!HU000008252T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 252
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 727750 (22) A bejelentés napja: 2003. 05. 19. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030727750 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1506222 A1 2003. 11. 27. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1506222 B1 2009. 03. 04.
(51) Int. Cl.: C07K 14/025 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03097673 PCT/IB 03/001912
(30) Elsõbbségi adatok: 200203957 2002. 05. 17.
(73) Jogosult: University of Cape Town, Cape Town (ZA)
ZA
(72) Feltalálók: VARSANI, Arvind, Devshi, 7925 Cape Town (ZA); RYBICKI, Edward, Peter, 7405 Cape Town (ZA)
HU 008 252 T2
(54)
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
L2 peptidet tartalmazó kiméra humán papillómavírus L1 fehérjék, a fehérjékbõl elõállított vírusszerû részecskék és eljárás a részecskék elõállítására
A leírás terjedelme 38 oldal (ezen belül 16 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 252 T2
A találmány háttere A találmány tárgya eljárás polipeptidek elõállítására, különösen humán papillómavírus vírusszerû részecskék („virus-like particle”, VLP) vagy kapszomerek elõállítására. A papillómavírusok a kis DNS-vírusok egy csoportját alkotják, amelyek kinövéseket és egyéb sérüléseket váltanak ki számos magasabb rendû gerincesben, ideértve az embereket. A papillómavírusok (PV) a Papillomavirus nemzetség, a Papillomaviridae család tagjai és kettõs szálú cirkuláris DNS-genomot tartalmaznak, amelynek a jellemzõ mérete 7900 bázispár (Seedorf és munkatársai, 1985). Az összes PV¹nek hasonló genomikus elrendezõdése van, ahol egy korai génszakasz kódolja a DNSreplikációban és a sejtes transzformációban érintett fehérjéket, és egy késõi szakasz kódolja a virális kapszid fehérjéket (1. ábra). Egy nem kódoló szakasz, amely hosszú szabályozószakaszként ismert („long control region”, LCR) tartalmazza a transzkripció és replikáció szabályozási elemeit. A papillómavírusok két virális struktúrfehérjét kódolnak az L1¹et és az L2¹t. A virion 360 L1 molekulát tartalmaz, amelyek 72 kapszomerbe rendezõdnek, amelyek mindegyike öt L1 molekulából álló pentamer (Baker és munkatársai, 1991). Az L1 és L2 molekulák aránya becslések szerint körülbelül 30:1 (Doobar és munkatársai, 1987), amely azt sugallja, hogy minden egyes virion körülbelül 12 L2 molekulát tartalmazhat. A virionokban lévõ nagyobb L1 molekulaszám vezetett ahhoz, hogy az L1¹et nevezik a „fõ” kapszid fehérjének és az L2¹t nevezik a „mellék” kapszid fehérjének. A HPV–16 L1 molekulát egy 1518 kb hosszúságú gén kódolja, amely 504 aminosavas fehérjét eredményez. Az L1 molekulatömege 55–58 kD (Browne és munkatársai, 1988). Az L1 doménjei valószínûleg elõsegítik a sejt kötõdést és tartalmaznak antigén tulajdonságú részeket, amelyek befolyásolják a vírusra adott antitest- és immunrendszeri válaszokat. A genitális humán papillómavírusok között (HPV) vannak alacsony kockázatú HPV¹k (például HPV 6 és HPV 11), amelyek genitális kinövéseket és méhnyaki sérüléseket okoznak, amelyek általában visszahúzódnak vagy nem fejlõdnek malignus irányba, és vannak nagy kockázatú (vagy onkogenikus) genotípusok (például HPV 16 és HPV 18), amelyek nagy fokozatú méhnyaki sérülésekkel és karcinómákkal hozhatóak kapcsolatba. A HPV-krõl ismertették, hogy etiológiai ágensek számos egyéb anogenitális és felsõ aerodigestiv szakasz rákjaiban (Breitburd és munkatársai, 1999). Jelentõs mennyiségû klinikai, molekuláris, kísérletes és epidemológiai bizonyíték alapján egyes HPV típusok tekinthetõek a méhnyakrák fõ okozóinak (Lowy és munkatársai, 1994; IARC, 1995). A HPV 16 a méhnyakrák esetek legnagyobb részében jelen van és további három típus (HPV 18, 31 és 45) van jelen körülbelül 30% további esetben (IARC, 1999). Habár a méhnyakrák incidenciája csökken az Amerikai Egyesül Államokban, mégis ez a leggyakoribb ma-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
lignancia nõknél a fejlõdõ országokban, évente körülbelül 500 000 újonnan diagnosztizált esettel. Tradicionálisan a legtöbb megelõzõ vakcina élõ csillapított vírusból vagy formalinnal inaktivált vírusból állt. A papillómavírus-virionok nagyon immunogének, amelyek nagy titerben (>10 000) indukálnak semlegesítõ antitesteket, ha szisztémásan vannak inokulálva (Doretzky és munkatársai, 1980; Kirnbauer és munkatársai‚ 1991, 1992). Azonban ezen tradicionális vakcinák nagy mennyiségeinek elõállításához kapcsolódó nehézségek és kockázatok miatt nagy hangsúlyt fektettek virális fehérjealegység vagy vírusszerû részecske (VLP) oltóanyagok kifejlesztésére. A HPV elleni profilaktikus oltóanyag legjobb jelöltfehérjéje az L1 fõ kapszidfehérje, amely önállóan összeáll VLP-kké (Schiller és Lowy, 2001). Ezek a VLP¹k nagyon jól jellemzettek, és morfológiailag megkülönböztethetetleneknek tûnnek a teljes virionoktól (Chen és munkatársai, 2001; Rose et al., 1993). A kísérleti állatokba történõ VLP injekciósemlegesítõ antitesteket indukál (Rose és munkatársai, 1998); Az injekciózott VLP oltóanyagok elsõdleges humán próbái szintén azt mutatták, hogy ezek jól tolerált és erõsen immunogén természetûek, és az elõbbi esetben robusztus B¹ és T¹sejt-válaszokat váltott ki (Evans és munkatársai, 2001; Harro és munkatársai, 2001). A mukotropikus HPV¹k onkogenikus típusai elleni hatásos, olcsó megelõzõ oltóanyagoknak potenciálisan hatásuk lehet a világ rákterhelésére, különösen a HPV 16¹tal szemben. A 6 és 16 típusú HPV¹k egy gyakori semlegesítõ epitópját találták meg a HPV 16 L2 mellék kapszidfehérje 108–120 (as) szakaszában (Kawana és munkatársai, 1998, 1999). Azok a Balb/c egerek, amelyek nazálisan voltak immunizálva szintetikus peptiddel, amely megfelelt az epitópnak, olyan immunválaszt váltott ki, amely a HPV 6, 16 és 18 L1/L2 kapsziddal keresztreagáló lgA és lgG antitesteket eredményezett (Kawana és munkatársai, 2001). Nyulak immunizálása a nyúl orális papillómavírus („Rabbit oral papillomavirus”, ROPV vagy „Cottontail rabbit papillomavirus” CRPV) 94–122 L2 szekvenciaszakaszából származó két átfedõ peptidek valamelyikével olyan szérumot eredményezett, amely reagált tisztított, kognát L2¹vel, különösen felismerte az L2¹t fertõzött sejtekben, és in vitro semlegesítette a vírust. A CRPV peptidekkel immunizált nyulak immunisak voltak a CRPV-tesztben (Embers és munkatársai, 2002). A feltalálók, tehát úgy döntöttek, hogy tovább vizsgálják ezen L2 epitóp bemutatását kiméra L1 VLP¹t önmagában alkalmazva oltóanyagként, és a további immunogén peptidszekvenciák bemutatásának modelljeként. Kapcsolódó szakterületen Müller és munkatársai [1997, Virology, 234(1), 93–111. old] szintén ismertet kiméra HPV 16 L1 fehérjéket, amelyekbe HPV–16 E7 szekvencia van inszertálva vagy C¹terminális vagy középsõ pozícióban. Továbbá Slupetzlay és munkatársai (2001, J. Gen. Virol., 82, 2799–2804. oldal) olyan kiméra
1
HU 008 252 T2
HPV–16 L1 fehérjéket ismertet, amelyek különbözõ kapszidfelszíni hurkokba inszertált HlV–1 gp 41 törzs 8 aminosavas B¹sejt peptid LELDKWAS epitópját tartalmazzák. 5 A találmány összefoglalása A találmány elsõ megvalósítási módja szerint a találmány tárgya eljárás humán papillómavírus (HPV) L2 peptidet tartalmazó kiméra HPV L1 polipeptid elõállítására, amely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: az L2 peptidet kódoló DNS-szekvencia bevitele az L1 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciába; az L1 polipeptidet és L2 peptidet kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-szekvencia bevitele olyan gazdasejtbe, amelyben a DNS-szekvencia expresszálható; a DNS-szekvencia expresszáltatása; és az eredményül kapott, L2 peptidet tartalmazó, kiméra L1 polipeptid kinyerése. A HPV L1 polipeptid és/vagy HPV L2 peptid lehet HPV–16 polipeptid vagy peptid. A HPV L2 peptid aminosavszekvenciája lehet a következõ: LVEETSFlDAGAP (SEQ ID NO: 1), vagy olyan szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat- vagy származékszekvencia legalább 80%¹os homológiát mutat az 1. azonosító számú szekvenciával és olyan peptidet kódol, amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. Az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve lehet az L2 DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és jellemzõen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált L2 nukleotidok számának. A fehérje expresszáltatása történhet prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerben. Az ismertetett eljárás céljaira a kiméra polipeptid szekvenciája lehet a 6., 8., 10., 12. és 14. ábrák bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13), vagy olyan szekvencia, amely legalább 80%-ban homológ a SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13 szekvenciák bármelyikével, és amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. Hasonló módon az eljárásban a kiméra polipeptidet kódoló DNS-szekvencia lehet az 5., 7., 9., 11. és 13. ábra bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12), vagy olyan szekvencia, amely legalább 80%-ban homológ ezen szekvenciák bármelyikével, és amely olyan polipeptidet kódol, amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. A kiméra L1 polipeptid összeállhat vírusszerû részecskékké és/vagy kapszomerekké. A vírusszerû részecske vagy kapszomer lehet immunogén. A találmány második megvalósítási módja szerint a találmány tárgya kiméra HPV L1 DNS-szekvencia, amelybe a fenti HPV L2 peptidet (SEQ ID NO:1) kódoló DNS-szekvencia lett inszertálva, ahol az eredményül kapott HPV L1 szekvencia HPV L2 peptid expressziójára képes.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
Az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve lehet az L2 DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és jellemzõen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált L2 nukleotidok számának. A kiméra nukleinsavszekvencia lehet az 5., 7., 9., 11. és 13. ábrák bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12), vagy olyan DNS-szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat vagy származék DNS-szekvencia legalább 80% homológiát mutat a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12 azonosító számú szekvenciák bármelyikével, és amely HPV L2 peptidet bemutató kiméra L1 peptidet kódol, ahol a kiméra L1 peptid képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. A találmány harmadik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya vektor, amely fent ismertetett nukleinsavszekvenciát tartalmaz. A találmány negyedik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya gazdasejt, amely fent ismertetett vektort tartalmaz. A találmány egy még további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya kiméra HPV L1 polipeptid, amely tartalmazza a fenti HPV L2 peptidet (SEQ ID NO: 1). A kiméra polipeptid lehet kiméra HPV L1 vírusszerû részecske vagy kapszomer. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya HPV polipeptid, amelynek aminosavszekvenciája a 6., 8., 10., 12. és 14. ábra bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13), vagy olyan szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat- vagy származék-aminosavszekvencia legalább 80% homológiát mutat a SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13 azonosító számú szekvenciák bármelyikével, és amely HPV L2 peptidet bemutató kiméra L1 peptid, ahol a kiméra L1 peptid képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya eljárás heterológ peptidet tartalmazó kiméra humán papillómavírus (HPV) L1 polipeptid elõállítására, ahol az eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvencia bevitele az L1 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciába a 241–279., 391–429., 520–558., 1240–1278. vagy 1291–1329. nukleotidpozícióknak a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciára történõ kicserélésével; az L1 polipeptidet és a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-szekvencia bevitele olyan gazdasejtbe, amelyben a DNS-szekvencia expresszálható; a DNS-szekvencia expresszáltatása; és az eredményül kapott, heterológ peptidet tartalmazó kiméra L1 polipeptid kinyerése. A heterológ peptidszekvencia lehet bármilyen egyéb HPV-szekvencia vagy bármilyen B¹sejt- vagy T¹sejt-specifikus antigénepitópból származó.
1
HU 008 252 T2
Az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve lehet a heterológ DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és jellemzõen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált heterológ nukleotidok számának. A találmány egy még további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya oltóanyag, amely a kiméra HPV L1 polipeptidet vagy a polipeptidet kódoló DNSszekvenciát tartalmaz lényegében a fent ismertetett módon. Az oltóanyag alkalmazható HPV-fertõzés megelõzõ vagy terápiás kezelésében, különösen HPV 6, 16 vagy 18 kezelésében. Elõnyösen az oltóanyag, amely képes HPV és/vagy a bejuttatott peptid elleni immunogén válasz kiváltására megfelelõ gazdában. Az oltóanyag továbbá gyógyszerészeti excipienst és/vagy adjuvánst is tartalmazhat. Az ábrák ismertetése Az 1. ábra a HPV 16 genomi szervezõdését diagramszerûen mutatja. A 2. ábra a HPV 16 L1 monomer szerkezetét mutatja. A 3. ábra mutatja a natív szekvenciájú HPV 16 L1 gén nukleotidszekvenciáját, amelybe inszertálva volt az L2 epitóp az 5–14. ábrák kimérakonstrukcióinak elõállítására (SEQ ID NO: 2). A 4. ábra mutatja a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciát (SEQ ID NO: 3). Az 5. ábra mutatja az A kimérakonstrukció nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 4). A 6. ábra mutatja az A kimérakonstrukció aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 5). A 7. ábra mutatja a C kimérakonstrukció nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 6). A 8. ábra mutatja a C kimérakonstrukció aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 7). A 9. ábra mutatja az E kimérakonstrukció nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 8). A 10. ábra mutatja az E kimérakonstrukció aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 9). A 11. ábra mutatja az F kimérakonstrukció nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 10). A 12. ábra mutatja az F kimérakonstrukció aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 11). A 13. ábra mutatja a H kimérakonstrukció nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 12). A 14. ábra mutatja a H kimérakonstrukció aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 13). A 15. ábra diagramszerûen mutatja az A kimérakonstrukciót. A 16. ábra diagramszerûen mutatja a C kimérakonstrukciót. A 17. ábra diagramszerûen mutatja az E kimérakonstrukciót. A 18. ábra diagramszerûen mutatja az F kimérakonstrukciót. A 19. ábra diagramszerûen mutatja a H kimérakonstrukciót.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
A 20. ábra az A konstrukcióból eredõ kiméra VLPkkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 21. ábra a C konstrukcióból eredõ kiméra VLPkkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 22. ábra az E konstrukcióból eredõ kiméra VLPkkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 23. ábra az F konstrukcióból eredõ kiméra VLPkkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 24. ábra a H konstrukcióból eredõ kiméra VLPkkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 25. ábra nem kiméra HPV 16 L1 (SA-opt) eredetû VLP-kkel inokulált egerek végpont titrálásaiból kapott adatokat mutatja. A 26. ábra mutatja az egerek válaszát a kezdeti immunizálást követõ fokozásra. A 27. ábra mutatja az L1 szekvenciába inszertált L2 peptid nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO: 14). A 28. ábra mutatja az L1 szekvenciába inszertált L2 peptid aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO: 14). A találmány egy megvalósítási módjának részletes ismertetése A kimérakonstrukciók tervezése A peptidet kódoló primereket szintetizáltunk: LVEETSFlDAGAP (SEQ ID NO: 1) amely egy gyakori semlegesítõ epitóp a HPV 6¹ra és 16¹ra az L2 HPV mellék kapszid fehérje 108–120. aminosav szakaszában. A HPV 16 L1 monomer szerkezete szerint, amelyet Chen és munkatársai közöltek (2000) (2. ábra), különbözõ felszíni hurkok és szakaszok jelennek meg, ha kialakulnak pentamerek és magasrendû szerkezetek. A V5 antitest (L1 elleni semlegesítõ antitest) epitóptérképezésén alapulva különbözõ szakaszokat/hurkokat választottunk ki az L2 peptid inszerciójához, hogy fenntartsuk az L1 VLP¹k V5 antitestkötõ szakaszát. Az L1 molekula fõ antigén szakaszát (V5 kötõszakasz) térképeztük az A266, (ahol az F50 a V271 felszíni aminosav alatt helyezkedik el) és az S282 (Roden és munkatársai, 1996, White és munkatársai, 1999) aminosavakkal. Ezen aminosavakon alapulva a feltalálók úgy döntöttek, hogy nem változtatják meg a molekulabeli B¹hurkot, mivel ez megváltoztatná az antigénszakaszt és lehetséges, hogy eltûntetne fontos L1 epitópokat. A következõ L1 szakaszokat választottuk ki az L2 peptid inszerciójára: A: E–F hurok (SEQ ID NO: 4 és 5), C: D–E hurok (SEQ ID NO: 6 és 7), E: a h4 hélix és az L1 J szakasza közötti szakasz (SEQ ID NO: 8 és 9), F: h4 hélix (SEQ ID NO: 10 és 11), H: belsõ C–D hurok (SEQ ID NO: 12 és 13).
1
HU 008 252 T2
Kimérakonstrukciók szintézise Kimérakonstrukciókat állítottunk elõ PCR alkalmazásával, ahol a primereket az L2 peptidet kódoló 3’¹véggel terveztük. A pSK plazmid vektorba klónozott HPV 16 SA¹opt L1 gént (3. és 4. ábrák) alkalmaztuk 5 templátként. A következõ DNS-szekvenciát alkalmaztuk az L2 peptid kódolására: 5 ’ - T T A G T G G A A G A A A C T A G T T T T A T T G A TGCTGGTGCACCA¹3’ (SEQ ID NO: 14). Az L2 peptidet a génbe úgy inszertáltuk, hogy he- 10 lyettesítettük az 1. táblázatban bemutatott szakaszokat. Ez a létezõ nukleotidok cseréjén alapuló eljárás az L2 nukleotidok L1 szekvenciába történõ egyszerû mindenféle helyettesítés nélküli inszertálásával szemben,
2
elõnyös abban a tekintetben, hogy a harmadlagos szerkezet zavarai minimális szinten maradnak, és a közeli szekvenciákhoz történõ antitest kötõdés az extra peptid „hurkok” következtében fellépõ szterikus hatásainak és interferenciájának lehetõsége minimalizálódik. Az inszertált L2 epitóp helyzetét adtuk meg a kimérakonstrukciókra rendre a 15–19. ábrákon. A szekvenált pSK-konstrukciók kiméra génjeit pFastbac1 vektorba (Sal I/Xba I hely) klónoztuk. A pFastbac1 klónokból származó DNS¹t alkalmaztuk DH10bac sejtek transzfekciójára bacmid klónok elõállítására. A kimérakonstrukciókat rovarsejtekben expresszáltattuk a Bac-to-Bac® baculovírus expressziós rendszer (Life Technologies) alkalmazásával.
1. táblázat Az L2 peptid inszerciója Kimérakonstrukció
Az L2 peptid nukleotidpozíciója
A
520–558
5(4)
174–186
6(5)
C
391–429
7(6)
131–143
8(7)
E
1291–1329
9(8)
431–443
10(9)
F
1240–1278
11(10)
414–426
12(11)
H
241–279
13(12)
81–93
14(13)
Bemutató ábra száma (SEQ ID NO)
A bacmid DNS¹t sf21 (Spodoptera frugiperda) rovarsejtekbe transzfektáltuk cellfectin alkalmazásával. Az alap Bac-to-Bac® protokollt követtük a rekombináns vírus sokszorosítására és az sf21 rovarsejtek infekciójára a kiméra VLP¹k expressziójához. Alap HPV 16 L1 VLP tisztítási protokollt követtünk. A megfertõzött rovarsejteket lepörgettük 3000 ford./perc alkalmazásával és foszfáttal pufferezett sóoldatban („phosphate buffered saline”, PBS) szuszpendáltuk újra 0,5 M NaCl-dal. A szuszpenziót 5 másodperces idõközönként négyszer szonikáltuk. Ezt követõen 40%¹os szacharózpárnára rétegeztük és pelletáltuk 100 000 g alkalmazásával 3 óra ideig. A pelletet újraszuszpendáltuk CsCl-pufferben (PBS 0,4 g/ml CsCl-dal) és újraszuszpendáltuk 18¹as és 26¹os tûk alkalmazásával történõ felszívással, hogy csökkenjen a szonikálás elõtti viszkozitás (5 másodperces idõközönként négyszer). A szuszpenziót 100 000 g alkalmazásával 10 °C hõmérsékleten 24 órát centrifugáltuk. A CsCl-gradiensekben nem figyeltünk meg elkülönülõ sávokat. 500 ml¹es frakciókat gyûjtöttünk be és
30
Az L2 peptid aminosavpozíciója
Bemutató ábra száma (SEQ ID NO)
elemeztük õket ELlSA alkalmazásával konformáció specifikus V5 és D9 (lineáris epitóp) monoklonális antitestek alkalmazásával. Azokat a frakciókat, amelyekrõl azt találtuk, hogy reagálnak a V5 és/vagy D9 antitestekkel összegyûjtöttük és PBS-sel szemben dializáltuk 4 °C hõmérsékleten, éjszakán át.
35
40
45
Eredmények Western-blotok azt mutatták, hogy nyulakban a peptid ellen termeltetett poliklonális L2 antitest (Dr. Neil Christensentõl beszerezve, The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) hozzákötõdött a kiméra L1 részecskékhez (55 kD), amely azt mutatja, hogy a kimérakonstrukciókról expresszálódik az L2 epitóp. A tisztított VLP¹k antitest jellemzését ELlSA alkalmazásával végeztük Dr. Neil Christensen által szolgáltatott antitestpanel alkalmazásával (Chistensen és munkatársai, 1996, 2001). A 2. táblázat összefoglalja az adatokat.
2. táblázat V5
E70
U4
9A
D9
l23
L2
A
+
–
+
+
+
+
+
C
–
–
+
+
+
+
+
E
+
+
+
+
+
+
+
F
+
+
+
+
+
+
+
5
1
HU 008 252 T2
2
2. táblázat (folytatás) V5
E70
U4
9A
D9
l23
L2
H
–
–
–
–
+
+
+
SA-opt L1
+
+
+
+
–
+
–
Az antitestek rövid ismertetését és a kötõhelyeiket az alábbi 3. táblázatban adjuk meg. 10 3. táblázat V5
monoklonális, konformációspecifikus antitest; 266. és 282. aminosav a kritikus
E70
monoklonális, konformációspecifikus antitest; 50., 266. és 282. aminosav a kritikus
U4
monoklonális, konformációspecifikus antitest
9A
monoklonális, egy lineáris szakaszhoz kötõdik az 1–171. aminosavszakaszban
D9
monoklonális, denaturált L1 fehérjét köt
123
monoklonális, a 111–130. aminosavszakaszban kötõdik
L2
L2 epitópot kötõ poliklonális antitest (108–120. aminosav)
15
20
25
A kimérarészecskék elektronmikroszkópiája EM eredmények azt mutatták, hogy a kimérakonstrukcióból kialakult részecskék nem azonosak a vad típusú HPV L1 gén által termeltekkel. A kialakult ré- 30 szecskék fõként részlegesen lebomlott vagy részlegesen szétesett állapotban vannak és általában összetapadva látszódnak. Állati kísérletek a kiméra antigénnel Hat darab, 5 Balb/c egérbõl álló csoportot alkalmaztunk az állati kísérletekben, annak meghatározására, hogy a kiméra VLP-kkel végzett inokulálás kiváltott¹e immunválaszt. Az 5 kimérakonstrukció által termelt kiméra VLP-ket és nem kiméra HPV 16 L1 (SA-opt) által termelt VLP-ket injekcióztunk be 100 mg koncentrációban két szubkután helyre. Az állatokat a 0., 2. és 4. héten oltottuk be. Vérmintákat és vaginális mosatokat vettünk különbözõ idõközönként. Minden egyes csoportból összegyûjtöttük az egér szérumot és ELISA alkalmazásával elemeztük rovarsejtekben rekombináns baculovírusok által termelt VLP-ket alkalmazva. Minden egyes egércsoportra végeztünk végponttitrálásokat, a válasz mértékének meghatározására és a válasz jobb visszatükrözésére (20–26. ábrák). Az eredmények azt mutatták, hogy nagy immunválaszt értünk el.
35
40
45
50
55 Hivatkozások Baker, T. S, W. W. Newcomb, N. H. Olson, L. M. Cowsert, C. Olson, and J. C. Brown. 1991. Biophys. J. 60:1445–1456. Breitburd, F. and P. Coursaget. 1999. Cancer Bio60 logy 9:431–445. 6
Browne, H. M., M. J. Churcher, M. A. Stanley, G. L. Smith, and A. C. Minson. 1988. J. Gen. Virol. 69, 1263–1273. Chen, X. S., Garcea, R. L., Goldberg, I., Casini, G., and Harrison, S. C. (2000). Mol. Cell. 5,557–567. Chen, X. S, Casini, G., Harrison, S. C and Garcea, R. (2001). Journal of Molecular Biology 307, 173–182. Christensen, N. D., J. Diller, C. Eklund, J. J. Carter, G. C. Wipf, C. A. Reed, N. M. Cladel, and D. A. Galloway. 1996. Virol. 223, 174–184. Christensen N. D., Cladel N. M., Reed C. A., Budgeon L. R., Embers M. E., Skulsky D. M., McClements W. L., Ludmerer S. W., Jansen K. U. 2001. 20; 291 (2):324–34. Doorbaar, J., and P. H. Gallimore. 1987. J. Virol. 61: 2793–2799. Doretzky, L., R. Shober, S. K. Chattopadhyay, and D. R. Lowy. 1980. Virology 103:369–375. ME Embers, L. R. Budgeon, M. Pickel, N. D. Christensen. 2002. J. Virol., 76 (19): 9798–9805. Evans, T. G, Bonnez, W, Rose, R. C, Koenig, S., Demeter, L., Suzich, J. A., O’Brien, D., Campbell, M., White, W. I., Balsley, J., and Reichman, R. C. 2001. J. Inect, Dis. 183, 1485–1493. Harro, C. D., Pang, Y. Y., Roden, R. B., Hildesheim, A., Wang, Z., Reynolds, M. J., Mast, T. C., Robinson, R., Murphy, B. R., Karron, R. A., Dillner, J., Schiller, J. T., and Lowy, D. R. 2001. J. Natl. Cancer Inst. 93, 284–292. IARC, World Health Organization. 1995. WHO Report of a technical meeting, Geneva. Ref Type: Report IARC, World Health Organization. 1999. WHO. Report of a technical meeting, Geneva, 16–18 Feb 1999. 1999. Ref Type: Report Kawana, K., Matsumoto, K., Yoshikawa, H., Taketani, Y., Kawana, T., Yoshiike, K., and Kanda, T. 1998. Virology 245, 353–359. Kawana, K., Yoshikawa, H., Takentani, Y., Yoshiike, K., and Kanda, T. (1999). Jouranl of Virology 73, 6188–6190. Kawana, K., Kawana, Y., Yoshikawa, H., Takentani, Y., Yoshiike, K., and Kanda, T. (2001). Vaccine 19, 1496–1502. Kimbauer, R., F. Booy, N. Cheng, D. R. Lowy, and J. T. Schiller. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 89, 12 180–12 184. Kimbauer, R., J. Taub, H. Greenstone, R. Roden, M. Durst, L. Gissman, D. R. Lowy, and J. T. Schiller. 1993. J. Virol. 67, 6929–6936. Lowy, D. R., R. Kirnbauer, and J. T. Schiller. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91:2436–2440. Roden, R. B. S., H. L. Greenstone, R. Kimbauer, F. P. Booy, J. Jessie, D. R. Lowy, and J. T. Schiller. 1996. J. Virol. 70, 5875–5883.
1
HU 008 252 T2
Rose, R. C., Bonnez, W., Reichman, R. C., and Garcea, R. L. 1993. J. Virol. 67, 1936–1944. Rose, R. C., White, W. I., Li, M., Suzich, J. A., Lane, C., and Garcea, R. L. 1998. Journal of Virology 72, 6151–6154. Schiller, J. T. and Lowy, D. R. 2001. Expert. Opin. Biol. Ther. 1, 571–581.
5
2
Seedorf, K., G. Krämmer, M. Dürst, S. Suhai, and W. G. Röwekamp. 1985. Virol. 145, 181–185. White, W. I, Wilson, S. D., Palmer-Hill, F. J., Woods, R. M, Ghim, S.¹J., Hewitt, L. A., Goldman, D:M, Burke, S. J., Jenson, A. B., Koenig, S., and Suzich, J. A. 1999. J. Virol. 73, 4882–488.
Szekvencialista <110> University of Cape Town University of Cape Town <120> Chimaeric Human Papillomavirus 16 L1 Virus-Like Particles and Methods for Preparing the Particles <130> PA132930/EP <140> EP1506222 <141> 2003–05–19 <150> ZA 2002/3957 <151> 2002–05–17 <160> 14 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Humán papillomavírus <400> 1
Leu Val Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavírus <400> 2
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta aataagtttg gcctgtgtag cctttattaa gtggataata tgcaaaccac aatccaggtg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt gtaacatccc cttaaaaaat cagtttcctt
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg gttttcctga gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga attgtccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca aggcaattgc acactttttg taggacgcaa
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac cacctcattt aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta tataatccag cagccattag aatgctagtg tacaaacaaa aaaggatccc ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacac catacacctc ttaaaggaaa caagcaggat
7
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat cttatgcagc cacaattgtg catgtaccaa ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagaagatac cagcacctaa agttttctgc tgaaggccaa
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat aaatgcaggt tttaattggt tgttgcagta tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag ttataggttt agaagatccc agacctagat accaaaattt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440
HU 008 252 T2
acattaggaa aacgaaaagc tacacccacc acctcatcta cctctacaac tgctaaacgc aaaaaacgta agctgtaa <210> 3 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 3
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270
8
1500 1518
HU 008 252 T2
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 4 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavírus <400> 4
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta aataagtttg gcctgtgtag cctttattaa gtggataata tgcaaaccac
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg gttttcctga gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac cacctcattt aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta tataatccag cagccattag aatgctagtg tacaaacaaa aaaggatcct 9
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat cttatgcagc cacaattgtg tagtggaaga
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat aaatgcaggt tttaattggt aactagtttt
60 120 180 240 300 360 420 480 540
HU 008 252 T2
attgatgctg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt gtaacatccc cttaaaaaat cagtttcctt acattaggaa aaaaaacgta
gtgcaccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca aggcaattgc acactttttg taggacgcaa aacgaaaagc agctgtaa
attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta tacacccacc
ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacac catacacctc ttaaaggaaa caagcaggat acctcatcta
ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagaagatac cagcacctaa agttttctgc tgaaggccaa cctctacaac
tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag ttataggttt agaagatccc agacctagat accaaaattt tgctaaacgc
<210> 5 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 5
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Leu Val Glu 165 170 175 Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190
10
600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1518
HU 008 252 T2
Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505
11
HU 008 252 T2
<210> 6 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavírus <400> 6
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta aataagtttg gcctgtgtag cctttattaa ggtgcaccaa tgcaaaccac aatccaggtg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt gtaacatccc cttaaaaaat cagtttcctt acattaggaa aaaaaacgta
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg gttttcctga gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga attgtccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca aggcaattgc acactttttg taggacgcaa aacgaaaagc agctgtaa
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac cacctcattt aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta tacacccacc
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta tataatccag cagccattag ttagtggaag tacaaacaaa aaaggatccc ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacac catacacctc ttaaaggaaa caagcaggat acctcatcta
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat aaactagttt cacaattgtg catgtaccaa ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagaagatac cagcacctaa agttttctgc tgaaggccaa cctctacaac
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat tattgatgct tttaattggt tgttgcagta tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag ttataggttt agaagatccc agacctagat accaaaattt tgctaaacgc
<210> 7 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 7
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110
12
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1518
HU 008 252 T2
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Leu Val Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430
13
HU 008 252 T2
Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 8 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavirus <400> 8
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta aataagtttg gcctgtgtag cctttattaa gtggataata tgcaaaccac aatccaggtg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt gtaacatccc ggtgcaccat cagtttcctt acattaggaa aaaaaacgta
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg gttttcctga gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga attgtccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca aggcaattgc acactttttg taggacgcaa aacgaaaagc agctgtaa
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac cacctcattt aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta tacacccacc
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta tataatccag cagccattag aatgctagtg tacaaacaaa aaaggatccc ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacac ttagtggaag ttaaaggaaa caagcaggat acctcatcta
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat cttatgcagc cacaattgtg catgtaccaa ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagaagatac aaactagttt agttttctgc tgaaggccaa cctctacaac
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat aaatgcaggt tttaattggt tgttgcagta tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag ttataggttt tattgatgct agacctagat accaaaattt tgctaaacgc
<210> 9 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 9
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30
14
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1518
HU 008 252 T2
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350
15
HU 008 252 T2
Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys Leu Val 420 425 430 Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 10 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavirus <400> 10
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta aataagtttg gcctgtgtag cctttattaa gtggataata tgcaaaccac aatccaggtg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt attgatgctg cttaaaaaat cagtttcctt
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg gttttcctga gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga attgtccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca gtgcaccagc acactttttg taggacgcaa
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac cacctcattt aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta tataatccag cagccattag aatgctagtg tacaaacaaa aaaggatccc ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacat catacacctc ttaaaggaaa caagcaggat 16
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat cttatgcagc cacaattgtg catgtaccaa ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagtggaaga cagcacctaa agttttctgc tgaaggccaa
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat aaatgcaggt tttaattggt tgttgcagta tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag aactagtttt agaagatccc agacctagat accaaaattt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440
HU 008 252 T2
acattaggaa aacgaaaagc tacacccacc acctcatcta cctctacaac tgctaaacgc aaaaaacgta agctgtaa <210> 11 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 11
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270
17
1500 1518
HU 008 252 T2
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Val Glu 405 410 415 Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 12 <211> 1518 <212> DNA <213> Humán papillómavirus <400> 12
atgtctcttt gttgtaagca agactacttg ttagttccta ttagtggaag gcctgtgtag cctttattaa gtggataata tgcaaaccac
ggctgcctag cggatgaata cagttggaca aagtatcagg aaactagttt gtgttgaggt ataaattgga gagaatgtat ctatagggga
tgaggccact tgttgcacgc tccctatttt attacaatac tattgatgct aggccgtggt tgacacagaa atctatggat acactggggc
gtctacttgc acaaacatat cctattaaaa agggtattta ggtgcaccag cagccattag aatgctagtg tacaaacaaa aaaggatccc 18
ctcctgtccc attatcatgc aacctaacaa gaatacattt atacacagcg gtgtgggcat cttatgcagc cacaattgtg catgtaccaa
agtatctaag agggacatcc taacaaaata acctgacccc gctggtttgg tagtggccat aaatgcaggt tttaattggt tgttgcagta
60 120 180 240 300 360 420 480 540
HU 008 252 T2
aatccaggtg gttgatactg ccactggata ccatatggcg tttaataggg gggtctactg acctctgatg aatggcattt aatatgtcat aaggagtacc ataaccttaa gactggaatt gtaacatccc cttaaaaaat cagtttcctt acattaggaa aaaaaacgta
attgtccacc gctttggtgc tttgtacatc acagcttatt ctggtactgt caaatttagc cccaaatatt gttggggtaa tatgtgctgc tacgacatgg ctgcagacgt ttggtctaca aggcaattgc acactttttg taggacgcaa aacgaaaagc agctgtaa
attagagtta tatggacttt tatttgcaaa tttttattta tggtgaaaat cagttcaaat caataaacct ccaactattt catatctact ggaggaatat tatgacatac acctccccca ttgtcaaaaa ggaagtaaat atttttacta tacacccacc
ataaacacag actacattac tatccagatt cggagggaac gtaccagacg tattttccta tattggttac gttactgttg tcagaaacta gatttacagt atacattcta ggaggcacac catacacctc ttaaaggaaa caagcaggat acctcatcta
ttattcagga aggctaacaa atattaaaat aaatgtttgt atttatacat cacctagtgg aacgagcaca ttgatactac catataaaaa ttatttttca tgaattccac tagaagatac cagcacctaa agttttctgc tgaaggccaa cctctacaac
tggtgatatg aagtgaagtt ggtgtcagaa tagacattta taaaggctct ttctatggtt gggccacaat acgcagtaca tactaacttt actgtgcaaa tattttggag ttataggttt agaagatccc agacctagat accaaaattt tgctaaacgc
<210> 13 <211> 505 <212> PRT <213> Humán papillómavírus <400> 13
Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Leu Val Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190
19
600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1518
HU 008 252 T2
Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr 420 425 430 Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505
20
1
HU 008 252 T2
2
<210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Humán papillómavirus <400> 14
ttagtggaag aaactagttt tattgatgct ggtgcacca SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán papillómavírus (HPV) L2 peptidet tartalmazó kiméra HPV L1 polipeptid, elõnyösen HPV 16 polipeptid vagy peptid elõállítására, amely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: az L2 peptidet kódoló DNS-szekvencia bevitele az L1 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciába; az L1 polipeptidet és L2 peptidet kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-szekvencia bevitele olyan gazdasejtbe, amelyben a DNS-szekvencia expresszálható; a DNS-szekvencia expresszáltatása, elõnyösen prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerben; és az eredményül kapott L2 peptidet tartalmazó kiméra L1 polipeptid kinyerése. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a HPV L2 peptid aminosavszekvenciája a következõ: LVEETSFIDAGAP (SEQ ID NO: 1), vagy olyan szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat- vagy származékszekvencia legalább 80%¹os homológiát mutat az 1. azonosító számú szekvenciával és olyan peptidet kódol, amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve van az L2 DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és elõnyösen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált L2 nukleotidok számának. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kiméra polipeptid aminosavszekvenciája a 6., 8., 10., 12. és 14. ábrák bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13), vagy olyan szekvencia, amely legalább 80%-ban homológ a SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13 szekvenciák bármelyikével, és amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. 5. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kiméra polipeptidet kódoló DNS-szekvencia az 5., 7., 9., 11. és 13. ábra bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12), vagy olyan szekvencia, amely legalább 80%-ban homológ ezen szekvenciák bármelyikével, és amely olyan polipeptidet kódol, amely képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a kiméra L1 polipeptid képes vírusszerû részecskékké és/vagy kapszomerekké, elõnyösen immunogén vírusszerû részecskékké vagy kapszomerekké összeállni. 7. Kiméra humán papillóma vírus (HPV) L1 DNSszekvencia, amelybe HPV L2 peptidet (SEQ ID NO:1)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 21
39
kódoló DNS-szekvencia lett inszertálva, amely képes a HPV L2 peptidet expresszálni. 8. A 7. igénypont szerinti HPV L1 DNS-szekvencia, ahol az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve van az L2 DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és elõnyösen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált L2 nukleotidok számának. 9. Humán papillómavírus (HPV) DNS-szekvencia, amelynek a DNS-szekvenciája az 5., 7., 9., 11. és 13. ábra bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12), vagy olyan DNS-szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat vagy származék DNS-szekvencia legalább 80% homológiát mutat a SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 és 12 azonosító számú szekvenciák bármelyikével, és amely HPV L2 peptidet bemutató kiméra L1 peptidet kódol, ahol a kiméra L1 peptid képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. 10. Vektor, amely a 7–9. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz. 11. Gazdasejt, amely a 10. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 12. Kiméra humán papillómavírus (HPV) L1 polipeptid, elõnyösen kiméra HPV L1 vírusszerû részecske vagy kapszomer, amely LVEETSFIDA GAP (SEQ ID NO: 1) aminosavszekvenciájú peptidet tartalmaz. 13. Humán papillómavírus (HPV) polipeptid, amelynek aminosavszekvenciája a 6., 8,, 10., 12. és 14. ábra bármelyikén bemutatott szekvencia (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13), vagy olyan szekvencia, amely ezen szekvencia módosulata vagy származéka, azzal a megkötéssel, hogy a módosulat vagy származék aminosavszekvencia legalább 80% homológiát mutat a SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 és 13 azonosító számú szekvenciák bármelyikével, és amely HPV L2 peptidet bemutató kiméra L1 peptid, ahol a kiméra L1 peptid képes HPV elleni immunogén válasz kiváltására. 14. Eljárás heterológ peptidet tartalmazó kiméra humán papillómavírus (HPV) L1 polipeptid elõállítására, ahol az eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvencia bevitele az L1 polipeptidet kódoló DNS-szekvenciába a 241–279., 391–429., 520–558., 1240–1278. vagy 1291–1329. nukleotidpozícióknak a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciára történõ kicserélésével; az L1 polipeptidet és a heterológ peptidet kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó DNS-szekvencia bevitele olyan gazdasejtbe, amelyben a DNS-szekvencia expresszálható; a DNS-szekvencia expresszáltatása; és
1
HU 008 252 T2
az eredményül kapott, heterológ peptidet tartalmazó kiméra L1 polipeptid kinyerése. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a heterológ peptid-szekvencia bármilyen egyéb HPV-szekvencia vagy bármilyen B¹sejt- vagy T¹sejt-specifikus antigénepitópból származik. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, ahol az L1 DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidja törölve van a heterológ DNS-szekvencia bevitelének helyénél, és elõnyösen az L1 DNS-szekvenciából törölt nukleotidok száma megfelel az inszertált heterológ nukleotidok számának.
2
17. Oltóanyag, amely 12. vagy 13. igénypont szerinti kiméra humán papillómavírus (HPV) L1 polipeptidet vagy 7–9. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciát tartalmaz, elõnyösen HPV-fertõzés meg5 elõzõ vagy terápiás kezelésében történõ alkalmazásra, és legelõnyösebben HPV 6, 16 vagy 18 kezelésében történõ alkalmazásra. 18. A 17. igénypont szerinti oltóanyag, amely képes HPV és/vagy a bejuttatott peptid elleni immunogén vá10 lasz kiváltására megfelelõ gazdában, amely oltóanyag továbbá gyógyszerészeti excipienst és/vagy adjuvánst is tartalmaz.
22
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
23
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
24
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
25
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
26
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
27
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
28
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
29
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
30
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
31
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
32
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
33
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
34
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
35
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
36
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
37
HU 008 252 T2 Int. Cl.: C07K 14/025
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
