezzel teljesen ellentétben, a hidrofób-módosított kopoliaminosavak ezen nanorészecskéi spontán adszorbeálják a proteineket oldatban, anélkül hogy kémiailag módosítanák és denaturálnák ezeket, és anélkül hogy aggresszív kezelésnek vetnék alá, például „emulgeálásnak” és „oldószerlepárlásnak”. A készítményeket folyadékban vagy liofilizált formában lehet tárolni. Injekció, például szubkután injekció után, a proteinekkel töltött nanorészecskék szuszpenziói fokozatosan szabadítják fel in vivo a bioaktív nem denaturált proteint. A protein hatóanyag ilyen nem kovalens asszociációi – (AP)/poli[Glu] vagy poli[Asp] – szerepelnek a WO–A–00/30618 számú szabadalmi bejelentésben. Az említett szabadalmi bejelentés konkrétan pH=7,4 értékû kolloid szuszpenziókat ír le, amelyek humán inzulin és „hidrofób-módosított” poliglutamát nanorészecskéinek asszociációit tartalmazzák. Az alábbi Táblázat bemutatja a használt „hidrofób-módosított” poliaminosavakat és a WO–A–00/30618 példáiban kapott asszociációs fokokat. Példa
Polimer
Asszociációs fok (%)
1.
poli[(Glu-O¹Na)0,63-blokk-(GluO-metil)0,37]
55
2.
poli[(Glu-O¹Na)0,66-blokk-(GluO-etil)0,34]
26
3.
poli[(glu-O¹Na)0,65-blokk-(GluO-hexadecil)0,35]
36
4.
poli[(Glu-O¹Na)0,88-blokk-(GluO-dodecil)0,12]
>90
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
Ezek a kolloid szuszpenziók 1,4 mg/ml inzulint és 10 mg/ml „hidrofób-módosított” poliaminosavat tartalmaznak. A WO–A–00/30618 számú dokumentumban az 1. ábra azt mutatja, hogy a fent említett szuszpenziókkal vektorizált inzulin in vivo felszabadulási ideje 12 óra. Ezt a felszabadulási idõt profitábilisan lehetett növelni. Tehát, annak ellenére, hogy az említett PCT bejelentés már jelentõs elõnyt jelent, technikai tartalmát tovább lehet optimalizálni a fent említett jellemzõk vonatkozásában, különösen ami az interferonok in vivo felszabadulási idejének meghosszabbítását jelenti. A még nem publikált 02 07008 (2002. 06. 07.), 02 09670 (2002. 07. 30.), 03 50190 (2003. 05. 28.) és 01 50641 (2003. 10. 03.) számú francia szabadalmi bejelentések új, vízoldékony amfifil poliaminosavakra vonatkoznak, amelyek aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységeket tartalmaznak, és amelyekben legalább egy egység hidrofób ojtásokat hordoz. A WO–A–00/30618 számú szabadalmi bejelentésben leírt hidrofób-módosított poliaminosavakhoz hasonlóan, ezek az új polimer kiindulási anyagok spontán keletkeznek vizes folyékony közegben, nanorészecskék kolloid szuszpenzióiban, amelyeket az AP (inzulin) prolongált felszabadításához lehet használni. Biokompatibilisek és biodegradálhatók, és a proteinek, különösen a terápiás proteinek, ezekre a nanorészecskékre spontán adszorbeálódnak, anélkül hogy kémiailag módosulnának vagy denaturálódnának. Ezek a szabadalmi bejelentések továbbá ezeken a poliaminosavakon alapuló új gyógyászati, kozmetikai, dietetikus vagy fitoszaniter készítményekre vonatkoznak. A 02 07008 számú francia szabadalmi bejelentés szerinti amfifil, „hidrofób-módosított” poliaminosavak aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységeket tartalmaznak, amelyek hidrofób ojtásokat hordoznak, és amelyek legalább egy alfa-tokoferol-egységet (pl. poliglutamátot vagy poliaszpartátot) tartalmaznak, amelyek szintetikus vagy természetes eredetû alfa-tokoferollal vannak ojtva. Az említett, nem publikált szabadalmi bejelentés olyan kolloid szuszpenzióra vonatkozik, amely polimer/aktív protein asszociációkból képzõdött nanorészecskéket tartalmaz, és amelynek az elõállítása úgy történik, hogy összekevernek 1 mg alfa-tokoferollal ojtott poliglutamátot és 7 mg inzulint 1 ml vízben pH=7,0 értéken. A 02 09670 számú francia szabadalmi bejelentés szerinti amfifil „hidrofób-módosított” poliaminosavak aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységeket tartalmaznak, amelyek hidrofób ojtásokat hordoznak, és amelyek legalább egy hidrofób egységet tartalmaznak, és össze vannak kapcsolva aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységekkel két amidcsoportot tartalmazó rotáló kötés útján, és pontosabban a lizin vagy ornitin típusú „spacer” útján. Az említett, nem publikált szabadalmi bejelentés konkrétan kolloid szuszpenziót ír le, amely polimer/ak-
1
HU 007 737 T2
tív protein asszociációkból képzõdött nanorészecskéket tartalmaz, és amelynek az elõállítása úgy történik, hogy összekevernek 10 mg, lizin „spacer” útján palmitinsavval ojtott poliglutamátot és 200 IU inzulint (7,4 mg) 1 ml vízben, pH=7,4 értéken. A 03 50190 számú francia szabadalmi bejelentés szerinti amfifil „hidrofób-módosított” poliaminosavak aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységeket tartalmaznak, amelyek közül néhány legalább egy aszparaginsavhoz vagy glutaminsavhoz kapcsolódó ojtást hordoz, ahol a kapcsolódás Leu és/vagy ILeu és/vagy Val és/vagy Phe alapú aminosav „spaceren” keresztül történik, és ahol egy 6–30 szénatomos hidrofób csoport kapcsolódik egy észterkötésen keresztül a „spacer”-hez. Az említett, nem publikált szabadalmi bejelentés konkrétan leír egy kolloid szuszpenziót, amely polimer/aktív protein asszociációkból képzõdött nanorészecskéket tartalmaz, és amelyet úgy kapnak, hogy összekevernek 10 mg, –Leu-OC8-cal, –Val-OC12-vel vagy –Val-koleszteril ojtással ojtott poliglutamátot tartalmazó vizes oldatot és 200 IU, 7,4 mg inzulint 1 ml vízre vonatkoztatva, pH=7,4 értéken. A 01 50641 számú francia szabadalmi bejelentés anionos, amfifil lineáris homopoliaminosavakat ír le, amelyek aszparaginsav- vagy glutaminsavegységet tartalmaznak, és amelyeknek a végei 8–30 szénatomos hidrofób csoportokat hordoznak. Konkrétan, a „hidrofób-módosított” telekel homopoliaminsav lehet például poli[GluONa], melynek PheOC18/C18 végei vannak, vagy egy poli[GluONA], mely PheOC18/alfa-tokoferol végekkel rendelkezik. Az említett, nem publikált szabadalmi bejelentés leír még egy kolloid szuszpenziót, amely polimer/aktív protein asszociációkból képzõdött nanorészecskéket tartalmaz, és amelyet úgy kapnak, hogy összekevernek 10 mg egyik fent említett polimert és 200 IU, 7,4 mg inzulint 1 ml vízre, pH=7,4 értéken. Az említett publikálatlan szabadalmi bejelentés szerinti szuszpenziókkal „vektorizált” inzulin in vivo felszabadulási ideje profitábilisan növelhetõ. Akárhogy is legyen, a hidrofób-módosított poliaminosavak nanorészecskéinek kolloid szuszpenzióira vonatkozó egyik irodalom sem ír le olyan készítményt, amely lehetõvé teszi a következõket: (I) a hatóanyag felszabadulási idejének megfelelõ megnövelése parenterális injekció, különösen szubkután injekció után; (II) és/vagy az aktív protein-plazmakoncentráció csúcsának csökkentése a proteint tartalmazó készítmény injektálása után. Ilyen körülmények között, a jelen találmány egyik lényeges célja az volt tehát, hogy olyan folyékony gyógyszerkészítményt állítsunk elõ aktív IFN prolongált felszabadítására, amellyel legyõzhetõk az irodalomból ismert hátrányok, és különösen lehetõvé válik parenterális, pl. szubkután injekció után, hogy prolongált in vivo felszabadulási idejû, nem denaturált interferonokat kapjunk. A találmány további lényeges célja olyan folyékony gyógyászati készítmény elõállítása, amely alkalmas in-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
terferon vagy interferonok in vivo prolongált felszabadítására, ami eléggé folyékony ahhoz, hogy könnyen injektálható és szûréssel sterilizálható legyen, ahol a szûrõk pórusmérete 0,2 mikron vagy annál kisebb. A találmány lényeges célja továbbá interferon vagy interferonok prolongált in vivo felszabadítására szolgáló gyógyászati készítmény, amely mind fizikokémiai, mind biológiai értelemben tároláskor stabil. A találmány további lényeges célja interferon vagy interferonok prolongált in vivo felszabadítására szolgáló gyógyászati készítmény, amely legalább egy következõ tulajdonsággal rendelkezik: biokompatibilitás, biodegradálhatóság, atoxikusság és jó lokális tolerancia. A találmány további lényeges célja interferon vagy interferonok lassú, prolongált in vivo felszabadítására szolgáló gyógyászati készítmény, ahol a készítmény alacsony viszkozitású, vizes kolloid szuszpenzió, amely polimer PO szubmikronikus részecskéit tartalmazza, amelyek önmagukban összekapcsolódnak legalább egy interferonnal, és ahol a polimer PO vízoldékony biodegradálható polimer, amely hidrofób csoportokat hordoz. A találmány további lényeges célja interferon vagy interferonok lassú, prolongált in vivo felszabadítására szolgáló gyógyászati készítmény, amely alacsony viszkozitású, vizes kolloid szuszpenzió, amely polimer PO szubmikronikus részecskéit tartalmazza, amelyek legalább egy interferonnal autoasszociáltak, és a polimer PO lehet például aszparaginsavegységekbõl és/vagy glutaminsavegységekbõl álló poliaminosav, legalább ezen csoportok közül néhány legalább egy hidrofób csoportot (HG) tartalmazó ojtást hordoz, és a PO biodegradálható, vízoldékony és amfifil is. A találmány további célja a készítménybõl származó olyan termékek és/vagy prekurzorok, amelyekre a fenti célok felsorolásánál utaltunk. Különösen a bejelentõ javára írható, hogy fiziológiás hõmérsékleten alacsony viszkozitású, vizes folyékony gyógyászati készítményeket fejlesztett ki, amelyek meglepõ módon gélesített üledéket képeznek in vivo, azután, hogy embereknek vagy meleg vérû emlõsöknek parenterálisan könnyen beadtuk, és ez az üledékképzõdés nem következik be a pH vagy a hõmérséklet változásával parenterális injekció hatására, vagy amikor a szerves oldószer a fiziológiás közegben diszpergálódik. A keletkezett gélesített üledék ily módon lényegesen megnöveli az IFN in vivo felszabadulási idejét in vivo. A találmány tehát interferon vagy interferonok prolongált felszabadulását elõsegítõ folyékony gyógyászati készítményre vonatkozik, ahol a készítmény tartalmaz hidrofób csoportokat (HG) hordozó vízoldékony biodegradálható polimer szubmikronális részecskéin alapuló alacsony viszkozitású, vizes kolloid szuszpenziót, ahol a részecskék nem kovalensen kapcsolódnak legalább egy interferonnal és adott esetben legalább egy másik hatóanyaggal (AP), és a következõképpen jellemezhetõ: – a szuszpenzió diszperziós közege lényegében vízbõl áll,
1
HU 007 737 T2
– a készítmény alkalmas arra, hogy parenterálisan befecskendezzük, majd in vivo gélesített üledéket képez, és ennek a gélesített üledéknek a képzõdését: – egyrészt legalább részben legalább egy fiziológiás protein in vivo jelenléte miatt jön létre, – másrészt lehetõvé teszi, hogy az adagolás után 24 órával meghosszabbítsa és szabályozza az AP in vivo felszabadulási idejét, – az injekció körülményei között folyékony, – és folyékony a fiziológiai hõmérsékleten és/vagy pH mellett és/vagy a következõk jelenlétében: – fiziológiai koncentrációjú fiziológiai elektrolit, – és/vagy legalább egy felületaktív anyag. Elõnyösen ez a gélesedés in vivo nem a pH változásának és/vagy a hõmérséklet változásának az eredménye, vagy nem az injekciós készítményben esetleg jelen levõ egy vagy több szerves oldószer in vivo diszpergálódásának az eredménye. Anélkül, hogy ehhez az elmélethez kötnénk magunkat, megfontolhatjuk, hogy a fiziológiai koncentrációkban in vivo jelen levõ fiziológiás proteinek lehetõvé teszik a legalább egy interferonnal összekapcsolt PO nanorészecskék aggregációját. Az ilyen gélesedés például egy órán belül vagy több idõ alatt, többek között 24, 48 vagy 72 óra alatt jön létre. A készítmény parenterális befecskendezése után kapott géles üledék lehetõvé teszi a protein felszabadulási idejének értékes meghosszabbodását, valamint az interferon vagy interferonok plazmakoncentráció csúcsának csökkentését. A találmány egyik optimalizált változata szerint olyan a PO¹koncentráció, hogy a parenterális injekció után in vivo gélesedett üledéket képez. Az egyik definíció szerint, amely nem in vivo viselkedésen alapul, ahogy azt fent jeleztük, hanem egy in vitro viselkedésen, és a találmány folyékony gyógyszerkészítményre vonatkozik a hatóanyag(ok) (AP) prolongált felszabadulására, ez a készítmény: – cseppfolyós szobahõmérsékleten, – továbbá cseppfolyós fiziológiás hõmérsékleten és/vagy pH¹nál és/vagy a következõk jelenlétében: – fiziológiai koncentrációjú fiziológiai elektrolit, – és/vagy legalább egy felületaktív anyag, – és tartalmaz egy alacsony viszkozitású, vizes kolloid szuszpenziót, amely HG hidrofób csoportokat hordozó, vízoldékony biodegradálható polimer PO szubmikronikus részecskéin alapul, és ezek a részecskék nem kovalensen kapcsolódnak legalább egy interferonhoz (és adott esetben legalább egy hatóanyaghoz), és a szuszpenzió diszperziós közege lényegében vízbõl áll, ezt a készítményt az jellemzi, hogy a PO¹koncentrációt elég magas értékre helyezzük ahhoz, hogy lehetõvé váljon in vitro gélesített üledék képzõdése legalább egy protein jelenlétében. A találmány szerinti folyékony gyógyászati készítményeket azzal jellemezhetjük, hogy a PO¹koncentrációja a következõ:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
– [PO]³0,9.C1, – elõnyösen 20.C1³[PO]³C1, – és különösen elõnyösen 10.C1³[PO] C1, ahol C1 jelentése a PO részecskék „indukált gélesedési” koncentrációja IG teszttel mérve. A készítmény parenterális injekció utáni gélesedési üledéke a protein felszabadulási idejének értékes meghosszabbítását teszi lehetõvé, továbbá lehetõvé teszi az interferon(ok) plazmakoncentrációs csúcsának a csökkenését is. Az AP felszabadulási idõ jelentõsen megnövekszik az irodalom szerinti készítményekkel összevetve, különösen a WO–A–00/30618 és a még nem nyilvánosságra hozott 02 07008, 02 09670, 03 50190 és 01 50641 számú francia szabadalmi bejelentésekben leírt megoldásokhoz képest. A találmány szerinti készítményekkel elõidézett in vivo felszabadulásiidõ-meghosszabbodás annál értékesebb, minthogy a felszabadult interferonok még mindig teljesen bioaktívak, és nem denaturáltak. A jelen leírás keretében az interferonok tetszés szerint módosítatlan vagy módosított interferonok, pl. olyan interferonok, amelyeket egy vagy több polioxi-etilén-csoport ojtásával módosítunk. Az interferon család fehérjéi közül említhetõ az IFN alfa, IFN béta és IFN gamma. A jelen leírásban a legalább egy interferonnal és adott esetben legalább egy egyéb hatóanyaggal asszociált vagy nem asszociált polimer PO szupramolekuláris elrendezõdéseket tetszõlegesen „szubmikronikus részecskékként” vagy „nanorészecskékként” emlegetjük. Ezek az alább definiált Md módszerrel mérve átlagos hidrodinamikai átmérõjû részecskéknek felelnek meg, azaz ez az átmérõ például 1 és 500 nm, elõnyösen 5 és 250 nm között változik. Ezen túlmenõen igen fontos megjegyezni, hogy ezek a készítmények cseppfolyósak, ezért elõnyösen igen alacsony a viszkozitásuk, és ezért könnyen injektálhatók. Csak in vivo gélesednek. A találmány szerint a „cseppfolyós”, „alacsony viszkozitású” vagy „igen alacsony viszkozitású” minõsítések elõnyösen olyan dinamikus viszkozitásnak felelnek meg, amely kisebb vagy egyenlõ 5 Pa·s-sel. A viszkozitás referenciamérését végezhetjük például 20 °C¹on AR1000 reométer (TA Instruments) felhasználásával, amely fel van szerelve egy kúp és tányér geometriával (4 cm, 2°). A v viszkozitást 10 s–1 nyírási gradiensre mérjük. Így a találmány szerinti készítmények viszkozitása lehet például 1·10–3 és 5 Pa·s, elõnyösen 1·10–3 és 0,8 Pa·s és különösen 1·10–3 és 0,5 Pa·s között. Ennek az alacsony viszkozitásnak a következtében a találmány szerinti készítmények nemcsak könnyen injektálhatók parenterálisan, különösen többek között intramuszkulárisan vagy szubkután, hanem könnyen sterilizálhatók is steril szûrõkön szûrve csökkent költséggel, ahol a szûrõk pórusmérete 0,2 mm. A találmány szerinti készítményeknek ez a cseppfolyós állapota vagy alacsony viszkozitása fennáll a szobahõmérsékletnek, pl. 4 és 30 °C közötti hõmérsék-
1
HU 007 737 T2
letnek megfelelõ injekciós hõmérsékleten, és a fiziológiás hõmérsékleten. A találmány szerinti készítmény elõnyösen egy vagy több interferonnal és adott esetben egy vagy több más hatóanyaggal asszociált vizes kolloid nanorészecske szuszpenzió. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerint ennek a szuszpenziónak a diszperziós közege lényegében vízbõl képzõdik. A gyakorlatban ez a víz legalább 50 tömeg%¹ot képvisel a készítmény össztömegére vonatkoztatva. A találmány fogalmait használva, a „protein” vagy egy fehérjét, vagy egy peptidet jelent, és az is lehet, hogy ez a protein vagy peptid módosítatlan vagy módosított, például egy vagy több polioxi-etilén-csoporttal ojtott. A találmány értelmében a „fiziológiai fehérjék” kifejezés meleg vérû emlõsök endogén proteinjeit és/vagy peptidjeit jelenti, amelyek jelen vannak az injekció helyszínén. A „fiziológiai hõmérséklet” a találmány értelmében a meleg vérû emlõsök fiziológiai hõmérsékletét jelenti, azaz például kb. 37–42 °C¹ot. A találmány értelmében a „fiziológiai pH” például 6 és 7,6 közötti érték. A találmány fogalmai szerint a „gél” egy félig szilárd állapotot jelent, amelybe átalakul a találmány szerinti cseppfolyós készítmény spontán módon, kizárólag a fiziológiai protein(ek) jelenléte révén, a fiziológiai pH és/vagy a fiziológiai hõmérséklet és/vagy egy fiziológiai elektrolit (pl. Ca++) jelenléte és/vagy az injektált készítményben esetleg jelen levõ szerves oldószer in vivo diszperziója (vagy szétszóródása) lényeges beavatkozása nélkül. A találmány fogalmai szerint a „fiziológiai elektrolit” azt jelenti, hogy elektrolit (pl. Ca++-ion) van jelen a meleg vérû emlõsökben. A „fiziológiai koncentráció” a találmány értelmében a meleg vérû emlõsökben található bármilyen fiziológiai koncentráció a szóban forgó fiziológiás közegben. Ezenkívül a találmány szerinti készítmények nem toxikusak, jó lokális toleranciát mutatnak, és stabilak. Azt is a feltalálók javára lehet írni, hogy kifejlesztettek egy in vitro IG tesztet a találmány szerinti elõnyös készítmények populációjának kiválasztására, és a készítményekben a megfelelõ PO¹koncentrációk meghatározására. A találmány szerint a Cl gélesedési koncentráció mérésére szolgáló IG teszt egy referenciateszt a kritikus C1 koncentráció, a továbbiakban az indukált gélesedési C1 koncentráció definiálására, amely minden találmány szerinti kolloid készítményt jellemez. A C1 indukált gélesedési koncentráció meghatározására szolgáló IG teszt a következõ: A C1 koncentrációt úgy határozzuk meg, hogy találmány szerinti amfifil polimer különbözõ koncentrációit és konstans terápiás fehérjekoncentrációt tartalmazó kolloid készítményeket állítunk elõ. Ebbõl a célból száraz porított polimer növekvõ mennyiségeit ionmentesített vízben oldjuk. Az oldatokat 25 °C¹on tartjuk 16 órán keresztül, mágneses keverés közben, mielõtt összeke-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
vernénk a terápiás fehérje koncentrált oldatával. Ennek a terápiás proteinnek a térfogatát és az oldat koncentrációját úgy állítjuk be, hogy a készítményben a kívánt proteinkoncentrációt kapjuk [például 0,3 mg/ml interferon-alfa 2b]. Az ily módon elõállított kolloid készítményeket koncentrált vizes marhaszérumalbumin (BSA)-oldattal keverjük össze, amely 30 mg/ml tartalmú, majd 15 percig 3000 rpm mellett centrifugáljuk. Az elegyet ezután enyhén keverjük 24 órán keresztül, majd jellemzés céljából kinyerjük. A viszkoelaszticitási értékeket „kúp és tányér” geometriájú AR1000 reométeren mérjük (átmérõ 4 cm, és szög 1,59). A lineáris viszkoelaszticitási doménben elhelyezkedõ 0,01 rad deformációt szinuszosan rátesszük 0,1 és 300 rad/s frekvenciatartományra. A minta hõmérsékletét állandó 20 °C¹on tartjuk Peltier-cella segítségével. A G’ rugalmassági modulus frekvenciaspektrumai és a viszkozitási modulus vagy a G’’ modulusveszteség lehetõvé teszik a Tr jellegzetes relaxációs idõ definiálását, ezt itt annak a frekvenciának a reciprokaként definiáljuk, amelynél a G’ rugalmassági modulus keresztezi a G’’ viszkozitási modulust. Ezen kérdések részletes beszámolója megtalálható Ferry mûvében, melynek címe: Viscoelastic Properties of Polymers, J. D. Ferry, J. Wiley, NY, 1980, és J. REGALADO és társai cikkében: Macromolecules, 1999, 32, 8580. A Tr relaxációs idõ mérése a készítmény polimerkoncentrációjának függvényeként lehetõvé teszi a C1 koncentráció definiálását, amelynél ez a Tr idõ meghaladja az 1 másodpercet. A gélesedési C1 koncentráció értékeinek példái az alábbi 7. példában találhatók. Hasonlóan definiáljuk a C0.1 és C10 koncentrációkat, ahol a relaxációs idõ meghaladja a 0,1, illetve 10 másodpercet. Ezeket a koncentrációkat a következõ növekedõ sorrendben osztályozzuk: C0.1
1
HU 007 737 T2
(blokk-kopolimerek vagy szekvenciált kopolimerek) formájában lehet elosztva. Korlátozás nélkül, egy hidrofób-módosított PO polimert megválaszthatunk amfifil kopoliaminosavak, poliszacharidok (elõnyösen pullulánokat és/vagy kitozánokat és/vagy mukopoliszacharidokat tartalmazó alcsoportból), zselatinok és ezek elegyei közül. A találmány egyik elõnyös változata szerint a PO amfifil kopoliaminosavakból választható. A találmány szerint és a jelen leírásban a „poliaminosav” fogalom mind a 2–20 „aminosav”-egységet tartalmazó oligoaminosavakat, mind a több mint 20 „aminosav”-egységet tartalmazó poliaminosavakat jelenti. A találmány szerinti poliaminosavak elõnyösen oligomerek vagy homopolimerek, amelyek tartalmazhatnak glutaminsav vagy aszparaginsav ismétlõdõ egységeket, vagy ennek a két típusú „aminosav”-egységnek az elegyét tartalmazó kopolimereket. A szóban forgó egységek ezekben a polimerekben D, L vagy D/L konfigurációjú aminosavak, és alfa- vagy gamma-helyzeten keresztül kapcsolódnak a glutamát- vagy glutaminsavegység esetében, és alfa- vagy béta-helyzeten keresztül az aszparaginsav- vagy aszpartátegység esetében. A fõ poliaminosavlánc elõnyös „aminosav”-egységei L¹konfigurációjúak, és alfa típusú kötést tartalmaznak. Az egyik elõnyös találmány szerinti változat szerint a PO polimer aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységekbõl képezett poliaminosav, és ezen egységek közül legalább néhány legalább egy hidrofób HG csoportot tartalmazó ojtásokat hordoz. Ezek a poliaminosavak különösen olyan típusúak, amilyen típus megtalálható a WO–A–00/30618 számú PCT szabadalmi bejelentésben. Egy elsõ lehetõség szerint a készítmény szerinti PO definíciója az (I) általános képlettel definiálható:
5
10
15
20
25
2
– aminalapú kationok, – oligoaminalapú kationok, – poliaminalapú kationok (különösen elõnyös a poletilén-imin), – és aminosavalapú kationok, elõnyösen lizin- vagy argininalapú kationok, – kationos poliaminosavak, elõnyösen polilizin vagy oligolizin; R4 jelentése közvetlen vegyértékvonal vagy 1–4 aminosavegységen alapuló „spacer”; A egymástól függetlenül –CH2– csoport (aszparaginegység) vagy –CH2–CH2– csoport (glutaminegység); n/(n+m) jelentése moláris ojtási arány, és 0,5–100 mol% között változik; n/(n+m) jelentése moláris ojtási arány, és értéke elég alacsony a PO¹hoz vízben oldva pH=7 értéken és 25 °C¹on, PO szubmikronikus részecskék kolloid szuszpenziójának képzésére, n/(n+m) elõnyösen 1–25 mol%, és különösen 1–15 mol%; n+m jelentése polimerizációs fok, és 10¹tõl 1000¹ig és elõnyösen 50¹tõl 300¹ig változik; HG jelentése egy hidrofób csoport. Egy második lehetõség szerint a készítményben levõ PO (II), (III) és (IV) általános képlettel jellemezhetõ:
30
(II) 35
40
(III)
45 (I) ahol R1 jelentése hidrogénatom, 2–10 szénatomos lineáris alkil- vagy 3–10 szénatomos elágazó láncú alkilcsoport, benzilcsoport, terminális aminosavegység vagy –R4-[HG]; 2 R jelentése hidrogénatom, 2–10 szénatomos lineáris acil- vagy elágazó láncú 3–10 szénatomos acilcsoport, piroglutamát vagy –R4-[HG]; 3 R jelentése hidrogénatom vagy kation egység, elõnyösen a következõkbõl megválasztva: – fémkationok, elõnyösen nátrium, kálium, kalcium vagy magnézium közül megválasztva, – szerves kationok, elõnyösen a következõ alcsoportból megválasztva:
(IV) ahol HG jelentése hidrofób csoport; 50 R30 jelentése lineáris 2–6 szénatomos alkilcsoport; R3’ jelentése hidrogénatom vagy kationos egység, elõnyösen a következõkbõl megválasztva: – fémkationok, elõnyösen nátrium, kálium, kalcium vagy magnézium, – szerves kationok, elõnyösen a következõ cso55 portból megválasztva: – aminalapú kationok, – oligoaminalapú kationok, – poliaminalapú kationok (a polietilén-imin különösen elõnyös), 60 8
1
HU 007 737 T2
– és aminosavakon alapuló kationok, elõnyösen lizin- vagy argininalapú kationok, – és kationos poliaminosavak, elõnyösen polilizin vagy oligolizin, R50 jelentése 2–6 szénatomos alkil¹, dialkoxi- vagy diaminocsoport; R4 jelentése vegyértékvonal vagy 1–4 aminosavegységen alapuló „spacer”; A jelentése egymástól függetlenül –CH2– csoport (aszparaginegység) vagy –CH2–CH2– csoport (glutaminegység); n’+m’ vagy n’’ jelentése polimerizációs fok, és 10¹tõl 1000¹ig, elõnyösen 50 és 300 között változhat. A PO HG csoportja elõnyösen egymástól függetlenül lehet az alábbi képletû egyértékû csoport:
5
10
15
20
(GH) ahol R5 jelentése metil (alanin), izopropil (valin), izobutil (leucin), szek-butil (izoleucin) vagy benzil (fenil-alalnin); R6 jelentése 6–30 szénatomos hidrofób csoport; I értéke 0–6. A találmány egyik említésre méltó jellemzõje szerint a PO összes vagy néhány R6 hidrofób csoportja egymástól függetlenül a következõ csoportból lehet megválasztva: – 6–30 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkoxicsoport, amely legalább egy heteroatomot (elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogén- és/vagy kénatomot) és/vagy legalább egy telítetlenségi egységet tartalmaz; – 6–30 szénatomos alkoxicsoport, amely egy vagy több kondenzált karbociklusos gyûrût, és adott esetben legalább egy telítetlenségi egységet és/vagy legalább egy heteroatomot (elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogén- és/vagy kénatomot) tartalmaz; – 7–30 szénatomos alkoxi-aril- vagy aril-oxi-alkilcsoport, és alkalmas arra, hogy legalább egy telítetlenségi egységet és/vagy legalább egy heteroatomot (elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogénés/vagy kénatomot) tartalmazzon. A gyakorlatban és korlátozó jelleg nélkül, a PO ojtásának R6 hidrofób csoportja alkohol prekurzorból származik, amely lehet oktanol, dodekanol, tetradekanol, hexadekanol, oktadekanol, oleil-alkohol, tokoferol és koleszterin. A találmány elsõ változata szerint a poliaminosavak fõ láncait alfa-L-glutamát vagy alfa-L-glutaminsav homopolimerek képezik. Egy második változat szerint a poliaminosavak fõ láncai alfa-L-aszpartát vagy alfa-L-aszparaginsav homopolimerek.
25
30
2
A találmány egy harmadik változata szerint a poliaminosavak fõ láncai alfa-L-aszpartát/alfa-L-glutamát vagy alfa-L-aszparaginsav/alfa-L-glutaminsav kopolimerek. Elõnyösen, a PO fõ poliaminosav láncának aszparaginsav- és/vagy glutaminsavegységeinek eloszlása olyan, hogy a kapott polimer vagy random, vagy blokk típusú, vagy multiblokk típusú. A találmány szerinti készítményben használt PO molekulatömege elõnyösen 2000 és 100 000 g/mol közötti, és elõnyösen 5000 és 40 000 g/mol közötti. Egy elsõ megvalósítási forma szerint a készítményben a PO ojtásának R6 hidrofób csoportja tokoferolból képzett alkohol prekurzorból származik, és: – 1%£[n/(n+m)]×100£10%, – elõnyösen 3,5%£[n/(n+m)]×100£7,5%, – n+m 100 és 400 között, elõnyösen 120 és 300 között változik. A készítmény egy második változata szerint a PO ojtásának egy R6 hidrofób csoportja koleszterinbõl képzett alkohol prekurzorból származik, és: – 1%£[n/(n+m)]×100£10%, – elõnyösen 3,5%£[n/(n+m)]×100£6,5%, – n+m 100 és 400 között, elõnyösen 120 és 300 között változik. A találmány szerinti készítmény mindkét említett elõnyös változatában a PO polimer koncentrációja elõnyösen 15 és 50 mg/ml között van. Az egyik változat szerint a találmány szerinti készítmény PO¹ja legalább egy polialkilén típusú ojtást hordoz, amely glutamát- és/vagy aszpartátegységhez kötõdik. Ez az ojtás elõnyösen polialkilénglikol típusú, és az (V) képlettel jellemezhetõ:
35
40
45
50
55
60 9
(V) ahol R’4 jelentése vegyértékvonal vagy 1–4 aminosavegységen alapuló „spacer”; X jelentése heteroatom, amely lehet oxigén¹, nitrogén- és kénatomból megválasztott; R7 és R8 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy egyenes láncú 1–4 szénatomos alkilcsoport; n’’’ értéke 10 és 1000 között, és elõnyösen 50 és 300 között változik. A gyakorlatban a polialkilénglikol például polietilénglikol. A találmány szerint kívánatos, hogy a polialkilénglikol ojtás mólszázaléka 1–30% között legyen. A PO poliaminosavak rendkívül értékesek abból a szempontból is, hogy egy állítható ojtási sebességgel pH=7,4 értéken vízben (pl. foszfátpufferrel együtt) kolloid szuszpenzió képzése közben diszpergálódnak. Ezenkívül az interferon hatóanyagok vagy egyéb, proteinekbõl, peptidekbõl és kis molekulákból megvá-
1
HU 007 737 T2
lasztott AP¹k spontán asszociálódnak az ezen PO aminosavakat tartalmazó nanorészecskékkel. Magától értetõdik, hogy a poliaminosavakon alapuló PO¹k karboxilcsoportokat tartalmaznak, amelyek vagy semlegesek (COOH forma) vagy ionizáltak (COO–-anion), a pH¹tól és a készítménytõl függõen. Ezért a vizes fázisban való oldékonyság közvetlenül függ a PO¹ban levõ szabad karboxilcsoportok arányától (a hidrofób egységgel nincs ojtva), és a pH¹tól. Vizes oldatban az ellenkation lehet egy fémkation, pl. nátrium, kalcium vagy magnézium, vagy egy szerves kation, pl. trietanol-amin, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán vagy egy poliaminszerû polietilén-imin. A találmány szerinti készítményben alkalmazható poliaminosav típusú PO¹t elõállíthatjuk például a szakember számára ismert módszerekkel. Random poliaminosavakat kaphatunk a hidrofób ojtás ojtásával, amelyet elõzõleg „spacer”-rel funkcionalizáltunk, közvetlenül a polimerre, ismert kapcsolási reakció segítségével. A PO blokk vagy multiblokk poliaminosavakat a megfelelõ aminosav-N-karboxianhidridek (NCA) szekvenciális polimerizációjával állíthatjuk elõ. Például egy homopoliglutamátot vagy egy homopoliaszpartát-poliaminosavat vagy egy blokk, multiblokk vagy random glutamát/aszpartát kopolimert ismert módon állíthatunk elõ. Az alfa típusú poliaminosav elõállítására a legismertebb módszer aminosav-N-karboxianhidridek (NCA) polimerizációján alapul, ez a módszer megtalálható például a „Biopolymers”, 1976, 15, 1869 cikkben, és H. R. Kricheldorf következõ címû munkájában: „Alpha-amino acid N¹carboxy anhydride and related heterocycles”, Springer Verlag (1987). Az NCA-származékok elõnyösen NCA-O¹Me, NCA-O¹Et vagy NCAO¹Bz származékok (Me=metil, Et=etil és Bz=benzil). Ezután a polimereket megfelelõ körülmények között hidrolizáljuk, és így sav formájában kapjuk a polimert. Ezek a módszerek a bejelentõ FR–A–2 801 226 számú szabadalmi bejelentésének leírásán alapulnak. A találmány szerint alkalmazható számos polimer, például a poli(alfa-L-aszparaginsav), poli(alfa-L-glutaminsav), poli(alfa-D-glutaminsav) és poli(gamma-L-glutaminsav) típusú, különbözõ molekulatömegû polimerek a kereskedelemben hozzáférhetõk. Az alfa-béta típusú poliaszparaginsavat aszparaginsav kondenzációjával állíthatjuk elõ, és így egy poliszukcinimidet kapunk, amelyet ezt követõen bázikusan hidrolizálunk (Tomida és társai, Polymer, 1997, 38, 4733–36). Az ojtást összekapcsoljuk a polimer savcsoportjával, ezt könnyen végrehajthatjuk úgy, hogy poliaminosavat reagáltatunk karbodiimid kapcsolószer jelenlétében, és adott esetben egy katalizátor, pl. 4¹dimetilamino-piridin jelenlétében, megfelelõ oldószerben, pl. dimetil-formamidban (DMF), N¹metil-pirrolidonban (NMP) vagy dimetil-szulfoxidban (DMSO). A karbodiimid például diciklohexil-karbodiimid vagy diizopropilkarbodiimid. Az ojtási sebességet kémiailag szabályozzuk az alkotórészek sztöchiometriájával, és a reagensekkel vagy a reakcióidõvel. A „spacer”-rel funkcionalizált hidrofób graftokat szokásos peptidkapcsolási vagy
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
közvetlen kondenzálási módszerrel kapjuk, savas katalizálással. Ezek a módszerek a szakember számára jól ismertek. Egy blokk- vagy multiblokk-kopolimert elõzetesen hidrofób grafttal szintetizált NCA származékok felhasználásával szintetizálunk. A hidrofób NCA származékot például NCA-O-benzillel kopolimerizáljuk, és a benzilcsoportokat ezután szelektíven hidrolízissel távolítjuk el. A PO poliaminosavak szintézise elõnyösen PO nanorészecskék vizes szuszpenzióit eredményezi. Az ilyen szuszpenziókat porított PO nanorészecskékké lehet átalakítani szakember számára ismert megfelelõ szárítással, például melegítéssel (kemence stb.), evakuálással, szárítószerek alkalmazásával, liofilizálással vagy porítással. Ezek a PO nanorészecskék szuszpenzióban vagy porszerû állapotban képezik a találmány szerinti készítmények elõállításához a kiindulási anyagot. Ezen a ponton azt lehet mondani, hogy a találmány szerinti készítmények legalább egy PO¹n és legalább egy AP¹n alapuló nanorészecskék nem kovalens asszociációjából erednek, vizes, folyékony közegben. Az elõállításhoz a PO és/vagy az interferon(ok) (és/vagy bármilyen további AP) szilárd formában (elõnyösen por formájában), és/vagy folyékony formában (elõnyösen kolloid vizes szuszpenzió formájában) lehetnek jelen. A jelen leírás vonatkozásában az interferon(ok)/PO asszociáció azt jelenti, hogy az interferon(ok) polimer PO¹val kapcsolódnak [pl. egy vagy több poliaminosavval], egy vagy több, kovalens kémiai kötéstõl vagy kovalens kémiai kötésektõl eltérõ kötéssel. Az egy vagy több interferon és a találmány szerinti PO asszociációjának módszere megtalálható különösen a WO–A–00/30618 számú szabadalmi bejelentésben. Ez abból áll, hogy legalább egy interferont (és egy vagy több lehetséges hatóanyagot) PO nanorészecskéket tartalmazó folyékony közegbe iktatunk, és így kolloid nanorészecskeszuszpenziót kapunk, amely telítve van egy vagy több interferonnal (és egy vagy több lehetséges más hatóanyaggal). A találmány tárgya továbbá eljárás a fent említett készítmény elõállítására. Egy elsõ elõnyös kivitelezési mód szerint ezt az eljárást a következõ lépések jellemzik: – legalább egy PO nanorészcskékbõl álló kolloid szuszpenziót veszünk, – ezt a PO nanorészecskékbõl álló kolloid szuszpenziót összekeverjük legalább egy interferonnal (és egy vagy több egyéb lehetséges hatóanyaggal), elõnyösen vizes oldatban, – adott esetben hozzáadunk legalább egy segédanyagot, – a pH¹t és/vagy az ozmolaritást szükség szerint beállítjuk, és – adott esetben a kapott szuszpenziót leszûrjük. Az interferon (egy az egy vagy több egyéb lehetséges hatóanyag) elõnyösen vizes szuszpenzió vagy oldat formájában van jelen a PO kolloid nanorészecskeszuszpenzióhoz történõ összekeveréshez.
1
HU 007 737 T2
A találmány egy másik kivitelezési módja szerint ezt az eljárást lényegében az jellemzi, hogy: – veszünk legalább egy PO polimerport, – ezt a port összekeverjük legalább egy interferon (és egy vagy több egyéb lehetséges hatóanyag) vizes szuszpenziójával vagy oldatával, elõnyösen vizes oldatban, – adott esetben hozzáadunk legalább egy segédanyagot, – a pH¹t és/vagy az ozmolaritást szükség esetén beállítjuk, és – adott esetben a kapott szuszpenziót leszûrjük. Az ily módon kapott készítményeket átalakíthatjuk gélekké, porrá vagy filmmé a szakember számára ismert módon, például diaszûréssel vagy bepárlással koncentrálva, bevonással, porlasztással vagy liofilizálással. Ezeket a módszereket adott esetben kombinálhatjuk. Létezik egy harmadik kivitelezési mód is a találmány szerinti folyékony készítmények elõállítására, és a harmadik mód lényegében a következõ lépésekbõl áll: – a találmány szerinti fent definiált folyékony készítményt szárítva egy port kapunk, – ezt összekeverjük vizes folyékony közegben, elõnyösen keverés közben, – adott esetben legalább egy segédanyagot adunk hozzá, – szükség esetén a pH¹t és az ozmolaritást beállítjuk, és – adott esetben a kapott szuszpenziót leszûrjük. Segédanyagként például adagolhatunk antimikrobiális szereket, puffereket, antioxidánsokat és az izotonicitást beállító szereket, melyek a szakember számára ismertek. Irodalomként utalunk például a következõ mûre: Injectable Drug Development, P. K. Gupta és társai, Itnerpharm Press, Denver, Colorado, 1999. Szükség esetén a folyékony készítményt például 0,2 mm porozitású szûrõkön történõ szûréssel sterilizálhatjuk. Közvetlenül is befecskendezhetjük a páciensnek. A találmány szerinti folyékony készítmények elõállításának valamennyi említett példáját elõnyösen atmoszferikus nyomáson és szobahõmérsékleten (pl. 25 °C¹on) hajtjuk végre. Az egyik találmány szerinti értékes készítmény esetében a szubmikronikus részecskékkel (nem asszociált interleukinnal/interleukinokkal) nem asszociált interferon(ok) tömegaránya százalékosan a következõ: – [nem asszociált interferon(ok)]£1, – elõnyösen [nem asszociált interferon(ok)]£0,5. A találmány szerint az elõnyös interferon az interferon-alfa. Egy másik változat szerint a találmány kiterjed bármilyen találmány szerinti, fent definiált folyékony készítménybõl kapott termék származékaira is, amelyek PO/interferon fent definiált, nem kovalens asszociációkból képezett szubmikronikus részecskéket tartalmaznak. A gyakorlatban ezek a származékok fõleg porok, gélek, implantátumok vagy filmek lehetnek. A találmány továbbá kiterjed a fent definiált folyékony készítmény bármilyen prekurzorára is.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
A termékszármazékokkal kapcsolatban még hangsúlyozni kell, hogy a találmány kiterjed egy eljárásra is a fent definiált készítménybõl származó por elõállítására, és ez az eljárás úgy jellemezhetõ, hogy a port a fent definiált készítmény szárításával kapjuk. A találmány szerinti készítmény elõnyösen gyógyszerkészítmény, anélkül hogy kizárnánk a kozmetikai, dietetikus vagy fitoszaniter készítményeket, amelyek legalább egy fent definiált PO¹t, legalább egy interferont és adott esetben legalább egy további hatóanyagot tartalmaznak. A találmány szerint az interferontól eltérõ lehetséges további hatóanyag lehet fehérje, glikoprotein, egy vagy több polialkilénglikol-lánchoz kapcsolt protein [elõnyösen polietilénglikol (PEG)-láncok: „PEGilezett fehérje”], poliszacharid, liposzacharid, oligonukleotid, polinukleotid vagy peptid. Ezt a további hatóanyagot választhatjuk hemoglobinokból, citokrómokból, albuminokból, interferonokból, citokinekbõl, antigénekbõl, antitestekbõl, eritropoietinbõl, inzulinból, növekedési hormonokból, VIII és IX faktorokból, haemopoiesisstimuláló faktorokból és ezek elegyeibõl. Az egyik változat szerint ez a további hatóanyag egy „kis” hidrofób, hidrofil vagy amfifil szerves molekula, pl. peptid, pl. leuprolid vagy ciklosporin, vagy kis molekula, pl. az antraciklin, taxoid vagy kamptotecin családokhoz tartozó molekulák vagy ezek elegyei. A találmány szerinti készítmény primer tulajdonságaihoz tartozik az injektálhatóság és az injekció helyén üledékképzõ képesség in vivo, a nanorészecskék gélesedésével vagy aggregációjával fiziológiai proteinek vagy analógok jelenlétében. A találmány szerinti készítményt különösen parenterálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan vagy intracerebrális úton injektálhatjuk, vagy egy tumorba. A találmány szerinti készítményt adagolhatjuk orálisan, nazálisan, vaginálisan, okulárisan vagy bukkálisan is. A készítményt elõnyösen gyógyszerek elõállítására használhatjuk, különösen parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intradermális, intraperitoneális vagy intracerebrális úton történõ adagolásra, vagy egy tumorba történõ adagolásra, vagy orálisan, nazálisan, vaginálisan vagy okulárisan. Bár a találmány szerinti készítmény elõnyösen gyógyszerkészítmény, ez nem zárja ki a kozmetikumokat, dietetikumokat vagy fitoszaniter készítményeket, amelyek legalább egy fent definiált PO¹t és legalább egy megfelelõ hatóanyagot tartalmaznak. Egy további változat szerint a találmány kiterjed a gyógyszerek elõállítására, különösen parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intradermális, intraperitoneális vagy intracerebrális úton vagy egy tumorba történõ adagolásra, vagy orális, nazális, vaginális vagy okuláris úton történõ adagolásra, azzal jellemezve, hogy lényegében abból áll, hogy legalább egy fent definiált készítményt és/vagy abból származó terméket és/vagy a készítmény prekurzorát alkalmazzuk.
1
HU 007 737 T2
A találmány további részleteit és elõnyeit és változatait az alábbi példákban mutatjuk be, melyek leírják a hidrofób csoporttal ojtott poliaminosavakból képzett PO szintézisét, ennek átalakítását az interferon prolongált felszabadulását szolgáló rendszerré, mégpedig egy olyan találmány szerinti készítménnyé, amely stabil vizes kolloid szuszpenzió, és bemutatjuk a rendszer azon képességét, hogy nemcsak asszociál egy interferonnal, hanem különösen gélesedik, térhálósodik, hogy az interferonok in vivo igen hosszan szabaduljanak fel. Az ábrák leírása 1. ábra: Plazma IFN-koncentrációk görbéi (pikogramm/ml), amelyet kutyán regisztráltak az alábbi készítmény szubkután injektálása után: – a találmány szerinti (A) IFN-készítmény (9. és 10. példa): görbe – – –, – és nem a találmány szerinti (D) kontroll IFN-készítmény (10. példa): görbe – – –, T idõ függvényében órában kifejezve, és 60 mg/kg IFN dózis mellett.
5
10
15
20
2
10 000 Da, és amelyet NCAGluOMe polimerizációjával, majd hidrolízissel állítunk elõ az FR–A–2 801 226v számú szabadalmi bejelentés szerint) 92 ml dimetilformamidban (DMF) szolubilizálunk oly módon, hogy 40 °C¹on 2 órát melegítjük. Amint a polimer szolubilizálódik, a hõmérsékletet hagyjuk leesni 25 °C¹ra, és egymás után hozzáadunk 6 ml DMF-ben elõzetesen szolubilizált 1,49 g D,L-alfa-tokoferolt (>98%, Fluka®tól beszerezve), valamint 6 ml DMF-ben elõzetesen szolubilizált 0,09 g 4¹dimetil-amino-piridint és elõzetesen 6 ml DMF-ben szolubilizált 0,57 g diizopropil-karbodiimidet. 25 °C¹on 8 órás keverés után a reakcióközeget 15% nátrium-kloridot és sósavat tartalmazó 800 ml vízbe öntjük (pH=2). A kicsapódott polimert ezután szûréssel kinyerjük, és 0,1N sósavval, majd vízzel mossuk. A polimert ezt követõen 75 ml DMFben újra szolubilizáljuk, majd, mint fent, sót és savat tartalmazó vízbõl újra kicsapjuk pH=2¹ig. Kétszer mossuk vízzel, a csapadékot többször mossuk diizopropiléterrel. Ezután a polimert egy kemencében vákuumban szárítjuk 40 °C¹on, és így 85%¹os termelést kapunk.
Példák 1. példa: P1 amfifil polimer Szintetikus eredetû alfa-tokoferollal ojtott poliglutamát szintézise 5,5 g alfa-L-poliglutamátot (melynek molekulatömege a polioxi-etilén standardhoz viszonyítva kb.
25
2. példa: P2, P3, P4, P5 és P6 amfifil polimerek Ezeket a polimereket ugyanúgy kapjuk, ahogy a P1 polimert. Az 1. táblázat az alábbiakban ezen polimerek jellemzõit összegzi. A P1 polimer jellemzõit összehasonlításként adjuk meg.
1. táblázat Polimer
Poliglutamát Mn1 g/mol
Hidrofób csoport
Ojtás % (NMR)2
Polimer Mn1 g/mol
P1
10 000
alfa-tokoferol3
7
13 900
P2
10 000
alfa-tokoferol3
4
14 400
P3
16 900
alfa-tokoferol3
4
15 200
P4
10 000
koleszterin
5
11 500
P5
16 900
koleszterin
5
12 900
P6
10 000
n-dodekanol
15
11 500
1
polioxi-etilén ekvivalensekben proton NMR-rel megbecsült moláris ojtási sebesség 3 szintetikus eredetû 2
3. példa: P6 polimeren alapuló, 30 ml interferonalfa 2b (IFN) készítmény elõállítása (a) Amfifil polimer kolloid oldatának elõállítása Egy lombikba helyezünk 1,5 g, 2. példa szerinti P6 amfifil poliaminosav liofilizált port. Ezt a port 30 ml 50 steril injekciós vízben feloldjuk. A polimer oldatot 16 órán keresztül 35 °C¹on tartjuk mágneses keverés közben. Az oldat ozmolaritását 275±20 mOsmol¹ra állítjuk be Fiske Mark 3 ozmométer segítségével úgy, hogy az 5,13 mol, 30 tömeg%¹os szükséges vizes nát- 55 rium-klorid-oldatot bevezetjük. A pH¹t szükség esetén 7,4±0,2¹re állítjuk 1 N nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával. A polimer koncentrációját steril 0,15 M vizes nátrium-klorid-oldat hozzáadásával 45 mg/ml¹re állítjuk. Ezt követõen a polimer oldatot leszûrjük egy 0,8 és 60 12
0,2 mikron közötti pórusméretû szûrõn, majd 4 °C¹on tároljuk. (b) A protein polimerrel képezett asszociációja A fenti polimer P6 kolloid oldatból 26,65 ml¹t és 1,85 ml IFN oldatot (PC GEN; 2,42 mg/ml¹t tartalmazó koncentrált oldat) összekeverünk egy üveglombikban. Az ozmolaritást és a pH¹t ismét beállítjuk 300±20 mOsmol¹ra és 7,4±0,2¹re, szükség esetén 0,1 N nátriumhidroxid-oldat és steril 0,9%¹os nátrium-klorid hozzáadásával. A proteinnel töltött oldatot 5 óráig érleljük 25 °C¹on egy kemencében, majd 0,8–0,2 mikron szûrõn leszûrjük. Ennek során 0,15 mg/ml IFN¹t és 40 mlg/ml P6 polimert tartalmazó, injektálásra kész készítményt kapunk 30 ml mennyiségben.
1
HU 007 737 T2
4. példa: P1–P5 polimerek egyikén alapuló, találmány szerinti, hosszan ható interferon (IFN)készítmény elõállítása A készítményt a 3. példa szerint állítjuk elõ, elõször elõállítunk a kívánt végsõ koncentráció 1,25-szorosában egy kolloid polimer oldatot, majd ezt az oldatot 2,42 mg/ml¹t tartalmazó koncentrált interferonoldattal keverjük össze. A proteinoldat térfogatát úgy határozzuk meg, hogy megválasztjuk a polimerkoncentráció proteinkoncentrációhoz viszonyított célzott arányát. A 3. példához hasonlóan, a koncentráció és a pH beállítása nátrium-klorid-oldat és nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával történik. 5. példa: Különbözõ, találmány szerinti PO polimerek nanorészecskéinek átlagos hidrodinamikai átmérõ mérése A találmány szerinti PO polimerrészecskéinek átlagos hidrodinamikai átmérõjét az alább definiált Md módszerrel mérjük. A PO oldatokat 1 vagy 2 mg/ml koncentrációban állítjuk elõ 0,15 mol nátrium-klorid közegben, és 24 órát keverjük. Ezután leszûrjük ezeket az oldatokat egy 0,8–0,2 mm¹es szûrõn, mielõtt dinamikus fényforrással analizálnánk Brookhaven-féle készüléken, amely 488 nm hullámhosszú, vertikálisan polarizált lézersugárral mûködik. A PO polimer nanorészecskéinek hidrodinamikus átmérõjét az elektromos mezõ autokorrelációs funkciójából számítjuk ki összegzéses módszerrel, lásd: „Surfactant Science Series” 22. kötet, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, 3. fejezet, M. Dekker, 1984. A 2. példa szerinti PO, P2, P3, P4 és P6 polimerekre a következõ eredményeket kapjuk:
5
10
15
20
25
30
35
2. táblázat Polimer
Átlagos hidrodinamikai átmérõ (nm)
P2
60
P3
90
P4
30
P6
15
40
45
2
6. példa: Protein és PO polimer nanorészecskék spontán asszociációja Egy 25 mmol¹os foszfátpufferoldatot állítunk elõ porított NaH2PO4-bõl (Sigma ref. S¹0751), és 1 N nátriumhidroxid-oldattal pH=7,2¹re állítjuk (SDS ref. 3470015). P1 polimer nanorészecskék kolloid szuszpenzióját állítjuk elõ úgy, hogy éjjel a fenti foszfátpufferoldatban feloldunk 5 mg/ml liofilizált polimert. Egy BSA (Sigma A¹2934) törzsoldatot állítunk elõ úgy, hogy feloldunk 10 mg/ml proteint 2 órán keresztül ugyanebben a pufferban. A törzsoldatokat és a puffert egy 0,22 mm szûrõn leszûrjük. Elegyeket állítunk elõ úgy, hogy a két törzsoldat elõre meghatározott térfogatait hozzáadjuk, és a foszfátpufferban hígítjuk, majd végül állandó polimerkoncentrációjú (0,1 mg/ml) minták egy skáláját adjuk hozzá, és a proteinkoncentrációkat 0¹tól 1,8 mg/ml¹re növeljük. A mintákat hagyjuk 5 órán keresztül 25 °C¹on asszociálódni, majd kapilláris elektroforézissel analizáljuk, egy úgynevezett frontális módszer segítségével, amely lehetõvé teszi, hogy a fehérjét és a fehérje-polimer komplexet külön vizualizáljuk. A módszer további részleteit megtalálhatjuk a következõ cikkben: Gao J. Y., Dublin P. L., Muhoberac B. B., Anal. Chem., 1997, 69, 2945. Az analíziseket Agilent G16000A készüléken végezzük, amely fel van szerelve egy ömlesztett szilícium-dioxid buborék kapillárissal (G1600–62–232 típus). A szabad proteinnel megfelelõ elsõ szint magassága lehetõvé teszi a nem asszociált BSA koncentrációjának meghatározását. A tapasztalat azt mutatja, hogy 0,1 g protein/g polimer alatti proteinmennyiségeknél a protein asszociálódik a polimer nanorészecskékkel. 7. példa: C1 gélesedési koncentrációjának meghatározása a PO P1–P4 és P6 polimerek vonatkozásában Az IG tesztet alkalmazzuk az 1. és 2. példában szereplõ P1–P6 polimerekkel asszociált IFN-készítményekre. Ezeknek a készítményeknek a proteinkoncentrációit az alábbi táblázatban mutatjuk be. A készítmények BSA jelenlétében (30 mg/ml koncentráció) mutatott relaxációs idejét az IG teszt szerinti eljárással mérjük. A C1 kritikus koncentrációját, amelynél a relaxációs idõ meghaladja az 1 másodpercet, az IFN¹re vonatkozó 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat IFN-készítmények indukált gélesedési koncentrációja Polimer
IFN-koncentráció (mg/ml) C1 koncentráció (mg/ml)
P1
0,3 17
P2
0,15 >30
55 8. példa: A találmány szerinti kiválasztáshoz tartozó IFN-készítmény szubkután injektálása után a kutyán mért IFN farmakokinetika 0,3 mg/ml koncentrációjú (A) IFN-készítményt és 30 mg koncentrációjú P1 amfifil polimert állítunk elõ a 4. példában leírt eljárással. 60 13
P3
0,15 16
P4
0,15 17
P6
0,3 >50
Ezt a készítményt szubkután injektáljuk beagle kutyákba (n=3) 60 mg/kg dózisban. Szérummintákat veszünk az 1., 5., 11., 24., 36., 48., 72., 96., 120., 14., 168. és 240. órában. A plazma IFN-koncentrációt ezeken a mintákon ELISA-val mérjük (Immunotech IM 3193 kit).
1
HU 007 737 T2
Így kapjuk az 1. ábrán látható átlagos plazmakoncentráció profilt, ami világosan mutatja a protein prolongált felszabadulását a szérumba a nem találmány szerinti (D) kontrollkészítménnyel, 0,3 mg/ml IFN-nel és 40 mg/ml P6 amfifil polimerrel összevetve (lásd 4. táblázat, 9. példa). Kvantitatív szempontból az IFN meghosszabbított felszabadulását a találmány szerinti készítmények segítségével, a következõ méréssel becsüljük meg. (a) Tmax az a medián idõ, amelynél a plazmakoncentráció a maximumot éri el, (b) T50 idõ, amely az az átlagos idõ, amely után a plazmakoncentrációs görbe alatti terület eléri a mért maximális értéke 50%¹át. Ennek a készítménynek az esetében a Tmax és T50 idõk a következõk: Tmax=48 óra, T50=54,2 óra. 9. példa: Amfifil poliaminosavakon alapuló különbözõ IFN-készítmények szubkután injekciója utáni IFN farmakokinetika kutyán A 4. példában leírt eljárással a következõ készítményeket állítjuk elõ:
Polimer
Polimerkoncentráció (mg/ml)
IFN-koncentráció (mg/ml)
Relaxációs idõ Tr (s)
Q
P1
30
0,3
>10
B
P1
10,5
0,15
>10
C
P2
15
0,15
<0,03
D
P6
40
0,3
0,4
Az A készítmény polimerkoncentrációja nagyobb, mint a 7. példában mért C1 gélesedõ koncentráció. Más szóval, az IG tesztben mért relaxációs idõ több mint 1 másodperc. Ezért ez az A készítmény a találmány szerinti szelekcióhoz tartozik. Másrészt, a B, C és D készítmények koncentrációi kisebbek, mint gélesedési koncentrációik, ezért ezek a készítmények nem tartoznak a találmány szerinti szelekcióhoz. Ezeket a készítményeket 60 mg/kg dózisban injektáljuk be beagle kutyákba. A plazmamintákat 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 és 240 óra múlva vesszük. A plazma IFN-koncentrációt az elõzõ példában leírt módon mérjük. Az A, B, C és D készítmények Tmax és T50 ideje az 5. táblázatban látható:
15
20
30
35
40
45
50
5. táblázat 55 Készítményreferencia
Tmax (h)
T50 (h)
A
48
54,2
B
5
16,7
Készítményreferencia
Tmax (h)
T50 (h)
C
11
19,3
D
5
17,3
Így az A készítmény a találmány szerinti szelekcióhoz tartozik, és sokkal hosszabb a felszabadulási ideje, mint a B, C és D készítményeknek, melyek nem tartoz10 nak a találmány szerinti szelekcióhoz.
25
4. táblázat Készítmény
5
2
60 14
10. példa: In vivo szubkután injekciót követõen a találmány szerinti készítmények gélesedésének megfigyelése A találmány szerinti készítmények szubkután viselkedését házi sertésen tanulmányoztuk. Hat házi sertést beoltottunk a hasi bõr alatt 4 mm mélységben, 0,3 ml alábbi készítményekkel: A készítmény: 2. példa szerinti P6 polimer izotóniás vizes oldata, pH=7,3, koncentráció 45 mg/ml. B készítmény: 1. példa szerinti P1 polimer izotóniás vizes oldata, pH=7,3, koncentráció 20 mg/ml. Az adagolás után 72 órával a befecskendezett helyekrõl mintákat vettünk. A hisztológiai vizsgálat a B készítmény esetében a polimer gélesedett üledékének jelenlétét mutatja. Ennek formája egyenletes színû plakkok. Ezzel ellentétben, ez a jelenség nem figyelhetõ meg az A készítménynél, amely esetében a polimer beszûrõdött a kollagén rostok közé. Hangsúlyozhatjuk, hogy a B polimer mátrix teljesen biodegradálható, minthogy a szövet teljesen visszatért 21 nap múlva a normális állapotába.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Folyékony gyógyászati készítmény interferon(ok) nyújtott felszabadulására, ahol ez a készítmény tartalmaz legalább egy interferont, adott esetben legalább egy másik hatóanyagot, elõnyösen vizes oldatban, és hidrofób (GH) csoportokat hordozó, biodegradálható, vízoldékony, szubmikronikus (PO) polimerrészecskéken alapuló, alacsony viszkozitású, vizes, kolloid szuszpenziót, ahol a részecskék nem kovalens módon kötõdnek az interferonhoz, és adott esetben az említett másik hatóanyaghoz, azzal jellemezve, hogy – a szuszpenzió diszperzív közege lényegében vízbõl áll, – ennek [PO] koncentrációját elég magas értékre állítjuk be ahhoz, hogy a gyógyszerkészítményt parenterálisan injektálhassuk, és ezt követõen in vivo géles üledéket képezzen, és ennek a géles üledéknek a képzõdését: – egyrészt részben legalább egy in vivo jelen levõ fiziológiás fehérje hozza létre, – és másrészt ez teszi lehetõvé az interferon in vivo felszabadulásának tartósságát, és adott esetben a hatóanyag nyújtott és szabályozott, az adagolást követõen 24 órán túl terjedõ hatását,
1
HU 007 737 T2
– és hogy folyékony az injekció körülményei között, – és hogy folyékony fiziológiai hõmérsékleten és/vagy pH¹értéken is, és/vagy – a fiziológiai koncentrációban jelen levõ fiziológiai elektrolit jelenlétében, – és/vagy legalább egy felületaktív anyag jelenlétében. 2. Folyékony gyógyszerkészítmény interferon(ok) és adott esetben más hatóanyag(ok) hosszan tartó felszabadulására, ez a készítmény: – atmoszferikus nyomáson cseppfolyós halmazállapotú, – fiziológiai hõmérsékleten és/vagy pH¹értéken is folyékony, és/vagy – fiziológiai koncentrációban jelen levõ fiziológiai elektrolit jelenlétében, – és/vagy legalább egy felületaktív anyag jelenlétében, – és tartalmaz legalább egy interferont, adott esetben legalább egy további hatóanyagot, elõnyösen vizes oldatban, és egy hidrofób csoportokat (GH) hordozó, biodegradálható, vízoldékony, szubmikronikus PO polimerrészecskéken alapuló, alacsony viszkozitású, vizes, kolloid szuszpenziót, ahol a részecskék nem kovalens módon kötõdnek az interferonhoz és adott esetben az említett hatóanyaghoz, és a szuszpenzió diszperzív közege lényegében vízbõl áll, azzal jellemezve, hogy [PO] koncentrációját elég magas értékre állítjuk be ahhoz, hogy lehetõvé tegye a gélesedett üledék in vitro képzõdését legalább egy fehérje jelenlétében. 3. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a [PO] koncentrációja olyan, hogy: – [PO]³0,9 C1, – elõnyösen 20C1³[PO]³C1, – és még elõnyösebben 10.C1³[PO]³C1, ahol a C1 a PO részecskék „indukált gélesedési” koncentrációját jelenti IG teszttel mérve. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a módosított PO hidrofób polimereket a következõ csoportból választjuk meg: poliaminosavak, poliszacharidok – elõnyösen pullulánokat és/vagy kitozánokat és/vagy mukopoliszacharidokat tartalmazó alcsoportból –, továbbá zselatinok vagy ezek elegyei. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a (GH) hidrofób csoportok a lánchoz képest laterálisan helyezkednek el. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO polimer aszparaginsavegységekbõl és/vagy glutaminsavegységekbõl képzett poliaminosav, és legalább néhány ilyen egység legalább egy hidrofób csoportot (GH) tartalmazó graftokat hordoz. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy (PO)¹k a következõ (I) általános képlettel jellemezhetõ(k):
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
(I) ahol R1 jelentése hidrogénatom, egyenes szénláncú 2–10 szénatomos vagy elágazó szénláncú 3–10 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, terminális aminosavegység vagy –R4-[GH]; 2 R jelentése hidrogénatom, egyenes szénláncú 2–10 szénatomos vagy elágazó láncú 3–10 szénatomos acilcsoport, piroglutamát vagy –R4-[GH]; R3 jelentése hidrogénatom vagy kationos egység, elõnyösen: – fémkation, amely elõnyösen lehet nátrium, kálium, kalcium vagy magnézium, – szerves kation, elõnyösen: – aminalapú kation, – oligoaminalapú kation, – poliaminalapú kation (különösen elõnyös a polietilén-imin), – aminosav(ak)on alapuló, elõnyösen lizin- vagy argininalapú kation, – vagy kationos poliaminosav, elõnyösen polilizin vagy oligolizin; R4 jelentése vegyértékvonal vagy 1–4 aminosavegységet tartalmazó „spacer”; A jelentése egymástól függetlenül –CH2– (aszparaginsavegység) vagy –CH2–CH2– (glutaminsavegység); n/(n+m) jelentése moláros ojtási arány, és változhat 0,5-tõl 100 mol%¹ig; n/(n+m) jelentése moláros ojtási arány, és értéke elég alacsony ahhoz, hogy a vízben szolubilizált PO pH=7 értéken és 25 °C¹on szubmikronikus PO részecskék kolloid szuszpenzióját képezi, elõnyösen n/(n+m) 1–25 mol%, és még elõnyösebben 1 és 15 mol% között van; n+m 10-tõl 1000¹ig, elõnyösen 50¹tõl 300¹ig változik; GH jelentése hidrofób csoport. 8. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a (PO)¹k megfelel(nek) a (II), (III) és (IV) képletek valamelyikének:
50
(II) 55
60 15
(III)
1
HU 007 737 T2
5 (IV) ahol GH jelentése hidrofób csoport; R30 jelentése egyenes szénláncú 2–6 szénatomos alkilcsoport; R3 jelentése hidrogénatom vagy kationos egység, elõnyösen a következõ csoportból: – fémkationok, elõnyösen nátrium, kálium, kalcium, magnézium, – szerves kationok, elõnyösen: – aminalapú kationok, – oligoaminalapú kationok, – poliaminalapú kationok (különösen elõnyös a polietilén-imin), – aminosav(ak)on alapuló kationok, elõnyösen lizin- vagy argininalapú kationok, – vagy kationos poliaminosavak, elõnyösen polilizinbõl vagy oligolizinbõl választva; R50 jelentése 2–6 szénatomos alkil¹, dialkoxi- vagy diamincsoport; R4 jelentése vegyértékvonal vagy 1–4 aminosavegységet tartalmazó „spacer”; A jelentése egymástól függetlenül –CH2– (aszparaginsavegység) vagy –CH2–CH2– (glutaminsavegység); n’+m’ vagy n’’ jelentése a polimerizációfok, és változhat 10¹tõl 1000¹ig, elõnyösen 50¹tõl 300¹ig. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény, amelyet az jellemez, hogy a PO GH csoportjai egymástól függetlenül az alábbi képletû egyértékû csoportot jelentik:
10
15
20
25
30
35
40
(GH) ahol R5 jelentése metil (alanin), izopropil (valin), izobutil (leucin), szek-butil (izoleucin), benzil (fenil-alanin); R6 jelentése 6–30 szénatomos hidrofób csoport; I értéke 0–6 közötti egész szám. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO R6 hidrofób csoportjai közül mindegyik vagy néhány egymástól függetlenül a következõ csoport lehet: – egyenes vagy elágazó láncú 6–30 szénatomos alkoxicsoport, és amely legalább egy heteroatomként elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogénés/vagy kénatomot tartalmaz, és/vagy tartalmaz legalább egy telítetlenséget; – alkoxicsoport, amely lehet 6–30 szénatomos, és egy vagy több gyûrû karbociklust és adott esetben legalább egy telítetlenséget és/vagy legalább
45
50
55
60 16
2
egy heteroatomként elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogén- és/vagy kénatomot tartalmaz; – 7–30 szénatomos alkoxi-aril- vagy aril-oxi-alkilcsoport, amely tartalmazhat legalább egy telítetlen kötést és/vagy legalább egy heteroatomként elõnyösen oxigén- és/vagy nitrogén- és/vagy kénatomot. 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO graft R6 hidrofób csoportja az alábbi csoportba tartozó alkoholos prekurzorból származik: oktanol, dodekanol, tetradekanol, hexadekanol, oktadekanol, oleil-alkohol, tokoferol vagy koleszterin. 12. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO¹t alfa-L-glutamát vagy alfa-L-glutaminsav homopolimer képezi. 13. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO¹t alfa-L-aszpartát vagy alfa-L-aszparaginsav homopolimer képezi. 14. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO¹t alfa-L-aszpartát/alfa-L-glutamát vagy alfa-L-aszparaginsav/alfa-L-glutaminsav kopolimer képezi. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO¹ban az aszparaginsav- és/vagy a glutaminsavegységek disztribúciója, amelyek legalább egy GH egységet tartalmazó graftokat hordoznak, olyan, hogy a kialakult polimer vagy random vagy blokk típusú vagy multiblokk típusú. 16. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO móltömege 2000 és 100 000 g/mol, elõnyösen 5000 és 40 000 g/mol között van. 17. A 7. és 9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO graftjának R6 hidrofób csoportja tokoferollal képezett alkoholos prekurzorból képzõdik, és hogy – 1%£[n/(n+m)]×100£10% – elõnyösen 3,5%£[n/(n+m)]×100£7,5%, – n+m 100 és 400, elõnyösen 120 és 300 közötti. 18. A 7. és 9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a PO graft R6 hidrofób csoportja koleszterinnel képezett alkoholos prekurzorból származik: – 1%£[n/(n+m)]×100£10% – elõnyösen 3,5%£[n/(n+m)]×100£6,5%, – n+m 100 és 400, elõnyösen 120 és 300 közötti. 19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a [PO] polimer koncentrációja 15 és 50 mg/ml közötti. 20. Az 1–19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy viszkozitása 20 °C¹on £5 Pa·s. 21. Az 1–20. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a szubmikronikus részecskékhez nem kötött interferon(ok) [nem kötött interferon(ok)] tömegrésze olyan, hogy: – [nem kötött interferon(ok)]£1 – elõnyösen [nem kötött interferon(ok)]£0,5. 22. Az 1–21. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az interferon interferon-alfa.
1
HU 007 737 T2
23. Az 1–22. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az interferontól eltérõ további hatóanyag(ok) lehet(nek) protein, glikoprotein, egy vagy több polialkilénglikol-lánchoz [elõnyösen polietilénglikol (PEG): „PEGilezett protein”] kapcsolt protein, poliszacharid, liposzacharid, oligonukleotid, polinukleotid vagy peptid, ez vagy ezek a további hatóanyag(ok) elõnyösen lehet(nek) haemoglobinok, citokrómok, albuminok, interferonok, citokinek, antigének, antitestek, eritropoietin, inzulin, növekedési hormonok, VIII és IX faktor, haematopoiesist stimuláló faktorok vagy ezek elegyei. 24. Az 1–23. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy injektálható parenterálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intradermálisan, intraperitoneálisan vagy intracerebrális úton vagy egy tumorba. 25. Az 1–24. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy gyógyszerek elõállítására szolgál, különösen parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intradermális, intraperitoneális vagy intracerebrális vagy tumorba történõ adagolásra, vagy akár orális, nazális, vaginális vagy okuláris úton történõ adagolásra. 26. Eljárás gyógyszerek elõállítására, különösen parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intradermális, intraperitoneális vagy intracerebrális vagy tumorba történõ adagolásra, vagy akár orális, nazális, vaginális vagy okuláris úton történõ adagolásra, azzal jellemezve, hogy lényegében legalább egy, 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítményt alkalmazunk. 27. Származtatott termék, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypontban definiált nem kovalens PO/hatóanyag asszociációkkal képzett szubmikronikus részecskéket tartalmaz, és az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítménybõl állítjuk elõ. 28. A 27. igénypont szerinti származtatott termék, azzal jellemezve, hogy porból vagy gélbõl áll. 29. Eljárás az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény elõállítására, azzal jellemezve, hogy lényegében a következõ lépésekbõl áll: – legalább egy PO nanorészecskéinek kolloid szuszpenzióját alkalmazzuk, – a PO nanorészecskéknek kolloid szuszpenzióját összekeverjük legalább egy interferonnal (és egy vagy több, adott esetben alkalmazott egyéb ható-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
17
2
anyaggal/hatóanyagokkal), elõnyösen vizes oldatban, – adott esetben hozzáadunk legalább egy segédanyagot, – a pH¹t és/vagy az ozmolaritást szükség szerint beállítjuk, és – adott esetben az így kapott szuszpenziót leszûrjük. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyag(ok) vizes szuszpenzió vagy oldat formájában van(nak), a PO nanorészecskék kolloid szuszpenziójával történõ összekeveréshez. 31. Eljárás az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény elõállítására, azzal jellemezve, hogy lényegében a következõ lépésekbõl áll: – legalább egy PO polimert tartalmazó port használunk, – ezt a port összekeverjük legalább egy interferon (és adott esetben egy vagy több egyéb hatóanyag) vizes szuszpenziójával vagy oldatával, elõnyösen vizes oldatban, – adott esetben legalább egy segédanyagot adunk hozzá, – a pH¹t és/vagy az ozmolaritást szükség szerint beállítjuk, és – adott esetben az így kapott szuszpenziót leszûrjük. 32. Eljárás az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény elõállítására, azzal jellemezve, hogy lényegében a következõ lépésekbõl áll: – az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti folyékony készítmény szárításából származó port használjuk, – ezt a port összekeverjük egy vizes folyékony közeggel, elõnyösen keverés közben, – adott esetben hozzáadunk legalább egy segédanyagot, – a pH¹t és/vagy az ozmolaritást szükség szerint beállítjuk, és – adott esetben az így kapott szuszpenziót leszûrjük. 33. Eljárás az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítménybõl kapott por elõállítására, azzal jellemezve, hogy a port az 1–25. igénypontok bármelyike szerinti készítmény szárításával kapjuk.
HU 007 737 T2 Int. Cl.: A61K 38/21
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
