!HU000007751T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 751
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 519211 P 2003. 11. 12.
(73) Jogosult: MERCK SHARP & DOHME CORP., Rahway, New Jersey (US)
US
(72) Feltalálók: BRYAN, Janine, T., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); BROWNLOW, Michelle, K., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); SCHULTZ, Loren, D., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); WANG, Xin-Min, Rahway, New Jersey 07065-0907 (US); JANSEN, Kathrin, U., Rahway, New Jersey 07065-0907 (US) (54)
HU 007 751 T2
C12N 15/37
(21) Magyar ügyszám: E 04 810619 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 10. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040810619 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1687329 A2 2005. 05. 26. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1687329 B1 2009. 12. 23.
(2006.01) A61K 39/12 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) C07K 14/025 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05047315 PCT/US 04/037372
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest
HPV58 L1 optimalizált expressziója élesztõben
A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 6 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 751 T2
A találmány tárgyát képezi általánosságban humán eredetû papillomavírus („human papillomavirus”, HPV) fertõzés megelõzése és/vagy terápiája. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik HPV58 L1 proteint kódoló, szintetikus polinukleotidok és ilyen polinukleotidokat tartalmazó rekombináns vektorok és gazdák. A találmány tárgyát képezik HPV58 vírusszerû részecskék („virus-like particles”, VLPs), amelyeket rekombináns HPV58 L1 vagy L1+L2 expressziójával állítottunk elõ élesztõsejtekben, valamint eljárás HPV-fertõzések megelõzésére és kezelésére alkalmas vakcinák és gyógyászati készítmények elõállítására. A találmány háttere A humán eredetû papillomavírusoknak (HPV) több mint 80 típusa létezik, amelyek közül többet biológiai fenotípusok széles körével hoznak összefüggésbe, jóindulatú proliferatív szemölcsöktõl a rosszindulatú karcinómákig [összefoglalást lásd McMurray és mtsai.: Int. J. Exp. Pathol. 82(1), 15–33 (2001)]. A HPV6 és HPV11 típusokat hozzák a leggyakrabban összefüggésbe jóindulatú szemölcsökkel, valamint nem rosszindulatú condyloma acuminata és/vagy genitális vagy légúti nyálkahártyán jelentkezõ, enyhe fokú dysplasia kórképekkel. A HPV16 és HPV18 súlyos kockázatú típusok, amelyeket leggyakrabban a méhnyak, hüvely, vulva és a végbél in situ és invazív karcinómájával hoznak összefüggésbe. A méhnyak karcinómáinak több mint 90%¹át hozzák összefüggésbe a HPV16, HPV18 vagy a kevésbé gyakori HPV31, -33, -45, 52 és -58 típusokkal [Schiffman és mtsai.: J. Natl. Cancer Inst. 85(12), 958–64 (1993)]. Az a megfigyelés, hogy a méhnyakrákok több mint 90%-ában kimutatható HPV DNS, nyomós epidemiológiai bizonyíték arra nézve, hogy a HPV¹k méhnyakkarcinómát okoznak. A papillomavírusok kis (50–60 nm), burok nélküli, ikozaéder DNS-vírusok, amelyek legfeljebb nyolc korai és két késõi gént kódolnak. A vírusgenom nyitott leolvasási keretének („open reading frame”, ORF) elnevezése E1–E7, valamint L1 és L2, ahol „E” jelentése korai („early”) és „L” jelentése késõi („late”). Az L1 és L2 a vírus kapszidproteinjeit kódolja, míg az E gének olyan funkciókkal függenek össze, mint a vírusreplikáció és a sejtek transzformálása. Az L1 protein a fõ kapszidprotein és molekulatömege 55–60 kDa. Az L2 protein a minor kapszidprotein. Immunológiai adatok arra utalnak, hogy az L2 protein a víruskapszidban az L1 proteinhez képest beljebb helyezkedik el. A különbözõ papillomavírusokban az L1 és L2 proteinek nagyfokú konzerváltságot mutatnak. Az L1 proteinnek vagy az L1 és L2 proteinek kombinációjának az expresszálódása élesztõben, rovareredetû sejtekben, emlõseredetû sejtekben vagy baktériumokban vírusszerû részecskék („virus-like particles”, VLPs) önszervezõdõ összeállásához vezet [összefoglalásért lásd Schiller és Roden: „Papillomavirus reviews: Current Research on Papillomaviruses” szerk.: Lacey; Leeds, Egyesült Királyság, Leeds Medical Information 101–12 (1996)]. A VLP¹k morfológiailag hason-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
lítanak az eredeti virionokhoz és állatnak vagy embernek beadva, neutralizáló ellenanyagok magas titerét képesek kiváltani. Mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén vírusgenomot, HPV-vakcinák fejlesztése során biztonságos alternatívát nyújtanak az élõ vírusok alkalmazásával szemben [összefoglalást lásd Schiller és Hidesheim: J. Clin. Virol. 19, 67–74 (2000)]. Ebbõl az okból, az L1 és L2 géneket immunológiai célpontként azonosították HPV fertõzések és betegségek elleni profilaktikus és terápiás vakcinák kifejlesztése céljára. Tobery T. W. és mtsai. (2003) két vakcinatípus összehasonlítását ismertetik HPV16L1-specifikus humorális immunválasz kiváltására: „…makákó majmokat immunizáltunk HPV16L1¹et kódoló, adenovírus (Ad) eredetû vektorral…, HPV16L1¹et kódoló plazmid DNS vektorral…, élesztõben elõállított HPV16L1-proteinnel… vagy élesztõben elõállított HPV16L1+E1/E2/E7 kiméra vírusszerû részecskékkel…” (1541. oldal, jobb oldali hasáb, utolsó bekezdés). Azt tapasztalták, hogy „az L1 VLP csoport jelentõsen magasabb neutralizáló titereket mutatott, mint a cVLP, L1 DNS és adeno¹L1 csoportok…” (1542. oldal, jobb oldali hasáb, elsõ bekezdés). A HPV-vakcinák fejlesztését és forgalmazását hátráltatta, hogy nehézségbe ütközött a kapszidproteinek magas expressziós szintjeinek elérése sikeresen transzformált gazdaszervezetekben, ami korlátot szabott a tisztított protein elõállításának. Ennek megfelelõen, HPV L1 proteineket, például HPV58 L1 proteint kódoló, vad típusú nukleotidszekvenciák azonosítása ellenére, igény mutatkozik könnyen megújítható, nyers HPV L1 proteinforrásra, amely olyan, HPV58 L1¹et kódoló nukleotidszekvenciákat alkalmaz, amelyeket a kívánt gazdasejtben történõ alkalmazásra optimalizáltak. Ezen túlmenõen, igény mutatkozik a natív proteinek immunitást kiváltó tulajdonságát mutató HPV58 L1 VLP¹k nagy mennyiségének az elõállítására vakcinák fejlesztése céljából. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik készítmények és eljárások HPV58 L1 gének által expresszált proteintermékeken alapuló vakcina elõállítására. A találmány tárgyát képezik HPV58 L1 proteint kódoló polinukleotidok, ahol a polinukleotidokat élesztõsejtben való magas szintû expresszióra kodonoptimalizáltuk. A találmány tárgyát képezik továbbá HPV58 L1 vírusszerû részecskék (VLP¹k), ahol az említett VLP-ket rekombináns HPV58 L1 vagy L1+L2 expresszáltatásával állítjuk elõ élesztõsejtben, a találmány tárgyát képezi továbbá HPV58 VLP¹k alkalmazása HPV-asszociált rákok megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati és vakcinakészítményekben. A találmány tárgyát képezik HPV58 L1 proteint kódoló, szintetikus DNS-molekulák. A szintetikus molekulák kodonjait úgy terveztük meg, hogy azok élesztõsejt által preferált kodonokat tartalmazzanak. A szintetikus molekulák alkalmazhatók a HPV58 L1 protein forrásaként, amely protein VLP¹vé önszervezõdhet. Ezek a VLP¹k alkalmazhatók VLP-alapú vakcinában.
1
HU 007 751 T2
Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi szintetikus nukleinsavmolekula, amely HPV58 L1 proteint kódol, és amelyet a SEQ ID NO 2 azonosító számú szekvencia ismertet, amely nukleinsavszekvencia a SEQ ID NO 1 azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidok szekvenciáját tartalmazza (a leírásban „58 L1 R szekvencia”). A találmány tárgyát képezik továbbá mind prokarióta, mind eukarióta eredetû, rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek, amelyek a leírásban ismertetett nukleinsavmolekulákat tartalmazzák. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a gazdasejt élesztõsejt. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások HPV58 VLP¹k elõállítására, valamint eljárások HPV58 VLP¹k alkalmazására. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, az élesztõ az alábbiak közül választott: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV58 vírusszerû részecskéket (VLP-ket) tartalmazó vakcina elõállítására, ahol a HPLV58 VLP-ket élesztõben állítjuk elõ. A találmány ezen szempontjának másik megvalósítási módja szerint, az eljárás tartalmazza továbbá legalább egy további HPV-típusba tartozó VLP¹k hozzáadását. A legalább egy további HPV lehet bármely adott HPV, beleértve azokat, amelyeket a szakirodalom már ismertetett, vagy amelyeket azt követõen azonosítottak. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a további HPV-típus olyan típus, amelyet klinikai fenotípussal, például szemölcsökkel vagy méhnyakrákkal hoznak összefüggésbe. Az egyik további megvalósítási mód szerint, a legalább egy további HPV-típus az alábbiak közül választott: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 és HPV68. A leírásban és a csatolt igénypontokban alkalmazott „egy” határozatlan névelõ és „az” határozott névelõ egyes számú alakja többes számot is jelenthet, kivéve ha a szövegkörnyezet egyértelmûen az ellenkezõjére utal. A leírásban és a csatolt igénypontokban az alábbi definíciókat és rövidítéseket alkalmazzuk: „Promoter” kifejezés alatt DNS-szálon levõ olyan felismerõhelyet értünk, amelyhez az RNS-polimeráz kötõdik. A promoter iniciáló komplexet képez az RNSpolimerázzal, hogy iniciálja és irányítsa a transzkripciós aktivitást. A komplex módosítható aktiváló szekvenciákkal, amelyeket „enhancereknek” (expressziót fokozó szekvenciáknak), vagy „5’ irányú aktiváló szekvenciáknak”, vagy gátló szekvenciákkal, amelyeket „silencerek-nek” (csendesítõ szekvenciáknak) nevezünk. „Vektor” kifejezés alatt bármely olyan eszközt értünk, amely révén DNS-fragmensek gazdaszervezetbe vagy gazdaszövetbe bevihetõk. A vektorok számos típusa létezik, beleértve plazmidokat, vírusokat (így például adenovírusokat), bakteriofágokat és kozmidokat.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
„Kazetta” kifejezés alatt olyan nukleotidot vagy szekvenciát értünk, amelyet adott vektorból expresszáltatni kívánunk, például a HPV58 L1 proteint kódoló nukleotidot vagy génszekvenciát. Általánosságban, egy adott kazetta vektorba inszertált génszekvenciát tartalmaz, és néhány megvalósítási mód szerint a vektor szabályozószekvenciákat szolgáltat a nukleotid vagy génszekvencia expresszálódásához. Más megvalósítási módok szerint, a szabályozószekvenciákat a nukleotid vagy génszekvencia biztosítja saját expresszálódásához. További megvalósítási módok szerint, a vektor szolgáltat néhány szabályozószekvenciát, és a nukleotid vagy génszekvencia biztosít további szabályozószekvenciákat. Például, a vektor biztosíthatja a promotert a nukleotid vagy génszekvencia transzkripciójához, és a nukleotid vagy génszekvencia biztosíthatja a transzkripció leállításához szükséges szekvenciát. A vektor által biztosított szabályozószekvenciák a korlátozás szándéka nélkül lehetnek expressziót fokozó szekvenciák („enhancer” szekvenciák), transzkripciót leállító szekvenciák („terminátor” szekvenciák), vágási hely befogadó és vágási hely donor szekvenciák („splice acceptor” és „splice donor” szekvenciák), riboszómakötõ szekvenciák és poli¹A oligonukleotidot hozzáadó szekvenciák. Az „58 L1 vad típusú szekvencia” és „58 L1 wt szekvencia” kifejezések alatt a leírásban a SEQ ID NO 3 azonosító számú szekvencia szerinti szekvenciát értjük. Bár az 58 L1 vad típusú szekvenciát már korábban ismertették, nem ritka, hogy kisebb szekvenciavariációkat találunk klinikai izolátumokból származó DNS¹ek között. Ennek megfelelõen, reprezentatív 58 L1 vad típusú szekvenciát izoláltunk olyan klinikai mintákból, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy HPV58 DNS¹t tartalmaznak (lásd az 1. példát). Az 58 L1 vad típusú szekvenciát alkalmaztuk referenciaszekvenciaként, a leírásban ismertetett, kodonoptimalizált 58 L1 szekvenciákkal történõ összehasonlítás céljára (lásd az 1. ábrát). A „HPV58 L1 R” és „58 L1 R” kifejezések alatt a leírásban ismertetett, példaként szolgáló HPV58 L1 nukleotidszekvenciát értünk (SEQ ID NO 1), amelyben a szekvenciát úgy építettük át, hogy olyan kodonokat tartalmaznak, amelyek elõnyösek magas szintû expresszálódásra élesztõsejtekben. „Hatékony mennyiség” kifejezés alatt azt értjük, hogy a polipeptid megfelelõ szintjét tartalmazó, elegendõ vakcinakészítményt adunk be abból a célból, hogy immunválaszt kapjunk. Szakember számára világos, hogy ez a szint különbözõ lehet. „Konzervatív aminosavhelyettesítés” kifejezés alatt aminosav helyettesítését értjük másik, kémiailag hasonló aminosavcsoporttal. Konzervatív aminosavhelyettesítésre példák: hidrofób csoport (izoleucin, leucin, valin vagy metionin) helyettesítése másik hidrofób csoportra; poláros csoport helyettesítése másik, azonos töltésû poláros csoportra (például arginint lizinre; glutaminsavat aszparaginsavra). Az „emlõs” kifejezés alatt bármely emlõst értünk, emberi lényt is beleértve.
1
HU 007 751 T2
„VLP” vagy „VLP¹k” jelentése vírusszerû részecske vagy részecskék. A „szintetikus” kifejezés alatt azt értjük, hogy a HPV58 L1 gént úgy állítottuk elõ, hogy nukleotidok olyan szekvenciáját tartalmazza, amely nem azonos az ismertetett, természetben elõforduló, vad típusú HPV58 L1 génben jelen levõ nukleotidok szekvenciájával (58 L1 wt, SEQ ID NO 3). Amint azt fentebb ismertettük, a találmány tárgyát képezik szintetikus molekulák, amelyek olyan kodonokat tartalmazó nukleotidok szekvenciáját tartalmazzák, amelyek elõnyösek élesztõsejtekben történõ expresszálódás céljára. A találmány szerinti szintetikus molekulák ugyanazt az aminosavszekvenciát kódolják, mint a vad típusú HPV58 L1 gén (SEQ ID NO 2). Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra szekvencia-összerendezést ábrázol, amely a találmány szerinti, szintetikus HPV58 L1 génben (SEQ ID NO 1, jelölése „58 L1 R”) módosított nukleotidokat hasonlítja össze (lásd a 2. példát). A referenciaszekvencia az 58 L1 vad típusú szekvencia (SEQ ID NO 3, jelölése „58 L1 wt”; lásd az 1. példát). A módosított nukleotidokat a megfelelõ helyzetükben jelöltük. A nukleotid sorszámát zárójelbe tettük. Az 58 L1 átépített szekvenciában az azonos nukleotidokat pontokkal jelöltük. A 2. ábra átépített szintetikus HPV58 L1 kettõs szálú nukleinsav¹, valamint egybetûs kódú aminosavszekvenciáját ábrázolja. A 3. ábra HPV58 L1 wt és 58 L1 R transzkriptumok Northern-blot-vizsgálatát ábrázolja (lásd a 4. példát). A blotot DIG-reagenssel jelölt, azonos mennyiségû 58 L1 wt és 58 L1 R DNS-próbák elegyével próbáztuk. Feltüntettük a sávonként elektroforetizált összes RNS mennyiségét. A jobb oldalon levõ nyíl a teljes hosszúságú 58 L1 R transzkriptum várt méretét jelöli. A 4. ábra HPV58 L1 wt (58) és 58 L1 R (58R) proteinek Western-blot-vizsgálatát ábrázolja. A HPV16 L1 proteint referencia céljából vontuk be a vizsgálatba (16). Tíz, 5 és 2,5 mg teljes proteinkivonatot denaturáltunk, és vittünk fel 10%¹os SDS-PAGE gélre. A HPV58 L1 proteint élesztõvel kimerített, trpE-HPV31 L1 elleni, kecskében termelt, poliklonális antiszérummal detektáltuk, amely keresztreagál az 58 L1 és 16 L1 proteinekkel. A molekulatömeg-markereket kDa egységekben jelöltük a bal oldalon. Az 5. ábra az összes élesztõprotein 1 mikrogrammjára vonatkoztatott, intakt HPV58 L1 VLP¹k mennyiségét mutatja (ng), amelyet ELISA-vizsgálattal befogtunk és detektáltunk (lásd a 7. példát). Két párhu-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 4
2
zamossal végzett két vizsgálat eredményét mutatjuk. A HPV58 L1 wt protein (fekete és szürke oszlopok) VLP expressziója az összes élesztõprotein 1 mgjára vonatkoztatva 36 ng volt. A HPV58 L1 R protein, azaz az átépített, élesztõre kodonoptimalizált 58 L1 VLP expressziója (fehér és vonalkázott oszlopok) 2–3-szor magasabb volt, mint a HPV58 L1 R expressziója, és a 2. vizsgálatban az összes élesztõprotein 1 mgjára vonatkoztatva elérte a 95 ng értéket. A 6. ábra HPV58 L1 R protein-molekulákból összeálló HPV58 VLP¹k reprezentatív mintáját mutatja transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálattal (lásd a 8. példát). A feltüntetett szakasz hossza körülbelül 100 nm. A találmány részletes ismertetése A méhnyakrákok többsége humán eredetû papillomavírus (HPV) specifikus onkogén típusaival történt fertõzéssel függ össze. A találmány tárgyát képezik készítmények és eljárás onkogén HPV-típusok génjei által expresszált proteintermékeket tartalmazó vakcina elõállítása. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik HPV58 L1 proteint kódoló polinukleotidok, ahol a polinukleotidokat kodonoptimalizáltuk élesztõben történõ, magas szintû expresszálódásra. A találmány tárgyát képezik továbbá HPV58 vírusszerû részecskék (VLP¹k), amelyeket élesztõben állítunk elõ. A találmány tárgyát képezik polinukleotidok, valamint azok révén elõállított VLP¹k alkalmazása vakcinák elõállítási eljárásában, HPV-vel összefüggõ rák megelõzésére és/vagy kezelésére. A vad típusú HPV58 L1 egyik szekvenciáját már ismertették [Genbank nyilvántartási száma: NC 001443, lásd Kirii és mtsai.: Virology 185(1), 424–427 (1991)]. A találmány tárgyát képezik HPV58 L1 proteint kódoló, szintetikus DNS-molekulák. A találmány szerinti, szintetikus molekulák kodonok szekvenciáját tartalmazzák, ahol a kodonok legalább egy részét módosítottuk, hogy olyan kodonokat alkalmazzunk, amelyek élesztõsejt számára magas szintû expresszáláshoz elõnyösek. A szintetikus molekulák kódolószekvenciaként alkalmazhatók HP58 L1 protein expresszálására, amely VLP¹vé önszervezõdhet. A fenti VLP¹k alkalmazhatók VLP-alapú vakcinákban abból a célból, hogy hatékony immunprofilaxist biztosítsanak neutralizáló ellenanyagok és sejt által közvetített immunitás révén. Az ilyen VLP-alapú vakcinák elõnyösek továbbá a már kialakult HPV-fertõzések kezelésére. HPV VLP¹k expresszáltatása élesztõben azokat az elõnyöket nyújtja, hogy költségkímélõ és könnyen adaptálható fermentorokban végzett ipari méretû elõállításhoz. Ezen túlmenõen, az élesztõ genomja könnyen módosítható abból a célból, hogy biztosítsuk fokozott szaporodást és expressziós potenciált mutató, rekombináns, transzformált élesztõk szelektálását. Azonban, számos HPV L1 protein, például a HPV58 L1 protein is,
1
HU 007 751 T2
olyan szinten expresszálódik élesztõsejtekben, amely alacsonyabb, mint ami ipari méretekben történõ elõállításhoz elvárt. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezik HPV58 L1 génszekvenciák, amelyeket élesztõsejt környezetben való magas szintû expresszálódásra „optimalizáltunk”. Négy lehetséges nukleotid bázis „tripla” kodonja több, mint 60 variáns formában létezhet. Mivel ezek a kodonok mindössze 20 eltérõ aminosav számára határoznak meg üzenetet (valamint a transzkripció kezdéséhez és végzõdéséhez), néhány aminosavat több, mint egy kodon kódolhat, amely jelenség kodonredundancia néven ismert. Nem egészen megértett okokból, az alternatív kodonok nem egyformán vannak jelen különbözõ típusú sejtek endogén DNS-ében. Valójában úgy tûnik, hogy bizonyos típusú sejtekben, bizonyos kodonok tekintetében változó természetes hierarchia, vagy „preferencia” nyilvánul meg. Egy példaként, a leucin aminosavat hat DNS-kodon, a CTA, CTC, CTG, CTT, TTA és TTG kodonok bármelyike meghatározhatja. Mikroorganizmusok genomi kodonhasználatának a kimerítõ elemzése felfedte, hogy az E. coli endogén DNS¹e leggyakrabban a CTG leucint meghatározó kodont tartalmazza, míg az élesztõk és nyálkagombák DNS¹e leggyakrabban a TTA leucint meghatározó kodont alkalmazza. Ezen hierarchia fényében általánosságban úgy gondolják, hogy adott, leucinban gazdag polipeptid magas szintû expressziójának a valószínûsége E. coli gazdában bizonyos mértékig a kodonhasználat gyakoriságától függ. Valószínû például, hogy TTA kodonokban gazdag gén nehezen expresszálódik E. coliban, míg CTG kodonban gazdag gén valószínûleg erõsen expresszálódik ebben a gazdában. Hasonlóképpen, leucinban gazdag polipeptid expresszálására elõnyös kodon élesztõsejtek esetében a TTA kodon. A kodonpreferencia jelenségnek a rekombináns DNS-technológiára gyakorolt hatásai észrevehetõk, és a jelenség magyarázatul szolgálhat számos korábbi kudarcra, amikor exogén gének magas szintû expresszióját kívánták elérni sikeresen transzformált gazdaszervezetekben – az inszertált génben egy kevésbé „preferált” kodon ismétlõdhet, és elõfordulhat, hogy a gazda expressziós sejtgépezete nem mûködik kellõ hatékonysággal. A fenti jelenség arra utal, hogy szintetikus úton elõállított gének, amelyeket úgy terveznek, hogy a célzott sejtek preferált kodonjait tartalmazzák, rekombináns proteinek expressziójának gyakorlati céljaira, idegen genetikai anyag optimális formáját nyújtják. Ennek megfelelõen, a találmány egyik szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi HPV58 L1¹gén, amely élesztõsejtben magas szintû expresszió elérésére kodonoptimalizált. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint azt találtuk, hogy ugyanazt a proteinszekvenciát kódoló alternatív kodonok alkalmazása feloldhatja élesztõsejtekben a HPV58 L1¹proteinek expressziójára ható korlátokat. A találmány szerint, HPV58 L1 génszegmenseket konvertáltunk olyan szekvenciákká, amelyek azonos transzlált szekvenciát eredményeztek, azonban alter-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
natív kodonhasználat mellett, amint azt Sharp és Cowe ismertetik [„Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae”, Yeast 7, 657–678 (1991)]. Az eljárás általában tartalmazza olyan kodonok azonosítását vad típusú szekvenciákban, amelyek ritkán asszociálódnak erõsen expresszált élesztõgénekkel, és optimális kodonokra cserélésüket élesztõsejtekben való erõs expresszió céljából. Ezt követõen, az új génszekvenciát ellenõrizzük a kodonhelyettesítés által létrehozott, nem kívánt szekvenciákra nézve (például „ATTTA” szekvenciák, intron vágási felismerõ hely véletlen létrehozása, nem kívánt restrikciós enzim helyek, magas GC tartalom, transzkripciót leállító szignálok jelenléte, amelyeket az élesztõ felismer, és hasonlók). A nem kívánt szekvenciákat úgy távolítjuk el, hogy a már létezõ kodonokat azonos aminosavat kódoló, eltérõ kodonokkal helyettesítjük. Ezt követõen, a szintetikus génszegmenseket javított expresszióra nézve vizsgáljuk. A fent ismertetett eljárásokat alkalmaztuk HPV58 L1 szintetikus génszegmensek elõállítására, amelyek magas szintû expresszióra optimalizált gént eredményeztek. Bár a fenti eljárás összefoglalja HPVvakcinákban alkalmazható, kodonoptimalizált gének tervezésére irányuló módszertanunkat, szakember számára világos, hogy hasonlóan hatékony vakcina és/vagy gének fokozott expressziója elérhetõ az eljárás kismértékû változtatásával, vagy a szekvencia kismértékû változtatásával. A találmány tárgyát képezi szintetikus polinukleotid, amely a SEQ ID NO 2 azonosító számú szekvencia szerinti HPV58 L1 proteint kódolja, a fenti nukleinsavmolekula a SEQ ID NO 1 azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidok szekvenciáját tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá mind prokarióta, mind eukarióta rekombináns vektorok és rekombináns gazdasejtek, amelyek a leírásban ismertetett nukleinsavmolekulákat tartalmazzák. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, a gazdasejt élesztõ gazdasejt. A leírásban ismertetett eljárásokkal elõállított, szintetikus HPV58 DNS vagy annak fragmensei rekombináns eljárással expresszáltathatók oly módon, hogy azokat molekuláris eljárással, megfelelõ promotert és megfelelõ további transzkripciós elemeket tartalmazó expressziós vektorba klónozzuk, majd prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekbe visszük át abból a célból, hogy rekombináns HPV58 L1 proteint állítsunk elõ. Ilyen manipulációkra alkalmas eljárásokat ismertetnek például Sambrook és mtsai. [Sambrook és mtsai.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989); Ausubel és mtsai.: „Current protocols in Molecular Biology”, Green Pub. Associates és Wiley-Interscience, New York (1988); Rose és mtsai.: „Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1990)]. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV58 L1 protein expresszálására rekombináns gazdasejtben, amely eljárás tartalmazza: (a) a SEQ ID NO 1 azonosító számú szekvencia szerinti nukleinsavat
1
HU 007 751 T2
tartalmazó vektor bevitelét élesztõ gazdasejtbe; és (b) az élesztõ gazdasejt tenyésztését olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a fenti HPV58 L1 protein expresszálódását. A találmány szerinti, szintetikus gének expressziós kazettává állíthatók össze, amely olyan megtervezett szekvenciákat tartalmaz, amelyek biztosítják a HPV58 L1 protein hatékony expresszálódását a gazdasejtben. A kazetta elõnyösen tartalmazza a szintetikus gént a hozzá funkcionálisan kapcsolt, megfelelõ transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciákkal, például promotert és leállítószekvenciákat. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint, a promoter a S. cerevisiae GAL1 promotere, bár szakember számára világos, hogy számos ismert, élesztõeredetû promoter, így például GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 vagy PGK promoterek közül bármely alkalmazható, vagy alkalmazhatók más eukarióta génbõl származó promoterek. Elõnyös transzkripciót leállító szekvencia a S. cerevisiae ADH1 leállítószekvencia, bár más ismert transzkripciót leállító szekvenciák is alkalmazhatók. Különösen elõnyös a GAL1 promoter és ADH1 leállítószekvencia kombinációjának az alkalmazása. A találmány tárgyát képezik továbbá HPV58 vírusszerû részecske (VLP), amelyet HPV58 L1 vagy L1+L2 gének rekombináns eljárással történõ expresszáltatásával állítottunk elõ, valamint eljárások HPV58 VLP¹k elõállítására és eljárások HPV58 VLP¹k alkalmazására. A VLP¹k képesek önszervezõdéssel összeállni, amikor az L1 protein, a humán eredetû és állati eredetû papillomavírusok fõ kapszidproteinje élesztõben, rovarsejtben, emlõssejtben vagy baktériumokban expresszálódnak [összefoglalást lásd Schiller és Roden: „Papillomavirus reviews: Current Research on Papillomaviruses” szerk.: Lacey; Leeds, Egyesült Királyság, Leeds Medical Information 101–12 (1996)]. Morfológiailag megkülönböztethetetlen HPV VLP¹k elõállíthatók L1 és L2 kapszidproteinek kombinációjának az expresszáltatásával is. A VLP¹k az L1 protein 72 pentamerébõl állnak, T=7 ikozaéder szerkezetben [Baker és mtsai.: Biophys. J. 60(6), 1445–56 (1991)]. A VLP¹k morfológiailag hasonlók az eredeti virionokhoz és állatnak beadva, neutralizáló ellenanyagok magas titerét képesek kiváltani. Kimutatták, hogy nyulak [Breitburd és mtsai.: J. Virol. 69(6), 3959–63 (1995)] és kutyák [Suzich és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25), 11 553–57 (1995)] VLP-kkel történõ immunizálása egyaránt indukál neutralizáló ellenanyagokat és véd kísérletes papillomavírus-fertõzés ellen. Azonban, mivel a VLP¹k nem tartalmazzák a potenciálisan onkogén vírusgenomot és egyetlen génbõl expresszáltatva képesek önszervezõdni, HPV-vakcinák fejlesztése során biztonságos alternatívát jelentenek az élõ vírusok alkalmazásával szemben [összefoglalást lásd Schiller és Hidesheim: J. Clin. Virol. 19, 67–74 (2000)]. A leírásban a HPV58 rekombináns L1 proteinjét vagy rekombináns L1+L2 proteinjeit tartalmazó, vírusszerû részecskéket ismertetünk, ahol a rekombináns proteineket élesztõben expresszáltatjuk.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Amint azt fentebb ismertettük, a találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a HPV58 VLP-ket élesztõben állítjuk elõ. A találmány egyik további elõnyös megvalósítási módja szerint, az élesztõ az alábbiak közül választott: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV58 VLP¹k elõállítására, amely eljárás tartalmazza: (a) élesztõ transzformálását HPV58 L1 proteint vagy HPV58 L1+L2 proteineket kódoló rekombináns DNSmolekulával; (b) a transzformált élesztõ gazdasejt tenyésztését olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a rekombináns DNS-molekula expresszálódását, hogy rekombináns HPV58 L1 proteint állítsunk elõ; (c) a rekombináns HPV58 protein izolálását, hogy HPV58 VLP-ket állítsunk elõ; ahol a HPV58 L1 gén tartalmazza a SEQ ID NO 1 azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidok szekvenciáját. Az elõállított HPV58 VLP¹k alkalmazhatók immunválasz állatban történõ indukálására szolgáló eljárásban, amely tartalmazza HPV58 vírusszerû részecskék állatba történõ beadását, közelebbrõl, alkalmazhatók HPV-vel összefüggõ méhnyakrák megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló eljárásban, amely tartalmazza HPV58 VLP-ket tartalmazó vakcina emlõsnek történõ beadását. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás HPV58 vírusszerû részecskéket (VLP-ket) tartalmazó vakcina elõállítására. A találmány ezen szempontjának egyik alternatív megvalósítási módja szerint, a vakcina elõállítási eljárása tartalmazza továbbá legalább egy további HPV-típusba tartozó VLP¹k hozzáadását. Az egyik elõnyös megvalósítási mód szerint, a legalább egy további HPV-típus az alábbiak közül választott: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 és HPV68. A találmány szerinti eljárás elõnyös megvalósítási módja szerint, HPV16 VLP-ket adunk hozzá. Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint, HPV16 VLP-ket és HPV18 VLP-ket adunk hozzá. A találmány egy még további elõnyös megvalósítási módja szerint, az eljárás tartalmazza továbbá HPV6 VLP¹k, HPV11 VLP¹k, HPV16 VLP¹k és HPV18 VLP¹k hozzáadását. A találmány szerinti vakcinakészítmények alkalmazhatók önmagukban, megfelelõ dózisban, amely lehetõvé teszi HPV58 fertõzés optimális gátlását, minimális lehetséges toxicitás nélkül. Ezen túlmenõen, kívánt lehet más ágensekkel együtt, vagy egymást követõen történõ beadásuk. A vírusszerû részecskék mennyisége, amelyet a vakcinázni kívánt alanynak be kell adni, az expresszált géntermék immonogenitásától függ. Általánosságban, az immunológiailag vagy profilaktikusan hatékony dózis körülbelül 10–100 mg, elõnyösen körülbelül 20–60 mg VLP, közvetlenül izomba injektálva. Mérle-
1
HU 007 751 T2
gelni kell a szubkután, intradermális vagy bõrön át történõ beadás lehetõségét, valamint a beadás más módjait, például intraperitoneális, intravénás vagy inhalációs bejuttatás lehetõségét is. Mérlegelni kell továbbá emlékeztetõvakcina beadását. Elõnyös lehet továbbá adjuvánssal, például timsóval vagy Merck alumínium adjuvánssal történõ intravénás, intramuszkuláris, szubkután vagy más úton végzett beadás, a találmány szerinti vakcina beadásával egyidejûleg vagy azt követõen. Miután ismertettük a találmány elõnyös megvalósítási módjait, utalva a csatolt ábrákra, érthetõ, hogy a találmány nem korlátozódik a pontos megvalósítási módokra, és hogy szakember különbözõ változtatásokat és módosításokat végezhet. Az alábbi példák a korlátozás szándéka nélkül illusztrálják a találmányt. 1. példa Reprezentatív HPV58 L1 szekvencia meghatározása HPV58 L1 szekvenciát már korábban ismertettek (Genbank nyilvántartási száma: NC 001443). Nem ritka azonban, hogy klinikai izolátumokból származó DNS¹ek között kisebb szekvenciaeltéréseket találunk. Abból a célból, hogy reprezentatív HPV58 L1 vad típusú szekvenciát határozzunk meg, három olyan klinikai mintából izoláltunk DNS¹t, amelyekrõl korábban kimutatták, hogy HPV58 DNS¹t tartalmaznak. HPV58 L1 szekvenciát amplifikáltunk polimeráz-láncreakcióval („polymerase chain reaction”, PCR), Taq DNS-polimeráz és az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: HPV58 L1 F5’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTATG¹3’ (SEQ ID NO 4) és 58 3’11BgIII 5’¹GAGATCTGTGTAAGTACCACAACAATTA¹3’ (SEQ ID NO 5). Az amplifikált termékeket agarózgéleken elektroforetizáltuk és etídium-bromid festéssel tettük láthatóvá. A körülbelül 1500 bázispár (bp) méretû L1 csíkokat kivágtuk és a DNS¹t Geneclean Spin Kit (Q¹Bio Gene, Carlsbad, CA) reagenskészlettel tisztítottuk. Ezt követõen, a DNS¹t pCR2.1 TA klónozási vektorhoz (Invitrogen) ligáltuk. TOP10F’ E. coli-sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel és a sejteket LB agarlemezre szélesztettük, amelyet ampicillinnel, IPTG reagenssel és kék/fehér telepek szelektálásához X¹gal reagenssel egészítettünk ki. A lemezeket megfordítottuk és 16 órán át, 37 °C¹on inkubáltuk. A fehér telepeket ampicillinnel kiegészített LB tápközegben tenyésztettük 16 órán át, 37 °C¹on, rázatás mellett. Miniprep készítményeket állítottunk elõ abból a célból, hogy plazmidDNS¹t vonjunk ki. Abból a célból, hogy a plazmidokban kimutassuk az L1 gént, restrikciós endonukleáz emésztést végeztünk. A restrikciós fragmenseket agarózgél-elektroforézissel és etídium-bromid festéssel tettük láthatóvá. DNSszekvenálást végeztünk mind a három klinikai izolátumból származó klónozott L1 inszertet tartalmazó plazmidokon. Abból a célból, hogy a késõbbi optimalizáláshoz referenciaszekvenciát állítsunk elõ, a klónok
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
2
mindegyikébõl származó nukleotid- és transzlált aminosavszekvenciát összehasonlítottuk a szakirodalomban ismertetett HPV58 L1 szekvenciákkal. A három klinikai izolátum szekvenciavizsgálata azt mutatta, hogy egyetlen szekvencia sem volt azonos a Genbank szekvenciával. A pCR2.1 HPV58 L1 4¹es számú klónt választottuk reprezentatív 58 L1 szekvenciaként, és arra a leírásban egymással felcserélhetõen „58 L1 vad típusú szekvencia” vagy „58 wt szekvencia” elnevezéssel utalunk (SEQ ID NO 3, lásd az 1. ábrát). Az 58 L1 wt szekvencia öt pontmutációt tartalmazott: ebbõl kettõ aminosavak cseréjét eredményezte és három csendes mutáció volt. A Genbank HPV58 L1 szekvenciához képest aminosavcserét eredményezõ pontmutációk a 372¹es nukleotidnál (A®T) és a 897¹es nukleotidnál (A®G) fordultak elõ, rendre megváltoztatva a 124¹es aminosavat leucinról fenil-alaninra és a 299¹es aminosavat izoleucinról metioninra. A három csendes pontmutáció a 774¹es (A®G), 792¹es (T®C) és 999¹es (G®A) pozícióban volt. Az 58 L1 vad típusú szekvenciát PCR-amplifikáltuk Taq polimeráz és az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek BamHI kiterjesztést adtak a szekvenciához: 5’-58BamHI 5’¹GGGATCCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC¹3’ (SEQ ID NO 6) és 3’-Bam58 5’¹GGGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA¹3’ (SEQ ID NO 7). A kapott PCR-termékeket agarózgél-elektroforézissel és etídium-bromid festéssel tettük láthatóvá. A körülbelül 1500 bp méretû csíkot kivágtuk, majd a DNS¹t Geneclean vizsgálókészlettel tisztítottuk. A PCR-terméket ezt követõen pCR2.1 plazmidhoz ligáltuk, majd a ligációs eleggyel TOP10F’ sejteket transzformáltunk. Fehér telepeket szelektáltunk és tenyésztettünk ampicillinnel kiegészített LB tápközegben 37 °C¹on, 16 órán át, rázatás mellett. Miniprep készítményeket állítottunk elõ abból a célból, hogy plazmid-DNS¹t vonjunk ki. Abból a célból, hogy a HPV58 L1 gént kiszabadítsuk a vektorszekvenciából, BamHI restrikciós endonukleáz emésztést végeztünk. Az emésztett DNS¹t agarózgélelektroforézisnek vetettük alá és etídium-bromid festéssel tettük láthatóvá. Az L1 csíkot Geneclean készlettel tisztítottuk, majd defoszforilezett, BamHI enzimmel emésztett pGAL110 plazmidhoz ligáltuk. A ligációs eleggyel DH5a E. coli-sejteket transzformáltunk. Abból a célból, hogy helyes orientációjú HPV58 L1 inszertre szûrjünk, a telepekbõl származó plazmid-DNS¹t PCRamplifikáltuk. DNS-szekvenálást végeztünk abból a célból, hogy ellenõrizzük az inszertek szekvenciáját és orientációját. Kiválasztottunk egyetlen klónt és elneveztük HPV 58L1 #10 klónnak. A kiválasztott klónból maxiprep DNS¹t állítottunk elõ. Saccharomyces cerevisiae sejteket tettünk kompetenssé szferoplasztok glusulázkezeléssel („glusulase”) történõ elõállításával, majd transzformáltunk pGAL110-HPV 58 #1 plazmiddal. Az élesztõ transzformációs elegyet Leu(–) szorbitol felsõ agar-rétegben Leu(–) szorbitol agarlemezekre öntöttük, majd lefordítva inkubáltuk 3–5 napon át, 30 °C¹on. Telepeket emeltünk ki és szélesztettünk kló-
1
HU 007 751 T2
nok izolálása céljából Leu(–) szorbitol agarlemezekre. Ezt követõen, izolált telepeket tenyésztettünk 1,6% glükózt és 4% galaktózt tartalmazó 5XLeu(–) Ade(–) szorbitol tápközeg 5 ml¹ében, görgõcsöves tenyészetben, 30 °C¹on, hogy 58 L1 transzkripciót és proteinexpressziót indukáljunk. 2. példa Kodonok optimalizálása élesztõk számára Élesztõk számára elõnyös kodonokat már ismertettek [Sharp P. M. és Cowe E.: „Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae”, Yeast 7, 657–678 (1991)]. A HPV58 L1 wt protein expressziója detektálható volt, azonban fokozott expresszió eléréséhez a HPV58 L1 gént elõnyös élesztõ-kodonok alkalmazásával átépítettük. Az átépített HPV58 L1 szekvencia, amely élesztõre optimalizált kodonszekvenciákat tartalmazott, az HPV58 L1 wt szekvenciához képest 404 nukleotidváltoztatást tartalmazott. Az így kapott szekvenciát a leírásban „58 L1 R” (R=„rebuilt”, azaz átépített) szekvenciának neveztük (lásd az 1. ábrát). Az 58 L1 R transzlált aminosavszekvenciája változatlan maradt. A HPV58 L1 R nukleotidszekvenciáját (SEQ ID NO 1) és aminosavszekvenciáját (SEQ ID NO 2) a 2. ábra mutatja. A fenti átépített szekvencia a HPV58 L1 protein fokozott expresszióját biztosítja, amely a vad típus alkalmazásához képest jelentõs elõrehaladás vakcinák fejlesztésénél (lásd a 4. példát). Optimalizált gén elõállítása céljából alkalmazott stratégiánk az volt, hogy hosszú, átfedõ szensz és antiszensz oligomereket terveztünk, amelyek átfedték a gént, nukleotidokat élesztõ számára elõnyös kodonszekvenciákkal helyettesítenek, miközben megtartják az aminosavszekvenciát. Ezeket az oligonukleotidokat alkalmaztuk templát-DNS helyett PCR-reakcióban, Pfu polimeráz jelenlétében. További amplifikációs láncindító oligonukleotidokat terveztünk és alkalmaztunk az átépített szekvenciák templát oligomerekbõl történõ amplifikálására. Az amplifikálás optimális körülményei specifikusak voltak az egyes szakaszokra nézve, azonban a leggyakrabban alkalmazott program az alábbihoz hasonlított: 95 °C, 2 percen át (denaturálás), ezt követte 35 cikluson át 95 °C, 1 percen át (denaturálás), 55 °C, 1 percen át (temperálás), 72 °C, 3,5 percen át (kiterjesztés), ezt követõen 72 °C, 10 percen át (végsõ kiterjesztés) és 4 °C tartása. A PCR-termékeket agarózgélelektroforézissel vizsgáltuk. A megfelelõ méretû csíkokat kivágtuk és a DNS¹t megtisztítottuk. Az amplifikált fragmenseket ezt követõen templátként alkalmaztuk az 1497 nt átépített HPV58 L1 gén összeállításához. Az átépítést követõen az 1497 nt csíkot gélen tisztítottuk, majd pCR-Blunt vektorhoz (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligáltuk. A ligálást követõen, TOP10 sejteket transzformáltunk a ligációs eleggyel. Telepeket növesztettünk kanamicint tartalmazó LB tápközegben, és a telepekbõl miniprep eljárásokkal plazmid-DNS¹t vontunk ki. A plazmid-DNS¹t szekvenáltuk, hogy ellenõrizzük a kívánt 58 L1 átépített változásokat. Abból a célból, hogy mindkét végéhez BamHl kiterjesztést adjunk
5
10
15
20
25
30
35
40
2
hozzá, az 58 L1 R (átépített) polinukleotidot újra amplifikáltuk a pCR-Blunt¹58 L1 R plazmidból, az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: 5’Bam 58 Rebuild 5’¹GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC¹3’ (SEQ ID NO 8) és 3’Bam 58 Rebuild 5’¹GGATCCTTACTTCTTGACCTTC¹3’ (SEQ ID NO 9). Az amplifikált L1¹terméket gélen tisztítottuk Geneclean készlet alkalmazásával, majd pCR2.1 plazmidba (Invitrogen) klónoztuk. A pCR2.1 plazmiddal TOP10F sejteket transzformáltunk. Fehér telepeket szelektáltunk és tenyésztettünk ampicillint tartalmazó LB tápközegben, 37 °C¹on, 16 órán át, rázatás mellett. A plazmid-DNS¹t miniprep eljárással vontuk ki. Abból a célból, hogy a HPV58 L1 gént kiszabadítsuk a vektorszekvenciából, BamHl restrikciós endonukleáz emésztést végeztünk. Az emésztett DNS¹t agarózgél-elektroforézisnek vetettük alá és etídium-bromid festéssel tettük láthatóvá. Az L1 csíkot Geneclean készlettel tisztítottuk, majd defoszforilezett, BamHI enzimmel emésztett pGAL110 plazmidhoz ligáltuk. A ligációs eleggyel DH5a E. coli-sejteket transzformáltunk. Az így kapott telepeket PCR-vizsgálattal szûrtük a helyes orientációjú HPV58 L1 inszert jelenlétére. Maxiprep DNS¹t állítottunk elõ. A szekvenciát és annak orientációját restrikciós emésztési profilokkal és DNSszekvenálással ellenõriztük. A kiválasztott klónt pGAL110-HPV58L1R#17 klónnak neveztük el. Saccharomyces cerevisiae sejteket tettünk kompetenssé szferoplasztok elõállításával, majd transzformáltunk pGAL110-HPV 58L1R #17 plazmiddal. Az élesztõ transzformációs elegyet Leu(–) szorbitol felsõ agarrétegben Leu(–) szorbitol agarlemezekre öntöttük, majd lefordítva inkubáltuk 3–5 napon át, 30 °C¹on. Telepeket emeltünk ki és szélesztettünk klónok izolálása céljából Leu(–) szorbitol agarlemezekre. Ezt követõen, izolált telepeket tenyésztettünk 1,6% glükózt és 4% galaktózt tartalmazó 5XLeu(–) Ade(–) szorbitol tápközeg 5 ml¹ében, görgõcsöves tenyészetben, 30 °C¹on, hogy L1 transzkripciót és proteinexpressziót indukáljunk. Negyvennyolc óra múlva, OD600=10 mennyiségû sejtnek megfelelõ tenyésztési térfogatot centrifugáltunk, a felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket –70 °C¹on tároltuk.
45 3. példa RNS elõállítása Galaktózzal HPV58 L1 vagy HPV58 L1 R expresszálására indukált, transzformált élesztõsejteket olvasz50 tottunk jégen, 0,8 ml Trizol reagensben (Life Technologies, Gibco BRL) szuszpendáltuk és 5 percen át, szobahõmérsékleten inkubáltuk. A csõbe egyötöd térfogat kloroformot mértünk be. Ezt követõen, a csövet erõteljesen ráztuk, hogy tartalma jól elegyedjen, majd 3 per55 cen át inkubáltuk szobahõmérsékleten. Öt percen át centrifugáltuk, percenként 13 000 fordulatszám mellett, majd a felsõ fázist összegyûjtöttük és egy másik csõbe vittük át. Az elegyhez 0,4 ml izopropanolt adtunk és 10 percen át inkubáltuk szobahõmérsékleten. Abból a 60 célból, hogy az RNS¹t tömörítsük, 10 percen át centri8
1
HU 007 751 T2
fugáltuk, percenként 13 000 fordulatszám mellett. A felülúszót leöntöttük, az RNS-üledéket 75%¹os etanollal mostuk és a centrifugálást megismételtük. A felülúszót leöntöttük és az RNS-üledéket 15 percen át hagytuk a levegõn száradni, majd RNáz-tól mentes vízben szuszpendáltuk. Az RNS koncentrációjának a meghatározásához spektrofotometriát alkalmaztunk, feltételezve, hogy A260=1 leolvasott érték 40 mg RNS-nek felel meg abban az esetben, ha A260/280 egyenlõ 1‚7–2,0 értékkel. 4. példa Northern-blot-vizsgálat 1,1%¹os agaróz-formaldehid gélt öntöttünk. RNSbõl 5 és 10 mg¹ot elegyítettünk denaturáló pufferrel (végsõ koncentrációja: 6% formaldehid, 50% formamid és 0,1×MOPS), majd 10 percen át 65 °C¹ra hevítettük. Az elegyhez egytized térfogatrész mintapuffert adtunk, és a mintát gélre vittük fel. Az elektroforézist 75 V mellett végeztük, 1×MOPS pufferben, körülbelül 3 órán át. A gélt 60 percen át mostuk 10×SSC oldatban. Az RNS¹t kapilláris hatással Hybond¹N+ nejlonmembránra vittük (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 16 órán át, 10×SSC oldatban. Ezt követõen, az RNS¹t keresztkötésekkel a nejlonmembránhoz fixáltuk, Stratagene UV Stratalinker önkeresztkötõ funkciójának alkalmazásával (Stratagene, La Jolla, CA). A fixálást követõen, a nejlonmembránt hagytuk levegõn megszáradni. Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detecting Kit I (Hoffmann¹La Roche Ltd., Bázel, Svájc) készletet alkalmaztuk az 58 L1 wt és 58 L1 R DNS-szekvenciák DIG reagenssel történõ jelölésére, hogy azokat próbakoktélként alkalmazzuk 58 L1 wt és 58 L1 R transzkriptumok detektálására Northern-blot-vizsgálatokban. Az elõhibridizálást, hibridizálást és az immunológiai elõhívást a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, a blotot 37 °C¹on elõhibridizáltuk 30 percen át, kímélõ rázatás mellett. A próbakoktélt úgy denaturáltuk, hogy 5 percen át, 95 °C¹ra hevítettük, majd jégen csillapítottuk. A próbakoktélt hozzáadtuk a hibridizáló oldathoz, majd 4 órán át 44,6 °C¹on, kíméletes rázatás mellett érintkeztettük a membránnal. Ezt követõen, a hibridizáló oldatot eltávolítottuk és a blotot kétszer 5 percen át mostuk 0,1% SDS¹t tartalmazó, 2×SSC oldattal szobahõmérsékleten, amelyet egy további mosás követett 65 °C¹on, 0,1% SDS¹t tartalmazó, 2×SSC oldattal. Ezt követõen, a blotot 30 percen át blokkoltuk, majd DIG elleni, alkalikus foszfatázzal konjugált ellenanyag 1:5000 léptékû hígításával érintkeztettük 30 percen át. A blotot mostuk és a próbához kötõdött RNS jelenlétét úgy mutattuk ki, hogy NBT/BCIP szubsztrát detektálásával láthatóvá tettük a kötõdött, alkalikus foszfatázzal konjugált, DIG elleni ellenanyagot. Az 58 L1 wt proteint expresszáló élesztõ kezdeti vizsgálata arra utalt, hogy a HPV58 L1 protein teljes hosszúságú transzkripciója és transzlációja funkcionálisan megtörtént; az expresszió azonban fokozható, ha a szekvenciát élesztõ számára elõnyös kodonszekven-
5
2
ciákkal átépítjük. Az átépített 58 L1 szekvenciát úgy alakítottuk át, hogy kihagytunk minden lehetséges, érés elõtti transzkripciós leállítószekvenciát, hogy biztosítsuk az erõteljes transzkripciót. Az 58 L1 R transzkriptum Northern-blot-vizsgálata azt mutatta, hogy az elõállított teljes hosszúságú transzkriptumok mennyisége fokozódott az 58 L1 wt protein eredményeivel összehasonlítva (3. ábra).
5. példa HPV58 L1 protein expressziója Galaktózzal indukált élesztõsejt-tenyészetek fagyasztott üledékét (OD600=10 mennyiségû sejtnek megfelelõ sejtet) olvasztottuk jégen és szuszpendál15 tunk 2 mmol/l PMSF reagenst tartalmazó PC¹puffer (100 mmol/l Na2HPO4 és 0,5 mol/l NaCl, pH=7,0) 300 ml-ében. Savval mosott, 0,5 mm átmérõjû üveggyöngyöket adtunk hozzá, körülbelül csövenként 0,5 g¹ot. A csöveket háromszor öt percen át vortexszel20 tük, egyperces szünetekkel. Az elegyhez 7,5 ml 20%¹os TritonX 100 reagenst adtunk és a vortex lépést 5 percen át, 4 °C¹on megismételtük. A felülúszót steril, kisméretû centrifugacsõbe vittük át, összes élesztõprotein jelölést tettünk rá, dátummal láttuk el és –70 °C¹on tá25 roltuk. 10
30
35
40
45
50
55
60 9
6. példa Western-blot-vizsgálat Minden egyes 58 L1 konstrukció esetében húsz izolált élesztõkolóniából származó teljes élesztõprotein-kivonatot vizsgáltunk Western-blot-vizsgálattal, hogy ellenõrizzük az 58 L1 protein expresszióját galaktózzal történõ indukciót követõen. Reprezentatív 58 L1 wt és 58 L1 R izolátumokból származó teljes proteinkivonatok 10, 5 és 2,5 mg mennyiségét elegyítettük SDS-PAGE mintapufferrel és hevítettük 95 °C¹ra 10 percen át. Pozitív kontrollként 16 L1 proteint alkalmaztunk, amelynek mérete körülbelül 55 kD, és negatív kontrollként HPV L1 proteintõl mentes teljes élesztõprotein-kivonatot (nem bemutatott adat) vittünk fel. A proteineket 10%¹os SDS-PAGE gélre vittük fel és Tris-glicin pufferben elektroforetizáltuk. A proteinek elválasztását követõen, a proteineket a gélrõl nitro-cellulózra vittük át, majd a blotot 1×hígítópufferben blokkoltuk (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), 1 órán át, szobahõmérsékleten, rázás mellett. A blotot háromszor mostuk, és szobahõmérsékleten, 16 órán át inkubáltuk élesztõvel kimerített, kecskében termelt, trpE-HPV31 L1 elleni szérummal, amely keresztreagál HPV16 és HPV58 L1 proteinekkel. Ezt követõen, a blotot háromszor mostuk, majd kecske elleni, HRPO enzimmel konjugált ellenanyag 1:2500 léptékû hígításával inkubáltuk 1 órán át. A blotot ismét háromszor mostuk, majd NBT/BCIP detektáló szubsztráttal (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) érintkeztettük. Az immunreaktív proteineket lila csíkok formájában detektáltuk a bloton. Az 58 L1 protein minden esetben különálló immunreaktív csík formájában volt detektálható a nitro-celluló-
1
HU 007 751 T2
zon, körülbelül 55 kD¹nak megfelelõ pozícióban (lásd a 4. ábrát). Az 58 L1 csíkok intenzitása erõsebbnek tûnt, mint az 58 L1 wt csíkoké, ami arra utalt, hogy élesztõkodon-optimalizálást követõen, javított 58 L1 expressziót értünk el. 7. példa ELISA vizsgálat Abból a célból, hogy demonstráljuk az 58 L1 VLP expresszióját, az 58 L1 wt és 58 L1 R teljes élesztõkivonatok mintáját ELISA eljárással vizsgáltuk. A HPV58 L1 és HPV58 L1 R proteineket expresszáló élesztõsejteket számos eljárással szaporítottuk, beleértve görgõcsöves kultúrákat, rázólombikokat és fermentorokat. Az élesztõsejteket lizáltuk és proteinkivonatokat állítottunk elõ abból a célból, hogy meghatározzuk az elõállított HPV58 L1 vírusszerû részecskéknek (VLP-knek) a teljes protein egy mikrogrammjára vonatkoztatott mennyiségét. Abból a célból, hogy kimutassuk HPV58 L1 VLP¹k expresszióját, szendvicsELISA vizsgálatot terveztünk. Protein¹G reagensen tisztított H582C3.F7 (F7) monoklonális ellenanyagot (mAb) alkalmaztunk intakt 58 L1 VLP¹k teljes élesztõprotein-kivonatból történõ kötésére. Az F7 mAb fajlagosan felismer egy HPV58 L1 VLP konformációs epitópot. A nem kötõdött proteineket kimostuk, majd egy másik, konformációra fajlagos mAb¹ot, a H586E11.F4 (F4) mAb¹ot alkalmaztuk detektáló ellenanyagként. Valódi, helyes konformációt mutató 58 L1 VLP¹k kötõdtek, és a detektálást HRPO enzimmel konjugált, egéreredetû IgG2b ellenanyag elleni ellenanyag és TMB szubsztrát alkalmazásával tettük lehetõvé. Közelebbrõl, F7 ellenanyagot alkalmaztunk Immulon 4 HBX 96 vályulatú lemezek bevonására éjszakán át, 4 °C¹on. A lemezeket háromszor mostuk 0,05% Tween 20 reagenst tartalmazó PBS-pufferrel, majd blokkolóoldattal (PBS+0,05% Tween 20+1% BSA) blokkoltuk. A lemezeket háromszor mostuk és az A sorba antigéneket (teljes élesztõlizátum, blokkolópufferben 12,5 mg/ml koncentrációra hígítva) mértünk be, két párhuzamossal. Tisztított HPV58 L1 VLP referencia standardokat mértünk be az A sor 3¹as és 4¹es oszlopába (206 ng/ml, 12,5 mg/ml¹es teljes élesztõprotein-oldatban). A referencia- és vizsgálati mintákból az egyes
2
oszlopokban felezõ tovafutó hígítást készítettünk. Három órán át, szobahõmérsékleten történõ inkubálást követõen, az antigénfelesleget leszívtuk és a lemezeket háromszor mostuk. Konformációra fajlagos 5 F4 mAb¹ot hígítottunk blokkolóoldatban, bemértük a vályulatokba és egy órán át inkubáltuk szobahõmérsékleten. A lemezeket mostuk, majd 5 perc idõtartamra TMB reagenst (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) mértünk a vályulatokba, hogy HRP enzimmel jelölt 10 ellenanyagkomplexeket mutassunk ki. A detektálási reakciót 2 mol/l H2SO4-oldat hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket 450 nm hullámhosszon olvastuk le, és a HPV58 L1 VLP koncentrációját a referenciastandardokkal összehasonlítva határoztuk meg, az összes 15 protein egy mg-jára vonatkoztatott ng VLP egységekben. Az 5. ábra HPV58 L1 wt és HPV58 L1 R proteineket expresszáló élesztõkbõl származó összes protein egy mikrogrammjára vonatkoztatott, két párhuzamos 20 vizsgálatban detektált VLP¹k mennyiségét hasonlítja össze. A HPV58 L1 VLP expressziós szintje körülbelül két-háromszorosára emelkedett az élesztõ kodonoptimalizálása eredményeképpen. 25
30
35
40
45
8. példa Transzmissziós elektronmikroszkópia Abból a célból, hogy demonstráljuk: az 58 L1 protein tényleg önszervezõdik és pentamer L1¹kapszomereket képez, amelyek viszont vírusszerû részecskékké állnak össze önszervezõdéssel, részlegesen tisztított 58 L1 R protein kivonatot vetettünk alá transzmissziós elektronmikroszkópos (EM) vizsgálatnak. Élesztõt tenyésztettünk kisléptékû fermentálással és a sejteket tömörítettük. Az így kapott üledéket tisztításnak vetettük alá. Az üledéket és a tisztított élesztõkivonatokat immunblot-eljárással ellenõriztük, hogy kimutassuk az L1 protein expresszióját és a tisztítási folyamat során mutatott retencióját. A tisztított élesztõkivonatokat ezt követõen 45%¹os szacharózpárnán centrifugáltuk, és az így kapott üledéket pufferben szuszpendáltuk transzmissziós EM vizsgálat céljára. A 6. ábra a képzõdött 58 L1 VLP¹k reprezentatív képét mutatja. A szferikus részecskék átmérõje a nyers mintában 30–60 nm, és néhány részecske kapszomerek rendezett sorát mutatja.
Szekvencialista <110> Merck & Co., Inc. <120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 58 L1 In YEAST <130> 21561 PCT <150> 60/519,211 <151> 2003–11–12 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 10
HU 007 751 T2
<210> 1 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 L1¹R <400> 1
atgtccgtct gtcgtctcca agattgttgg gtcttggttc ccaaacaagt tgggcttgtg cacccatact ggttctgaca ggttgtaagc gctgctaccg gtcgacactg ccaatcgaca ccatacggtg ttcaacagag ggtaacaccg acctctgaat aacggtatct aacatgacct gaatacgtca accttgactg tggcaattcg acctctcaag aacaagtaca ttcccattgg agatctgctc
ggagaccatc ctgacgaata ctgttggtaa caaaggtctc tcggtttccc tcggtttgga tcaacaagtt acagagaatg caccaactgg actgtccacc gtttcggttg tctgtaactc actccttgtt ctggtaagtt ctgtcatcca ctcaattgtt gttggggtaa tgtgtaccga gacacgtcga ctgaaatcat gtttgactcc ctatcacctg ccttctggga gtagaaagtt caaccactag
cgaagctacc cgtctctaga cccatacttc tggtttgcaa agacacttcc aatcggtaga cgacgacacc tttgtccatg tgaacactgg attggaattg tatggacttc cacctgtaag cttcttcttg gggtgaagct atcctctgct caacaagcca ccaattgttc agtcaccaag ggaatacgac gacctacatc accaccatct tcaaaagact agtcaacttg cttgttgcaa agctccatcc
gtctacttgc acctctatct tccatcaagt tacagagtct ttctacaacc ggtcaaccat gaaacctcca gactacaagc ggtaagggtg ttcaactcca ggtaccttgc tacccagact agaagagaac gttccagacg ttcttcccaa tactggttgc gtcactgtcg gaaggtacct ttgcaattcg cacaccatgg gcttccttgc gctccaccaa aaggaaaagt tctggtttga accaagagaa
caccagttcc actactacgc ctccaaacaa tcagagtcag cagacactca tgggtgttgg acagataccc aaacccaatt ttgcttgtaa tcatcgaaga aagctaacaa acttgaagat aaatgttcgt acttgtacat ctccatctgg aaagagctca tcgacaccac acaagaacga tcttccaatt actctaacat aagacaccta aggaaaagga tctctgctga aggctaagcc agaaggtcaa
agtctccaag tggttcctct caacaagaag attgccagac aagattggtc tgtctctggt agctcaacca gtgtttgatc caacaacgct cggtgacatg gtccgacgtt ggcttctgaa cagacacttc caagggttct ttccatggtc aggtcacaac tagatccact caacttcaag gtgtaagatc cttggaagac cagattcgtc agacccattg cttggaccaa aagattgaag gaagtaa
<210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> Human Papillomavirus Type 58 <400> 2
Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro 35 40 45 Tyr Phe Ser Ile Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro 50 55 60 Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr 85 90 95 11
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1497
HU 007 751 T2
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp 115 120 125 Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn 130 135 140 Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile 145 150 155 160 Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys 165 170 175 Asn Asn Asn Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met 195 200 205 Asp Phe Gly Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile 210 215 220 Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val Ile Gln Ser 275 280 285 Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser 290 295 300 Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly 340 345 350 Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu 355 360 365 Tyr Asp Leu Gln Phe Val Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala 370 375 380 Glu Ile Met Thr Tyr Ile His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp 385 390 395 400 Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr 405 410 415
12
HU 007 751 T2
Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro 420 425 430 Pro Lys Glu Lys Glu Asp Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val 435 440 445 Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly 450 455 460 Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys 465 470 475 480 Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val 485 490 495 Lys Lys <210> 3 <211> 1497 <212> DNA <213> 58 Human Papillomavirus Type <400> 3
atgtccgtgt gttgtaagca agacttttgg gtattagttc cccaataaat tgggcatgtg catccttatt gggtctgata ggctgtaaac gctgctactg gtagatacag cctattgata ccttatgggg tttaataggg ggtaatactg acctcagaat aatggcattt aatatgacat gaatatgtac acactaactg tggcaatttg acctcccagg aataaatata tttcctttgg cgttcggccc
ggcggcctag ctgatgaata ctgttggcaa ccaaggtatc ttggttttcc taggccttga tcaataaatt acagggaatg ctcccactgg attgtcctcc ggtttggatg tttgtaacag atagtttgtt ccggaaaact cagttatcca cacaattatt gctggggcaa tatgcactga gtcatgttga cagagataat gtttaacacc ctattacttg ctttttggga gacgaaagtt ctactacccg
tgaggccact tgtgtcacgc tccatatttt aggcttacag tgatacatct aataggtagg tgatgacact cttatctatg tgagcattgg attggaactt catggacttt tacatgcaaa cttttttctt tggcgaggct aagtagtgca taataagcct tcagttattt agtaactaag agaatatgac gacatatata tcctccgtct ccaaaaaaca ggttaactta tttattacaa tgcaccatcc
gtgtacctgc acaagcattt tccatcaaaa tatagggtct ttttataacc ggacagccat gaaaccagta gattataaac ggtaaaggtg tttaattcta ggtacattgc tatccagatt agacgtgagc gtcccggatg ttttttccaa tattggctac gttaccgtag gaaggtacat ttacagtttg catactatgg gccagtttac gcacccccta aaggaaaagt tcaggcctta accaaacgca
<210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító
13
ctcctgtgcc attattatgc gtcccaataa ttagggtgcg ctgatacaca tgggtgttgg acagatatcc aaacacaatt ttgcctgtaa ttattgagga aggctaataa atttaaaaat agatgtttgt acctttatat ctcctagtgg agcgtgcaca ttgataccac ataaaaatga tttttcagct attccaatat aggacacata aagaaaagga tttctgcaga aagcaaagcc aaaaggttaa
tgtgtctaag tggcagttcc caataaaaaa tttacctgat acgtttggtc cgtaagtggt cgcacagcca atgtttaatt caataatgca tggtgacatg aagtgatgtg ggccagtgaa taggcacttt taaagggtcc ctctatggtt aggtcataac tcgtagcact taattttaag ttgcaaaatt tttggaggac tagatttgtt agatccatta tctagatcag cagactaaaa aaaataa
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1497
HU 007 751 T2
<400> 4
21
atgtccgtgt ggcggcctag t
<210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító <400> 5
28
gagatctgtg taagtaccac aacaatta
<210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító <400> 6
31
gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c
<210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító <400> 7
28
gggatccgtg taagtaccac aacaatta
<210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító <400> 8
ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR láncindító
14
34
1
HU 007 751 T2
2
<400> 9
ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc
34
<210> 10 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antiszensz HPV 58 L1 <400> 10
tacaggcaga cagcagaggt tctaacaacc cagaaccaag ggtttgttca acccgaacac gtgggtatga ccaagactgt ccaacattcg cgacgatggc cagctgtgac ggttagctgt ggtatgccac aagttgtctc ccattgtggc tggagactta ttgccataga ttgtactgga cttatgcagt tggaactgac accgttaagc tggagagttc ttgttcatgt aagggtaacc tctagacgag
cctctggtag gactgcttat gacaaccatt gtttccagag agccaaaggg agccaaacct agttgttcaa tgtctcttac gtggttgacc tgacaggtgg caaagccaac agacattgag tgaggaacaa gaccattcaa gacagtaggt gagttaacaa caaccccatt acacatggct ctgtgcagct gactttagta caaactgagg gatagtggac ggaagaccct catctttcaa gttggtgatc
gcttcgatgg gcagagatct gggtatgaag accaaacgtt tctgtgaagg ttagccatct gctgctgtgg aaacaggtac acttgtgacc taaccttaac atacctgaag gtggacattc gaagaagaac cccacttcga taggagacga gttgttcggt ggttaacaag tcagtggttc ccttatgctg ctggatgtag tggtggtaga agttttctga tcagttgaac gaacaacgtt tcgaggtagg
cagatgaacg tggagataga aggtagttca atgtctcaga aagatgttgg ccagttggta ctttggaggt ctgatgttcg ccattcccac aagttgaggt ccatggaacg atgggtctga tcttctcttg caaggtctgc aagaagggtt atgaccaacg cagtgacagc cttccatgga aacgttaagc gtgtggtacc cgaaggaacg cgaggtggtt ttccttttca agaccaaact tggttetctt
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Nukleinsavmolekula, amely SEQ ID NO 2 azonosító számon bemutatott HPV58 L1 proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, ahol a nukleinsavszekvencia SEQ ID NO 1 azonosító számon bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmaz. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmazó vektor. 3. A 2. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejt. 4. A 3. igénypont szerinti gazdasejt, amely gazdasejt élesztõsejt. 5. A 4. igénypont szerinti gazdasejt, ahol az élesztõsejt az alábbiak közül választott: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe.
45
50
55
60 15
gtggtcaagg tgatgatgcg gaggtttgtt agtctcagtc gtctgtgagt acccacaacc tgtctatggg tttgggttaa aacgaacatt agtagcttct ttcgattgtt tgaacttcta tttacaagca tgaacatgta gaggtagacc tttctcgagt agctgtggtg tgttcttgct agaaggttaa tgagattgta ttctgtggat tccttttcct agagacgact tccgattcgg tcttccagtt
tcagaggttc accaaggaga gttgttcttc taacggtctg ttctaaccag acagagacca tcgagttggt cacaaactag gttgttgcga gccactgtac caggctgcaa ccgaagactt gtctgtgaag gttcccaaga aaggtaccag tccagtgttg atctaggtga gttgaagttc cacattctag gaaccttctg gtctaagcag tctgggtaac gaacctggtt ttctaacttc cttcatt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1497
6. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a gazdasejt Saccharomyces cerevisiae. 7. Eljárás HPV58 L1 vírusszerû részecskék (VLP¹k) elõállítására, amely eljárás tartalmazza: (a) élesztõ transzformálását 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekulával; (b) a transzformált élesztõ tenyésztését olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a kodonoptimalizált nukleinsavmolekula expresszióját, rekombináns papillomavírus-protein elõállítása céljából; és (c) rekombináns papillomavírus-protein izolálását HPV58 L1 VLP¹k elõállítása céljából. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol az élesztõ az alábbiak közül választott: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis és Schizosaccharomyces pombe.
1
HU 007 751 T2
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol az élesztõ Saccharomyces cerevisiae. 10. Eljárás HPV-fertõzések kezelésére vagy megelõzésére szolgáló vakcina elõállítására, amely eljárás tartalmazza HPV58 L1 VLP¹k elõállítását a 7–8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina legalább egy további HPV-típus VLP¹it is tartalmazza. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy további HPV-típus az alábbiak közül választott: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33,
2
HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 és HPV68. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy HPV-típus magában foglal HPV16¹ot. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina 5 tartalmaz továbbá HPV18 VLP-ket. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz továbbá HPV6 VLP-ket és HPV11 VLP-ket. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, ahol a 10 vakcina tartalmaz továbbá HPV31 VLP-ket. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina tartalmaz továbbá HPV45 VLP-ket.
16
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
17
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
18
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
19
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
20
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
21
HU 007 751 T2 Int. Cl.: C12N 15/37
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
