!HU000004117T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 004 117
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 39/39
(21) Magyar ügyszám: E 03 745782 (22) A bejelentés napja: 2003. 04. 03. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030745782 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1490106 A2 2003. 10. 16. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1490106 B1 2008. 05. 28.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20020007640 2002. 04. 04.
(73) Jogosult: Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH, 38124 Braunschweig (DE)
EP
(72) Feltalálók: Guzman, Carlos Alberto, 38304 Wolfenbüttel (DE); Mühlradt, Peter, 38114 Braunschweig (DE) (54)
(2006.01) A61P 31/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03084568 PCT/EP 03/003497
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
Lipopeptid vagy lipoprotein adjuvánsként történõ alkalmazása terápiás profilaktikus vakcináció során
(57) Kivonat
HU 004 117 T2
A találmány tárgyát képezi lipopeptidek és lipoproteinek mukozális adjuvánsként történõ alkalmazása nyálkahártyán keresztül történõ különbözõ vakcinációknál, elõnyösen intranazálisan. A találmány szerinti lipopeptidek egy peptid vagy protein aminoterminális ciszteinjénél 2,3-diacil-oxi-(2R)-propil-csoporttal szubsztituált
peptidek vagy proteinek, elõnyösen mikoplazmákból származó S¹(2,3-biszpalmitoil-oxi-(2R)-propil)-ciszteinil-peptidek. A találmány szerinti peptidek nagyon hatásosak még kis adagban is, jó immunizálási reakciókat eredményeznek, és többek között növelik az IgAszintet.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 12 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 004 117 T2
A találmány tárgyát képezi lipopeptid vagy lipoprotein adjuvánsként történõ alkalmazása nyálkahártyán keresztül történõ terápiás (gyógyító) vagy profilaktikus (megelõzõ) vakcináció során, vagyis mukozális adjuvánsként. A világon évente a halálesetek egyharmada még mindig fertõzõ betegségek következménye, amelyek ezenkívül az új, rákos megbetegedések legalább 15%áért is felelõsek. A fertõzõ betegségek továbbá különbözõ krónikus, gyulladásos, érrendszeri vagy degeneratív természetû betegségek patofiziológiájában is szerepet játszanak. A fertõzõ betegségek sokba kerülnek a társadalomnak a betegek kezelési költségei és a munkából való kiesésük miatt. A fertõzõ betegségek elleni védekezés általában kétféle módon történik, nevezetesen gyógyítással vagy megelõzéssel. Itt válnak az oltások hatásos fegyverré a fertõzõ betegségekkel szemben. Még sok olyan fertõzõ betegség létezik azonban, amelyekre semmilyen vakcina nem áll rendelkezésre, vagy megfelelõ immunizáció nem érhetõ el. Sok vakcina rossz hatékonysága, súlyos mellékhatásai, gyenge stabilitása vagy magas költségei miatt nem megfelelõ. Nagy szükség van tehát új, jobb oltóanyagokra (vakcinákra). A vakcinákat fertõzõ betegségeknél hagyományosan megelõzésre szokták alkalmazni, és ezen a területen sok betegségnél sikeresen bevezették. Új felismerések arra utalnak, hogy vakcináció rendkívül alkalmas eszköz továbbá más, olyan fertõzõ betegségek immunterápiájánál is, ahol ez idáig nem szoktak oltani, például vírusos hepatitisnél, Helicobacter pylori fertõzéseknél, herpeszvírus-fertõzéseknél stb. Egy további alkalmazási terület vakcinák bevonása autoimmun betegségek, gyulladásos megbetegedések, tumorok, allergia immunterápiájába és immunprofilaxisába, valamint embernél és állatoknál a fogamzásgátlásban való alkalmazása. Részben (és különösen ez utóbbi esetben) tûnik úgy, hogy vakcináknak hatásos mukozális beadási módra való alkalmazhatósága és jó mukozális immunreakció ezzel járó kialakulása kapcsolatban van egymással. A fertõzések többsége vagy a nyálkahártyára korlátozódik, vagy a betegség okozójának egy korábbi fertõzési fázisban keresztül kellett jutnia a nyálkahártyán. Ezért feltétlenül arra kell törekedni, hogy vakcináció során nemcsak szisztémás, hanem mindenekelõtt mukozális immunválaszt is kapjunk, azért hogy ezáltal mind a fertõzést (kolonizációt), mind pedig a betegség kialakulását csírájában elfojtsuk. Megfelelõ mukozális immunválasz a fertõzési veszélyt nyilvánvalóan csökkenti. Mivel a szisztémás és a mukozális immunrendszer – bár részben átfed – nem teljesen azonos, mukozális patogének elleni védelem érdekében parenterálisan beadott vakcinák kevéssé hatásosak [McGhee, Mestecky et al., „The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development”, Vaccine 10, 75–88 (1992)]. Valóban a parenterálisan beadott vakcinák lényegében szisztémás immunválaszokat váltanak ki, míg a mukozális úton, azaz nyálkahártyán keresztül
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
beadott vakcinák a természetes fertõzések révén kiváltott immunválaszhoz hasonlót váltanak ki. Ily módon a mukozális immunizálás eredményes szisztémás és mukozális immunválaszhoz vezet. Várható továbbá, hogy vakcinák mukozális beadása kevesebb mellékhatással jár, és a betegek jól tolerálják. Mukozális úton a vakcinák könnyebben beadhatók, és a vakcinációs protokollokkal jobban összhangba hozhatók. Elkészítésük kevesebb költséggel jár. Antigének mukozális úton történõ beadása eddig néhány számottevõ nehézséggel járt. A fõ probléma abban áll, hogy az így beadott antigén gyakran alig immunogén. Ez különbözõ mechanizmusokon alapszik, mint például (i) felgyorsult antigénmegsemmisítés a gazdaszervezet nem specifikus kiürítõ („clearance”) mechanizmusai révén (például csillóaktivitás, perisztaltika), (ii) antigénbontás helyileg ható enzimek révén, (iii) az antigén megváltoztatása és/vagy szerkezeti módosítása különleges pH¹érték következtében (savas közeg a gyomorban, alkalikus a béltraktusban), (iv) a nyálkahártya gyengén átjárható az antigén számára, valamint (v) nagyon korlátozott hozzáférés az antigénprezentáló sejtekhez. Ezeknek a nehézségeknek a legyõzésére különbözõ stratégiákat alkalmaznak, például antigéneknek hordozóként partikulumokba történõ zárása vagy partikulumokkal történõ kapcsolása (mikropartikulumok, nanopartikulumok, baktériumok vagy baktériumdarabok), vírusszerû készítmények alkalmazása, liposzómák vagy ISCOM¹ok (immunstimuláló komplexek) vagy viroszómák alkalmazása, transzgenikus növények alkalmazása, antigéntermelés legyengített, vírusos vagy bakteriális hordozókkal, akár szokásos vektorokként vagy nukleinsavvakcinák hordozóiként és/vagy ezen segédanyagok mukozális adjuvánsokkal történõ beadása. Az ezen a területen kifejtett erõfeszítések ellenére eddig gyakorlatilag egyetlen megfelelõen hatásos és ugyanakkor jól tolerálható mukozális adjuvánst sem sikerült a gyakorlatba bevezetni. „Adjuvánsnak” azokat az anyagokat nevezzük, amelyeket immunizálás során a tényleges antigén (azaz azon anyag, amely a kívánt immunreakciót kiváltja) mellett adnak azért, hogy a humorális és/vagy sejt közvetítette immunválaszt erõsítsék („Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie”, 1. kötet, Spektrum Akademischer Verlag 1995). Sok adjuváns alkalmazása csupán tapasztaláson alapul, ahol a hatás nem pontosan magyarázható, és nem is tervezhetõ elõre. Hagyományosan elsõsorban a következõ adjuvánscsoportokat alkalmazzák: alumínium-hidroxid, ásványi olajok emulziói, szaponinok, detergensek, szilíciumvegyületek, tiokarbamid, Gram-negatív baktériumok endotoxinjai, Gram-pozitív baktériumok exotoxinjai, elölt baktériumok vagy ezek részei. Optimális adjuvánsok alkalmazása a vakcinációnál döntõ szerepet játszik. Adjuvánsok nélkül beadott antigének csak ritkán váltanak ki kielégítõ immunválaszt. Itt nemcsak a kiváltott immunválasz erõsségérõl van szó, hanem a minõségérõl is. Nem megfelelõ immun-
1
HU 004 117 T2
mintázat kiváltása immunpatológiás reakciókhoz és a fertõzési tünetek súlyosbodásához vezethet. Ebben az összefüggésben azok az adjuvánsok segíthetnek, amelyek a kívánt immunreakciót segítik elõ. Emberi alkalmazásra engedélyezett adjuvánsok korlátozott számban állnak rendelkezésre. Az engedélyezési hatóságok által, emberi használatra jóváhagyott kevés számú adjuvánsok egyike az alumíniumhidroxid. Abból a ténybõl kiindulva, hogy egy adjuváns szisztémás alkalmazásnál aktív, azaz az antigén hatását segíti, nem lehet arra következtetni, hogy ez más alkalmazási módokra is igaz. Ennek tipikus példája az alumínium-hidroxid, amely egy anyag immunogenitását intramuszkuláris, szubkután, intraperitoneális vagy intradermális adagolásnál támogatja, ugyanakkor mukozális beadásnál teljesen hatástalan marad. Az utóbbi években intenzív kutatás folyt új adjuvánsok, köztük mukozális beadási módra szánt adjuvánsok után. Csak kevés anyagot találtak, amelyek a mukozális választ serkentik. Ezek közül egyesek hordozóként mûködnek, amelyekhez az antigének kapcsolva vannak, vagy ezekkel fuzionálva vannak. Sokkal kevesebb univerzálisan bevethetõ, „igazi” adjuvánst találtak, amelyek az antigénekkel keverve adhatók. Igazi mukozális adjuváns Escherichia coli hõstabil toxinja és Vibrio cholerae koleratoxinja. Mindkettõrõl leírták, hogy mukozális adjuvánsként hatásosak [Holmgren et al., „Cholera toxin and cholera B subunit as oralmucosal adjuvant and antigenvector system”, Vaccine, 11, 1179–1184 (1993) és Douce et al., „Mutants of Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic, mucosal adjuvants”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1644–1648 (1995)]. A velük járó toxicitás és a lehetséges mellékhatások azonban akadályozzák emberben vakcinációra történõ felhasználásukat. Bár géntechnológiai úton ezen molekulák nem toxikus változatait is elõállították, azonban még mindig erõs, el nem viselhetõ mellékhatásokról számolnak be, mint például a légzõrendszer nyálkahártyájának kóros megváltozása és toxinoknak az agyba történõ bejutása [N. Garcon, prezentáció a „Word Vaccine Congress” kongresszuson, Genf, 26–28 September 1999; és van Ginkel, F. B. et al., „Cutting edge: The Mucosal Adjuvant Cholera Toxin Redirects Vaccine Proteins into Olfactory Tissues”, J. Immunol. 165, 4778–4782 (2000)]. Továbbra is nagy szükség van új, tolerálható és hatásos mukozális adjuvánsokra. A találmány azon a célkitûzésen alapul, hogy olyan nagy hatékonyságú és ember számára nem toxikus mukozális adjuvánsok készletét fejlesszük ki, amelyek hagyományos vagy új vakcinákban, mint például elõnyösen profilaktikus vagy terápiás oltóanyagokban lévõ – beleértve a rák- és DNS-vakcinákat is –, legkülönfélébb támogatandó aktív alkotórészekkel együtt alkalmazhatók. A feladat megoldását az (I) szerkezeti képletû lipopeptid vagy lipoprotein alkalmazása valósítja meg mukozális adjuvánsként terápiás vagy profilaktikus, nyálkahártyán keresztül történõ vakcinációhoz,
2
(I) 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
ahol R1 és R2 azonos vagy egymástól különbözõ lehet, és jelentése C7–25-alkil, C7–25-alkenil vagy C7–25-alkinil, X jelentése kénatom, oxigénatom vagy CH2, R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy metil, és Y jelentése egy 1–25 aminosavból álló, fiziológiailag elviselhetõ és az alkalmazott fajokban önmagában nem immunogén aminosavszekvencia, és a *¹gal jelölt aszimmetrikus szénatom abszolút R¹konfigurációban van a Cahn–Ingold–Prelog-szabály szerint. Habár a DE 19652586 A1 számú német szabadalmi bejelentésben már említik egy bizonyos S¹(2,3-dihidroxi-propil)-cisztein-peptidnek két, a dihidroxi-propilcsoporton észterkötéssel kötött zsírsavat tartalmazó származékának vakcinaadjuvánsként történõ alkalmazását, azonban pusztán elméletileg, és mukozális adjuvánsra való utalás nélkül, a szokásos vakcinációs módból kiindulva. Elõnyösen a 2,3-diacil-oxi-propil-szubsztituált aminosav karboxiterminálisan kötött aminosavszekvenciát (Y) a következõ szekvenciák közül választjuk: a) GQTNT, b) SKKKK, c) GNNDESNISFKEK vagy d) GQTDNNSSQSAAPGSGTTNT. Jelenleg különösen elõnyös egy S¹[2,3-biszpalmitoil-oxi-(2R)-propil]-ciszteinil-peptid, ahol a peptidlánc ismét egy 1–25 aminosavból álló, fiziológiailag elviselhetõ, az alkalmazott fajokban önmagában nem immunogén aminosavszekvencia lehet. Jelenlegi ismereteink szerint a karboxiterminális peptidláncnak a lipopeptid hidrofilitását vagy lipofilitását irányító és adott esetben módosító hatása lehet, így általánosságban valamennyi peptid- vagy fehérjelánc, amely – a vakcina alkalmazási célja szerint – ezt a követelményt teljesíti, alkalmazható. A peptidláncnak fiziológiailag elviselhetõnek és különösen az alkalmazott fajokban [azaz a beoltott (vakcinált) fajokban, akár ember, akár állat] önmagában nem immunogénnek kell lennie. Jelenlegi tudásunk szerint mukozális adjuvánsok hatásossága szempontjából döntõ jelentõségû az (I) képlet szerinti szerkezet, ahol a megjelölt helyen lévõ aszimmetriacentrumnak központi szerepe van. A találmány szerinti mukozális adjuváns minden szakember számára ismert eljárásokkal a vakcinációhoz alkalmazandó antigénhez vagy más aktív molekulához köthetõ, ezekkel együtt fizikai (például mikropartikulumok, nanopartikulumok, liposzómák, ISCOM¹ok, polimerek) vagy biológiai részecskékbe (baktériumok, baktériumrészek) vagy viroszómákba zárhatók, vagy
1
HU 004 117 T2
az antigénnel keverhetõk. Hordozóhoz való kötésnél hordozóként transzportmolekulák vagy transzportfehérjék is számításba jöhetnek. Elõnyösen a találmány szerinti, az elõzõekben megadott (I) képlet szerinti lipoprotein vagy lipopeptid az aktív vakcináló komponenssel (például az antigénnel) egy készítményben van, amely intranazális, intraNALT („nasal associated lymphoid tissue”, orral kapcsolatos limfoid szövet), aeroszolosított, orális, intrarektális, konjunktivális, intravaginális, intrauretrális alkalmazásra vagy a nõi mell tejcsatornáiban történõ alkalmazásra megfelelõ és alkalmas. Egy másik módon a találmány szerinti mukozális adjuváns egy reagenskészletben áll rendelkezésre egy vakcinával az elõbb említett módokon történõ együttes alkalmazásra, és adott esetben ehhez igazítható. A találmány szerinti lipopeptid vagy lipoprotein elõnyösen szintetikus úton nyerhetõ. A találmány szerinti lipopeptidek a szakterületen általánosan ismert eljárásokkal is mikoplazmaklónból és elõnyösebben Mykoplasma fermentans klónból nyerhetõ. A találmány szerinti lipopeptideket MALP-nak, azaz makrofágot aktiváló lipopeptideknek is nevezzük. Számos variáns tartozik ide, amelyek közül MALP¹2 egy 2 kDa nagyságú, (I) képletû lipopeptid, ahol Y jelentése GNNDESNISFKEK; R3, R4 jelentése hidrogénatom és R1, R2 jelentése palmitoil (C15) (S¹(2,3-biszpalmitoil-oxi-propil)-ciszteinil-GNNDESNISFKEK). A találmány szerinti lipopeptidek és ¹proteinek szintézise elõnyösen a „Synthesis of Na¹Fmoc protected derivates of S¹(2,3-dihidroxi-propil)-cisztein and their application in peptide synthesis” [J. W. Metzger, K¹H. Wiesmüller, G. Jung, Int. J. Peptide Proteine Res. 38, 545–554 (1991)] leírása szerint valósítható meg. Ott egyébként a természetesnek megfelelõ (például mikoplazmaklónból nyert) lipopeptideket tévedésbõl S¹konfigurációval jelölik, habár ezek a kötéseket a nemzetközileg érvényes Cahn–Ingold–Prelog-nómenklatúra szerint R¹konfigurációnak kellene jelölni [lásd, például D. Chapman, Introduction to Lipids, Mc Graw-HIII, London, 1969, S, 67 „Phosphoglycerides”; Burgos et al., J. Org. Chem., 52, 4973–4977 (1987); Morr et al., Eur. J. Immunol., 32, 3337–3347 (2002)]. A találmány egy továbbfejlesztett változatában a lipopeptid vagy lipoprotein legalább egy további adjuvánssal és/vagy antigénnel egy készítményben áll rendelkezésre. Elõnyösen egy vagy több gyulladásgátló, antiangiogén, citotoxikus vagy immunmoduláló anyaggal vagy liganddal (például kemokinekkel, citokinekkel, CD40-liganddal) vagy antitestekkel együtt adható be, vagy egy készítményben ezekkel együtt adható. A lipopeptid vagy lipoprotein, mint ezt az elõzõekben említettük, fizikai vagy biológiai hordozóhoz is kapcsolható vagy köthetõ. Továbbá egy elkészítési módban további adalék és segédanyagokat, elõnyösen konzerválóanyagokat vagy stabilizálókat tartalmazhat, és ezek alkalmazhatók. A találmányi leírásban a hatékony mukozális adjuvánsok elõállítása érdekében végzett kutatásokban el-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
ért jelentõs elõrelépést ismertetünk: A lipopeptid az (I) képlet keretei közt módosítható, és ezzel kvalitatív és kvantitatív hatásossága változik, és a kívánt alkalmazáshoz igazítható. Viszonylag kedvezõ költséggel elõállítható, és emberre nem toxikus. Az esetek többségében viszonylag kis mennyiség hozzáadásával nyilvánvaló serkentõ hatást lehet elérni. A találmány szerinti lipopeptidek kémiai és biokémiai tulajdonságukban jól jellemzettek, és elõnyösen szintetikus úton elegendõen tiszta formában elõállíthatók [Mühlradt, P. F., M. Kiess, H. Meyer, R. Sussmuth, G. Jung, „Isolation, structure, elucidation, and synthesis of a macrophage stimulatory lipopeptide from Mycoplasma fermentans acting at picomolar concentration”, J. Exp. Med., 185, 1951 (1997); és Takeuchi, O., A. Kaufinann, K. Grole, T. Kawai, K. Hoshino, M. Morr, P. F. Mühlradt, és S. Akira; „Cutting edge: Preferentially the R¹stereoisomer of the mycoplasma1 lipopeptide macrophage-activating lipopeptide¹2 activates immune cells through a toll-like receptor 2 and MyD88-dependent signaling pathway”, J. Immunol., 164, 554 (2000), U. Deiters, P. F. Mühlradt, Mycoplasma1 Lipopeptide MALP¹2 induces the chemoattractant proteins MIP¹1a, MCP¹1 és MIP¹2 and promotes leukocytes infiltration in mice, Infect Immun 67(7), 3390–3398 (1999)], súlyos mellékhatások jelenlegi tudásunk szerint nem várhatóak. A találmány egy további elõnyös vonása, hogy a találmány szerinti mukozális adjuváns hozzákeverésével történõ immunizálás során IgA magas koncentrációja tapasztalható a kezelt kísérleti állatok nyálkahártya-szekrétumaiban. Ez az ellenanyagfajta a nyálkahártyának a fertõzések elleni védelmében nagy jelentõségû. Mivel ez idõ szerint nincsenek engedélyezett, hatásos adjuvánsok humán betegek intranazális immunizálására, a találmány jelentõs orvosi elõrelépést jelent ezen a területen. A találmányi leírásban ismertetett, (I) általános képletû lipopeptidek vagy lipoproteinek általánosan is, azaz nem csak mukozális módon alkalmazhatók adjuvánsként, beleértve különleges felhasználási módokat DNS-vakcinák és rákellenes vakcinák, nem fertõzõ betegségek elleni vakcinák és hasonlók számára, például a szokásos vakcinációs módokon (intramuszkuláris, szubkután, intradermális, intraperitoneális). A találmány szerinti antigének a legkülönfélébb antigénekkel kombinálhatók oltóanyaggá. Antigénekként elõnyösen célantigének választhatók fertõzõ betegségek, tumorok, autoimmun betegségek, allergiák, valamint krónikus vagy akut gyulladásos betegségek profilaxisára és terápiájára. A választás többek között a fertõzõ kórokozó, mint például vírusok, baktériumok, paraziták, rickettsia, mikoplazma, gombák és hasonlók antigénkészletébõl származhat. Oltás kifejezés alatt értjük emberek vagy állatok termékenységének szabályozása céljából végzett, antigénnel történõ kezelést is. A találmány szerinti mukozális adjuvánsok a példákból megérthetõ elõnyös tulajdonságai egyetlen, ezen bejelentésnél korábbi, nyilvánosságra került iratból sem vezethetõk le.
1
HU 004 117 T2
A kísérletek/vizsgálatok módszertani szempontjai Elõkísérletként elõször is in vitro szûrõvizsgálatot végeztünk, hogy a vizsgált lipopeptidek antigénprezentáló sejteket aktiváló képességét értékeljük. Célsejtekként csontvelõ-eredetû dendritikus sejteket (DC) alkalmaztunk, amelyeket az elõalakokból GM¹CSF segítségével kaptunk. Gyökeres ellentétben azzal, amit MALP-2-nek makrofágokkal szemben tanúsított aktivitása alapján várni lehetett, a MALP¹2 csak gyenge aktivitást mutatott primer dendritikus sejtekkel szemben. A kontrollpróbákkal összehasonlítva, amelyeket E. coli lipopoliszacharidok (LPS, 10 ng/ml) jelenlétében inkubáltunk, az 5 ng/ml MALP-2-vel kezelt dendritikus sejteknél csak nagyon gyenge aktiválást tapasztaltunk. Ezen elõkísérletek alapján a MALP-2-tõl és a megfelelõ lipopeptidektõl nem várhattuk, hogy adjuvánsként alkalmasak, mivel az adjuvánsokról feltételezik dendritikus sejtek aktiválásának egy bizonyos képességét. A dendritikus sejtek általában az antigénprezentáló sejtek fõ csoportja. Az elsõdleges immunválaszban központi szerepet játszanak, ahol (1.) a leghatékonyabb antigénprezentáló sejtek, (2.) a legfontosabb epitópforrások specifikus T¹sejt-klónok számára, és (3.) nyugvó T¹sejtek legfontosabb aktiválói, amelyek az elsõdleges immunválaszt in vivo kiváltják. Míg az LPSsel kezelt dendritikus sejteknél jelentõs serkentést, illetõleg a CD40, beleértve a CD80 és CD86 növekedését tapasztaltuk, addig a MALP-2-vel kezelt dendritikus sejteknél, ha egyáltalán volt, akkor csak gyenge hatást lehetett megfigyelni. Ez részben várható volt, és összhangban áll a makrofágokkal kapott eredményekkel. Ott azt tapasztaltuk, hogy MALP-2-vel történõ hosszan tartó kezelésnél egy kezdeti serkentõ szakasz után MHC II osztályú molekulák (amelyek az igazi antigénprezentációhoz fontosak) megnövekedett forgalma és csökkent expressziója lépett fel [M. Frisch et al., Eur. J. Immunol. 26, 1050–1057 (1996)]. Annál meglepõbb az adjuváns tapasztalt hatása. Az elõkísérletek eredményei egyelõre erõsen az ellen szóltak, hogy az itt vizsgált lipopeptidek és ¹proteinek adjuvánsként aktivitást mutathatnak. Habár ezek az in vitro vizsgálatok azt sugallták, hogy a kérdéses lipopeptidek itt nem sok sikert ígérnek, mégis negatív kontrollpróbaként, azaz mint makrofágaktiváló anyagok rosszul ható példáiként az in vivo vizsgálatokba bevontuk, mivel ezek az anyagok korábbi vizsgálatokból rendelkezésre álltak. Meglepõ módon, teljesen ellentétben az in vitro kísérletekkel azt tapasztaltuk, hogy például MALP-2-nek a b¹galaktozidáz modellantigénnel történõ adása esetén akár intranazálisan (in.), akár intraperitoneálisan [ip. (megjegyzés: állatkísérletben)] már 0,5 mg per állat per adag dózisban a b¹galaktozidázspecifikus IgG szérumtiter 675-szörösétõl 3560-szorosáig (in.), illetõleg 64¹szeresétõl 128-szorosáig (ip.) növekedett. A találmány szerinti lipopeptidek alkalmazásánál már az elsõ immunizálást követõen megközelítõleg maximális IgGválaszt lehetett elérni, és ez az IgG-titer megfelel 10 mg (háromszoros moláris feleslegben lévõ) koleratoxin
5
10
15
20
25
30
35
2
B¹alegység (CTB), egy jól jellemzett mukozális adjuváns dózisának. Hasonló eredményeket tapasztaltunk a találmány szerinti lipopeptidek és ¹proteinek intradermális vagy szubkután beadásakor. Ezért ki lehet abból indulni, hogy a találmány szerinti lipopeptidek és ¹proteinek dózisa a hagyományos adjuvánsokkal összehasonlítva legalább háromszor kisebb (moláris) koncentrációban eredményes tud lenni, és kell hogy eredményes legyen. Azt is ki lehetett mutatni, hogy a találmány szerinti lipopeptidek intranazális úton történõ beadása a mukozális immunrendszert összességében hatásosan stimulálja. Adjuvánsként MALP-2-nek a modellantigénhez történõ adásával az összes IgA¹ra vonatkoztatva 36%, illetve 23% antigénspecifikus IgA¹t találtunk a tüdõ- és a vaginális mosófolyadékban. Ez azt mutatja, hogy a találmány szerinti lipopeptidek nemcsak helyi mukozális immunválaszt váltanak ki, hanem az IgA-termelõ sejteknek más, távoli nyálkahártya-területekre történõ elterjesztése is oly mértékben megtörténik, amely jó mukozális immunválaszt eredményez. Ez a hatás a mukozális beadási módhoz kötõdik. A találmány szerinti lipopeptideknek antigénnel való együttes beadása erõsebb sejtes immunválaszt vált ki, mint a CTB, mind helyileg a nyirokcsomókban, mind pedig a lépben (p<0,05). A b¹galaktozidázspecifikus IgG-izotípusok vizsgálata, valamint az in vitro stimulált sejtek által kiválasztott citokinek profilja azt mutatta, hogy a lipopeptidek együttes beadása domináns Th2válaszmintázatot vált ki. A kísérletek eredményei azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti lipopeptidek hatásos adjuvánsok vakcinákban antigének mukozális úton való beadásakor. Egy fontos szempont, amelyet itt meg kell említenünk, hogy a lipopeptidmennyiség fokozatos emelése (az itt megnevezett optimális dózisból kiindulva) az immunválasz folyamatos csökkenéséhez vezet. Ez az ellentétes irányú hatás váratlan és a technika jelenlegi állása szerint nem magyarázható.
40
45
50
55
60 5
Példák Általános rész A példákban ismertetett kísérleteknél elsõdlegesen egy szintetikus, egy Mycoplasma-eredetû lipopeptidnek messzemenõen megfelelõ MALP-2¹t alkalmaztunk mukozális adjuvánsként b¹galaktozidázzal, mint modellantigénnel. Ezt a bizonyos példaértékû lipopeptidet elõzetesen meghatározott, lényegi tulajdonságai alapján (biokémiai tulajdonságok, makrofágstimuláló aktivitás) választottuk ki. Amennyiben más nincs megadva, a példákban alkalmazott, szintetikus lipopeptidet, S¹[2,3biszpalmitoil-oxi-propil]-ciszteinil-GNNDESNISFKEK, a továbbiakban csak „MALP-2”-nek jelöljük. A MALP¹2 dózisát mindenekelõtt elõkísérletekben határoltuk be, amelyek során MALP-2¹t szubkután, intradermálisan, intranazálisan vagy intraperitoneálisan egerekbe oltottuk. Valamennyi eljárásban MALP2-nek b¹galaktozidázzal egyidejûleg vagy azzal együtt történõ beadása a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok termelõdésének szignifikáns növekedését
1
HU 004 117 T2
eredményezte. Az intranazális vagy intraperitoneális úton MALP¹2 jelenlétében végzett oltást követõen kiváltott immunválaszt elemeztük, és összehasonlítottuk az adjuvánsként CTB alkalmazásával nyert eredményekkel. A példákban bemutatjuk, hogy MALP¹2 alkalmazása már beadásonkénti 0,5 mg dózisban szignifikánsan magasabb humorális és sejtes, b¹galaktozidázspecifikus immunválaszt eredményezett. Már az intraperitoneális beadás is jobb immunválaszt eredményezett, az intranazális mód azonban még hatékonyabbnak mutatkozott. Ezzel szemben CTB-nél háromszoros moláris feleslegre volt szükség hasonló szisztémás vagy mukozális, humorális válaszhoz. Ami a sejtes immunválaszt illeti, a MALP-2-vel immunizált egerek lépsejtjei nyilvánvalóan magasabb proliferációt mutattak (p<0,05), mint a háromszoros moláris feleslegben lévõ CTB-vel vakcinált állatok lépsejtjei. Az adjuvánsként MALP-2-vel intranazális úton kapott elsõdleges immunválaszt a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagválasz kinetikáját illetõen magasabb ellenanyagtiter megjelenése jellemzi, amely már az elsõ immunizálást követõen csaknem a maximális szintet érte el. A humorális és sejtes válaszok in. vakcináció után erõsebbek voltak, amely a MALP¹2 differenciált, helyi hatására utal, amely vagy a biológiai hozzáférhetõségével magyarázható, vagy a célsejteken a specifikus receptorok térbeli eloszlására vezethetõ vissza. Mint korábban már említettük, még vakcinációs úton közvetlenül el nem érhetõ nyálkahártyaszövetekben is nyilvánvaló immunválaszt tapasztaltunk, azaz b¹galaktozidázspecifikus IgA¹t a tüdõ és a vagina mosófolyadékában. A találmány tárgyának alapjául szolgáló kísérletek azt mutatják, hogy a találmány szerinti lipopeptidek új és hatásos mukozális adjuvánsok, ahol az a követelmény, hogy a célantigénnek az aktív lipopeptiddel kapcsolva kell lenni, más lipopeptidektõl eltérõen nem szükségszerû. A kísérletek teljes idõtartama alatt a beoltott állatoknál semmilyen mellékhatást, vagy akut vagy krónikus toxicitási tünetet nem tapasztaltunk. A találmány szerinti lipopeptidekben lévõ, viszonylag rövid peptidalegység viszonylag mérsékelt immunogenicitást hordoz, amely azt a veszélyt, hogy immunválasz magával a lipopeptiddel szemben fellép, minimálisra csökkenti. Ez nyilvánvaló elõny a fehérjékkel, mint adjuvánsokkal szemben. MALP¹2 adjuvánsként történõ intranazális beadását követõen anti-MALP¹2 ellenanyagot nem lehetett kimutatni. Ez nyilvánvaló elõny a fehérjékkel, mint adjuvánsokkal szemben, mivel magával az adjuvánssal szembeni immunválasz csökkenthet egy késõbbi immunreakciót egy másik oltóanyaggal szemben, amely ugyanezt az adjuvánst tartalmazza. A találmány szerinti lipopeptidek oltóanyagként különbözõ kórokozók ellen, valamint rák elleni vakcinákban vagy termékenységet szabályozó vakcinákban alkalmazhatók. A találmány további elõnyei a lipopeptidek jó tárolhatósága, a szintetikusan elõállítható lipopeptidek nagyobb tisztasága és az áttekinthetõ kémiai és biokémiai tulajdonságok.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Az ábrák ismertetése 1. ábra: Primer dendritikus sejtekkel végzett in vitro vizsgálatok A primer dendritikus sejteket BALB/c egerek csontvelõjébõl rekombináns GM¹CSF (5×104 U/ml) alkalmazásával, az elõalakok in vitro érésével nyertük. Az érett dendritikus sejteket 10 ng/ml E. coli lipopoliszachariddal (LPS), illetõleg 5 ng/ml MALP-2-vel stimuláltuk. Végül a sejteket CD11c-specifikus ellenanyagokkal (dendritikussejt-marker) anti-CD40-nel vagy antiCD80-nal vagy anti-CD86-tal együtt, kettõsen jelöltük. A CD40, CD80, illetõleg a CD86 expresszióját a CD11c-vel jelölt sejtekben áramlási (flow) citométer segítségével határoztuk meg. Az eredményeket a pozitív sejtek százalékában adjuk meg az összes CD11c-pozitív populációra vonatkoztatva. 2. ábra: Dendritikus sejtek vizsgálata MALP-2-kezelés után áramlási citométerrel (FACScan) A primer dendritikus sejteket BALB/c egerek csontvelõjébõl rekombináns GM¹CSF (5×104 U/ml) alkalmazásával, az elõalakok in vitro érésével nyertük. Az érett dendritikus sejteket 10 ng/ml E. coli lipopoliszachariddal (LPS), illetõleg 5 ng/ml MALP-2-vel stimuláltuk. Végül a sejteket CD11c-specifikus ellenanyagokkal (dendritikussejt-marker) anti-CD40-nel vagy antiCD80-nal vagy anti-CD86-tal együtt, kettõsen jelöltük, és a sejteket áramlási citométerrel vizsgáltuk. A kapukat a nem rokon, kontrollellenanyag-izotóppal való jelölésre állítottuk. 3. ábra: Humorális immunválaszok MALP-2-vel, mint adjuvánssal történõ oltás után Egereket szubkután (sc.), intraperitoneális (ip.), intradermális (id.) és intranazális (in.) módon immunizáltunk, vagy csupán b¹galaktozidázzal (40 mg) vagy MALP-2-vel (0,5 mg) kevert b¹galaktozidázzal a 0., a 7. és a 14. napokon. Az elsõ immunizálást követõ 28. napon szérummintákat vettünk, és a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok titerét ELISA-val határoztuk meg. Az eredményeket a végponttiterek mértani középértékének reciprok log2 függvényében ábrázoljuk. Kontrollcsoportként egy olyan állatcsoportot alakítottunk ki, amelyekben az állatokat b¹galaktozidázzal immunizáltuk adjuvánsként alumínium-hidroxid alkalmazásával. 4. ábra: Humorális immunválaszok MALP-2-vel, mint adjuvánssal állatonként és immunizálásonként 1 mg dózisban történõ oltás után Egereket intraperitoneális (ip.) és intranazális (in.) módon immunizáltunk, vagy csupán b¹galaktozidázzal (40 mg/adag) vagy MALP-2-vel (1,0 mg/adag) kevert b¹galaktozidázzal a 0., a 7. és a 14. napokon. Az elsõ immunizálást követõ 28. napon szérummintákat vettünk, és a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok titerét ELISA-val határoztuk meg. Az eredményeket az abszorpciós értékekben adjuk meg (OD 405 nm). 5. ábra: Sejtreakciók adjuvánsként MALP-2-nek különbözõ koncentrációkban történõ alkalmazásával történõ oltást követõen Intraperitoneális (ip.) vagy intranazális (in.) úton vagy csupán b¹galaktozidázzal (40 mg/adag) vagy
1
HU 004 117 T2
MALP-2-vel (1,0 vagy 0,5 mg/adag) kevert b¹galaktozidázzal a 0., a 7. és a 14. napokon immunizált egérlépsejtek b¹galaktozidázspecifikus T¹sejt-proliferációs válaszait vizsgáltuk. Az elsõ immunizálást követõ 28. napon az állatokat megöltük, a lépsejteket in vitro négy napon keresztül 20 mg/ml oldható b¹galaktozidáz jelenlétében újra stimuláltuk. Az eredményeket stimulációs indexekként ábrázoljuk (cpm mintákban/cpm a nem stimulált kontrollsejtekben). 6. ábra: b-Galaktozidázspecifikus IgG-válaszok kinetikája beoltott egerek szérumában Öt állatból álló csoportot (n=5) vagy in. (A), vagy ip. (B) 50 mg b¹galaktozidázzal (), b¹gal plusz 10 mg CTBvel (), b¹gal plusz 0,5 mg MALP-2-vel (), vagy csupán pufferoldattal () oltottunk. Az oltások napjait (0., 14. és 21. nap) nyíllal megjelöltük. Az eredményeket a mértani végponttiterek reciprok log2 függvényében ábrázoljuk, a SEM¹et (átlagos eltérést) függõleges vonalakkal adjuk meg. 7. ábra: b-Galaktozidázspecifikus IgA in. oltott egerek tüdõ- és vagina-mosófolyadékában Az eredményeket b¹galaktozidázspecifikus IgA-nak az összes, ott lévõ IgA¹ra vonatkoztatott százalékában ábrázoljuk. A SEM¹et függõleges vonalakkal adjuk meg. 8. ábra: Szérum-IgE-szintek meghatározása MALP-2-vel, mint adjuvánssal történõ immunizálást követõen Egereket intraperitoneális (ip.) és intranazális (in.) módon immunizáltunk, vagy csupán b¹galaktozidázzal (40 mg/adag) vagy kizárólag MALP-2-vel, vagy MALP2-vel (0,5 mg/adag) kevert b¹galaktozidázzal a 0., a 7. és a 14. napokon. Az elsõ immunizálást követõ 28. napon szérummintákat vettünk, és az IgE-szinteket „capture” (befogó) ELISA-val határoztuk meg. Az eredmények az IgE-koncentrációkat mutatják be (ng/ml). 9. ábra: Intraperitoneálisan vagy intranazálisan oltott egerek lépének (A és B) és regionális nyirokcsomósejtjeinek (C) b¹galaktozidázspecifikus T¹sejt-proliferációs reakciói A sejteket in vitro négy napon keresztül különbözõ koncentrációjú, oldható b¹galaktozidázzal újra stimuláljuk. Az eredményeket a nem stimulált sejtek háttérértékébõl kivont, háromszoros csoportból számolt átlagos cpm értékben adjuk meg. A SEM¹et függõleges vonalakkal ábrázoljuk. 10. ábra: Beoltott egerekben kiváltott Th¹profil A beoltott egereknél az in vitro stimulált lépsejtek által kiválasztott b¹galaktozidázspecifikus IgG-izotípusokat és ¹citokineket a szérumban ELISA segítségével határoztuk meg. Az eredményeket IgG1/IgG2a és IL–10/IL–2 (a leggyakrabban elõforduló citokinek) koncentrációs viszonyaival ábrázoljuk. 11. ábra: Beoltott egerek in vitro stimulált sejtjei által kiválasztott citokinek A citokintermelõdést ELISA segítségével a sejtfelülúszókból mértük meg, amely sejteket 48 (IL–2), illetõleg 96 óra hosszat (IFNg, IL–4 és IL–10) b¹gal (20 mg/ml) jelenlétében inkubáltunk. Az eredményeket
2
a beoltott egerekben talált citokinmennyiségnek a be nem oltott, kontrollegereknél tapasztalt mennyiséghez viszonyított arányában ábrázoljuk. 12. ábra: Humorális immunválaszok, amelyeket MALP-2-vel, mint adjuvánssal 2 mg per ál5 lat per immunizálás adagban történõ vakcinációt követõen kaptunk. Az egereket vagy csak b¹galaktozidázzal (100 mg/adag), vagy MALP-2-vel (2 mg/adag) kevert b¹galaktozidázzal a 0., a 7., a 14. és a 31. na10 pokon orálisan immunizáltunk. Az elsõ immunizálást követõ 45. napon szérummintákat vettünk, és a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok titerét ELISA-val határoztuk meg. 15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
1. példa: Egérfélék csontvelejébõl nyert, primer dendritikus sejtek in vitro stimulálása MALP-2-vel A kísérlet menete: BALB/c egerek csontvelõjébõl az elõalakok in vitro, rekombináns GM¹CSF jelenlétében (5×104 U/ml) való érésével a szokásos eljárások útján primer kultúrákat állítottunk elõ. Az érett dendritikus sejteket E. coli lipopoliszachariddal (LPS) vagy 5 ng/ml MALP-2-vel stimuláltuk. Tizenkét vagy 24 órás stimulálást követõen a sejteket áramlási citométerrel vizsgáltuk, hogy megállapítsuk a felületi markerek expresszióját, amelyek az antigénprezentációs képességben nagy szerepet játszanak. Azon vegyületek kiválasztására, amelyek vakcináció területén in vivo felhasználásra adjuvánsként számba jöhetnek, elõször a csontvelõ-eredetû dendritikus sejtek primer kultúráival in vitro kísérleteket végeztünk. Azért választottuk a dendritikus sejteket, mivel ezek a leghatékonyabb antigénprezentáló sejtek, és az elsõdleges immunválasznál kulcsszerepet játszanak. Valóban ez az egyetlen sejttípus, amely in vivo képes nyugvó T¹sejteket elsõdleges immunválasz elindításához aktiválni. Ezért kezeltünk dendritikus sejteket a vizsgált egységekkel vagy LPS-sel, amely kontrollként szolgált. Különbözõ idõpontokban mintákat vettünk, fluoreszcensen jelölt ellenanyagokkal jelöltük, amely ellenanyagok specifikusak arra a sejtmarkerre nézve, amely a dendritikus sejtek antigénprezentáló képessége szempontjából döntõ, és áramlási citométer segítségével vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatják (1. és 2. ábra), hogy a pozitív kontrollcsoporttal ellentétben a CD40 és a kostimulálódó CD86-molekula expressziója a MALP-2-vel kezelt dendritikus sejtekben nem emelkedett meg. A kostimulálódó CD80-molekula expressziójára való hatás csekély volt, ha egyáltalán volt. A kostimulálódó molekulák szignált küldenek, amelyek a T¹sejtek hatásos aktiválásához fontos, az MHC-molekulákon belüli közremûködõ epitóp prezentációjához hozzájárulnak. Mint arról korábban már beszámoltak, bizonyított nyálkahártya-adjuvánsok (mukozális adjuvánsok), mint például koleratoxin hatása kostimulálódó molekulák expressziójának szelektív erõsödéséhez kötõdik. Ezért az in vitro tapasztalt eredmények erõsen arra utalnak, hogy MALP¹2 nem, vagy alig képes nyálkahártya-adjuvánsként mûködni.
1
HU 004 117 T2
2. példa: Humorális válaszok különbözõ beadási módokon, adjuvánsként MALP¹2 különbözõ koncentrációival végzett oltás után A kísérlet leírása: Hat-nyolc hetes, nõstény BALB/c (H¹2d) egereket vásároltunk Hartan Winkelmann GmbH-tól (Borchen, Németország), és a helyi és az EU¹irányelvek szerint tartottuk õket. Öt egérbõl álló csoportokat az 1., a 7. és a 14. napon vagy csupán 40 mg b¹galaktozidázzal (Boehringer, Mannheim, Németország), vagy 1, illetõleg 0,5 mg szintetikus MALP¹2 hozzákeverésével oltottunk. Intranazális (in.) alkalmazásnál mindkét orrlyukba 10 ml¹t adtunk, míg ip., sc. és id. injekcióban b¹galaktozidázt MALP-2-vel 400, 100 ml PBS-ben, illetõleg MALP¹2 nélkül 100 ml PBS-ben szuszpendáltunk. Az elsõ oltást követõ 28. napon szérummintákat vettünk, és –20 °C¹on tároltuk a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok meghatározásáig. Nunc-Immuno Maxisorp 96 lyukú lemezeket (Nunc, Roskiide, Dánia) lyukanként 100 ml, 5 mg/ml koncentrációjú b¹galaktozidázzal (Boehringer, Mannheim, Németország) 0,05 M karbonátpufferben (pH 8,2) rétegeztünk. 1% BSA¹t és 0,05% Tween–20¹at tartalmazó PBS-sel készített szérumhígításokat adtunk hozzá (100 mg/lyuk), és a lemezeket 37 °C¹on, 24 órán keresztül inkubáltuk. Mosást követõen biotinilált g¹láncspecifikus kecskeeredetû, egér elleni IgG¹t (Sigma Chemie, Deisenhofen, Németország) adtunk hozzá, és a lemezeket további egy órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on. Négyszeres mosást követõen 100 ml peroxidázzal konjugált streptavidint (Pharmingen) adtunk a sejtekhez, és a lemezeket 30 percen keresztül, 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeres mosást követõen a reakciókat 0,01% hidrogén-peroxidot tartalmazó, 0,1 M citrát-foszfát-pufferben (pH 4,35) lévõ ABTS-sel kifejlesztettük. Az eredményeket vagy a 405 nm¹nél mért abszorpcióval vagy a végponttiterekkel ábrázoltuk (az utolsó hígítás reciprok log2 értéke, amely hígítás 30 perces inkubálást követõen 405 nm¹nél 0,1 egység optikai denzitást mutat a negatív kontrollcsoport értéke felett). A csalódást keltõ eredmények ellenére, amelyeket primer dendritikus sejtek MALP¹2 alkalmazásával nyert in vitro vizsgálatai során kaptunk, elhatároztuk, hogy a következõ, in vivo vizsgálatokban olyan állatcsoportokat is bevonunk, amelyeket adjuvánsként MALP¹2 alkalmazásával oltottunk be. Ezért tehát egereket vagy csak a b¹galaktozidáz modellantigénnel vagy az antigénnel és MALP-2-vel ip., sc., id. és in. oltottunk. Az elvárásokkal ellentétben erõs adjuvánshatást állapítottunk meg, amikor az antigént 0,5 mg MALP-2-vel kevertük, és a beadás útjától és módjától függetlenül (3. ábra). A legerõsebb reakciókat az ip. és az in. oltásoknál kaptuk. A kapott reakciók legalább olyan erõsek (id.) vagy erõsebbek voltak, mint a hagyományos adjuvánsként alumínium-hidroxid sc. injektálásával kapott reakciók (3. ábra). Mivel a megelõzõ vizsgálatokban a hagyományos lipopeptidek alkalmazásánál lényegesen magasabb koncentrációban adták az adjuvánsként alkalmazott alkotóelemet, ezért MALP¹2 nagyobb dózisainak hatását is vizsgáltuk. E célból állatokat adjuvánsként 1 mg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
MALP-2¹t oltottunk b¹galaktozidázzal a két leghatásosabb immunizációs úton (ip. és in.). Az elvárásokkal ellentétben a MALP¹2 dózisának növelése az adjuvánshatás megszûnéséhez vezetett (4. ábra). Ez azt mutatta, hogy az irodalomban más lipopeptidekre megadott, standard koncentráció alkalmazásával a MALP¹2 in vivo kísérleteiben nem tudtunk adjuvánshatást a humorális válaszban kimutatni. 3. példa: Humorális immunválaszok, amelyeket adjuvánsként MALP¹2 különbözõ koncentrációban, különbözõ beadási módokon való oltása után kaptunk A kísérlet menete: Hat-nyolc hetes, nõstény BALB/c (H¹2d) egereket vásároltunk Hartan Winkelmann GmbH-tól (Borchen, Németország), és a helyi és az EU¹irányelvek szerint tartottuk õket. Öt egérbõl álló csoportokat az 1., a 7. és a 14. napon vagy csupán 40 mg b¹galaktozidázzal (Boehringer, Mannheim, Németország), vagy 1, illetõleg 0,5 mg szintetikus MALP¹2 hozzáadásával oltottunk. Intranazális (in.) alkalmazásnál mindkét orrlyukba 10 ml¹t adtunk, míg ip. injekcióban b¹galaktozidázt MALP-2-vel vagy anélkül 400 ml PBS-ben szuszpendáltunk. A lépsejteket eltávolítottuk, és a sejtes immunválaszok meghatározásához összegyûjtöttük („pool”¹t képeztünk). A sejteket 10% magzati borjúszérummal, 100 U/ml penicillinnel, 50 mg/ml sztreptomicinnel, 5×10–5 M 2¹merkaptoetanollal és 1 mM L¹glutaminnal (GIBCO BRL, Karlsruhe, Németország) kiegészített RPMI 1640-ben 37 °C¹on, párás légkörben, 5% szén-dioxidban szaporítottuk. A lépsejtszuszpenziókat teljes tápközegben 5×106 sejt/ml¹re állítottuk. Lyukanként 100 ml sejtet terítettünk lapos aljú, 96 lyukú mikrotiterlemezekre (Nunc), és a lemezeket 4 napon keresztül inkubáltuk 20 mg/ml oldható b¹galaktozidáz jelenlétében. A tenyésztés utolsó 18 órájában minden lyukba 1 mCi [3H]timidint adtunk (Amersham International, Freiburg, Németország). A sejteket azután egy sejteket begyûjtõ készülék segítségével (Inotech, Wohlen, Svájc) filterpapírra vittük (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Németország), és a szaporodott sejtek DNS-ébe beépült [3H]timidint g¹szcintillációs számlálóval mértük (Wallac 1450, MicroTrilux). Az eredményeket a [3H]timidin felvételének cpm-ben kifejezett számtani közepével ábrázoljuk. Az eredményeket stimulációs indexként ábrázoljuk (SI, cpm minta/cpm nem stimulált kontrollsejtek). Az adjuvánshatás humorális területen tapasztalt meglepõ csökkenését figyelembe véve, amely MALP¹2 magasabb dózisban történõ alkalmazásánál volt megfigyelhetõ, elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk, vajon hasonló hatás tapasztalható¹e a sejtes immunválasznál is. E célból egereket vagy csak b¹galaktozidázzal, vagy 1 mg MALP-2-vel kevert b¹galaktozidázzal immunizáltunk. Az immunizálást követõ 28. napon a lépet megtisztítottuk, in vitro 20 mg/ml b¹galaktozidázzal újra stimuláltuk, és a sejtosztódási képességüket [3H]timidinnek a DNS-ükbe történõ beépülésével határoztuk meg g¹szcintillációs számláló segítségével. A kapott eredmények (5. ábra) megerõsítették, hogy MALP¹2 al-
1
HU 004 117 T2
kalmazása magasabb koncentrációkban nemcsak azt eredményezi, hogy humorális immunválasz többé már nem tapasztalható, hanem még a sejt közvetítette immunizáció is csökken. 5 4. példa: MALP-2-nek egy oldható antigénnel történõ közös intranazális és intraperitoneális beadása hatásos szisztémás humorális választ indukál A kísérlet menete: Hat-nyolc hetes, nõstény BALB/c (H¹2d) egereket vásároltunk Hartan Winkelmann GmbH-tól (Borchen, Németország), és a helyi és az EU¹irányelvek szerint tartottuk õket. Öt egérbõl álló csoportokat az 1., a 14. és a 21. napokon vagy csupán 40 mg b¹galaktozidázzal (Boehringer, Mannheim, Németország), vagy 0,5 mg szintetikus MALP-2, illetõleg hagyományos adjuvánsként 10 mg koleratoxin B¹alegység (CTB, ICN Biomedicals Inc., Ohio) hozzáadásával oltottunk. Intranazális (in.) alkalmazásnál mindkét orrlyukba 10 ml¹t adtunk, míg ip. injekcióban b¹galaktozidázt MALP-2-vel 400, 100 ml PBS-ben, illetõleg MALP¹2 nélkül 100 ml PBS-ben szuszpendáltunk. Szérumpróbákat különbözõ idõpontokban vettünk (0., 13., 20. és 30. nap), és –20 °C¹on tároltuk a b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok meghatározásáig. NuncImmuno Maxisorp 96 lyukú lemezeket (Nunc, Roskiide, Dánia) lyukanként 100 ml, 5 mg/ml koncentrációjú b¹galaktozidázzal (Boehringer, Mannheim, Németország) 0,05 M karbonátpufferben (pH 8,2) rétegeztünk. 1% BSA¹t és 0,05% Tween–20¹at tartalmazó PBS-sel felezõ sorozathígításokat készítettünk a szérumokból vagy a mosófolyadékokból, és a lyukakhoz adtuk (100 mg/lyuk), és a lemezeket 37 °C¹on, 24 órán keresztül inkubáltuk. Mosást követõen biotinilált g¹láncspecifikus kecske antiegér-IgG¹t (Sigma Chemie, Deisenhofen, Németország) adtunk hozzá, és a lemezeket további egy órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on. Négyszeres mosást követõen 100 ml peroxidázzal konjugált streptavidint (Pharmingen) adtunk a sejtekhez, és a lemezeket 30 percen keresztül, 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeres mosást követõen a reakciókat 0,01% hidrogén-peroxidot tartalmazó, 0,1 M citrát-foszfát-pufferben (pH 4,35) lévõ ABTS-sel kifejlesztettük. Az eredményeket az utolsó hígítás reciprok log2 értékével ábrázoljuk, amely hígítás 30 perces inkubálást követõen 405 nm¹nél 0,1 egység optikai denzitást mutat a negatív kontrollcsoport értéke felett. 5. példa: MALP-2-nek egy oldható antigénnel való intranazális együttes beadása hatásos ellenanyagreakciót vált ki a nyálkahártyában A kísérlet menete: A 31. napon az egereket megöltük, és végsõ mintát vettünk. Vaginális és tüdõöblítést végeztünk, amikor is a szerveket 1 ml, 50 mM EDTAval, 0,1% BSA-val és 10 mM PMSF-fel kiegészített PBS-sel mostuk. A mosófolyadékokat végül centrifugáltuk, hogy a szöveti törmelékeket eltávolítsuk (10 perc 3000×g), és a fennmaradó folyadékot –20 °C¹on tároltuk. A tüdõ- és vaginális mosófolyadékban az összes IgA koncentrációjának meghatározásá-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 9
2
hoz a megfelelõ minták sorozathígításait mikrotiterlemezeken inkubáltuk, ahol a lemezeket befogó ellenanyagként elõzetesen kecske antiegér-IgA-val (Sigma Chemie) vontuk be (100 ml/lyuk). Tisztított egér-IgA (Sigma Chemie) sorozathígításaiból standardgörbét készítettünk. Annak érdekében, hogy MALP-2-nek azon képességét vizsgáljuk, hogy mukozális választ vált¹e ki in. együttesen adott antigénnel szemben, az immunizált állatok tüdõ- és vaginális mosófolyadékában b¹galaktozidázspecifikus IgA-termelõdést vizsgáltuk. Míg csak b¹galaktozidázzal történõ oltás után b¹galaktozidázspecifikus IgA termelõdését a tüdõ mosófolyadékában kimutatható mennyiségben nem lehetett találni, a b¹galaktozidázzal és MALP-2-vel immunizált állatokban az antigénspecifikus IgA szintjének szignifikáns emelkedését lehetett megállapítani (7. ábra). MALP¹2 együttes adása hatásos IgA-termelõdést váltott ki még távol fekvõ nyálkahártyában is, mint ez a vaginális mosófolyadékban b¹galaktozidázspecifikus IgA szignifikáns koncentrációjával bizonyítható volt (7. ábra). Statisztikailag szignifikáns különbséget a nyálkahártyában lévõ b¹galaktozidázspecifikus ellenanyagok szintjében a 0,5 mg MALP-2-vel vagy a 10 mg CTB-vel immunizált állatok között nem lehetett kimutatni. 6. példa: MALP¹2 adjuvánsként történõ alkalmazásával való immunizálás nem növeli a szérum IgE-szintjét A kísérlet menete: Immunizált és kontrollállatok szérumában lévõ összes IgE koncentrációjának meghatározásához a megfelelõ minták sorozathígítását készítettük el és inkubáltuk mikrotiterlemezeken, amelyeket elõzetesen befogó ellenanyagként antiegér-IgE-vel vontunk be (100 ml/lyuk). Az 1% BSA-val és 0,05% Tween–20-szal kiegészített PBS-sel két órán keresztül, szobahõmérsékleten történõ blokkolást követõen a szérum 1:100-szoros, PBS-Tweenben készült hígításait adtuk a lyukakhoz (100 ml/lyuk), és a lemezeket egy órán keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Mosást követõen biotinilált antiegér-IgE¹t adtunk hozzá, és a lemezeket egy további órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on. Négyszeri öblítést követõen 100 ml peroxidázzal konjugált streptavidint (Pharmingen) vittünk a lyukakba, és a lemezeket 30 percen keresztül, 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeri öblítést követõen a reakciókat 0,01% hidrogén-peroxidot tartalmazó, 0,1 M citrát-foszfát-pufferben (pH 4,35) lévõ ABTS-sel kifejlesztettük. Tisztított egérIgE sorozathígításaival standardgörbét készítettünk. Ismert tény, hogy bizonyos nyálkahártya-adjuvánsok IgE termelõdésének fokozásával allergiás reakciókat okozhatnak. Ennek a hipotézisnek az igazolására hozzáláttunk MALP¹2 beadásának hatását a szérum IgE-szintjére vizsgálni. Mint a 8. ábrából kiderül, MALP¹2 parenterálisan (ip.), illetõleg nyálkahártyán keresztüli beadása nem növeli az IgE szérumbeli koncentrációját. Ezzel szemben MALP¹2 jelenléte inkább pozitív hatást gyakorol az IgE-tartalom növekedésére, mint ezt a csak b¹galaktozidázzal ip. történõ oltást követõ 28. napon meg lehetett figyelni.
1
HU 004 117 T2
7. példa: MALP¹2 hatásos, T¹sejtek közvetítette proliferációs reakciót vált ki, amennyiben egy oldható antigénnel együtt adják A kísérlet menete: Az állkapocs alatti nyirokcsomókat és a lépet eltávolítottuk, és a sejtes immunreakciók vizsgálatához összegyûjtöttük. A sejteket 10% magzati borjúszérummal, 10 U/ml penicillinnel, 50 mg/ml sztreptomicinnel, 5×10–5 M 2¹merkaptoetanollal és 1 mM L¹glutaminnal (GIBCO BRL, Karlsruhe, Németország) kiegészített RPMI 1640-ben szaporítottuk, és 37 °C¹on, párás légkörben, 5% szén-dioxidban tároltuk. A nyirokcsomósejtekbõl és a lépsejtekbõl készült szuszpenziókat teljes tápközegben 5×106 sejt/ml¹re állítottuk, lapos aljú, 96 lyukú mikrotiterlemezekbe (Nunc) 100 ml/lyuk mennyiségben terítettük, és a lemezeket négy napon keresztül különbözõ koncentrációjú oldható b¹galaktozidáz jelenlétében inkubáltuk. Minden koncentrációt három csoportban vizsgáltunk. Az inkubálás utolsó 18 órájában minden lyukhoz 1 mCi [3H]timidint adtunk (Amersham International, Freiburg, Németország). Végül a sejteket filterpapírra vittük (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Németország) egy sejteket begyûjtõ készülék segítségével (Inotech, Wohlen, Svájc), és a szaporodott sejtek DNS-ébe beépült [3H]timidint g¹szcintillációs számlálóval mértük (Wallac 1450, MicroTrilux). Az eredményeket a [3H]timidin felvételének cpm-ben kifejezett számtani közepével ábrázoltuk. A T¹sejtek immunreakcióit a 31. napon értékeltük, amikor is a regionális nyirokcsomókból és a lépbõl b¹galaktozidázzal történt in vitro újrastimulációt követõen nyert sejtek szaporodását határoztuk meg. A csupán galaktozidázzal ip. oltott állatok lépsejtjei szolgáltak pozitív kontrollcsoportként, és szignifikáns szaporodási reakciót mutattak a nem immunizált csoporthoz képest (9A. ábra). A szaporodás további fokozódását figyeltük meg azokból az állatokból származó lépsejteknél, amelyek MALP¹2 és antigén együttes injekcióját kapták p<0,05). Míg csak b¹galaktozidáz in. adminisztrációja semmilyen kimutatható sejtgyarapodást nem okozott, MALP¹2 együttes adása hatásos proliferációs választ eredményezett mind helyileg (nyirokcsomósejtek), mind szisztémásan (lépsejtek) (9B. és C. ábrák). Megjegyzésre érdemes, hogy a legerõsebb T¹sejt-proliferációt azon egerek lépsejtjeinél figyeltük meg, amelyeknél a MALP-2¹t és a b¹galaktozidázt in. alkalmaztuk (9B. ábra). Valamennyi esetben nyilvánvaló dózisfüggõ hatást tapasztaltunk a b¹galaktozidázkoncentrációk emelésével az újrastimuláció alatt (5, 10, 20 mg/ml). Végül pedig MALP¹2 adjuvánsként történõ alkalmazása (0,5 mg) a T¹sejtek szaporodásának statisztikailag szignifikáns fokozódásához vezetett összehasonlítva plusz b¹galaktozidázzal (10 mg) történõ in. immunizálással (8B. ábra). 8. példa: MALP¹2 adjuvánsként történõ alkalmazásával kiváltott, segítõ T¹sejt-mintázat vizsgálata A kísérlet menete: Nunc-Immuno MaxiSorp 96 lyukú vizsgálati lemezeket (Nunc, Roskilde, Dánia) lyukanként 100 ml, 5 mg/ml b¹galaktozidázzal rétegeztünk
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 10
2
(Boehringer, Mannheim, Németország) 0,05 M karbonátpufferben (pH 8,2). A szérumból vagy a mosófolyadékból felezõ sorozathígításokat készítettünk 1% BSA¹t és 0,5% Tween–20¹at tartalmazó PBS-ben (100 ml/lyuk), és a lemezeket 2 órán keresztül, 37 °C¹on inkubáltuk. Mosást követõen biotinnnal konjugált patkány antiegér-IgG1¹et, ¹IgG2a¹t, ¹IgG2b¹t, illetõleg ¹IgG3¹at (Pharmingen, Hamburg, Németország) adtunk hozzá, hogy az Ig¹alosztályokat meghatározzuk. A lemezeket további egy órán keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeres öblítést követõen a sejtekhez 100 ml peroxidázzal konjugált streptavidint (Pharmingen) adtunk, és a lemezeket 30 percen keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeres öblítést követõen a reakciókat 0,01% hidrogén-peroxidot tartalmazó, 0,1 M citrát-foszfát-pufferben (pH 4,35) lévõ ABTS-sel fejlesztettük ki. A szérumban lévõ IgG-alosztályok koncentrációjának meghatározása érdekében standardgörbét készítettünk, ahol a lyukakban izotípusspecifikus kecske antiegér-IgG¹t rétegeztünk, és azután tisztított egér-IgG1gyel, ¹IgG2a-val, ¹IgG2b-vel, illetõleg ¹IgG3-ellenanyagokkal (Dianova, Hamburg, Németország) inkubáltuk. Szaporodó sejtkultúrák felülúszó folyadékát a 2. és a 4. napokon levettük, és –70 °C¹on tároltuk. Az IFNg, IL–2, IL–4 és IL–10 meghatározásokat ELISA segítségével végeztük, és Pharmingen kereskedelmi forgalomban kapható ellenanyagait alkalmaztuk a gyártó elõírásai szerint. Röviden összefoglalva, a 96 lyukú mikrotiterlemezeket egy éjszakán keresztül tisztított patkány antiegér-IFN¹g, anti-IL–2, anti-IL–4, illetõleg anti-IL–10 monoklonális ellenanyagokkal (Pharmingen) 4 °C¹on rétegeztük. Háromszori mosás után a lemezeket blokkoltuk, és a felülúszó folyadékokat a lyukakba vittük. Minden citokinre készítettünk egy standardgörbét, ahol a megfelelõ, rekombináns, egérféle-eredetû citokint (Pharmingen) alkalmaztuk. A lemezeket szobahõmérsékleten további 4 órán keresztül inkubáltuk. Mosást követõen biotinilált patkány antiegér-IFN¹g, ¹IL–2, ¹IL–4, illetõleg ¹IL–10 monoklonális ellenanyagokat (Pharmingen) adtunk a lyukakhoz, és a lemezeket egy órán keresztül szobahõmérsékleten inkubáltuk. Hatszoros mosást követõen streptavidin-peroxidáz konjugátumot adtunk hozzá, és a lemezeket 30 percen keresztül szobahõmérsékleten inkubáltuk. Ezután a lemezeket az elõzõekben ismertetettek szerint ABTS-sel kifejlesztettük. Elõször az immunizált egerek szérumában lévõ b¹galaktozidázspecifikus IgG alosztály-besorolását végeztük el. Mint az 1. táblázatban látható, a b¹galaktozidázspecifikus IgI-izotípus fõ típusa IgG1 az immunizálási módtól függetlenül. Ez a domináns Th2-reakciómintázat már az elsõ immunizálási adag után felismerhetõ, és az azt követõ megerõsítõ (booster) immunizálások során is megmarad. Az IgG1 az egyetlen izotípus, amelyik csak b¹galaktozidáz beadásánál is kimutatható, míg CTB vagy MALP¹2 együttes beadásánál további b¹galaktozidázspecifikus izotípusok, nevezetesen IgG2a (Th1 típus), IgG2b (Th2 típus) és IgG3 (Th1 típus) is megjelentek. Ennek ellenére az IgG1/2a (10. ábra), az IgG1/2b illetõleg az IgG1/3 aránya 100nál nagyobb volt.
1
HU 004 117 T2
2
1. táblázat b¹Galaktozidázspecifikus IgG-izotípusok immunizált egerek szérumábana Immunizálási csoport
b-gal (in.)
IgG2a
IgG2b
IgG3
22,6±21,3
0,7±0,5
0,3±0,1
0,6±0,0
b-gal+MALP¹2 (in.)
6439,0±1775
20,8±5,4
43,3±18,9
2,4±0,5
b-gal+CTB (in.)
4108,3±1437
31,9±9,5
49,2±17,3
2,4±0,6
b-gal (ip.)
191,5±132,1
0,1±0,0
0,5±0,1
0,6±0,0
b-gal+MALP¹2 (ip.)
2829,7±1119
10,0±2,8
15,8±6,2
2,3±0,6
0,4±0,0
0,23±0,0
0,1±0,0
0,4±0,0
Kontrollcsoport a
IgG1
Az eredményeket átlagérték (mg/ml) ±SEM formában adjuk meg (csoportonként 5 egér).
Az immunizálással kiváltott Th¹reakciók további jellemzése érdekében mértük az in vitro stimulált lépsejtek folyadék-felülúszóinak IFN-g¹, IL–2¹, IL–4- és IL–10-tartalmát (11A. ábra). Megállapítottuk, hogy ezen négy citokin közül az IL–10 képviseltette magát a legerõsebben, amely arra utal, hogy Th2-válasz jött létre. Az IL–10-mennyiség azokban az egerekben, amelyek MALP-2-vel in. voltak immunizálva, szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrollcsoportnál (2,2 ng/ml összehasonlítva a 0,009 ng/ml-rel, p<0,005), és azokkal az egerekkel összehasonlítva is, amelyeknél CTB¹t alkalmaztunk, mint nyálkahártya-adjuvánst (0,6 ng/ml, p<0,05). A megfigyelt válaszmintázat a Th2 típusú domináns citokinnel egybevág az ugyanezen állatoknál megállapított b¹galaktozidázspecifikus IgG1 kimutatásával (10. ábra). Valóban az IL–10 kiválasztásának erõs stimulálása egybevág azzal a szereppel, amelyet ez a citokin a Th1-sejteken keresztül a citokinszintézis gátlásában játszik, a B¹sejtek szaporodásának elõsegítésében és az IgA-termelõdésének elõsegítésében. Annak ellenére, hogy a regionális nyirokcsomósejtek tenyészetének tápközegében a citokinkoncentráció alacsonyabb abszolút értékeit sikerült megállapítani, az általános mintázat a lépsejtkultúráknál megállapítotthoz hasonlít (10. ábra). Érdekes, hogy bár az IL–10 és IL–4 kiválasztása stimulálódott azon egerek sejtjeiben, amelyek csak b¹galaktozidázzal ip. voltak immunizálva, a Th1-citokin IL–2 és IFN¹g azonban a kimutathatósági határ alatt maradt. Ezzel szemben az IL–2¹t és IFN-g¹t azoknál az egereknél is ki lehetett mutatni, amelyek az antigént CTB-vel vagy MALP-2-vel keverve kapták (10. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak a megállapított IgG-izotípus-mintázattal (1. táblázat), és megerõsítik, hogy bár a Th2-reakciótípusok vannak túlsúlyban, de azért MALP¹2 a Th1-sejtek stimulálását is elõsegíti. 9. példa: b¹Galaktozidáz modellantigénnel történõ orális immunizálás MALP-2, mint nyálkahártyaadjuváns alkalmazásával Hat-nyolc hetes, nõstény BALB/c (H¹2d) egereket vásároltunk a Hartan Winkelmann GmbH-tól (Borchen, Németország), és a helyi és az európai közösség elõírásai szerint tartottuk õket. Öt¹öt egérbõl álló csoportokat az 1., a 14., a 21. és a 31. napokon 100 mg b¹gal-lal (Boehringer, Mannheim, Németország) vagy csak
20
25
30
35
40
45
50
55
egyedül, vagy 2 mg szintetikus MALP-2-vel, mint adjuvánssal orális úton (25 ml adagban) immunizáltunk. A 45. napon szérumpróbákat vettünk, és –20 °C¹on tároltuk a b¹gal-specifikus ellenanyagok meghatározásáig. Nunc-Immuno MaxiSorp® 96 lyukú vizsgálati lemezeket (Nunc, Roskiide, Dánia) lyukanként 100 ml, 5 mg/ml koncentrációjú b¹gal-lal rétegeztünk 0,05 M karbonátpufferben (pH 8,2). A szérumokból vagy a mosófolyadékokból felezõ sorozathígításokat készítettünk 1% BSA¹t és 0,05% Tween–20¹at tartalmazó PBS-ben (100 ml/lyuk), és a lemezeket 2 órán keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Mosás után biotinilált g¹láncspecifikus kecske antiegér-IgG¹t adtunk a lyukakba (Sigma Chemie, Deisenhofen, Németország), és a lemezeket további egy órán keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Négyszeres mosást követõen a sejtekhez 100 ml peroxidázzal konjugált streptavidint adtunk (Pharmingen), és a lemezeket 30 percen keresztül 37 °C¹on inkubáltuk. Négy mosási lépést követõen a reakciókat 0,01% hidrogén-peroxidot tartalmazó, 0,1 M citrát-foszfát-pufferben (pH 4,35) lévõ ABTS-sel kifejlesztettük. A végsõértéktitereket azon utolsó hígítás reciprok logaritmikus log2 értékével fejezzük ki, amelynél 30 perc inkubálás után az optikai denzitás 405 nm¹nél 0,1 egységgel nagyobb a negatív kontrollnál kapott értéknél. b¹Gal-lal szembeni immunválaszokat csak azoknál az állatoknál figyeltünk meg, amelyek MALP-2-vel, mint nyálkahártya-adjuvánssal voltak immunizálva, illetõleg oltva (lásd, 12. ábra). Várható, hogy különbözõ adagolásnál is immunreakciók mind a testfolyadékokban, mind pedig a sejtekben kiválthatók, melyek hatásosabbak, mint a csak az antigén beadásával kiváltott válaszok. Továbbá antigénspecifikus nyálkahártya-reakciók legalábbis helyileg a belekben (azaz antigénspecifikus szekretoros IgA a bél mosófolyadékában) kimutathatók. Ezenkívül várható, hogy szekretoros reakciók távoli nyálkahártyákban is megfigyelhetõk.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Az (I) szerkezeti képletû lipopeptid vagy lipoprotein alkalmazása mukozális adjuvánsként nyálkahártyán keresztül történõ, terápiás vagy profilaktikus vak60 cinációnál, 11
1
HU 004 117 T2
(I) 5
ahol R1 és R2 azonos vagy egymástól különbözõ lehet, és jelentése C7–25-alkil, C7–25-alkenil vagy C7–25-alkinil, X jelentése S, O vagy CH2, R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül H vagy metil, és Y jelentése egy 1–25 aminosavból álló, fiziológiailag elviselhetõ és az alkalmazott fajokban önmagában nem immunogén aminosavszekvencia, és a *¹gal jelölt aszimmetrikus szénatom a Cahn–Ingold–Prelog-szabály szerint abszolút R¹konfigurációban van. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy Y 12–25 aminosavból áll. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az Y aminosavszekvenciát a következõkbõl választjuk: a) GQTNT b) SKKKK c) GNNDESNISFKEK d) GQTDNNSSQSAAPGSGTTNT. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az (I) szerkezeti képlet szerinti lipoprotein vagy lipopeptid S¹[2,3-biszpalmitoiloxi-(2R)-propil]-ciszteinil-peptid. 5. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a mukozális adjuváns
10
15
20
25
30
35
12
2
a tényleges vakcinakomponenssel együtt készítményben van jelen, amely vakcinakomponens intranazális, intra-NALT, orális aeroszolként, intrarektális, konjunktivális, intravaginális vagy intrauretrális felhasználásra vagy nõi mell tejcsatornáiban történõ felhasználásra szánt. 6. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a mukozális adjuváns a nõi mell tejcsatornáiba, intranazális, intra-NALT, orális aeroszolként, intrarektális, konjunktivális, intravaginális vagy intrauretrális módon, vakcinával együttesen történõ beadásra szolgáló reagenskészletben van jelen. 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid vagy lipoprotein még legalább egy további adjuvánssal és/vagy antigénnel egy készítményben van jelen. 8. Az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid vagy lipoprotein egy fizikai vagy biológiai hordozóval van társítva vagy kombinálva. 9. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid vagy lipoprotein egy vagy több gyulladásgátló, antiangiogén, citotoxikus vagy immunmodulátor anyaggal vagy liganddal vagy ellenanyaggal együtt kerül beadásra, vagy ezekkel egy készítményben van jelen. 10. Az 1–9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a lipopeptid vagy lipoprotein készítményben van jelen, amely további adalék és segédanyagokat, elõnyösen konzerválóanyagokat vagy stabilizátorokat tartalmaz. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vakcina, amelyet az adjuváns kísér, peptid, protein, DNS, poliszacharid, glikolipid vagy glikoprotein formájú.
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
13
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
14
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
15
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
16
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
17
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
18
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
19
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
20
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
21
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
22
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
23
HU 004 117 T2 Int. Cl.: A61K 39/39
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
