(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000005558T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 005 558

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 760998 (22) A bejelentés napja: 2004. 05. 12. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040760998 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1629007 A2 2004. 11. 25. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1629007 B1 2009. 04. 15.

(51) Int. Cl.: C07K 14/505 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04101606 PCT/US 04/014889

(30) Elsõbbségi adatok: 469993 P 2003. 05. 12. 470244 P 2003. 05. 12.

(73) Jogosult: Affymax, Inc., Palo Alto, CA 94303 (US)

US US

(72) Feltalálók: HOLMES, Christopher, P., Saratoga, CA 95070 (US); YIN, Qun, Palo Alto, CA 94303 (US); LALONDE, Guy, Woodside, CA 94062 (US); SCHATZ, Peter, Cupertino, CA 95014 (US); TUMELTY, David, Sunnyvale, CA 94085 (US); PALANI, Balu, Cupertino, CA 95014 (US); ZEMEDE, Gemete, H., Santa Clara, CA 94051 (US) (54)

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

Az eritropoietin-receptort kötõ, új peptidek

(57) Kivonat

HU 005 558 T2

A találmány tárgyát eritropoietin-receptor (EPO¹R) agonista peptidvegyületek képezik. A találmány tárgyát ilyen peptidvegyületeket elégtelen vagy hibás vörösvértest-termeléssel járó rendellenességek kezelésére

alkalmazó terápiás eljárások is képezik. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti peptidvegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A leírás terjedelme 64 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 005 558 T2

A találmány tárgyköre A találmány tárgyát eritropoietin-receptor (EPO¹R) agonista peptidvegyületek képezik. A találmány tárgyát ilyen peptidvegyületeket elégtelen vagy hibás vörösvértest-termeléssel járó rendellenességek kezelésére alkalmazó terápiás eljárások is képezik. A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti peptidvegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények is. A találmány háttere Az eritropoietin egy 165 aminosavból álló, körülbelül 34 kilodalton (kD) molekulasúlyú, a 24., 38., 83. és 126. aminosavpozíciókban elõnyös glikozilációs helyet hordozó glikoproteinhormon, amely eredetileg egy 23 aminosavból álló szignálpeptidet tartalmazó prekurzor fehérjeként termelõdik. Az EPO három formában fordul elõ: a¹ és b¹eritropoietin, illetve szialocsoportot nem tartalmazó (aszialo¹) eritropoietin. Szénhidrátkomponenseiket tekintve az a¹ és b¹formák között ugyan van némi eltérés, viszont potenciájuk, biológiai aktivitásuk és molekulasúlyuk ugyanaz. Az aszialoforma olyan a¹ vagy b¹forma, amelyrõl a terminális szénhidrát (sziálsav) eltávolításra került. Az EPO¹t kódoló DNSszekvencia ismert [US 4 703 008 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Lin]. Az EPO serkenti a prekurzor eritrociták osztódását és differenciálódását, és ezáltal biztosítja az eritrociták termelõdését. Az EPO akkor termelõdik a vesében, ha a szervezetben oxigénhiányos állapot áll elõ. A prekurzor eritrociták EPO által indukált differenciálódása során globinszintézis indukálódik, a nem komplex szintézise serkentõdik, és nõ a ferritinreceptorok száma. E változások lehetõvé teszik, hogy a sejtek több vasat vegyenek fel és több, az érett eritrocitákban oxigént kötõ, mûködõképes hemoglobint szintetizáljanak. Ennélfogva az eritrociták és azok hemoglobinja a test oxigénellátásában kulcsszerepet tölt be. E változásokat az EPO és a prekurzor eritrociták sejtfelszínén lévõ megfelelõ receptor közötti kölcsönhatás indítja be [lásd például Graber és Krantz, Ann. Rev. Med. 29, 51–66 (1978)]. Az egészséges állapotú testben – ahol a szöveteket a megfelelõ számú eritrocita elegendõ oxigénnel látja el – az EPO igen alacsony koncentrációkban van jelen a plazmában. E normálisan alacsony koncentráció elégséges a vörösvértestek normális öregedése folytán bekövetkezõ veszteség pótlásának serkentésére. Hipoxiás körülmények esetén – azaz, amikor a keringésben a vörösvértestek oxigénszállítása lecsökken – a keringésben jelen lévõ EPO mennyisége megnõ. Hipoxiát válthat ki, például, vérzés miatti lényeges vérveszteség, sugárzásnak való túlzott mértékû kitettség okozta vörösvértest-pusztulás, tengerszint feletti nagy magasság vagy elhúzódó ájulás, illetve az anémia különféle formái miatt bekövetkezõ csökkent oxigénfelvétel. Az ilyen hipoxiás stresszre válaszként a megnövekedett EPO-szintek a progenitor eritroid sejtek proliferációjának serkentésével fokozzák a vörösvérsejt-termelést. Amikor a keringésben lévõ vörösvértestek száma nagyobb annál, mint ami a szövetek normális oxi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

génellátásához szükséges, az EPO-szintek a keringésben lecsökkennek. Mivel az EPO elengedhetetlenül szükséges a vörösvértestek kialakulásához, e hormon potenciálisan egyaránt alkalmazható az alacsony vagy hibás vörösvérsejt-termelés jellemezte vérrendellenességek diagnosztizálására és kezelésére. A közelmúltban elvégzett kísérletek alátámasztották az EPO-terápia hatékonyságát, többek között az alábbi betegségi stádiumok, rendellenességek és hematológiai rendellenességi stádiumok esetén való kipróbálására: béta-talasszémia [Vedovato és munkatársai, Acta. Haematol. 71, 211–213 (1984)]; cisztás fibrózis [Vichinsky és munkatársai, J. Pediatric 105, 15–21 (1984)]; terhességi és menstruációs rendellenességek [Cotes és munkatársai, Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90, 304–311 (193)]; koraérettség miatti korai anémia [Haga és munkatársai, Acta Pediatr. Scand. 72, 827–831 (1983)]; gerincvelõsérülés [Claus-Walker és munkatársai, Arch. Phys. Med. Rehabil. 65, 370–374 (1984)]; ûrutazás [Dunn és munkatársai, Eur. J. Appl. Physiol. 52, 178–182 (1984)]; akut vérveszteség [Miller és munkatársai, Brit. J. Haematol. 52, 545–590 (1982)]; korosodás [Udupa és munkatársai, J. Lab. Clin. Med. 103, 574–580 és 581–588 (1984), és Lipschitz és munkatársai, Blood 63, 502–509 (1983)]; abnormális vörösvérsejt-képzõdéssel járó különféle neoplasztikus betegségi állapotok [Dainiak és munkatársai, Cancer 5, 1101–1106 (1983), és Schwartz és munkatársai, Otolaryngol. 109, 269–272 (1983)]; és veseelégtelenség [Eschbach és munkatársai, N. Eng. J. Med. 316, 73–78(1987)]. A tisztított, homogén EPO jellemzésére is sor került [US 4.677.195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Hewick)]. EPO¹t kódoló DNS-szekvenciát már tisztítottak, klónoztak és expresszáltak a természetes EPO-éval azonos biokémiai és immunológiai tulajdonságokkal rendelkezõ rekombináns polipeptid elõállítása céljából. A természetes EPO¹n lévõvel azonos oligoszacharidokat hordozó rekombináns EPOmolekulát is elõállítottak [Sasaki és munkatársai, J. Biol. Chem. 262, 12 059–12 076 (1987)]. Úgy tûnik, hogy az EPO biológiai hatásának közvetítése, részben, sejtmembránhoz kötött receptorral való kölcsönhatás révén történik. Egérlépbõl izolált, éretlen eritroidsejtek alkalmazásával folyt kezdeti kísérletek alapján felmerült, hogy az EPO¹t kötõ sejtfelszíni fehérjék két, egy körülbelül 85 000 dalton és egy körülbelül 100 000 dalton molekulasúlyú, polipeptidet tartalmaznak [Sawyer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3690–3694 (1987)]. Az EPO¹t kötõ helyek számát sejtfelszínenként átlagosan 800–1000 közöttinek kalkulálták. E kötõhelyek közül körülbelül 300 megközelítõleg 90 pM¹os (pikomólos) Kd-értékkel, míg a maradék, csökkent affinitással, körülbelül 570 pM¹os Kd-értékkel köt EPO¹t [Sawyer és munkatársai, J. Biol. Chem. 262, 5554–5562 (1987)]. Egy független vizsgálat szerint a Friend-féle leukémia vírus anémiás törzsével (FVA) oltott egerek lépébõl preparált, EPO¹ra reagáló eritroblasztoknak összesen körülbelül 400 magas (Kd=100 pM) és alacsony affinitású (Kd=800 pM) EPO-

1

HU 005 558 T2

kötõhelye van [Landschulz és munkatársai, Blood 73, 1476–1486 (1989)]. További kísérletek során kapott eredmények jelezték, hogy az EPO-receptor (EPO¹R) két formáját egyetlen gén kódolja. Ezt a gént is klónozták már [lásd például Jones és munkatársai, Blood 76, 31–35 (1990); Noguchi és munkatársai, Blood 78, 2548–2556 (1991); Maouche és munkatársai, Blood 78, 2557–2563 (1991)]. Például az egéreredetû és emberi EPO¹R fehérjék DNS-szekvenciái és kódolt peptidszekvenciái a WO 90/08822 számú nemzetközi bejelentésben vannak leírva (D’Andrea és munkatársai). A jelenlegi modell szerint, az EPO EPO¹R-hez való kötõdése a két EPO¹R-molekula dimerizálódásához és aktiválódásához vezet, amely a jelátvitel (szignáltranszdukció) rákövetkezõ lépéseit eredményezi [lásd például Watowich és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2140–2144 (1992)]. Az EPO¹R klónozott génjeinek elérhetõsége elõmozdítja e fontos receptor agonistáinak és antagonistáinak kutatását. A rekombináns receptorfehérje elérhetõsége lehetõvé teszi a receptor-ligandum kölcsönhatás tanulmányozását különféle, sokféle peptidet véletlenszerûen vagy félig véletlenszerûen elõállító rendszerekben. E rendszerek közé tartozik a „peptidek plazmidokon” rendszer [lásd US 6.270.170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]; a „peptidek fágokon” rendszer [lásd US 5.432.018 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, és Cwirla és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378–6382 (1990)]; a „kódolt szintetikus könyvtár” (encoded synthetic library, ESL) rendszer [lásd US 946 239 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (1992. szept. 16.)]; és az „igen nagy léptékû, immobilizált polimerszintézís” rendszer [lásd 5.143.854 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 90/15070 számú nemzetközi bejelentés; Fodor és munkatársai, Science 251, 767–773 (1991); Dower és Fodor, Ann. Rep. Med. Chem. 26, 271–180 (1991); és US 5 424 186 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. EPO¹R-rel – legalábbis valamilyen mértékig – kölcsönhatásba lépõ peptideket azonosítottak és írtak le például az US 5 773 569; US 5 830 851, és US 5 986 047 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban [Wrighton és munkatársai]; a WO 96/40749 számú nemzetközi bejelentésben [Wrighton és munkatársai]; az US 5 767 078 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban és a 96/40772 számú nemzetközi bejelentésben [Johnson és Zivin]; a WO 01/38342 számú nemzetközi bejelentésben [Balu], és a WO 01/91780 számú nemzetközi bejelentésben [Smith-Swintosky és munkatársai]. Konkrétan olyan, peptidmotívumot tartalmazó peptidcsoportot azonosítottak, amelynek tagjai EPO¹R-hez kötõdnek és EPO-tól függõ sejtproliferációt serkentenek. Továbbá a motívumot tartalmazó, eddig azonosított peptidek EPO-tól függõ sejtproliferációt serkentenek in vitro, ahol a serkentés EC50-értéke körülbelül 20 nanomólos (nM) és körülbelül 250 nM közé esik.

2

Ennélfogva az EPO által serkentett maximális sejtproliferáció 50%-ának megfelelõ mértékû serkentéshez 20 nM és 250 nM közötti peptidkoncentráció szükséges. Az EPO¹R-agonisták döbbenetes potenciáljának is5 meretében, e receptor által közvetített fontos biológiai aktivitások és betegségek kezelésére irányuló vizsgálatok esetében továbbra is szükség van fokozott potenciájú és aktivitású EPO¹R-peptidagonisták azonosítá10 sára. A találmány tárgyát ilyen vegyületek képezik. Az e részben és a részletes leírásban említett hivatkozások és/vagy azok tárgyalása pusztán csak a találmány leírásának tisztázását szolgálják, és nem jelentik annak elismerését, hogy ezen hivatkozások bármelyike 15 a szabadalmazhatóság szempontjából figyelembe veendõ anterioritás lenne.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

A találmány összefoglalása A találmány tárgyát új, drámaian megnövekedett potenciájú és aktivitású EPO¹R-agonista peptidvegyületek képezik. E peptidvegyületek az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei, vagy az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei, az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG) aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 3 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei; ahol minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van feltüntetve, az „(AcG)” jelentése N¹acetil-glicin, az „(1¹nal)” jelentése 1¹naftil-alanin, és az „(MeG)” jelentése N¹metil-glicin, vagy más néven szarkozin. Egy adott peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz a monomerek cisztein aminosavai között. A peptidmonomerek elágazó tercier amidlinkerhez történõ kovalens kötéssel dimerizálhatók. A tercier amidlinker az alábbi képlettel ábrázolható: –C1O–CH2–X–CH2–C2O– ahol: X jelentése NCO–(CH2)2–N1H–; a linker C1 atomja amidkötést képez az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; a linker C2 atomja amidkötést képez a második peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; és az X N1 atomja pedig karbamátkötés vagy amidkötés révén kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz; ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 20 000 dalton és körülbelül 40 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a linker N1 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

1

HU 005 558 T2

2

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a linker N1 atom-

ja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol 20 (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és a

linker N1 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

4

1

HU 005 558 T2

2

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és

a linker N1 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

A peptidmonomerek elágazó tercier amidlinkerhez történõ kovalens kötéssel dimerizálhatók. A tercier amidlinker az alábbi képlettel ábrázolható: –C1O–CH2–X–CH2–C2O–, ahol X jelentése NCO–(CH2)2–NH–C3O–; a linker C1 atomja amidkötést képez az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; és a linker C2 atomja amidkötést képez a második peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával. A találmány szerinti peptiddimerek még az alábbi szerkezetû spacer-csoportot is tartalmazzák: –N1H–(CH2)4–C4H–N2H–, ahol a spacer C4 atomja kovalensen kapcsolódik az X C3 atomjához; a spacer N1 atomja karbamát- vagy amidkötés révén kovalensen kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz; és a spacer N2 atom-

ja karbamát- vagy amidkötés révén kovalensen kap25 csolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 10 000 dalton és körülbelül 50 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig 30 könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Minden PEG-csoport egyedileg lehet 10 000 dalton (10 kD), 20 kD, 30 kD, 40 kD, vagy 50 kD. Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPlT(1¹nal)VC35 QPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

5

1

HU 005 558 T2

2

A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban a két peptidmonomer C¹terminális lizinje L¹lizin. Továbbá a fenti kémiai szerkezetbõl a szakember számára egyértelmû, hogy a két lineáris PEG-csoport lizinnel van

összekapcsolva (például mPEG 2 -Lys-NHS vagy mPEG2-Lysinol-NPC formájában), amely lizin elõnyösen L¹lizin és amely révén az alábbi sztereokémia alakul ki:

Esetleg a lizinek közül egy vagy több lehet D¹lizin, aminek eredményeként, a szakember számára könnyen érthetõ, alternatív sztereokémiák jöhetnek létre. Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VC-

QPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány 25 szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

Akárcsak a fentiekben, e vegyületben lévõ lizinmolekulák elõnyösen mind L¹lizinek, ami az alábbi sztereokémiát eredményezi:

45

6

1

HU 005 558 T2

További lehetõség, hogy a lizinek közül egy vagy több lehet D¹lizin, aminek eredményeként alternatív sztereokémiája molekulák jöhetnek létre, ami a szakember számára könnyen érthetõ. Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VC-

5

2

QPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, ahol Y jelentése karbamátcsoport, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

Elõnyös, ha ebben a molekulában a peptidmonomert és a lineáris PEG-csoportokat összekötõ lizincso-

portok mind L¹lizinek, melynek eredményeként az alábbi sztereokémia jön létre:

Esetleg a lizinek közül egy vagy több lehet D¹lizin, aminek eredményeként, a szakember számára könnyen érthetõ, alternatív sztereokémiák jöhetnek létre. Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VC-

QPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel áb45 rázolható:

7

1

HU 005 558 T2

2

Elõnyös, ha ebben a molekulában a peptidmonomert és a lineáris PEG-csoportokat összekötõ lizincso-

portok mind L¹lizinek, melynek eredményeként az alábbi sztereokémia jön létre:

A találmány más megvalósítási módjaiban, a lizinek közül egy vagy több lehet D¹lizin, aminek eredményeként, a szakember számára könnyen érthetõ, alternatív sztereokémiák jöhetnek létre. A peptidmonomerek lizinlinkerhez való kapcsolással is dimerizálhatók, ahol egy peptidmonomer C¹terminálisánál kapcsolódik a lizin e¹amino-csoportjához és a második peptidmonomer C¹terminálisánál kapcsolódik a lizin a¹amino-csoportjához. A találmány szerinti peptiddimerek még az alábbi szerkezetû spacer csoportot is tartalmazzák: –N1H–(CH2)2–O–(CH2)2–O–(CH2)2N2H–. Az egyik végen, a spacer N1 atomja amidkötéssel van hozzákapcsolva a lizinlinker karbonilcsoportjának

szénatomjához. A másik végen, a spacer N2 atomja karbamátkötéssel vagy amidkötéssel csatlakozik va25 lamilyen aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 20 000 dalton és körülbelül 40 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák 30 pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Ahol a spacer karbamátkötéssel kapcsolódik egy adott polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek (a SEQ ID No. 35 3 számú szekvencia) az alábbi képlettel ábrázolhatók:

Továbbá, a találmány tárgyát ilyen peptidvegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, és különféle egészségügyi állapotok ilyen peptidvegyületek alkalmazásával történõ kezelésére szolgáló eljárások képezik.

His vagy H; a glutaminé Gln vagy Q; az aszparaginé Asn vagy N; a liziné Lys vagy K; az aszpartinsavé Asp vagy D; a glutaminsavé Glu vagy E; a ciszteiné Cys 50 vagy C; a triptofáné Trp vagy W; az argininé Arg vagy R; és a gliciné pedig Gly vagy G. A nem hagyományos aminosavakat az alábbiak szerint rövidítettük: az 1¹naftil-alanin rövidítése 1¹nal vagy Np; az N¹metil-gliciné (más néven szarkoziné) MeG vagy Sc; és az acetile55 zett gliciné (N¹acetil-gliciné) pedig AcG. A leírás szerinti értelemben, a „polipeptid” vagy „fehérje” kifejezés olyan, aminosavmonomerek által alkotott polimert jelen, amelyben alfa-aminosavak amidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz. Ennélfogva a poli60 peptidek legalább két aminosav hosszúságúak, és

A találmány szerinti megoldás részletes leírása Meghatározások A peptidekben lévõ aminosavakat az alábbi rövidítésekkel jeleztük: a fenil-alanin rövidítése Phe vagy F; a leucin és Leu vagy L; az izoleuciné Ile vagy I; a metioniné Met vagy M; a valiné Val vagy V; a szeriné Ser vagy S; a proliné Pro vagy P; a treoniné Thr vagy T; az alaniné Ala vagy A; a tiroziné Tyr vagy Y; a hisztidiné

8

1

HU 005 558 T2

gyakran hosszabbak. Általában, a „peptid” kifejezés olyan polipeptidet jelent, amely csak néhány aminosav hosszúságú. A találmány szerinti új EPO¹R-agonista peptidek elõnyösen 50 aminosavnál nem hosszabbak. Elõnyösebb, ha körülbelül 17 és körülbelül 40 aminosav közötti hosszúságúak. A peptidekkel szemben, egy adott polipeptid bármilyen számú aminosavat tartalmazhat. Ennélfogva a polipeptid kifejezés peptideket és hosszabb aminosavszekvenciákat foglal magában. A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászatilag elfogadható” kifejezés olyan molekuláris entitásokat és készítményeket jelent, amelyeket „általában biztonságosnak tekintenek”, például, embernek való beadás esetén élettanilag tolerálhatók és jellemzõen nem váltanak ki allergiás vagy hasonlóképpen kellemetlen reakciót, mint például gyomorrontást, szédülést és hasonlókat. A leírás szerinti értelemben elõnyös, ha a „gyógyászatilag elfogadható” kifejezés szövetségi vagy állami kormányzati szabályozó hivatal vagy az US Gyógyszerkönyv vagy más, általában elfogadott gyógyszerkönyv által, állatokban, elõnyösebben emberben való alkalmazás jóváhagyását jelenti. A „hordozó” kifejezés olyan diluenst, adjuvánst, kötõanyagot vagy vivõanyagot jelent, amellyel a vegyület beadásra kerül. Ilyen gyógyászati hordozók lehetnek steril folyadékok, például víz és olaj, ideértve a nyersolajból, állatból, növénybõl származó vagy szintetikus olajokat, például mogyoróolaj, ásványi olaj, szezámolaj és hasonlók. Elõnyös, ha hordozóként – különösen az injektálható oldatok esetében – vizet vagy vizes oldatot, sóoldatokat és vizes dextróz- vagy glicerinoldatot alkalmazunk. Alkalmas gyógyászati hordozók a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” kiadványban (E. W. Martin) vannak leírva. A leírás szerinti értelemben az „agonista” kifejezés olyan, biológiailag aktív ligandumot jelent, amely kötõdik annak komplementer, biológiailag aktív receptorához és azt aktiválva vagy biológiai választ vált ki a receptorban, vagy fokozza a receptor már létezõ biológiai aktivitását. Új, EPO¹R-agonista peptidek A találmány tárgyát olyan új, EPO¹R-agonista peptidvegyületek képezik, amelyek aktivitása és potenciája drámaian megnövekedett. E peptidvegyületek az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei, vagy az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei, ahol minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van feltüntetve, az „(AcG)” jelentése N¹acetil-glicin, az „(1¹nal)” jelentése 1¹naftil-alanin, és az „(MeG)” jelentése N¹metil-glicin, vagy más néven szarkozin. Egy adott peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz a monomerek cisztein aminosavai között. Ilyen monomerek vázlatosan az alábbiak szerint ábrázolhatók:

2

vagy 5

(SEQ ID NO: 1); és 10 vagy

15 (SEQ ID NO: 2)

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

E monomer peptidek dimerizálásával fokozott EPO¹R-agonista aktivitású peptiddimereket állítunk elõ. A linker (LK) csoport olyan, elágazó tercier amid, amely a két monomer C¹terminális lizinjéhez való egyidejû kapcsolódásával összeköti a két peptidmonomer C¹terminálisát. A tercier amidlinker az alábbi képlettel ábrázolható: –C1O–CH2–X–CH2–C2O– ahol: X jelentése NCO–(CH2)2–N1H–; a linker C1 atomja amidkötést képez az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; a linker C2 atomja amidkötést képez a második peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; és az X N1 atomja pedig karbamátkötés vagy amidkötés révén kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz; ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 20 000 dalton és körülbelül 40 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek mint a megállapított molekulasúly). A tercier amidlinker az alábbi képlettel is ábrázolható: –C1O–CH2–X–CH2–C2O– ahol: X jelentése NCO–(CH2)2–NH–C3O–; a linker C1 atomja amidkötést képez az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával; és a linker C2 atomja amidkötést képez a második peptidmonomer C¹terminális lizinjének e¹amino-csoportjával. A találmány szerinti peptiddimerek még az alábbi szerkezetû spacer csoportot is tartalmazzák: –N1H–(CH2)4–C4H–N2H– ahol: a spacer C4 atomja kovalensen kapcsolódik az X C3 atomjához; a spacer N1 atomja karbamát- vagy amidkötés révén kovalensen kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz; és a spacer N2 atomja karbamát- vagy amidkötés révén kapcsolódik egy aktivált PEG-csoporthoz, ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 10 000 dalton és körülbelül 60 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEGkészítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Eszerint a találmány szerinti új peptidek PEG-csoportot is tartalmaznak, amely karbamát- vagy amidkö-

1

HU 005 558 T2

téssel kovalensen kapcsolódik a peptiddimer tercier amidlinkeréhez. A PEG gyógyászatilag elfogadható, vízben oldódó polimer. A találmány szerinti megoldásban alkalmazandó PEG lehet olyan, lineáris, nem elágazó PEG, amelynek molekulasúlya körülbelül 20 kilodalton (20 K) és körülbelül 60 K közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Elõnyösebb, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 30 K és körülbelül 40 K közé esik. A szakember képes kiválasztani a kívánt polimerméretet olyan tényezõk figyelembevételével, mint amilyen a kívánt dozírozás, keringési idõ, proteolízissel szembeni rezisztencia, a biológiai aktivitásra gyakorolt hatások (ha van ilyen), könnyû kezelhetõség, antigenicitás mértéke vagy hiánya, és a PEG terápiás peptidekre gyakorolt más ismert hatásai. A találmány szerinti peptidek, peptiddimerek és más, peptiden alapuló molekulák a vízoldékony polimer(ek)nek a molekula receptorkötõ részéhez való kapcsolására szolgáló különféle kémiai eljárások bármelyikének alkalmazásával (például peptid+spacer) kapcsolhatók vízoldékony polimerekhez (például PEGhez). A találmány jellemzõ megvalósításai módjában a vízoldékony polimer(ek)et egyetlen kapcsolódási ponton kötjük kovalensen a receptorkötõ részhez, bár más megvalósítási módokban alkalmazható többszörös kapcsolódási pont, ideértve azokat a variációkat is, ahol különféle, vízoldékony polimerféléket kapcsolunk a receptorkötõ rész elkülönült kapcsolódási pontjaihoz, így például kovalens kapcsolódási pont(ok) a spacerhez és/vagy egyik vagy mindkét peptidlánchoz. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a dimer vagy magasabb multimer elkülönült peptidláncféleségeket (azaz heterodimert vagy más heteromultimert) tartalmaz. Például, de a találmányt semmiben sem korlátozva, egy adott dimer tartalmazhat egy, PEG-kötõhelyet tartalmazó elsõ peptidláncot és egy PEG-kötõhelyet nem hordozó vagy az elsõ peptidlánctól eltérõ kapcsolásra szolgáló más kémiai eljárást alkalmazó második peptidláncot, és bizonyos változatokban a spacer tartalmaz vagy nem tartalmaz PEG-kötõhelyet és a spacer – amennyiben PEG-ezett – hasznosíthat az elsõ és/vagy második peptidláncétól eltérõ kémiai kapcsolási eljárást. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában a receptor kötõrészéhez kapcsolt PEG¹t alkalmazunk, és ettõl különbözõ vízoldékony polimert (például szénhidrátot) konjugálunk a molekula peptidrészének aminosavai egyikének oldalláncához. A receptort kötõ rész PEG-ezésére (peptid+spacer) különféle polietilénglikol (PEG)-féleségek alkalmazhatók. Lényegében bármilyen alkalmas reaktív PEG-reagens alkalmazható. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban a reaktív PEG-reagens a receptort kötõ részhez való konjugáláskor karbamát- vagy amidkötés kialakulását eredményezi. Alkalmas reaktív PEG-féleségek közé tartoznak, minden korlátozás nélkül, a NOF Corporation (Yebisu Garden Place Tower, 20–3 Ebisu 4¹chome, Shibuya¹ku, Tokyo 150–6019) Drug Delivery Systems katalógusában (2003) és a Nektar Therapeu-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

tics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806) Molecular Engineering katalógusában (2003) beszerzésre elérhetõ PEG¹ek. A találmány különféle megvalósítási módjaiban például minden korlátozás nélkül, gyakran elõnyösek az alábbi PEG-reagensek: mPEG2NHS, mPEG2-ALD, többkaros PEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-tioészterek, mPEG-kettõs észterek, mPEGBTC, mPEG-ButyrALD, mPEG-ACET, heterofunkcionális PEGs CNH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, FmocPEG-NHS, NHS-PEG¹VS, NHS-PEG-MAL), PEG akrilátok (ACRL-PEG-NHS), PEG-foszfolipidek (például mPEG-DSPE), a SUNBRITE sorozatba tartozó többkaros PEG¹ek, ideértve a szakember által választott kémiai eljárással aktivált, glicerinalapú PEG¹ek GL¹sorozata, a SUNBRITE sorozatba tartozó bármilyen aktivált PEG (így, minden korlátozás nélkül, a karboxilPEG¹ek, p¹NP-PEG¹ek, Trezil-PEG¹ek, aldehid PEG¹ek, acetál-PEG¹ek, amino-PEG¹ek, tiol-PEG¹ek, maleimido-PEG¹ek, hidroxil-PEG-amin, amino-PEGCOOH, hidroxil-PEG-aldehid, karboxilsavanhidrid típusú PEG, funkcionalizált PEG-foszfolipid, és más hasonló és/vagy alkalmas reaktív PEG¹ek, amelyeket a szakember a konkrét alkalmazás és felhasználás ismeretében kiválaszt. A találmány szerinti peptidek tartalmazhatnak két, valamilyen spacer csoporthoz karbamát- vagy amidkötéssel kovalensen kapcsolt PEG-csoportot, ahol a spacer csoport kovalensen kötõdik a peptiddimer tercier amidlinkeréhez. A találmány ilyen megvalósítási módjaiban alkalmazott két PEG-csoport mindegyike lehet lineáris és akár egyetlen csatlakozási pontban lehetnek egymáshoz kapcsolva. Elõnyös, ha minden PEG-csoport molekulasúlya körülbelül 10 kilodalton (10 K) és körülbelül 60 K közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Lineáris PEGcsoportok különösen elõnyösek. Elõnyösebb, ha a két PEG-csoport mindegyikének molekulasúlya körülbelül 20 K és körülbelül 40 K közé esik, és még elõnyösebb, ha körülbelül 20 K és körülbelül 40 K közé esik. Ennél is elõnyösebb, ha a két PEG-csoport mindegyikének molekulasúlya körülbelül 20 K. A szakember képes kiválasztani a kívánt polimerméretet olyan tényezõk figyelembevételével, mint amilyen a kívánt dozírozás, keringési idõ, proteolízissel szembeni rezisztencia, a biológiai aktivitásra gyakorolt hatások (ha van ilyen), könnyû kezelhetõség, antigenicitás mértéke vagy hiánya, és a PEG terápiás peptidekre gyakorolt más ismert hatásai. A találmány tárgyát olyan peptidagonisták is képezik, amelyek az (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG) aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 3 számú szekvencia) peptidmonomerek homodimerjei, ahol minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van feltüntetve, az „(AcG)” jelentése N¹acetilglicin, az „(1¹nal)” jelentése 1¹naftil-alanin, és az „(MeG)” jelentése N¹metil-glicin, vagy más néven szarkozin. A peptiddimer mindkét peptidmonomerje intra-

1

HU 005 558 T2

molekuláris diszulfidkötést tartalmaz a monomerek cisztein aminosavai között. Ilyen monomerek vázlatosan az alábbiak szerint ábrázolhatók (a SEQ ID No. 3 számú szekvencia): 5

vagy 10

E monomer peptidek dimerizálásával fokozott EPO¹R-agonista aktivitású peptiddimereket állítunk elõ. A linker (LR) csoport lizin aminosav, amely a két monomer C¹terminális aminosavához való csatlakozáskor a két peptidmonomer C¹terminálisát köti össze. Az egyik peptidmonomer a C¹terminálisánál kapcsolódik a lizin e¹amino-csoportjához és a második peptidmonomer a C¹terminálisánál kapcsolódik a lizin a¹amino-csoportjához. Például, a dimer szerkezetileg ábrázolható az I. képletben, és összefoglalva a II. képletben bemutatottak szerint: I. képlet

15

20

25

30

35 II. képlet

40

45

11

2

Az I. és II. képletben az N2 a lizin e¹amino-csoportjának nitrogénatomját, az N1 pedig a lizin a¹amino-csoportjának nitrogénatomját jelenti. A találmány szerinti peptiddimerek még az alábbi szerkezetû spacer csoportot is tartalmazzák: –N1H–(CH2)2–O–(CH2)2–O–(CH2)2–N2H– Az egyik végen a spacer N1 atomja amidkötéssel van hozzákapcsolva a lizinlinker karbonilcsoportjának szénatomjához. A másik végen a spacer N2 atomja karbamátkötéssel vagy amidkötéssel csatlakozik valamilyen aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 10 000 dalton és körülbelül 60 000 dalton közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Elõnyösebb, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 20 000 dalton és körülbelül 40 000 dalton közé esik. Ennek megfelelõen a találmány szerinti új peptidek a peptiddimerhez kovalensen kapcsolt PEG-csoportot is tartalmaznak. A PEG gyógyászatilag elfogadható, vízben oldódó polimer. A találmány szerinti megoldásban alkalmazandó PEG lehet lineáris, nem elágazó PEG, amelynek molekulasúlya körülbelül 20 kilodalton (20 K) és körülbelül 60 K közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Elõnyösebb, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 20 és körülbelül 40 K közé, még elõnyösebben 30 és körülbelül 40 K közé esik. A szakember képes kiválasztani a kívánt polimerméretet olyan tényezõk figyelembevételével, mint amilyen a kívánt dozírozás, keringési idõ, proteolízissel szembeni rezisztencia, a biológiai aktivitásra gyakorolt hatások (ha van ilyen), könnyû kezelhetõség, antigenicitás mértéke vagy hiánya, és a PEG, terápiás peptidekre gyakorolt más ismert hatásai. Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a linker N1 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

1

HU 005 558 T2

2

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a linker

N1 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a

linker N1 atomja karbamátkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a

linker N1 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új 45 peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

12

1

HU 005 558 T2

2

A találmány szerinti elõnyös peptiddimerek, minden korlátozás nélkül, az alábbiak:

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

13

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

14

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

15

1

HU 005 558 T2

2

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja karbamátkötéssel kovalensen

kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének amino- 20 savszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) és a spa-

cer N1 és N2 atomja amidkötéssel kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyület az alábbi képlettel ábrázolható:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VC- 40 QPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja karbamátkötéssel kovalen-

sen kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

16

1

HU 005 558 T2

kapcsolódik egy aktivált polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti új peptidvegyületek az alábbi képlettel ábrázolhatók:

Ahol a homodimer mindkét monomerjének aminosavszekvenciája (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) és a spacer N1 és N2 atomja amidkötéssel kovalensen

A találmány szerinti elõnyös peptiddimerek, minden korlátozás nélkül, az alábbiak:

2

25

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

17

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

18

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 1)

19

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 1)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

20

HU 005 558 T2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

21

1

HU 005 558 T2

2

Táblázat (folytatás)

(SEQ ID NO: 2)

(SEQ ID NO: 2)

Ahol a spacer karbamátkötéssel kapcsolódik egy adott polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány

szerinti új peptidvegyületek (a SEQ ID No. 3 számú szekvencia) az alábbi képlettel vázolhatók:

Ahol a spacer amidkötéssel kapcsolódik egy adott polietilénglikol (PEG)-csoporthoz, a találmány szerinti

45 új peptidvegyületek (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) az alábbi képlettel ábrázolhatók:

E dimerszerkezet leírható [Ac-peptid, diszulfid]2Lysspacer-PEG20–40 alakban, utalva a lizin a¹ és e¹aminocsoportjához egyaránt kapcsolódó, N¹terminálisán acetilezett peptidre, ahol mindkét peptid intramolekuláris di-

szulfidhidat és a lizin C¹terminálisa és egy PEG-csoport közötti kovalens kötést kialakított spacer molekulát tartalmaz, és ahol a PEG molekulasúlya körülbelül 60 20 000 dalton és körülbelül 40 000 dalton közé esik. 22

1

HU 005 558 T2

2

A találmány szerinti elõnyös peptiddimerek, minden korlátozás nélkül, az alábbiak:

(SEQ ID NO: 3)

(SEQ ID NO: 3)

(SEQ ID NO: 3)

(SEQ ID NO: 3)

(SEQ ID NO: 3)

(SEQ ID NO: 3)

23

1

HU 005 558 T2

A húsz hagyományos aminosav sztereoizomerjei (például D¹aminosavak), nem természetes aminosavak, mint például a,a-diszubsztituált aminosavak, N¹alkil-aminosavak, tejsav, és más nem hagyományos aminosavak is a találmány szerinti vegyületek alkalmas összetevõi lehetnek. Nem hagyományos aminosavak közé tartoznak például minden korlátozás nélkül, az alábbiak: b¹alanin, 3¹piridil-alanin, 4¹hidroxiprolin, O¹foszfoszerin, N¹metil-glicin, N¹acetilszerin, N¹formilmetionin, 3¹metilhisztidin, 5¹hidroxi-lizin, norleucin, és más hasonló aminosavak és iminosavak. Más módosítások is lehetségesek, így például az aminoterminális módosítása, a karboxiterminális módosítása, természetes körülmények között elõforduló, genetikailag kódolt aminosavak közül egynek vagy többnek helyettesítése nem hagyományos aminosavval. Egy vagy több aminosav oldalláncának módosítása, peptidfoszforiláció, és hasonlók. A találmány szerinti peptidszekvenciák lehetnek önmagukban vagy a peptidlánc N¹terminális és/vagy C¹terminális kiterjesztésével együtt. Ilyen kiterjesztések lehetnek természetes körülmények között kódolt peptidek, igény szerint, természetes körülmények között nem elõforduló szekvenciákkal együtt vagy lényegében azok nélkül; a kiterjesztések közé tartozhat bármilyen addíció, deléció, pontmutáció, vagy a szekvencia más változtatásai vagy kombinációi a szakember kívánsága szerint. Egy adott változatban, a szekvencia humanizálását eredményezõ aminosavszubsztitúció a peptidet az emberi immunrendszerrel kompatibilissé teszi. A találmány tárgyát képezi mindenféle típusú fúziós fehérje, így a találmány szerinti, EPO¹R¹t aktiváló szekvenciák mellé vagy közelében lévõ immunglobulin-szekvencia nem immunglobulin-eredetû spacer szekvenciával együtt vagy anélkül. A találmány egyik megvalósítási módjában a találmány tárgya olyan immunglobulinlánc, amely EPO¹R¹t aktiváló szekvenciát tartalmaz a nehéz és/vagy könnyû lánc variábilis (V) régiója helyett.

5

10

15

20

25

30

35

40 A találmány szerinti peptidvegyületek elõállítása Peptidszintézis A találmány szerinti peptidek elõállíthatók a technikában ismert klasszikus eljárásokkal. E standard eljárások közé tartozik szilárd fázisú szintézis, részlegesen szilárd fázisú szintetikus eljárások, fragmentumkondenzáció, klasszikus oldatos szintézis, és rekombináns DNS-technológia [lásd például Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)]. A találmány egyik megvalósítási módjában a peptiddimer peptidmonomereket egyedileg szintetizáljuk és a szintézist követõen dimerizáljuk. A találmány egy másik megvalósítási módjában a dimer peptidmonomerjeit C¹terminálisuknál kapcsoljuk össze két, a peptidszintézis kiindulási helyeként szolgáló funkcionális csoportot és egy másik molekulacsoporthoz (például a szilárd hordozó felszínén esetleg jelen levõ) való kötõdést lehetõvé tevõ harmadik funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmazó, elágazó tercier amidlinker (LK)

45

50

55

60 24

2

csoport alkalmazásával. Ebben az esetben, a szilárd fázisú szintetikus eljárások valamelyik variációja segítségével a két peptidmonomer közvetlenül szintetizálható a linker (LK) csoport két reaktív nitrogéncsoportjára. Ilyen szintézis lehet szekvenciális vagy egyidejû. A találmány egy másik megvalósítási módjában a két peptidmonomer közvetlenül szintetizálható a linker (LK) csoport két reaktív nitrogéncsoportjára a szilárd fázisú szintetikus eljárások valamelyik variációja segítségével. Ilyen szintézis lehet szekvenciális vagy egyidejû. A találmány e megvalósítási módjában két, a peptidszintézis kiindulási helyeként szolgáló funkcionális csoportot és egy másik molekulacsoporthoz (például a szilárd hordozó felszínén esetleg jelen levõ) való kötõdést lehetõvé tevõ harmadik funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmazó harmadik funkcionális csoportot [például a lizin karboxilcsoportja, vagy a lizinamid aminocsoportja, olyan lizincsoport, amelyben a karboxilcsoport amidcsoporttá (–CONH2) lett alakítva] tartalmazó lizinlinker (LK) csoportot alkalmazunk. Amennyiben a dimer peptidláncainak szekvenciális szintézise linkeren történik, a linkermolekula két funkcionális amincsoportját két különbözõ, ortogonálisan eltávolítható aminvédõcsoporttal védjük. A védett linkert a linker harmadik funkcionális csoportja révén kapcsoljuk valamilyen szilárd hordozóhoz. Az elsõ aminvédõcsoportot eltávolítjuk, és a dimer elsõ peptidjét az elsõ, már nem védett amincsoporton szintetizáljuk. Majd, eltávolítjuk a második aminvédõcsoportot, és a dimer második peptidjét a második, már nem védett amincsoporton szintetizáljuk. Például a linker elsõ aminocsoportját védhetjük Alloc-kal, és a másodikat pedig Fmoc-kal. Ebben az esetben, gyenge bázissal [például 20% piperidin dimetil-formamidban (DMF) oldva] végzett kezeléssel eltávolíthatjuk az Fmoc-csoportot (de az Alloc-csoport nem), és megszintetizáljuk az elsõ peptidláncot. Ezután alkalmas reagenssel [például Pd(PPh3)/4¹metil morfolin és kloroform] az Alloc-csoportot távolíthatjuk el, és utána megszintetizáljuk a második peptidláncot. Figyeljünk arra, hogy amennyiben a ciszteinnél a diszulfidkötés kialakulásának szabályozására más tiolvédõcsoportot alkalmazunk (lásd alább), akkor ezt az eljárást még akkor is alkalmazni kell, ha a dimer peptidláncainak végsõ aminosavsorrendje azonos. Amennyiben a dimer peptidláncainak szimultán szintézise linkeren történik, a linkermolekula két funkcionális amincsoportját ugyanazzal a két eltávolítható aminvédõcsoporttal védjük. A védett linkert a linker harmadik funkcionális csoportja révén kapcsoljuk valamilyen szilárd hordozóhoz. Ebben az esetben a linkermolekula két védett funkcionális csoportjának védelmét egyidejûleg szüntetjük meg, és a már nem védett aminokon a két peptidláncot egyidejûleg szintetizáljuk. Figyeljünk arra, hogy ezen eljárás alkalmazásakor a dimer peptidláncainak szekvenciái azonosak legyenek, és a ciszteinre alkalmazott tiolvédõcsoportok is mind megegyezzenek. A peptidszintézisre alkalmazott elõnyös eljárás a szilárd fázisú szintézis. A szilárd fázisú peptidszintéziseljárások a technikában jól ismertek [lásd például Ste-

1

HU 005 558 T2

wart, „Solid Phase Peptide Syntheses”, kiad.: Freeman and Co., San Francisco (1969); Novabiochem Corp. (San Diego, USA) General Catalog (2002/2003); Goodman, „Synthesis of Peptides and Peptidomimetics”, kiad.: Houben–Weyl, Stuttgart (2002)]. A szilárd fázisú szintézisben, a szintézis jellemzõen a peptid C¹terminális végétõl kiindulva, a¹amino-csoporton védett gyanta alkalmazásával történik. Alkalmas kiindulási anyag, például, a kívánt a¹aminosav klór-metilezett gyantához, hidroxi-metil-gyantához, polisztirolgyantához, benzhidrilamin-gyantához, vagy hasonlókhoz való kapcsolásával állítható elõ. Egy ilyen klór-metilezett gyantát árul BIO-BEADS SX¹1 kereskedelmi néven a Bio Rad Laboratories (Richmond, CA). A hidroxi-metil-gyanta elõállítása az irodalomban le van írva [Bodonszky és munkatársai, Chem. Ind. London 38, 1597 (1966)]. A benzhidrilamin (BHA)-gyanta is le van írva [Pietta és Marshall, Chem. Commun. 650 (1970)], és a hidroklorid forma kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ a Beckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA) cégtõl. Például a¹amino-csoporton védett aminosav cézium-bikarbonát-katalizátor segítségével valamilyen klór-metilezett gyantához kapcsolható a Gisin által leírt eljárás szerint [Gisin, Helv. Chim. Acta 56, 1467 (1973)]. A kiindulási kapcsolás után az a¹amino-csoportot védõ csoportot – például szerves oldószerekkel készült trifluor-ecetsav- (TFA) vagy sósavoldat (HCl) alkalmazásával – szobahõmérsékleten eltávolítjuk. Ezután az a¹amino-csoporton védett aminosavakat egymás után összekapcsolva növekvõ, hordozóhoz kötött peptidlánchoz jutunk. Az a¹amino-csoportot védõ csoportok azok, amelyekrõl ismert, hogy alkalmazhatók a peptidek lépésenkénti szintézisének mûvészetében. Ilyen anyagok közé tartoznak az alábbiak: acil típusú védõcsoportok (e. g., formil, trifluoroacetil, acetil), aromás uretán típusú védõcsoportok [e. g., benzil-oxi-karbonil (Cbz) és szubsztituált Cbz], alifás uretán típusú védõcsoportok [e. g., t¹butil-oxi-karbonil (Boc), izopropil-oxikarbonil, ciklohexil-oxi-karbonil], és alkil típusú védõcsoportok (e. g., benzil, trifenil-metil), fluor-fenil-metiloxi-karbonil (Fmoc), alliloxi-karbonil (Alloc), és 1¹(4,4dimetil-2,6-dioxociklohex-1-ilidén)-etil (Dde). Az oldalláncot védõ csoportok (jellemzõen éterek, észterek, tritil¹, PMC, és hasonló csoportok) a kapcsolás során érintetlenül maradnak, és nem válnak le az aminoterminálist védõ csoport általi védelem megszüntetésekor vagy a kapcsolás során. Az oldalláncot védõ csoportnak olyannak kell lennie, hogy azt el lehessen távolítani a végsõ peptid szintézisének befejezésekor és a célpeptidet meg nem változtató reakciókörülmények között. A Tyr aminosav esetében az oldalláncot védõ csoportok közé tartoznak az alábbi csoportok: tetrahidropiranil, terc-butil, tritil, benzil, Cbz, Z¹Br-Cbz, és 2,5-dikloro-benzil. Az Asp aminosav esetében az oldalláncot védõ csoportok közé tartoznak az alábbi csoportok: benzil, 2,6-dikloro-benzil, metil, etil, és ciklohexil. A Thr és Ser aminosavak esetében az oldalláncot védõ csoportok közé tartoznak az alábbi csoportok: acetil, benzoil, tritil, tetrahidropiranil, benzil, 2,6-dikloro-benzil, és Cbz. Az Arg aminosav esetében az oldalláncot védõ

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

2

csoportok közé tartoznak az alábbi csoportok: nitro, Tozil (Tos), Cbz, adamantil-oxi-karbonil-mezitoil-szulfonil (Mts), 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurán-5szulfonil (Pbf), 4¹metoxi-2,3,6-trimetil-benzolszulfonil (Mtr), vagy Boc. A Lys aminosav esetében az oldalláncot védõ csoportok közé tartoznak az alábbi csoportok: Cbz, 2¹kloro-benzil-oxi-karbonil (2¹Cl-Cbz), 2¹bromobenzil-oxi-karbonil (2¹Br-Cbz), Tos, vagy Boc. Az a¹amino-csoportot védõ csoport eltávolítása után, a megmaradt védett aminosavakat a kívánt sorrendben aminosavanként összekapcsoljuk. Minden védett aminosavat általában körülbelül háromszoros feleslegben reagáltatunk a megfelelõ karboxilcsoport-aktivátor, például metilén-kloridban (CH2Cl2), N¹metilpirrolidonban, dimetil-formamidban (DMF), vagy ezek keverékében oldott 2¹(1H-benzo-triazol-1¹il)-1,1,3,3tetrametil-uronium-hexafluoro-foszfát (HBTU) vagy diciklohexil-karbodiimid (DCC), alkalmazásával. A kívánt aminosavszekvencia elkészítése után, a kívánt peptidet valamilyen, a peptidet a gyantáról leválasztó és minden megmaradt oldalláncvédõ csoportot hasító reagenssel – például trifluoro-ecetsavval (TFA) vagy hidrogén-fluoriddal (HF) – leválasztjuk a gyantáról. Klór-metilezett gyanta alkalmazása esetén a hidrogén-fluoriddal végzett kezelés szabad peptidsavak kialakulását eredményezi. Benzhidrilamin-gyanta alkalmazásakor a hidrogén-fluorid-kezeléssel közvetlenül jutunk szabad peptidaminokhoz. Esetleg klór-metilezett gyanta alkalmazásakor, ha a peptidgyantáról az oldalláncában védett peptidet ammóniával választjuk le, akkor a kívánt, oldalláncban védett amidot, ezzel szemben az alkil-amin alkalmazásakor oldalláncban védett alkilamidot vagy dialkilamidot kapunk. Ezután a szokásos hidrogén-fluoridos kezeléssel eltávolítjuk az oldalláncot védõ csoportot, és így jutunk szabad amidokhoz, alkilamidokhoz vagy dialkilamidokhoz. A találmány szerinti észterek elõállításában a peptidsavak elõállítására alkalmazott gyantákat hasznosítunk, és az oldalláncban védett peptidet bázissal és a megfelelõ alkohollal (például metanol) hasítjuk le. Ezután az oldalláncokat védõ csoportokat a szokásos módon hidrogén-fluoriddal végzett kezeléssel eltávolítva kapjuk a kívánt észtert. Ezen eljárások olyan peptidek szintetizálására is alkalmazhatók, amelyekben a természetes körülmények között elõforduló 20, genetikailag kódolt aminosavtól eltérõ aminosav a találmány szerinti bármelyik vegyület egy, kettõ, vagy több pozíciójánál szubsztituálva van. A találmány szerinti peptidekbe szubsztituálható szintetikus aminosavak közé tartoznak, minden korlátozás nélkül, az alábbiak: N¹metil, L¹hidroxi-propil, L-3,4-dihidroxi-fenil-alanil, d¹aminosavak, például L¹d-hidroxi-lizil és D¹d-metil-alanil, L¹a-metil-alanil, b aminosavak, és izoquinolil. D¹aminosavak és természetes körülmények között elõ nem forduló szintetikus aminosavak is beépíthetõk a találmány szerinti peptidekbe.

A peptidek módosításai A találmány szerinti peptidvegyületek amino60 és/vagy karboxiterminálisa is módosítható a találmány 25

1

HU 005 558 T2

szerinti más vegyületek elõállítása céljából. Például az aminoterminális acetilezhetõ ecetsavval vagy annak valamelyik halogénezett származékával, például a¹klór-ecetsavval, a¹bróm-ecetsavval, vagy a¹jód-ecetsavval. A genetikailag kódolt 20 aminosav (vagy a sztereoizomer D¹aminosavak) természetes körülmények között elõforduló oldalláncai helyettesíthetõk más oldalláncokal, például alkil¹, alacsonyabb alkil¹, ciklusos 4, 5, 6 vagy akár 7 tagú alkil¹, amid¹, amid alacsonyabb alkil¹, amid di(alacsonyabb alkil)¹, alacsonyabb alkoxi¹, hidroxi¹, karboxi- és azok alacsonyabb észterszármazékai, és 4, 5, 6 vagy akár 7 tagú heterociklusos csoportokkal. Konkrétan, alkalmazhatók olyan prolinanalógok, amelyben a prolin gyûrûmérete 5 tagúról 4, 6 vagy 7 tagúra lett változtatva. A ciklusos csoportok lehetnek telítettek vagy telítetlenek. A telítetlen gyûrû lehet aromás vagy nem aromás. Elõnyös, ha a heterociklusos csoport egy vagy több nitrogén, oxigén és/vagy kén heteroatomot tartalmaz. Ilyen csoportok közé tartoznak például az alábbi csoportok: furazanil, furil, imidazolidinil, imidazolil, imidazolinil, izotiazolil, izoxazolil, morfolinil (például morfolino), oxazolil, piperazinil (például 1¹piperazinil), piperidil (például 1¹piperidil, piperidino), piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridil, pirimidinil, pirrolidinil (például 1¹pirrolidinil), pirrolinil, pirrolil, tiadiazolil, tiazolil, tienil, tiomorfolinil (például tiomorfolino), és triazolil. E heterociklusos csoportok lehetnek szubsztituáltak vagy nem szubsztituáltak. Ahol egy adott csoport szubsztituálva van, a szubsztituens lehet alkil, alkoxi, halogén, oxigén, vagy szubsztituált, illetve nem szubsztituált fenil. Peptidek könnyen módosíthatók foszforilezéssel és más eljárásokkal [lásd például Hruby és munkatársai, Biochem J. 268, 249–262 (1990)]. A találmány szerinti peptidvegyületek szerkezeti modellként szolgálhatnak hasonló biológiai aktivitású nem peptid vegyületek elõállításához. A szakember számára egyértelmû, hogy „lead” peptidvegyületekével azonos vagy hasonlóan kívánatos biológiai aktivitású, de az oldékonyságot, stabilitást és hidrolízisnek, illetve proteolízisnek való ellenállóságot tekintve a „lead” vegyületnél elõnyösebb aktivitású vegyületek elõállítására különféle eljárások léteznek [Morgan és Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24, 243–252 (1989)]. Ilyen eljárások közé tartozik a peptidváz helyettesítése foszfonátokból, amidátokból, karbamátokból, szulfonamidokból, szekunder aminokból, és N¹metil-aminosavakból álló vázzal. Diszulfidkötések kialakítása A találmány szerinti vegyületek két, intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaznak. Ilyen diszulfidkötések kialakíthatók az egyes peptidmonomerek cisztein aminosavainak oxidálásával. A találmány egyik megvalósítási módjában a ciszteinkötés kialakításának szabályozását a kívánt izomer kialakításának optimalizálása szempontjából hatékony típusú és koncentrációjú oxidálóágens kiválasztásával

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 26

2

vizsgáltuk. Például egy adott peptiddimert két, intramolekuláris diszulfidkötés (peptidlánconként egy-egy) kialakításának céljából elõnyösen oxidálhatunk (az intramolekuláris diszulfidkötések kialakítása mellett) DMSO vagy jód (I2) oxidálóágens alkalmazásával. A találmány további megvalósítási módjaiban, a peptidszintézis során a ciszteinkötés kialakulását a tiolt védõ csoportok szelektív alkalmazásával szabályozzuk. Például amennyiben két intramolekuláris diszulfidkötést tartalmazó dimerre van szükség, az elsõ monomer peptidláncot úgy szintetizáljuk, hogy a magszekvencia két cisztein aminosavát egy elsõ tiolvédõcsoporttal [például tritil (Trt), alliloxi-karbonil (Alloc), és 1¹(4,4-dimetil-2,6-dioxociklohex-1-ilidén)-etil (Dde) vagy hasonlók] védjük, majd megszintetizáljuk a második monomer peptidet, amelyben a magszekvencia két cisztein aminosavát egy második – az elsõ tiolvédõcsoporttól eltérõ tiolvédõcsoporttal [például acetamido-metil (Acm), t¹butil (tBu) vagy hasonlók] védjük. Mindezek után, az elsõ tiolvédõcsoportok eltávolításával befolyásoljuk az elsõ monomer gyûrûvé alakulását (ciklizációját), majd ezután második tiolvédõcsoportok eltávolításával a második monomer gyûrûvé alakulását. A találmány más megvalósítási módjaiban elõállítjuk e diszulfidszármazékok olyan analógjait, amelyben a kénatomok CH2-csoporttal vagy a kén más izoszterjével vannak helyettesítve. Ezen analógok a találmány szerinti vegyületekbõl a technikában ismert eljárások alkalmazásával [Barker és munkatársai, J. Med. Chem. 35, 2040–2048 (1992); és Or és munkatársai, J. Org. Chem. 56, 3146–3149 (1991)] végzett intramolekuláris vagy intermolekuláris átrendezõdéssel elõállíthatók, ahol minden peptidmonomer tartalmaz legalább egy C vagy homocisztein aminosavat és a második C aminosav helyén egy a¹amino-g-vajsavat. A szakember számára egyértelmû, hogy ilyen átrendezõdés az a¹amino-g-vajsav és homocisztein más homológjainak alkalmazása esetén is elõfordulhat. A fenti gyûrûzárási stratégiák mellett más, nem diszulfid típusú peptidciklizálási stratégiák is alkalmazhatók. Ilyen alternatív ciklizálási stratégiák közé tartoznak, például, amidciklizációs stratégiák és azok, amelyekben tioéterkötések kialakulása történik. Így a találmány szerinti vegyületek létezhetnek intramolekuláris amidkötéssel vagy intramolekuláris tioéterkötéssel ciklizált formában. Például szintetizálhatunk olyan peptidet, amelyben a magszekvencia egyik ciszteinjét lizinre, a második ciszteint pedig glutaminsavra cseréltük, majd e két aminosav oldalláncai közötti amidkötéssel gyûrûs monomert állíthatunk elõ. Esetleg olyan peptidet is szintetizálhatunk, amelyben a magszekvencia egyik ciszteinre lizinre (vagy szerint) van cserélve, és ezt követõen a lizin (vagy szerin) aminosav és a magszekvencia második cisztein aminosav oldalláncai közötti tioéterkötés révén gyûrûs monomert alakíthatunk ki. A diszulfidciklizációs stratégiák mellett, az amidciklizációs stratégiák és tioéter-ciklizációs stratégiák egyaránt könnyen alkalmazhatók a találmány szerinti vegyületek gyûrûvé zárására. Esetleg a peptid aminoterminálisa a¹szubsztituált ecetsavval lefedhetõ, ahol az

1

HU 005 558 T2

a¹szubsztituens egy távozócsoport, mint például a¹halo-ecetsav, például a¹klór-ecetsav, a¹bróm-ecetsav, vagy a¹jód-ecetsav. Elágazó tercier amidlinker addíciója A peptidmonomerek elágazó tercier amidlinkercsoporttal dimerizálhatók. A találmány egyik megvalósítási módjában a linkert a peptidszintézis alatt építjük be a peptidbe. Például, ha a linker LK csoport két, a peptidszintézishez kiindulási helyül szolgáló funkcionális csoportot és egy vagy több más, egy vagy több más molekulacsoport kötõdését lehetõvé tevõ funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmaz, a linker szilárd hordozóhoz konjugálható. Ebben az esetben a két peptidmonomer közvetlenül szintetizálható a linker (LK) csoport két reaktív nitrogéncsoportjára a szilárd fázisú szintetikus eljárások valamelyik variációja segítségével. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában a linker a peptiddimer két peptidmonomerjéhez konjugálható a peptidszintézis után. Ilyen konjugáció elérhetõ a technikában jól megalapozott eljárásokkal. A találmány egyik megvalósítási módjában a linker két, a szintetizált peptidmonomerek célzott funkcionális csoportjaihoz való csatlakoztatásra alkalmas funkcionális csoportot tartalmaz. Például két – vagy elõre aktivált, vagy alkalmas kapcsolóreagens mellett jelen lévõ – karboxilcsoportot tartalmazó linker reagáltatható a két peptidmonomer egyikén célbavett lizin oldalláncának amincsoportjával. Például a peptidmonomerek kémiai úton kapcsolhatók a tercier amidlinkerhez. A*–C1O–CH2–X–CH2–C2O–B* ahol: X=NCO–(CH2)2–NH–Y, és Y=megfelelõ védõcsoport, mint például t¹butil-oxi-karbonil (Boc) védõcsoport; A*=alkalmas funkcionális csoport, például N¹oxi-szukcinimid, amely a linker C1 atomjának az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizin aminosavának e¹amino-csoportjához való konjugálására szolgál; B*=alkalmas funkcionális csoport, például N¹oxi-szukcinimid, amely a linker C2 atomjának a második peptidmonomer C¹terminális lizin aminosavának e¹amino-csoportjához való konjugálására szolgál. Továbbá például a peptidmonomerek kémiai úton kapcsolhatók a tercier amidlinkerhez. A*–C1O–CH2X–CH2–C2O–B* ahol: X=NCO–(CH 2 ) 2 –NH–C 3 O–; A*=alkalmas funkcionális csoport, például N¹oxi-szukcinimid, amely a linker C1 atomjának az elsõ peptidmonomer C¹terminális lizin aminosavának e¹amino-csoportjához való konjugálására szolgál; B*=alkalmas funkcionális csoport, például N¹oxi-szukcinimid, amely a linker C2 atomjának a második peptidmonomer C¹terminális lizin aminosavának e¹amino-csoportjához való konjugálására szolgál; és a tercier amidlinker kémiai úton a spacer csoporthoz van kötve, Y–NH–(CH2)4–C4H–NH–Y ahol: az X C3 atomja kovalensen kötõdik a spacer C4 atomjához, és Y=alkalmas védõcsoport, mint például t¹butil-oxi-karbonil (Boc) védõcsoport.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 27

2

Lizinlinker addíciója A peptidmonomerek lizinlinker LK csoporttal dimerizálhatók. A találmány egyik megvalósítási módjában a lizinlinkert a peptidszintézis alatt építjük be a peptidbe. Például, ha a lizinlinker LK csoport két, a peptidszintézishez kiindulási helyül szolgáló funkcionális csoportot és egy vagy több más, egy vagy több más molekulacsoport kötõdését lehetõvé tevõ funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmaz, a linker szilárd hordozóhoz konjugálható. Ezután a szilárd fázisú szintetikus eljárások valamelyik variációja segítségével a két peptidmonomer közvetlenül szintetizálható a lizinlinker LK csoport két reaktív nitrogéncsoportjára. A találmány egy olyan, alternatív megvalósítási módjában, amelyben a peptiddimert lizinlinker LK csoporttal dimerizáljuk, a linker a peptidszintézis után konjugáltatható a peptiddimer két peptidmonomerjéhez. Ilyen konjugáció elérhetõ a technikában jól megalapozott eljárásokkal. A találmány egyik megvalósítási módjában a linker legalább két, a szintetizált peptidmonomerek célzott funkcionális csoportjaihoz való csatlakoztatásra alkalmas funkcionális csoportot tartalmaz. Például, a lizin két szabad aminocsoportja reagáltatható mindkét peptidmonomer C¹terminális karboxilcsoportjával. Spacer addíciója A találmány szerinti peptidvegyületek spacer csoportot is tartalmaznak. A találmány egyik megvalósítási módjában a spacert a peptidszintézis alatt építjük be a peptidbe. Például ahol a spacer szabad aminosavat és egy második, további molekulacsoport kötõdését lehetõvé tevõ funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmaz, a linker konjugálható a szilárd hordozóhoz. A találmány egyik megvalósítási módjában két funkcionális csoportot tartalmazó spacert egy elsõ funkcionális csoport révén elõször a szilárd hordozóhoz csatlakoztatjuk. Ezután két, a peptidszintézis kiindulási helyeként szolgáló funkcionális csoportot és egy másik molekulacsoporthoz (például a szilárd hordozó felszínén esetleg jelen levõ) való kötõdést lehetõvé tevõ harmadik funkcionális csoportot (például karboxilcsoportot vagy aminocsoportot) tartalmazó harmadik funkcionális csoportot tartalmazó lizinlinker LK csoportot konjugáltatunk a spacerhez a spacer második funkcionális csoportja és a linker harmadik funkcionális csoportja révén. Ezt követõen a két peptidmonomer közvetlenül szintetizálható a linker (LK) csoport két reaktív nitrogéncsoportjára a szilárd fázisú szintetikus eljárások valamelyik variációja segítségével. Például szilárd fázishoz kapcsolt, szabad aminocsoportot tartalmazó spacer reagáltatható a lizinlinkerhez a lizinlinker szabad karboxilcsoportja segítségével. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában a spacert a peptidszintézis alatt építjük be a peptiddimerbe. Ilyen konjugáció elérhetõ a technikában jól megalapozott eljárásokkal. A találmány egyik megvalósítási módjában a linker legalább egy, a szintetizált

1

HU 005 558 T2

peptid célzott funkcionális csoportjához való csatlakoztatásra alkalmas funkcionális csoportot tartalmaz. Például szabad aminocsoportot tartalmazó spacer reagáltatható egy adott peptid C¹terminális karboxilcsoportjával. Egy másik példában szabad karboxilcsoportot hordozó linker reagáltatható egy adott lizinamid szabad aminocsoportjával. Polietilénglikol (PEG) csatlakoztatása Az utóbbi években, vízoldékony polimereket, mint például polietilénglikolt (PEG), alkalmaztak terápiás vagy diagnosztikai szempontból fontos peptid kovalens módosítására. Az ilyen polimerek csatlakoztatásáról úgy vélik, hogy fokozza a biológiai aktivitást, a vérben megnöveli a keringési idõt, csökkenti az immunogenitást, vizes oldatban fokozza a stabilitást, és javítja a proteázok általi emésztés elleni rezisztenciát. Például az irodalomban leírtak szerint a PEG kovalens csatlakoztatása terápiás polipeptidekhez, például interleukinokhoz [Knauf és munkatársai, J. Biol. Chem. 263, 15 064 (1988); Tsutsumi és munkatársai, J. Controlled Release 33, 447 (1995)], interferonokhoz [Kita és munkatársai, Drug Des. Delivery 6, 157 (1990)], katalázhoz [Abuchowski és munkatársai, J. Biol. Chem. 252, 582 (1977)], szuperoxid-dizmutázhoz [Beauchamp és munkatársai, Anal. Biochem. 131, 25 (1983)], és adenozindeaminázhoz [Chen és munkatársai, Biochim. Biophys. Acta 660, 293 (1981)], in vivo megnöveli a polipeptidek féléletidejét és/vagy csökkenti azok immunogenitását és antigenicitását. A találmány szerinti peptidvegyületek tartalmazhatnak polietilénglikol (PEG)-csoportot, amely karbamátkötéssel vagy amidkötéssel kovalensen van csatlakoztatva az elágazó tercier amidlinkerhez vagy a peptiddimer spaceréhez. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott PEG például lehet lineáris, nem elágazó PEG, amelynek molekulasúlya körülbelül 20 kilodalton (20 K) és körülbelül 40 K közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Elõnyös, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 30 K és körülbelül 40 K közé esik. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott PEG másfelõl lehet például lineáris, nem elágazó PEG, amelynek molekulasúlya körülbelül 10 K és körülbelül 60 K közé esik (a „körülbelül” kifejezés azt jelzi, hogy PEG-készítményekben bizonyos molekulák nehezebbek, és bizonyos molekulák pedig könnyebbek, mint a megállapított molekulasúly). Elõnyös, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 20 K és körülbelül 40 K közé esik. Elõnyösebb, ha a PEG molekulasúlya körülbelül 20 K. PEG kovalens kapcsolására szolgáló eljárások (PEG-ezés) példái az alábbiakban vannak leírva. Ezek az illusztrációs célt szolgáló leírások a találmány szerinti megoldást semmiben sem korlátozzák. A szakember számára egyértelmû, hogy a technikában a legkülönfélébb eljárások léteznek a PEG kovalens kapcsolására. Mint olyan, a technikában ismert számtalan kapcsolási eljárások bármelyikével kap-

5

10

15

20

25

30

2

csolt PEG¹t hordozó peptidvegyületek a találmány oltalmi körébe tartoznak. Például, PEG köthetõ kovalensen a linkerhez aktivált PEG-molekula kovalens csatlakoztatására alkalmas reaktív csoport (például szabad aminocsoport vagy karboxilcsoport) révén. Különféle reaktív csoportokat tartalmazó, metoxilezett PEG („mPEG”) alkalmazásával PEG-molekulák köthetõk aminocsoportokhoz. Ilyen polimerek közé tartozna az alábbiak: mPEGszukcinimidil szukcinát, mPEG-szukcinimidil karbonát, mPEG-imidát, mPEG-4-nitro-fenil karbonát, és mPEGciánursav-klorid. Hasonlóképpen szabad amincsoportot tartalmazó, metoxilezett PEG (mPEG-NH2) alkalmazásával PEG-molekulák kapcsolhatók karboxilcsoportokra. A találmány néhány megvalósítási módjában a linker vagy spacer terminális aminocsoportot tartalmaz (például a spacer terminálisánál). E terminális aminocsoport stabil kovalens karbamátkötés kialakítása végett reagáltatható valamilyen alkalmasan aktivált PEGmolekulával, például mPEG-p-nitro-fenil-karbonáttal (mPEG-NPC). Esetleg e terminális aminocsoport stabil kovalens karbamátkötés kialakítása végett reagáltatható valamilyen alkalmasan aktivált PEG-molekulával, például mPEG-szukcinimidil-butiráttal (mPEG-SBA) vagy reaktív N¹hidroxil-szukcinimid (NHS) csoportot tartalmazó mPEG- szukcinimidil propionáttal (mPEG-SPA). A találmány más megvalósítási módjaiban a linker reaktív csoportja, alkalmas reakciókörülmények között valamilyen, amintartalmú PEG-molekulával kovalens kötés kialakítása végett aktiválható karboxilcsoportot tartalmaz. Alkalmas PEG-molekulák közé tartozik az mPEGNH2 és alkalmas reakciókörülmények közé tartozik a karbodiimid által közvetített amidképzés vagy hasonlók.

35

40

45

50

55

60 28

EPO¹R-agonista aktivitásának vizsgálata In vitro funkcionális vizsgálatok A tesztelendõ peptid és az EPO között az EPO¹Rhez való kötõdésért való versengés kvantitatív mértékét in vitro kompetitív vizsgálattal mérjük. Például [lásd például US 5 773 569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat], E. coliban rekombináns úton elõállíthatjuk az emberi EPO¹R (EPO¹t kötõ fehérje, EBP) extracelluláris doménjét és a rekombináns fehérjét szilárd hordozóhoz, például mikrotiterlemezhez vagy szintetikus gyöngyhöz (például Sulfolink gyöngyök, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) kötjük. Majd immobilizált EBP¹t inkubálunk jelzett rekombináns EPO-val, vagy jelzett rekombináns EPO-val és tesztpeptiddel. Ilyen vizsgálatokhoz a tesztpeptidbõl hígítási sorozatokat készítünk. Hozzáadott tesztpeptid nélkül végzett mérésben, kapott pontok határozzák meg az EBP összes EPO-kötését. Tesztpeptidet tartalmazó reakcióknál meghatározzuk a kötött EPO mennyiségét és a kontroll (total=100%) kötés százalékaként adjuk meg. Ezen értékeket a peptidkoncentráció függvényében ábrázoljuk. Az IC50-érték a tesztpeptid azon koncentrációja, amely az EPO EBP-hez való kötõdését 50%¹ra csökkenti (azaz az EPO kötõdésének 50%¹os gátlása).

1

HU 005 558 T2

Egy másik in vitro kompetitív kötési vizsgálat két gyöngy, EPO-val konjugált gyöngy és EPO¹R-rel konjugált gyöngy, közelében generált fényjelet méri. A gyöngyhöz való közelséget az EPO EPO¹R-hez való kötésével generáljuk. EPO-val az EPO¹R-hez való kötõdésért versengõ tesztpeptid megakadályozza ezt a kötõdést, ezáltal csökken a fényemisszió. A tesztpeptid fényemisszió 50%¹os csökkenését eredményezõ koncentrációja felel meg az IC50-értéknek. A találmány szerinti peptidek igen hatékonyan versengenek az EPO-val az EPO¹R-hez való kötõdést illetõen. E javított funkció miatt lényegesen alacsonyabb peptidkoncentrációnál képesek gátolni az EPO kötõdését (azaz IC50-értékeik nagyon alacsonyak). A találmány szerinti monomer és dimer EPO¹R agonista peptidek azon biológiai aktivitása és potenciája, amivel specifikusan kötõdnek az EPO¹R receptorhoz, in vitro sejtalapú funkcionális vizsgálatok alkalmazásával mérhetõ. Az egyik vizsgálat emberi EPO¹R¹t expresszáló és fos promoterrel meghajtott luciferáz riportergén-konstrukcióval is transzfektált, egéreredetû pre-B-sejtvonalon alapul. EPO-nak vagy egy másik EPO¹R agonistának való kitettség esetén az ilyen sejtek luciferáz szintetizálásával válaszolnak. Szubsztrátumának, a jük, hogy a tesztpeptid hígítási sorozatait a sejtekhez adjuk és a sejteket 4 órán át inkubáljuk. Inkubálás után a sejtekhez luciferint adunk és fényemissziót mérünk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük az EC50-értéknek. Ebben a vizsgálatban a találmány szerinti peptidek nagymértékben fokozott, EPO¹R jeltõl függõ luciferázexpresszió-elõsegítési képességet mutatnak. E javított funkció abban mutatkozik meg, hogy lényeges alacsonyabb peptidkoncentráció kell a maximális luciferázaktivitás felének eléréséhez (azaz EC50-értékeik nagyon alacsonyak). Ez a vizsgálat a találmány szerinti, EPO¹R-agonista peptidek potenciájának és aktivitásának becslésére szolgáló elõnyös eljárás. Egy másik vizsgálat egy jól ismert, nem transzformált, egéreredetû csontvelõbõl származó sejtvonal, a FDC-PI/ER sejtek [Dexter és munkatársai, J. Exp. Med. 152, 1036–1047 (1980)], alkalmazásával történik, amely sejtvonalba EPO¹R van stabilan transzfektálva. E sejtek EPO-tól függõ proliferációt mutatnak. Egy ilyen vizsgálatban a sejteket a szükséges növekedési faktorok [lásd például az US 5.773.569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírtak] jelenlétében, félstacionárius sûrûségig szaporítjuk. A sejteket PBS-ben mostuk és a növekedési faktorokat nem tartalmazó teljes tápoldatban 16–24 órán át éheztettük. A sejtek életképességének (például tripánkékkel végzett festéssel történõ) meghatározása után a növekedési faktorokat nem tartalmazó teljes tápoldattal 105 sejt/50 ml koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk. A tesztelendõ, EPO¹R-agonista peptidvegyületekbõl (jellemzõen a szabad, oldatfázisban lévõ peptidbõl és nem pedig fághoz vagy valami máshoz kötött peptidbõl vagy immobilizált peptidbõl) hígítási sorozatok készítettünk 96 lyukú szövettenyésztõ leme-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 29

2

zekben lyukanként 50 ml végtérfogatra. Minden lyukhoz sejteket (50 ml) adunk és a sejteket 24–48 órán át inkubáljuk (ez az az idõpont, aminél a negatív kontrollnak el kell pusztulnia vagy quiescensnek kell lennie). Ekkor a technikában ismert eljárásokkal, például a sejtproliferációt jelzõ H3-timidin beépülését mérõ MTT-vizsgálattal [Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55–63 (1983)], sejtproliferációt mérünk. A peptideket EPO¹R¹t expresszáló sejtvonalon és parentális, nem expresszáló sejtvonalon egyaránt értékeljük. A maximális sejtproliferáció felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük az EC50-értéknek. Ebben a vizsgálatban a találmány szerinti peptidek nagymértékben fokozott, EPO-tól függõ sejtszaporodás-elõsegítési képességet mutatnak. E javított funkció abban mutatkozik meg, hogy lényeges alacsonyabb peptidkoncentráció kell a maximális sejtproliferáció felének eléréséhez (azaz EC50-értékeik nagyon alacsonyak). Ez a vizsgálat a találmány szerinti, EPO¹R-agonista peptidek potenciájának és aktivitásának becslésére szolgáló elõnyös eljárás. Egy másik vizsgálatban a sejteket EPO-val kiegészített tápoldatban a stacionárius fázis eléréséig szaporítjuk, majd összegyûjtjük és további 18 órán EPO¹t nem tartalmazó tápoldatban tenyésztjük. A sejteket az alábbi három, azonos sûrûségû csoportba osztjuk szét: egy csoport, amelyben nincs hozzáadott faktor (negatív kontroll); egy másik, amely tartalmaz EPO¹t (pozitív kontroll); és egy harmadik, a tesztpeptidet tartalmazó kísérleti csoport. A tenyésztett sejteket különbözõ idõpontokban begyûjtjük, fixáljuk, és DNS¹t kötõ fluoreszcens festékkel [például propidium-jodiddal vagy Hoechst festékkel (Sigma)] festjük. Ezután – például FACS Scan áramlási citométer alkalmazásával – fluoreszcenciát mérünk. Meghatározhatjuk a sejtciklus egyes fázisaiban lévõ sejtek arányát, például a CellFIT szoftver SOBR modelljének (Becton Dickinson) alkalmazásával. A negatív kontrollcsoporthoz képest, az EPO-val vagy aktív peptiddel kezelt sejtek esetében a sejtek nagyobb része lesz „S” fázisban (amit a megnövekedett DNS-tartalom miatt megnövekedett fluoreszcencia jelez). Hasonló vizsgálatok végezhetõk FDCP¹1 [Dexter és munkatársai, J. Exp. Med. 152, 1036–1047 (1980)] vagy TF¹1 sejtvonalak [Kitamura és munkatársai, Blood 73, 375–380 (1989)] alkalmazásával. Az FDCP-1, növekedési faktortól függõ, egéreredetû, multipotenciális, primitív, hematopoietikus progenitor sejtvonal, amely WEHI-3-mal kiegészített tápoldatban (IL-3¹at tartalmazó tápoldat) proliferálódni ugyan tud, de nem képes differenciálódni (ATCC száma: TIB¹68). Ilyen vizsgálatokhoz az FDCP¹1 sejtvonalat emberi vagy egéreredetû EPO¹R-rel transzfektáljuk – az EPO jelenlétében proliferálódni igen, de differenciálódni nem képes – FDCP-1hEPO¹R vagy FDCP-1-mEPO¹R sejtvonalak elõállítása céljából (megfelelõen). A TF-1, EPO-tól függõ sejtvonal, is alkalmazható az EPO¹R-agonista peptidek sejtproliferációra kifejtett hatásainak mérésére. Egy még további vizsgálatban, H3-timidin lépsejtekbe való beépülésén alapuló mikrovizsgálati eljárás

1

HU 005 558 T2

[lásd Krystal, Exp. Hematol 11, 649–660 (1983)] alkalmazható találmány szerinti vegyületek EPO-agonista képességének felderítése céljából. Röviden, B6C3F1 egereket két napig naponta fenilhidrazinnal (60 mg/kg) injektáltunk. A harmadik napon lépsejteket gyûjtöttünk és MTT-vizsgálat alkalmazásával 24 óra leforgása alatt megvizsgáltuk azok proliferációs képességét. Eritropoietinre érzékeny sejtvonalban, az EPO EPO¹R-hez való kötõdése a receptor és számos intracelluláris fehérje – így Shc, vav és JAK2 kináz – tirozinfoszforilációját indukálja. Ennélfogva egy másik in vitro vizsgálat méri a találmány szerinti peptidek EPO¹R és a reakcióúton késõbb szereplõ („downstream”) intracelluláris jelátviteli fehérjék tirozinfoszforilációját indukáló képességét. A fentiekben leírt kötési és proliferációs vizsgálattal aktívként azonosított peptidek az EPO által az eritropoietinre érzékeny sejtekkel közel azonos foszforilációs mintázatot váltanak ki. Ehhez a vizsgálathoz, FDC-Pl/ER-sejteket [Dexter és munkatársai, J Exp Med 152, 1036–47 (1980)] EPO-val kiegészített tápoldatban tartunk fenn és a stacionárius fázis eléréséig szaporítjuk, majd e sejteket EPO¹t nem tartalmazó tápoldatban 24 órán át tenyésztjük. Meghatározott számú ilyen sejtet tesztpeptiddel inkubálunk körülbelül 10 percig 37 °C hõmérsékleten. Minden vizsgálattal egy idõben, EPO-val kezelt kontrollsejtmintát is futtatunk. A kezelt sejteket centrifugálással összegyûjtjük, SDS-lízispufferben felszuszpendáljuk, és SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek vetjük alá. A gélben elválasztott peptideket nitrocellulózra transzferáljuk, és a bloton a foszfotirozint tartalmazó fehérjéket standard immunológiai eljárásokkal láthatóvá tesszük. Például a blotot lehet vizsgálni foszfotirozin elleni antitesttel (például foszfotirozin elleni, egéreredetû IgG-vel, Upstate Biotechnology, Inc.), majd mosás után egy második antitesttel [például peroxidázzal jelzett, egérelleni, kecskeeredetû IgG-vel (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Washington, DC)]. Ezt követõen standard eljárásokkal – például kolorimetrikus, kemolumineszcens vagy fluoreszcens vizsgálatok – láthatóvá tehetõk a foszfotirozintartalmú fehérjék. Például kemolumineszcens vizsgálat elvégezhetõ az Amershamtól beszerezhetõ ECL Western Blotting rendszer alkalmazásával. Egy másik, a találmány szerinti peptidek aktivitásának becslésére alkalmazható, sejtalapú in vitro vizsgálat az egéreredetû csontvelõsejtek vagy emberi periferiális vérsejtek alkalmazásán alapuló telepvizsgálat. Egéreredetû csontvelõt egerek combcsontjából nyerhetünk, míg emberi periferiális vérminta egészséges donortól gyûjthetõ. A periferiális vér esetében elõször a mononukleáris sejteket izoláljuk a vérbõl, például Ficoll-Hypaque gradiensen (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Kanada) történõ centrifugálással. Ehhez a vizsgálathoz normoblasztszámlálást végzünk az eredeti mintában lévõ normoblasztok számának és koncentrációjának meghatározása céljából. Meghatározott számú sejtet metil-cellulózra lemezelünk ki (a gyártó útmutatásai szerint, Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Kanada). Egy kísérleti csoportot tesztpeptiddel, egy pozitív kontrollcsoportot EPO-val keze-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 30

2

lünk, míg a negatív kontrollcsoport semmilyen kezelésben sem részesül. Egy bizonyos meghatározott inkubálási idõ, általában 10 nap és 18 nap, elteltével minden csoportban pontozzuk a szaporodó telepek számát. Egy aktív peptid elõsegíti a telepképzõdést. A találmány szerinti vegyületek aktivitásának bemutatására szolgáló, más in vitro biológiai vizsgálatok például az alábbiak: EPO-tól függõ hematopoietikus progenitor sejtvonal [Greenberger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2931–2935 (1983)]; fehérjék tirozinfoszforilációja B6SUt.EP-sejtekben [Quelle és Wojchowski, J. Biol. Chem. 266, 609–614 (1991)]; EPO-receptor tirozinfoszforilációja EPO¹ra érzékeny, emberi sejtekben [Dusanter-Fourt és munkatársai, J. Biol. Chem. 287, 10 670–10 678 (1992)]; pp 100 citoszolfehérje tirozinfoszforilációja FDC-ER-sejtekben [Quelle és munkatársai, J. Biol. Chem. 267, 17 055–17 060 (1992)]; kolorimetrikus vizsgálat hemoglobinra [Worthington és munkatársai, Exp. Hematol. 15, 85–92 (1987)]; hemoglobin kimutatása 2,7-diamino-fluorénnel [Kaiho és Miuno, Anal. Biochem. 149, 117–120 (1985)]; c¹myb expressziója [Patel és munkatársai, J. Biol. Chem. 267, 21 300–21 302 (1992)]; JAK2 asszociációja és tirozinfoszforilációja [Witthuhn és munkatársai, Cell 74, 227–236 (1993)]; GATA transzkripciós faktorok expressziója [Leonard és munkatársai, Blood 82, 1071–1079 (1993)]; és G1 tranzíció szabályozása D2 és D3 ciklizálásával [Ando és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9571–9575 (1993)]. A Molecular Devices Corp. által tervezett, mikrofiziométer néven ismert eszközt sikeresen alkalmazták az agonisták és antagonisták különféle receptorokra gyakorolt hatásának mérésére. A berendezés mûködése az extracelluláris közeg, receptoraktiválás hatására bekövetkezõ savanyodási rátájának (acidification rate) meghatározásán alapul. In vivo funkcionális vizsgálatok Egy adott tesztpeptid potenciájának becslésére szolgáló lehetséges in vivo funkcionális vizsgálatok egyike a policitémiás, exhipoxiás egéren alapuló biológiai vizsgálat. Ehhez a vizsgálathoz, az egereket több napon át tartó, változó kondicionáló ciklusoknak vetjük alá. E ciklusban az egerek alacsony légnyomású és normális légnyomású körülményeknek vannak váltakozva kitéve. Majd a tesztminták beadása elõtt az egereket 2¹3 napig normális nyomás alatt tartjuk. Tesztpeptidmintákat, vagy a pozitív kontroll egerek esetében EPO standardot, a kondicionált egerekbe injektáljuk szubkután. Radioaktív vasat (például Fe59) adunk be 2 nappal késõbb, és a radioaktív vas beadása után 2 nappal vérmintákat veszünk. Ezután minden vérmintán standard eljárásokkal hematokrit- és radioaktivitásméréseket végzünk. Az aktív tesztpeptidekkel injektált egerekbõl vett vérmintákban (az Fe59-nek az eritrociták hemoglobinjához való kötõdése miatt) nagyobb radioaktivitást lehet mérni, mint a tesztpeptiddel vagy EPOval nem injektált állatokból származó vérminták esetében.

1

HU 005 558 T2

Egy adott tesztpeptid potenciájának becslésére szolgáló másik lehetséges in vivo funkcionális vizsgálatok a retikulocitavizsgálat. Ehhez a vizsgálathoz normális kezeletlen egereket három, egymást követõ napon EPO-val vagy tesztpeptiddel injektáltunk szubkután. A harmadik napon az egereket vasdextránnal is injektáltuk (ip.). Az ötödik napon vérmintákat gyûjtöttünk az egerektõl. A vérben lévõ retikulociták százalékos arányát tiazolnarancs-festéssel és áramlási citometriás analízissel (retic-count program) határoztuk meg. Emellett manuálisan meghatároztuk a hematokritértékeket. A korrigált retikulocitaszázalékot az alábbi képlet alkalmazásával határoztuk meg: % RETICKORRIGÁLT=% RETICMEGFIGYELT× (HematokritEGYEDI/HematokritNORMÁL). Tesztpeptiddel vagy EPO-val nem kezelt egerekhez képest, az aktív tesztvegyületekkel injektált állatok megnövekedett % RETICKORRIGÁLT szintet mutatnak. A találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek alkalmazása A találmány szerinti vegyületek alkalmas in vitro eszközök az EPO biológiai szerepének tisztázására, ideértve az EPO termelését és az EPO EPO¹R-hez való kötõdését befolyásoló, vagy az által befolyásolt számos faktor értékelését (például az EPO/EPO¹R jelátvitel/receptoraktiválás mechanizmusa). A találmány szerinti peptidek továbbá alkalmasak az EPO¹R-hez kötõdõ más vegyületek kifejlesztésére, mivel a találmány szerinti peptidek a szerkezet-aktivitási viszonyról fontos információkat szolgáltatnak, ami elõsegíti a fejlesztést. Továbbá, az EPO¹R-hez való kötõdési képességük alapján, a találmány szerinti peptidek reagensként alkalmazhatók az EPO¹R élõ sejteken; fixált sejteken; biológiai mintákban; szövethomogenizátumokban; tisztított, természetes anyagokban való kimutatására. Például ilyen peptidek jelölésével felszínükön EPO¹R¹t tartalmazó sejteket lehet azonosítani. Ezenfelül, az EPO¹R-hez való kötõdési képességük alapján, a találmány szerinti peptidek in situ festésben, FACS-analízisben (fluorescence-activated cell sorting, fluoreszcencia által aktivált sejtosztályozás), Western-blotolásban, ELISA-ban (enzyme-linked immunosorbent assay, enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat) stb. alkalmazhatók. Továbbá, az EPO¹R-hez való kötõdési képességük alapján, a találmány szerinti peptidek alkalmazhatók receptortisztításban, vagy felszínükön (vagy permeabilizált sejteken belül) EPO¹R¹t expresszáló sejtek tisztításában. A találmány szerinti peptidek különféle orvosi kutatási vagy diagnosztikai célokra szolgáló, kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ reagensként is hasznosíthatók. Ilyen alkalmazások közé tartoznak, minden korlátozás nélkül, az alábbiak: (1) kalibrációs standardként való alkalmazás EPO¹R-agonista jelöltek aktivitásainak mennyiségi meghatározáshoz különféle funkcionális vizsgálatok során; (2) blokkolóreagensként való alkalmazás random peptidszûrésben, azaz új EPO¹R-peptidligandum-családok keresésében a pepti-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 31

2

dek alkalmazhatók a találmány szerinti EPO-peptidek visszanyerésének blokkolására; (3) EPO¹R-rel való együttes kristályosításban való alkalmazás, azaz kialakíthatók olyan kristályok, amelyekben a találmány szerinti peptidek az EPO¹R-hez vannak kötve, ami lehetõvé teszi, hogy röntgensugár-krisztallográfia alkalmazásával receptor/peptidszerkezetet meg lehessen határozni; (4) eritrocita-prekurzorsejtek globinszintézist és hem-komplex szintézisét indukáló, és a differenciálódás beindításával a ferritinreceptorok számát növelõ, kapacitásának mérésére való alkalmazás; (5) az EPOtól függõ sejtvonalak – például FDCP-1-mEPO¹R és a TF¹1- proliferációjának és szaporodásának fenntartására való alkalmazás; (6) a találmány szerinti peptidek radioaktív kromoforral való jelzésével kapcsolatos alkalmazás; és (7) más kutatási és diagnosztikai alkalmazás, ahol az EPO¹R¹t elõnyösen aktiválva van vagy ilyen aktiválás könnyen kalibrálható valamilyen EPO¹Ragonista ismert mennyisége ellen, és hasonlók. A találmány egy még további szempontja szerint a találmány tárgyát kezelési eljárások és gyógyszer gyártására szolgáló eljárások képezik. A találmány szerinti vegyületek beadhatók meleg vérû állatoknak, ideértve az embereket is, az EPO-nak az EPO¹R-hez való in vivo kötõdésének serkentésére. Eszerint a találmány tárgyát EPO-hiánnyal kapcsolatos rendellenességek terápiás kezelésére szolgáló eljárások képezik, amely eljárásokban a találmány szerinti peptidet az EPO¹R serkentésére, és így az EPO hiányával kapcsolatos szimptómák enyhítésére elegendõ mennyiségekben adjuk be. Például a találmány szerinti peptidek alkalmazhatók veseelégtelenség és/vagy végstádiumú veseelégtelenség/dialízis, AIDS-szel járó anémia, krónikus gyulladásos betegséggel (például reumás artritis és krónikus bélgyulladás) és autoimmun betegséggel járó anémia kezelésére, és sebészeti beavatkozás elõtt egy adott beteg vörösvértestszámának növelésére. A találmány szerinti peptidek beadásával kezelhetõ más betegségi állapotok, rendellenességek és hematológiai rendellenességi állapotok közé tartoznak az alábbiak: B¹talasszémia, cisztás fibrózis, terhességi és menstruációs rendellenességek, koraéréses korai anémia, gerincvelõ-sérülés, ûrrepülés, akut vérveszteség, korosodás, stroke, központi idegrendszeri és szív vérellátási hiányossága, és abnormális eritropoiézissel járó, különféle neoplasztikus betegségi állapotok. A találmány más megvalósítási módjaiban, a találmány szerinti peptidvegyületek alkalmazhatók olyan rendellenességek kezelésére, amelyeket nem alacsony vagy hiányos vörösvértestek jellemeznek, például transzfúziót megelõzõ kezelésre. Továbbá a találmány szerinti vegyületek beadása csökkentheti a vérzési idõt és így beadható betegeknek mûtéti beavatkozás elõtt vagy várható vérzéssel járó esetekben. Ezenfelül a találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók megakariociták aktiválására. Mivel az EPO-ról kimutatták, hogy vaszkuláris endotélsejtekre mitogén és kemotaktikus hatást gyakorol és befolyásolja a központi kolinerg neuronokat [Amagnostou és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,

1

HU 005 558 T2

5978–5982 (1990); és Konishi és munkatársai, Brain Res. 609, 29–35 (1993)], a találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók különféle vaszkuláris rendellenességek kezelésére, például: sebgyógyulás elõsegítésére, kollaterális koszorúerek növekedésének (mint például ami a miokardiális infarktus után elõfordulhat) elõsegítésére, trauma kezelésére, és posztvaszkuláris graft kezelésre. A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá különféle olyan neurológiai rendellenességek kezelésére, amelyeket általában – más neuroaktív vegyületekéhez, például neurotranszmitterekéhez képest – alacsony abszolút acetilkolinszintek vagy alacsony relatív acetilkolinszintek jellemeznek. Gyógyászati készítmények A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát a fenti EPO¹R-agonista peptidvegyületek gyógyászati készítményei képezik. Az ilyen készítmények beadásával enyhíthetõ vagy modulálható állapotok közé tartoznak a fentiekben jelzett állapotok. Ilyen gyógyászati készítmények szolgálhatók orális, parenterális [intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás (iv.) vagy szubkután injekció], transzdermális (passzív, illetve iontoforézis vagy elektroporáció alkalmazásával), nyálkahártyán át (nazálisan, vaginálisan, rektálisan vagy nyelv alatt) vagy biológiai lebontható inzertek alkalmazásával történõ beadásra, és kiszerelhetõ az egyes beadási módoknak megfelelõ dózisformákba. Általában a találmány tárgyát a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidet tartalmazó gyógyászati készítmények vagy abból származó termékek képezik, amelyek gyógyászatilag elfogadható hígítókat, tartósítószereket, oldószereket, emulgeálókat, adjuvánsokat és/vagy hordozókat is tartalmaznak. Ilyen készítmények közé tartoznak különféle pufferalkotókat (például TRIS¹HCl, acetát, foszfát) hígító, pH¹t és ionerõsséget biztosító anyagok; adalék anyagok, például detergensek és oldószerek (például Tween 20, Tween 80, Polysorbate 80), antioxidánsok (például aszkorbinsav, nátrium-metabiszulfát), tartósítószerek (például timerzol, benzil-alkohol) és térfogatnövelõ anyagok (például laktóz, mannitol); az anyag polimervegyületek – például tejsavpolimer, poliglikolsav stb. – szemcsés készítményeibe vagy liposzómákba való beépítése. Hialuronsav is alkalmazható. Ilyen készítmények befolyásolhatják a találmány szerinti fehérjék és származékok fizikai állapotát, stabilitását, in vivo felszabadulásának mértékét, és az in vivo clearance mértékét. [lásd például Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1435–1712, 18. kiad., kiad.: Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 (1990)]. A készítmények elõállíthatók folyadék formájában vagy szárított (például liofilizált) por formájában. Orális beadás A találmány tárgyát képezik orálisan beadható szilárd dózisformák, amelyek általában le vannak írva a Remington’s Pharmaceutical Sciences kiadványban [18. kiad., kiad.: Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 (1990)]. Szilárd dózisformák közé tartoznak tabletták, kapszulák, pirulák és cukorkák, ostyák, pelletek,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 32

2

porok vagy szemcsék. Emellett liposzomális vagy fehérjeszerû kapszulázás is alkalmazható a találmány szerinti készítmények kiszerelésére (mint például az US 4 925 673 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírt fehérjeszerû mikrogömbök). Liposzomális kapszulázás is alkalmazható és a liposzómák különféle polimerekkel módosíthatók [például US 5 013 556 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Terápiás célokra szolgáló lehetséges szilárd dózisformák leírása a Modern Pharmaceutics címû kiadványban van megadva [Marshall, Modern Pharmaceutics, szerk: Banker és Rhodes, 10. fej. (1979)]. Általában a készítmény EPO¹R agonista peptidet (vagy annak kémiailag módosított formáját) és a gyomorban lévõ környezet ellen védõ és a vékonybélben a biológiailag aktív anyag felszabadítását biztosító inert összetevõket tartalmaz. A találmány tárgyát továbbá orális beadásra szolgáló folyékony dózisformák is képezik. A folyékony dózisformák közé tartoznak gyógyászatilag elfogadható emulziók, oldatok, szuszpenziók és szirupok, amelyek más összetevõket is tartalmazhatnak, így például inert hígítókat, adjuvánsokat – például nedvesítõágenseket, emulgeáló- és szuszpendálóágenseket, és édesítõ¹, ízesítõ- és illatosítóágenseket. A peptideket lehet kémiailag módosítani oly módon, hogy a származék orális bevitele hatékony legyen. Általában a találmány szerinti kémiai módosításnak számít legalább egy csoport csatlakoztatása önmagában a vegyület molekulájához, ahol a csoport (a) proteolízisgátlást, és (b) a gyomorból vagy vékonybélbõl a véráramba való felvételt tesz lehetõvé. Továbbá kívánatos, hogy az összetevõ vagy összetevõk általános stabilitása fokozódjon és keringési ideje a testben hosszabb legyen. Ahogyan a fentiekben tárgyaltuk, gyógyászati alkalmazáshoz elõnyös kémiai módosítás a PEG-ezés. Tovább alkalmazható csoportok közé tartoznak az alábbiak: propilénglikol, etilénglikol és propilénglikol kopolimerjei, karboxi-metil-cellulóz, dextrán, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon), poliprolin, poli1,3-dioxolán és poli-1,3,6-tioxokán [lásd például Abuchowski és Davis „Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, Enzymes as Drugs. Szerk.: Hocenberg és Roberts, kiad.: Wiley-Interscience, New York, NY (1981); és Newmark és munkatársai, J. Appl. Biochem. 4, 185–189 (1982)]. Orális készítmények esetében, a felszabadulás helye lehet a gyomor, a vékonybél (a duodenum, a jejuneum, vagy az ileum), vagy a vastagbél. A szakember ismeri az olyan elérhetõ formulációkat, amelyek nem oldódnak fel a gyomorban, hanem az anyagok a duodenumban vagy a vékonybél valamely más szakaszában szabadítják fel. Elõnyös, ha a felszabadulás elkerüli a gyomorban uralkodó környezet romboló hatásait oly módon, hogy vagy védik a peptidet (vagy származékot) vagy peptidet (vagy származékot) a gyomorban uralkodó környezet elhagyása után szabadítják fel, például a vékonybélben. például az alábbiak: cellulóz-acetát-trimellitát (CAT), hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalát (HPMCP), HPMCP

1

HU 005 558 T2

50, HPMCP 55, polivinil-acetát-ftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquátric, cellulóz-acetát-ftalát (CAP), Eudragit L, Eudragit S, és Shellac. E bevonatok kevert filmként is alkalmazhatók. Tablettákon olyan bevonat vagy bevonatkeverék is alkalmazható, amely nem a gyomor hatásai elleni védelmet szolgálja. Ilyenek közé tartoznak a tabletta lenyelését megkönnyítõ cukorbevonatok. Száraz gyógyszer (azaz por) bevitelére szolgáló kapszulák lehetnek kemény héjúak (mint például zselatintartalmú héj), illetve a folyadékformákhoz lágyzselatin alkalmazható. Az ostyák héját alkotó anyag lehet vastag keményítõ vagy más ehetõ papír. Pirulák, cukorkák, öntött tabletták vagy porok esetében nedvestömörítési eljárások alkalmazhatók. A peptidet (vagy származékot) finom mikroszemcsékként lehet beletenni a körülbelül 1 mm részecskeméretû granulátumok vagy pelletek formájában lévõ készítménybe. A kapszulaként történõ beadásra szolgáló készítmény is lehet por, enyhén összenyomott dugó, vagy akár tabletta. E gyógyszerek préseléssel állíthatók elõ. A készítmény tartalmazhat színezékeket és/vagy ízesítõanyagokat. Például a peptidet (vagy származékot) tartalmazó, ehetõ termékként formulázható (például liposzómával vagy mikrogömbkapszulázással), például színezékeket és ízesítõágenseket tartalmazó, hûtött ital formájában. A peptid (vagy származék) valamilyen inert anyaggal hígítható vagy térfogata növelhetõ. Ilyen hígítók közé tartozhatnak szénhidrátok, különösen mannitol, a¹laktóz, vízmentes laktóz, cellulóz, szacharóz, módosított dextrán és keményítõ. Töltõanyagként alkalmazhatók bizonyos szervetlen sók, így például kalcium-trifoszfát, magnézium-karbonát és nátrium-klorid. Néhány, kereskedelmi forgalomban elérhetõ hígító a Fast-Flo, Emdex, STA¹Rx 1500, Emcompress és Avicell. Szétesést elõsegítõ („dezintegráló”) anyagok is lehetnek a szilárd dózisformában lévõ gyógyászati készítményben. Mállasztóként alkalmazható anyagok közé tartozik – minden korlátozás nélkül – a keményítõ, ideértve a kereskedelmi forgalomban Explotab néven kapható, keményítõalapú anyagot is. Keményítõnátrium-glikolát, Amberlit, nátrium-karboxi-metilcellulóz, ultramilopektin, nátriumalginát, zselatin, narancshéj, savas karboxi-metil-cellulóz, semleges szivacs és bentonit egyaránt alkalmazható. E mállasztóanyagok lehetnek oldhatatlan, kationcserélõ gyanták. Porított gumi is alkalmazható mállasztóanyagként és kötõanyagként, és tartalmazhatnak olyan porított gumikat is, mint amilyen az agar, a karaya vagy tragakant. Alginátsav és annak nátriumsója is alkalmas mállasztóanyag. Kötõanyagok alkalmazhatók a peptid (vagy származék) ágens összetartására kemény tabletta kialakítása esetén, és kötõanyag származhat még természetes eredetû termékbõl, mint amilyen például az akácia, tragakant, keményítõ és zselatin. Továbbiak közé tartozik a metil-cellulóz (MC), etil-cellulóz (EC) és karboxi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 33

2

metil-cellulóz (CMC). Poli(vinil-pirrolidon) (PVP) és hidroxi-propil-metil-cellulóz (HPMC) alkoholos oldatai egyaránt alkalmazható a peptid (vagy származék) granulálására. A peptidet (vagy származékot) tartalmazó készítményben antifrikciós ágens is jelen lehet a formulálási folyamat során fellépõ tapadás megakadályozása végett. A peptid (vagy származék) és az öntõszerszám fala közötti rétegként kenõanyagok is alkalmazhatók. Ilyen kenõanyagok közé tartoznak – minden korlátozás nélkül – az alábbiak: sztearinsav és annak magnézium- és kalciumsói, politetrafluoro-etilén (PTFE), folyékony paraffin, növényi olajok és viaszok. Olyan, oldható kenõanyagok is alkalmazhatók, mint amilyen a nátrium-lauril-szulfát, magnézium-lauril-szulfát, különféle molekulasúlyú polietilénglikolok, Carbowax 4000 és 6000. A kiszerelés alatt a gyógyszer áramlási tulajdonságait esetleg javító és a préselés alatti átrendezõdést elõsegítõ síkosítóanyagok is hozzáadhatók. A síkosítóanyagok közé tartozhatnak az alábbiak: keményítõ, talkum, pirogén szilika és szilikoaluminát hidrát. A peptid (vagy származék) vizes környezetben való feloldódásának elõsegítésére, nedvesítõágensként valamilyen felületaktív anyag adagolható. Felületaktív anyagok közé tartozhatnak anionos detergensek, például nátrium-lauril-szulfát, dioktil-nátrium-szulfoszukcinát és dioktil-nátrium-szulfonát. Kationos detergensek is alkalmazhatók és ezek közé tartozhat a benzalkonium-klorid vagy benzetomium-klorid. A készítményben felületaktív anyagként számba vehetõ potenciális, nemionos detergensek az alábbiak: lauromkcrogol 400, polioxil 40 sztearát, poli(oxi-etilén) hidrogenált ricinusolaj 10, 50 és 60, glicerin-monosztearát, poliszorbát 20, 40, 60, 65 és 80, szacharóz-zsírsav-észter, metilcellulóz és karboxi-metil-cellulóz. A fehérjébõl vagy származékból elõállított készítményben e felületaktív anyagok jelen lehetnek önmagukban vagy különbözõ arányú keverékként. A peptid (vagy származék) felvételét potenciálisan fokozó adalék anyagok, például a zsírsavak, olajsavak, linolsav és linolénsav. Szabályozott felszabadítást biztosító formulák is kívánatosak lehetnek. A peptid (vagy származék) beépíthetõ valamilyen inert mátrixba (például gumikba), amely diffúziós vagy kioldásos mechanizmussal történõ felszabadulást tesz lehetõvé. Lassan lebomló mátrixok is beépíthetõk a készítménybe. Bizonyos, bélben oldódó bevonatoknak is lehet késleltetett felszabadulást biztosító hatása. A szabályozott felszabadulás biztosításának egy másik módja az Oros terápiás rendszeren (Alza Corp.) alapuló eljárás alkalmazása (azaz a gyógyszert olyan, féligáteresztõ membránba zárjuk, amely lehetõvé teszi, hogy víz lépjen be és az ozmotikus hatások miatt a gyógyszer kipréselje egy kis nyíláson át. Más bevonatok is alkalmazhatók a kiszereléshez. Ezek közé tartoznak a drazsírozóüstben alkalmazható különféle cukrok. A peptid (vagy származék) beadható filmmel bevont tablettaként és az ilyen esetekben alkal-

1

HU 005 558 T2

mazott anyagokat két csoportba soroljuk: Az elsõ csoportba tartoznak a bélben nem oldódó anyagok, így például metil-cellulóz, etil-cellulóz, hidroxi-etil-cellulóz, metil-hidroxi-etil-cellulóz, hidroxi-propil-cellulóz, hidroxi-propil-metil-cellulóz, nátrium-karboxi-metilcellulóz, providon és a polietilénglikolok. A második csoportot a bélben oldódó anyagok alkotják, amelyek általában a ftálsav észterei. Anyagkeverékek is alkalmazhatók az optimális filmbevonat biztosítására. A filmmel való bevonás végezhetõ drazsírozóüstben, vagy fluidizálóágyban vagy préseléses bevonással. Parenterális beadás A találmány szerinti, parenterális beadásra szolgáló készítmények közé tartoznak vizes vagy nemvizes steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. Nemvizes oldószerek vagy vivõanyag például a propilénglikol, polietilénglikol, növényi olajok – például olívaolaj és kukoricaolaj – zselatin és injektálható szerves észterek, például etil-oleát. Ilyen dózisformák tartalmazhatnak még adjuvánsokat, például tartósító¹, nedvesítõ¹, emulgeáló- és diszpergálóágenseket. Ezek sterilizálhatók, például baktériumot visszatartó szûrõn át végzett szûréssel, sterilizálóágensek beépítésével a készítményekbe, a készítmények besugárzásával vagy a készítmények melegítésével. Ezek elõállíthatók közvetlenül a felhasználás elõtt steril víz vagy más injektálható steril közeg alkalmazásával.

5

10

15

20

25

30 Rektális vagy vaginális beadás Rektális vagy vaginális beadásra szolgáló készítmények elõnyösen olyan kúpok, amelyek – az aktív vegyület mellett – kötõanyagot, például kakaóvajat vagy kúpviaszt tartalmaznak. Nazális és nyelv alatti bevitelre szánt készítményeket is a technikában ismert, standard kötõanyagokkal állítjuk elõ. Bevitel a tüdõn át A találmány tárgyát képezi az EPO¹R-agonista peptidek (vagy azok származékai) tüdõn át történõ beadása. A peptidet (vagy származékot) inhalálással beadjuk egy adott emlõs tüdején át és a peptid (vagy származék) a tüdõ epitéliumát áthaladva bejut a véráramba [lásd például Adjei és munkatársai, Pharmaceutical Research 7, 565–569 (1990); Adjei és munkatársai, Int. J. Pharmaceutics 63, 135–144 (1990) (leuprolid-acetát); Braquet és munkatársai, J. Cardiovascular Pharmacology 13 (sup5), 143–146 (1989) (endotelin¹1); Hubbard és munkatársai, Annals of Internal Medicine, 3. köt, 206–212 (1989) (a1-antitripszin); Smith és munkatársai, J. Clin. Invest. 84, 1145–1146 (1989) (a-1proteináz); Oswein és munkatársai, „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (1990) (rekombináns emberi növekedési hormon); Debs és munkatársai, J. Immunol. 140, 3482–3488 (1988) (g-interferon és a¹tumornekrózis-faktor); és US 5.284.656 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Platz és munkatársai) (granulocita- telepserkentõ faktor]. Szisz-

35

40

45

50

55

60 34

2

temikus hatás kiváltására szánt gyógyszerek tüdõn át való bevitelére szolgáló eljárások és készítmények az US 5.451.569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban [Wong és munkatársai] vannak leírva. A találmány gyakorlatba vételében való használatot illetõen, a találmány tárgyát terápiás termékek tüdõn át történõ bevitelére tervezett, különféle mechanikai eszközök képezik, ideértve – minden korlátozás nélkül – a porlasztókat, kimért dózist adagoló belégzõeszközök, és porbelégzõk, amelyek mindegyike a szakember számára ismert. A kereskedelmi forgalomban kapható néhány, a találmány gyakorlatba vételére alkalmas eszközök például az alábbiak: Ultravent belégzõeszköz (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); az Acorn II belégzõeszköz (Marquest Medical Products, Englewood, CO); a Ventolin kimért dózist adagoló belégzõeszköz (Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); és a Spinhaler porbelégzõ (Fisons Corp., Bedford, MA). Minden ilyen eszközhöz szükség van a peptid (vagy származék) adagolására alkalmas formulációk alkalmazására. Jellemzõ, hogy minden formuláció specifikus az alkalmazott eszköz típusára, és – a terápiában hasznos szokásos diluensek, adjuvánsok és/vagy hordozók mellett – szükség lehet megfelelõ hajtóanyag alkalmazására. Továbbá liposzómák vagy mikrogömbök, zárványkomplexek, vagy más típusú hordozók alkalmazása is a találmány tárgyát képezi. A kémiai módosítástól vagy az alkalmazott eszköz típusától függõen, kémiailag módosított peptidek különféle formulációkban is elõállíthatók. Szórófejes vagy ultrahangos porlasztóban való alkalmazásra szolgáló formulációk jellemzõen tartalmaznak vízben oldott peptidet (vagy származékot), 0,1–25 mg biológiailag aktív fehérje/ml oldat koncentrációban. A formuláció tartalmazhat puffert és egyszerû cukrot (például fehérjestabilizálás vagy ozmotikus nyomás szabályozása céljából). Az aeroszolt alkotó oldat porlasztása miatt, a peptid (vagy származék), felszín által indukált aggregációjának csökkentése vagy megelõzése céljából a porlasztóba szánt formuláció felületaktív anyagot is tartalmazhat. A kimért dózist adagoló belégzõeszközzel való alkalmazásra szánt formulációk általában a peptidet (vagy származékot) tartalmazó, finoman elosztott, a felületaktív anyag segítségével a hajtógázban szuszpendált porból állnak. A hajtógáz lehet bármilyen, e célra hagyományosan alkalmazott anyag, mint például klorofluoro-karbon, hidrokloro-fluoro-karbon, hidrofluorokarbon, vagy szénhidrogén, így trikloro-fluorormetán, dikloro-fluorormetán, dikloro-tetrafluoro-etanol, és 1,1,1,2-tetrafluoro-etán, vagy ezek kombinációi. Alkalmas felületaktív anyagok közé tartozik a szorbitán-trioleát és a szójalecitin. Az olajsav is alkalmazható felületaktív anyagként. Porinhaláló eszközbõl való adagolásra szolgáló formulációk tartalmaznak peptidet (vagy származékot) tartalmazó, finoman elosztott száraz port és tartalmazhatnak még olyan mennyiségû (például a formuláció

1

HU 005 558 T2

50–90 tömeg%¹át kitevõ mennyiségû) térfogatnövelõ ágenst, például laktózt, szorbitolt, szacharózt vagy mannitolt, amely elõsegíti a por szétszórását az eszközbõl. Legelõnyösebb, hogy ha peptidet (vagy származékot) a disztális tüdõbe való bevitelhez legalkalmasabb, 10 nm¹nél (vagy mikronnál) kisebb méretû, legelõnyösebben 0,5–5 nm¹es átlagos szemcseméretû szemcsés formulációban állítjuk elõ. Nazális beadás A találmány tárgyát az EPO¹R-agonista peptidek (vagy származékok) orron át történõ adagolása is képezi. Az orron át történõ beadás lehetõvé teszi, hogy a terápiás termék orron át történõ beadása után közvetlenül a peptid a véráramba jusson, a termék tüdõben való lerakódásának szükségessége nélkül. Az orron át történõ bevitelre szolgáló formulációk közé tartoznak a dextránnal vagy ciklodextránnal készültek.

2

Példák A találmányt az alábbi példák segítségével részletesebben leírjuk. Ezek és más példák azonban a részletes leírás bármely részében csak illusztrációs célokat 5 szolgálnak, és semmiben sem korlátozzák a találmány vagy bármely példaként felhozott forma oltalmi körét és jelentését. Hasonlóképpen a találmány nem korlátozódik az itt leírt különösen elõnyös megvalósítási módok egyikére sem. Ezzel szemben a találmány számos mó10 dosítása vagy változata az ezen részletes leírás elolvasása után egyértelmû a szakember számára, és ilyen módosítás vagy változtatás végezhetõ a találmány szellemétõl és oltalmi körétõl való eltérés nélkül. Ennélfogva a találmányt csak a mellékelt szabadalmi igény15 pontokban meghatározottak korlátozzák az azonos jelentésû teljes oltalmi körrel együtt, amire az igénypontokban oltalmat igényelünk. 1. példa: EPO¹R-agonista peptiddimerek szintézise szilárd fázisú szintézissel 1. lépés – A Cbz-TAP szintézise: kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ diamint („TAP”, Aldrich Chemical Co.) (10 g, 67,47 mmol) vízmentes DCM-mel (100 ml) készült oldatát 0 °C¹ra hûtöttük. Vízmentes 25 DCM-ben (50 ml) oldott benzil-kloroformátot (4,82 ml, 33,7 mmol) adtunk ehhez, egy csepegtetõtölcsér segítségével 6–7 óra alatt, miközben a reakciókeverék hõmérsékletét végig 0 °C¹on tartottuk, majd hagytuk szobahõmérsékletre (~25 °C) felmelegedni. További 30 16 óra elteltével a DCM¹et vákuumban eltávolítottuk és a visszamaradt anyagot 3 N HCl és éter között megosztottuk. A vizes réteget lehûtöttük, 50%¹os vizes NaOH-dal pH=9 értékre semlegesítettük, majd etil-acetáttal extraháltuk. Az etil-acetát-réteget vízmentes Na235 SO4¹on megszárítottuk, majd vákuumban megszárítva jutottunk a nyers mono-Cbz-TAP-hoz (5 g, körülbelül 50%¹os kitermelés). A vegyületet a következõ reakcióban mindenféle további tisztítás nélkül alkalmaztuk. 20

Dózisok Minden peptidvegyület esetében, további vizsgálatok elvégzése további információkat eredményez különbözõ betegek különféle állapotai kezelésére szolgáló megfelelõ dózisszintek vonatkozásában, és a terápiás környezet, a beteg kora és általános egészségi állapota ismeretében a szakember meg tudja határozni a megfelelõ dozírozást. A kiválasztott dozírozás függ a kívánt terápiás hatástól, a beadás módjától, és a kívánt kezelés hosszától. Általában emlõsöknek testsúly-kilogrammonként 0,001–10 mg dózisszinteket adunk be naponta. Általában intravénás injekció vagy infúzió esetén a dózis lehet alacsonyabb. A dozírozási rend a keringési féléletidõ és az alkalmazott formuláció függvényében változhat. A találmány szerinti peptidek (vagy azok származékai) beadhatók egy vagy több további aktív összetevõvel vagy gyógyászati készítménnyel együtt.

2. lépés – A Cbz-TAP-Boc szintézise: A Cbz-TAP 5 g, 17,7 mmol) hexánnal (25 ml) képzett, erõteljesen kevert szuszpenziójához Boc2O¹t (3,86 g, 17,7 mmol) adtunk és szobahõmérsékleten tovább kevertük. A reakciókeveréket DCM-mel (25 ml) hígítottuk és 10%¹os vizes citromsavval (2×), vízzel (2×) és sóoldat-

tal mostuk. A szerves réteget vízmentes Na2SO4¹en megszárítottuk és vákuumban betöményítettük. A nyersterméket (kitermelés=5 g) közvetlenül alkal50 maztuk a következõ reakcióban.

35

1

HU 005 558 T2

2

3. lépés – A Boc-TAP szintézise: Az elõzõ reakcióból származó nyersterméket metanolban (25 ml) feloldottuk és szénen (5% w/w) lévõ 5% Pd jelenlétében ballonnyomás alatt 15 órán át hidrogéneztük. A keveréket leszûrtük, metanollal mostuk és a szûrletet vákuum

5

4. lépés – A TentaGel linker szintézise: TentaGelbromidot (2,5 g, 0,48 mmol/g, Rapp Polymere, Németország), fenolos linkert (5 ekvivalens) és K2CO3¹ot (5 ekvivalens) 20 ml DMF-ben 70 °C¹on 14 órán át

melegítettünk. Szobahõmérsékletre való lehûtés után, a gyantát mostuk (0,1 N HCl, ACN, DMF, MeOH), 15 majd szárítás után egy borostyánszínû gyantát kaptunk.

5. lépés – A TentaGel-linker-TAP(Boc) szintézise: A fenti gyantából 2,5 grammot, H¹TAP-Boc¹ot (1,5 g, 5 ekv.) és jégecetet (34 ml, 5 ekv.) MeOH és THF 1:1 arányú keverékében felvettünk és 12 órán át rázattuk. Ehhez a keverékhez THF-ben készült 1 M¹os nátrium-ciano-borohidrid-oldatot (5 ekv.) ad-

25 tunk és további 7 órán átrázattuk. A gyantát szûrtük, mostuk (DMF, THF, 0,1 N HCl, víz, MeOH), majd szárítottuk. A gyanta egy kis mennyiségét DCM-ben oldott Bz¹Cl-lel és DIEA-val benzileztük, 70% TFADCM-mel hasítottuk, és LCMS-sel és HPLC-vel ellen30 õriztük.

6. lépés – A TentaGel-linker-TAP-Lys szintézise: A fentiekben elõállított gyantát aktivált (5 ekv. aminosav és 5 ekv. HATU, 0,5 M DMF-fel készült oldatából, a 10 ekv. DIAE hozzáadása után elõállított) FmocLys(Fmoc)-OH-oldattal kezeltük, és 14 órán át finoman rázattuk. A gyantát mostuk (DMF, THF, DCM, MeOH) és azt megszárításával jutottunk el a védett gyantához.

40 A fennmaradt amincsoportokat úgy zártuk le, hogy a gyantát DCM-ben oldott 10% ecetsavanhidriddel és 20% piridinnel 20 percig kezeltük, majd a fentiekben leírtak szerint mostuk. Az Fmoc-csoportokat úgy távolítottuk el, hogy a gyantát DMF-ben oldott 30%¹os piperi45 dinnel 20 percig, óvatos rázatással kezeltük, majd mostuk (DMF, THF, DCM, MeOH) és szárítottuk.

7. lépés – A TentaGel-linker-TAP-Lys(Peptid)2 szintézise: A fentiekben leírtak szerinti gyantát Fmoc-aminosav-kapcsolás, HBTU/HOBt-aktiválásból és piperidinnel végzett Fmoc eltávolításból álló, ismételt ciklusainak alávetve, mindkét peptidláncot egyidejûleg építettük fel. Ez kényelmesen kivitelezhetõ egy ABI

55 433 gyártmányú automata peptidszintetizáló berendezésen (Applied Biosystems, Inc.). A végsõ Fmoc-eltávolítás után, a terminális aminocsoportokat DCM-ben oldott ecetsavanhidriddel (10 ekv.) és DIEA-val (20 ekv.) végzett 20 perces kezeléssel acileztük, majd 60 a fentiekben leírtak szerint mostuk. 36

alatt betöményítve jutottunk a nyers H¹TAP-Boc termékhez (kitermelés=3,7 g). Az 1–3. lépések után a Boc-TAP összes kitermelése megközelítõleg 44%¹os volt (az alkalmazott Cbz¹CI mennyisége alapján számítva).

1

HU 005 558 T2

2

8. lépés – Lehasítás a gyantáról: A fentiek szerinti gyantát TFA¹t (82,5%), fenolt (5%), etánditiolt (2,5%), vizet (5%), és tioanizolt (5%) tartalmazó oldatban 3 órán át, szobahõmérsékleten szuszpendáltuk. Más hasítókeverék, például TFA (95%), víz (2,5%), és trii-

zopropilszilán (2,5%), is alkalmazható. A TFA-oldatot 5 °C¹ra hûtöttük és Et2O¹ba töltve a peptidet lecsaptuk. Szûrés és csökkent nyomáson való szárítás után jutottunk el a kívánt peptidhez. A peptidet C18 oszloppal el15 látott, preparatív HPLC-vel tisztítottuk.

9. lépés – Peptidek oxidálása az intramolekuláris diszulfidkötések kialakítása céljából: A peptiddimert 20% DMSO/víz oldatban feloldottuk (1 mg száraz peptid/ml) és szobahõmérsékleten 36 órán át inkubáltuk. A peptidet C18 HPLC-oszlopra (Waters Delta-Pak C18, 15 mikro-

nos szemcseméret, 300 Å pórusméret, 40 mm×200 mm 30 hosszú) vittük fel, és lineáris CAN/víz/0,01% TFA gradienssel (5–95% ACN, 40 perc) tisztítottuk. A kívánt peptidet tartalmazó frakciók liofilizálásával a terméket pelyhes fehér szilárd anyagként kaptuk meg.

Redukált cisztein aminosavakat tartalmazó, dimer peptid (XYZ)

10. lépés – A terminális –NH2-csoportok PEGezése: PEG-ezés karbamátkötés révén: A peptiddimert száraz DMF-ben 1,5 ekvivalens (moláris alapon) aktivált PEG-féleséggel (mPEG-NPC, NOF Corp., Japán) összekeverve tiszta oldatot készítettünk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 4 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmérsékleten 14 órán át kevertük,

Oxidált diszulfidkötéseket tartalmazó, dimer peptid (XYZ)

majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. 55 A PEG-ezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk. A tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. Az alábbi vázlat a SEQ ID No. 3 számú szekvencia alkalmazásával végzett mPEG-NPC PEG-ezést mutat60 ja be. 37

1

HU 005 558 T2

2

PEG-ezés amidkötés révén: A peptiddimert száraz DMF-ben 1,5 ekvivalens (moláris alapon) aktivált PEGféleséggel (PEG-SPA-NHS, Shearwater Corp, USA) összekeverve tiszta oldatot készítettünk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 10 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmérsékleten 2 órán át kevertük, majd

20 C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A PEG-ezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk. A tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. Az alábbi vázlat a SEQ ID No. 3 számú szekvencia alkalmazásával vég25 zett PEG-SPA-NHS PEG-ezést mutatja be.

11. lépés – Tisztítás ioncserével: Számos cserélõ hordozót vizsgáltunk meg arra nézve, hogy a kiindulási dimer peptid megtartása mellett képesek¹e elválasztani a nem reagált (vagy hidrolizált) PEG¹t a fenti peptidPEG konjugátumtól. Az ioncserélõ gyantát (2–3 g) 1 cm¹es oszlopba töltöttük, majd a nátriumformává (0,2 N NaOH¹ot töltöttünk az oszlopra addig, amíg az eluens pH¹ja 14 nem lett, körülbelül 5 oszloptérfogat) és azután hidrogénformává alakítottuk (elúció 0,1 N HCl-dal vagy 0,1 M HOAc-vel, amíg az eluens pH¹ja meg nem egyezett a betöltéskor mért pH¹val, körülbelül 5 oszloptérfogat), majd a gyantát 25%¹os ACN/víz eleggyel addig mostuk, amíg a pH 6 nem lett. A konjugálatlan peptidet vagy a peptid-PEG konjugátumot

25%¹os ACN/víz elegyben feloldottuk (10 mg/ml) és a pH¹t 3¹nál alacsonyabb értékre állítottuk be TFA-val, majd felvittük az oszlopra. Két-három oszloptérfogat 50 25%¹os ACN/víz eleggyel történt mosás és 5 ml¹es frakciók gyûjtése után, a peptidet 25%¹os ACN/víz elegyben oldott 0,1 M¹os NH4OAC-vel szabadítottuk fel az oszlopról, ismét 5 ml¹es frakciókat gyûjtve. HPLC-vel végzett analízis megmutatta, hogy mely 55 frakciók tartalmazzák a kívánt peptidet. Elpárologtatással egybekötött fényszórásdetektorral (ELSD) végzett analízis jelezte, hogy amikor a peptid fennmaradt az oszlopon és a NH4OAC-oldattal eluálásra került (általában a 4. és 10. frakciók között), szennyezõdésként 60 elõforduló nem konjugált PEG¹t nem lehetett megfi38

1

HU 005 558 T2

gyelni. Amikor a peptid a kezdõ mosási pufferben (általában az elsõ 2 frakció) eluálódott, a kívánt PEG-konjugátum elválasztását és feleslegben lévõ PEG¹t nem észleltünk. Az alábbi oszlopok egyaránt visszatartották a peptidet és a peptid-PEG konjugátumot, és sikeresen megtisztították a peptid-PEG konjugátumot a nem konjugált peptidtõl. 1. táblázat Ioncserélõ gyanták Hordozó

5

2

2. példa: EPO¹R-agonista peptiddimerek szintézise fragmentumkondenzációval 1. lépés – A (Cbz)2-Lys szintézise: Standard körülmények között, lizint reagáltattunk benzil-kloroformáttal, két aminocsoportján Cbz-csoporttal védett lizin elõállítása céljából.

10

Forrás

Mono S HR 5/5, elõre megtöltött, erõs kationcserélõ oszlop

Amersham Biosciences

SE53 Cellulose, mikroszemcsés, erõs kationcserélõ hordozó

Whatman

SP Sepharose Fast Flow, erõs kationcserélõ hordozó

Amersham Biosciences

15

2. lépés – A Boc-TAP szintézise: Boc-TAP¹ot az 1. példában leírt 1–3. lépés szerint szintetizáltunk. 3. lépés – (Cbz)2-Lys összekapcsolása (Cbz)2-Lys és Boc-TAP standard kapcsolási körülmények közötti összekapcsolása (Cbz)2-Lys-TAP-Boc¹ot eredménye20 zett.

4. lépés – Lys-TAP-Boc: Az elõzõ reakcióból származó nyersterméket metanolban (25 ml) feloldottuk és szénen (5% w/w) lévõ 5% Pd jelenlétében ballonnyo-

35 más alatt 15 órán át hidrogéneztük. A keveréket leszûrtük, metanollal mostuk és a szûrletet vákuum alatt betöményítve jutottunk a nyers Lys-TAP-Boc termékhez.

5. lépés – Peptidmonomerek szintézise fragmentumkondenzációval: A peptidmonomer szekvenciájának négy peptidfragmentumát standard eljárásokkal szintetizáltuk. E részben védett fragmentumokat két, egymástól független kapcsolási körnek vetettük alá. Az elsõ körben a monomer N¹terminális felét alakítjuk ki a peptidfragmentumok közül kettõnek összekapcso-

lásával, míg a monomer C¹terminális felét a másik két 55 peptidfragmentum összekapcsolásával képezzük. A második kapcsolási körben, az N¹terminális és C¹terminális fél összekapcsolásával állítjuk elõ a teljesen védett monomert. Ezután, a monomer védelmét OBn alkalmazásával végzett standard eljárásokkal 60 megszüntetjük. 39

1

HU 005 558 T2

2

(a SEQ ID No. 12 számú szekvencia) jód alatt oxidáljuk a 6. lépés – Peptidmonomerek oxidálása az intramolekuláris diszulfidkötések kialakítása céljából: az OBn-nel 35 monomerek Acm-mel védett cisztein aminosavai közötti intramolekuláris diszulfidkötések kialakítása céljából. megszüntetett védelmû, kondenzált peptidmonomereket

7. lépés – Lys-TAP-Boc kapcsolása oxidált, OBn alkalmazásával megszüntetett védelmû monomerekkel, peptiddimer kialakítása céljából: Standard körülmények között, Lys-TAP-Boc¹t kapcsoltunk kétszeres mo-

láris feleslegben lévõ oxidált, OBn-nel megszüntetett védelmû monomerekkel, peptiddimer kialakítása céljából. Ezt követõen a peptiddimer védelmét standard kö60 rülmények között megszüntettük. 40

1

HU 005 558 T2

8. lépés – A megszüntetett védelmû dimer PEGezése: A megszüntetett védelmû dimert az 1. példa 10. lépésében leírtak szerint PEG-ezzük. 9. lépés – Tisztítás ioncserével: A megszüntetett védelmû dimert az 1. példa 11. lépésében leírtak szerint tisztítottuk. 3. példa: Aktivitásvizsgálatok in vitro E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vitro vizsgálatok vannak leírva. E vizsgálatok eredményei bemutatták, hogy a találmány szerinti új peptidek EPO¹R-hez kötõdnek és EPO¹R jelkibocsátást aktiválnak. Továbbá, e vizsgálatok eredményei rámutattak arra is, hogy az új peptidkészítmények EPO¹R¹t kötõ affinitása és biológiai hatása meglepõen magasabb, mint a korábban leírt, EPO¹t utánzó peptideké. EPO¹R agonista peptiddimereket állítottunk elõ az 1. példában vagy a 2. példában leírt eljárások szerint. E peptiddimerek potenciáját az alábbiakat tartalmazó in vitro aktivitásvizsgálatokkal értékeltük: Riportervizsgálat, proliferációs vizsgálat, kompetitív kötési vizsgálat, és C/BFU vizsgálat. E négy vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk.

2

Ezen in vitro aktivitási vizsgálatok eredményei a 2. táblázatban vannak összefoglalva.

40

45

50

55

60

41

1. Riportervizsgálat Ez a vizsgálat egéreredetû pre-B-sejtvonalból származó, Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux riportersejten alapul. Ez a riportersejtvonal az emberi EPO-receptor extracelluláris részét az emberi GCSF-receptor intracelluláris részéhez kapcsolva tartalmazó kimérikus receptort expresszál. E sejtvonal még egy fos promoter által meghajtott, luciferáz riportergén-konstrukcióval is transzfektálva van. Ha e kimérikus receptort eritropoietikus ágens hozzáadásával aktiváljuk, akkor ez a luciferáz riportergén expresszióját eredményezi, és ennélfogva – a luciferáz szubsztrátumának, a luciferinnek hozzáadása esetén – fénykibocsátás történik. Eszerint ilyen sejtekben az EPO¹R aktivációjának szintje a luciferáz aktivitásának mérésével mennyiségileg meghatározható. A Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux sejteket 10%, újszülött borjúból származó szérummal [fetal bovine serum (FBS; Hyclone)], 10% WEHI¹3 felülúszóval (a WEHI¹3 sejtek tenyésztenék felülúszója, ATCC sz.: TIB¹68), és penicillin/streptomicinnel kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco) tenyésztettük. Körül-

1

HU 005 558 T2

belül 18 órával a vizsgálat elõtt, a sejteket 10% FBSsel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatba való átvitellel éheztettük. A vizsgálat napján, a sejteket 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal egyszer mostuk, majd 1×106 sejt/ml sejtet ismert koncentrációjú tesztpeptid, vagy pozitív kontrollként szolgáló EPO (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) jelenlétében, 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban tenyésztettük. A tesztpeptidekbõl készült hígítási sorozatokat egymás után teszteltük e vizsgálatban. Vizsgálati lemezeket 37 °C¹on, 5% CO2-légkörben 4 órán át inkubáltuk, majd minden lyukhoz luciferint (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) adtunk. Ötperces inkubálás után, Packard Topcount Luminometeren (Packard Instrument Co., Downers Grove, Hl.) fényemissziót mértünk. A kapott fényértékeket a tesztpeptid relatív koncentrációjának függvényében ábrázoltuk és Graph Pad szoftver alkalmazásával analizáltuk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük az EC50értéknek (lásd 2. táblázat: Riporter EC50). 2. Proliferációs vizsgálat E vizsgálat emberi EPO¹R expresszálására transzfektált, egéreredetû Baf3 pre-B-sejtvonalon alapul. A transzfektálás eredményéül kapott BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejtvonal proliferációja EPO¹Raktiválástól függ. MTT alkalmazásával mennyiségileg meghatározzuk a sejtproliferáció mértékét. Az MTT vizsgálatban kapott jel az életképes sejtek számával arányos. A BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejteket 10% FBS-sel (Hyclone) és 2% WEHI¹3 felülúszóval (ATCC sz.: TIB¹68) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában tenyésztettük. A tenyésztett sejteket (1×106 sejt/ml) 12 órán át, 10% FBS-sel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában éheztettük. Az éheztetett sejteket Dulbecco-féle PBS-sel (Gibco) kétszer mostuk, és 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban, 1×106 sejt/ml sûrûségû szuszpenzióként felszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióból 50 ml¹es mintákat (~50 000 sejt) lemezeltünk ki 96 lyukú vizsgálati lemezekre, háromszoros ismétlésben. Tesztelni kívánt, EPO¹t utánzó peptidekbõl, 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal készült hígítási sorozatokat (50 ml) vagy EPO¹t (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) vagy Aranesp™¹et (a-darbepoietin, kereskedelmi forgalomban az Amgentõl beszerezhetõ EPO¹R-agonista) (50 ml) mértünk be a 96 lyukú vizsgálati lemezek lyukaiba (a lyukakban a végsõ térfogat 100 ml volt). Például 12 különféle hígítás tesztelhetõ, ahol a tesztpeptid (vagy a kontroll EPO peptid) végkoncentrációja 810 pM és 0,0045 pM közötti tartományba esik. A kilemezelt sejteket elõször 48 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd minden tenyészlemez lyukaiba bemértünk 10¹10 ml MTT¹t (Roche Diagnostics) és további 4 órán át inkubáltuk. A reakciót 10% SDS+0,01 N HCl hozzá-

5

2

adásával állítottuk le. A lemezeket 12 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd spektrofotométerrel 595 nm hullámhosszon megmértük minden lyuk abszorbanciáját. A leolvasott abszorbanciaértékek és a tesztpeptid-koncentráció közötti összefüggést grafikusan ábrázoltuk, és Graph Pad szoftver alkalmazásával EC50-értékeket számítottunk. A maximális abszorbancia felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC50-értéknek (lásd 2. táblázat: Proliferációs EC50).

10

15

20

25

30

35

40

45

50

3. Kompetitív kötési vizsgálat A kompetitív kötési számításokat olyan vizsgálat alkalmazásával végeztük, amelyben az alábbi két gyöngy egymáshoz való közelségének következtében fényjel jön létre: biotinilált, EPO¹R¹t kötõ peptidtracert hordozó streptavidin donorgyöngy és EPO-r-hez kötött akceptorgyöngy. A fényt nem besugárzásos energiaátvitel hozza létre, amely energiaátvitel esetén megvilágításkor egy elsõ gyöngyrõl szinglet oxigén szabadul fel, és a felszabadult szinglet oxigénnel való érintkezés a második gyöngyben fényemissziót vált ki. E gyöngykészletek kereskedelmi forgalomban elérhetõk (Packard). A gyöngyök az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracer EPO¹R-hez való kötõdése révén kerülnek egymáshoz. Az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracerrel az EPO¹R-hez való kötõdésben versengõ tesztpeptid megakadályozza e kötõdést és ezzel csökkenti a fényemissziót. Az eljárás részletesebben az alábbiak szerint zajlik: Az EPO¹R-agonista peptid, illetve a pozitív vagy negatív kontrollok hígítási sorozataiból mérjünk be 4 ml¹t egy 384 lyukú lemez lyukaiba. Azután ehhez lyukanként adjunk 2 ml receptor/gyöngy keveréket. A receptor/gyöngy keverék az alábbiakból áll: 15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú streptavidin donorgyöngyök (Packard), 15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú ab179 monoklonális antitest (ez az antitest ismeri fel a rekombináns EPO¹R-ben lévõ, emberi placentából származó lúgos foszfatázt), protein A¹val bevont akceptorgyöngyök (protein A fogja megkötni az ab179 antitestet; Packard), 112,5 ml, 1:6,6 arányban hígított rekombináns EPO¹R (az ab179 antitest által célbavett epitópot tartalmazó, emberi placentából származó lúgos foszfatázrészt tartalmazó fúziós fehérjeként, kínai hörcsögben elõállítva) és 607,5 ml Alphaquest puffer (4 OmM HEPES, pH=7,4; 1 mM MgCl2; 0,1% BSA, 0,05% Tween 20). Ütögetéssel összekeverni. Lyukanként adjunk 2 ml biotinilált EPO¹R¹t kötõ fehérjetracert (30 nM végkoncentráció). A peptidtracer – egy EPO¹R¹t kötõ fehérje – elõállítása az 1. példában leírtak szerint, a Biotin-GGLYACHMGPITWVCQPLRG szekvencia (a SEQ ID No. 4 számú szekvencia) alkalmazásával történik. Peptidnyomkövetõ

55

60 42

1

HU 005 558 T2

Egyperces centrifugálással összekeverni. A lemezt szigeteljük le Packard Top Seallel és csavarjuk be fóliába. Inkubáljuk szobahõmérsékleten 12 órán át. Ábrázoljuk a fényemissziót a fehérjekoncentráció függvényében és analizáljuk Graph Pad vagy Excel programmal. A fényemisszióban, a tesztpeptid nélkül megfigyelt fényemisszióhoz viszonyítva 50%¹os csökkenést eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük az IC50-értéknek (lásd 2. táblázat: AQ IC50). 4. C/BFU¹e vizsgálat Az EPO¹R jelképzés a csontvelõ-eredetû õssejteket proliferálódó vörösvértest-prekurzorokká történõ differenciálódásra serkenti. E vizsgálat azt méri, hogy a tesztpeptid milyen mértékben képes serkenteni a vörösvértest-prekurzorok proliferációját és differenciálódását emberi csontvelõbõl származó pluripotens õssejtekbõl. E vizsgálathoz 10% FBS-sel (Hyclone) kiegészített IMDM tápoldatban (Gibco) hígítási sorozatokat készítettünk a tesztpeptidbõl. E hígítási sorozatokból, vagy pozitív kontrollként alkalmazott EPO-peptidbõl annyit adtunk metil-cellulózhoz, hogy a végtérfogat 1,5 ml legyen. A metil-cellulóz és peptid keverékét gondosan vortexeltük. Emberi csontvelõbõl származó CD34+ sejtmintákat (100 000 sejt/ml, Poietics/Cambrex) kiolvasztottunk. Egy 50 ml¹es csõben a kiolvasztott sejteket óvatosan hozzáadtuk 0,1 ml, 1 mg/ml koncentrációjú DNÁz-hoz (Stem Cells). Ezután a sejtekhez 40–50 ml IMDM tápoldatot adtunk: Az elsõ 10 ml tápol-

5

10

15

20

25

30

2

datot cseppenként, az 50 ml¹es csõ fala mentén adagoltuk, majd a maradék térfogat tápoldatot lassan beleengedtük a keverékbe a csõ oldala mentén. A sejteket 900 rpm-mel 20 percig centrifugáltuk, és a tápoldatot óvatosan leszívtuk. A sejteket 1 ml IMDM tápoldatban felszuszpendáltuk, és az 1 ml¹re esõ sejtsûrûséget hemocitométer-lemezen meghatároztuk (a sejtszuszpenzióból 10 ml minta a lemezre; sejtsûrûség=átlagos sejtszám×10 000 sejt/ml). A sejteket IMDM tápoldatban 15 000 sejt/ml sûrûségre hígítottuk. A hígított sejtekbõl 100 ml¹t adtunk az egyes metil-cellulóz-peptidminta keverékekhez (a vizsgálati tápoldatban a végsõ sejtkoncentráció 1000 sejt/ml volt), és a keveréket vortexeltük. Miután a keverékbõl eltûntek a buborékok, tompa végû tû alkalmazásával leszívtunk 1 ml¹t. Az egyes mintákból leszívott keverékekbõl 0,25 ml¹t bemértünk egy 24 lyukú lemez (Falcon brand) 4¹4 lyukába. A kilemezelt keverékeket 37 °C¹on, 5% CO2-atmoszférában, párásított inkubátorban 14 napig inkubáltuk. Fázismikroszkóppal (5×–10×objektív, 100×végsõ nagyítás) osztályoztuk az eritroidtelepek jelenlétét. Az EPO¹ra pozitív kontrollnál megfigyelt maximális számú kialakult telep 90%¹át eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC90-értéknek (lásd 2. táblázat: C/BFU¹e EC90). A találmány szerinti peptidek IC50-értékeinek mérésére egy alternatív, radioligandumos kompetitív kötési vizsgálat is alkalmazható. E vizsgálat az 125I-EPO, EPOr-hez való kötõdését méri. Elõnyös, ha a vizsgálatot az alábbi, példaként ismertetett protokoll szerint végezzük:

A) Anyagok Rekombináns, emberi EPO¹R/Fc kiméra

Azonosítás: Rekombináns, emberi EPO¹R/Fc kiméra Szállító: R & D Systems (Minneapolis, MN, US) Katalógusszám: 963-ER Tételszám: EOK033071 Tárolás: 4 °C

Jódozott, rekombináns, emberi eritropoietin

Azonosítás: (3[l25]-jódtirozil) Eritropoietin, human Rekombináns, magas specifikus aktivitású, 370 kBq, 10 mCi Szállító: Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, US) Katalógusszám: IM219–10 mCi Tételszám: Tárolás: 4 °C

Protein¹G Sepharose

Azonosítás: Protein¹G Sepharose 4 Fast Flow Szállító: Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, US) Katalógusszám: 17–0618–01 Tételszám: Tárolás: 4 °C

Vizsgálati puffer

0,1% borjú-szérumalbumint és 0,1% nátriumazidot tartalmazó, foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS), pH=7,4 Tárolás: 4 °C

B) A megfelelõ receptorkoncentráció meghatározása Ötven mikrogramm liofilizált, rekombináns, az emberi IgG1 Fc¹részével fuzionált, EPOr extracelluláris domént 1 ml vizsgálati pufferben feloldottunk. A vizsgálatban alkalmazandó receptor korrekt mennyiségének meghatározása céljából, 12×75 mm¹es polipropilén tesztcsövek-

ben kombináltuk e receptorkészítménybõl készült 55 100 ml¹es hígítási sorozatokat körülbelül 20 000 cpm, 200 ml térfogatú, jódozott emberi eritropoietinnel (125IEPO). A csöveket lezártuk és 12 órán át 4 °C¹on enyhén rázattuk egy LabQuake rotációs rázógépen. A következõ napon minden csõhöz hozzáadtunk 60 50 ml, 50% Protein¹G Sepharose¹t tartalmazó keveré43

1

HU 005 558 T2

ket. A csöveket óvatos kevergetés mellett, 4 °C¹on 2 órán át inkubáltuk. A csöveket 15 percig 4000 rpmmel (3297×G) centrifugáltuk a Protein¹G Sepharose leülepítése céljából. A felülúszót óvatosan eltávolítottuk és kiöntöttük. Mosás (háromszor, 1 ml 4 °C¹os vizsgálati puffer) után, az üledékeket Wallac Wizard gammaszámlálóban mértük. Az eredményeket analizáltuk és kiszámítottuk a maximális kötés 50%-ának eléréséhez szükséges hígítást. C) A peptid IC50-értékének meghatározása A Peptid I IC50-értékének meghatározásához, a peptidbõl készült 100 ml¹es hígítási sorozatokat 100 ml rekombináns eritropoietin-receptorral (100 pg/csõ) kombináltuk 12×75 mm¹es polipropilén tesztcsövek-

2

ben. Ezután, 100 ml térfogatú, jódozott emberi eritropoietinnel (125I-EPO) adtunk minden csõhöz, és a csövek lezárása rekombináns eritropoietin-receptorral (100 pg/csõ) kombináltuk 12×75 mm¹es polipropilén 5 tesztcsövekben. Ezután, 100 ml térfogatú, jódozott emberi eritropoietinnel (125I-EPO) adtunk minden csõhöz, és a csövek lezárása után, óvatos kevergetés mellett, 4 °C¹on 2 órán át inkubáltuk. A rákövetkezõ napon, a fentiekben leírtak szerint 10 meghatároztuk a kötött 125I-EPO mennyiségét. Az eredményeket analizáltuk és Graphpad Prism 4.0 verziójának [GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA)] alkalmazásával kiszámítottuk az IC50-értéket. Minden peptidnél a vizsgálatot kétszer vagy többször ismételtük, össze15 sen 3 vagy több ismételt IC50-meghatározás céljából.

2. táblázat Peptiddimerek aktivitásának vizsgálata in vitro A vegyület elnevezése

Peptiddimer

Riporter EC50 (pM)

Proliferációs EC50 (pM)

IC50 (pM)

C/BFU¹e EC90 (nM)

–

–

110

2,2

150

72

–

2,7

II. peptid (SEQ ID NO: 3)

III. peptid (SEQ ID NO: 3)

4. példa: In vivo aktivitásvizsgálatok E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vivo vizsgálatok vannak leírva. EPO¹R-agonista peptiddimereket állítottunk elõ az 1. példában vagy 2. példában leírt eljárások szerint. E peptidmonomerek és ¹dimerek in vivo aktivitását vizsgálati sorozatokban, így policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálatban és retikulocitavizsgálatban, értékeltük. E két vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk. 1. Policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálat A tesztpeptidek in vivo aktivitását a Cotes és Bangham által leírt [Cotes és Bangham, Nature 191, 1065–1067 (1961)] eljárásból adaptált, policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálatban elemeztük. E vizsgálat egy adott tesztpeptid EPO-utánzó képességét vizsgálja: azaz az EPO¹R-aktiváló és új vörösvértest-szintézist indukáló képességet. A vörösvértestek szintézisének mennyiségi meghatározása radio-

aktivitással jelzett vas újonnan szintetizált vörösvértes40 tekbe való beépülésén alapul. BFD1 egereket 7–10 napig hagytuk a környezethez akklimatizálódni. Minden állatnak lemértük a testsúlyát, és az alacsony súlyú állatokat (<15 gramm) nem alkalmaztuk. Alacsonynyomású kamrában, egereket egy45 mást követõ kondicionáló ciklusoknak vetettünk alá összesen 14 napon át. Az egyes 24 órás ciklusok 18 órás 0,40±0,02% atmoszférás nyomásból és 6 órán át tartó környezeti nyomásból álltak. Kondicionálás után, a dozírozást megelõzõen az egereket további 50 72 órán át környezeti nyomáson tartottuk. Tesztpeptideket, vagy rekombináns, emberi EPO standardokat 0,1% BSA¹t tartalmazó PBS-ben (PBS/BSA) hígítottunk. A peptidmonomerekbõl készült törzsoldatokat elõször dimetil-szulfoxidban 55 (DMSO) szolubilizáltuk. Negatív kontrollcsoportok egy önmagában PBS/BSA-val injektált csoportból és egy 1%¹os DMSO-val injektált csoportból álltak. Minden dóziscsoport 10 egérbõl állt. Az egereket szubkután (a tarkó bõrén át) injektáltuk a megfelelõ minta 60 0,5 ml¹ével. 44

1

HU 005 558 T2

A minta injektálása után 48 órával, az egereknek 0,2 ml Fe59¹et (Dupont, NEN) adtunk be intraperitoneálisan, egerenként körülbelül 0,75 mCi dózisban. Az Fe59 beadása után 24 órával meghatároztuk az egerek testsúlyát, és az Fe59 beadása után 48 órával az egereket elöltük. Minden állatból szívpunktúrával vért gyûjtöttünk és hematokriteket mértünk (antikoagulánsként heparint alkalmaztunk). Minden vérmintát (0,2 ml) Fe59beépülésre analizáltunk Packard gammaszámláló alkalmazásával. Nem reagáló egereket (azaz a negatív kontrollhoz képest alacsonyabb mértékû radioaktivitásbeépüléses egerek) töröltük a megfelelõ adathalmazból. Azokat az egereket is töröltük, amelyeknél a negatív csoportban mért értékek 53%¹át meg nem haladó hematokritértékeket mértünk. Minden kísérleti dózisra vonatkozó eredmények 10 állatból származnak. Minden csoportra kiszámoltuk a vérbe beépült radioaktivitás átlagos mennyiségét [szám/perc (CPM)].

5

10

15

20 2. Retikulocitavizsgálat Normális BDF1 egereket három egymást követõ napon át kontroll EPO-val vagy tesztpeptiddel dozíroztunk (0,5 ml, szubkután injektálva). A harmadik napon az egereket vasdextránnal (100 mg/ml) is dozíroztuk (0,1 ml, intraperitoneálisan). Az ötödik napon az egereket CO2-dal elaltattuk és szívpunktúrával elvéreztettük. A vérmintákban lévõ retikulociták százalékos arányát tiazolnarancs-festéssel és áramlási citometriás analízissel (retic-count program) határoztuk meg. A hematokritértékeket manuálisan határoztuk meg. A korrigált retikulocitaszázalékot az alábbi képlet alkalmazásával határoztuk meg: % RETICKORRIGÁLT=% RETICMEGFIGYELT× (HematokritEGYEDI/HematokritNORMÁL). 3. Hematológiai vizsgálat Normális CDI egereket pozitív kontrollként EPOval, illetve tesztpeptiddel vagy hordozóval négy héten át, hetente egyszer intravénás injekcióval dozíroztunk. Egy sorozat pozitív kontroll vagy tesztpeptiddózist (mg/kg-ként megadva) teszteltünk az aktív vegyület koncentrációjának változtatásával a készítményben. Az injektált térfogat 5 ml/kg volt. A hordozóval injektált csoport 12 állatból, a további dóziscsoportok mindegyike 8 állatból állt. A napi életképességet és heti testsúlyokat feljegyeztük. A dozírozott egereket éheztettük, majd izofluránbelélegeztetéssel elaltattuk és szívpunktúrával vagy abdominális aorta punktúrájával vérmintát gyûjtöttünk az 1. napon (hordozóval kezelt kontrollegerek) és a 15., illetve 29. napokon (4 egér/csoport/nap). A vért Vacutainer® csövekbe transzferáltuk. Elõnyös antikoaguláns az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA). A vérmintákat végpontokra nézve a vörösvérszintézisre és fiziológiára – így, hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) és össz-eritrocitaszám (RBC) – nézve értékeltünk a technikában jól ismert automata klinikai analizátorok (például a Coulter, Inc. által gyártott analizátorok) alkalmazásával.

25

2

5. példa: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCOPLRK aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 4 számú szekvencia) peptidmonomerek EPO¹R-agonista homodimerjeinek szintézise/// 1. lépés – A peptidmonomerek szintézise: Egy ABI 431A peptidszintetizálón peptidmonomereket szintetizáltunk standard Fmoc-kémia alkalmazásával (TGRAM gyanta; 0,18 mmol/g Rapp Polymere, Németország). Amidált karboxiterminálist hordozó peptidmonomerek szintéziséhez, a teljesen összeállított peptidet 82,5% TFA, 5% víz, 6,25% anizol, és 6,25% etánditiol tartalmú keverékkel hasítottuk le a gyantáról. A megszüntetett védelmû terméket szûréssel elválasztottuk a gyantától és dietil-éterrel kicsaptuk. Gondos szárítás után a terméket C18 fordított fázisú nagy teljesítményû folyadékkromatográfiával tisztítottuk (gradiens: acetonitril/víz 0,1% trifluor-ecetsavban). A peptid szerkezetét elektroporlasztásos tömegspektrometriával ellenõriztük. A diszulfidképzés befolyásolása céljából, a peptidet DMSO:víz 1:1 arányú keverékében 1 mg/ml koncentrációban feloldottuk. A terméket C18 fordított fázisú nagy teljesítményû folyadékkromatográfiával tisztítottuk (gradiens: acetonitril/víz 0,1% trifluorecetsavban). A peptidmonomereket az alábbi ábrával lehet bemutatni:

(SEQ ID NO: 1) 30

35

40

45

50

55

60 45

2. lépés – A trifunkcionális linker szintézise: Száz milliliterben DCM-mel készült, dietil-iminoacetát (10,0 g, 52,8 mmol) és Boc-b-alanin (10,0 g, 52,8 mmol) oldathoz diizopropil-karbodiimidet (8,0 ml, 51,1 mmol) adtunk (legalább 10 perc alatt, szobahõmérsékleten). Az adagolás során a reakciókeveréket körülbelül 10 °C¹kal magasabb hõmérsékletre melegítettük fel, majd 20 perc alatt visszahûtöttük szobahõmérsékletre. A reakciókeveréket 12 órán át kevertük és a kicsapódott diizopropil-ureát szûréssel eltávolítottuk. Az oldószert vákuum alatt, szobahõmérsékleten eltávolítottuk, és a visszamaradt anyagot etil-acetátban feloldottuk, majd ismét szûrtük a további kicsapódott urea eltávolítása céljából. A szerves fázist választótölcsérbe öntöttük, mostuk (telített NaHCO3, sóoldat, 0,5 N HCl, sóoldat), szárítottuk (MgSO4), szûrtük és vákuum alatt beszárítva színtelen olaj formájában megkaptuk a diészterterméket. A diésztert MeOH:THF 1:1 arányú keverékében (100 ml) felvettük és vizet (25 ml), majd NaOH¹ot (5 g, 125 mmol) adtunk hozzá. Méréseink szerint a pH=10-nél magasabb volt. A reakciókeveréket 2 órán át szobahõmérsékleten kevertük, majd 6 N HCl hozzáadásával a pH¹t 1¹re savanyítottuk. A vizes fázist NaCl-dal telítettük és etil-acetáttal négyszer extraháltuk. A kombinált szerves fázist mostuk (sóoldat), szárítottuk (MgSO4) és vákuum alatt félig szilárd, fehér anyaggá koncentráltuk be. A szilárd anyagot 50 ml DCM-ben feloldottuk és 300 ml hexán hozzáadásával fehér zagyot állítottunk elõ. Az oldószert vákuum alatt eltávolítva fehér színû szilárd disav-

1

HU 005 558 T2

hoz jutottunk (14,7 g, a két lépésre 91,5%¹os kitermelés). A disav (1 g, 3,29 mmol) 20 ml DMF-fel készült oldatához N¹hidroxi-szukcinimidet (770 mg, 6,69 mmol), diizopropil-karbodiimidet (1,00 ml, 6,38 mmol) és 4¹dimetil-amino-piridint (3 mg, 0,002 mmol) adtunk. A reakciókeveréket 12 órán át kevertük, és az oldószert vákuum alatt eltávolítottuk. A visszamaradt anya-

5

2

got etil-acetátban felvettük és a kicsapódott ureát szûréssel eltávolítottuk. A szerves fázist választótölcsérbe öntöttük, mostuk (telített NaHCO3, sóoldat, 0,5 N HCl, sóoldat), szárítottuk (MgSO4), szûrtük és vákuum alatt beszárítva, fehér színû szilárd anyag formájában megkaptuk a di¹NHS-észter-terméket (1,12 g, 68%¹os kitermelés).

3. lépés – A trifunkcionális linker kapcsolása a peptidtartalmazó DCM-ben 30 percig oldva eltávolítottuk a Boc csoportot, majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. monomerekhez: A linkerhez való kapcsolásnál, száraz A dimer szerkezetét elektroporlasztásos tömegspektroDMF-ben 2 ekv. peptidet 1 ekv. trifunkcionális linkerrel összekeverve tiszta oldatot kaptunk, majd 2 perccel ké- 20 metriával ellenõriztük. E kapcsolási reakció a linkert az egyes monomerek lizin aminosavai e¹amino-csoportjásõbb ehhez hozzáadtunk 5 ekv. DIEA¹t. A keveréket szonak nitrogénatomjához köti. A folyamatot az alábbiakban, bahõmérsékleten 14 órán át kevertük. Az oldószert váa SEQ ID No. 1 számú szekvenciával mutatjuk be. kuum alatt eltávolítottuk és a nyersterméket 80% TFA¹t

46

1

HU 005 558 T2

4. lépés – A peptiddimer PEG-ezése: PEG-ezés a karbamátkötés révén: A peptiddimert száraz DMF-ben azonos mennyiségû (moláris alapon) aktivált PEG-féleséggel (mPEG-NPC, NOF Corp., Japán) összekeverve tiszta oldatot készítettünk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 4 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmér-

PEG-ezés amidkötés révén: A peptiddimert száraz DMF-ben azonos mennyiségû (moláris alapon) aktivált PEG-féleséggel (PEG-SPA-NHS, Shearwater Corp, USA) összekeverve tiszta oldatot készítettünk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 10 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmérsékleten 2 órán át ke-

5

2

sékleten 14 órán át kevertük, majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A PEG-ezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk, a tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. Az mPEG-NPC-vel végzett PEG-ezést a SEQ ID No. 1 számú szekvenciával mutatjuk be.

40 vertük, majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A PEG-ezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk. A tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. A el végzett PEG-ezést a SEQ ID No. 1 számú szekven45 ciával mutatjuk be.

47

1

HU 005 558 T2

5. lépés – Peptidek tisztítása ioncserével: Számos cserélõ hordozót vizsgáltunk arra nézve, hogy a kiindulási dimer peptid megtartása mellett, képesek¹e elválasztani a nem reagált (vagy hidrolizált) PEG¹t a fenti peptid-PEG konjugátumtól. Az ioncserélõ gyantát (2–3 g) 1 cm¹es oszlopba töltöttük, majd a nátrium formává (0,2 N NaOH¹ot töltöttünk az oszlopra addig, amíg az eluens pH¹ja 14 nem lett, körülbelül 5 oszloptérfogat) és azután hidrogénformává alakítottuk (elúció 0,1 N HCl-dal vagy 0,1 M HOAc-vel, amíg az eluens pH¹ja meg nem egyezett a betöltéskor mért pH¹val, körülbelül 5 oszloptérfogat), majd a gyantát 25%¹os ACN/víz eleggyel mostuk, amíg a pH=6 nem lett. A konjugáció elõtti peptidet vagy a peptid-PEG konjugátumot 25%¹os ACN/víz elegyben feloldottuk (10 mg/ml) és a pH¹t TFA-val 3¹nál alacsonyabb értékre állítottuk be, majd felvittük az oszlopra. Két-három oszloptérfogat 25%¹os ACN/víz eleggyel történt mosás és 5 ml¹es frakciók gyûjtése után, a peptidet 25%¹os ACN/víz elegyben oldott 0,1 M¹os NH4OAC-vel szabadítottuk fel az oszlopról ismét 5 ml¹es frakciókat gyûjtve. HPLC-vel végzett analízis megmutatta, hogy mely frakciók tartalmazták a kívánt peptidet. Elpárologtatással egybekötött fényszórásdetektorral (ELSD) végzett analízis jelezte, hogy amikor a peptid fennmaradt az oszlopon és a NH4OAC-oldattal eluálásra került (általában a 4. és 10. frakciók között), szennyezõdésként elõforduló nem konjugált PEG¹t nem lehetett megfigyelni. Amikor a peptid a kezdõ mosási pufferben (általában az elsõ 2 frakció) eluálódott, a kívánt PEG-konjugátum elválasztását és feleslegben lévõ PEG¹t nem észleltünk. Az alábbi oszlopok egyaránt visszatartották a peptidet és a peptid-PEG konjugátumot, és sikeresen meg-

2

tisztították a peptid-PEG konjugátumot a nem konjugált peptidtõl. 30

3. táblázat Ioncserélõ gyanták Hordozó

35

40

45

50

55

60

48

Forrás

Mono S HR 5/5, elõre megtöltött, erõs kationcserélõ oszlop

Amersham Biosciences

SE53 Cellulose, mikroszemcsés, erõs kationcserélõ hordozó

Whatman

SP Sepharose Fast Flow, erõs kationcserélõ hordozó

Amersham Biosciences

6. példa: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCOPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) EPO¹R agonista peptidmonomerek peptidhomodimerjeinek szintézise (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) EPO¹R agonista peptidmonomerek peptidhomodimerjeit az 1. példában leírtak szerint szintetizáltuk kivéve azt, hogy az 1. lépésben a szintetizált peptidek szekvenciája az alábbi volt: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) Ahol a PEG¹t karbamátkötéssel csatlakoztattuk a linkerhez, e szintézisnek a SEQ ID No. 1 számú szekvenciával képzett végterméke szerkezetileg az alábbiak szerint ábrázolható:

1

HU 005 558 T2

2

Ahol a PEG¹t amidkötéssel csatlakoztattuk a linkerhez, e szintézisnek a SEQ ID No. 1 számú megadott

szekvenciával képzett végterméke szerkezetileg az 20 alábbiak szerint ábrázolható:

7. példa: In vitro aktivitásvizsgálatok E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vitro vizsgálatok vannak leírva. E vizsgálatok eredményei bemutatták, hogy a találmány szerinti új peptidek EPO¹R-hez kötõdnek és EPO¹R jelkibocsátást aktiválnak. Továbbá e vizsgálatok eredményei rámutattak arra is, hogy az új peptidkészítmények EPO¹R¹t kötõ affinitása és biológiai hatása meglepõen magasabb, mint a korábban leírt, EPO¹t utánzó peptideké. EPO¹R agonista peptidmonomereket és ¹dimereket állítottunk elõ az 1. példában vagy a 2. példában leírt eljárások szerint. E peptiddimerek potenciáját az alábbiakat tartalmazó in vitro aktivitásvizsgálatokkal értékeltük: riportervizsgálat, proliferációs vizsgálat, kompetitív kötési vizsgálat, és C/BFU vizsgálat. E négy vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk. Ezen in vitro aktivitási vizsgálatok eredményei a 2. táblázatban vannak összefoglalva.

1. Riportervizsgálat Ez a vizsgálat egéreredetû pre-B-sejtvonalból származó, Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux riportersejten alapul. Ez a riportersejt-vonal az emberi EPO-receptor extracelluláris részét az emberi GCSF-receptor intracelluláris részéhez kapcsolva tartalmazó kimérikus receptort expresszál. E sejtvonal még egy fos promoter által meghajtott, luciferáz riportergén-konstrukcióval is transzfektálva van. Ha e kimérikus receptort eritropoietikus ágens hozzáadásával aktiváljuk, akkor az aktiválás a luciferáz riportergén expresszióját eredményezi, és ennélfogva – a luciferáz szubsztrátumának, a luciferinnek hozzáadása esetén – fénykibocsátás történik. Eszerint ilyen sejtekben az EPO¹R aktivációjának szintje a luciferáz aktivitásának mérésével mennyiségileg meghatározható. A Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux sejteket 10%, újszülött borjúból származó szérummal [fetal bovine serum (FBS; Hyclone)], 10% WEHI¹3 felülúszóval (a WEHI¹3 sejtek tenyésztenék felülúszója, ATCC sz.:

45

50

55

60

49

1

HU 005 558 T2

TIB¹68), és penicillin/streptomicinnel kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco) tenyésztettük. Körülbelül 18 órával a vizsgálat elõtt, a sejteket 10% FBS-sel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatba való átvitellel éheztettük. A vizsgálat napján a sejteket 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal egyszer mostuk, majd 1×106 sejt/ml sejtet ismert koncentrációjú tesztpeptid, vagy pozitív kontrollként szolgáló EPO (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) jelenlétében, 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban tenyésztettük. A tesztpeptidekbõl készült hígítási sorozatokat egymás után teszteltük e vizsgálatban. Vizsgálati lemezeket 37 °C¹on, 5% CO2-légkörben 4 órán át inkubáltuk, majd minden lyukhoz luciferint (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) adtunk. Ötperces inkubálás után, Packard Topcount Luminometeren (Packard Instrument Co., Downers Grove, Hl.) fényemissziót mértünk. A kapott fényértékeket a tesztpeptid relatív koncentrációjának függvényében ábrázoltuk és Graph Pad szoftver alkalmazásával analizáltuk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC50-értéknek. 2. Proliferációs vizsgálat E vizsgálat emberi EPO¹R expresszálására transzfektált, egéreredetû Baf3 pre-B-sejtvonalon alapul. A transzfektálás eredményéül kapott BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejtvonal proliferációja EPO¹Raktiválástól függ. MTT alkalmazásával mennyiségileg meghatározzuk a sejtproliferáció mértékét. Az MTT vizsgálatban kapott jel az életképes sejtek számával arányos. A BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejteket 10% FBS-sel (Hyclone) és 2% WEHI¹3 felülúszóval (ATCC sz.: TIB¹68) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában tenyésztettük. A tenyésztett sejteket (1×106 sejt/ml) 12 órán át, 10% FBS-sel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában éheztettük. Az éheztetett sejteket Dulbecco-féle PBS-sel (Gibco) kétszer mostuk, és 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban, 1×106 sejt/ml sûrûségû szuszpenzióként felszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióból 50 ml¹es mintákat (~50 000 sejt) lemezeltünk ki, háromszoros ismétlésben, 96 lyukú vizsgálati lemezekre. Tesztelni kívánt, EPO¹t utánzó peptidekbõl, 10% FBSsel (WEHI¹3 I felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal készült hígítási sorozatokat (50 ml) vagy EPO¹t (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) vagy Aranesp™¹et (a-darbepoietin, kereskedelmi forgalomban az Amgentõl beszerezhetõ EPO¹R-agonista) (50 ml) mértünk be a 96 lyukú vizsgálati lemezek lyukaiba (a lyukakban a végsõ térfogat 100 ml volt). Például 12 különféle hígítás tesztelhetõ, ahol a tesztpeptid (vagy a kontroll EPO peptid) végkoncentrációja 810 pM és 0,0045 pM közötti tartományba esik. A kilemezelt sejteket elõször 48 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd minden tenyészlemez lyukaiba bemértünk 10¹10 ml MTT¹t (Roche Diagnostics) és további 4 órán át inkubál-

5

2

tuk. A reakciót 10% SDS+0,01 N HCl hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket 12 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd spektrofotométerrel 595 nm hullámhosszon megmértük minden lyuk abszorbanciáját. A leolvasott abszorbanciaértékek és a tesztpeptid-koncentráció közötti összefüggést grafikusan ábrázoltuk, és Graph Pad szoftver alkalmazásával EC50-értékeket számítottunk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC50-értéknek.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

3. Kompetitív kötési vizsgálat A kompetitív kötési számításokat olyan vizsgálat alkalmazásával végeztük, amelyben az alábbi két gyöngy egymáshoz való közelségének következtében fényjel jön létre: biotinilált, EPO¹R¹t kötõ peptidtracert hordozó streptavidin donorgyöngy és EPO-r-hez kötött akceptorgyöngy. A fényt nem besugárzásos energiaátvitel hozza létre, amely energiaátvitel esetén megvilágításkor egy elsõ gyöngyrõl szinglet oxigén szabadul fel, és a felszabadult szinglet oxigénnel való érintkezés a második gyöngyben fényemissziót vált ki. E gyöngykészletek kereskedelmi forgalomban elérhetõk (Packard). A gyöngyök az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracer EPO¹R-hez való kötõdése révén kerülnek egymáshoz. Az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracerrel az EPO¹R-hez való kötõdésben versengõ tesztpeptid megakadályozza e kötõdést, csökkentve ezzel a fényemissziót. Az eljárás részletesebben az alábbiak szerint zajlik: Az EPO¹R-agonista peptid, illetve a pozitív vagy negatív kontrollok hígítási sorozataiból mérjünk be 4 ml¹t egy 384 lyukú lemez lyukaiba. Azután ehhez lyukanként adjunk 2 ml receptor/gyöngy keveréket. A receptor/gyöngy keverék az alábbiakból áll: 15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú streptavidin donorgyöngyök (Packard), 15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú ab179 monoklonális antitest (ez az antitest ismeri fel a rekombináns EPO¹Rben lévõ, emberi placentából származó lúgos foszfatázt), protein A¹val bevont akceptorgyöngyök (protein A fogja megkötni az ab179 antitestet; Packard), 112,5 ml, 1:6,6 arányban hígított rekombináns EPO¹R (az ab179 antitest által célbavett epitópot tartalmazó, emberi placentából származó lúgos foszfatázrészt tartalmazó fúziós fehérjeként, kínai hörcsögben elõállítva) és 607,5 ml Alphaquest puffer (4 0 mM HEPES, pH=7,4; 1 mM MgCl2; 0,1° BSA, 0,05% Tween 20). Ütögetéssel összekeverni. Lyukanként adjunk 2 ml biotinilált EPO¹R¹t kötõ fehérjetracert (30 nM végkoncentráció). A peptidtracer – egy EPO¹R¹t kötõ fehérje – elõállítása az 1. példában leírtak szerint, a SEQ ID No. 1 számú szekvencia alkalmazásával történik. Peptidnyomkövetõ

55

Egyperces centrifugálással összekeverni. A lemezt 60 szigeteljük le Packard Top Seallel és csavarjuk be fó50

1

HU 005 558 T2

liába. Inkubáljuk szobahõmérsékleten 12 órán át. Tizennyolc óra elteltével AlphaQuest leolvasóberendezés (Packard) alkalmazásával olvassuk le a fényemissziót. Ábrázoljuk a fényemissziót a fehérjekoncentráció függvényében és analizáljuk Graph Pad vagy Excel programmal. A fényemisszióban, a tesztpeptid nélkül megfigyelt fényemisszióhoz viszonyítva, 50%¹os csökkenést eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük IC50értéknek. 4. C/BFU¹e vizsgálat Az EPO¹R jelképzés a csontvelõ-eredetû õssejteket proliferálódó vörösvértest-prekurzorokká történõ differenciálódásra serkenti. E vizsgálat azt méri, hogy a tesztpeptid milyen mértékben képes serkenteni a vörösvértest-prekurzorok proliferációját és differenciálódását primer emberi csontvelõbõl származó pluripotens õssejtekbõl. E vizsgálathoz, 10% FBS-sel (Hyclone) kiegészített IMDM tápoldatban (Gibco) a tesztpeptidbõl hígítási sorozatokat készítettünk. E hígítási sorozatokból, vagy pozitív kontrollként alkalmazott EPO-peptidbõl annyit adtunk metil-cellulózhoz, hogy a végtérfogat 1,5 ml legyen. A metil-cellulóz és peptid keverékét gondosan vortexeltük. Emberi csontvelõbõl származó CD34+ sejtmintákat (100 000 sejt/ml, Poietics/Cambrex) kiolvasztottunk. Egy 50 ml¹es csõben a kiolvasztott sejte-

5

10

15

20

25

2

ket óvatosan hozzáadtuk 0,1 ml, 1 mg/ml koncentrációjú DNÁz-hoz (Stem Cells). Ezután a sejtekhez 40–50 ml IMDM tápoldatot adtunk: az elsõ 10 ml tápoldatot cseppenként, az 50 ml¹es csõ fala mentén adagoltuk, majd a maradék térfogat tápoldatot lassan beleengedtük a keverékbe a csõ oldala mentén. A sejteket 900 rpm-mel 20 percig centrifugáltuk, és a tápoldatot óvatosan leszívtuk. A sejteket 1 ml IMDM tápoldatban felszuszpendáltuk, és az 1 ml¹re esõ sejtsûrûséget hemocitométer-lemezen meghatároztuk (a sejtszuszpenzióból 10 ml minta a lemezre; sejtsûrûség=átlagos sejtszám×10 000 sejt/ml). A sejteket IMDM tápoldatban 15 000 sejt/ml sejtsûrûségre hígítottuk. A hígított sejtekbõl 100 ml¹t adtunk az egyes metil-cellulózpeptidminta keverékekhez (a vizsgálati tápoldatban a végsõ sejtkoncentráció 1000 sejt/ml volt), és a keveréket vortexeltük. Miután a keverékbõl eltûntek a buborékok, tompa végû tû alkalmazásával leszívtunk 1 ml¹t. Az egyes mintákból leszívott keverékekbõl 0,25 ml¹t bemértünk egy 24 lyukú lemez (Falcon brand) 4¹4 lyukába. A kilemezelt keverékeket 37 °C¹on, 5% CO2-atmoszférában, párásított inkubátorban 14 napig inkubáltuk. Fázismikroszkóppal (5×–10×objektív, 100×végsõ nagyítás) osztályoztuk az eritroidtelepek jelenlétét. Az EPO¹ra pozitív kontrollnál megfigyelt maximális számú kialakult telep 90%¹át eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC90-értéknek (lásd 2. táblázat: C/BFU¹e EC90).

4. táblázat Peptiddimerek aktivitásának vizsgálata in vitro A vegyület elnevezése

Peptiddimer

Riporter EC50 (pM)

Proliferációs EC50 (pM)

IC50 (pM)

C/BFU¹e EC90 (nM)

–

–

–

6,2

IV. peptid (SEQ ID NO: 1)

8. példa: In vivo aktivitásvizsgálatok E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vivo vizsgálatok vannak leírva. EPO¹R-agonista peptidmonomereket és ¹dimereket állítottunk elõ az 1. példában leírt eljárások szerint. E peptidmonomerek és ¹dimerek in vivo aktivitását vizsgálati sorozatokban, így policitémiás exhipoxiás egéren alapuló biológiai vizsgálatban és retikulocitavizsgálat-

ban, értékeltük. E két vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk. 55

1. Policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálat A tesztpeptidek in vivo aktivitását a Cotes és Bangham által leírt [Cotes és Bangham, Nature 191, 1065–1067 (1961)] eljárásból adaptált, policitémiás ex60 hipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálatban ele51

1

HU 005 558 T2

meztük. E vizsgálat egy adott tesztpeptid EPO-utánzó képességét vizsgálja: azaz az EPO¹R-aktiváló és új vörösvértest-szintézist indukáló képességet. A vörösvértestek szintézisének mennyiségi meghatározása radioaktivitással jelzett vas újonnan szintetizált vörösvértestekbe való beépülésén alapul. BFD1 egereket 7–10 napig hagytuk a környezethez akklimatizálódni. Minden állatnak lemértük a testsúlyát, és az alacsony súlyú állatokat (<15 gramm) nem alkalmaztuk. Alacsonynyomású kamrában, az egereket egymást követõ kondicionáló ciklusoknak vetettünk alá összesen 14 napon át. Az egyes 24 órás ciklusok 18 órás 0,40±0,02% atmoszférás nyomásból és 6 órán át tartó környezeti nyomásból álltak. Kondicionálás után, a dozírozást megelõzõen az egereket további 72 órán át környezeti nyomáson tartottuk. Tesztpeptideket, vagy rekombináns, emberi EPO standardokat 0,1% BSA¹t tartalmazó PBS-ben (PBS/BSA) hígítottunk. A peptidmonomerekbõl készült törzsoldatokat elõször dimetil-szulfoxidban (DMSO) szolubilizáltuk. Negatív kontrollcsoportok egy önmagában PBS/BSA-val injektált csoportból és egy 1%¹os DMSO-val injektált csoportból álltak. Minden dóziscsoport 10 egérbõl állt. Az egereket szubkután (a tarkó bõrén át) injektáltuk a megfelelõ minta 0,5 ml¹ével. A minta injektálása után 48 órával az egereknek 0,2 ml Fe59¹et (Dupont, NEN) adtunk be intraperitoneálisan, egerenként körülbelül 0,75 mCi dózisban. Az Fe59 beadása után 24 órával meghatároztuk az egerek testsúlyát, és az Fe59 beadása után 48 órával az egereket elöltük. Minden állatból szívpunktúrával vért gyûjtöttünk és hematokriteket mértünk (antikoagulánsként heparint alkalmaztunk). Minden vérmintát (0,2 ml) Fe59beépülésre analizáltunk Packard gammaszámláló alkalmazásával. Nem reagáló egereket (azaz a negatív kontrollhoz képest alacsonyabb mértékû radioaktivitásbeépüléses egerek) töröltük a megfelelõ adathalmazból. Azokat az egereket is töröltük, amelyeknél a negatív csoportban mért értékek 53%¹át meg nem haladó hematokritértékeket mértünk. Minden kísérleti dózisra vonatkozó eredmények 10 állatból származnak. Minden csoportra kiszámoltuk a vérbe beépült radioaktivitás átlagos mennyiségét [szám/perc (CPM)]. 2. Retikulocitavizsgálat Normális BDF1 egereket három egymást követõ napon át kontroll EPO-val vagy tesztpeptiddel dozíroztunk (0,5 ml, szubkután injektálva). A harmadik napon az egereket vasdextránnal (100 mg/ml) is dozíroztuk (0,1 ml, intraperitoneálisan). Az ötödik napon az egereket CO2-dal elaltattuk és szívpunktúrával elvéreztettük. A vérmintákban lévõ retikulociták százalékos arányát tiazolnarancs-festéssel és áramlási citometriás analízissel (retic-count program) határoztuk meg. A hematokritértékeket manuálisan határoztuk meg. A korrigált retikulocitaszázalékot az alábbi képlet alkalmazásával határoztuk meg: % RETICKORRIGÁLT= % RETICMEGFIGYELT× (HematokritEGYEDI/HematokritNORMÁL).

2

3. Hematológiai vizsgálat Normális CDI egereket pozitív kontrollként EPOval, illetve tesztpeptiddel vagy hordozóval négy héten át, hetente egyszer intravénás injekcióval dozíroztunk. 5 Egy sorozat pozitív kontroll vagy tesztpeptiddózist (mg/kg-ként megadva) teszteltünk az aktív vegyület koncentrációjának változtatásával a készítményben. Az injektált térfogat 5 ml/kg volt. A hordozóval injektált csoport 12 állatból, a további dóziscsoportok mindegyi10 ke 8 állatból állt. A napi életképességet és heti testsúlyokat feljegyeztük. A dozírozott egereket éheztettük, majd izofluránbelélegeztetéssel elaltattuk és szívpunktúrával vagy abdominális aorta punktúrájával vérmintát gyûjtöttünk az 15 1. napon (hordozóval kezelt kontrollegerek) és a 15., illetve 29. napokon (4 egér/csoport/nap). A vért Vacutainer® csövekbe transzferáltuk. Elõnyös antikoaguláns az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA). A vérmintákat végpontokra nézve a vörösvérszinté20 zisre és fiziológiára – így hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) és össz-eritrocitaszám (RBC) – nézve értékeltünk a technikában jól ismert automata klinikai analizátorok (például a Coulter, Inc. által gyártott analizátorok) alkalmazásával. 25 9. példa: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCOPLRK aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) peptidmonomerek EPO¹R agonista peptidhomodimerjeinek szintézise 1. lépés – A peptidmonomerek szintézise: Egy ABI 30 431A peptidszintetizálón peptidmonomereket szintetizáltunk standard Fmoc-kémia alkalmazásával (TGRAM gyanta; 0,18 mmol/g Rapp Polymere, Németország). Amidált karboxiterminálist hordozó peptidmono35 merek szintéziséhez a teljesen összeállított peptidet 82,5% TFA, 5% víz, 6,25% anizol, és 6,25% etánditiol tartalmú keverékkel hasítottuk le a gyantáról. A megszüntetett védelmû terméket szûréssel elválasztottuk a gyantától és dietil-éterrel kicsaptuk. Gondos szárítás 40 után a terméket C18 fordított fázisú nagy teljesítményû folyadékkromatográfiával tisztítottuk (gradiens: acetonitril/víz 0,1% trifluor-ecetsavban). A peptid szerkezetét elektroporlasztásos tömegspektrometriával ellenõriztük. A peptidmonomereket az alábbi ábrával lehetne 45 bemutatni: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLRK-NH2 (a SEQ ID No. 1 számú szekvencia) 2. lépés – A trifunkcionális linker szintézise: Száz milliliterben DCM-mel készült, dietil-iminoacetát 50 (10,0 g, 52,8 mmol) és Boc-b-alanin (10,0 g, 52,8 mmol) oldathoz diizopropil-karbodiimidet (8,0 ml, 51,1 mmol) adtunk (legalább 10 perc alatt, szobahõmérsékleten). Az adagolás során a reakciókeveréket körülbelül 10 °C¹kal magasabb hõmérsékletre melegí55 tettük fel, majd 20 perc alatt visszahûtöttük szobahõmérsékletre. A reakciókeveréket 12 órán át kevertük és a kicsapódott diizopropil-ureát szûréssel eltávolítottuk. Az oldószert vákuum alatt, szobahõmérsékleten eltávolítottuk, és a visszamaradt anyagot etil-acetátban fel60 oldottuk, majd a további kicsapódott urea eltávolítása 52

1

HU 005 558 T2

2

céljából ismét szûrtük. A szerves fázist választótölcsérbe öntöttük, mostuk (telített NaHCO3, sóoldat, 0,5 N HCl, sóoldat), szárítottuk (MgSO4), szûrtük és vákuum alatt beszárítva, színtelen olaj formájában megkaptuk a diészterterméket. A diésztert MeOH:THF 1:1 arányú keverékében (100 ml) felvettük és vizet (25 ml), majd NaOH¹ot (5 g, 125 mmol) adtunk hozzá. Méréseink szerint a pH=10-nél magasabb volt. A reakciókeveréket 2 órán át szobahõmérsékleten kevertük, majd 5 N HCl hozzáadásával a pH¹t 1¹re savanyítottuk. A vizes fázist NaCl-dal telítettük és etil-acetáttal négyszer extraháltuk. A kombinált szerves fázist mostuk (sóoldat), szárítottuk (MgSO4) és vákuum alatt félig szilárd, fehér anyaggá koncentráltuk be. A szilárd anyagot 50 ml DCM-ben feloldottuk és 300 ml hexán hozzáadásával

fehér zagyot állítottunk elõ. Az oldószert vákuum alatt eltávolítva fehér színû szilárd disavhoz jutottunk (14,7 g, a két lépésre 91,5%¹os kitermelés). A disav (1 g, 3,29 mmol) 20 ml DMF-fel készült oldatához 5 N¹hidroxi-szukcinimidet (770 mg, 6,69 mmol), diizopropil-karbodiimidet (1,00 ml, 6,38 mmol) és 4¹dimetilamino-piridint (3 mg, 0,002 mmol) adtunk. A reakciókeveréket 12 órán át kevertük, és az oldószert vákuum alatt eltávolítottuk. A visszamaradt anyagot etil-acetát10 ban felvettük és a kicsapódott ureát szûréssel eltávolítottuk. A szerves fázist választótölcsérbe öntöttük, mostuk (telített NaHCO3, sóoldat, 0,5 N HCl, sóoldat), szárítottuk (MgSO4), szûrtük és vákuum alatt beszárítva, fehér szilárd anyag formájában megkaptuk a 15 di¹NHS-észter-terméket (1,12 g, 68%¹os kitermelés).

3. lépés – A trifunkcionális linker kapcsolása a peptidmonomerekhez: A linkerhez való kapcsolásnál, száraz DMF-ben 2 ekv. peptidet 1 ekv. trifunkcionális linkerrel összekeverve tiszta oldatot kaptunk, majd 2 perccel késõbb ehhez hozzáadtunk 5 ekv. DIEA¹t. A keveréket szobahõmérsékleten 14 órán át kevertük. Az oldószert vákuum alatt eltávolítottuk és a nyersterméket 80% TFA¹t tartalmazó DCM-ben 30 percig old-

va eltávolítottuk a Boc csoportot, majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A dimer szerkezetét elektroporlasztásos tömegspektrometriával ellenõriz30 tük. E kapcsolási reakció a linkert az egyes monomerek lizin aminosavai e¹amino-csoportjának nitrogénatomjához köti. A SEQ ID No. 1 számú szekvencia alkalmazásával végzett kapcsolást az alábbiakban mutatjuk be:

53

1

HU 005 558 T2

4. lépés – Lizin mPEG2-lizinol-NPC-vel összekapcsolt két lineáris PEG-láncot tartalmazó PEG-csoport szintézise: Kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ lizinolt feleslegben jelen lévõ mPEG2-NPC-vel kezelve MPEG2-lizinolt állítottunk elõ, amelyet azután NPC-vel reagáltatva mPEG2-lysinol-NPC-hez jutottunk. mPEG2~Lys-NHS Ez a termék kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ, például a Nektar Therapeutics (490 Discovery Drive, Huntsville, Alabama 35806) Molecular Engineering 2003¹as katalógusából megrendelve (tételszám: 2Z3X0T01).

2

5. lépés – A peptiddimer PEG-ezése: PEG-ezés a karbamátkötés révén: A peptiddimert és a PEG-féle20 séget (mPEG2-Lysinol-NPC) száraz DMF-ben 1:2 moláris arányban összekeverve tiszta oldathoz jutottunk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 4 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmérsékleten 14 órán át kevertük, majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítot25 tuk. A PEG-ezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk. A tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. Az mPEG-Lysinol-NPC-vel végzett PEG-ezést a SEQ ID No. 1 számú szekvenciával az alábbiakban 30 mutatjuk be.

54

1

HU 005 558 T2

PEG-ezés amidkötés révén A peptiddimert és a PEG-féleséget (mPEG2-LysNHS; Shearwater Corp, USA) száraz DMF-ben 1:2 moláris arányban összekeverve tiszta oldathoz jutottunk. A fenti oldathoz 5 perc elteltével 10 ekv. DIEA¹t adtunk. A keveréket szobahõmérsékleten 2 órán át kevertük,

6. lépés – Peptidek tisztítása ioncserével: Számos cserélõ hordozót vizsgáltunk meg arra nézve, hogy a kiindulási dimer peptid megtartása mellett, képesek¹e elválasztani a nem reagált (vagy hidrolizált) PEG¹t a fenti peptid-PEG konjugátumtól. Az ioncserélõ gyantát (2–3 g) 1 cm¹es oszlopba töltöttük, majd a nátriumformává (0,2 N NaOH¹ot töltöttünk az oszlopra addig, amíg az eluens pH¹ja 14 nem lett, körülbelül 5 oszloptérfogat) és azután hidrogénformává alakítottuk (elúció 0,1 N HCl-dal vagy 0,1 M HOAc-vel, amíg az eluens pH¹ja meg nem egyezett a betöltéskor mért pH¹val, körülbelül 5 oszloptérfogat), majd a gyantát 25%¹os ACN/víz eleggyel mostuk, amíg a pH=6 nem lett. A konjugáció elõtti peptidet vagy a peptid-PEG konjugátumot

5

2

majd C18 fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk. A PEGezett peptid szerkezetét MALDI tömeggel igazoltuk. A tisztított peptidet az alábbiakban körvonalazott kationcserélõ kromatográfiával is tisztítottuk. Az mPEG2-LysNHS-sel végzett PEG-ezést az alábbiakban, a SEQ ID No. 1 számú szekvencia alkalmazásával mutatjuk be.

25%¹os ACN/víz elegyben feloldottuk (10 mg/ml) és a pH¹t TFA-val 3¹nál alacsonyabb értékre állítottuk be, majd felvittük az oszlopra. Két-három oszloptérfogat 50 25%¹os ACN/víz eleggyel történt mosás és 5 ml¹es frakciók gyûjtése után, a peptidet 25%¹os ACN/víz elegyben oldott 0,1 M¹os NH4OAC-vel szabadítottuk fel az oszlopról ismét 5 ml¹es frakciókat gyûjtve. HPLC-vel végzett analízis megmutatta, hogy mely frakciók tartal55 mazták a kívánt peptidet. Elpárologtatással egybekötött fényszórásdetektorral (ELSD) végzett analízis jelezte, hogy amikor a peptid fennmaradt az oszlopon és az NH4OAC-oldattal eluálásra került (általában a 4. és 10. frakciók között), szennyezõdésként elõforduló nem kon60 jugált PEG¹t nem lehetett megfigyelni. Amikor a peptid a 55

1

HU 005 558 T2

kezdõ mosási pufferben (általában az elsõ 2 frakció) eluálódott, a kívánt PEG-konjugátum elválasztását és feleslegben lévõ PEG¹t nem észleltünk. Az alábbi oszlopok sikeresen visszatartották a peptidet és a peptid-PEG konjugátumot egyaránt visszatartották, és a peptid-PEG konjugátumot sikeresen megtisztították a nem konjugált peptidtõl. 5. táblázat Ioncserélõ gyanták Hordozó

Forrás

Mono S HR 5/5, elõre megtöltött, erõs kationcserélõ oszlop

Amersham Biosciences

SE53 Cellulose, mikroszemcsés, erõs kationcserélõ hordozó

Whatman

SP Sepharose Fast Flow, erõs kationcserélõ hordozó

Amersham Biosciences

2

10. példa: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) EPO¹R agonista 5 peptidmonomerek peptidhomodimerjeinek szintézise (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K aminosavszekvenciájú (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) EPO¹R agonista peptidmonomerek peptidhomodi10 merjeit az 1. példában leírtak szerint szintetizáltuk kivéve azt, hogy az 1. lépésben a szintetizált peptidek szekvenciája az alábbi volt: (AcG)GLYACHMGPIT(1¹nal)VCQPLR(MeG)K (a SEQ ID No. 2 számú szekvencia) 15 Ahol a PEG¹t karbamátkötéssel csatlakoztattuk a linkerhez, e szintézisnek a SEQ ID No. 2 számú szekvenciával képzett végterméke szerkezetileg az alábbiak szerint ábrázolható:

Ahol a PEG¹t karbamátkötéssel csatlakoztattuk a linkerhez, e szintézisnek a SEQ ID No. 2 számú szek-

35 venciával képzett végterméke szerkezetileg az alábbiak szerint ábrázolható:

11. példa: Aktivitásvizsgálatok in vitro E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vitro vizsgálatok vannak leírva. E vizsgálatok eredményei bemutatták, hogy a találmány szerinti új peptidek EPO¹R-hez kötõdnek és EPO¹R jelkibocsátást aktiválnak. Továbbá, e vizsgálatok eredményei rámutattak arra is, hogy az új peptidké-

szítmények EPO¹R¹t kötõ affinitása és biológiai hatása meglepõen magasabb, mint a korábban leírt, EPO¹t 55 utánzó peptideké. EPO¹R agonista peptidmonomereket és ¹dimereket állítottunk elõ az 1. példában vagy a 2. példában leírt eljárások szerint. E peptiddimerek potenciáját az alábbiakat tartalmazó in vitro aktivitásvizsgálatokkal érté60 keltük: riportervizsgálat, proliferációs vizsgálat, kompe56

1

HU 005 558 T2

titív kötési vizsgálat, és C/BFU vizsgálat. E négy vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk. Ezen in vitro aktivitási vizsgálatok eredményei 2. táblázatban vannak összefoglalva. 5 1. Riportervizsgálat Ez a vizsgálat egéreredetû pre-B-sejtvonalból származó, Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux riportersejten alapul. Ez a riportersejtvonal az emberi EPO-receptor extracelluláris részét az emberi GCSF-receptor intracelluláris részéhez kapcsolva tartalmazó kimérikus receptort expresszál. E sejtvonal még egy fos promoter által meghajtott, luciferáz riportergén-konstrukcióval is transzfektálva van. Ha e kimérikus receptort eritropoietikus ágens hozzáadásával aktiváljuk, akkor az aktiválás a luciferáz riportergén expresszióját eredményezi, és ennélfogva – a luciferáz szubsztrátumának, a luciferinnek hozzáadása esetén – fénykibocsátás történik. Eszerint ilyen sejtekben az EPO¹R aktivációjának szintje a luciferáz aktivitásának mérésével mennyiségileg meghatározható. A Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux sejteket 10%, újszülött borjúból származó szérummal [fetal bovine serum (FBS; Hyclone)], 10% WEHI¹3 felülúszóval (a WEHI¹3 sejtek tenyésztenék felülúszója, ATCC sz.: TIB¹68), és penicillin/streptomicinnel kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco) tenyésztettük. Körülbelül 18 órával a vizsgálat elõtt, a sejteket 10% FBS-sel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatba való átvitellel éheztettük. A vizsgálat napján a sejteket 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal egyszer mostuk, majd 1×106 sejt/ml sejtet ismert koncentrációjú tesztpeptid, vagy pozitív kontrollként szolgáló EPO (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) jelenlétében, 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban tenyésztettük. A tesztpeptidekbõl készült hígítási sorozatokat egymás után teszteltük e vizsgálatban. Vizsgálati lemezeket 37 °C¹on, 5% CO2-légkörben 4 órán át inkubáltuk, majd minden lyukhoz luciferint (Steady-Glo; Promega, Madison, WI) adtunk. Ötperces inkubálás után, Packard Topcount Luminometeren (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL.) fényemissziót mértünk. A kapott fényértékeket a tesztpeptid relatív koncentrációjának függvényében ábrázoltuk és Graph Pad szoftver alkalmazásával analizáltuk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC50-értéknek. 2. Proliferációs vizsgálat E vizsgálat emberi EPO¹R expresszálására transzfektált, egéreredetû Baf3 pre-B-sejtvonalon alapul. A transzfektálás eredményéül kapott BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejtvonal proliferációja EPO¹Raktiválástól függ. MTT alkalmazásával mennyiségileg meghatározzuk a sejtproliferáció mértékét. Az MTT vizsgálatban kapott jel az életképes sejtek számával arányos. A BaF3/Gal4/Elk/EPOR sejteket 10% FBS-sel (Hyclone) és 2% WEH1–3 felülúszóval (ATCC sz.:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 57

2

TIB¹68) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában tenyésztettük. A tenyésztett sejteket (1×106 sejt/ml) 12 órán át, 10% FBS-sel és 0,1% WEHI¹3 felülúszóval kiegészített DMEM/F12 tápoldatban (Gibco), forgatott flaskában éheztettük. Az éheztetett sejteket Dulbecco-féle PBS-sel (Gibco) kétszer mostuk, és 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldatban, 1×106 sejt/ml sûrûségû szuszpenzióként felszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióból 50 ml¹es mintákat (~50 000 sejt) 96 lyukú vizsgálati lemezekre, háromszoros ismétlésben kilemezeltünk. Tesztelni kívánt, EPO¹t utánzó peptidekbõl, 10% FBS-sel (WEHI¹3 felülúszó nélkül) kiegészített DMEM/F12 tápoldattal készült hígítási sorozatokat (50 ml) vagy EPO¹t (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) vagy Aranesp™¹et (a-darbepoietin, kereskedelmi forgalomban az Amgentõl beszerezhetõ EPO¹R-agonista) (50 ml) mértünk be a 96 lyukú vizsgálati lemezek lyukaiba (a lyukakban a végsõ térfogat 100 ml volt). Például 12 különféle hígítás tesztelhetõ, ahol a tesztpeptid (vagy a kontroll EPO peptid) végkoncentrációja 810 pM és 0,0045 pM közötti tartományba esik. A kilemezelt sejteket elõször 48 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd minden tenyészlemez lyukaiba bemértünk 10¹10 ml MTT¹t (Roche Diagnostics) és további 4 órán át inkubáltuk. A reakciót 10% SDS+0,01 N HCl hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket 12 órán át 37 °C¹on inkubáltuk, majd spektrofotométerrel 595 nm hullámhosszon megmértük minden lyuk abszorbanciáját. A leolvasott abszorbanciaértékek és a tesztpeptid-koncentráció közötti összefüggést grafikusan ábrázoltuk, és Graph Pad szoftver alkalmazásával EC50-értékeket számítottunk. A maximális fényemisszió felét eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük EC50-értéknek. 3. Kompetitív kötési vizsgálat A kompetitív kötési számításokat olyan vizsgálat alkalmazásával végeztük, amelyben az alábbi két gyöngy egymáshoz való közelségének következtében fényjel jön létre: biotinilált, EPO¹R¹t kötõ peptidtracert hordozó streptavidin donorgyöngy és EPO-r-hez kötött akceptorgyöngy. A fényt nem besugárzásos energiaátvitel hozza létre, amely energiaátvitel esetén megvilágításkor egy elsõ gyöngyrõl szinglet oxigén szabadul fel, és a felszabadult szinglet oxigénnel való érintkezés a második gyöngyben fényemissziót vált ki. E gyöngykészletek kereskedelmi forgalomban elérhetõk (Packard). A gyöngyök az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracer EPO¹R-hez való kötõdése révén kerülnek egymáshoz. Az EPO¹R¹t kötõ fehérjetracerrel az EPO¹R-hez való kötõdésben versengõ tesztpeptid megakadályozza e kötõdést, csökkentve ezzel a fényemissziót. Az eljárás részletesebben az alábbiak szerint zajlik: Az EPO¹R-agonista peptid, illetve a pozitív vagy negatív kontrollok hígítási sorozataiból mérjünk be 4 ml¹t egy 384 lyukú lemez lyukaiba. Azután ehhez lyukanként adjunk 2 ml receptor/gyöngy keveréket. A receptor/gyöngy keverék az alábbiakból áll: 15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú streptavidin donorgyöngyök (Packard),

1

HU 005 558 T2

2

15 ml, 5 mg/ml koncentrációjú ab179 monoklonális antidifferenciálódásra serkenti. E vizsgálat azt méri, hogy a test (ez az antitest ismeri fel a rekombináns EPO¹Rtesztpeptid milyen mértékben képes serkenteni a vöben lévõ, emberi placentából származó lúgos foszfarösvértest-prekurzorok proliferációját és differenciálótázt), protein A¹val bevont akceptorgyöngyök (protein dását primer emberi csontvelõbõl származó pluripoA fogja megkötni az ab179 antitestet; Packard), 5 tens õssejtekbõl. 112,5 ml, 1:6,6 arányban hígított rekombináns EPO¹R E vizsgálathoz 10% FBS-sel (Hyclone) kiegészített (az ab179 antitest által célbavett epitópot tartalmazó, IMDM tápoldatban (Gibco) a tesztpeptidbõl hígítási soemberi placentából származó lúgos foszfatázrészt tarrozatokat készítettünk. E hígítási sorozatokból, vagy potalmazó fúziós fehérjeként, kínai hörcsögben elõállítva) zitív kontrollként alkalmazott EPO-peptidbõl annyit adés 607,5 ml Alphaquest puffer (4 0 mM HEPES, 10 tunk metil-cellulózhoz, hogy a végtérfogat 1,5 ml lepH=7,4; 1 mM MgCl2; 0,1% BSA, 0,05% Tween 20). gyen. A metil-cellulóz és peptid keverékét gondosan Ütögetéssel összekeverni. Lyukanként adjunk 2 ml biovortexeltük. Emberi csontvelõbõl származó CD34+ sejttinilált EPO¹R¹t kötõ fehérjetracert (30 nM végkoncentmintákat (100 000 sejt/ml, Poietics/Cambrex) kiolvaszráció). A peptidtracer – egy EPO¹R¹t kötõ fehérje – elõtottunk. Egy 50 ml¹es csõben a kiolvasztott sejteket állítása az 1. példában leírtak szerint, a SEQ ID No. 15 óvatosan hozzáadtuk 0,1 ml, 1 mg/ml koncentrációjú 2 számú szekvencia alkalmazásával történik. DNÁz-hoz (Stem Cells). Ezután a sejtekhez óvatosan 40–50 ml IMDM tápoldatot adtunk: az elsõ 10 ml tápolPeptidnyomkövetõ datot cseppenként, az 50 ml¹es csõ fala mentén adagoltuk, majd a maradék térfogat tápoldatot lassan beleen20 gedtük a keverékbe a csõ oldala mentén. A sejteket 900 rpm-mel 20 percig centrifugáltuk, és a tápoldatot óvatosan leszívtuk. A sejteket 1 ml IMDM tápoldatban felszuszpendáltuk, és az 1 ml¹re esõ sejtsûrûséget hemocitométerlemezen meghatároztuk (a sejtszuszpen25 zióból 10 ml minta a lemezre; sejtsûrûség=átlagos sejtEgyperces centrifugálással összekeverni. A lemezt szám×10 000 sejt/ml). A sejteket IMDM tápoldatban szigeteljük le Packard Top Seallel és csavarjuk be fó15 000 sejt/ml sejtsûrûségre hígítottuk. A hígított sejtekliába. Inkubáljuk szobahõmérsékleten 12 órán át. Tibõl 100 ml¹t adtunk az egyes metil-cellulóz-peptidminta zennyolc óra elteltével AlphaQuest leolvasóberendekeverékekhez (a vizsgálati tápoldatban a végsõ sejtkonzés (Packard) alkalmazásával olvassuk le a fény- 30 centráció 1000 sejt/ml volt), és a keveréket vortexeltük. emissziót. Ábrázoljuk a fényemissziót a fehérjekonMiután a keverékbõl eltûntek a buborékok, tompa végû centráció függvényében és analizáljuk Graph Pad vagy tû alkalmazásával leszívtunk 1 ml¹t. Az egyes mintákból Excel programmal. leszívott keverékekbõl 0,25 ml¹t bemértünk egy 24 lyuA fényemisszióban, a tesztpeptid nélkül megfigyelt kú lemez (Falcon brand) 4¹4 lyukába. A kilemezelt kefényemisszióhoz viszonyítva 50%¹os csökkenést ered- 35 verékeket 37 °C¹on, 5% CO2-atmoszférában, párásított ményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintjük IC50-érinkubátorban 14 napig inkubáltuk. Fázismikroszkóppal téknek. (5×–10×objektív, 100×végsõ nagyítás) osztályoztuk az eritroidtelepek jelenlétét. Az EPO¹ra pozitív kontrollnál 4. C/BFU¹e vizsgálat megfigyelt maximális számú kialakult telep 90%¹át Az EPO¹R jelképzés a csontvelõ-eredetû õssejte- 40 eredményezõ tesztpeptid-koncentrációt tekintettük ket proliferálódó vörösvértest-prekurzorokká történõ EC90-értéknek (lásd 2. táblázat: C/BFU¹e EC90). 6. táblázat Peptiddimerek aktivitásának vizsgálata in vitro A vegyület elnevezése

Peptiddimer

Riporter EC50 (pM)

Proliferációs EC50 (pM)

IC50 (pM)

C/BFU¹e EC90 (nM)

195

165

111

3

I. peptid (SEQ ID NO: 1)

58

1

HU 005 558 T2

12. példa: Aktivitásvizsgálatok in vivo E példában a találmány szerinti EPO¹R-agonista peptidek aktivitásának és potenciájának értékelésére alkalmazható különféle in vivo vizsgálatok vannak leírva. EPO¹R-agonista peptidmonomereket és ¹dimereket állítottunk elõ az 1. példában leírt eljárások szerint. E peptidmonomerek és ¹dimerek in vivo aktivitását vizsgálati sorozatokban, így policitémiás exhipoxiás egéren alapuló biológiai vizsgálatban és retikulocitavizsgálatban, értékeltük. E két vizsgálatot az alábbiakban részletesen leírjuk. 1. Policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálat A tesztpeptidek in vivo aktivitását a Cotes és Bangham által leírt [Cotes és Bangham, Nature 191, 1065–1067 (1961)] eljárásból adaptált, policitémiás exhipoxiás egereken végzett biológiai vizsgálatban elemeztük. E vizsgálat egy adott tesztpeptid EPO-utánzó képességét vizsgálja: azaz az EPO¹R-aktiváló és új vörösvértest-szintézist indukáló képességet. A vörösvértestek szintézisének mennyiségi meghatározása radioaktivitással jelzett vas újonnan szintetizált vörösvértestekbe való beépülésén alapul. BFD1 egereket 7–10 napig hagytuk a környezethez akklimatizálódni. Minden állatnak lemértük a testsúlyát, és az alacsony súlyú állatokat (<15 gramm) nem alkalmaztuk. Alacsonynyomású kamrában, az egereket egymást követõ kondicionáló ciklusoknak vetettünk alá összesen 14 napon át. Az egyes 24 órás ciklusok 18 órás 0,40±0,02% atmoszférás nyomásból és 6 órán át tartó környezeti nyomásból álltak. Kondicionálás után, a dozírozást megelõzõen az egereket további 72 órán át környezeti nyomáson tartottuk. Tesztpeptideket vagy rekombináns, emberi EPO standardokat 0,1% BSA¹t tartalmazó PBS-ben (PBS/BSA) hígítottunk. A peptidmonomerekbõl készült törzsoldatokat elõször dimetil-szulfoxidban (DMSO) szolubilizáltuk. Negatív kontrollcsoportok egy önmagában PBS/BSA-val injektált csoportból és egy 1%¹os DMSOval injektált csoportból álltak. Minden dóziscsoport 10 egérbõl állt. Az egereket szubkután (a tarkó bõrén át) injektáltuk a megfelelõ minta 0,5 ml¹ével. A minta injektálása után 48 órával, az egereknek 0,2 ml Fe59¹et (Dupont, NEN) adtunk be intraperitoneálisan, egerenként körülbelül 0,75 mCi dózisban. Az Fe59 beadása után 24 órával meghatároztuk az egerek testsúlyát, és az Fe59 beadása után 48 órával az egereket elöltük. Minden állatból szívpunktúrával vért gyûjtöttünk és hematokriteket mértünk (antikoagulánsként heparint alkalmaztunk). Minden vérmintát (0,2 ml) Fe59beépülésre analizáltunk Packard gammaszámláló alkalmazásával. Nem reagáló egereket (azaz a negatív kontrollhoz képest alacsonyabb mértékû radioaktivitásbeépüléses egerek) töröltük a megfelelõ adathalmazból. Azokat az egereket is töröltük, amelyeknél a negatív csoportban mért értékek 53%¹át meg nem haladó hematokritértékeket mértünk.

2

Minden kísérleti dózisra vonatkozó eredmények 10 állatból származnak. Minden csoportra kiszámoltuk a vérbe beépült radioaktivitás átlagos mennyiségét [szám/perc (CPM)]. 5 2. Retikulocitavizsgálat Normális BDF1 egereket három egymást követõ napon át kontroll EPO-val vagy tesztpeptiddel dozíroztunk (0,5 ml, szubkután injektálva). A harmadik napon 10 az egereket vasdextránnal (100 mg/ml) is dozíroztuk (0,1 ml, intraperitoneálisan). Az ötödik napon az egereket CO2-dal elaltattuk és szívpunktúrával elvéreztettük. A vérmintákban lévõ retikulociták százalékos arányát tiazolnarancs-festéssel és áramlási citometriás analí15 zissel (retic-count program) határoztuk meg. A hematokritértékeket manuálisan határoztuk meg. A korrigált retikulocitaszázalékot az alábbi képlet alkalmazásával határoztuk meg: % RETICKORRIGÁLT=% RETICMEGFIGYELT× (HematokritEGYEDI/HematokritNORMÁL) 20

25

30

35

40

45

50

55

60 59

3. Hematológiai vizsgálat Normális CDI egereket pozitív kontrollként EPOval, illetve tesztpeptiddel vagy hordozóval négy héten át, hetente egyszer intravénás injekcióval dozíroztunk. Egy sorozat pozitív kontroll vagy tesztpeptiddózist (mg/kg-ként megadva) teszteltünk az aktív vegyület koncentrációjának változtatásával a készítményben. Az injektált térfogat 5 ml/kg volt. A hordozóval injektált csoport 12 állatból, a további dóziscsoportok mindegyike 8 állatból állt. A napi életképességet és heti testsúlyokat feljegyeztük. A dozírozott egereket éheztettük, majd izofluránbelélegeztetéssel elaltattuk és szívpunktúrával vagy abdominális aorta punktúrájával vérmintát gyûjtöttünk az 1. napon (hordozóval kezelt kontrollegerek) és a 15., illetve 29. napokon (4 egér/csoport/nap). A vért Vacutainer® csövekbe transzferáltuk. Elõnyös antikoaguláns az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA). A vérmintákat végpontokra nézve a vörösvérszintézisre és fiziológiára – így hematokrit (Hct), hemoglobin (Hgb) és össz-eritrocitaszám (RBC) – nézve értékeltünk a technikában jól ismert automata klinikai analizátorok (például a Coulter, Inc. által gyártott analizátorok) alkalmazásával. A találmány nem korlátozódik az itt leírt specifikus megvalósítási módok által behatárolt oltalmi körre. Hanem, az itt leírtak mellett, a találmány különféle módosításai a szakember számára egyértelmûek a fenti leírás és a csatolt ábrák alapján. Az ilyen módosítások is a mellékelt szabadalmi igénypontok oltalmi körébe tartoznak. Továbbá az is egyértelmû, hogy minden megadott érték hozzávetõleges, és a leírás céljait szolgálja. A találmány leírásában számos hivatkozásra – így szabadalmakra, szabadalmi iratokra és különféle közleményekre – hivatkozunk. Az ilyen hivatkozások és/vagy azok tárgyalása pusztán csak a találmány leírásának tisztázását szolgálják, és nem jelentik annak elismerését, hogy ezen hivatkozások bármelyike a találmányt megelõzõen létezett volna.

1

HU 005 558 T2

2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

5

ahol (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) [„PEG”] legalább egy lineáris polietilélglikol-csoportot (PEG-csoportot) tartalmaz, ahol minden PEGcsoport molekulasúlya körülbelül 20 000 daltontól körülbelül 40 000 daltonig terjed. 30 2. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

ahol: (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin és az MeG jelentése N¹metil-glicin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) a PEG lineáris, el nem ágazó, körülbelül 20 000 daltontól körülbelül 40 000 daltonig terjedõ mo55 lekulasúlyú polietilénglikol-molekulát tartalmaz. 3. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert: 60

60

1

HU 005 558 T2

2

ahol: (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) a PEG lineáris, el nem ágazó, körülbelül 20 000 daltontól körülbelül 40 000 daltonig terjedõ molekulasúlyú polietilénglikol-molekulát tartalmaz. 25 4. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

ahol: (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin és az MeG jelentése N¹metil-glicin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) a PEG lineáris, el nem ágazó, körülbelül 20 000 daltontól körülbelül 40 000 daltonig terjedõ mo55 lekulasúlyú polietilénglikol-molekulát tartalmaz. 5. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert: 60

61

1

HU 005 558 T2

2

ahol (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) [„PEG”] legalább két, egyetlen kapcsolódási helyen csatlakozó, lineáris polietilénglikol (PEG)-csoportot tartalmaz, amelyek kombinált molekulasúlya kö20 rülbelül 10 000 daltontól körülbelül 60 000 daltonig terjed. 6. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

ahol: (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin és az MeG jelentése N¹metil-glicin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

40

(iii) a PEG két lineáris polietilénglikol (PEG)-csoportot tartalmaz, amelyek kombinált molekulasúlya körülbelül 10 000 daltontól körülbelül 30 000 daltonig terjed. 7. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt 45 aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

62

1

HU 005 558 T2

ahol (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

5

2

(iii) a PEG két lineáris polietilénglikol (PEG)-csoportot tartalmaz, amelyek kombinált molekulasúlya körülbelül 10 000 daltontól körülbelül 30 000 daltonig terjed. 8. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

ahol (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) a PEG lineáris, el nem ágazó, körülbelül 20 000 daltontól körülbelül 40 000 daltonig terjedõ molekulasúlyú polietilénglikol (PEG)-csoportot tartal30 maz. 9. Eritropoietin-receptorhoz (EPO¹R) kötõdõ és azt aktiváló vegyület, amely tartalmazza az alábbi képletû peptiddimert:

ahol (i) a peptiddimer mindkét peptidmonomerjében minden aminosav standard egybetûs rövidítéssel van jelezve, AcG jelentése N¹acetil-glicin, és az 1¹nal jelentése 1¹naftil-alanin; (ii) a peptiddimer mindkét peptidmonomerje intramolekuláris diszulfidkötést tartalmaz az egyes monomerek két-két cisztein aminosava (C) között;

(iii) a PEG két lineáris polietilénglikol (PEG)-csoportot tartalmaz, amelyek kombinált molekulasúlya körülbelül 10 000 daltontól körülbelül 60 000 daltonig terjed. 55 10. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben a PEG vagy minden PEG molekulasúlya körülbelül 30 000 dalton. 11. Az 5–7. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben a PEG vagy minden PEG molekulasúlya 60 körülbelül 20 000 dalton. 63

1

HU 005 558 T2

12. Az 1–4. és 8. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben a PEG vagy minden PEG molekulasúlya körülbelül 30 000–40 000 kD. 13. Bármely megelõzõ igénypont szerinti vegyület alkalmazása rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, azzal jellemezve, hogy a rendellenesség eritropoietin-hiánnyal vagy alacsony vagy fogyatékos vörösvértest-populációval jellemezhetõ. 14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rendellenesség a következõ csoportból választott: vég-

2

stádiumú veseelégtelenség vagy dialízis, AIDS-szel járó anémia, autoimmun betegség vagy malignancia, béta-talasszémia, cisztás fibrózis, koraéréses korai anémia, krónikus gyulladásos betegséggel járó ané5 mia, gerincvelõ-sérülés, akut vérveszteség, korosodás és abnormális eritropoiézissel járó neoplasztikus betegségi állapot. 15. Az 1–12. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartal10 mazó gyógyászati készítmény.

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest